CN103204942A

CN103204942A - 猪圆环病毒ⅱ型基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103204942A
Application number: CN2013100500031A
Authority: CN
Inventors: 荣俊; 杜元钊; 范根成; 韩建文; 蔡联燊
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2013-02-08
Filing date: 2013-02-08
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2033-02-08
Also published as: CN103204942B

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用。其中，猪圆环病毒II型疫苗包括可溶性融合蛋白，该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。应用本发明的技术方案制备的猪圆环病毒II型疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，对猪等动物没有致病性。并且，本发明的疫苗抗原通过大肠杆菌表达，因此制备过程相对简单，成本低。

Description

猪圆环病毒Ⅱ型基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体而言，涉及一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用。

背景技术

1991年加拿大John Harding报道了断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，后经研究证实猪圆环病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)是该综合征的主要病原。

现有研究表明，猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease，PCVD)是由PCV2感染而引起的一种临床综合征，其主要症状表现为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴结炎及肾炎等。猪圆环病毒II型主要侵害5-12周龄断奶仔猪，而且与近年来发生的PMWS、猪皮炎与肾炎综合症(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、A2型先天性振颤(congenital tremor，CT)、猪增生性和坏死性肺炎(Porcine Proliferative and necrotizing Pneumonia，PNP)、繁殖障碍(Reproductive failure)等疾病都有密切关系。PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，经常以亚临床感染的形式出现，易被忽视。由于PCV2感染使免疫系统受到损害，容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病呈世界流行，从2000年我国首次发现存在此病以来，已给我国养猪业造成了相当大的经济损失。

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)在分类学上属圆环病毒科、圆环病毒属，是已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径约17nm，呈20面体对称结构，无囊膜。PCV具有两个基因型，即：PCV1、PCV2，基因组大小约为1.76kb，含有2个主要阅读框架，其中ORF1基因产物与病毒复制酶(Rep)相关，ORF2基因产物是构成病毒衣壳蛋白(Capsid protein，简称：cap)的成分。PCV1是由Tischer等1974年首次在PK15细胞培养物中发现，对猪无致病性。PCV2是于1991年首次在加拿大猪群中发现。1998年证实该病毒具有感染性和致病性，是养猪业需要防治的病毒类型。但由于PCV2在体外培养时不产生细胞病变，病毒增殖能力差，采用传统的方法制备该病毒疫苗非常困难。

用基因工程的方法制备猪圆环病毒II型(PCV2)疫苗是控制该病的重要途径。尽管目前市场上已有杆状病毒表达的PCV2基因工程亚单位疫苗的供应，但人们仍在寻求新的低成本的PCV2疫苗的制备方法。

发明内容

本发明旨在提供一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗、及其制备方法和应用，以提供一种新的猪圆环病毒II型亚单位疫苗及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种可溶性融合蛋白。该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。

进一步地，定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下至少一组氨基酸残基位点：1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；4)第186位；5)第222位。

进一步地，定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下氨基酸残基位点：6)第97，99，116位；或7)第97，99，180，186位。

进一步地，定位信号区域剪切包括猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因5’端剪切掉39～159bp的DNA链；优选地，69～123bp；优选地，105bp。

根据本发明的另一个方面，提供上述可溶性融合蛋白在制备猪圆环病毒II型疫苗中的应用。

根据本发明的再一个方面，提供编码上述可溶性融合蛋白的DNA序列。

根据本发明的又一个方面，提供一种载体。该载体包含上述编码可溶性融合蛋白DNA序列。

根据本发明的又一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述载体。

进一步地，该宿主细胞保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为武汉市武汉大学)，保藏编号为CCTCC M2012474；保藏日期2012年11月23日，分类命名Escherichia coli BL21/pET28a PCV2MNdX Cap(埃希氏菌属，大肠杆菌种)。

