JP4125385B2 - ブタ呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスに対して免疫応答を高めるワクチン、該ウイルスによって惹起される病気からブタを保護する方法、該ウイルスに対する免疫応答を高めるワクチンを生産する方法、及び該ウイルスから得られたｄｎａ - Google Patents

Description

【０００１】
［発明の背景］
＜発明の分野＞
本発明は呼吸器及び生殖器ウイルスによって惹起される病気からブタを保護するワクチン、呼吸器及び生殖器疾病からブタを保護する方法、ワクチンを生産する方法、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスから得られたＤＮＡに関する。
【０００２】
＜背景の論議＞
近年、北アメリカ及び欧州の家畜ブタは呼吸器及び生殖器ウイルス（A. A. S. P. 9 月／10月, 1991， 7 - 11 頁； Veterinary Record,1992 年2 月1 日、87-89 頁; Ibid.,1991年11月30日、495 - 496 頁；Ibid.,1991年10月26日、370 頁；Ibid.,1991年10月19日、367 - 368 頁；Ibid.,1991年8 月3 日、102 - 103 頁；Ibid.,1991年7 月6 日; Ibid.,1991年6 月22日、578 頁；Ibid.,1991年6 月15日、574 頁；Ibid.,1991年6 月 8日、536 頁；Ibid.,1991年6 月1 日、511 頁；Ibid.,1991年3 月 2日、213 頁参照）の新種菌に罹患し易くなってきた。その最初に同定された新種菌は、いわゆる謎のブタ疾病（MSD)または“青耳症候群”に関係しているウイルスで、現在はブタ不妊症・呼吸器症候群（SIRS) あるいはブタ呼吸器・生殖器症候群(PRRS)として知られている。欧州では、この疾病はブタの伝染性流産・呼吸器症候群（PEARS)、青色流産［blue abortion disease ］、青耳病（英国）、青色流産（オランダ）、ブタ伝染性自然流産［Seuchenhafter spatabort der schweine］（ドイツ）、と呼ばれ、その対応ウイルスは“レリスタッドウイルス”［Lelystad virus］と名付けられている。合衆国では、この疾病はワバッシュ症候群（Wabash syndrome)、謎のブタ疾病（MPD)およびブタペストとも呼ばれている。PRRSに時々関連しておこる疾病に増殖性介在性肺炎（PIP)がある。
【０００３】
“青耳病”の発生は英国、ドイツ、ベルギ−、およびオランダの家畜ブタで観察されている。英国での発生はブタの品評会を中止に追い込んだ。PRRSの症状には、食欲不振（食欲減退）、微熱（発熱）末端チアノ−ゼ（青目が特徴的）、死産、流産、影響を受けた同産児の高死亡率、虚弱ブタの誕生、未熟児出産等がある。影響下の雌ブタから生きて生まれたブタの大半は４８時間後に死亡した。PRRSウイルスの臨床的徴候には、軽いインフルエンザ状徴候、速い呼吸（“サンピング［thumping］”）、散在性介在性肺炎等がある。PRRSウイルスは被感染動物に接触してから約２週間の潜伏期間をもつ。このウイルスはエンベロ−ブを有するＲＮＡ血管炎ウイルス［arterivirus ］のようにみえる（Ibid.,1992年 2月 1日参照）。このウイルスはブタ肺胞マクロファ−ジ中、CL2621細胞中（Benfield et al, J. vet.Diagn. Invest.,4:127 - 133, 1992; Collins et al, Swine Infertilityand Respiratory Syndrome/Mystery Swine Disease, Proc., MinnesotaSwine Conference for Veterinarians, pp 200 - 205, 1991) 、およびMARC細胞（Joo,PRRS: Diagnosis, Proc., Allen D. Leman Swine Conference,Veterinary Continuing Education and Extension, University of Minnesota (1993),20:53 - 55）で生育させることができる。またSIRSを起こすウイルスの培養の成功は、Wensvoort et al(Mystery Swine Disease in the Netherlands: The Isolation of Lelystad Virus. Vet.Quart. 13:121 - 130, 1991) によって報告されている。
【０００４】
合衆国でのPRRSの発生は養豚畜産業に悪影響を与えている。カナダでは、雌ブタで最高２週間継続する食欲減退、発熱、妊娠後期での流産、死産率の増加、虚弱児出産、激しい腹式呼吸及び下痢に始まる新生児の死亡がPRRSの特徴とされている。PRRSを起こすウイルスの単離、PRRS感染の診断、PRRSウイルスに対するワクチンの開発についての研究は公表されている（カナダ特許公報第2,076,744; PCT国際出願第WO93/03760; PCT国際出願第WO93/06211; および PCT国際出願第WO93/07898参照) 。
【０００５】
二番目のウイルス菌株は、PRRSの原因物質探索中に発見され、増殖性壊死性肺炎（PNP)として現在知られる疾病を引き起こす。PNP の症状及びPNP を惹起する病因ウイルスはPRRS及びその対応ウイルスと同一のように思えるが、認識できる相違がある。例えば、PNP を引き起こすウイルスはブタインフルエンザＡ型ウイルスのうちの、代表的ではないかあるいは典型的ではないウイルス（aSIV) だと思われている。
【０００６】
PNP の臨床的徴候は、主に発熱、呼吸困難、及び複式呼吸である。様々な年齢のブタが罹患するが、4 - 16週齢のブタに最も多く徴候が現れる。罹患したブタの肺は一様に所々肉状に赤くなっている (Collins, A.A.S.P., 9/10 月、1991年7 - 11頁）。対照的に、PRRSに罹患したブタは重篤な発熱を示さず、呼吸器徴候は散在性介在性肺炎の特徴である肺病巣を伴った新生ブタ( ３週齢未満）で主に観察される。
【０００７】
脳心筋炎ウイルス(EMCV)は別のウイルスであり、重篤な介在性壊死性石灰化心筋炎を併発する重篤な介在性肺炎を起こす。EMCVは、実験では、罹患した雌ブタにおいて生殖能力減退を起こす。(Kim et al, J. Vet.Diagn. Invest.,1:101 - 104 (1989); Links et al, Aust. Vet. J.,63:150 - 152 (1986); love et al, Aust. Vet. J., 63:128 - 129(1986参照) 。
【０００８】
最近、合衆国中西部で、3 - 8 週齢のブタにおいて、より病原性の高い型のPRRSが発生し、しかもその発生率は上昇している。典型的には、健康な3 - 5 週齢ブタが離乳後5 - 7 日で発病する。感染ブタの組織における汎用ウイルス同定方法ではブタのインフルエンザウイルス（SIV)、シュ−ドラビ・ウイルス［pseudorabies virus］(PRV) 、マイコプラズマ・ハイポニュ−モニア［Mycoplasma hypneumoniae ］がPRRSのこの新型とは関係ない事がわかった。
【０００９】
本発明は主に、新規のより病原性の高いPRRS型を引き起こす病原体からブタを保護するワクチン、ワクチンを製造投与する方法、およびこの新規PRRS型を引き起こす病原体のゲノム部分をコ−ドするＤＮＡに関する。しかしながら、本発明開発中に得られた情報が、いかなるおよび／または全てのブタの呼吸器及び生殖器疾病に対してのワクチン開発において有用であり、かつブタを保護する方法に有用となるであろうと信ずる。例えば、本発明者らは、以前に公表されたPRRSウイルスの病理と相違する少なくともひとつのPRRSウイルスの病理を特徴付けた（下記表１参照）。それ故、本発明は、このPRRS新型を惹起する、本発明者らによってPRRVウイルスの“アイオワ株”（PRRSV)と命名された病原体に関するワクチン及び方法には必ずしも限定されない。
【００１０】
それにもかかわらず、これらのブタのウイルスに対する有効なワクチンの開発に当たって、当該技術では悲観論及び楽観論が提示されてきた（The Veterinary Record, October 26,1991参照) 。ヒトインフルエンザワクチンがPRRSおよびPNP の影響に対していくばくかの保護を与えるのではないかという信条が当該技術分野には存在する（例えば、Ibid.,1991年7 月6 日参照）。しかしながら食用動物へのヒトワクチンの使用は一般的に調整管理省庁により反対されるので、このアプロ−チを現実的に実行することは困難である(Ibid 参照）。
【００１１】
ブタの畜産業は、これらのブタの生殖・呼吸器系疾病およびその別型疾病が発生することで悪影響を受けてきており、今後も影響を受けるであろう。驚いたことに、合衆国及び世界の動物ワクチンの市場は人間用ワクチン市場より大きい。だから畜産用家畜を疾病から保護することによって派生する実質的な公衆衛生貢献に加えて更に、新規動物用ワクチンの開発には経済的誘因も介在する。
［発明の要旨］
従って、本発明のひとつの目的はブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスによる感染からブタを保護する新規ワクチンを提供することにある。
【００１２】
更に本発明の目的は、PRRSV のアイオワ株に対しブタを保護するワクチンを提供することである。
【００１３】
更に本発明の目的は、ブタにおいて呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株に対して有効な免疫学的応答を高めるワクチンを提供することである。
【００１４】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株による感染からブタを保護する新規方法を提供することである。
【００１５】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株に対して有効な免疫学的応答を高める新規方法を提供することである。
【００１６】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株と免疫学的に結合する抗体を提供することである。
【００１７】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスによる感染に対してブタを保護するワクチンと免疫学的に結合する抗体を提供することである。
【００１８】
更に本発明の目的は、PRRSV のアイオワ株による感染に対してブタを保護するワクチンと免疫学的に結合する抗体を提供することである。
【００１９】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病、特にPRRSV のアイオワ株によって惹起される疾病に罹患したブタを治療する方法を提供することである。
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株に接触したブタを治療する方法を提供することである。
【００２０】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病、特にPRRSV のアイオワ株によって惹起される疾病、を惹起するウイルスを分析する診断キットを提供することである。
【００２１】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体のゲノム、特にPRRSV のアイオワ株から単離されたポリヌクレオチドを提供することである。
【００２２】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体、特にPRRSV のアイオワ株の一つ以上のタンパクをコ−ドしているポリヌクレオチドを提供することである。
【００２３】
更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体、特にPRRSV のアイオワ株由来の一つ以上の抗原ペプチドをコ−ドしているポリヌクレオチドを提供することである。
【００２４】
更に本発明の目的は、ブタの生殖器および呼吸器ウイルスまたは病原体を適切な細胞系を使用して培養する新規方法を提供することである。
【００２５】
更に本発明の目的は、PRRSV のアイオワ株を適切な細胞系を使用して培養する新規方法を提供することである。
【００２６】
これら及び下記の好ましい実施態様の記載中で明らかになるであろう他の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体による感染に対してブタを保護するワクチン、この様なブタの疾病を惹起するウイルスまたは病原体に対して有効な免疫学的応答を惹起する組成、この様なブタの疾病を惹起するウイルスまたは病原体に対して感染からブタを保護する方法、及び呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体のゲノム部分をコ−ドしているＤＮＡによって提供された。
［好ましい実施態様の詳細な説明］
本発明において、ブタの呼吸器および生殖器疾病は上述したPRRS、PNP 、および EMCV に言及し、PRRSV のアイオワ株によって惹起される疾病、およびこれらの疾病に綿密に関連し今までに出現したり将来出現するであろう疾病を述べる。
もし、未感染ブタにワクチン投与後、肺の病巣または疾病の症状が現れないか、または感染しても無保護のブタのように重篤でなければ、そして、感染ブタにワクチンを投与した後、肺の病巣または疾病の症状が除去され、または感染しても無保護のブタのように重篤でなければ、ワクチンは、“ブタの呼吸器および生殖器疾病ウイルスまたは病原体によって惹起される疾病に対してブタを保護”している。未感染ブタは、ブタの呼吸器および生殖器疾病病原体と接触していないか、ブタの呼吸器および生殖器疾病病原体と接触していても疾病の症状を表していないかのどちらかのブタである。感染ブタは、疾病の症状を示しているブタである。ブタの呼吸器および生殖器疾病の症状は、発熱温度、または肺の病巣（感染した肺組織のパ−セント）等で定量または評点化でき、または呼吸困難の重篤性等（詳細は下記に説明）で半定量できる。
【００２７】
“ブタの呼吸器および生殖器疾病ウイルスおよび病原体”は上述のようにブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起する。
【００２８】
新規の、より病原性の高いPRRS型を惹起する病原体はPRRSV の“アイオワ”株と命名された。PRRSウイルスの“アイオワ”株単離物によって惹起された疾病は、他のブタの呼吸器および生殖器疾病より重篤ではなく同等な症状を持つ。臨床徴候には、傾眠、呼吸困難、サンピング（強制呼気）、発熱、毛皮の荒れ、いびき、咳、目水腫、散発性結膜炎等がある。病巣には、肉眼視的なおよび／または顕微鏡視的な肺の病巣および急性間質性心筋炎等がある。病原体は単一のウイルスであるかまたは一つ以上の付加的病原体（他のウイルスまたはバクテリア）と結合しているものでもよい。更に、アイオワ株の病原性に劣る型および非感染型が発見されているが、それらは一部の上記症状を惹起するかまたはまったく症状を現わさないけれども、本発発明によると、それにもかかわらず、ブタの生殖器および呼吸器疾病に対する保護を行うために使用され得る。
【００２９】
様々なブタの疾病における組織学的病巣は違う。下記表１はブタウイルスによって惹起される多くの疾病に関連する病巣の生理学的所見および病理を比較してある。
【００３０】
【表１】

