KR20060019886A

KR20060019886A - 돼지 서코바이러스 제2형의 항원성 제조물 및 이를포함하는 이유후 전신소모성 증후군의 항원성 제조물

Info

Publication number: KR20060019886A
Application number: KR1020040068570A
Authority: KR
Inventors: 양용진; 이상봉; 문성철; 전용수; 김영인; 장형관
Original assignee: 주식회사 코미팜
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2006-03-06
Also published as: KR100767297B1

Abstract

본 발명은 돼지 서코바이러스 제2형의 항원성 제조물 및 상기 항원성 제조물을 포함하는 돼지 이유후 전신소모성 증후군의 항원성 제조물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 서코바이러스 제2형의 외막단백질을 코딩하는 염기서열에 있어서 상기 염기서열상에 존재하는 특정 당화단백질의 위치를 임의적으로 조정하므로써, 재조합된 단백질을 암호화 하도록 하여 돼지 서코바이러스 제2형에 대한 면역원성을 높일 뿐만 아니라, 돼지 서코바이러스 제2형이 주된 원인이 되는 이유후 전신소모성 증후군에 대한 면역원성도 높이는 항원성 제조물을 제공한다.

돼지 서코바이러스 제2형, 이유후 전신소모성 증후군, 당화

Description

돼지 서코바이러스 제2형의 항원성 제조물 및 이를 포함하는 이유후 전신소모성 증후군의 항원성 제조물{ANTIGENIC MATERIALS OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 FOR POSTWEANING MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROME}

도1은 수탁번호 KCCM-10498인 PCV2에 있어서 ORF2 염기서열이다.

도2는 상기 서열번호1의 염기서열상의 143번째 아스파라진내 N결합 당화위치가 제거되고, 88번째 아스파라진내 N결합 당화위치를 생성시킨 재조합 ORF2 유전자 염기서열이다.

돼지 서코바이러스 제2형(Porcine CircoVirus type 2; 이하 'PCV2'라 한다)은 1991년 캐나다를 시작으로 미국, 프랑스, 스페인, 아일랜드, 덴마크, 영국, 독일 등 전세계적으로 발생하고 있고, 아시아지역에서는 국내를 비롯한 일본과 대만에서도 발생이 확인된 원형의 외가닥 DNA바이러스로서, 서코비리데(Circoviridae)에 속한다. PCV2는 1974년 돼지신장세포에서 발견된 비병원성의 PCV1과 달리 감염에 의해 돼지 전신소모성 증후군(Postweaning M㎕ti-systemic Wasting Syndrome; 이하 'PMWS'라 한다)을 유발하는 원인체중 하나인 것으로 알려져 있으며 소독제, 유기용매, 열에 강한 저항성을 갖고 있어 양돈장에 오염되면 근절하기 힘든 바이러스이다.

국내에는 1998년에 최초로 보고되어 1999년에는 전국에 산재한 것이 확인되었다. 국내 감염형인 경우 6~12주령의 돼지에서 발생하였으며 폐사율은 극히 낮아 평균 1~5%에 달한다. 하지만 위생관리가 열악한 농장의 경우 20%이상의 폐사율을 보이기도 하였으며 80%이상의 발증돈은 타 질병의 원인체와 혼합감염양상을 보였다. 혼합감염되는 경우 체중감소, 위축, 호흡곤란, 기침, 폐렴, 설사, 청색증, 신경증상 등의 임상증상을 보이면서 20%이상 폐사가 나타난다.

PMWS는 이유자돈부터 육성돈에 이르기까지 모든 돼지에게 나타날 수 있는 질환으로서 감염농장에 따라 5~50%의 감염율을 보이고 있다. PMWS에 감염된 이유자돈의 폐사율은 그리 높은 편은 아니지만, 이유후부터 점진적인 체중감소를 동반하여 성장지연이 나타나게 되는데, 이러한 증상을 보인 개체인 경우 폐사율이 상대적으로 높아지는 양상을 보인다. 질병의 경과는 전신면역기능의 저하로 인해 소화기나 호흡기질병에 대한 방어기전이 제기능을 하지 못하게 되고 2차적인 감염체에 의해 위의 증상이 가속화되게 된다. 부검소견으로 전신의 임파절이 평상시의 3~4배로 종대되고 혼합감염원의 증상이 심화되어 발증한다.