根据本发明的又一个方面，提供一种猪圆环病毒II型疫苗。该疫苗包括上述可溶性融合蛋白。

进一步地，该疫苗包括佐剂，佐剂包括氢氧化铝胶和CpG-DNA。

根据本发明的又一个方面，提供上述疫苗的制备方法。该制备方法包括通过上述宿主细胞培养、提取抗原蛋白，然后添加佐剂制备而来。

根据本发明的又一个方面，提供上述猪圆环病毒II型疫苗在预防猪圆环病毒II型引起的猪相关疾病中的应用。

进一步地，对21日龄的猪进行免疫注射。

应用本发明的技术方案制备的猪圆环病毒II型疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，且对猪等动物没有致病性。使用该疫苗免疫后的猪只增重明显提高，呼吸道疾病明显减少。并且，本发明的疫苗通过大肠杆菌表达，因此制备过程相对简单，成本低。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明实施例的变异体筛选的工程菌E.coli.BL21/pET28a-PCV2MNd Xcap诱导表达产物的SDS-PAGE结果图，其中，1泳道为E.coli.BL21/pET28a(空白对照)上清，2泳道为E.coli.BL21/pET28a PCV2MNd X cap全菌，3泳道为E.coli.BL21/pET28a PCV2MNd Xcap全菌，4泳道为E.coli.BL21/pET28a PCV2MNd X cap上清，5泳道为E.coli.BL21/pET28aPCV2MNd X cap上清，M为蛋白marker；以及

图2示出了根据本发明实施例的蛋白纯化产物电泳结果，其中，M泳道为蛋白质低分子量标记物；l泳道为DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱液；2泳道为20％-40％饱和度硫酸铵沉淀蛋白。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

在重组疫苗研究中PCV2的Cap蛋白基因是最为重要的备选基因，因为Cap蛋白是该病毒主要的结构蛋白，含有型特异性抗原决定簇。有研究资料报道，PCV2的中和性单克隆抗体和多克隆猪抗血清都能与Cap蛋白相识别和发生中和反应。在基因工程疫苗中，重组基因工程亚单位疫苗是最为安全的疫苗，而且其免疫的效果也最为确定，只要抗原蛋白的量足够大就能产生相应的特异性抗体。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种可溶性融合蛋白。该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型(PCV2)衣壳蛋白(cap)基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，使基因中编码序列变短，删除部分或全部信号区域甚至部分N端序列。使精氨酸残基的稀有密码子变成能在大肠杆菌中很好表达的密码子，使该基因片段更适合于在大肠杆菌中表达。基因改造综合作用的结果是，表达产物具有天然cap蛋白的免疫原性，且在中性pH的缓冲溶液中有很好的溶解性。与传统的疫苗制备方法相比，在大肠杆菌中表达制备疫苗其制备工艺相对简单，成本低，且抗原纯度高、安全性好，免疫原性强。

对信号区域剪切可以是对猪圆环病毒II型衣壳蛋白全基因删除不同长度核苷酸序列，优选地，定位信号区域剪切包括猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因5’端剪切掉39～159bp的DNA链；更优选地，69～123bp；进一步优选地，105bp。

根据本发明一典型的实施方式，表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白的核苷酸序列的获得系用PCV2-FJ株，进行ORF2全基因克隆，然后对该基因进行5’端剪裁不同长度核苷酸序列后的剩余基因片段，它们分别为：Ndl3cap gene，Nd23cap gene，Nd35cap gene，Nd41cap gene，Nd53cap gene(剪切核苷酸数目见表1)用这些基因片段作为进一步改造用基因。

表1

注：诱导表达产物SDS-PAGE电泳后，经Biorad GelDoc XR凝胶成像分析系统中的Quantity One 1-D软件分析，表达蛋白占可溶性蛋白总量的百分比；SDS-PAGE检测表达蛋白相对含量(％)，指表达蛋白占可溶蛋白总量的百分比。

优选地，定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下至少一组氨基酸残基位点：1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；4)第186位；5)第222位；其中较优选的部位是：1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；最优选的部位是：第97和第99位。当然，这些位点的突变也可以联合使用，可以将最优选的定点变异部位(第97和第99位)与116位定点变异位点进行组合(即6，第97，99，116位联合突变)，或与180位和186位定点变异位点进行组合(即7，第97，99，180，186位联合突变)变异操作；最优的组合是：第97和第99位变异与第116位的组合(即6)第97，99，116位)。