ここでは、“PRRS(p) ”はPRRSウイルスの公表されている病理を示す。“PRRS(o) ”は本発明者らによって観察されたPRRSの病理、“SIV ”はブタのインフルエンザＡウイルスを示し、“PRCV”はブタ呼吸器コロナウイルスを示し、“PRMV”はブタのパラミキソウイルスを示し、“Iowa”は本発明者らによって発見されたPRRSV の新株、“II型”はII型肺胞細胞（これは感染ブタで増殖する）を表わす。“inter ”は間隙を、“気道壊死”は最終気道中の壊死を言い、記号（- ）、（ +）から（++++) は下記のように相対的重篤度を表現する。
【００３１】
（-): 陰性（観察されず）
（+): 軽度（観察閾値を超えた程度）
(++): 中度
(+++): 重度
(++++): 最も重度
PRRSV のアイオワ株は合衆国中西部でPRRSと一緒に、本発明者らによって同定された。ウイルスが天然界で発見されたので、PRRSV のアイオワ株に関係する疾病が特定のウイルスのために起こるのか、または一つ（以上）の病原体との組み合せによって起こるのかどうかは明らかではない。しかしながら、PRRSV のアイオワ株のプラ−ク精製サンプルでは単一特定ウイルスのように見える。それ故、“PRRSV のアイオワ株”は、特定プラ−ク精製ウイルスか、あるいはウイルスと一つ（以上）の病原体との組み合わせを含む感染動物からの組織ホモジネ−トかのいずれかといわれ、PRRSV のアイオワ株に感染したブタは、上記の様にPRRSV のアイオワ株によって惹起される疾病の特徴的な症状を示す。
【００３２】
PRRSV のアイオワ株は従来のPRRSを惹起する病原体とは相違する事が最近の事実で実証されている。例えば、PRRSV のアイオワ株で惹起される疾病の症状を示している感染ブタで観察される病巣は、従来の前述したPRRSウイルス単独で感染させたブタで観察される病巣より重篤であり、またアイオワ株で惹起される疾病に罹患しているブタは、PNP に関連したウイルス等のインフルエンザに対してはセロネガテイブである。
【００３３】
図１- 4 では、本発明に包含される様々な型のワクチン調製のための手法の工程のフロ−チャ−トが提供される。図１- 4 のフロ−チャ−トが本発明のワクチンを生産する模範的な方法として提供されているが、これによって、どのようにも本発明が制限されるものではない。
【００３４】
図１- 4 に詳述する各々のステップで、まず第一は、ブタの呼吸器および生殖器ウイルスまたは病原体による感染に罹患しやすい細胞系を同定することである（ワクチンの調製に関する論議を簡単にするために、“ウイルス”という言葉は、ブタの呼吸器および生殖器疾病に関連したウイルスおよび／または病原体を意味するものとする）。次に、罹患し易いホスト細胞のマスタ−細胞（MCS)ストックが調製される。罹患し易いホスト細胞はMCS から継続して植え継がれる。実用細胞ストック（WCS)がMCS およびMCS+n 間の継代細胞から調製される。
【００３５】
マスタ−種ウイルスがMCS およびMCS+n 間の罹患し易いホスト細胞系の上で、特に実用細胞ストック上で増殖される。生のウイルスが従来技術公知の方法で、目的ウイルスで惹起される疾病の症状に対応した疾病の症状を示している感染ブタから採取され、適宜に好適にホモジナイズされた組織サンプルより単離される。適切なホスト細胞、好ましくは実用細胞ストックサンプルが、ウイルスで感染され、培養される。続いて感染、培養されたホスト細胞から従来技術公知の方法で、ワクチンウイルスが単離され、プラ−ク精製される。ワクチンを調製するために使用するウイルスは、プラ−ク精製を３回されることが好ましい。マスタ−種ウイルス（MSV)は、従来技術公知の方法でプラ−ク精製したウイルスから調製される。マスタ−種ウイルス（MSV(X)は実用細胞ストック中で、少なくとも４回のMSV(X + 1), MSV(X + 2), MSV(X + 3), MSV(X + 4)の継代ウイルスを通して受け継がれる。MSV(X + 4)が実用となる種ウイルスと見做される。本発明のブタの研究に使用される継代ウイルスおよびワクチン生成物は５世代目の生成品、MSV(X + 5)、である。
【００３６】
実用細胞ストックに関連して、プロトタイプのワクチン、好ましくはMSV(X + 5)を調製するために実用種ウイルスは公知の方法で十分な量培養される。本発明のプロトタイプワクチンは、動物医薬品分野でのいづれの使用にも適する。適切なタイプには、改変された生または弱毒化ワクチン（図１）、不活性化細胞または死菌ワクチン（図２）、サブユニットワクチン( 図３）、遺伝子工学的に作製したワクチン（図４）、動物ワクチン技術分野で認識されているその他のワクチンがある。死菌ワクチンは、当業者に公知の方法で化学処理または熱等で不活性化される。
【００３７】
図 1 - 4のそれぞれで概要を示した手法では、下記プロトタイプワクチンの調製、ブタの免疫感作モデルの調製、臨床分析が当該技術分野において公知の方法で行われる。例えば、現実にワクチン接種、免疫感作研究を行う前に、防御し、治療されるべき疾病がその症状、臨床分析結果、および状態等で規定されなければならない。上述したように、PRRSV のアイオワ株に関連した病原体はその症状および状態で規定されている。PRRSV のアイオワ株に関連した病原体の臨床的分析は下記の実施例に記載されている。
【００３８】
疾病が十分に規定され、特定化された後、ブタにプロトタイプワクチンを投与して、該ブタを該疾病を惹起するウイルスまたは病原体に接触させる。これは当該技術でブタおよびその免疫システムへの“免疫感作”として知られる。免疫感作したブタをウイルスまたは病原体に接触させて反応を観察し、プロトタイプのワクチンのブタを保護する能力を分析した後、当該技術において公知の方法で、有効性研究が行われる。次に、可能性分析が当該技術公知の方法によって別々の手段で開発され、認可前のシリ−ズが生産される。
【００３９】
図１に概要を示したように改変生ワクチンの調製においては、プロトタイプワクチンが調製されてはじめて、細胞生育条件およびウイルス生産の至適化が計られ、生産概要が当該技術公知の方法で調製される。生産概要が作成されると、認可前のシリ−ズが当該技術公知の方法で引き続き調製される。認可前のシリ−ズは、一定の標準でシリ−ズを生産できる能力を示す可能性の高いプロトタイプワクチンの大規模生産と表現される。プロトタイプ生ワクチンを調製する一つの方法はウイルス感染細胞（好ましくは、マスタ−種ウイルスを感染させた細胞）を溶菌させるために、凍結解凍のサイクルに一回以上供することであろう。凍結解凍した感染細胞培養物質は、貯蔵保存性を高めるために凍結乾燥（フリ−ズドライ）される。その後再び水和して、感染細胞培養物質を生ワクチンとして使用する。
【００４０】
不活性化ワクチン（図２）の認可前のシリ−ズを調製する手段は基本的に改変をおこなった改変生ワクチンの調製に使用される手段と同様である。細胞生育条件およびウイルス生産プロトコ−ルを至適化した後、至適生産概要を作成する前に、ウイルスの不活性化の至適化を行なわなければならない。ウイルスの不活性化プロトコ−ルおよびその至適化は一般的に当業者に公知であり、研究される特定のウイルスによって、公知または予測される方法で変えられる。
【００４１】
サブユニットワクチン（図３）調製は、改変生ワクチンまたは不活性ワクチンの調製とは相違する。プロトタイプワクチンの調製に先立ち、ワクチンウイルスの防御または抗体成分が同定されなければならない。この様な防御または抗体成分には、あるアミノ酸部分またはブタにおいて特に強力な防御的、免疫学的応答を惹起するウイルスのコ−ト蛋白の（好ましくは、少なくとも５アミノ酸の長さを持ち、特に好ましくは少なくとも１０アミノ酸の長さを持つ）断片；単一または多種類のウイルスコ−ト蛋白自身、それらのオリゴマ−、ウイルスサブ構造あるいはそのようなサブ構造の均等部分もしくは単位を形成するウイルス被覆タンパクのより高次の関連物質；ウイルス表面上または近辺、あるいはヌクレオキャプシドのようなウイルスサブ構造中に存在するオリゴグリコシド、糖脂質または糖蛋白；ウイルスに関連するリポタンパクもしくは脂質基が含まれる。これらの構成成分は当該技術公知の方法で同定される。一度同定されると、続いてウイルスの防御的または抗体部分（サブユニット）は、当該技術公知の方法で精製されおよび／またはクロ−ンされる。
【００４２】
サブユニットワクチン（図３）の認可前のシリ−ズの調製は、幾つかの改変を加えて、不活性化ワクチン（図２）に使用される方法と同様である。例えば、サブユニットが組換え遺伝子工学的技法を通して生産されるならば、クロ−ンされたサブユニットの発現は当該技術公知の方法で最適に行われる（たとえば、Maniatis et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Habor Laboratory (1989), Cold Spring Habor, Massachusetts の関係部分参照）。一方、サブユニットが全コ−ト蛋白等のウイルスの完全な構造的特徴を示すならば、ウイルスからの単離が最適におこなわれなければならない。どちらの場合も、不活性化手段を最適に行った後、サブユニットの精製手段が生産概要を作成する前に、最適に行われる。
【００４３】
遺伝子学的に調製されるワクチン（図４）は、他のワクチン調製用に使用される一般的手法を改変することから始められる。プラ−ク精製後、野生型ウイルスが、当該技術公知の方法、好ましくは、PSP-36またはマクロファ−ジ細胞をホストとして使用する通常の細胞培養方法で適宜な組織ホモジネ−トから単離される。
【００４４】
ＲＮＡは当該技術公知の方法、好ましくは商業的入手可能なＲＮＡ単離キット（例えば、Stratagene, La Jolla, Californiaから入手されるキット）を使用するグアニデイン イソシアネ−ト法によって、生物学的に純粋なウイルスまたは病原体から抽出され、当該技術公知の方法で、好ましくは塩化セシウム濃度勾配による超遠心分離法によって精製される。ＲＮＡはオリゴ(dT)- セルロ−スカラムクロマトグラフによって更に精製され、濃縮される。
【００４５】
ウイルスゲノムは、次に適当なホストに当該技術公知の方法によってクロ−ンされ（上記Maniatis et al. 参照）、分析されてウイルスの抗体部分を生じるのに必要不可欠なゲノム部分を決定する。その後の手段は改変生ワクチン、不活性化ワクチン、またはサブユニットワクチンのための方法と一般的には同じである。
【００４６】
本発明のワクチンはブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体に対してブタを保護する。好ましくは本発明のワクチンはPRRSV のアイオワ株に関連する病原体に対してブタを保護する。しかしながら、本発明のワクチンはPRRSV のアイオワ株に関連する病原体に綿密に関連する変種に接触させることによる感染に対してもブタを保護すると期待される。
【００４７】
比較的少数のウイルスしか生ウイルスワクチンを生産する事ができない。生ウイルスワクチンの利点は、全身、局部、体液または細胞介在免疫反応等のすべての可能性のある免疫反応がワクチン受容体中で活性化されることである。生ウイルスワクチンの欠点は、SV40ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、牛胎児血清の共通汚染源等の外来の生物主によって汚染される可能性があることにある。この危険性は、生ワクチンウイルスがその疾病分野での感染性に戻り、胎児、子供の動物および他の種に対して弱毒化されないかもしれず、生ワクチンの利点を凌駕してしまう。
【００４８】
不活性化ウイルスワクチンはウイルスをホルマリンまたは疎水性溶剤、酸等の不活性化剤、紫外線またはＸ線等の照射、加熱等によって調製される。不活性化は従来技術で理解されている方法で行われる。ウイルスは感染しやすい細胞に感染することができなくなったら不活性化したと考えられる。例えば、化学不活性化では、ウイルスを含有している適切なウイルスサンプルまたは血清サンプルが、十分な量と濃度の不活性化剤でウイルスを不活性化するに十分な高温（不活性化剤によっては低温）とpHで十分な時間で処理される。加熱による不活性化は、ウイルスを不活性化するに十分な温度および時間で行われる。照射による不活性化は、光の波長または他のエネルギを使用して、ウイルスを不活性化するに十分な時間で行なわれる。ヒト使用の不活性化ワクチンの例として、インフルエンザワクチン、灰白髄炎、狂犬病、Ｂ型肝炎がある。ブタに使用される活性化ワクチンの成功・有効例は、ブタのパブロウイルスのワクチンである。
【００４９】
サブユニットワクチンは半精製されたウイルスサブユニットから、図３の論説において上述した方法で調製される。例えば、インフルエンザより単離された血液凝集素、インフルエンザより単離されたノイラミニダ−ゼ表面抗原が調製され、全ウイルスよりも毒性が少ない事がわかっている。一方、サブユニットワクチンはウイルスの高度に精製されたサブユニットからも調製される。人間における例として、ヒトＢ型肝炎の22ｎｍ表面抗原がある。ヒト単純ヘルペスウイルスサブユニットおよび人間に使用される多くのサブユニットワクチンが知られている。
【００５０】
弱毒化ウイルスワクチンは自然にもみられ、自然発生の遺伝子欠損が起こっているのかもしれず、また細胞培養または組織培養に何回も通すという様々な公知方法で調製できる。ウイルスは遺伝子欠損または遺伝子変異によって弱毒化され得る。
【００５１】
遺伝子工学的ワクチンは当該技術公知の方法によって調製される。この様な技術には、組換えＤＮＡを使用する方法、生ウイルスを使用する方法がある。例えば、あるウイルスが、ブタにおける強度の免疫応答または防御応答等に関係する蛋白をコ−ドしている事が確認される可能性がある。同定されたこの様な遺伝子は、バキュロウイルス等の蛋白発現ベクタにクロ−ニングすることができ、適当なホスト細胞への感染に使用できる（例えば O ´ Reilly et al.“Baculovirus Expression Vector: A Lab Mannual”Freeman & Co (1992)). ホスト細胞を培養し、目的のワクチン蛋白を発現し、これを目的量精製し、そして呼吸器および生殖器疾病からブタを保護するために使用する。
【００５２】
遺伝子工学的に調製された蛋白は、一般に、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞で発現させる。遺伝子工学的に作製された蛋白は、通常の方法で精製され、および／または単離され、ブタの呼吸器および生殖器疾病に対して保護を与えるために動物に直接接種される。ブタの呼吸器および生殖器疾病病原体またはウイルス由来のエンベロ−プ蛋白が、弱毒化抗体を誘発するためにワクチンに使用される。細胞性免疫を誘発させるために、ブタの呼吸器および生殖器疾病病原体またはウイルス由来の核蛋白がワクチンに使用される。
【００５３】
好ましくは、本発明は、PRRSV のアイオワ株由来のポリ核酸を含有するトランスファベクタで昆虫細胞系（HI-FIVE)を形質転換する。好ましくは、本発明の転移ベクタは、直線状にしたバキュロウイルスＤＮＡとPRRSV のアイオワ株由来のポリ核酸を含有するプラスミドを具備する。組換えバキュロウイルスを作るため、ホスト細胞系に直線状にしたバキュロウイルスＤＮＡとプラスミドを共に形質導入する。特に好ましくは、本発明のポリ核酸は、PRRSV のアイオワ株の蛋白を一つ以上コ−ドしている。
【００５４】
別法として、一つ以上のエンベロ−ブ蛋白および／または核蛋白をコ−ドしているブタの呼吸器および生殖器疾病病原体またはウイルス由来のＲＮＡまたはＤＮＡをポックスウイルスまたはアデノウイルス等の生ベクタに挿入し、ワクチンとして使用する。
【００５５】
このように本発明は、呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスゲノム部分から単離されるポリ核酸に関し、好ましくはPRRSV のアイオワ株のゲノムから単離されるポリ核酸に関する。“ポリ核酸”という言葉は、病原体由来のＲＮＡまたはＤＮＡのみならず、ＲＮＡまたはＤＮＡに対応しているかまたは相補的であるＲＮＡおよびｃＤＮＡを意味する。本発明のポリ核酸は本発明のワクチンを生産するための手段として、被感染動物を選別し同定する手段として、および関係するウイルスおよび病原体を同定するための手段として実用的である。
【００５６】
本発明の一つの実施態様において、ポリ核酸は呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルス蛋白を一つ以上コ−ドし、好ましくはウイルス膜（エンベロ−プ）蛋白およびキャプシド蛋白（核蛋白）の一方または両方をコ−ドする。特に好ましくは、本発明のポリ核酸はそのゲノムの3´末端由来の 2ｋｂの断片から採取され、PRRSV のアイオワ株のゲノムの ORF-5、ORF-6 によってコ−ドされるエンベロ−プ蛋白を一つ以上および／またはORF-7 によってコ−ドされる核蛋白をコ−ドする。最も好ましくは、ポリ核酸はPRRSV のアイオワ株に関連した病原体、例えば、下記例Ｉ- III （ISU-12) に記載した病原体のゲノムから単離され、ORF5（配列番号13）、 ORF6 （配列番号15）、ORF7（配列番号18）およびISU-12ゲノム（配列番号 8）の3´末端配列の1938ｂｐからなる群より選ばれる。
【００５７】
本発明の状況において、ウイルスまたは病原体由来のＲＮＡおよび／またはＤＮＡによってコ−ドされる蛋白またはペプチドは、もしそのポリ核酸免疫蛋白またはペプチドがポリ核酸免疫蛋白またはペプチドコ−ドしているポリ核酸と90％以上の相同性をもつならば、“疫学的に同等”とみなされる。本出願における“相同性”とは病原体の二つ以上のウイルスの間の、同一な核酸またはアミノ酸のパ−セントをいう。従って、本発明の別の態様は、呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスのゲノムから得られるポリ核酸と少なくとも90% 相同性である単離したポリ核酸を、好ましくは、PRRSV のアイオワ株に関連した病原体のゲノムから得られるポリ核酸を含む。
【００５８】
ウイルスのゲノム中のポリ核酸の比較的短い部分（約20ｂｐ以上）がここに記載した方法および当業者に公知の方法によって被感染動物および／または関連ウイルスを選別同定するために使用される。従って、本発明の態様は、更に、呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスのゲノム部分から得られる単離された断片から基本的になる単離された（および望ましくは精製された）ポリ核酸を包含し、好ましくはPRRSV のアイオワ株に関連した病原体のゲノム部分（すくなくとも20ヌクレオチドの長さ、好ましくは20から 100ヌクレオチドの長さを持つ）から得られるポリ核酸を包含する。特に好ましくは、本発明の単離されたポリ核酸の断片はISU-12ゲノム（配列番号 8）1938ｂｐの3´末端配列から得られ、最も好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選ばれる。
【００５９】
本発明の単離されたポリ核酸断片は、ウイルスポリ核酸に対応（相補）しているｃＤＮＡをひとつ以上の適当な制限酵素の消化分解して得られるかまたは商業的に入手可能な自動ポリヌクレオチド合成機を使用して合成できる。
【００６０】
本発明のもう一つの実施態様では、ポリ核酸が呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルス由来の抗原性ペプチドを一つ以上コ−ドしており、好ましくはPRRSV のアイオワ株に関連した病原体由来の抗原性ペプチドを一つ以上コ−ドしている。上述したように、本発明のポリ核酸は呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルス由来の、好ましくはPRRSV のアイオワ株に関連した病原体由来の蛋白の少なくとも5 アミノ酸、特に少なくとも10アミノ酸の長さの抗原性部分をコ−ドしている。蛋白の抗原性部分を決定する方法は当業者に公知である。
【００６１】
本発明は、PRRSV のアイオワ株の ORFの 1種以上によってコ−ドされるタンパク質にも関する。好ましくは、このタンパク質は、配列番号 8、13、15、18および19からなる群より選ばれるポリ核酸配列によってコ−ドされる。本発明の蛋白および抗原性ペプチドは、PRRSV 特にPRRSV のアイオワ株に接触したブタを選別する血清学的テストに有用である。
【００６２】
