CN101948849A - 猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗及其制备方法。首先，将猪圆环病毒2型去除N端41个氨基酸残基的Cap蛋白基因克隆入质粒pKK-233-2，获得重组表达质粒pKK-233-2-Cap，重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α，获得重组基因工程菌DH5α/pKK-233-2-Cap。不需要添加IPTG或乳糖诱导，重组基因工程菌组成型表达截短型Cap蛋白，分离纯化截短型Cap蛋白，添加佐剂制成猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗。Cap蛋白还可以用于制备猪圆环病毒2型引起的相关疾病诊断试剂。

Description

猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备与应用

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型的基因工程疫苗及其制备方法，以及应用截短型Cap蛋白作为ELISA检测抗原鉴定猪圆环病毒2型感染，特别指猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗，属基因工程领域。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是目前已知最小的动物病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCV1(猪圆环病毒1型)和PCV2(猪圆环病毒2型)两种血清型。PCV1广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中，经动物感染试验证明PCV1无致病性。PCV2与猪群中发生的多种疾病相关，如断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征及先天性震颤等，给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。

PCV2是近年来新发现的猪的重要传染病之一，患病仔猪出现发烧、腹泻、躯体震颤、渐行性消瘦，直至死亡。繁殖母猪则出现产死胎等繁殖障碍。该病主要导致猪体的免疫抑制，从而继发或并发其他疾病，使猪群的免疫能力下降。由于PCV2在细胞上的增殖滴度很低，很难应用传统的灭活疫苗和弱毒疫苗来预防该病，而DNA疫苗这种新型疫苗免疫效力又不高。因此，开发一种有别于传统疫苗的基因重组疫苗以及PCV2的早期诊断就显得尤为重要。

临床上对于PCV2的诊断，常根据流行病学、临床症状和病理变化作出初步诊断，但由于PCV2与PRRS、PPV和PRV等疾病引起的临床症状相似，通过临床检查、病例剖检难以确诊，故该病的诊断还要借助于实验室诊断。

PCV2的实验室诊断方法有病原学方法和血清学方法。其中病原学诊断方面以PCR法最为常见，但PCR法要求苛刻的试验条件，加之费用昂贵，限制了其大规模推广，其可信性又受到由PCR的高度敏感性带来的假阳性结果的影响。因此，开发操作简单、结果可靠、敏感性高、特异性好、方便基层应用的可产业化生产的血清抗体检测方法成为预防PCV2传播的可靠途径之一。

Allan等(1998a)用PCV1全病毒为抗原建立了ELISA方法，但由于PCV1和PCV2抗原的交叉反应性，该方法不能把PCV1型和PCV2型区分开来。Walker等(2000)应用PCV2单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法，虽然该方法灵敏性和特异性都很高，但同时存在操作耗时耗力，不能大量重复生产的缺点。

南京农业大学姜平教授采用重组腺病毒基因工程技术研制出一种PCV2的重组腺病毒及疫苗，但重组腺病毒载体存在对某些细胞感染能力差，转基因表达水平较低，持时较短等缺点；南京农业大学曹瑞兵采用酵母分泌表达的PCV2 Cap蛋白作为检测抗原，制备了检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的ELISA试剂盒，但酵母菌表达重组PCV2 Cap蛋白存在生产周期过长和酵母菌容易污染周围环境的缺点，限制了该方法的推广和应用；哈尔滨兽医研究所的刘长明研究员利用昆虫杆状病毒表达载体，筛选获得了一株PCV2 Cap蛋白重组杆状病毒毒株(rBac/PCV2 Cap)，但该方法同样存在生产成本高和生产周期长的特点。

此外，童光志研究员和姜平教授等研究者分别利用大肠杆菌对截短型Cap蛋白的表达进行了不同的研究。对于PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中的表达，国内外也有相关文献报道，如：Liu等在大肠杆菌中进行了PCV2 Cap蛋白全基因的表达(Protein Exp.Purif.21(2001b)，115-120)，Zhou等在大肠杆菌中表达了截短型Cap蛋白(Journal of Biotechnology 118(2005)201-211)，但总的来讲，PCV2 Cap蛋白的表达量很低，分别为1mg/L和6.142mg/L，且需要进行蛋白复性及加入价格昂贵的IPTG，二者均限制了大肠杆菌对PCV2 Cap蛋白表达。

综合以上研究结果，目前对于PCV2疫苗的研制及PCV2抗体检测试剂盒的应用，迫切需要建立一种生产周期短、生产成本低、蛋白产量高、蛋白活性好的PCV2 Cap蛋白的制备方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)克隆猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因到表达载体质粒pKK233-2中，获得重组表达载体pKK233-2-Cap，其中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白为去除N端41个氨基酸残基的截短型Cap蛋白；