将以上7种突变后的表达菌，按菌体湿重的10倍加生理盐水，超声波破碎后，12000转/分离心15分钟后取上清，用琼脂双向免疫扩散实验(AGP)进行抗原滴度检测。结果如下表2：

表2

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述载体。优选地，该宿主细胞是BL21，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012474。该宿主细胞经过生物工程方法的诱导能表达出可溶性重组猪圆环病毒II型衣壳蛋白。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种猪圆环病毒II型疫苗。该疫苗包括上述可溶性融合蛋白。

由于原核细胞表达的抗原蛋白比较单一，配合佐剂的使用可以达到更好的免疫效果。由于疫苗使用的对象是猪，而猪对内毒素和油性佐剂反应很大，因此，采用氢氧化铝胶佐剂为主要佐剂，配合使用CpG-DNA，构成复合佐剂，弥补单纯铝胶佐剂免疫增强作用不佳的缺点。根据本发明一种典型的实施方式，该疫苗是大肠杆菌表达猪圆环病毒II型(PCV2)衣壳蛋白、氢氧化铝胶和CpG-DNA的均质物。

进一步地，对21日龄的猪进行免疫注射，可使免疫猪产生针对猪圆环病毒II型的抗体，该抗体可使受免疫猪产生对猪圆环病毒II型感染的抵抗力。

根据本发明一种典型的实施方式，疫苗的制作具体包括如下步骤：

将PCV2 Cap蛋白基因5’端删除105bp的DNA链进行第97、第99位、第116位氨基酸残基的变异操作(AGA或AGG变异为CGC)。然后，将剪接并修饰后的基因连接到pET28a质粒载体上，然后转化大肠杆菌BL21细胞。构建成重组PCV2 Cap蛋白表达工程菌命名为：E.coli BL21/pET28a-MNd X Cap。

用发酵培养的方法生产表达工程菌，待OD值达1.4左右时加入诱导剂α-乳糖至工作浓度为30mmol/L。诱导培养5小时。收菌后用超声波破碎或用高压均质机破碎至98％以上菌体破碎。去除细菌碎片和不溶性沉淀，收集含重组cap蛋白的上清液。

将诱导表达生产的可溶性猪圆环病毒cap蛋白用分段硫酸铵沉淀的方法进行分离，该方法的核心是用生理盐水溶解表达产物后，收集10％-50％饱和度之间的硫酸铵沉淀。优化的是20-40％之间的沉淀。将沉淀用0.05M磷酸缓冲液复溶后，用Sephadex G25进行除盐后，进行DEAE离子交换层析。

疫苗佐剂采用氢氧化铝胶加CpG-DNA复合佐剂。复合佐剂成份为(工作浓度)：每升复合佐剂中含氢氧化铝(以Al³⁺计)：360-440mg，CpG-DNA：5000-10000OD(TaKaRa合成)。

疫苗的配制方法：

1)抗原蛋白的准备。将纯化的表达蛋白用灭菌生理盐水稀释，用抗PCV2多克隆抗血清进行琼脂双向扩散检测(AGP)，其抗原含量的琼扩效价应≥1∶8；

2)5×氢氧化铝胶-CpG DNA复合佐剂工作液制备(以1升计算)取2.5万-5.0万OD的CpG DNA用灭菌生理盐水200ml溶解，并过滤除菌。加入Al³⁺浓度为9.0-11.0mg/ml氢氧化铝胶原液200ml。然后加生理盐水至1000ml。

3)取4份抗原蛋白液加1份5×氢氧化铝胶-CpG复合佐剂工作液混合，充分混匀。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例