PMWS에 관여하는 병원체로는 PCV2가 가장 대표적이고, 그 외에도 PRRSV(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus), PPV(Porcine Parvovirus) 및 SIV(Swine Influenzavirus) 등과 같은 바이러스성 병원체; 및 Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella m㎕tocida, Haemophilus parasuis, Salmonella종 및 Staphylococcus종 등의 세균성 병원체가 알려져 있다. 그러나, PCV2에 감염된 모든 돼지가 전신소모성 증후군의 증상을 보이는 것은 아니지만, 2차적인 감염이나 백신면역에 의한 면역세포의 활성화가 일어난 경우에는 증상의 정도가 심화되는 것이 보고되고 있다. 특히 백신면역에 의한 발증은 세균성 불활화백신으로서 흉막폐렴, 마이코플라즈마성 폐렴백신에 주로 해당하는 것으로 알려져 있다.

PRRS바이러스는 아터리비리데(arteriviridae)에 속하는 바이러스로서 열에 약해 쉽게 불활화되며 유기용매에 사멸하기 때문에 외부환경에 노출되면 쉽게 사멸하지만 근절하기 힘들며 대륙간 항원적, 유전적인 변이가 뚜렷한 바이러스로 알려져 있다. 크게 폐렴양상을 보이는 호흡기형과 유사산 및 이유자돈의 폐사와 같은 생식기형으로 구분되지만 최근에는 동시에 발증하는 양상을 보인다. 감염경로는 농장간 돼지의 이동이나 사람, 차량의 이동으로 인한 직접감염이 성립하며 농장내에서 돼지간 접촉감염, 경구나 호흡기를 통한 지속적인 순환감염이 의심되고 있다. 또한 종돈의 정액을 통한 교미 및 인공수정에 의한 감염도 이뤄지고 있다. 감염된 돼지는 항체의 보유와 상관하지 않고 약 100간 바이러스를 지속적으로 배출하는 양상을 갖는다.

PRRS바이러스는 전세계적으로 널리 분포하여 돼지에 질병을 일으키는 바이러스로서, 1980년대 후반 국내에 유입하였을 것으로 추정된다. 상기 바이러스에 대한 분리는 1993년 보고되었다. 최근 국내 항체양성돈 보유실태를 양돈장규모로 확인한 결과 약 60%정도의 농장이 PRRS바이러스에 감염되어 있었고, 각 농장별 감염정도는 5~90%로 다양하게 감염양상이 나타났으며 전국 개체에 대한 항체양성돈 보유정도는 약 21%정도가 감염되어 있는 것으로 확인되었다. 감염된 모돈에서 유사산, 허약자돈의 분만, 호흡곤란 및 신경증상 등이 나타났다.

최근 국내의 PRRS바이러스의 감염양상은 준임상형 PRRS바이러스의 지속감염을 통한 질병확산이 일어나고 있으며 임상증상과 피해정도가 불명확한 실태이다. 이로 인해 초기의 단독적인 급성형 질병의 유행에 비해 최근 타 병원체와 복합적으로 감염되고 만성형으로 질병의 양상인 PRDC(Porcine Respiratory Disease Complex, 돼지 복합호흡기질환)의 주요한 원인체이며 최근 농장에서 크게 문제시 되고 있는 PMWS(Porcine M㎕ti-systemic Wasting Syndrome, 돼지 전신소모성 증후군)의 속발원인체로도 인정되고 있다.

세균성 병원체가 근절된 유럽의 경우 PMWS에 관여하는 주요한 원인체로 PCV2와 PPV로 확인되었지만, 국내에서는 PCV2와 PRRSV가 PMWS에 관여하는 주요 원인체인 것으로 보고되고 있다.