本発明は更に、次の症状および臨床的徴候：し眠、呼吸困難、強制呼気、発熱、毛皮の荒れ、いびき、咳、目の水腫、散発結膜炎によって特徴づけられるブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起する生物学的に純粋なウイルスまたは病原体に関する。本発明のウイルスまたは病原体の生物学的に純粋なサンプルは更に、次の組織学的欠損：肉眼視的および／または顕微鏡視的欠損、ＩＩ型肺胞細胞、心筋炎、脳炎、肺滲潤、合胞体形成、を含んだ呼吸器および生殖器疾病を惹起することが特徴的である。“生物学的に純粋”という言葉は、全て単一親から派生した子孫であるウイルスまたは病原体のサンプルについていう。通常“生物学的に純粋な”サンプルは細胞培養中で３回プラーク精製を行なうことでなし遂げられる。特に、本発明の生物学的に純粋なウイルスまたは病原体はブタの生殖および呼吸症候群のアイオワ株である。アイオワ株のサンプルは、ブダペスト条約の下、アメリカンタイプカルチャーコレクション（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に受付番号ＶＲ２３８５およびＶＲ２３８６として１９９２年１０月２８日付で寄託されている。また、ＶＲ２４２８、ＶＲ２４２９およびＶＲ２４３０も１９９３年９月２９日付でＡＴＣＣに寄託されている。
【００６３】
PRRSV のアイオワ株も、またそのｍＲＮＡのノ−ザレンブロットによって同定される。例えば、PRRSV のアイオワ株は、欠損を含む7 または9 ｍＲＮＡのいずれかを含む。特に、下記例に記述するように、PRRSV のアイオワ株のｍＲＮＡは最高４つの欠損を含む。
【００６４】
本発明は更に、生理学的に許容可能なキャリア中で生殖器および呼吸器疾病を惹起するウイルスに対する免疫応答を高めるに有効な本発明のワクチンの量を具備するウイルスの感染からブタを保護する構成成分に関する。
【００６５】
本発明ワクチンの有効量はブタの生殖器および呼吸器疾病および関連疾病を惹起するウイルスに接触したブタを保護するワクチンに対して免疫学的応答を十分に高めた量である。ブタは疾病の生理学的悪症状または悪影響のひとつないしは全部に著しい減少が見られる程度にまで保護されることが好ましい。
【００６６】
成分は、一回または繰り返し投与される。投与量にはたとえば、ウイルス系抗原（ワクチン）を1 - 1,000 マイクログラムが含まれるが、結果として逆効果になる程、または感染の生理学症状が出るほどのウイルス系抗原の量を含むべきでない。活性な抗生剤の適切な量を決定する方法は当該技術にて公知である。
【００６７】
本発明のワクチンを含む成分は、アジュバントと結合して投与される。アジュバントは本発明のワクチンと結合されると免疫学的反応を増加させる物質である。アジュバントは、ワクチンと同時に同部分に投与されるか、あるいは異なる時期にたとえば追加抗原量として投与される。アジュバントはまたワクチンが投与される方法、部位または位置とは異なる方法、部位または位置で動物に効果的に投与される。アジュバントには、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、大腸菌またはコレラ毒、そのＢサブユニットから単離された熱生存または熱に安定なエンテロトキシン、ジフテリア毒、破傷風毒、百日咳毒、フロイト不完全アジュバント、フロイト完全アジュバント等がある。ジフテリア毒、破傷風毒、百日咳毒等の毒系アジュバントは、例えばホルムアルデヒド処理で使用前に不活性化される。
【００６８】
本発明はまた、ブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスに対する感染からこのようなウイルスによる感染に対して保護を必要とするブタにこのようなウイルスに対して免疫学的応答を高めるワクチンを有効量投与することを具備するブタを保護する方法に関する。ブタの呼吸器および生殖器疾病をウイルスおよび病原体に対して“感染よりブタを保護”することは、本発明のワクチンをブタに投与後、対照（感染ブタ）に比較して、ブタの対応する疾病に付随する臨床的疾病の症状（発熱等）が減少（重篤度が減少する）するかなくなることことを意味する。臨床的症状は定量化され（例えば、発熱、抗体計数、および／または灰の病巣）あるいは半定量化される（呼吸困難の重篤性等）。
【００６９】
本発明においては、感染ブタにおける呼吸困難を測定するシステムが開発された。本発明の臨床的呼吸評価システムは下記のような基準で感染ブタの呼吸困難を評価する。
【００７０】
０＝無疾病、正常呼吸
１＝ブタにストレスを与えた時（大量に呼吸を強いた時および／または呼吸回数を高めた時）、軽い呼吸異常、および多呼吸を示す
２＝ブタが休息状態の時、軽い呼吸異常、および多呼吸を示す。
【００７１】
３＝ブタがストレス状態の時、中程度の呼吸異常、および多呼吸を示す。
【００７２】
４＝ブタが休息状態の時、中程度の呼吸異常、および多呼吸を示す。
【００７３】
５＝ブタがストレス状態の時、重篤な呼吸異常、および多呼吸を示す。
【００７４】
６＝ブタが休息状態の時、重篤な呼吸異常、および多呼吸を示す。
【００７５】
本発明の臨床的呼吸得点システムにおいて、評点“０”は正常で、ブタの呼吸器および生殖器疾病に感染していないことを示す。評点“３”は中程度の呼吸器疾病を示し、評点“６”は、重篤な呼吸器疾病を示す。もしワクチンまたは成分を与えられた免疫感作ブタ群がワクチンまたは成分を与えられていない免疫感作ブタ群より低い平均臨床的呼吸評点を示したとすれば、本発明のワクチンまたは成分が有効であったと見なされる。（ブタは非ワクチン接種ブタにおいて疾病を惹起するに十分な濃度の病原体に接触させた時、ブタは免疫感作されたと見なす）。
【００７６】
本発明のワクチン成分は、呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスにまだ接触させないブタに直接投与されることが好ましい。本発明のワクチンは経口的にまたは非経口的に投与される。非経口的投与経路には、皮膚内、筋肉内、静脈下、腹膜内、皮下、鼻腔内投与経路がある。
【００７７】
溶液として投与する場合、本発明のワクチンは、シロップ、エリキシル、チンキ剤等の水溶液の形で調製され得る。これらの組成は当該技術にて公知であり、抗原および他の添加剤を適切な溶媒系に溶解させて調製する。このような溶媒には、水、生理食塩水、エタノ−ル、エチレングリコ−ル、グリセロ−ル、Ａ１液体等がある。当該技術公知の適切な添加剤には、認可染料、香料、甘味剤、チメロサル［thimerosal］（ソデイウム マ−キュリ−チオサリチレ−ト［Sodium ethylmercurithiodslicylate ］）等の抗菌保存剤がある。これらの溶液は、例えば、部分的に過水分解されたゼラチン、ソルビト−ル、または細胞培養培地の添加により安定化され、当該技術にて公知の方法で、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、および／またはリン酸二水素カリウム等の当該技術にて公知の試薬を用いて、緩衝化する。
【００７８】
液体の組成には、懸濁液およびエマルジョンがある。例えば、コロイドミルを使用する懸濁液の調製、および例えばホモジナイザを使用してのエマルジョンの調製は当該技術にて公知である。
【００７９】
体液系に注入するよう考案された非経口投与形態は、ブタの体液と対応する濃度の適切な等張性、ｐＨ緩衝性が必要とされる。非経口投与組成は使用前に殺菌しなければならない。
【００８０】
等張性は塩化ナトリウムおよび必要に応じて他の塩で調節される。エタノ−ルまたはプロピレングリコ−ル等の他の溶剤は構成物成分の溶解性を増し、溶液の安定性増すために使用される。本発明の組成中に使用され得る他の添加物には、デキストロ−ス、汎用の抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレ−ト剤がある。
【００８１】
本発明は、
（Ａ）ブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体を採集し、
（Ｂ）（i)ウイルスまたは病原体をプラ−ク精製し、（ii) ウイルスまたは病原体を不活性化するに十分な温度および時間でウイルスまたは病原体を加熱し、(iii) ウイルスまたは病原体を不活性化させるに十分な量の不活性化化学剤にウイルスまたは病原体を接触させるかまたは混合し、(iv)ウイルスまたは病原体を対応するサブユニットに分解し、少なくとも一つのサブユニットを単離し、(V) ウイルスまたは病原体の表面蛋白をコ−ドしているポリ核酸を合成または単離し、適切なホスト細胞にそのポリ核酸を感染させ、そのホスト細胞を培養し、培養物から表面蛋白を単離することからなる群より選ばれる方法で、ウイルスまたは病原体を処理するというステップを具備する本発明のワクチンを生産する方法に関する。
【００８２】
好ましくは、(i) 感染させたホスト細胞を沈殿させ、(ii)沈殿細胞を溶菌し、(iii) 次の処理工程の前に、ウイルスまたは病原体を遠心分離するという工程で、ウイルスまたは病原体は培養培地より採集される。特に好ましくは、ウイルスまたは病原体を感染させたホスト細胞を採集の前に、適切な培地で培養する。
【００８３】
好ましくは、感染ホスト細胞を培養した後、感染ホスト細胞を汎用のポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）溶液を、感染細胞を沈殿させるに十分な量培地に添加して沈殿させる。沈殿した感染細胞は遠心分離により更に精製する。沈殿細胞は次に当該技術公知の方法で溶菌する。好ましくは、細胞は凍結解凍の繰り返し（３回の凍結解凍が特に好ましい）で溶かされる。沈殿細胞の溶解によってウイルスが放出され、ウイルスは好ましくは遠心分離によって採集される。ウイルスは単離され、セシウムクロライド濃度勾配遠心分離によって精製され、セシウムクロライド濃度勾配から適切なウイルス含有バンドを回収する。
【００８４】
別法として、感染細胞培養物を、細胞を溶菌させるため凍結解凍する。凍結解凍細胞培養物質は、生ワクチンとして直接使用する。しかし、凍結解凍細胞培養物質は（貯蔵用に）凍結乾燥し、ワクチンとしての使用には再水和することが好ましい。
【００８５】
培養培地は緩衝生理食塩水、必須栄養素類、当該技術にて公知の適切な炭素および窒素源をウイルス感染細胞が生育するに十分な濃度で含む。
【００８６】
適切な培養培地はダルベッコ最小必須培地（DMEM) 、イ−グル最小必須培地(MEM) 、ハム培地、メデアム199 、ウシ［bovine］胎児血清、ウシ［calf］胎児血清、ウイルス感染細胞の生育を助成する他の同様な培地がある。培養培地には、牛［bovine］胎児血清（10% 以下）、および／またはＬ−グルタミン（2 mM以下）、または汎用の生育補助剤、および／または抗生物質等の適切な添加剤が供給される。好ましい培地はDMEMである。
【００８７】
本発明のワクチンは、適切な細胞系で培養されたウイルスまたは病原体から調製されることが好ましい。その細胞系には、PSP-36, およびウイルスが感染でき、培養することができるPSP-36均等細胞系が好ましい。PSP-36均等細胞系の例として、PSP-36-SAHがあり、これはブタペスト条約（12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U. S.A.) の下，アメリカンタイプカルチャ−コレクションに受託番号CR11171 で寄託されている。その他の均等細胞系はMA-104で、Whittaker Bioproducts,Inc.(Walkersville, Maryland)から商業的入手可能である。PRRSV のアイオワ株に関連している病原体はブタの螺旋系細胞［turbiinate cells］で培養できることが予備結果で示された。プラ−ク精製後、PRRSV のアイオワ株に関連している病原体は、表Ｉの見出し“アイオワ”で特徴づけされ、図5 - 8 にも示されている病巣を生成する。
【００８８】
従って、本発明はまたウイルスまたは病原体を、好ましくはウイルスが感染でき、培養することができるPSP-36およびその均等細胞系からなる群から選ばれる細胞系中で培養する方法に関する。本発明によるウイルスまたは病原体を培養する方法は、感染細胞系PSP-36またはブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスおよび病原体で感染させる事ができるPSP-36およびその均等細胞系を具備し、その感染細胞系を適切な培地で培養することを具備する。
【００８９】
好ましくは、ウイルスまたは病原体はPRRSV のアイオワ株であり、PRRS、PNP 、および関連疾病からなる群から選ばれた疾病を惹起する。本発明のワクチンは、特に好ましくはPRRSV のアイオワ株から調製され、PSP-36細胞で培養される。細胞系MA-104はサルの腎臓細胞から得られ、上皮細胞状である。MA-104は、ダルベッコ最小必須培地および10％ FBS（牛胎児血清）を含む培養フラスコ中に、集密単層を形成する。単層が形成されると、細胞は、感染ブタ中における適宜な組織（肺および／または心臓）から採取され、10％のホモジナイズされた組織サンプルと共に接種される。ウイルスおよびホスト細胞の成長を許容し、ホスト細胞（バクテリアまたは酵母）以外の細胞の成育および／または生存性を抑制するために適宜な抗生物質が使用されることが好ましい。
【００９０】
PSP-36細胞もMA-104細胞も両方ともPRRSウイルスのある単離物を（10⁷ TCID₅₀／ｍｌ超) 高タイタ−で育成する。PSP-36細胞およびMA-104細胞はまたPRRSV のアイオワ株に関連した病原体を育成する。MA-104細胞は、またロタウイルス、ポリオウイルス、および他のウイルスを育成する。
【００９１】
CL2621細胞はブタ起源ではないと信じられており、上皮細胞状であり、および特許独占である(Boehringer-mannheim) 。PSP-36細胞およびMA-104細胞とは対称的に、PRRSを惹起するウイルスのサンプルのCL2621細胞での培養は成功しなかった（Bautista et al. American Association of Swine Practitioners Newsletter, 4:32, 1992) 。
【００９２】
CL2621細胞は、ブタ起源ではなく、上皮細胞状でありMEM 培地で成育されることが主な特徴である。しかしBenfield et al. ( J. Vet. Diagn. Invest., 1992; 4:127-133)はCL2621細胞はPRRSウイルスを増殖させるために使用されるが、MA-104細胞はポリオウイルスの増殖を制御するために使用されると報告して、CL2621細胞はMA-104細胞と同様ではなく、同一細胞で両ウイルスは増殖されない事を示唆している。
【００９３】
PRRSV のアイオワ株に関連した病原体はPSP-36, PSP-36-SAHおよびMA-104以外の細胞系では通常生育できない。しかしながら、PSP-36およびMA-104またはCL2621細胞でPRRSウイルスのある菌株は生育しないけれども、上述したようにPRRSを惹起するあるウイルスがCL2621細胞および原始ブタ肺胞マクロファ−ジ中の両方で生育すると報告されている。
【００９４】
本発明のワクチンは、ウイルスおよび病原体に接触する患者（この場合はブタ）に免疫的抵抗性を付与できる抗体を調製するために使用され得る。本発明に包含される抗体は、(1) 呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスおよび病原体に対してブタを保護するワクチンか、あるは (2)ブタの呼吸器および生殖器疾病ウイルスおよび病原体自身のいずれかに免疫学的に結合する。本発明の抗体はまた、ブタが呼吸器および生殖器病ウイルスまたは病原体に接触したことがあるか否かを決定する診断剤として、および本発明のワクチンの調製に利用できる。抗体は免疫親和性カラムを調製するために使用でき、免疫親和性カラムはウイルスまたは病原体、または蛋白自身を単離するため使用される。
【００９５】
この様なワクチンまたはウイルスに対する抗体を育てるために、マウス、ウサギまたは他の動物等の接種用の適切なホスト動物を、ワクチンを調製するために使用される蛋白で免疫化しなければならない。そこでホスト動物は上述したタイプのワクチンのうち一つで免疫化（注入され）され、任意に、上述されたような免疫賦活剤（アジュバント）が投与される。ホスト動物は好ましくは１−４週間、最も好ましくは２週間毎のある一定期間をおいて１から５回続けて免疫化される。そしてホスト動物は屠殺され、その血液が採取される。血清が全血液から公知の技術で分離される。その血清はワクチンに対する抗体を含んでいる。抗体はまたイムノグロブリン( IgG ）抗体を付与するため公知の方法で精製される。
【００９６】
本発明はまた本発明のワクチンおよび／またはウイルスに対するモノクロ−ナル抗体を包含する。モノクロ−ナル抗体はKohler et al(Nature, vol. 256 (1975)、pages 495 - 497)の方法で生成される。基本的には、免疫化されたホスト動物（上述した）の脾蔵の全細胞調製物から得られた免疫細胞と、ハイブリド−マを生成するための汎用手法により骨髄細胞と融合される。ハイブリド−マは培養され、結果として得られる培養液で、病原体（ウイルスまたはワクチン）を保持している液体または接種細胞に対しての選別がおこなわれる。ホスト動物の腹膜にハイブリド−マを導入し、ハイブリド−マを腹膜内で成長させる。ホスト動物の腹水を採集すると、ハイブリド−マによって生成される病原体に対するモノクロ−ナル抗体のサンプルが提供される。又、ハイブリド−マ細胞培養からの上澄液は、当業者に公知の方法によって単離され、モノクロ−ナル抗体の源として使用される。本発明の抗体はイムノグロブリンのIgG またはIgM 型であることが好ましい。
【００９７】
本発明は、ブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルス、またはブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスによる感染に対してブタを保護するワクチンと免疫学的に結合する抗体を、必要に応じて生理学的に許容できるキャリアで有効量、ブタに投与する事を具備している呼吸器および生殖器疾病に罹患しているブタを治療する方法に関する。
【００９８】
本発明の方法は、ブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスの分析用診断キットに関するかまたはブタの呼吸器疾病および生殖器疾病に関し、上述した本発明の抗体および該抗体と陽性の免疫学的反応を示す診断用剤を具備している。
【００９９】
本発明の診断キットは公知の免疫蛍光アッセイ( IFA ）、免疫パ−オキシダ−ゼアッセイ(IPA) 、および酵素連結免疫吸着アッセイの手法を改変したものを基本としていることが好ましい。
【０１００】
IFA では、感染細胞はアセトンおよびメタノ−ル溶液で固定され、感染したブタの回復期血清に対する抗体は感染細胞と共に、好ましくは摂氏37度で30分培養される。陽性の免疫学的反応は抗体がウイルス感染細胞と結合する反応で、次の洗浄工程( 通常PBS 緩衝液で３回）においても洗い流されない。次に、蛍光試薬( FITC) で標識した第二の抗体を添加し好ましくはもう30分培養する。陽性の免疫学的反応の結果、第二抗体が最初の洗浄後も保持されている抗体に結合し、その結果、蛍光の信号となり、信号が検出され、半定量できる。陰性の免疫学的反応は、感染細胞に抗体が少ししか結合しないか全く結合しないかの結果になる。従って、第二の、蛍光標識の抗体が結合しなければ、蛍光標識は洗い流され、適切な陽性対照に比べて蛍光は少ししか検出されないか全く検出されない。
【０１０１】
IPA およびELISA キットは、第二抗体が蛍光試薬の代わりに特異的酵素で標識されている以外はIFA キットと同様である。この様に、第二抗体に結合している酵素の基質が添加されるとその結果色付生成物が生成され、そしてこれが検出され、例えば色素計で定量される。
【０１０２】
本発明の他の特徴は、以下の例示実施態様の説明の過程において明らかになるであろう。この例示実施態様は、本発明を説明するために提供されるものであって、それらに限定することを意図するものではない。
例 １
例１では、５〜８週齢のブタにおける特定の地方に限定された肺炎のケースを考察した。ブタで観察されたPRRSV のアイオワ株に関する顕微鏡視的な病変は、ウィルスの感染が原因であることを裏づける。（それ故、以後は議論を簡単にするために、ここでは“ウィルス”及び“ウィルス性”と言う用語は、上述の意味に於けるウィルスもしくは感染性の病原体またはそれ自体の特性について使うこととする。）0.22μｍのフィルターでろ過した、感染ブタ由来の肺のホモジネートを用いて、この病気を通常のノトバイオートブタに実験的に伝染させた。ブタのウィルス性の呼吸器系の一般的な病原体は示されなかった。２つのタイプのウィルスの粒子が電子顕微鏡によって細胞培養液で観察された。１つのタイプは、直径70ｎｍで外膜に覆われ、短い表面スピクルを有していた。もう１つのタイプは外膜に覆われ、細長く、多態性で、大きさは80×320 ｎｍであり、抗体によりコートされていた。