一、PCV2cap蛋白基因的克隆载体的构建

1材料与方法

1.1病料DNA的提取

取猪圆环病毒感染后病死猪的腹股沟淋巴结样品0.5g，加无菌生理盐水4.5ml，置于玻璃匀浆器中制成匀浆。取472μl淋巴结匀浆液，加入25μl10％SDS和2.5μl蛋白酶K(25mg/ml)，置于50℃水浴作用2小时，加入500μl水饱和酚，涡旋30秒，置12000rpm离心10分钟。将上清移入另外一支离心管中，加500μl的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)混合后置12000rpm离心10分钟。取上清，按1/10体积加入3mol/L醋酸钠(pH值5.3)，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃冰箱中30分钟。以15000rpm离心10分钟，弃上清后加入70％乙醇1ml洗涤沉淀，以15000rpm离心10分钟，弃上清，真空干燥DNA沉淀。使用前加入30μl双蒸水溶解，置-20℃冰箱中保存备用。

1.2PCR扩增PCV2cap蛋白基因

1.2.1试剂

第一套引物(外套引物)

Out capP1

5′CGC TTC TTC CAT TCT TTT TGC TGG3′

Out cap P2

5′GTG GAA CTG TAC CTT TTT TGG CCC3′

扩增体系如下：

1、10×PCR Buffer 2.5μl

2、dNTPs 0.25μl

3、Out cap P1(10μmol/L) 1.0μl

4、Out cap P2(10μmol/L) 1.0μl

5、Taq酶 0.1μl

6、病料总DNA 1μl

7、加水补至 25μl

PCR扩增温度循环参数：

04℃，5min→

(94℃，45S，→60℃，45S，→72℃，90S)×30cycles→

72℃，10min。

电泳检测后用第二套引物进行二次扩增。

第二套引物(PCV2cap蛋白全基因)

Pcv2capP1

5′GGA TCC ATG ACG TAT CCA AGG AGG CGT3′(BamH I)

Pcv2capP2

5′aag ctt TCA TTA AGG GTT AAG TGG GGG3′(Hind III)

扩增体系：

1、水 15.7μl

2、10×PCR Buffer 2μl

3、dNTPs 0.2μl

4、Pcv2 cap P1(10μmol/L) 1μl

5、Pcv2 cap P2(10μmol/L) 1μl

6、Taq酶 0.1μl

7、前步扩增产物DNA 1μl

温度循环参数：

94℃，5min→

(94℃，45S，→64℃，45S，→72℃，60S)×30cycles→

72℃，10min。

电泳回收702bp的扩增带，并挂接到pMD-18T质粒载体上。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后用限制性核酸内切酶(BamH I/Hind III)消化质粒DNA，电泳检测鉴定重组质粒。然后将鉴定正确的转化菌送至北京三博远志生物技术有限公司进行序列测定。