PCV2의 ORF2(Open Reading Frame 2)는 당단백질로서 약 30kDa의 분자량을 갖으며 ORF2만을 유핵세포에 단백질발현을 유도한 경우 바이러스양의 파티클이 확인되었다. 특히 ORF2의 유핵세포발현체를 진단키트에 이용하려는 시도가 행해지고 있으며 유전자의 변이면(Mutation)에서 대륙간 상동성(Homology)이 높고 변이체(Mutant)발생률이 낮아 재조합단백질의 중요한 인자로서 선발되어 백신개발연구 중에 있다. 그러나, 현재 발견된 병원성 PCV2의 ORF2는 143번째 아스파라진(Asn143)에 N결합당화과정이 나타나는 것으로 알려져 있으며, 이는 오히려 주위에 위치한 항원결정기(Epitope)인 121~135 아미노산, 169~183 아미노산에 감작하는 항체(Journal of General Virology (2000) 81, 1815-1824)의 결합을 방해하는 역할을 한다는 문제가 있었다.

또한, PRRS바이러스의 경우 생물학적, 항원적 특성이나 병원성이 다양한 변이주가 발생되는 양상을 갖는다. 특히 병원성은 각 이종의 독주간 RNA 재조합 등 다양한 기전을 통해 변이주 출현때문에 진단 및 백신프로그램 개발에 난항을 겪고 있는 실태이다. 특히 미주지역에서 급성으로 발병하는 독주가 발생함에 따라 다가의 예방약의 개발이 필요한 시점이 되었다. 대륙간 혈청형이 크게 다른 독주를 백신으로 제작하는데 사용하는 것은 극히 제한적일 수 밖에 없으며 또한 PRRS바이러스의 외래 스트레인을 이용한 재조합백신을 이용한 형태의 프로그램으로 PRRS바이러스의 감염을 저해하려는 시도가 많았지만 유전학적인 변이가 심해 감염의 정도를 줄일 뿐 사실상 바이러스의 감염을 근절하는 효과를 보이지는 못하고 있었다. 오히려 약독화백신으로 사용한 독주의 유전자가 이종변이를 통해 감염주에 이행되는 역 효과까지 발생하는 것으로 최근 보고되었고 미국의 경우 약독화백신을 투여한 농장에서 오히려 급성형의 발증이 보고되었다. 이에 국내에서 분리되고 지역별로 항원적인 상동성이 높은 독주의 개발과 약독화백신보다 재조합백신이 필요하다는 문제가 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 PCV2의 외막단백질을 암호화하는 ORF2의 염기서열에 있어서 당화 위치를 조정하므로써, PCV2에 대한 면역원성을 높인 항원성 제조물 및 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본원발명은 상기 항원성 제조물 및 PRRSV의 ORF7의 발현단백질을 이용하여 PCV2가 주된 원인의 하나로 작용하는 PMWS에 대한 항원성 제조물 및 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 PCV2에 대한 항원성 제조물은, 수탁번호 KCCM-10498인 PCV2에 있어서 ORF2 염기서열에서 143번째 아스파라진내 N결합 당화위치가 제거되고, 88번째 아스파라진내 N결합 당화위치를 생성시킨 서열번호2의 재조합 ORF2의 발현단백질이다.

PCV2의 ORF2는 143번째 아스파라진에 N결합당단백질은 오히려 주위에 위치한 항원결정기인 121~135 아미노산, 169~183 아미노산에 감작하는 항체의 결합을 방해하는 역할을 하지만, 면역세포의 활성을 자극하는 역할도 하기 때문에 당화아미노산을 완전히 소거하였을 경우 면역세포의 활성이 떨어지게된다. 이에 본 발명의 발 명자는 PCV2의 ORF2의 88번째 아스파라진에 N결합 당화가 유발되도록 재조합하면 항원결정기에 영향을 주지 않으면서도 면역세포의 활성을 떨어뜨리지 않는다는 사실을 발견하여 본 발명에 이른 것이다.