（Ｉ）材料と方法
（Ａ）自然発生肺炎に感染したブタ由来の材料
南西アイオワで子をはらんでない肥育用家畜メスブタ900 頭の一集団から 6週齢の感染した 3頭のブタ由来の組織を収集し、研究に用いた。この集団に関する事前の観察によると離乳後 5〜 7日で、同様に感染したブタの50〜70％が食欲不振となり、ラフ- ヘアード［rough-haired］となり、無気力、咳、発熱及び“サンピング”を示した。感染したブタの10〜25％は結膜炎を患っていた。感染したブタのほとんどは、7 〜10日間で回復したが、10〜15％のブタは２次的な細菌の感染により重い発育阻害が生じ、食用ブタとして販売できなかった。死産、ミイラ化した胎児、不妊症を含むブタの生殖減退は、この集団での病気の最初の発生と同時に起こった。しかし、それは後に時間がたつと共に減退した。この授乳期［nursery stage ］での呼吸器系の病気は継続していた。
【０１０３】
肺の病変は、 4頭の異なる 6週齢のブタのホルマリン固定化組織において増殖性細気管支炎や肺胞炎が認められたことにより特徴づけられた。SIV 、シュードラビーズウィルス（PRV ）や脳心筋炎ウィルス（EMCV）を単離する試みは成功しなかった。ブタのインフルエンザウィルス、シュードラビーズウィルス（PRV ）やMycoplasma hyopneumoniaeについての肺の凍結切片を用いた免疫蛍光検査は、陰性だった。Pasteurella multocida タイプＤが鼻腔から単離され、Haemophilus parasuis が肺から単離された。
【０１０４】
10日間乳を飲ませなかった 5〜 6週齢の急性発病した 5頭のブタが引き続いてこの集団から得られた。全てのブタの体温は少なくとも40.5℃だった。このブタを解剖した。そして、ウィルス性肺炎に最も典型的な肉眼視的病変をもつブタから肺組織サンプルを集めて調製し、通常の特殊な無菌ブタ（SPF ）に直ちに接種した。 5〜 6週齢の急性発病した 5頭のブタ全てからの、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脳および心臓の組織サンプルを、通常の細菌性及びウィルス性病原体について培養した。同じ組織の切片を組織病理学的考察のために集め、10％の中性ホルマリン緩衝液で固定した。
【０１０５】
（Ｂ）通常のブタにおける実験的な伝染
(1)実験用ブタ
16頭の 5週齢のブタが、マイコプラズマ、PRV 、ブタ呼吸器系コロナウィルス（PRCV）、伝染性の胃腸炎ウィルス（TGEV）に感染していない一集団から得られた。コンクリートフロアーの自動換気された２つの独立した 4× 5ｍの部屋の各々にブタを 8頭ずつ入れた。このブタは蛋白（含量）が18％のトウモロコシ- 大豆の食料と任意に水を与えられた。
【０１０６】
(2)実験のデザイン
自然発生肺炎によるブタを剖検した後直ちに、ダルベッコ改良イーグル最少必須培地中に10％の肺ホモジネートを調製して1000×ｇで10分間清澄化し、続いて10,000×ｇで10分間遠心分離を行なった。清澄化した上澄みを、0.22μｍのフィルターでろ過した。 8頭のブタに、ろ過した肺ホモジネート 5ｍｌを鼻腔内に接種した。 8頭のコントロールには、通常の感染していないノトバイオートブタから上記の通り調製し、ろ過した肺ホモジネート 5ｍｌを鼻腔内に接種した。
【０１０７】
臨床的な兆候と体温がモニターされ、毎日記録された。各々のグループから１頭のブタを接種後（DPI ） 5、 7、10および15日目に安楽死させ、剖検した。好気的かつ嫌気的細菌単離法、マイコプラズマ単離、Mycoplasma hypopneumoniae SIV 、PRV 、パラインフルエンザウィルス（BRSV）のための抗原検出、さらにウィルス単離のために、剖検の際に組織を収集した。組織は組織病理学的な検査のために、10％中性ホルマリン緩衝液で固定した。肺は剖検の際に、ホルマリンを用いて膨張させることにより固定した。
【０１０８】
（Ｃ）ノトバイオートブタでの実験的な伝染
(1)実験用ブタ
初乳を与えられていない帝王切開由来で（CDCD）、雑種の、生後一日のノトバイオートブタ 8頭をランダムに２つのグループに分けた。( 各々のグループは 4頭) 。ブタは鉄が添加されかつ滅菌された缶詰の牛乳代替物を与えられた。(SPF-LAC,Pet-Ag Inc . Elgin, Illinois.)
(2)実験のデザイン
生後３日齢の４頭の本試験用［principle ］ブタに、肺ホモジネートろ過物（0.22μｍ）を鼻腔内に（ 3ｍｌ）および経口的に（ 1ｍｌ）接種した。このろ過物は、感染後(post -infection) ７日目に集められた実験的に感染させた通常のブタの肺から調製された。もう１つの４頭のコントロールのブタニは、通常のノトバイオ−トブタから調製された肺ホノジネートを接種した。
【０１０９】
各々のグループから１頭が接種後5 、9 、28そして35日目で殺された。肺、肝臓、腎臓、脳、脾臓、胸線、鼻甲介［nasal turbinates］、心臓そして腸を組織病理学的な検査のために10％中性緩衝ホルマリンで固定した。肺、脳、脾臓、心臓は、ウィルスの単離のために収集された。肺、肝臓、脾臓は、細菌学的な単離のために収集された。肺は、マイコプラズマ単離のためにフリース［Friis ］培地に即座に収集されるか、-70 ℃で凍結された。
【０１１０】
（Ｄ）微生物学的な分析
(1)ウィルス単離
1000×ｇで清澄化した組織懸濁液（10％ W/V）を細胞単層に接種し、細胞病理学的な影響を観察した。ブタ胎児の一次腎臓（細胞）培養物、ブタの肺胞の一次マクロファージ培養物、PK15の継代細胞株、ウシ甲介［turbinate ］、授乳期のハムスターの腎臓（BHK ）、ベロ［Vero］、ブタ精巣（ST）がウィルス単離を試みるために用いられた。気管支- 肺胞直接洗浄物培養物を、感染並びに対照ノトバイオートブタから調製した。ウィルスを検出する試みは間接的な免疫蛍光法によりなされた。それは、ブタのパーボウィルス（PPV ）、SIV 、ウシウィルス性下痢ウィルス、血球凝集性脳心筋炎ウィルス（HEV ）、TGEV、EMCVに対するノトバイオートの高度免疫ブタ血清もしくは回復期ブタ血清をレファレンスに用いた。10日目の胚を含有する鶏卵の尿膜内へ濾液を接種することにより盲目的な継代を 3回行ない、各継代の後に血球凝集活性について尿膜液を試験した。
【０１１１】
(2)マイコプラズマの単離
肺懸濁液を、マイコプラズマブロス培地フリース（Ferris(1975), Acta Vet, Scand., 27,337）、BHI-TS, D-TS（Ross et al (1971), Journal of Bacterioplogy, 103,707）および BHL（Yamamoto et al (1982), Proc.Int. Pig Vet. Society Congress, P.94）に接種した。培養物を、明らかに生育した時、または 3、 7、14、21日目に継代し、落射免疫蛍光法［epiimunofluorescence］により同定した（Del Giudice et al (1967), Journal of Bacteriology, 93,1205）。
【０１１２】
(3)細菌の単離
鼻甲介から綿棒で集めた標本を、マッコンキー［MacConkey ］、テルギトール-7［tergitol-7］、PMD （P. multocida単離用）寒天培地の他に、２つの血液寒天平板培地に接種した。１つの血液寒天平板培地は、ＣＯ₂ とＨ₂ ガスによる嫌気的な環境下で、37℃で培養した。もう１つのプレートはStaphylococcus epidermidisの培養コロニーを用いて交差画線培養を行い、他のプレートとともに37℃で好気培養を行った。
【０１１３】
肺を、鼻甲介から綿棒で集めた標本のように正確に塗布した。肝臓と脾臓は２つの血液寒天培地（嫌気的なものと好気的なもの）とテルギトール-7培地で培養した。全ての細菌の単離体は、標準的な方法によって同定した（Biberstein (1990), In: Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology, ed. Carter et al, 5th ed., pp.129-142, Academic Press Inc., San Diego Cal.; and Carter(1990) In: Diagnostic procedures inVeterinary Bacteriology and Mycology, ed. Carter G.R. and Cole J.R., 5th ed., pp.129-142, Academic Press Inc., San Diego, Cal. ）
(4)血清学
PRV 、TGEVまたはEMCVに対する血清抗体のテストには、血清中和テストを用いた。EMCVまたはHEV に対する血清抗体テストには、血球凝集阻害テストを用いた。BRSV、PI-3、SIV またはTGEVに対する血清抗体検出には、間接免疫蛍光テストを用いた。ノトバイオート血清を、PRRSV に対する抗体についてテストした。PRRSV 抗体の検出のために、CL2621細胞系を用いた間接免疫蛍光分析を用いた。
（II）結果
（Ａ）自然発生肺炎
急性罹患ブタ由来の肺は、虚脱していなかった。肉眼視的には、この肺は、中度の小葉間の浮腫、およびあらゆる肺葉を通じて多病巣性ないし線状に癒着した領域をもつ拡張不全肺となっていた。上部と中部の肺葉に 5 - 15 ％の頭腹部［cranioventral ］硬化がみられた。組織病理学的試験により、中度の、急性び慢性増殖性細気管支炎および肺炎が認められた。軽度の多病巣性リンパ形質［lymphoplasmacytic ］心筋炎がみられた。他の器官での病変はみられなかった。
【０１１４】
アデノウィルス、PRV 、SIV 、HEV 、ブタ呼吸器系コロナウィルス（PRCV）、ブタパーボウィルス（PPV ）、EMCV、およびエンテロウィルスに対するウィルス単離の試みは、この集団から後に得られた急性罹患ブタからのものと同様に元々の場合の感染でも認められなかった。
【０１１５】
凍結肺切片の免疫蛍光法検査では、Mycoplasma hyponeumoniae、SIV 、ウシ呼吸器系多核性［syncytial ］ウィルス, パラインフルエンザウィルス-3（PI-3）、PRV やTGEV抗体を明らかにできなかった。
【０１１６】
上記(I)(A)項の 5頭の通常の SPFブタ由来の１つの血清からは、間接的な免疫蛍光法により、PRRSV の1:20の希釈で陽性のイムノグロブリン反応を得た。このブタの鼻甲介や肺からはそれぞれ Pasteurella multocida Ｄ型と Haemophlilus parasuisが単離された。ホモジネートおよび接種のために選ばれた急性罹患ブタの肺からは、好気的または嫌気的な細菌は単離されなかった（上記(C)(2)項の材料と方法参照）。
【０１１７】
（Ｂ）通常のブタの研究
7 DPIで、本試験用のブタは全て体温が40〜41.1℃であり、中度の呼吸器系障害を呈した。このブタは、食欲不振で無気力であった。15 DPIで、これらのブタは回復した。
【０１１８】
肺内での顕微鏡視的な変化は、虚脱がないことや軽度な肺葉内の浮腫そして肺の 20 - 40％を散在的に占める無気肺の黄褐色の線状領域によって特徴づけられる。
【０１１９】
7 DPIの肺の顕微鏡検査により、II型肺細胞［pneumocyte］増殖、肺胞内腔における混合炎症細胞および壊死細胞残渣の蓄積、および肺胞隔膜におけるマクロファージおよびリンパ球の浸潤によって特徴付けられるパッチ状間質性肺炎が明かとなった。肺胞の内腔は蛋白性の液を含んでいる。時折、肺胞内の内腔や隔膜壁にシンシチウム様の細胞が見られた。
【０１２０】
図５は、ヘマトキシリンーエオシン染料で染色された、10 DPIの通常のブタの肺由来の組織学的な切片を示している。拡張しているII型肺細胞増殖（矢印）や肺胞間隔内に壊死細胞残骸（矢印先）がある。10日目に観察された病変の状態と様子は、 7日目のものと同様であった。
【０１２１】
図６は、ヘマトキシリンーエオシン染料を用いて染色した、10 DPIの通常のブタの肺からの別の組織学的な切片を示している。シンシチウム様の細胞（矢印）が肺胞の間隔に存在する。 7日目よりも10日目の方が、明白なII型肺炎の増殖とより多くのシンシチウアが観察された。
【０１２２】
15 DPIでは、病変は依然としてやや激しいものであったが、ブタは臨床上は正常のようにみえた。細菌、マイコプラズマも肺から単離されなかった。EMCV、PRV 、PRCV、アデノウィルスまたはSIV のウィルスを単離する試みは、ネガティブであった。凍結肺切片の免疫蛍光検査では、BRSV、PI-3ウィルス、PRV 、SIV 、TGEVまたは Mycoplasma hyopneumoniae 抗原は示されなかった。
【０１２３】
コントロールのブタにおいては、肉眼視的もしくは顕微鏡視的な病変は見られなかった。
【０１２４】
（Ｃ）ノトバイオートブタの研究
本試験用の全ての接種されたブタは、5 DPI までに重い呼吸器系障害や“サンピング”を経験した。体温は40.5℃またはそれ以上で、食欲不振、無気力を呈した。このブタは 8 DPIまでに臨床上回復し、15 DPIまでには臨床上正常にみえるようになった。どのブタも死ななかった。正常な肺ホモジネートろ過物を接種されたコントロールブタは、臨床上正常なままだった。
【０１２５】
5 DPI までの顕微鏡視的な病変は、虚脱していない肺、軽度の多病巣性の赤褐色の［tan-red ］拡張不全肺および軽い小葉間浮腫により特徴づけられた。顕微鏡視的には、肺の複数領域での肺胞隔膜の単核細胞浸潤および中度のII型肺細胞増殖を伴う軽い広汎性の間質性肺炎があった。肺胞内腔内に炎症細胞、壊そした細胞残骸と蛋白性の液の蓄積があった。他の器官には病変は見られなかった。
【０１２６】
9 DPI までに、肺は虚脱せず、中度の小葉間浮腫、および多病巣性の硬い赤褐色の拡張不全肺の 1 - 3ｃｍの領域があった。図７は、ヘマトキシリン- エオシン染料を用いて染色した、9 DPI までのノトバイオートブタの肺由来の組織学的な切片を示す。中度のII型肺細胞増殖（矢印頭）、そしてシンシチア様の細胞の形成（矢印）があった。顕微鏡的には、II型肺細胞増殖が更に広がっていることを除くと、病変は 5 DPIで観察されたものと同様であり、内腔内で肺胞隔膜に沿ってシンシチア様の細胞が少数あった。腎臓には膨張した腎細管があり、そのいくつかにはリンパ形質の滲出と細胞残骸が見られた。
【０１２７】
28 DPIまでに、先端及び中肺葉で20％の頭腹部両側の拡張不全肺があった。同時に他の肺葉内では 1 - 2ｃｍの病巣領域を有する拡張不全肺が認められた。顕微鏡学的には、肺の病変は、9 DPI までに観察されたものと同様であったが、それに加えて細気管支周辺［peribronchiolar ］や動脈周辺［periarteriolar］に軽度のリンパ形質蓄積があった。軽度ないし中度のリンパ球および形質細胞の浸潤が、多病巣的に、脈絡膜の網状構造、髄膜、心筋炎, 鼻甲介において見られた。
【０１２８】
図８は、35 DPIで、肺の病変は弱まったが、多病巣性リンパ形質性の心筋炎が明かとなったことを示している。PRV 、SIV 、アデノウィルス、EMCV、HEV 、PPV 、エンテロウィルス、PRCVのウィルス単離の試みは成功しなかった。細胞変性効果は、ブタの肺胞のマクロファージ内で観察され、細胞の丸まり［rounding］、細胞溶菌、細胞死により特徴付けられた。気管支- 肺胞洗浄物の直接培養物が広がったシンシチアを発現することを図９に示す。ここではコントロールブタから調製された同様の培養物での観察は示されていない。これらの培養物のネガティブ染色免疫電子顕微鏡法による試験から、２つのタイプのウィルス様粒子が明かとなった。１つのタイプは図10で示すように、直径約70ｎｍで外膜に覆われ、短い表面のスピクルを持っていた。もう一方のタイプは、図11で示されるように外膜で覆われ、多態性で、大きさ約80×320 ｎｍで、抗体によりコートされていた。細菌は、肺、肝臓、脾臓、脳からは単離されなかった。
【０１２９】
28 DPIおよび35 DPIで集められた血清では、SIV 、EMCV、TGEV、BRSV、HEV,またはPI-3ウイルスへの抗体価は得られなかった。これらの血清は、PRRSウイルスの抗体に対し陽性（1:1280）であった。
【０１３０】
コントロールのブタは、研究を通じて正常であり、著しい顕微鏡的な病変はどの組織にも見られなかった。コントロールのブタからは、細菌もしくはウィルスは単離されなかった。
（III ）論考
実験的に接種された通常およびノトバイオ−トブタにおいて、自然発生の特定の地方に限定された肺炎にかかっているブタ由来の肺ろ過物は、肺や心臓に病変をもたらした。自然発症または実験的な感染でも観察されたこの病変は、ウィルス性要因からなる。
【０１３１】
一般的に同定されたブタのウイルス性呼吸器系病原体は以前には単離されていない。細胞変性効果が観察され、本試験用のブタの肺胞のマクロファージ培養細胞の溶菌により特徴づけられた。これは、Yoonら(Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, vol. 4 (1992), p . 139)によるPRRSウィルス感染の報告と一致する。しかしながら、この研究でみられた直接的な気管支- 肺胞洗浄培物培養での多数のシンシチアは、PRRSでの以前の報告では見られなかった。
【０１３２】
感染細胞の培養物の電子顕微鏡観察では、２つのウィルス様粒子が示された。表面上に短いスピクロを有する70ｎｍ径の外膜に覆われたウィルス様粒子の外見は、Benfieldら(Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, vol. 4 (1992), p. 117) により報告されたPRRSウイルスと一致する。しかし、もう一方のウィルス様粒子は異なっているように思われる。SIV 、PRV 、TGEV (PRCV) およびEMCVに対する抗体価はどのブタも発現していなかった。
【０１３３】
例Ｉにおいて再現された臨床上の疾患は、5 DPI 以内に、あらゆる接種されたノトバイオートおよび通常のブタにおいて、重い呼吸器系の障害を和らげることにより特徴づけられた。この実験における病気は、以前の実験で観察されたよりさらに重症であった(Collin et al a nd Yoon et al supra)。
【０１３４】
Morin らによって最近同定されたSIV A 型変異体(Canadian Veterinary Journal, Vol. 31 (1990),p.837 )について記述された、末端の器官上皮細胞の壊死や増殖は、例Ｉでは観察されなかった。aSIV（Morin et al, and Girard et al, 上述）と関連のある肺胞に沿った繊維素の沈澱や硝子質の膜は観察されなかった。例Ｉにおいて、15 DPIを越えて生存したブタで観察された重い非化膿性の心筋炎はaSIV（Morin et al, and Girard et al,上述）とは関連がない。ブタはSIV に対し血清変換しなかった。そしてSIV は胚を有する鶏卵での継代では検出されなかった。
【０１３５】
PRRS発生および実験的な接種において圧倒的に見出だされる肺の病変では、単核細胞による間質性の浸潤が顕著にみられた（Collins et al, Pol et al, supra ）。例Ｉの感染したブタにおいて観察されたII型肺細胞増殖、シンシチア細胞形成および心筋炎は、他では観察されなかった。例Ｉのろ過性病原体で一貫して再現される病変は、この研究で示された病気、そしてそれは我々がPRRSV のアイオワ株と名付けた物であるが、本病気は独特なウィルス源もしくは別の病原体とPRRSV ウィルスとの組み合わせにより引き起こされることを示唆している。
例 II
（Ｉ）材料と方法
（Ａ）野外における供試材料と罹病経過
持続的な重い授乳期の肺炎を伴うPRRSの発生をうけ、もとの42頭の生まれた子供うちわずか20頭しか生きているブタが残っていない一集団から一頭のブタが得られた。このブタを解体し、肺組織のサンプルを集め、標準的な無菌ホモジネーション技術を用いてホモジネートした。イーグル最少必須培地（MEM ）にて調製した肺ホモジネート（10％ W/V）および0.22μｍのフィルターでろ過したものを接種源として用いた。
【０１３６】
（Ｂ）細胞
PSP-36と名付られた継代細胞系は、Whittaker Bioproducts,Inc.（Walkersville, Maryland）から購入したMA-104細胞由来のものである。PSP-36細胞のサンプルを別々に繁殖させ、この細胞系をPSP-36-SAHと名付た。ブタ肺胞のマクロファージ、および例を下記表IIに示す約90の他の細胞系をウィルスの単離に用いた。
【０１３７】
【表２】