2pMD18T-PCV2cap质粒目的基因测序结果及推测的氨基酸排列次序如下：

Max ORF starts at AA pos1(may be DNA pos1)for 233 AA(699bases)，MW＝27803

Total amino acid number：233，MW＝27803

10 20 30 40 50 60

1 ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGC

1 M T Y P R R R Y R R R R H R P R S H L G

70 80 90 100 110 120

61 CAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGG

21 Q I L R R R P W L V H P R H R Y R W R R

130 140 150 160 170 180

121 AAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACC

41 K N G I F N T R L S R T F G Y T I K R T

190 200 210 220 230 240

181 ACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTT

61 T V K T P S W A V D M M R F N I N D F L

250 260 270 280 290 300

241 CCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAG

81 P P G G G S N P R S V P F E Y Y R I R K

310 320 330 340 350 360

301 GTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCC

101 V K V E F W P C S P I T Q G D R G V G S

370 380 390 400 410 420

361 AGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCC

121 S A V I L D D N F V T K A T A L T Y D P

430 440 450 460 470 480

421 TATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTAC

141 Y V N Y S S R H T I T Q P F S Y H S R Y

490 500 510 520 530 540

481 TTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGA

161 F T P K P V L D S T I D Y F Q P N N K R

550 560 570 580 590 600

541 AATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACT

181 N Q L W L R L Q T A G N V D H V G L G T

610 620 630 640 650 660

601 GCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAA

201 A F E N S I Y D Q E Y N I R V T M Y V Q

670 680 690 700

661 TTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTTAA

221 F R E F N L K D P P L N P *

二、PCV2cap蛋白基因的剪接及表达筛选

材料与方法

PCV2全基因保存载体：pMD18T-PCV2cap

限制性核酸内切酶：BamH I；Hind III

设计引物对PCV2cap蛋白N端序列的基因进行剪接。引物见下表3：

表3

注：在N端剪接引物3中引入了2个定点变异密码子，分别由AGA变为和由AGG变为

PCR反应体系：

1、水 15.6μl

2、10×PCR Buffer 2μl

3、dNTPs 0.2μl

4、N端剪接引物(1-5) 1μl

5、下游引物 1μl

6、Taq酶 0.1μl

7、pMD18T-PCV2 cap DNA 0.1μl

电泳回收扩增带，并连接到pMD-18T质粒载体上。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后用限制性核酸内切酶(BamH I/Hind III)消化质粒DNA，电泳检测鉴定重组质粒。分别依次命名为：pMD-18T PCV2Nd V cap，pMD-18T PCV2Nd W cap，pMD-18T PCV2Nd X cap，pMD-18T PCV2Nd Y cap，pMD-18T PCV2 Nd Z cap。

将5种PCV2cap蛋白基因N末端剪质粒pMD-18T PCV2Nd V cap，pMD-18T PCV2Nd Wcap，pMD-18T PCV2Nd X cap，pMD-18T PCV2Nd Y cap，pMD-18T PCV2Nd Z cap。分别用限制性核酸内切酶(BamH I/Hind III)进行消化，并与同样酶线性化的表达质粒pET28a进行连接。

连接产物分别命名为：pET28a-PCV2NdV cap，pET28a-PCV2NdW cap，pET28a-PCV2NdXcap，pET28a-PCV2NdY cap，pET28a-PCV2NdZ cap。

用连接产物转化大肠杆菌BL21，筛选转化子。构建成5种PCV2抗原蛋白表达工程菌。进行诱导表达实验，诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。诱导表达产物SDS-PAGE电泳后，经Biorad GelDoc XR凝胶成像分析系统中的Quantity One1-D软件分析，表达蛋白占可溶性蛋白总量的百分比；SDS-PAGE检测表达蛋白相对含量(％)，指表达蛋白占可溶蛋白总量的百分比。检测结果显示，在同等条件下工程菌E.coli.BL21/pET28a-PCV2NdX cap的诱导表达产物最高。

三、PCV2cap蛋白基因的定点变异的导入及变异基因的筛选

(一)、PCV2cap蛋白基因的定点变异的导入

材料与方法：

以pMD-18T PCV2Nd X cap质粒为模板，用TaKaRa MutanBEST Kit进行基因的点突变操作。根据试剂盒的要求设计变异导入引物和对应引物，见表4。

表4

注：表中

为引入变异的密码子序列。

定位变异的操作过程按照试剂说明书的要求进行，参数可根据实际情况修改。简要操作过程如下：

1、在第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入

PCR反应(25μl体系)

PCR温度循环参数：

(94℃30s，60℃30s，72℃5min)×35Cycles

用1％琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。切胶回收目的基因片段。

扩增产物的末端平滑及5′未端磷酸化反应

置37℃反应10分钟，然后转入70℃反应10分钟。

连接反应：

取5μl扩增产物的末端平滑及5′未端磷酸化反应液于一只新的微量离心管中，加入5μl的Ligation Solution I，均匀混合。置于16℃水浴反应1小时。

将全量连接反应液转至100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中(全式金公司生产)。进行化学转化。转化菌提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定后，送交三博远志生物公司进行序列测定。正向测序成功后进行一次反向测定和一次重复测定。三次测定的结果确定其核酸序列。测序结果显示：第97位和第99位氨基酸残基的编码序列由原序列的AGA变异为CGC。质粒命名为：pMD-18T PCV2M1Nd X cap。