당화는 단백질과 같은 분자에 다당(Polysaccharide)를 덧붙이는 기전으로서 세포내의 막단백질(Membrane Protein)과 분비단백질(Secretory Protein)의 합성과정에서 나타난다. 조면소포체(RER, Rough Endoplasmic Retic㎕um)에서 합성되는 대부분의 단백질은 당화과정을 거친다. 당화과정을 거친 단백질은 특정부위가 접히거나(Folding) 분비단백질의 안정성에 상관하여 단백질분해효소에 대해 저항성을 갖게 하며 또한 면역학적으로 면역세포에 특정 항원결정기(Epitope)를 보호하는 역할을 하기도 하지만 면역세포의 감작하는 주요 반응원으로서의 역할을 하기도 한다. 또한 면역세포에서 세포와 세포간 접착, 세포와 항원과의 결합에 상관한다. 당화과정은 크게 N결합당화(N-linked Glycosylation)과 O결합당화(O-linked Glycosylation)로 구분하며 당화과정을 통한 단백질의 변형에는 특정한 요구조건이 없는 것으로 알려져 있으나 당화가 일어나지 않은 단백질인 경우 쉽게 분해된다.

당화과정은 생체내 효소에 의해 이뤄지는 과정으로 특정부위에만 이뤄진다. N결합당화의 경우는 변형(folding)을 유도하며 아스파라진(Asparagine)의 아마이드기내 질소에 14개의 다당이 돌리콜(Dolichol)이라는 매개물질에 의해 소포체강내에서 이뤄진다. N결합당화는 아스파라진-기타의 아미노산-세린(Serine)이나 트레오닌(Threonine)이 연결된 경우 아스파라진에 당화효소에 의해 14개의 다당이 결합한다. 변형이 적당히 이뤄진 후 3개의 단당이 떨어져 나오면서 소포체에서 단백질이 빠져나오게 된다. 이렇게 소포체를 빠져나온 단백질은 골지체(Golgi Apparatus)로 유입되면서 만노스(Mannose)의 추가적인 소거가 이뤄진다. 이렇게 골지체를 통과하면서 나름대로의 기능을 단백질(Mature Protein)이 된다. O결합당화의 경우 골지체에서 단백질성숙 중 가장 나중에 일어나며 연속되는 세린이나 트레오닌잔기에 갈락토스나 시알릭산이 추가되는 경향을 갖지만 특정위치는 정확히 확인되지 않고 있다.

본 발명의 PMWS에 대한 항원성 제조물은, 상기 재조합 ORF2의 발현단백질과 PRRSV의 ORF7의 발현단백질을 포함하는 것이다.

본 발명의 발명자는 PRRSV의 뉴클레오캡시드단백질을 암호화하고 있는 유전자인 ORF7이 PRRSV의 외피단백질에 비해 유전자의 변이가 적다는 것을 발견하여 본 발명에 이른 것이다. PRRSV의 ORF7의 발현단백질은 병원체의 병원성과 숙주면역에 대한 반응성에 대해 높은 유효성을 보이지는 않지만 PRRSV의 감염을 차단하는데 제한적인 요소로서 작동한다. 따라서 상기 재조합 ORF2의 발현단백질과 PRRSV의 ORF7의 발현단백질을 포함하는 항원성 제조물은 PMWS의 조장에 대해 상당한 감수성을 갖는 것으로 확인되었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

ORF2에서 당단백질의 위치 변경에 따른 면역원성의 변화

[단계1:PCV2의 분리 및 동정]

PMWS증상을 나타내는 개체에서 림프절을 수집하고 페니실린과 스트렙토마이신을 함유한 동량의 MEM배지(2X, Gibco BRL)를 혼합한 후 유발과 균질기를 이용하여 조직을 파쇄하였다. 균질화한 조직을 -70℃로 동결시키고 다시 파쇄하는 과정을 3회 반복하였다. 균질화한 조직을 4℃, 1,500rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 재원심분리(4℃, 5,000rpm, 20분)하여 상층액을 회수하고 이 회수액을 바이러스시액으로 사용하고, nPK-15세포주(이하 "nPK-15세포주"라 한다)를 시험에 공여하였다. 25cm² 플라스크에 미리 배양해 둔 nPK-15세포주의 배지를 버리고 PBS로 3회 세척한 후 위의 바이러스시액 1.0mL를 1시간동안 감작시키고 PBS로 3회 재세척하고 2% FBS를 함유한 MEM배지로 37℃, 5% CO₂, 3일간 배양하고 세포변성효과(CPE, CytoPathic Effect)가 나타나지 않더라도 5회에 걸쳐 계대(Blind Passage)하여 세포변성효과를 보인 경우 원종계대로 사용하였다.