（Ｃ）ウイルス単離
上述のように調製された肺ホモジネート物を、2,000 ×ｇもしくは 3,000ｒｐｍで、 4℃、15分間清澄化した。上清を0.22μｍのフィルターでろ過した。ろ過物を、上記（Ｂ）項に示した細胞系の各々に接種した。培養物は、引き続き 0-4％のウシ胎児血清（FBS ）および抗生物質を含む適当な培地に維持された。細胞系は、細胞病理学的効果（CPE ）について毎日モニターした。CPE が 8〜 9日内で観察されなかい場合には、培養物を 2-3回盲目的に継代した。わずかなCPE が観察された場合には、培養物をISU-12に対する回復期ブタ抗血清を用いて間接免疫蛍光分析法（IFA ）で検査した。
【０１３８】
（Ｄ）ウィルス力価
ISU-12単離体の一連の10倍希釈溶液を、 2％のFBS と 1×抗生物質を加えたダルベッコ最少必須培地(DEM) で調製した。各々の希釈溶液（ 0.2ｍｌ）を、PSP-36細胞およびLab-Tek チャンバー内で播種されたブタの肺胞マクロファージ培養細胞の各々の入ったウェルのそれぞれに同様にして接種した。接種後（DPI ） 3日目に、このチャンバーを、冷80％アセトンおよび20％メタノール溶液を用いて、 4℃で15分間固定した。その後、このチャンバーを、IFA において回復期のISU-12抗血清と抗-PRRS ウイルス血清を用いて染色した。
【０１３９】
（Ｅ）間接的な免疫蛍光分析法（IFA ）
PSP-36細胞とブタ肺胞マクロファージ培養物をISU-12単離体に感染させた。感染から20および48時間後、培養物を冷80％アセトンおよび20％メタノール溶液を用いて4 ℃で15分間固定した。IFA は、ISU-12回復期血清並びにSouth Dakota State University, Brookings, South Dakotaから購入した抗PRRSV 血清および抗PRRSV モノクローナル抗体を用いて行われた。コントロールとして非感染PSP-36細胞とマクロファージ培養物が用いられた。
【０１４０】
（Ｆ）放射性免疫沈降分析（RIP ）
ISU-12単離体と偽感染 PSP-36 細胞を、³⁵Ｓ- メチオニンおよび³⁵Ｓ- システインでラベルした。25ｃｍ³ フラスコ内で、 3日齢のPSP-36細胞を、10⁴ TCID₅₀のISU-12ウィルス 0.5ｍｌで感染させた。感染から24時間後、この培地をメチオニンとシステインがはいっていないDMEM培地と置き換え、37℃で 1時間インキュベートした。その後、この培地を、100 μci/ml の³⁵Ｓ- メチオニン（³⁵Met ）と³⁵Ｓシステイン（³⁵Cys ）を加えた新しいメチオニンとシステインがはいっていないDMEM培地に置き換えた。³⁵Met と³⁵Cys の添加の 5時間後、細胞を冷リン酸緩衝液（PBS ）、ｐＨ 7.2で３度洗浄した。その後、フラスコから回収し、1,000 ×ｇ、 410分間の遠心分離によりペレットにした。このラベルされたウィルス蛋白と偽感染細胞を含んだペレットを、溶菌緩衝液で破壊した後、細胞残渣をZhu らの方法（Am. J. Vet. Res., 51:232-238 (1990) ）に従う遠心分離により清澄化した。次いで、溶解物を、冷した正常なPSP-36細胞溶解物に予備吸収された［preabsorbed ］ISU-12回復期血清および抗-PRRS ウィルス血清と共に 4℃で一晩インキュベートした。セファロース- プロテインＡビーズ（Sigma Chemical Co., ST. Louis, Missouri から購入）を添加し、 2時間室温に放置することにより免疫複合体を集めた。その後、このセファロース- プロテインＡビーズと免疫複合体の混合物を、溶菌緩衝液で 3度、滅菌水で 3度洗浄した。この混合物を50μｌのサンプル緩衝液に再懸濁し、前述のZhu らによって示されたようにSDS-PAGEゲルで電気泳動した。
【０１４１】
（Ｇ）電子顕微鏡（EM）
PSP-36細胞を、25ｃｍ³ フラスコ内でISU-12ウィルス に感染させた。感染から48時間後、この感染した細胞を 3％グルタルアルデヒド（ｐＨ 7.2）を用いて 4℃で 2時間固定した。その後、この細胞をフラスコから回収し、遠心分離によりペレットにした。この細胞ペレットを加工し、プラスチックに埋め込んだ。このプラスチックに埋め込んだ細胞ペレットを薄い切片にして染色し、Paulらによって示されたように（Am. J. Vet. Res.,38:311-315(1976) ）、透過型電子顕微鏡にて観察した。
(II)ブタの生殖器および呼吸器疾患の実験的再現
（Ａ）実験 92.1 SPF
上記のISU-12由来の肺ろ過物を、 5週齢の特殊な無菌(SPF) ブタ 6頭の鼻腔内に接種した。このブタを、接種後 3、 5、10、28および43日めに殺した。
【０１４２】
（Ｂ）実験 92.3 SPF
6頭のSPF 雑種のブタに、 5週齢で、鼻腔内にISU-12肺ろ過物と感染したブタ肺胞マクロファージ材料を接種した。このISU-12に感染したブタは、接種後10および28日目に壊体された。
【０１４３】
（Ｃ）実験 92.10 SPF
3頭の 5週齢のブタに、105 TCID50／ｍｌのウイルスを含んだPSP-36で増殖したISU-12を鼻腔内に 3ｍｌ接種した。本試験用のブタは、接種後 5、10および28日目に解体した。コントロールブタは、接種後 5、10日目に解体された。
【０１４４】
（Ｄ）実験 92.12SPF
5週齢のブタ22頭を 6つのグループに分けた。グループＩでは、 6頭のブタ（本試験用）に、10⁵ TCID50／ｍｌのウィルス含むPSP-36で増殖させた、プラーク精製 ISU-12 （プラークNo.1）ウィルスを鼻腔内に 3ｍｌ接種した。グループIIでは、 6頭のブタに、コントロール細胞培養液を接種した。グループIII （プラークNo.2）およびグループIV（プラークNo.3）の各々では、 2頭のブタにプラーク精製ISU-12を接種した。グループＶでは、 3頭のブタに精製されていないプラークのISU-12を接種した。グループVIでは、 3頭のブタにISU-12組織ろ過物を接種した。
【０１４５】
接種後 5、10および25日目でグループＩとIIの各々から、 2頭の本試験用のブタと２頭のコントロールのブタを剖検した。プラークNo.2と 3を接種された 2頭のブタは、各々接種後10日目に剖検した。グループＶとIVのそれぞれ１頭のブタを、接種後 5、10および25日目に剖検した。
【０１４６】
（Ｅ）顕微鏡視的考察
剖検後、肺、脳、心臓そして脾臓を集め、10％の中性ホルマリン緩衝液で固定してパラフィンに埋め込み、そしてヘマトキシンとエオシンで染色した。
（III ）結果
（Ａ）ウイルスの培養
(1)ブタ肺胞マクロファージ培養物より単離されたISU-12の培養
ISU-12肺ろ過物に感染したブタ肺胞マクロファージ培養内において、細胞病理学的効果が接種後 2-3日目に始まるのが観察された。細胞病理学的効果は、マクロファージと溶菌細胞の凝集により特徴づけられる。ISU-12に感染した培養中のマクロファージ培養物の約90％が接種後 4-5日目で細胞病理学的効果を示した。図12(A) は、細胞病理学的効果は非感染マクロファージ培養液では観察されないことを示している。第３継代のマクロファージ培養液中におけるISU-21ウイルス価は10⁴ - 10⁵ TCID₅₀／ｍｌであった。
【０１４７】
図12(C) で示したように、ノトバイオ−トブタ由来ISU-12回復期血清を用いることにより、ISU-12感染ブタ肺胞マクロファージ培養物の細胞質内で、間接的な免疫蛍光分析(IFA) によりウイルス抗源が検出された。免疫蛍光は接種していないマクロファージ培養物では検出されなかった。
【０１４８】
(2)継代細胞系上でのISU-12単離体の培養
テストした約90の細胞系のうち（上記の“材料と方法”の（Ｂ）項参照）、ウイルスの複製の証拠が以下に示す 6株の細胞に認められた。それは、PSP-36、PSP-36-SAH、MA-104、滑膜細胞、肺胞のマクロファージ細胞、ブタ鼻甲介細胞である。
【０１４９】
図13(B) は、接種後 2日目で細胞病理学的変化が始まり、それが変性、細胞の丸め込み［rounding］および凝集によって特徴づけらることを示している。接種後 3-4日目、丸め込まれた細胞の凝集が増加し、いくつかの凝集は融合した。丸め込まれた細胞の多くは細胞単層から分離し、引き続いて単層の分解を引き起こした。接種後 5日め、細胞病理学的効果はかなり激しくなり、典型的には単層の95％をこえるものが関与した。図13(A) で示されるように、コントロールPSP-36細胞には細胞病理学的効果は観察されなかった。このISU-12単離体は、PSP-36細胞において高いウィルス価に生育し、11回の細胞継代培養で約10⁶ - 10⁷ TCID₅₀／ｍｌであった。
【０１５０】
ウィルス性抗原は、ISU-12肺ろ過物を実験的に感染させたノトバイオ−トブタ由来回復期血清と感染した細胞の細胞質で検出された（図14(B) 参照）。蛍光はコントロールPSP-36細胞からは検出されなかった（図14(A) ）。
（III ）ウィルスの特性
（Ａ）PRRSウィルスに対するISU-12の抗原類縁性
免疫蛍光分析法（IFA ）における明るい細胞質の蛍光（図14(C) 参照）により立証されるように、PRRSウィルス単離体 VR-2332 に対するモノクロール抗体（Dr. Benfield, South Dakota State Univesity, Brookings, south Dakota から購入）と抗-PRRSV血清（USDA National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowaから取得）はISU-12感染PSP-36細胞と反応したが、非感染PSP-36細胞とは反応しなかった。
【０１５１】
（Ｂ）ウィルスの蛋白
抗ISU-12回復期血清と抗PRRSウィルス血清を、ウィルス蛋白を分析するために用いた。 2つの血清は少なくとも 4つの蛋白を認識し、各々分子量は19、24、32および61ｋＤであった（図15）。図15では、偽感染（レーン 2と 3）及びISU-12感染（レーン 4-7）が、抗ISU-12血清（レーン 2と 5）、抗PRRSV 血清（レーン 3と 4）、抗PRRSV モノクローナル抗体（レーン 6）またはウサギ抗PRRSV 血清（Dr. Benfield, South Dakota state University, Brookings, south Dakotaより取得）と免疫沈降した。レーン 1と 8は分子量マーカーを流した。これらの蛋白は偽感染PSP-36細胞においては明らかではなかった。
【０１５２】
（Ｃ）ウィルスの構造
55-85ｎｍの範囲の典型的なウィルス粒子がISU-12が感染したPSP-36細胞内で観察された。このウィルス粒子は外膜に覆われ、球状で、ISU-12が感染したPSP-36細胞の細胞質小胞内に存在した。
（IV）実験的な病気の再現
（Ａ）実験 92.1 SPF
上述のISU-12由来肺ろ過物を、 5週齢の特殊な無菌ブタ（SPF ） 6頭の鼻腔内に接種した。ブタを、接種後（DPI ） 3、 5、10、28および43日目に殺した。接種後 3日めに、ISU-12感染ブタは、重い呼吸器系の障害と発熱を呈した。これらの兆候は 10-14日間持続した。肉眼視的な肺の病変は、肺の60％が重い多病巣性の黄褐色硬化していることにより特徴付けられた。また、中度の心臓肥大と腹水の蓄積がみられた。顕微鏡視的な変化は、II型肺細胞増殖を伴う重症な間質性肺炎増殖、シンシチア細胞の形成、肺胞の滲出、単核細胞による軽度の間質性濃厚化により特徴づけられた。軽度の非化膿性［nonsuppurative］心筋炎、重い脳炎および中度のリンパ形質の腎炎があった。10および28日目に剖検したISU-12実験ブタは、NVSLによって確認されたようにPRRS剤に血清変換されていた。
【０１５３】
（Ｂ）実験 92.3 SPF
あらゆるISU-12接種SPF ブタは、 3日以内にひどい呼吸器系の障害を示し、これは14日を越えて持続した。肉眼視的病変は、肺のうっ血、浮腫、顕著な多病巣性び慢性肝変により特徴付けられた。顕微鏡視的には、重い増殖性間質性肺炎、中度の腎炎、中度の心筋炎および軽度の脳炎が観察された。接種後10および28日目に解体されたISU-12感染ブタは、NVSLにより確認されたようにPRRSへ血清変換されていた。
【０１５４】
（Ｃ）実験 92.10 SPF
接種されたブタの臨床上の兆候には、接種後 5-22 日目で観察された、ひどいし眠、発熱、中度の食欲不振および中度のもしくはひどい呼吸器系の障害が含まれる。中度の涙目［tearing ］は実験の間ずっとこれらのブタで見られた。顕微鏡視的な病変には、接種後 5日目で軽度の増殖性間質性肺炎、ひどいネクロプルレント［nercropurulent］扁桃炎が含まれた。接種後10日目では、II型増殖を伴う中度の多病巣性PIP 、肺胞の滲出、多核巨大細胞、シンシチア様細胞形成が観察された。また、接種後10日目では、血管周囲の筋腱袖および神経膠症を伴う中度の多病巣性脳炎が観察された。接種後10日目では、軽度の門脈周囲のリンパマクロファージ肝炎、軽度な非化膿性心筋炎および鼻炎が検出された。接種後26日目では、単核細胞による顕著な多病巣性間質性濃厚化、中度の多病巣性II型肺細胞増殖、少量の混合した肺胞の滲出、リンパ球とマクロファージの細気管支周囲の筋腱袖の緩みにより特徴付けられる重度の間質性肺炎が見られる。また、中度の多病巣性心筋炎、軽度の肝炎、軽度の腎炎、扁桃炎がみられた。 2頭のISU-12感染ブタは接種後10日目でPRRSへ血清変換した。
【０１５５】
コントロールブタは、実験継続中臨床的に正常であり、肉眼視的および顕微鏡視的な病変は示されなかった。このブタは、PRRSに対して血清反応陰性であった。
【０１５６】
（Ｄ）実験 92.12 SPF
生物学的にクローン化されていないISU-12は、SPF ブタに対し病原性があり、上述の実験 92.10 SPFで示されるように、間質性肺炎、心筋炎、脳炎を引き起こす。ISU-12の 3つの生物学的クローン（プラークNo.1、 2および 3）を接種されたブタは、軽度の間質性肺炎を引き起こした。しかしII型肺細胞増殖、肺胞の滲出、心筋炎、および／または脳炎の証拠はこれらのブタからは検出されなかった。クローン化され、もしくはクローン化されてないISU-12を接種された全てのブタは、接種後10日目でPRRSへ血清変換した。コントロールブタは、ウィルス感染と病気から免れていた。
（Ｖ）要約
重い肺炎が、自然に発病したブタ（ISU-12）の肺および心臓ろ過物（0.22μｍ）を用いて、 5週齢のSPF ブタで実験的に再現された。PRRSV （ISU-12）のアイオワ株により惹起された肺炎は、間質性肺炎、II型肺細胞増殖、シンシチア様細胞形成により特徴付けられる。発病したブタからは心筋炎と脳炎が観察された。ISU-12は、ブタ肺胞マクロファージ培養物および継代細胞系、PSP-36において細胞病理学的効果(CPE) を引き起こした。ウィルス性抗原は、間接免疫蛍光法によってISU-12感染培養物において検出されたが、非感染細胞では検出されなかった。ISU-12は、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光法により、PRRSウィルス株VR-2332 に抗原的に関連付けられる。しかしながら、非プラーク精製 ISU-12 に感染したブタの顕微鏡視的な病変において相違が観察された。そしてこれは、他のウィルスもしくは病原体がPSP-36で生育することが可能であり、かつこの他のウィルスもしくは病原体が、PRRSV のアイオワ株によって惹起される病変が、文献でこのウィルスについて報告されているものとは異なりそれより激しいことの原因である可能性を示している。クローン化され、もしくはクローン化されてないISU-12を接種された全てのブタは、接種後10日目でPRRSへ血清変換した。コントロールブタは、ウィルス感染と病気から免れていた。
例 III
アイオワ株ブタの呼吸器および生殖器症候群に関与する病原体の3´末端領域の分子クローニングおよび核酸配列決定
（Ｉ）材料および方法
（Ａ）ウイルスの増殖および精製
後述の考察を簡単にするために、単語“ウイルス”および“ウイルスの”は、ウイルスあるいは本出願で上述した意味を持つ病原体を示すか、あるいはウイルスもしくは病原体の性質を示している。
【０１５７】
継代細胞系ＰＳＰ-36 は、アイオワ株ＰＲＲＳＶに関与したＩＳＵ-12 を単離および増殖させるために使われた。ＩＳＵ-12 ウイルスはＰＳＰ-36 細胞で 3回プラーク精製した。その後、ＰＳＰ-36 細胞をプラーク精製したウイルスに感染させた。感染した細胞の70％以上が細胞変性の変化を示した時、細胞を 3回凍結および融解した。それから培養液を、 4℃にて5000ｇで15分間の低速遠心によって清澄にした。それからウイルスを 7％ＰＥＧ-8000 および 2.3％ＮａＣｌで 4℃にて一晩中撹拌することによって沈降させ、沈降物を遠心によってペレット化した。それからウイルスの沈殿物をトリス−ＥＤＴＡバッファー 2ｍｌで再溶解し、ＣｓＣｌ勾配（1.1245 - 1.2858 ）の最上部に上層した。20℃で約 8時間28,000ｒｐｍで遠心した後、1.15 - 1.18 ｇ／ｍｌの密度を持つ透明なバンドを検出して集めた。このバンドの感染力価はＩＦＡにより決定され、10⁶ ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌになる事が見出された。典型的なウイルス粒子もネガティヴ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）によって観察された。
【０１５８】
（Ｂ）ウイルスＲＮＡの単離
全ＲＮＡは、市販のＲＮＡ単離キット（ストラタジーン社から入手）を用い、ＣｓＣｌ勾配中のウイルス含有バンドから単離した。その後、ポリ（Ａ）ＲＮＡをカラムメーカー（インビトロージェン）によって指示された方法に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィーによって濃縮した。
【０１５９】
（Ｃ）ＩＳＵ-12 ｃＤＮＡλライブラリーの構築
ＩＳＵ-12 ｃＤＮＡλライブラリー構築の一般的に図式化した方法を図１６に示す。ｍＲＮＡからの第一鎖ｃＤＮＡ合成は、ＸｈｏＩ制限部位を持つオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用した逆転写によって行なった。ヌクレオチド混合物は、正常のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび続いて行われるクローニングステップで使用される制限酵素からｃＤＮＡを保護する類似体５−メチルｄＣＴＰを含んでいた。
【０１６０】
次いで、第二鎖ｃＤＮＡ合成はＲＮａｓｅおよびＤＮＡポリメラーゼＩで行なった。ｃＤＮＡ末端はＴ4 ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し（平滑末端）、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼでＥｃｏＲＩアダプターに結合し、続いてＴ4 ポリヌクレオチドリン酸化酵素でリン酸化した。ｃＤＮＡをＸｈｏＩで切断し、切断されたｃＤＮＡの大きさをアガロースゲルで選択した。大きさが 1ｋｂよりも大きく切断されたｃＤＮＡを選択し、市販のＤＮＡ精製キット（ジーンクリーン、ＢＩＯ 101から入手、ラジョーラ社、カルフォルニア）により精製した。
【０１６１】
精製したｃＤＮＡは、その後λファージベクターのアームに結合し、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩの粘着末端で処理した。結合したベクターはラムダ抽出液で感染性のあるラムダファージにパッケージングした。形質導入にはＥ．ｃｏｌｉ細胞のＳＵＲＥ株（ストラタジーン社から入手）を用い、ラムダライブラリーを増幅し、ＸＬ-1ブルー細胞株で力価測定した。
【０１６２】
（Ｄ）差別化ハイブリダイゼイションによるλライブラリーのスクリーニング差別化ハイブリダイゼイションによるＰＩＰウイルスＩＳＵ-12 種の本物のクローンを同定するための一般的な図式化した方法が図１７に示されており、さらに以下に記載される。λライブラリーをＫＬ-1ブルー細胞に播種し、プラークを 2回ずつナイロン膜上に拾い上げて、通常の方法論により 0.5ＮＮａＯＨで変性した。ウイルス感染ＰＳＰ-36 細胞および非感染ＰＳＰ-36 細胞両方からのメッセンジャーＲＮＡをカラムのメーカー（インビトロゲン）によって記載された通りにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィーによって単離した。
【０１６３】
相補的なＤＮＡプローブを、メーカー（アマシャム）によって記載された方法に従い、³²Ｐ−ｄＣＴＰの存在下、ランダムプライマーを用いてウイルス感染ＰＳＰ-36 細胞及び正常ＰＳＰ-36 細胞から単離されたｍＲＮＡから合成した。二つのプローブ（一方はウイルス感染ＰＳＰ-36 細胞から合成されて、他方は正常な非感染ＰＳＰ-36 細胞から合成された）は、それから独立してセファデックスＧ−５０カラムクロマトグラフィーによって精製した。これらのプローブを50％ホルマリン中において、42℃で二重ナイロン膜とハイブリダイズさせた。ウイルス感染細胞から調製したプローブとハイブリダイズし、正常細胞から調製したプローブとハイブリダイズしなかったプラークを単離した。ウイルスｃＤＮＡインサートを含むファージミドは、インビトロでＧ 408ヘルパーファージの助けをかりて切断によってレスキューした。次いで、レスキューしたファージミドを、ＫＬ-1ブルー細胞で増幅した。ウイルスｃＤＮＡインサートを含むファージミドをＱｉａｇｅｎカラムクロマトグラフィーによって単離し、引き続いて配列決定した。
【０１６４】
（Ｅ）塩基配列決定および配列分析
ウイルスｃＤＮＡインサートを含むプラスミドをＱｉａｇｅｎカラムクロマトグラフィーによって精製し、種々の内部オリゴヌクレオチドプライマーと同様に、ユニヴァーサルおよびリバーサルプライマーを用いるザンガーダイデオキシ法によって配列決定した。配列は少なくとも３つの分離したクローンから得られた。不明瞭な配列結果が得られたときは、さらなるクローンあるいは領域の配列決定を行なった。塩基配列結果を集め、２種類のコンピューターソフトプログラム、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ（インテリゲネティクス社、マウンテンビュー、カルホルニア）およびＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（インターナルバイオテクノロジー社、ニューハーベン、コネチカット）を用いて独立に分析した。
【０１６５】
（Ｆ）オリゴヌクレオチドプライマー
オリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡシンセサイザー（アプライドバイオケミストリー）を用いて１本鎖ＤＮＡとして合成し、ＨＰＬＣによって精製した。オリゴヌクレオチドＰＰ284 （ 5´-CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT-3´ ；配列番号 1）およびＰＰ285 （ 5´-CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG-3´ ；配列番号 2）をＰＣＲ増幅のために合成した。ノーザンブロット分析のために、ＤＮＡプローブをウイルスゲノムの3´末端からこれら 2つのプライマーと共に合成した（下記論考参照）。オリゴヌクレオチドＰＰ286 （ 5´-GCCGCGGAAC CATCAAGCAC-3´；配列番号 3）およびＰＰ287 （5´-CAACTTGACG CTATGTGAGC-3´ ；配列番号 4）をＰＣＲ増幅のために合成した。これら２つのプライマーによって生成したＤＮＡプローブはさらにλライブラリーをスクリーニングするために使用した。オリゴヌクレオチドＰＰ288 （5´-GCGGTCTGGA TTGACGACAG-3´ ；配列番号 5）、ＰＰ289 （5´-GACTGCTAGG GCTTCTGCAC-3´ ；配列番号 6）、ＰＰ386 （5´-GCCATTCAGC TCACATAGCG-3´ ；配列番号 7）、ＰＰ286 およびＰＰ287 は内部配列を得るために配列決定プライマーとして使用した。
【０１６６】
（Ｇ）ノーザンブロット分析
ＩＳＵ-12 ｃＤＮＡクローンの3´末端からの特異的ＤＮＡ断片は、プライマーＰＰ284 およびＰＰ285 を使用したＰＣＲによって増幅した。ＤＮＡ断片は、市販のＤＮＡ精製キット（ジーンクリーン、バイオ101 から得た）を使用したアガロースゲルから切出し、ランダムプライマー伸張によって³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルした（アマシャムから入手したキットを使用）。全ＲＮＡは、メーカー（ストラタジーン社）によって指示された方法に従い、全ＲＮＡを単離するための市販のキットを使用して、36時間ポスト感染したＩＳＵ-12 感染ＰＳＰ-36 細胞から単離した。ＩＳＵ-12 サブゲノムｍＲＮＡ種は 6ＭグリオキザールおよびＤＭＳＯで変性し、 1％アガロースゲルで分離した。（ 1.5％アガロースゲルに置き換えた同様な方法の結果は、以下の例VIIIに記載され、図32に示される。）分離したサブゲノムｍＲＮＡを、それからＰＯＳＩＢＬＯＴ^TM圧力ブロッター（ストラタジーン）を使用してナイロン膜上に転送した。ハイブリダイゼイションを、ローラーボトラーを備えたハイブリダイゼイションオーブン内において、42℃で50％ホルムアミドで行なった。
結 果
（Ａ）ＩＳＵ-12 3´末端ゲノムのクローニング、同定および配列決定
オリゴ（ｄＴ）プライムド［primed］ｃＤＮＡλライブラリーを、ＩＳＵ-12 感染ＰＳＰ-36 細胞から得られた、部分的に精製されたウイルスから構築した。問題点は、レリスタッドウイルス配列に基づくプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする点であった。３つの組み合わせのプライマーが準備された。第１の組み合わせ（ＰＰ105 およびＰＰ106 ；配列番号 21-22）はレリスタッドゲノム配列の 14577ないし 14596および 14977ないし 14995の位置に相当し、ヌクレオカプシド遺伝子領域に局在した。第２の組み合わせ（ＰＰ106 およびＰＰ107 ；配列番号 22-23）はレリスタッドゲノム配列の 14977ないし 14995および 14054ないし 14072の位置に相当し、ＯＲＦ-6および-7の側面を固めている。第３の組み合わせ（ＰＭ541 およびＰＭ542 ；配列番号 24-25）は、レリスタッドゲノム配列の 11718ないし 11737および 11394ないし 11413の位置に相当し、ＯＲＦ-1b 領域に局在する。
【０１６７】
ＰＰ105 ：5´-CTCGTCAAGT ATGGCCGGT-3´（配列番号21）
ＰＰ106 ：5´-GCCATTCGCC TGACTGTCA-3´（配列番号22）
ＰＰ107 ：5´-TTGACGAGGA CTTCGGCTG-3´（配列番号23）
ＰＭ541 ：5´-GCTCTACCTG CAATTCTGTG-3´ （配列番号24）
ＰＭ542 ：5´-GTGTATAGGA CCGGCAACCG-3´ （配列番号25）
これらの 3組のプライマーを使用し、ＩＳＵ-12 病原体からＰＣＲによってプローブを生成する試みは全て成功しなかった。しかしながら、差別化ハイブリダイゼイション技術を使用した幾つか試験の後、ＩＳＵ-12 特異的ｃＤＮＡを代表する本物のプラークが、ＩＳＵ-12 感染ＰＳＰ-36 細胞及び正常ＰＳＰ-36 細胞から調製されたプローブを使用して単離された。差別化ハイブリダイゼイションに関する方法は、図17に記載され説明されている。
【０１６８】
3種のポジティブプラーク（λ-4、λ-75 およびλ-91 ）を最初に同定した。λファージ中に挿入したウイルスｃＤＮＡインサートを含むファージミドは、インビトロでＧ408 ヘルパーファージの助けで切断することによってレスキューされた。ポジティブクローンのインサートを、制限酵素切断および末端配列分析によって分析した。ｃＤＮＡクローンの特異性は、更にアイオワ株ＰＲＲＳＶにより感染されたＰＳＰ-36 細胞からのＲＮＡとハイブリダイズさせることによって確定した。それからＤＮＡプローブを、プライマーＰＰ286 およびＰＰ287 を用いるＰＣＲによってクローンλ-75 の5´末端から合成した。更にポジティブプラーク（λ-229、λ-268、λ-275、λ-281、λ-323およびλ-345）を、このプローブを使用する事によって同定した。3´末端ヌクレオチド配列を得るために使用された全てのλｃＤＮＡクローンを図18に示す。間違いを打ち消すために、少なくとも３つの別々のクローンについて配列決定を行なった。不明瞭な配列データである場合には、さらなるクローンおよび内部プライマー（ＰＰ288 、ＰＰ289 、ＰＰ286 、ＰＰ287 およびＰＰ386 ）を配列を決定するために使用した。1938ｂｐの3´末端配列（配列番号 8）を図19に示し、推定アミノ酸配列（配列番号 9 -12）を図20に示す。
【０１６９】
（Ｂ）サブゲノムｍＲＮＡの入れ子式セット
ウイルス感染ＰＳＰ-36 細胞からの全ＲＮＡを、 1％グリオキサール／ＤＭＳＯアガロースゲルで分離し、ナイロン膜上にブロットした。ｃＤＮＡプローブは、ウイルスゲノムの 3´-末端領域の横に位置するプライマーの組み合わせ（ＰＰ284 およびＰＰ285 ）を用いたＰＣＲによって生成した。プローブは 3´-非翻訳配列およびＯＲＦ-7配列の大部分を含んでいる。アイオワ株ＰＲＲＳＶで感染されたＰＳＰ-36 細胞のｍＲＮＡ種のパターンを示すノーザンブロットハイブリダイゼイションの結果は、ウイルスの複製にサブゲノムｍＲＮＡの形成を必要とするレリスタッドウイルス（ＬＶ）、ウマウイルス性動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸脱水素酵素−上昇ウイルス［lactate dehydrogenase-elevating virus ］（ＬＤＶ）およびコロナウイルスのｍＲＮＡ種のパターンと非常に類似していた。
ノーザンブロットプローブは 3´ 末端配列のみを提示したので、その結果は、ＩＳＵ-12 特異的サブゲノムｍＲＮＡがｍＲＮＡの 3´-入れ子式セット［3´-nested set ］を表わすことも示している。ＩＳＵ-12 ウイルスゲノムＲＮＡ（14ｋｂ）および 6つのサブゲノムｍＲＮＡ（ＲＮＡ 2（ 3.0ｋｂ）、ＲＮＡ 3（ 2.5ｋｂ）、ＲＮＡ 4（ 2.2ｋｂ）、ＲＮＡ 5（ 1.8ｋｂ）、ＲＮＡ 6（ 1.3ｋｂ）およびＲＮＡ 7（0.98ｋｂ））のサイズは、両方のゲノムおよびサブゲノムＲＮＡ種において異なるけれども、ＬＶのサイズに類似している。違いはサブゲノムｍＲＮＡの相対的な量においても観察され、ＲＮＡ 7が最も優勢なサブゲノムｍＲＮＡである。
【０１７０】
（Ｃ）サブゲノムＲＮＡにコードされたオープンリーディングフレームの分析
３つの大きなＯＲＦが、配列番号 8：ＯＲＦ-5（ｎｔ 239 - 901；配列番号13）、ＯＲＦ-6（ｎｔ 889 - 1403 ；配列番号15）およびＯＲＦ-7（ｎｔ 1403 - 1771；配列番号18）で見出されている。結果として得られた配列の5´末端に位置するＯＲＦ-4は、配列番号 8の1938ｂｐ 3´末端配列が不完全である。ＯＲＦ-5、-6および-7は、各々、 100アミノ酸より多くコード出来る能力を持っている。ＯＲＦ-5とＯＲＦ-6は互いに10ｂｐ重なり合っており、ＯＲＦ-6とＯＲＦ-7は互いに 5ｂｐ重なり合っている。ＯＲＦ-7中にもっぱら位置する 2つの小さなＯＲＦも発見されており、各々37ａａおよび43ａａのみをコードしている。他の 2つの短いＯＲＦは完全にＯＲＦ-5と重なり合っている。これらの 2つの短いＯＲＦのコード出来る能力は、各々29ａａおよび44ａａのみである。ノーザンブロット分析によると、これらの小さなＯＲＦと相互関係を有する特異的サブゲノムｍＲＮＡはなかった。ＯＲＦ-6およびＯＲＦ-7は各々ウイルス膜タンパクおよびカプシッドタンパクをコードすると思われる。
（Ｄ）リーダージャンクションに対するコンセンサス配列
配列分析は、サブゲノムｍＲＮＡにおいてリーダーが転写の際に結合する部位として働くかもしれない短い配列モチーフ、AACCを示している。各々、ＯＲＦ-6の結合部位はATG 開始コドンから21ｂｐ上流で発見され、ＯＲＦ-7の結合部位はATG 開始コドンから13ｂｐ上流で発見されている。AACCコンセンサス配列は、ＬＶのＯＲＦ-5では発見されているけれども、ＯＲＦ-5中では同定されていない。同様の結合配列はＬＤＶおよびＥＡＶでは発見されてる。
【０１７１】
（Ｅ） 3´-非翻訳配列およびポリ（Ａ）テイル
ＯＲＦ-7の停止コドンの次に続く 150ヌクレオチドの長さを持つ（ 150ｎｔ）非翻訳配列がＩＳＵ-12 ウイルスのゲノム中で同定されており、ＬＶ中の 114ｎｔ、ＬＤＶ中の80ｎｔおよびＥＡＶ中の59ｎｔと比較されている。ポリ（Ａ）テイルの長さは少なくとも13ヌクレオチドである。ＰＩＰウイルスＩＳＵ-12 、ＬＶおよびＬＤＶにおいて、ポリ（Ａ）テイルに隣接した領域に、コンセンサス配列、CCGG／ AAATT−ポリ（Ａ）がある。
【０１７２】
（Ｆ）ＯＲＦ-5、-6および-7の間並びに非翻訳配列の間でのＩＳＵ-12 およびＬＶゲノムの配列の比較
ＩＳＵ-12 とレリスタッドウイルスのゲノムのＯＲＦ-5領域の比較が図21に示されている。ＯＲＦ-6領域、ＯＲＦ-7領域、および非翻訳配列は各々に対応する比較が、図22、23および24に示されている。
【０１７３】
比較の結果が下記表III に記載されている。上記した事と一致するが、免疫原ウイルスと90％以上の相同性を有する場合には、ウイルスは免疫学的に等価であると見なされる。ＬＶおよびＩＳＵ-12 の間で、ＯＲＦ-5、ＯＲＦ-6、ＯＲＦ-7および非翻訳配列のヌクレオチド配列相同性は、各々、60％、68％、60％、58％である。従って、ＬＶおよびＩＳＵ-12 は免疫的に等価ではない。
【０１７４】
ＬＶ中のＯＲＦ-5および-6の大きさはＩＳＵ-12 中のＯＲＦ-5および-6よりも各々61ｎｔおよび 3ｎｔ小さい。対称的に、ＬＶ中のＯＲＦ-7の大きさはＩＳＵ-12 中のそれよりも15ｎｔ大きい。3´末端非翻訳配列も長さが異なる（ＩＳＵ-12 では 150ｎｔであるが、ＬＶではわずか 114ｎｔである）。ＬＶのように、ジャンクション配列AACCは、ＯＲＦ-5を除いて、アイオワ株ＰＲＲＳウイルス単離ＩＳＵ-12 のゲノム中でも同定されている。ＩＳＵ-12 中のＯＲＦ-6のジャンクション配列は ATG開始コドンから21ｎｔ上流にあり、しかしながら、ＬＶ中のＯＲＦ-6のジャンクション配列は ATGから28ｎｔ上流にある。
【表３】

