MXPA93006804A

MXPA93006804A - Vacunas que elevan una respuesta inmunologica contra virus que causan enfermadades respiratoriasreproductoras porcinas, metodos para proteger a un cerdo contra una enfermedad causada por un virusrespiratorio y reproductivo, un metodo para reprod.

Info

Publication number: MXPA93006804A
Application number: MXPA93006804A
Authority: MX
Inventors: Sagar Paul Prem
Original assignee: Univ Iowa State
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 2003-05-30
Also published as: US7517976B2; EP0595436A3; BR9304453A; DE69334141T2; US6110467A; JPH07138186A; US6251404B1; CA2102036A1; CN1096223A; TW517085B; TW497973B; EP0595436A2; CA2102036C; ES2286815T3; CN1087175C; AU672825B2; DE69334141D1; EP0595436B1; DK0595436T3; US20070269445A1

Abstract

La presente invencion proporciona una vacuna que protege a los cerdos de un virus y/o de un agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, un metodo para proteger a un cerdo de una enfermedad causada por un virus y/o un agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora, un metodo para producir una vacuna contra un virus y/o un agente infeccioso que causa enfermedad reproductora y respiratoria porcina, y una muestra biologicamente pura de un virus y/o de un agente infeccioso asociado con una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente la cepa de Iowa del virus de sindrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP), y un polinucleotido aislado que es cuando menos el 90 por ciento homologo con un polinucleotido obtenido del genoma de un virus y/o agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina.

Description

VACUNAS QUE ELEVAN UNA REPUESTA INMUNOLOGICA CONTRA VIRUS QUE CAUSAN ENFERMEDADES RESPIRATORIAS Y REPRODUCTORAS PORCINAS, MÉTODOS PARA PROTEGER A UN CERDO CONTRA UNA ENFERMEDAD CAUSADA POR UN VIRUS RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO, UN MÉTODO PARA PRODUCIR UNA VACUNA QUE ELEVA UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA CONTRA UN VIRUS QUE CAUSA UNA ENFERMEDAD RESPIRATORIA Y REPRODUCTORA PORCINA, Y ADN OBTENIDO A PARTIR DE UN VIRUS QUE CAUSA UNA ENFERMEDAD RESPIRATORIA Y REPRODUCTORA PORCINA Los señores PREM SAGAR PAUL, PATRICK GERALD HALBUR, MELISS? ANNE LUM, XIANG-JIN MENG, YOUNG S. LYOO, de nacionalidad norteamericana los tres primeros, china el cuarto y coreana el último, con domicilio respectivamente en 4206 Arizona Circle, ciudad de Ames, Estado de Iowa; 3211 Kingman Road, ciudad de Ames, Estado de Iowa; 1201 Northland Drive, ciudad de Mendota Heights, Estado de Minnesota; 725 Pammel Court, ciudad de Ames, Estado de Iowa; 159 E. Village, ciudad de Ames, Estado de Iowa, todos en los Estados Unidos de Norteamérica, inventores, ceden venden y traspasan a IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC., y SOLVAY ANIMAL HEALTH, INC., sociedades norteamericanas, con domicilio respectivamente en 214 O & L, ciudad de Ames, Estado de Iowa; y 1201 Northland Drive, ciudad de Mendota Heights, Estado de Minnesota, ambas en los Estados Unidos de Norteamérica, todos los derechos sobre la invención que enseguida se describe: * \<W o 2 RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una vacuna que protege a los cerdos de un virus y/ó de un agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, un método para proteger a un cerdo de una enfermedad causada por un virus y/ó un agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora, un método para producir una vacuna contra un virus y/ó un agente infeccioso que causa enfermedad reproductora y respiratoria porcina, y una muestra biológicamente pura de un virus y/ó de un agente infeccioso asociado con una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente la cepa de Iowa del virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) , y un polinucleótido aislado que es cuando menos el 90 por ciento homólogo con un polinucleótido obtenido del genoma de un virus y/ó agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina. ***** ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se refiere a una vacuna que protege a los cerdos de una enfermedad causada por virus respiratorios y reproductores, a un método para proteger a un cerdo de una enfermedad respiratoria y reproductora, a un método para producir una vacuna, y ADN obtenido a partir de un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina.