[단계2:PCV2의 분자생물학적 확인]

검출에 이용하는 시액은 조직절편균질액과 원종계대액을 DNAzol(MRC)을 이용하여 공급자의 권고사항에 따라 처리하고 추출된 DNA를 증류수(Distilled Water)에 100pmol/㎕의 농도로 용해하여 총DNA 2㎕, 순방향프라이머(PCV2F, 5'-TGA/GTA/CCT/TGT/TGG/AGA/GC-3') 1㎕, 역방향프라이머(PCV2R, 5'-GTA/ATC/CTC/CGA/TAG/AGA/GC-3') 1㎕, TAKARA Taq Polymerase(TAKARA) 0.5㎕를 혼 합하여 공급자(TAKARA)의 권고사항에 따라 92℃ 5분, 30순환(92℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 1분), 72℃ 30분으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 하였다. PCV2에 해당하면 전기영동시 469염기쌍에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었다.

[단계3:PCV1/PCV2 ORF2의 유전자클로닝]

검출에 이용하는 시액은 조직절편균질액과 원종계대액, PCV1의 감염이 확인되어 있는 PK-15세포주를 DNAzol(MRC)을 이용하여 공급자의 권고사항에 따라 처리하고 추출된 DNA를 증류수(Distilled Water)에 100pmol/㎕ 용해하여 총 DNA 5㎕, 순방향프라이머(PCV2ORF2F, 5'-CCG/GAT/CCT/CCA/TTA/AGG/ GTT/AAG/TGG/G-3') 1㎕, 역방향프라이머(PCV2ORF2R, 5'-CCG/GAT/CCT/CAG/ATA/TGA/CGT/ATC/CAA/G-3') 1㎕, TAKARA LA Taq Polymerase(TAKARA) 0.5㎕를 혼합하여 공급자(TAKARA)의 권고사항에 따라 92℃, 5분, 35순환(92℃, 30초; 46℃, 30초; 및 72℃, 2분)-72℃, 30분으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)실험을 하여 클론닝하고자 하는 ORF2를 확인하고 InsT/Aclon^TM PCR Product Cloning Kit(Fermentas)를 이용하여 플라즈미드벡터에 삽입하였다. Miniprep을 통해 ORF2유전자의 삽입을 확인한 후 염기서열 확인실험에 사용하고 제한효소처리를 하여 유핵세포(곤충세포 Sf9세포주발현용, PK-15세포주발현용) 및 무핵세포(대장균발현용) 발현벡터로 ORF2유전자를 옮겼다. 발현벡터로 옮겨진 ORF2유전자는 제한효소처리한 후 전기영동을 통해 존재를 확인하였다.

[단계4:ORF2유전자의 단백질발현, 정제 및 당화단백질확인실험]

ORF2유전자가 삽입된 상기의 발현벡터를 수용성세포(Competent Cell)로 옮겨 발현 및 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE로 발현량과 발현정도를 당화단백질 확인실험에 의하여 확인하였다. 단백질의 농도는 BSA 표준시액을 이용하여 적량곡선을 작성한 후 흡광도로 발현량을 비교확인하였다.

[단계5:ORF2유전자의 변이유도 및 재조합단백질의 발현]

당화위치를 이동시키기 위해 아미노산염기서열 중 변이를 유도하고자 하는 위치의 염기서열를 변경한 프라이머를 작성하였다. 144번째 아스파라진내 N결합당화를 없애기 위한 점돌연변이를 유도하기 위해 작성된 프라이머(순방향프라이머(5'-ACC/CAT/ATG/TAG/AGT/ACT/CCT-3'), 역방향프라이머(5'-AGG/AGT/ACT/CTA/CAT/ATG/GGT-3'))를 혼합하고 ORF2유전자가 삽입된 클로닝벡터를 주형으로 하여 상기 단계4와 동일한 조건으로 PCR실험한 후 클로닝용 벡터에 삽입하고, 일부는 염기서열확인실험에 사용하였다. 앞의 첫 번째 점돌연변이가 확인된 시료에 88번째 아스파라진내 N결합당화를 생성시키기 위해 작성된 프라이머(순방향프라이머(5'-GGA/CCA/ACA/ACA/TCT/CTA/TAC-3'), 역방향프라이머(5'-GTA/TAG /AGA/TGT/TGT/TGG/TCC-3'))를 혼합하여 앞의 실험과 동일한 조건으로 PCR실험한 후 클로닝용 벡터에 삽입하고 일부는 염기서열확인실험에 사용하고 일부는 제한효소를 이용하여 유핵세포(곤충세포 Sf9세포주발현용, PK-15세포주발현용) 및 무핵세포(대장균발현용) 발현벡터로 옮겨 발현을 유도하고 정제하였다.