(2)所述重组表达载体pKK233-2-Cap转化大肠杆菌，获得基因工程菌；

(3)所述基因工程菌进行发酵培养，表达猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白；

(4)回收基因工程菌菌体破碎后的上清液，分离纯化猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。

优选地，本发明所述大肠杆菌为DH5α。

优选地，本发明所述重组基因工程菌为DH5α/pKK233-2-Cap。

优选地，本发明所述转基因工程菌组成型表达Cap蛋白，为组成型表达，不需要添加诱导物。

本发明的另一方面为使用本发明所述方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。

本发明的另一方面为使用本发明所述方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。

本发明的另一方面为上述猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗的制备方法：由本发明所述方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白中，加入佐剂，获得猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。

本发明的另一方面为使用本发明所述方法制备的基因工程菌，可表达猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。

本发明的又一方面为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白在制备诊断试剂中的应用。优选地，使用本发明所述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白做为酶联免疫吸附试验的抗原，使用酶联免疫吸附试验检验被试样品。

技术效果

本发明选用了质粒pKK233-2为表达载体构建的基因工程菌，能稳定可靠的表达PCV2截短型Cap蛋白，其表达量显著高于现有技术描述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白表达量。

首先，本发明基因工程菌为组成型(渗漏)表达，其原因在于本发明实施例中构建的pKK-233-2-Cap的重组表达质粒中所含的强启动子trc具有组成型(渗漏)表达的特点，重组Cap蛋白是随着工程菌的生长而持续不断表达，特别是在不含变异基因lacI^q的宿主菌DH5α中，trc启动的组成型表达量非常高。因此，本发明构建的工程菌株DH5α/pKK-233-2-Cap，不需要添加诱导剂IPTG，解决了IPTG对动物存在毒性的问题以及高成本问题。

其次，由于trc启动的组成型表达量非常高的特点，在优化的培养条件下，本发明方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的表达量最高可达到150mg/L，远高于目前现有技术报道的PCV2 Cap蛋白的1mg/L和6.142mg/L的表达量水平。

最后，本发明的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白保留了PCV2 Cap蛋白羧基端区段，使其依然具有天然Cap蛋白的抗原活性，同时经该方法获得的截短型Cap蛋白为可溶性表达蛋白，其具有天然Cap蛋白的抗原活性，节省了大肠杆菌表达外源蛋白往往存在的包涵体复性的繁琐步骤，简化了蛋白表达后期纯化的步骤，从而以较低的成本得到了大量的具有生物活性的Cap蛋白。

因此，该基因工程菌可用于PCV2疫苗及PCV2诊断试剂等的生产中，生产成本较低，纯化方法简单，疫苗防治效果好，在工业上大规模生产猪圆环病毒2型的疫苗及诊断试剂上具有良好的应用前景。

附图说明

图1为重组质粒pMD 18-T-Cap双酶切电泳图。

图2为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白鉴定电泳图。

图3为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白柱层析纯化后电泳图。

图4为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白经摇瓶培养优化后鉴定图。

图5为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白Western blot鉴定图。

具体实施方式

本发明实施例克隆猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的基因，构建了表达载体pKK233-2-Cap，转化大肠杆菌，得到了克隆有猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因的基因工程菌。通过该基因工程菌的大规模培养，经分离纯化得到可溶性的截短型Cap蛋白。加适合的佐剂，制备为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。该蛋白还可用于制备猪圆环病毒2型引起的相关疾病的诊断试剂。

本发明试验了使用pKK233-2表达载体构建基因工程菌，其他含有lac启动子或其杂合启动子但不含lacI^q基因的表达载体，也可用于替代本发明使用的pKK233-2表达载体。本发明实施例优选pKK233-2表达载体，其蛋白表达量高，且为组成型表达，不需要添加诱导剂如IPTG等，解决了IPTG对动物存在毒性的问题以及高成本问题。

编码病毒的主要结构蛋白-核衣壳蛋白(Capsid，Cap)，其氨基端含有一个由41个氨基酸残基组成的核定位信号(Nuclear location signal，NLS)，与PCV2的细胞核内定位相关。有研究表明，核定位信号(NLS)影响ORF2全基因在大肠杆菌中的表达，造成重组PCV2 Cap蛋白的表达量极少。PCV2 Cap蛋白羧基端含有较多的转角结构，该区域抗原指数较高，其亲水性指数和呈现在蛋白表面的可能性也较大，该区段的抗原表位是优势抗原表位所在，因此本发明的实施例中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白保留了PCV2 Cap蛋白羧基端区段，使其依然具有天然PCV2 Cap蛋白的抗原活性。同时经该方法获得的截短型PCV2 Cap蛋白为可溶性表达蛋白，其具有天然PCV2 Cap蛋白的抗原活性，节省了大肠杆菌表达外源蛋白往往存在的包涵体复性的繁琐步骤，简化了蛋白表达后期纯化的步骤，从而以较低的成本得到了大量的具有生物活性的PCV2 Cap蛋白。