例 IV
昆虫細胞におけるアイオワ株病原体遺伝子の発現
(A) 組換えバキュロウイルスの作製
ＯＲＦ-5、ＯＲＦ-6およびＯＲＦ-7配列を、ＩＳＵ-12 ゲノムヌクレオチド配列に基づくプライマーを用いるＰＣＲによって個々に増幅した。ＯＲＦ-5は下記プライマーを用いて増幅した：
5´-GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-3´ （配列番号26）
3´-GGGAATTCGC CAAGAGCACC TTTTGTGG-5´ （配列番号27）
ＯＲＦ-6は下記プライマーを用いて増幅した：
5´-GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-3´ （配列番号28）
3´-GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5´ （配列番号29）
ＯＲＦ-7は下記プライマーを用いて増幅した：
5´-GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-3´ （配列番号30）
3´-GGGAATTCAC CACGCATTC-5´ （配列番号31）
増幅したＤＮＡ断片を、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ1393（Invitrogenより入手）中にクローニングした。線状にしたバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶＤＮＡ（Pharmingen, San Diego, California より購入） 1μｇおよびＰＣＲ増幅クローン化ｃＤＮＡ含有ベクター構築物 2μｇをリポフェクチン（Gibco ）50μｌと混合し、22℃で15分間インキュベートしてトランスフェクション混合物を調製した。
【０１７５】
ＨＩ−ＦＩＶＥ細胞播種の 1時間後、培地を新鮮なエクセル 400昆虫細胞培養培地［Excell 400 insect cell culture medium ］（JR Scientific Co. より入手）と取換え、トランスフェクション混合物を滴下により添加した。得られた混合物を28℃で 6時間インキュベートした。その後、トランスフェクション培地を除去し、新鮮なエクセル 400昆虫細胞培養培地を添加した。次いで、得られた混合物を28℃でインキュベートした。
【０１７６】
トランスフェクションの 5日後、培養培地を集め精製した。上清の10倍希釈液をＨＩ−ＦＩＶＥ細胞に接種し、室温で60分間インキュベートした。接種物を廃棄した後、細胞上に1.25％寒天のオーバーレイを塗布した。28℃で 4日間インキュベーションを行なった。然る後、透明なプラークを選定し、無菌のパスツールピペットを用いて取り出した。各プラークをグレースの昆虫培地［Grace´s insect medium ］ 1ｍｌと混合して 5ｍｌスナップキャップチューブに入れ、冷蔵庫内に一晩放置して寒天からウイルスを解放した。これらのチューブを2000×ｇで30分間遠心して寒天を分離し、その上清を新しい無菌チューブに移した。プラーク精製工程を 3回繰り返し、可能性のある野生型ウイルス汚染を避けた。精製組換えクローンを、さらなる調査のために、 -80℃で保存した。
(B) 組換えアイオワ株病原体タンパクの発現
発現の評価には、間接免疫蛍光測定法および放射標識免疫沈降法［radioimmunoprecipitation］を用いた。
【０１７７】
間接免疫蛍光測定法：図25に示す、24ウェル細胞培養クラスタープレート中のＨＩ−ＦＩＶＥ昆虫細胞に、野生型バキュロウイルスもしくは組換えバキュロウイルスを感染させるか、あるいは偽感染させた。72時間後、細胞を固定し、ブタ抗ＩＳＵ-12 ポリクローナル抗体の適当な希釈液、次いでフルオロセインイソチオシアネート標識（ＦＩＴＣ標識）抗ブタＩｇＧで染色した。図26−29に示すように、組換えウイルスに感染した細胞においては免疫蛍光が検出されたが、偽感染細胞もしくは野生型バキュロウイルスを接種した細胞では検出されなかった。例えば、図26は、細胞変性効果を発現する、ＩＳＵ-12 ＯＲＦ-6遺伝子（Baculo.PRRSV.6）を含む組換えバキュロウイルスに感染したＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す。図27は、同様に細胞変性効果を発現する、ＩＳＵ-12 ＯＲＦ-7遺伝子（Baculo.PRRSV.7）を含む他の組換えバキュロウイルスに感染したＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す。ＯＲＦ-5（Baculo.PRRSV.5、データは示さず）を含む組換えバキュロウイルスを用いても同様の結果が得られた。図28および29は、それぞれＩＳＵ-12 ＯＲＦ-6遺伝子およびＩＳＵ-12 ＯＲＦ-7遺伝子を含む組換えバキュロウイルスに感染し、ＩＳＵ-12 に対するブタ抗血清、次いでフルオロセイン結合抗ブタＩｇＧで染色されたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す。ここでは、この昆虫細胞は組換えアイオワ株病原体タンパクを産生している。ＯＲＦ-5を含む組換えバキュロウイルスでも同様の結果が得られた。
【０１７８】
放射標識免疫沈降法：組換えタンパクの抗原性および信頼性をさらに決定するために、各組換えウイルス（Baculo.PRRSV.5、Baculo.PRRSV.6およびBaculo.PRRSV.7）を用いて放射標識免疫沈降を行なった。ＨＩ−ＦＩＶＥ昆虫細胞を偽感染し、あるいは代わりに、組換えバキュロウイルスのそれぞれに感染させた。感染の 2日後、メチオニン非含有培地を添加した。各混合物を 2時間インキュベートした後、³⁵Ｓ- メチオニン（Amersham）で標識したタンパクを添加し、その混合物を28℃でさらに 4時間インキュベートした。凍結および解凍を 3サイクル行なうことにより放射標識した細胞溶解質を調製し、この細胞溶解質を予備免疫もしくは免疫抗ＩＳＵ-12 抗血清と共にインキュベートした。この免疫複合体をプロテインＡアガロースで沈殿させ、煮沸した後ＳＤＳ- ＰＡＧＥで解析した。このゲルに対して -80℃でＸ線フィルムを露光し、現像した。ＯＲＦ-6（図30）およびＯＲＦ-7（図31）生成物で予期されるサイズのバンドを検出した。
例 Ｖ
下記表４に記載される他の PRRSVの試料を 3回プラーク精製した。プラーク精製は、ＰＳＰ-36-ＳＡＨ細胞の清澄化組織ホモジネートを培養し、 1つのプラークは単一のウイルスによって生成されると仮定して、単一のプラークを選択することにより行なった。次いで、選択したプラークを培養し、再び単一のプラークを選択して 3回目の培養を行なった。South Dakota State University, Brookings, South Dakotaより購入した抗 PRRSVモノクローナル抗体を用いてＩＦＡを行なった。
【０１７９】
さらなる研究のために選択された幾つかの単離試料を下記表５に示し、それらの病原性およびｍＲＮＡの数により特徴付けた。
【０１８０】
【表４】