Discusión de los Antecedentes En los años recientes, los rebaños de cerdos norteamericanos y europeos han sido susceptibles a infecciones por nuevas cepas de virus respiratorios y reproductores (ver A.A.S.P., septiembre/octubre de 1991, páginas 7-11; rhe Veterinary Record, lo. de febrero de 1992, páginas 87-89; Ibid. , 30 noviembre de 1991, páginas 495-496; Ibid . , 26 de octubre de 1991, página 370; Ibid . , 19 de octubre de 1991, páginas 367-368; Ibid. , 3 de agosto de 1991, páginas 102-103; ' Ibid. , 6 de julio de 1991; Ibid. , 22 de junio de 1991, página 578; Ibid. , 15 de junio de 1991, página 574; Ibid . , 8 de junio de 1991, página 536; Ibid. , lo. de junio de 1991, página 511; Ibid. , 2 de marzo de 1991, página 213). Entre las primeras de " ' *-'l£" las nuevas cepas que se identificaron, estuvo un virus asociado con la llamada Enfermedad Misteriosa del Cerdo (EMC) , ó "síndrome de oreja azul", ahora conocida como Síndrome Respiratorio y de Infertilidad del Cerdo (SRIC) , ó Síndrome Respiratorio y Reproductor Porcino (SRRP) . En Europa, esta enfermedad también se ha llamado síndrome respiratorio y de aborto epidémico porcino (SRAEP) , enfermedad de aborto azul, enfermedad de oreja azul (Reino Unido) , abortus blau (Holanda) , y seuchenhafter spatabort der schweine (Alemania) , y el virus "* . te* correspondiente se ha llamado "virus Lelystad" . En los Estados Unidos, esta enfermedad también se ha llamado síndrome de abash, enfermedad misteriosa del cerdo (EMC) , y plaga de cerdos. Una enfermedad que algunas veces está asociada con el SRRP, es la neumonía intersticial proliferativa (NIP) . Se han observado brotes de "enfermedad de oreja azul" en los rebaños de cerdos en el Reino Unido, Alemania, Bélgica y Holanda. Su brote en Inglaterra ha conducido a la cancelación -. de las exhibiciones de cerdos. Los síntomas de SRRP incluyen una negativa a comer (anorexia) , una fiebre ligera (pirexia) , cianosis de las extremidades (notablemente orejas azulosas) , nacimientos muertos, abortos, alta mortalidad en las camadas afectadas, cerdos que nacen débiles, y nacimientos prematuros de cerdos. La mayoría de los lechones nacidos vivos de cerdas afectadas, mueren dentro de 48 horas. Los signos clínicos de SRRP incluyen signos como de influenza ligera, respiración ^ ^/. rápida ("agitación"), y una neumonitis intersticial difusa. El virus de SRRP tiene un período de incubación de aproximadamente 2 semanas desde el contacto con un animal infectado. El virus parece ser un arterivirus de ARN envuelto ( Ibid . , lo. de febrero de 1992). El virus se ha cultivado con éxito en macrófagos alveolares de cerdos, y en células CL2621 (Benfield y colaboradores, J. Vet. Diagn . Invest . , 4:127-133, 1992; Collins y colaboradores. Swine Infertility and Respiratory Syndrome/Mystery Swine Disease. Proc . , Minnesota Swine Conference for Beterianarians , páginas 200-205, 1991) , y en células MARC-145 (Joo, PRRS: Diagnosis, Proc . Alien D . Leman Swine Conference , Veterinary Continuing Education and Extensión, University of Minnesota (1993), 20:53-55). Un cultivo de éxito de un virus que causa SRIC también ha sido reportado por Wensvoort y colaboradores (Mystery Swine Disease. in the Netherlands: The Isolation of Lelystad Virus. Vet . Quart . 13:121-130, 1991). La presentación de SRRP en los Estados Unidos, ha afectado adversamente a la. industria de granjas de cerdos. En Canadá, el SRRP se ha caracterizado por anorexia y pirexia en las cerdas, que dura hasta dos semanas, abortos de plazo largo, 1 índices de nacimientos muertos incrementados, cerdos nacidos débiles y muertes neonatales precedidas por una rápida respiración abdominal y diarrea. El trabajo sobre el aislamiento del virus que causa SRRP, sobre un método para diagnosticar la infección de SRRP, y sobre el desarrollo de una vacuna contra el virus de SRRP, ha sido publicado (ver la Publicación de Patente Canadiense No. 2,076,744; la Publicación de Patente Internacional de TCP No. WO 93/03760; la Publicación de Patente Internacional de TCP No. WO 93/06211; y la Publicación de Patente Internacional de TCP No. WO 93/07898) . Una segunda cepa de virus descubierta en la investigación del agente que causa SRRP, causa una enfermedad conocida ahora como Neumonía Proiiferativa y de Necrotización r? [ fe. (NPN) . Los síntomas de NPN y la etiología del virus que la causa, parecen ser similares al SRRP, y su virus correspondiente, pero hay diferencias identificables. Por ejemplo, se cree que el virus que causa NPN es un virus de influenza A atípico ó no clásico (VICa) . Los signos clínicos principales de NPN son fiebre, disnea y respiración abdominal. Los cerdos de diferentes edades son afectados, pero la mayoría de los signos se presentan en W" cerdos entre 4 y 16 semanas de edad. Los pulmones de los cerdos afectados se enrojecen difusamente, y se ven de una consistencia "carnosa" (Collins, A.A.S.P., septiembre/octubre de 1991, páginas 7-11) . En contraste, los cerdos afectados con t ' SRRP, no muestran una fiebre significativa, y los signos respiratorios se observan principalmente en los cerdos neonatales (de menos de tres semanas de edad) con lesiones pulmonares, caracterizados por una neumonía intersticial '-?¿?