本发明实施例中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的分离与纯化，采用硫酸铵沉淀与柱层析的纯化方法，其他常用的蛋白质纯化手段，也可应用于本发明蛋白的纯化与分离。

本发明实施例中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的表达为组成型表达，主要分布于菌体裂解液的上清液中，对菌体进行破碎分离可以获得菌体内部的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。

本发明实施例中使用了油性佐剂与乳化剂制备疫苗，本领域疫苗制备中其他的佐剂与添加剂也可以应用于本发明疫苗的制备中。

本发明实施例中所述的Cap蛋白为去除N端41个氨基酸残基的截短型Cap蛋白。本发明实施例中所述截短型Cap蛋白为可溶性表达，不需要进行蛋白的变性和复性。使用本发明之方法，通过摇瓶优化试验，Cap蛋白的表达量可达到100mg/L。本发明实施例中所述截短型Cap蛋白经发酵优化培养后，Cap蛋白的表达量可达到150mg/L。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1：猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗的制备方法

1、克隆猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因到表达载体，获得重组表达载体。

①引物的设计

以PCV2-SH毒株核酸序列为参考(GenBank:AY686763)，应用Oligo6.0引物设计软件设计猪圆环病毒2型截短型Cap基因特异引物，上游引物：酶切位点NcoI 5′-CATGCCATGGTGAATGGCATCTTC-3′；下游引物：酶切位点HindIII 5′-CCCAAGCTTTTAAGGGTTAAGT-3′，PCR扩增目的基因长度为585bp。

②PCV2病毒核酸的提取

1ml DNAzol Reagent(Invitrogen

)加入0.1ml的保藏号CGMCCNo.2389的PCV2-SH病毒株样品，将离心管上下颠倒摇匀；室温下静置5min；4℃离心(10,000r/min、10min)后，将上清液移至新离心管；向其中加入0.5ml无水乙醇，上下颠倒混匀后室温下静置5min，4℃离心(4000r/min、2min)后，静置1min，然后吸去管内液体；向试管中加入1ml 75％乙醇，上下颠倒混匀3-6次后，静置1min，吸去乙醇，此步骤至少重复两次后，让样品在空气中自然干燥(5min)；于离心管中缓慢加入30μl 8mmol/L NaOH溶解DNA，然后在-20℃下贮存备用。

③PCV2Cap蛋白基因的PCR扩增并连接载体pMD 18-T。

以PCV2 DNA为模板，用设计的引物将目的基因进行PCR扩增。将PCV2 Cap蛋白基因连接到pMD 18-T载体中，命名为pMD 18-T-Cap质粒。以NcoI与HindIII双酶切鉴定及M13引物进行测序，鉴定PCR扩增基因的正确性。PCR结果见图1，其中M1为DNA Marker DL2000；M2为DNA Marker DL15000；泳道1为pMD18-T-Cap质粒双酶切后产物。由电泳图谱与测序结果可知，重组连接载体中PCV2截短型Cap蛋白基因含序列表中的SEQ ID NO1序列。

④构建含猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因的表达载体pKK233-2-Cap和基因工程菌。

用NcoI与HindIII双酶切pMD18-T-Cap质粒，用胶回收试剂盒回收猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因片段。与同样经过NcoI与HindIII双酶切pKK233-2质粒(购自Pharmacia公司)的胶回收目的片段进行连接，构建表达载体pKK233-2-Cap。用NcoI与HindIII双酶切及测序鉴定。

2、重组表达载体pKK233-2-Cap转化大肠杆菌DH5α，获得基因工程菌DH5α/pKK233-2-Cap。

将鉴定后的阳性重组表达质粒pKK-233-2-Cap转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性基因工程菌DH5α/pKK-233-2-Cap，并用15％甘油进行菌种保存。