【０１８１】
【表５】

非プラーク精製ＩＳＵ−１２およびプラーク精製ＩＳＵ−１２の各々の試料は、ブダペスト条約の条件の下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１，Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，Ｕ．Ｓ．Ａ． に、それぞれ受付番号ＶＲ２３８５およびＶＲ２３８６として１９９２年１０月２８日付で寄託されている。また、ＩＳＵ−２２、ＩＳＵ−５１、ＩＳＵ−５５およびＩＳＵ−３９２７の各々試料は、それぞれ受付番号ＶＲ２４２９、ＶＲ２４２８、ＶＲ２４３０およびＶＲ２４３１として１９９３年９月２９日付でＡＴＣＣに寄託されている。
【０１８２】
ＩＳＵ-3927 のｍＲＮＡは、 7つのｍＲＮＡのうち 4つが欠失していた。ＩＳＵ-3927 のｍＲＮＡ 4、 5、 6および 7は、ＩＳＵ-12 のものよりも早く移動し、したがってＩＳＵ-12 のものよりも小さい。この特徴は、ＩＳＵ-3927 の低毒性に関係している可能性がある。
【０１８３】
6種の単離体の病原性を 5週齢ＣＤＣＤブタにおいて比較した。15匹のブタに10⁵ ＴＣＩＤ₅₀のウイルスを接種した。10匹のブタを10ＤＰＩで解剖し、 5匹のブタを28ＤＰＩで解剖した。ウイルス単離体ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-51 およびＩＳＵ-55 の病原性が低かったのに対して、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-28 は最も病原性が高かった。先の研究においては、 5週齢のブタに対しては、唯一ＩＳＵ-3927 が穏やかな病原性であった。
【０１８４】
ＩＳＵ-22 および非プラーク精製（すなわち、プラーク精製されていない単離病原体）ＩＳＵ-12 により惹起された病変は、プラーク精製ウイルスによって惹起された病変よりも長い期間残った。プラーク精製単離体は、軽度の心筋梗塞および脳炎を惹起した。非プラーク精製単離体は、対応するプラーク精製単離体よりもさらに幾つかの疾患を惹起した。
【０１８５】
子ＣＤＣＤブタは、病原性の評価およびカンジダワクチンの有効性の優れたモデルを提供する。単離体ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-984は同様の病変を生じ、肉眼視的および顕微鏡視的病変の試験に基づいて、ワクチンの有効性の評価に用いることができる。ＩＳＵ-3927 はより毒性が低いが、PRRSV の病原株に対するワクチンの評価に適している。
【０１８６】
プラーク精製ＩＳＵ-12 を感染させたブタは、28日間で、（未感染ＰＳＰ-36 細胞を抗原投与した）対照ブタよりも体重が平均 9.9ポンド減少した。予備試験の結果は、 2−10ＤＰＩで、リンパ球減少および好中球増加が現われることを示している。
【０１８７】
非プラーク精製ＩＳＵ-12 を感染させたブタのみが重篤な脳炎を発病した。生物学的クローン化（プラーク精製）アイオワ株単離体を抗原投与したブタのいずれにも、鼻炎は観察されなかった。対称的に、組織濾液（非プラーク精製単離体）を接種物として用いた場合には、鼻炎が重かった。
【０１８８】
非プラーク精製ＩＳＵ-12 、プラーク精製ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-984、ＩＳＵ-3927 および未感染ＰＳＰ-36 細胞を感染させたＣＤＣＤブタの病理学および組織学を下記表 6−12にまとめる。これらの表において、肉眼視的肺病変評点は、肺の硬化の割合（すなわち、肺炎に罹患し病変を示す肺組織の割合）を表わす。評点は、 0ないし 100％硬化のスケールに基づく。「ＮＤ」は、肉眼視的肺病変評点を決定していないことを意味する。
【０１８９】
【表６】

上記表６において、「unpl. 」は非プラーク精製を、「uninoc. 」は未接種を意味する。
【０１９０】
上記表６における結果は、ＩＳＵ-12 およびＩＳＵ-22 が他の単離体より長く残る病変を生じることを示している。ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-984によって生じる病変の重篤性は同様である。ＩＳＵ-3927 によって生じる病変は大変軽く、他の単離体によって引き起こされる病変よりも早く治まる。全ての肉眼視的病変は、36ＤＰＩまでに治まった。
【０１９１】
下記表 7−12に示される病理学的な結果は、上記表１に示した重篤性と同じスケールに基づくものである。下記表 7−12において、「Int. thick. 」は組織間腔肥大を、「alv. exud.」は肺胞滲出を、および「encephal. 」は脳炎を意味する。
【０１９２】
【表７】

【０１９３】
【表８】

【０１９４】
【表９】

【０１９５】
【表１０】

【０１９６】
【表１１】

【０１９７】
【表１２】

7ＤＰＩでは、ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-984によって引き起こされる病変は重篤であり、その程度は互いに似ている。ＩＳＵ-3927 によって引き起こされる病変は、 7ＤＰＩで、軽度もしくは中度のもののみであった。
【０１９８】
10ＤＰＩでは、ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-984によって引き起こされる肺病変は、 7ＤＰＩでのものと同様ではあるが、若干重篤性を増している。非プラーク精製ＩＳＵ-12 を感染させたブタのみが軽い脳炎および心筋炎を発病している。10ＤＰＩでは、ＩＳＵ-3927 によって引き起こされた病変はほぼ治まっている。
【０１９９】
21ＤＰＩでは、ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-984によって引き起こされる心筋炎が軽いものであるのに対して、非プラーク精製ＩＳＵ-12 によって引き起こされる心筋炎は重篤である。非プラーク精製ＩＳＵ-12 を感染させたブタのみが21ＤＰＩで軽い脳炎を発病する。
【０２００】
28ＤＰＩでは、非プラーク精製ＩＳＵ-12 およびＩＳＵ-22 を感染させたブタにおいては、肺の病変は依然として軽度である。これらの単離体はまた、28ＤＰＩで重篤な心筋炎を引き起こす。しかしながら、ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-984およびＩＳＵ-3927 によって生じる肺の病変は、28ＤＰＩではほぼ治まっている。
【０２０１】
36ＤＰＩでは、全ての病変は本質的に治まっている。36ＤＰＩに、 1群当り 1匹のブタを試験した。
例 VI
イン・ビボでの交差中和［cross-neutralization］研究を行なった。最初に、ＣＤＣＤブタの鼻腔内にＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-984およびＩＳＵ-3927 から選択される単離体を接種し、 4週間後、これらのブタにＩＳＵ-12 を抗原投与した。ＩＳＵ-12 を用いる抗原投与の 8ＤＰＩ後、肺病変および他の疾患の症状を検査した。対照ブタはＩＳＵ-12 を抗原投与したのみである。結果を下記表13に示す。
【０２０２】
下記表13に示す病理結果は、上記表１に示した重篤性と同一のスケールに基づくものである。下記表13において、「Int. thick. 」は組織間腔肥大を、「alt. exud.」は肺胞滲出を、並びに「encephal. 」は脳炎を意味する。
【０２０３】
【表１３】