[단계6:발현단백질에 대한 면역원성실험]

실시예1

점돌연변이를 유도하여 재조합한 재조합 ORF2(이하 'PCV2 rORF2')에 대한 각 각의 대장균에서의 발현단백질, nPK-15세포에서 발현단백질, Sf9세포주에서의 발현단백질에 대해 10㎍, 100㎍, 1mg의 농도로 2주령의 마우스에 대해 2주간격으로 접종실험후 항체가를 측정하여 표1에 기재하였다.

비교예1

PCV2 rORF2 대신 단백질발현이 확인되고 정제된 PCV1의 ORF2(이하 'PCV1 ORF2')를 사용하는 것을 제외하고는 실시예1과 동일한 방법으로 마우스에 접종실험후 항체가를 측정하여 표1에 기재하였다.

비교예2

PCV2 rORF2 대신 단백질발현이 확인되고 정제된 PCV2의 ORF2(이하 'PCV2 ORF2')를 사용하는 것을 제외하고는 실시예1과 동일한 방법으로 마우스에 접종실험후 항체가를 측정하여 표1에 기재하였다.

[표1:각 발현매개체별 항원의 농도에 따른 ELISA항체가]

구 분(mL당)		10㎍	100㎍	1mg
대장균발현	실시예1	60.8	179.2	371.2
	비교예1	70.4	192.0	409.6
	비교예2	54.4	51.2	60.8
nPK-15발현	실시예1	332.8	716.8	ND
	비교예1	217.6	332.8	ND
	비교예2	54.4	60.8	ND
Sf9발현	실시예1	96.0	921.6	1536.0
	비교예1	89.6	371.2	601.6
	비교예2	70.4	115.2	210.8

대장균에서 발현되는 단백질은 일반적으로 당화과정을 갖지 않는 것으로 공지되고 있으며 이 실험에서 대장균내 발현단백질은 아미노산으로만 구성된 단백질로서 SDS-PAGE실험에 의해 유핵세포내 발현단백질과 비교해 적은 분자량을 갖는 것이 확인되었으며 암화세포인 nPK-15세포주에서의 단백질발현량이 많지 않아 고농도 실험에 사용하지 못하였다. 항체가의 측정은 ELISA법을 이용하였으며 ELISA에 사용된 항원으로는 대장균에서 발현된 PCV2 ORF2로서 항원결정기를 모두 노출하고 있는 ORF2단백질을 96well 플레이트에 코팅하여 사용하였다. 일반적으로 동일한 항원에 대해 항원반응성은 매우 높아서 표 1의 대장균발현 PCV2 ORF2가 다른 항원에 비해 상대적으로 높은 항체가가 측정되었으나 당단백질로서 발현된 유핵세포에서 점돌연변이를 유발시킨 단백질의 면역원성이 상대적으로 높았다.

[국내 PMWS발증돈의 감염원인체 확인실험]

국내의 돼지농장에서 PMWS가 발증한 43마리의 돼지에 대한 PCV2의 감염양상을 분자생물학적 및 혈청학적 실험을 통해 원인체를 판별한 다음 표2에 기재하였다.