3、重组表达载体pKK233-2-Cap在发酵罐中的优化培养，表达截短型Cap蛋白。

①基因工程菌的活化及猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的鉴定

将基因工程菌DH5α/pKK233-2-Cap挑取单菌落，接入3ml的含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，于37℃培养过夜。取50μl过夜培养液接入5ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，于30℃培养18h。取1ml培养液，室温12,000r/min离心1min，沉淀重新悬于100μl的1×SDS凝胶上样缓冲液，于100℃加热3min，室温12,000r/min离心1min，取40μl的悬液上样于12％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行鉴定。电泳完毕后考马斯亮蓝染色观察表达产物条带。电泳图谱见图2。其中，1为空宿主菌；2和3为DH5α/pKK233-2-Cap蛋白；M为蛋白质Marker。由图可知，DH5α/pKK233-2-Cap蛋白大小与预测蛋白一致。经测序可知，重组猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白序列含序列表中的SEQ ID NO2序列。

②基因工程菌的摇瓶培养试验

参考对重组基因工程菌DH5α/pKK-233-2-Cap在摇瓶中培养条件的优化，进一步扩大到对发酵罐中培养条件的优化。在摇瓶中首先进行培养基的初步筛选，主要对培养基中的碳源、氮源和无机磷酸盐的选择进行比较，最后利用正交试验，获得这几种元素的最佳配比量。

培养基配方为：葡萄糖1％，乙酸钠1％，蛋白胨2％，酵母膏1％，硫酸按0.5％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钠0.2％，磷酸氢二钾0.1％。

按上述培养基配方，对培养温度、pH值、装样量进行了细致优化。其中分别选定培养温度为25，28，30，33，37℃；所取pH值分别为6.4，6.8，7.2，7.6，8.0；分别采取10％，20％，30％，40％和50％的装样量以及120r/min，150r/min，180r/min和210r/min的转速对工程菌进行培养；分别在培养10h，12h，14h，16h，18h和20h取样进行SDS-PAGE。电泳结果显示：在最佳培养条件下，即培养温度37℃，pH值7.2，20％装样量，转速为120r/min时，猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的表达量可达到100mg/L。电泳结果见图4。其中，1为DH5α/pKK-233-2-Cap蛋白优化后样品；2为DH5α/pKK-233-2阴性对照样品；M为蛋白质Marker。

③发酵罐培养试验

在基本确定摇瓶培养条件后，将该优化后条件扩大到发酵罐中进行发酵罐条件的进一步优化。在10L生物反应器中加入7L培养基，121℃灭菌，接种量10％，通气量3L/min。通过流加1.5mol/L NaOH和1.0mol/L HCl控制发酵液中的pH为7.0。通过调节搅拌转速为400-500r/min，使溶解氧浓度保持在30％以上。培养12h后，流加补料培养基，配方为：甘油1％，乙酸钠1％，蛋白胨5％，酵母膏2.5％，硫酸铵1％。培养18h，猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的表达量最高可达到150mg/L。

4、分离纯化截短型Cap蛋白。

本发明实施例中步骤猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的具体纯化方法如下：

收集发酵表达的DH5α/pKK-233-2-Cap菌体及发酵液上清，4℃条件下以12,000r/min，15min离心菌体沉淀。将收集到的菌体用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤沉淀，按1/10体积用PBS重新悬浮进行超声裂解(200W、工作5sec、间隔5sec)，超声裂解结束后用12,000r/min离心30min收获菌体裂解上清中的可溶性蛋白。向菌体裂解上清中依次加入不同体积的饱和硫酸铵溶液，于4℃条件下过夜沉淀。4℃条件下以12,000r/min，10min离心过夜沉淀的蛋白。将离心后的沉淀用一定体积的PBS缓冲液(pH7.4)重新溶解，用PBS透析3天，取出-20℃保存。经硫酸铵沉淀后的蛋白中含有少量杂蛋白，因此采用葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-100，SIGMA)对目的蛋白进行更进一步的纯化。具体方法如下：将注射器装满结合Buffer，将层析柱与注射器连接，用10ml结合Buffer平衡层析柱。用注射器将样品以0.5ml/min的流速加入柱中，用20ml结合Buffer洗柱，流速为1.5ml/min，直到没有任何样品流出。用5ml洗涤Buffer以1ml/min洗柱，洗下溶液分别测OD₂₆₀和OD₂₈₀，计算纯化蛋白浓度。取部分样品重新悬于100μl的1×SDS凝胶上样缓冲液，于100℃加热3min，室温12,000r/min离心1min，取40ul的悬液上样于12％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行鉴定。电泳完毕后考马斯亮蓝染色观察表达产物条带，结果见图3。其中，1-3为DH5α/pKK-233-2-Cap蛋白过柱子后样品；M为蛋白质Marker。

5、加入佐剂，制备猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。

将分离纯化后的去NLS Cap蛋白溶液，按照一份蛋白溶液加2份油乳剂的比例，分散制成油乳剂疫苗。其中，油乳剂为白油、司本和硬脂酸铝，其比例是94∶4.5∶1.5。油化剂和蛋白抗原按照2∶1比例混合后，使用乳化机15,500r/min乳化5min。