° difusa. El virus de encefalomiocarditis (VEMC) es otro virus que causa una severa neumonía intersticial, junto con una severa miocarditis intersticial, necrotizante y calcificante. Experimentalmente, el VEMC produce una insuficiencia reproductiva en las cerdas afectadas (Kin y colaboradores) , J . Vet . Diagn . Invest . , 1:101-104 (1989); Links y colaboradores, Aust . Vet . J. , 63:150-152 (1986); Love y colaboradores, Aust. -^ 4. Vet . J . , 63:128-129 (1986). Recientemente, se ha estado presentando una forma de más virulenta de SRRP, con una mayor incidencia en los cerdos de 3 a 8 semanas de edad en el medio oeste de los Estados Unidos. Típicamente, los cerdos de 3 a 5 semanas de edad sanos se destetan y llegan a enfermarse de 5 a 7 días más tarde. Los métodos de identificación de virus de rutina sobre los tejidos de los cerdos afectados, han mostrado que el virus de influenza - de cerdos (VIC) , el virus de seudorrabia (VSR) , y el Mycoplas a hyponeumoniae no están asociados con esta nueva forma de SRRP: La presente invención se refiere primariamente a una vacuna que protege a los cerdos del agente infeccioso que causa esta nueva forma más virulenta de SRRP, a un método para producir y administrar la vacuna, y ADN que codifica una parte del genoma del agente infeccioso que causa esta nueva forma de SRRP. Sin embargo, se cree que la información aprendida en el curso del desarrollo de la presente invención, será útil para "W desarrollar vacunas y métodos para proteger a los cerdos contra cualquiera y/ó todas enfermedades respiratorias y reproductoras porcinas. Por ejemplo, los presentes Inventores han caracterizado la patología de cuando menos un virus de SRRP que difiere de la patología anteriormente publicada del virus de SRRP (ver la Tabla I más adelante) . Por consiguiente, la presente invención no necesariamente se limita a vacunas y métodos relacionados con el agente infeccioso que causa esta nueva forma de SRRP, que los presentes Inventores han llamado ^t la "cepa de Iowa" del virus de SRRP (VSRRP) . De todas maneras, en la técnica se ha expresado pesimismo y escepticismo con respecto al desarrollo de las vacunas efectivas contra estos virus porcinos {The Veterinary Record , 26 de octubre de 1991) . En la técnica existe una creencia de que la vacuna de influenza humana puede proporcionar alguna protección contra los efectos de SRRP y NPN (por ejemplo, ver íbi ., 6 de julio de 1991). Sin embargo, el p. uso de una vacuna humana en un animal para alimento, generalmente es desalentado por las agencias regulatorias y administrativas, y por consiguiente, este enfoque no es factible en la práctica real (Jjbid.). t 1 La industria de granjas de cerdos ha sido, y continuará siendo afectada adversamente por estas enfermedades reproductoras y respiratorias porcinas, y por las nuevas variantes de las mismas, a medida que se presentan. De una -# 'j manera sorprendente, el mercado de vacunas para animales en los Estados Unidos y en todo el mundo, es mayor que el mercado para vacunas humanas. Por consiguiente, existe un incentivo económico para desarrollar nuevas vacunas veterinarias, en adición al beneficio de salud pública sustancial que se deriva de proteger a los animales de granja de la enfermedad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De conformidad con lo anterior, un objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna novedosa que proteja a un cerdo contra la infección por un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar una vacuna que proteja a un cerdo contra la cepa de Iowa de VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar una vacuna que eleve una respuesta inmunológica efectiva contra un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora en un cerdo, particularmente contra la cepa de Iowa del VSRRP: Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un método novedoso para proteger a un cerdo contra la infección por un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente contra la cepa de Io a del VSRRP. I Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un método novedoso para elevar una respuesta inmunológica efectiva en un cerdo contra un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente contra la cepa de Iowa del VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un anticuerpo que se enlace inmunológicamente con un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente contra la cepa de Iowa del VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, & proporcionar un anticuerpo que se enlace inmunológicamente con una vacuna que proteja a un cerdo contra la infección por un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un anticuerpo que se enlace inmunológicamente con una vacuna que proteja a un cerdo contra la infección por la cepa de Iowa del VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un método para el tratamiento de un cerdo que sufra de una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente de una enfermedad causada por la cepa de Iowa del VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un método para el tratamiento de un cerdo expuesto a un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente a la cepa de Iowa del VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un estuche de diagnóstico para ensayar un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente una enfermedad causada por la cepa de Iowa del VSRRP.

Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un polinucleótido aislado del genoma de un virus # ó agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente de la cepa de Iowa del VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un polinucleótido que codifique una ó más proteínas de un virus ó agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente de la cepa de Iowa del VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un polinucleótido que codifique uno ó más péptidos antigénicos, a partir de un virus ó agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, particularmente de la cepa de Iowa del VSRRP. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un método novedoso para cultivar un virus 0; reproductor y respiratorio porcino, ó un agente infeccioso, utilizando una línea celular adecuada. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un método novedoso para cultivar la cepa de Iowa del VSRRP, utilizando una linea celular adecuada. Estos y otros objetos que llegarán a quedar más claros durante la siguiente descripción de las modalidades preferidas, han sido proporcionados por una vacuna que protege a un cerdo contra la infección por un virus, ó un agente infeccioso que causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, una composición que eleva una respuesta inmunológica efectiva a un virus ó agente infeccioso que causa esta enfermedad porcina, un método para proteger a un cerdo de la infección contra un virus ó un agente infeccioso que causa esta enfermedad porcina, y ADN que codifica una parte del genoma de un virus ó agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora. -f BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama de flujo para la producción de una vacuna viva modificada. La Figura 2 es un diagrama de flujo de un procedimiento para producir una vacuna inactivada. La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un procedimiento para producir una vacuna subunitaria. La Figura 4 es un diagrama dé flujo que ilustra un procedimiento para producir una vacuna genéticamente diseñada. Las Figuras 5 y 6 muestran secciones histológicas de los pulmones de cerdos convencionales 10 días después de la infección con una muestra del agente infeccioso aislado de un cerdo infectado con la cepa de Iowa del VSRRP. La Figura 7 muestra una sección histológica del pulmón de un cerdo gnotobiótico 9 días después de la infección con una muestra de agente infeccioso aislado de un cerdo infectado con la cepa de Iowa del VSRRP. La Figura 8 muestra las lesiones del corazón de un cerdo gnotobiótico 35 días después de la infección con una muestra de un agente infeccioso aislado de un cerdo infectado con la cepa de Iowa del VSRRP. La Figura 9 muestra cultivos de lavado bronquio- alveolar que exhiben sincitios extensos, preparado a partir de un cerdo gnotobiótico 9 días después de la infección con una muestra de filtrado de pulmón de un agente infeccioso aislado de un cerdo infectado con la cepa de Iowa del VSRRP (ISU-12; ver el Experimento I, Sección (II) (C) más adelante) . La Figura 10 es una micrografía de electrones de una partícula de virus envuelta, de aproximadamente 70 nanómetros de diámetro, que tiene espículos superficiales cortos, que se encuentra en los cultivos de macrófagos alveolares de cerdos infectados con un agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa del VSRRP. La Figura 11 es una micrografía de electrones de una partícula de virus envuelta pleomórfica de aproximadamente 80 x 320 nanómetros, recubierta por anticuerpos, que se encuentra en los cultivos de macrófagos alveolares de cerdos infectados con la cepa de Iowa del VSRRP. Las Figuras 12 (A) -(C), son una serie de fotografías que muestran cultivos de macrófagos alveolares de cerdos (MAC) : no infectados (A) ó infectados con ISU-12 (B y C; ver el Experimento II más adelante) . •« Las Figuras 13 (A) -(D) son una serie de