上記表13中のデータは、ＩＳＵ-12 が、ＩＳＵ-12 によって惹起される疾患の症状のほとんどからブタを守ることを示している。ＩＳＵ-984は、公知の PRRSVウイルスの最も毒性の高い株の中の 1種であるＩＳＵ-12 によって惹起される PRRS の幾つかの症状および臨床的徴候に対する保護を与える。
【０２０４】
しかしながら、PRRSウイルスのアイオワ株の穏やかな病原変種であるＩＳＵ-3927 は、生ワクチンとして調べられた単離体のうちで、続くＩＳＵ-12 での抗原投与に対する最も高い保護を与える。したがって、ＩＳＵ-3927 は、生ワクチンとしての使用に商業的な見込みがある。
例 VII
ＣＤＣＤブタ10匹の群を、下記表14に列挙される PRRSVのアイオワ株の単離体で、もしくは対照としての未感染ＰＳＰ-36 細胞で感染させた。下記表14に列挙される各ウイルス単離体の10⁵ ＴＣＩＤ₅₀を鼻腔内に抗原投与したときには、これらのブタは 5週齢であった。平均肉眼視的肺病変評点の統計的有意性の指標として、標準偏差（ＳＤ）が与えられる。
【０２０５】
【表１４】

肉眼視的肺病変評点の統計的な比較は、下記表15に示した。
【０２０６】
【表１５】

加えて、ブタの各群を、上述の臨床呼吸器評価システム（下記表16の「臨床学的評価手段」を参照）によって、呼吸困難について試験した。「肉眼視評点」は上述の肉眼視的肺病変評点を述べている。「脳炎」、「心筋炎」および「鼻炎」は、それぞれ、各群において、脳炎、心筋炎および鼻炎の病変を示すブタの数を述べている。「顕微鏡視的評点」は、以下のスケールに基づき、肺組織における組織間腔肺炎の顕微鏡視的病変の評価および比較に用いられる評点を述べている。
【０２０７】
0 ＝疾患なし；正常肺組織
1 ＝軽度の多病巣性顕微鏡視的病変
2 ＝軽度のび慢性顕微鏡視的病変
3 ＝中度の多病巣性顕微鏡視的病変
4 ＝中度のび慢性顕微鏡視的病変
5 ＝重度の多病巣性顕微鏡視的病変
6 ＝重度のび慢性顕微鏡視的病変
顕微鏡視的病変は、肉眼視的病変を示さない組織において観察されることがある。このため、「顕微鏡視的評点」は、肉眼視的病変、呼吸困難、熱等に加えて、これらの単離体の病原性の評価および比較のさらなる手段を提供する。
【０２０８】
【表１６】

例 VIII
ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-55 、ＩＳＵ-79 、ＩＳＵ-1894 およびＩＳＵ-3927 の各々を感染させたＰＳＰ-36 細胞からのｍＲＮＡを単離し、 1.5％アガロースゲル上で分離してサブゲノムｍＲＮＡをさらに分離した。 2群の移動パターンを観測した。
【０２０９】
群Ｉには、単離体ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-1894 、ＩＳＵ-3927 および、恐らく、ＩＳＵ-51 が含まれる。ＩＳＵ-12 のノーザンブロットを図32に、またＩＳＵ-1894 、ＩＳＵ-3927 およびＩＳＵ-51 のノーザンブロットを図33に示す。レリースタッド［Lelystad］ウイルスのように、それらの単離体の各々に（図32および33において、 1− 7と名付けられている） 7種のサブゲノムｍＲＮＡが見出された。サブゲノムｍＲＮＡ（ＳｇＲＮＡ）のサイズは、レリースタッドウイルスのものと同様である。
【０２１０】
群IIには、単離体ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-55 およびＩＳＵ-79 が含まれる。これらの単離体の各々は、 7種の代わりに、 9種のＳｇＲＮＡを有している。群IIのＳｇＲＮＡ 1、 2、 3、 6および 7は群Ｉのものと同一であるが、群ＩのＳｇＲＮＡ 3および 6の間に、図33において矢印で示される 2種のさらなるＳｇＲＮＡが見出された。
【０２１１】
予備試験の結果は、恐らくＰＳＰ-36 中のＩＳＵ-12 は除いて、群IIのウイルスは群Ｉの単離体よりも増殖し得るであろうことを示している。しかしながら、群IIの単離体と比較して、ＩＳＵ-12 の増殖が劣る場合もあり得る。
例 VIII
ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）変性生ワクチンの有効性の研究を、 3週齢 PRRSV血清陰性［PRRSV-seronegative］ＳＰＦブタにおいて行なった。このワクチンは、 2ｍｌ投与量当りプラーク精製ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ-12 （アイオワ株）10^5.8 ＴＣＩＤ₅₀からなる。 9匹のブタには鼻腔内投与（ＩＮ）により単一ワクチン投与量を与え、7 匹のブタには筋肉内投与により単一ワクチン投与量を与え、 9匹のブタを非ワクチン接種抗原投与対照（ＮＶ／ＣＨＡＬＬ）として用いた。ワクチン接種後35日目に、ワクチン接種および対照に抗原投与し、抗原投与後10日目に肉眼視的肺病変（冒された肺の割合）を評価した。
ブタの各群に対する平均肉眼視的肺病変は、図34における各柱の上部の数字によって示される。両ワクチン接種群は、非ワクチン接種対照よりも有意に低い（ｐ＜0.01）肉眼視的肺病変評点を示した。ワクチン接種群の間には、評点に有意の差は見出されなかった。ＩＳＵ-12 ＰＲＲＳＶワクチンは、10^5.8 ＴＣＩＤ₅₀投与量で、 3週齢ブタにおいて有効であることが立証された。
他の観察
ＩＳＵ-12 ウイルスは、クロロホルム処理に感受性を有するが、エンベロープで覆われている。ＩＳＵ-12 の複製は、5-ブロモデオキシウリジン処理に耐える。したがって、ＩＳＵ-12 はＤＮＡウイルスではない。ＩＳＵ-12 は血球凝集活性を欠損している。
【０２１２】
上述の教示に照らして、この発明の多くの変形および変種が可能であることは明らかである。したがって、特許請求の範囲内において、この発明がここに特定して記載されているものとは別の方法で実施し得ることは理解されるべきである。
【０２１３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】改変生ワクチン生産フローチャート。
【図２】不活性化ワクチン生産工程のフローチャート。
【図３】サブユニットワクチン生産工程の概要を表わすフローチャート。
【図４】遺伝子工学ワクチン生産工程の概要を表わすフローチャート。
【図５】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単離された病原体のサンプルによって感染させた通常ブタの、感染後１０日の肺の組織学的切片を示す顕微鏡写真。
【図６】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単離された病原体のサンプルによって感染させた通常ブタの、感染後１０日の肺の組織学的切片を示す顕微鏡写真。
【図７】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単離された病原体のサンプルによって感染させたノトバイオートブタの、感染後９日の肺の組織学的切片を示す顕微鏡写真。
【図８】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単離された病原体のサンプルによって感染させたノトバイオートブタの、感染後３５日の心臓病巣の組織学的切片を示す顕微鏡写真。
【図９】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単離された病原体（肺の▲ろ▼過サンプル）に感染させてから９日後のノトバイオートブタから調製された大規模な合胞体があらわれている気官支−肺胞洗浄培養を示す顕微鏡写真（ＩＳＵ−１２；例１、セクション（ＩＩ）（ｃ）、参照）。
【図１０】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に関連した病原体で感染させたブタの肺胞マクロファージ培養中に見られる、短い表面スピクラを持った直径約７０ｎｍのエンベロープウイルス粒子の電子顕微鏡写真。
【図１１】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタの肺胞マクロファージ培養中に見られる、抗体で被覆された約８０−３２０ｎｍのサイズの多形エンベローブウイルス粒子の電子顕微鏡写真。
【図１２】（Ａ）は未感染のブタ肺胞マクロファージ（ＳＡＭ）培養物、（Ｂ）はＩＳＵ−１２に感染したＳＡＭ培養物中のＣＰＥ、および（Ｃ）はＩＳＵ−１２に感染したＳＡＭ培養物中のＩＦＡを示す顕微鏡写真（例ＩＩ参照）。
【図１３】（Ａ）は未感染のＰＳＰ−３６の細胞培養物、（Ｂ）はＩＳＵ−１２で感染させた細胞中のＣＰＥ（４ＤＰＩ）、（Ｃ）はＩＳＵ−１２で感染させた細胞中のＣＰＥ（５ＤＰＩ）および（Ｄ）はＩＳＵ−９８４（ＰＲＲＳＶのアイオワ株を表わす第２のウイルス単離体）で感染させた細胞中のＣＰＥを示す顕微鏡写真。
【図１４】（Ａ）は未感染のＰＳＰ−３６細胞、（Ｂ）はＩＳＵ−１２で感染させ、回復期血清で染色した細胞中のＩＦＡ（２．５ＤＰＩ）、（Ｃ）はＩＳＵ−１２で感染させ、抗ＰＲＲＳＶポリクローナル抗体で染色した細胞中のＩＦＡ（２．５ＤＰＩ）および（Ｄ）はＩＳＵ−１２で感染させ、抗ＰＲＲＳＶモノクローナル抗体で染色した細胞中のＩＦＡを示す顕微鏡写真。
【図１５】ＰＳＰ−３６細胞で繁殖させたＩＳＵ−１２のタンパクの、放射性免疫沈殿（ＲＩＰ）によって測定したプロフイールであって、レーン１および２は抗ＰＲＲＳＶポリクローナル血清（１）および回復期血清（２）で免疫沈殿させた偽感染ＰＳＰ−３６細胞；レーン３および４は抗ＰＲＲＳＶポリクローナル血清（３）および回復期血清（４）で免疫沈殿させたウイルス感染ＰＳＰ−３６細胞を示す顕微鏡写真。
【図１６】ＰＲＲＳを惹起する病原体のｃＤＮＡλライブラリ構築の一般的手法を示すフローチャート。
【図１７】ＰＲＲＳＶ（ＩＳＵ−１２）のアイオワ株に関連した病原体の真性ｃＤＮＡクローンを差別化ハイブリゼーションによって同定するための一般的手法を示すフローチャート。
【図１８】（Ａ）はＩＳＵ−１２のヌクレオチド配列におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示し、（Ｂ）はサブゲノムｍＲＮＡであって、囲みＬはリーダー配列を、および（Ａ）ｎはゲノムの３’末端でのポリ（Ａ）テイルをそれぞれ示し、並びに（Ｃ）はＩＳＵ−１２の３’末端ヌクレオチド配列を得るために用いられるλｃＤＮＡクローンであって、配列が決定された領域を黒塗りのバーで、配列が決定されていない領域を斜線でそれぞれ示す図。
【図１９Ａ】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に関連した病原体のゲノムの１９３８ｂＰの３’末端配列を示す図。
【図１９Ｂ】図１９Ａに続いて、ＰＲＲＳＶのアイオワ株に関連した病原体のゲノムの１９３８ｂｐの３’末端配列を示す図。
【図１９Ｃ】図１９Ｂに続いて、ＰＲＲＳＶのアイオワ株に関連した病原体のゲノムの１９３８ｂｐの３’末端配列を示す図。
【図１９Ｄ】図１９Ｃに続いて、ＰＲＲＳＶのアイオワ株に関連した病原体のゲノムの１９３８ｂｐの３’末端配列を示す図。
【図２０Ａ】図１９の、ヌクレオチド配列の下に示されるＤＮＡ配列によってコードされている演繹アミノ酸配列を示す図。
【図２０Ｂ】図２０Ａに続いて、図１９のヌクレオチド配列の下に示されるＤＮＡ配列によってコードされている演繹アミノ酸配列を示す図。
【図２１】オープンリーデイングフレーム−５（ＯＲＦ−５）について、ＰＲＲＳＶ（ＩＳＵ−１２）のアイオワ株に関連した病原体とレリスタッドウイルスのヌクレオチド配列を比較する図。
【図２２】レリスタッドウイルスのＯＲＦ−６とＩＳＵ−１２ウイルスのＯＲＦ−６ヌクレオチド配列を比較する図。
【図２３】レリスタッドウイルスのＯＲＦ−７とＩＳＵ−１２ウイルスのＯＲＦ−７ヌクレオチド配列を比較する図。
【図２４】レリスタッドウイルスとＩＳＵ−１２ウイルスの３’非翻訳ヌクレオチド配列を比較する図。
【図２５】未感染のＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎ卵細胞ホモジネート（ＨＩ−ＦＩＶＥ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を示す顕微鏡写真。
【図２６】図２６は、細胞毒性効果を示しているＩＳＵ−１２ ＯＲＦ−６遺伝子を含む組換えバキュロウイルスで感染させたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す顕微鏡写真。
【図２７】細胞毒性効果を示しているＩＳＵ−１２ ＯＲＦ−７遺伝子を含む組換えバキュロウイルスで感染させたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す顕微鏡写真。
【図２８】ＩＳＵ−１２に対するブタの抗血清で染め、その後蛍光体結合抗ブタＩｇＧで染めたＩＳＵ−１２ ＯＲＦ−６遺伝子を含む組換えバキュロウイルスで感染させたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す顕微鏡写真（ここで、その昆虫細胞はＩＳＵ−１２ ＯＲＦ−６遺伝子でコードされた組換え蛋白を生成している）。
【図２９】ＩＳＵ−１２に対するブタの抗血清で染め、その後蛍光体結合抗ブタＩｇＧで染めたＩＳＵ−１２ ＯＲＦ−７遺伝子を含む組換えバキュロウイルスで感染させたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す顕微鏡写真（ここで、その昆虫細胞はＩＳＵ−１２ ＯＲＦ−７遺伝子でコードされた組換え蛋白を生成している）。
【図３０】ＩＳＵ−１２特異プライマを使用したＯＲＦ−５（レーンＥ）、ＯＲＦ−６（レーンＭ）、ＯＲＦ−７（レーンＮＰ）のＰＣＲ増幅の結果を表わす電気泳動を示す写真（ここで、レーンＳＭは分子量標準を含む）。
【図３１】ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ制限酵素でプラスミドＤＮＡを切断した後、ＩＳＵ−１２のゲノムのＯＲＦ−５（レーンＥ）、ＯＲＦ−６（レーンＭ）、ＯＲＦ−７（レーンＮＰ）を含んでいる組換えバキュロウイルス形質転換用ベクターｐＶＬ１３９３の発現結果を表わす電気泳動を示す写真（レーンＳＭは分子量標準を含む）。
【図３２】ＩＳＵ−１２のｍＲＮＡのノーザンブロットを表わす電気泳動を示す写真。
【図３３】ＡおよびＢは、ＰＲＲＳＶの他のアイオワ株（ＩＳＵ−２２、ＩＳＵ−５５，ＩＳＵ−７９、ＩＳＵ−１８９４，ＩＳＵ−３９２７）単離物から採集したｍＲＮＡのノーザンブロットを表わす電気泳動を示す写真。
【図３４】本発明ワクチンの一つの具体例を鼻腔下（ＩＮ）、筋肉下（ＩＭ）、に投与した３−週齢、ＰＲＲＳＶセロネガチブ、特定病原性の無いブタ群（ＳＲＦ）および対照ブタ群（ＮＶ／ＣＨＡＬＬ）の平均全肺病巣評点（病気に冒された肺のパーセント）の棒グラフ。

Claims (12)

1. ＩＳＵ−１２（ＡＴＣＣ ＶＲ２３８５及びＶＲ２３８６）である天然に存在する単離されたブタ呼吸器・生殖器症候群ウイルス。
2. 請求項１の単離されたウイルスを不活性化または弱毒化して得たウイルス及び生理学的に許容される担体を具備するブタ生殖器・呼吸器症候群に対するワクチン用組成物。
3. 細胞培養で連続的に継代することによって調製された弱毒化ウイルス及び生理学的に許容される担体を具備する、ＩＳＵ−１２（ＡＴＣＣ ＶＲ２３８５及び／又はＶＲ２３８６）に起因するブタ生殖器・呼吸器症候群からブタを防御するワクチンであって、前記ウイルスが、弱毒化される前の時点で請求項１のウイルスであるワクチン。
4. 未接種の５週齢の初乳を与えていない帝王切開で得られたブタの肺病変に比べて、ｐ値が０．０１未満の統計学的に有意な量で、前記５週齢の初乳を与えていない帝王切開で得られたブタの肺病変を減弱させる請求項３のワクチン。
5. 有効量の前記弱毒化ウイルスを具備する請求項３のワクチンであって、該ワクチンを接種した後、続いて生のブタ生殖器・呼吸器症候群ウイルスで攻撃誘発した初乳を与えていない帝王切開で得られたブタのグループの臨床的呼吸得点の平均を、同じく攻撃誘発したが、該ワクチンを接種しなかった初乳を与えていない帝王切開で得られたブタのグループに比べて、減少させるワクチン。
6. さらにアジュバントを具備する請求項３のワクチン。
7. ブタ生殖器および呼吸器症からブタを防御する方法であって、該疾病からの防御を必要とするブタに、請求項３のワクチンを有効量投与することを具備する方法。
8. 前記ワクチンが、経口又は非経口で投与される請求項７の方法。
9. 前記ワクチンが、筋肉内、皮内、静脈内、腹腔、皮下、又は鼻腔内投与される請求項７の方法。
10. 前記ワクチンが、前記疾病からの防御を必要とする雌ブタに投与される請求項７の方法。
11. 前記ワクチンが、ＰＳＰ−３６及びＰＳＰ−３６−ＳＡＨからなる群から選択される細胞株の中で培養されたウイルスから調製される請求項３、４又は５の何れか１項に記載のワクチン。
12. 請求項１に記載のウイルスを培養する方法であって、ＰＳＰ−３６、ＰＳＰ−３６−ＳＡＨ及び前記ウイルスに感染させ、培養することができるこれと均等な細胞株からなる群から選択される細胞株を請求項１に記載のウイルスに感染させることと、
    適切な培地中で、該感染させた細胞株を培養することとを具備し、
    前記ウイルスが、ブタ呼吸器および生殖器症を引き起こすものである、上記方法。

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