[표2:PMWS발증돈의 원인체 확인실험결과]

감염유형	원인체 및 혼합감염증	두 수
단독감염	PCV2	4
2중감염	PCV2+PRRS	8
	PCV2+살모넬라감염증	4
	PCV2+흉막폐렴	5
	PCV2+글래서씨병	3
	PCV2+파스튜렐라병	2
	PCV2+돼지 인플루엔자	1
	소 계	23
3중감염	PCV2+PRRS+살모넬라감염증	3
	PCV2+PRRS+파스튜렐라병	2
	PCV2+PRRS+흉막폐렴	4
	PCV2+PRRS+글래서씨병	3
	PCV2+PRRS+파스튜렐라병+글래서씨병	4
	소 계	16
계		43

PMWS를 발증한 돼지 43마리 모두는 PCV2에 감염되어 있었으며 공지된 내용처럼 혼합감염으로 인해 발증의 정도가 심화되는 양상을 보이고 있다(Veterinary Pathology 38:31-42(2001)). 표 2를 통하여 PCV2가 PMWS의 주요원인균임을 확인하였다. 또한, PRRSV와 혼합하여 감염한 결과(55.8%(24건))로부터, PRRSV가 종속감염체 중 가장 높은 연관성을 갖고, 발증의 정도도 심화되었음을 확인하였다.

[당화위치를 변경한 PCV2 rORF2와 PRRSV ORF7을 혼합한 재조합항원의 면역원성 확인실험]

[단계 1. 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 ORF7유전자의 클로닝]

PMWS증상을 나타내는 자돈의 폐조직을 수집하고 동량의 MEM배지(2X, Gibco BRL)을 혼합한 후 유발과 균질기를 이용하여 조직을 파쇄하였다. 균질화한 조직을 -70℃로 동결시키고 다시 파쇄하는 과정을 3회 반복하였다. 파쇄한 조직액을 4℃, 1,500rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하고 상층액을 재원심(4℃, 15,000rpm, 15분)하여 회수하여 바이러스확인 및 클로닝을 위한 시액으로 사용하였다. 파쇄된 조직액을 ㎕traSpecⅡ(BIOTECX)로 공급자의 권고사항에 따라 처리하고 추출된 RNA를 RNase가 함유되어 있지 않은 증류수(Distilled Water)에 적당한 농도로 용해하여 역전사중합효소연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)에 사용하였다. 총 RNA 5㎕, SuperScriptⅡ(Invitrogen) 1㎕, 포워드프라이머 (PRRSVORF7F, 5'-GCA/GGG/AGT/GGT/AAA/CCT/TG-3') 1㎕, 리버스프라이머 (PRRSVORF7R, 5'-TGC/CTC/AAG/AAT/GCC/AGC/CC-3') 1㎕를 혼합하여 역전사효소의 공급자(Invitrogen)의 권고사항에 따라 42℃에서 60분간 역전사반응시키고, 75℃ 30분으로 역전사효소를 불활화시킨 후 얻어진 상보성 DNA(Complementary DNA, cDNA)를 DNA주형으로 이용하였다. 상보성 DNA 5㎕, 상기의 프라이머 각 1㎕, TAKARA LA Taq Polymerase(TAKARA) 0.5㎕를 혼합하여 총 반응시액 50㎕를 기준으로 공급자(TAKARA)의 권고사항에 따라 92℃ 5분, 30순환(92℃ 30초, 48℃ 30초, 72℃ 2분)-72℃ 30분으로 PCR 실험 후, 전기영동하여 417bps의 ORF7을 확인하고 InsT/Aclon^TM PCR Product Cloning Kit(Fermentas)를 이용하여 플라즈미드벡터에 삽입하였다. 삽입된 벡터는 Miniprep을 통해 ORF7유전자의 삽입을 확인하고 제한효소처리를 하여 유핵세포(곤충세포 Sf9세포주발현용)로 ORF7유전자를 옮겼다. 발현벡터로 옮겨진 ORF7유전자는 제한효소처리를 통해 그 존재를 확인하였다.

[단계2:ORF7발현단백질에 대한 면역원성실험]

ORF7에 대한 대장균에서의 발현단백질, Sf9세포주에서의 발현단백질에 대해 10㎍, 100㎍, 1mg의 농도로 2주령의 마우스에 대해 2주간격으로 접종실험후 항체가를 측정하였으며 항체가를 측정하기 위해 ELISA실험에 사용된 항원은 대장균발현 ORF7을 공지의 기술로 96well 플레이트에 코팅하여 사용하였다. 표3에서 확인하듯이 두가지 항원 모두 접종농도에 비례하여 면역원성을 갖는 것이 확인되었다.