2、第116位氨基酸残基编码基因突变的导入

PCR过程中引物变为引物3#和引物4#之外，其它操作与第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入过程相同。测序结果显示：第116位氨基酸残基的编码基因由AGG变异为CGC。质粒命名为：pMD-18T PCV2M2Nd X cap。

3、第180位氨基酸残基编码序列变异的导入。

PCR过程中引物为引物5#和引物8#，其它操作与第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入过程相同。测序结果显示：第180位氨基酸残基编码序列由AGA变异为CGC。质粒命名为：pMD-18T PCV2M3Nd X cap。

4、第186位氨基酸残基编码序列变异的导入

除在PCR过程中引物变为引物6#和引物8#之外，其它操作与第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入过程相同。测序结果显示：第186位氨基酸残基编码序列由AGA变异为CGC。质粒命名为：pMD-18T PCV2M4Nd X cap。

5、第222位氨基酸残基编码序列变异的导入

除在PCR过程中引物变为引物9#和引物10#之外，其它操作与第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入过程相同。测序结果显示：第222位氨基酸残基编码序列由AGA变异为CGC。质粒命名为：pMD-18T PCV2M5Nd X cap。

6、第97，99，116位氨基酸残基编码序列变异的导入

以第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入成功并测序正确的质粒为扩增模板，以引物3#和引物4#为扩增引物，进行PCR扩增。其它操作同第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入过程。测序结果显示：第97，99位氨基酸残基的编码序列由AGA变异为CGC，第116位氨基酸残基的编码序列由AGG变为CGC。质粒命名为：pMD-18TPCV2M6NdX cap。

7、第97，99，180，186位氨基酸残基编码序列变异的导入

以第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入成功并测序正确的质粒为扩增模板，以引物7#和引物8#为扩增引物，进行PCR扩增。其它操作同第97和99位氨基酸残基的编码基因突变的导入过程。测序结果显示：第97，99，180，186位氨基酸残基的编码序列由AGA变异为CGC。质粒命名为：pMD-18T PCV2M7Nd X cap。

(二)、变异体的筛选

将以上7种定点变异质粒，即：pMD-18T PCV2M1Nd X cap，pMD-18T PCV2M2Nd X cap，pMD-18T PCV2M3Nd X cap，pMD-18T PCV2M4Nd X cap，pMD-18T PCV2M5Nd X cap，pMD-18T PCV2M6Nd X cap，pMD-18T PCV2M7Nd X cap，分别用限制性核酸内切酶(BamHI/HindIII)进行消化，并与同样酶线性化的表达质粒pET28a进行连接。

连接产物分别命名为：pET28a-PCV2M1Nd X cap，pET28a-PCV2M2Nd X cap，pET28a-PCV2M3Nd X cap，pET28a-PCV2M4Nd X cap，pET28a-PCV2M5Nd X cap，pET28a-PCV2M6Nd X cap，pET28a-PCV2M7Nd X cap。

用连接产物转化大肠杆菌BL21，筛选转化子。构建成7种PCV2抗原蛋白表达工程菌。进行诱导表达实验，诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。诱导产物用SDS-PAGE和琼脂双向免疫扩散实验(AGP)进行检测。

注：检测多克隆抗血清的制备和检验

取21日龄健康易感仔猪(PCV2ELISA和PCV2cap基因的PCR检测均为阴性)，用病毒含量最高的PCV2-FJ株第5代病毒培养物进行攻毒，每头滴鼻1毫升，肌肉注射2毫升。28天后，提取血清用ELISA试剂盒检测抗体。

检测结果显示，在同等条件下由pET28a-PCV2M6Nd X cap构建的工程菌的诱导表达产物在溶液上清中溶解最好且抗原滴度最高。(SDS-PAGE结果见图1，其中，1为E.coli.BL21/pET28a上清，2为E.coli.BL21/pET28a PCV2MNd X cap全菌，3为E.coli.BL21/pET28a PCV2MNd X cap全菌，4为E.coli.BL21/pET28a PCV2MNd X cap上清， 5为E.coli.BL21/pET28a PCV2MNd X cap上清，M为蛋白marker)将此工程菌命名为：E.coli.BL21/pET28a-PCV2MNdX cap。