实施例2：猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗的效力与生物学检验

将实施例1中制备的油乳剂疫苗按照兽用生物制品规程要求进行成品疫苗的检验，主要对成品疫苗进行性状检验、安全检验、效力检验、甲醛及硫柳汞残留量测定。结果显示：抽检样品外观均一，无霉菌生长；安全检验和效力检验均符合要求；甲醛及硫柳汞残留量也符合要求。用检验合格的制品进行临床试验——仔猪攻毒试验。

①安全性试验

用PCV2Cap疫苗2倍剂量(4ml/头)肌肉接种25日龄仔猪5头(由江苏某猪场提供)，临床观察28天无异常反应，证明该疫苗制品对本动物是安全的。

②仔猪攻毒试验

分别采用0.5ml、1.0ml、2.0ml和4.0ml四种免疫剂量免疫25日龄PCV2抗体阴性仔猪(由江苏某猪场提供)，每组5头，同时设未接种疫苗对照猪3头。在疫苗免疫后28天，所有免疫过的猪只抗体检测全部阳性(待检血清OD₄₅₀值/阴性血清OD₄₅₀值≥2.1为阳性)。首免后第5周用强毒(PCV2-SH强毒10^6.0TCID₅₀/ml)攻击，每头猪滴鼻1ml，肌肉注射2ml。试验结果表明：1.0ml、2.0ml和4.0ml免疫组均可获得5/5保护，0.5ml免疫组的保护率为4/5。

实施例3猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的免疫原性鉴定及在制备PCV2的检测试剂中的应用

①Western-blot试验

将纯化后的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白进行Western-blot鉴定。截短型PCV2 Cap蛋白的分子量约为22.5Ku，与猪圆环病毒2型阳性血清反应呈阳性结果；与阴性血清反应呈阴性结果；与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪肺疫、猪伪狂犬、猪细小病毒病阳性血清无反应，结果见图5。其中，1-6分别猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪肺疫、猪伪狂犬、猪细小病毒病阳性血清以及猪圆环病毒2型阴性血清反应结果；7为猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；M为蛋白质Marker。

②检测猪圆环病毒2型抗体间接ELISA的建立及其标准化

经方阵试验确定纯化后猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白，标准阳性血清以及标准阴性血清的最佳包被浓度。最终确定的最佳抗原工作浓度为30μg/ml，血清最佳稀释倍数为1∶50。使用最佳包被浓度包被ELISA板37℃作用1小时，4℃过夜。PBST洗涤三次后，0.15％BSA封闭，37℃作用2小时。PBST洗涤三次，加入待检样品以及标准阴、阳性血清，37℃作用1小时。PBST洗涤三次，加入兔抗猪IgG(DAKO)作用1小时。加入OPD显色缓冲液，显色15分钟，2mol/L硫酸终止反应，测定OD₄₉₀值。最后，运用建立的该方法检测来自河南、河北，山东等地的276份待检样品，并将检测结果与IFA检测结果进行比较，结果显示两种方法的符合率可达到97％以上。从而证明，猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白可用于PCV2临床样品的检测。具体比较结果见表1。

表1 Cap-ELISA和IFA检测样品结果比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)克隆猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白基因到表达载体质粒pKK233-2中，获得重组表达载体pKK233-2-Cap，其中猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白为去除N端41个氨基酸残基的截短型Cap蛋白；

(2)所述重组表达载体pKK233-2-Cap转化大肠杆菌，获得基因工程菌；

(3)所述基因工程菌进行发酵培养，表达猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白；

(4)回收基因工程菌菌体破碎后的上清液，分离纯化猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述大肠杆菌为DH5α。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述重组基因工程菌为DH5α/pKK233-2-Cap。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述基因工程菌表达猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白为组成型表达。

5.一种猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白，其特征在于，所述蛋白由权利要求1-4任意一项所述方法制备。

6.如权利要求5所述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白在制备疫苗中的应用。

7.一种猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，由权利要求5所述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白中，加入佐剂，获得猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。

8.一种根据权利要求7所述的方法制备的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白疫苗。

9.如权利要求5所述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白在制备诊断试剂中的应用。

10.一种猪圆环病毒2型相关疾病诊断试剂的制备方法，其特征在于，使用酶联免疫吸附试验检验被试样品，其中，酶联免疫吸附试验的抗原为使用权利要求5所述的猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。

11.一种由权利要求1-4任意一项所述方法构建的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌可表达猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白。

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