[표3:PRRS바이러스 ORF7의 각 발현매개체별 항원의 농도에 따른 ELISA항체가]

구 분(mL당)		10㎍	100㎍	1mg
PRRS바이러스 ORF7	대장균발현	89.6	179.2	409.6
PRRS바이러스 ORF7	Sf9세포발현	70.4	210.8	371.2

[단계3:PCV2 rORF2발현단백질과 PRRSV ORF7발현단백질의 혼합 및 적정농도 확인실험]

실시예1의 Sf9세포주에서 발현된 PCV2 rORF2와 PRRSV ORF7의 혼합농도를 확인하고자 표4와 같은 실험을 하였다. 동일한 항원을 농도만 달리 하여 2주령의 마우스를 대상으로 전술된 ELISA법을 이용하여 항체가를 측정하였다. 사용된 항원은 대장균발현된 PCV2 rORF2와 PRRS ORF7을 96well 플레이트에 코팅하여 사용하였다. 항원의 양을 1mg이상의 고농도로 접종한 경우 접종스트레스에 의해 개체가 폐사하는 경우가 나타났다.

[표4:PRRS바이러스 ORF7의 각 발현매개체별 항원의 농도에 따른 ELISA항체가]

구 분(mL당)		PCV2 rORF2 접종농도
구 분(mL당)		100㎍	500㎍	1mg
PRRSV ORF7 접종농도	100㎍	716.8/217.6	1536.0/192.0	921.6/179.2
	500㎍	371.2/192.0	1536.0/217.6	921.6/217.6
	1mg	716.8/332.8	921.6/371.2	921.6/371.2

[실시예2]

표4의 결과에 의존하여 PCV2 rORF2발현단백질과 PRRSV ORF7발현단백질을 500㎍의 농도로 혼합한 다음 공지의 면역보강제를 혼합하여 제조한 항원성 제조물을 멸균실험한 후 PMWS가 발증하는 농장의 개군을 대상으로 임신모돈에 분만5주전, 분만3주전에 접종하고 분자생물학적인 방법을 통해 분만자돈내 바이러스 감염여부 및 발증을 확인하였다.

[비교예3]

비슷한 월령 및 수임기간을 갖는 초임신돈 10마리에 상기 항원성 제조물 대신에 기존 백신프로그램을 사용하여 PMWS를 면역하였으며 실시예2와 동일한 방법으로 임신모돈에 접종하고 분만 자돈내 바이러스 감염여부 및 발증을 확인하였다.

[표5:기존백신프로그램과 재조합백신접종 후 원인체 및 PMWS발증 확인실험]

구분	접종두수(복당두수)	실험두수(30마리)
구분	접종두수(복당두수)	PCV2	PRRSV	PMWS발증두수
실시예2	10(9.8)	10	3	1
비교예3	10(10.2)	21	10	3

표5에서처럼 기존백신프로그램에 비해 PMWS증상을 나타내는 발증두수가 크게 감소하였고 실시예2는 분자생물학적인 확인실험을 통해 확인된 감염체가 비교예3에 비해 상대적으로 월등하게 적었다.

본 발명은 PCV2에 대한 면역원성을 높인 항원성 제조물 및 백신을 제공할 뿐만 아니라, PCV2가 주된 원인이 되는 PMWS에 대한 항원성 제조물 및 백신을 제공한다.

Claims

수탁번호 KCCM-10498인 PCV2에 있어서 ORF2 염기서열에서 143번째 아스파라진내 N결합 당화위치가 제거되고, 88번째 아스파라진내 N결합 당화위치를 생성시킨 서열번호2의 재조합 ORF2의 발현단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCV2에 대한 항원성 제조물.
수탁번호 KCCM-10498인 PCV2에 있어서 ORF2 염기서열에서 143번째 아스파라진내 N결합 당단백질이 제거되고, 88번째 아스파라진내 N결합 당단백질을 생성시킨 서열번호1의 재조합 ORF2의 발현단백질 또는 제1항의 항원성 제조물과, PRRSV의 ORF7의 발현단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 PMWS에 대한 항원성 제조물.