剪接及变异修饰后的PCV2MNd X cap基因序列及推断的氨基酸序列如下：

106 TACCGCTGGCGCCGC

36 TyrArgTrpArgArg

121 AAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACC

41 LysAsnGlyIlePheAsnThrArgLeuSerArgThrPheGlyTyrThrIleLysArgThr

181 ACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTT

61 ThrValLysThrProSerTrpAlaValAspMETMETArgPheAsnIleAsnAspPheLeu

241 CCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACCGCATACGCAAG

81 ProProGlyGlyGlySerAsnProArgSerValProPheGluTyrTyrArgIleArgLys

301 GTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACCGCGGAGTGGGCTCC

101 ValLysValGluPheTrpProCysSerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGlySer

36l AGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCC

121 SerAlaValIleLeuAspAspAsnPheValThrLysAlaThrAlaLeuThrTyrAspPro

421 TATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTAC

141 TyrValAsnTyrSerSerArgHisThrIleThrGlnProPheSerTyrHisSerArgTyr

481 TTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGA

161 PheThrProLysProValLeuAspSerThrIleAspTyrPheGlnProAsnAsnLysArg

541 AATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACT

181 AsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrAlaGlyAsnValAspHisValGlyLeuGlyThr

601 GCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAA

201 AlaPheGluAsnSerIleTyrAspGlnGluTyrAsnIleArgValThrMETTyrValGln

661 TTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTTAA

221 PheArgGluPheAsnLeuLysAspProProLeuAsnPro***

四、PCV2基因工程亚单位疫苗制备用cap蛋白的纯化

1、发酵培养及诱导表达：

用发酵培养的方法生产E.coli.BL21/pET28a-PCV2MNdX cap。待OD值达1.4左右时加入诱导剂α-乳糖至工作浓度为0.03mol/L。诱导培养5小时。

2、菌体裂解

用0.85％生理盐水将表达菌按1∶15复溶，充分溶解，使用超声波裂解200次，功率65％，裂解60S，停20S，裂解完毕后，进行镜检，确定98％以上的菌体裂解完全。

3、硫酸铵分级沉淀

(1)往上裂解液中加入20％比例的饱和硫酸铵(注：按25℃硫酸铵沉淀表，以下均为25℃，不作特别注明)；

(2)4℃沉淀12h以上，17000rpm连续流离心，进液速度为200mL/min；

(3)收集上清液，加入40％比例的饱和硫酸铵；

(4)4℃沉淀12h以上，17000rpm连续流离心，进液速度为150mL/min；

(5)收集沉淀。

4、纯化蛋白复溶

用0.85％生理盐水将3次纯化后PCV-2蛋白按1∶20复溶，充分溶解。

5、脱盐柱层析

将复溶的PCV2蛋白液上样于Sephadex G25层析柱，洗脱液是0.05M，pH7.0磷酸缓冲液。收集漏出蛋白峰。

6、离子交换层析分离

将脱盐回收的蛋白液用离子交换柱：DEAE Sepharose FastFlow进行纯化。洗脱液A：0.05MpH7.0磷酸缓冲液；洗脱液B：0.05M磷酸缓冲液，pH7.0，含有1mol氯化钠。进行线性梯度洗脱，用AGP检测洗脱液，收集抗原蛋白的洗脱峰。

7、硫酸铵沉淀及复溶

将上述收集液集中后加硫酸铵至40％饱和度，离心沉淀后用1∶50重量比的生理盐水复溶，AGP法测定抗原效价。

图2示出了蛋白纯化产物电泳结果，其中，M泳道为蛋白质低分子量标记物；1泳道为DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱液；2泳道为20％-40％饱和度硫酸铵沉淀蛋白

五、猪圆环病毒PCV-2基因工程亚蛋白疫苗的配制

以纯化抗原蛋白效价为1∶64(AGP)，PCV-2基因工程亚单位疫苗配制2000毫升(注：1000头份疫苗)，疫苗抗原效价设定为≥1∶8(AGP)滴度。

1、抗原蛋白的准备将纯化的抗原蛋白效价为1∶64(AGP)表达蛋白200ml用灭菌生理盐水稀释至1600ml。

2、5×氢氧化铝胶-CpG DNA复合佐剂工作液制备：取1-2万OD的CpG DNA用灭菌生理盐水100ml溶解，并过滤除菌。加入Al³⁺浓度为9.0-11.0mg/ml氢氧化铝胶原液80ml。然后加生理盐水至400ml。

3)取1600ml抗原蛋白液和400ml5×氢氧化铝胶-CpG复合佐剂工作液混合，充分混匀。

六、猪圆环病毒PCV-2基因工程亚蛋白疫苗的本体动物实验及结果

取21-27日龄实验猪，采集血清用ELISA试剂盒(IDEXX产品)测定抗PCV2抗体，均为阴性。将15头抗体阴性猪，随机分为3组。

空白对照组5头，颈部肌肉注射灭菌生理盐水2毫升；

实验1组5头，颈部肌肉注射1∶4疫苗2毫升；

实验2组5头，颈部肌肉注射1∶8疫苗2毫升。

注射免疫21天，用相同的疫苗进行2次免疫，2次免疫后14天(一免后35天)采集实验猪血清标本，用ELISA试剂盒检测抗体。结果见表5：

表5

注：35天ELISA检测结果判定为：大于0.423为阳性；小于0.394为阴性；0.394与0.423之间为可疑。

结果显示：

空白对照组抗体均为阴性

实验1组的抗体阳性率＝60％；可凝率＝20％；阴性率＝20％

实验2组的抗体阳性率＝80％；可凝率＝20％；阴性率＝0％

本发明通过PCV2cap蛋白基因的N端剪接和基因序列中部分基因序列的定点突变达到了以下几个结果：

1、通过基因剪接成功地实现了PCV2cap蛋白的表达；

2、通过基因剪接和定点突变使大部分表达的PCV2cap蛋白成为可溶性蛋白；

3、通过基因剪接和定点突变使表达的PCV2cap蛋白具有抗原活性；

4、结合复合佐剂的应用使本发明的疫苗制品能激活实验猪产生可靠的高滴度抗PCV2抗体。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种可溶性融合蛋白，其特征在于，包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，所述定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。

2.根据权利要求1所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下至少一组氨基酸残基位点：1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；4)第186位；5)第222位。

3.根据权利要求2所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下氨基酸残基位点：6)第97，99，116位；或7)第97，99，180，186位。

4.根据权利要求1所述的可溶性融合蛋白，其特征在于，所述定位信号区域剪切包括所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因5’端剪切掉39～159bp的DNA链；优选地，69～123bp；优选地，105bp。

5.如权利要求1至4中任一项所述的可溶性融合蛋白在制备猪圆环病毒II型疫苗中的应用。

6.编码如权利要求1至4中任一项所述的可溶性融合蛋白的DNA序列。

7.一种载体，其特征在于，包含如权利要求6所述的DNA序列。

8.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求7所述的载体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2012474。

10.一种猪圆环病毒II型疫苗，其特征在于，包括如权利要求1至4中任一项所述可溶性融合蛋白。

11.根据权利要求10所述的疫苗，其特征在于，进一步包括佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝胶和CpG-DNA。

12.根据权利要求10或11所述的疫苗、，其特征在于，通过如权利要求8或9所述的宿主细胞培养、提取抗原蛋白，然后添加佐剂制备而来。

13.如权利要求10或11所述的猪圆环病毒II型疫苗在预防猪圆环病毒II型引起的猪相关疾病中的应用。

14.根据如权利要求13所述的应用，其特征在于，对21日龄的猪进行免疫注射。