fotografías que muestran cultivos de células PSP-36: no infectados (A) , CPE en los infectados con ISU-12, cuatro DPI (B) , IFA de los infectados con ISU-12, cinco DPI (C; ver el Experimento II más adelante) , e infectados con ISU-984 (una segunda muestra del agente infeccioso aislado de un cerdo infectado con la cepa de Iowa del VSRRP) cinco días después de la infección (D) . Las Figuras 14 (A) -(D) son una serie de fotografías que muestran cultivos de células PSP-36: no infectados (A), ó infectados con ISU-12, propagado en MAC 2.5 días después de la infección (B, C y D) . La Figura 15 es un perfil de proteína de ISU-12 propagado en una línea celular PSP-36, determinado mediante radioinmunoprecipitación. La Figura 16 muestra un procedimiento general para la construcción de una biblioteca de cADN ? de una cepa de agente * infeccioso que causa SRRP. La Figura 17 muestra un procedimiento general para la identificación de clones auténticos del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa del VSRRP mediante hibridización diferencial. La Figura 18 muestra la construcción de clones de cADN ? utilizados para obtener la secuencia de nucleótidos 3'- terminal del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa del VSRRP. La Figura 19 presente la secuencia 3' -terminal de 1938-bp del genoma del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa del VSRRP. La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos deducida codificada por la secuencia de ADN de la Figura 19. La Figura 21 compara las secuencias de nucleótidos del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa del VSRRP (ISU-12) y del virus Lelystad con respecto al marco de lectura abierta-5 (MLA-5) . La Figura 22 compara las secuencias de nucleótidos del MLA-6 del virus de ISU-12 con el MLA-6 del virus Lelystad. La Figura 23 compara las secuencias de nucleótidos ' del MLA-7 del virus ISU-12, y del MLA-7 del virus Lelystad. La Figura 24 compara las secuencias de nucleótidos 3'-no traslacionales del virus ISU-12 y del virus Lelystad. La Figura 25 muestra homogenatos de células de huevo Trichoplusian egg no infectados (HI-FIVEMR, Invitrogen, San Diego, California) . La Figura 26 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen de MLA-6 del ISU-12, que exhibe un efecto citopático. La Figura 27 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen de MLA-7 del ISU-12, que también exhibe un efecto citopático. ^• ?- La Figura 28 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen de MLA-6 del ISU-12, manchadas con antisuero de cerdo para ISU-12, seguido por manchado con IgG contra cerdo conjugada con fluoresceína, en donde las células del insecto están produciendo una proteína recombinante codificada por el gen de MLA-6 del ISU-12. La Figura 29 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen de MLA-7 del ISU-12, manchado con antisuero de cerdo para ISU-12, seguido ? por manchado con IgG contra cerdo conjugada con fluoresceína, en donde las células del insecto están produciendo una proteína recombinante codificada por el gen de MLA-7 del ISU-12. La Figura 30 muestra los resultados de la s amplificación de PCR del MLA-5 (pista E) , MLA-6 (pista M) y MLA-7 (pista NP) , utilizando preparadores específicos de ISU- 12, en donde la pista SM contiene estándares de peso molecular. La Figura 31 muestra los resultados de expresar el vector de transferencia de baculovirus recombinante pVL1393, que contiene MLA-5 (pista M) , ó MLA-7 (pista NP) del genoma del ISU-12, después de disociar el ADN del plásmido con enzimas de restricción Ba Hl y EcoRI; la pista SM contiene los estándares del peso molecular. La Figura 32 muestra una mancha Northern del mARN del ISU-12.

Las Figuras 33A y 33B muestran manchas Northen de mARN tomadas de otros aislados de la cepa de Iowa del VSRRP (ISU-22, ISU-55, ISU-79, ISU-1894 e ISU-3927). La Figura 34 es una gráfica de barras de los puntajes de lesión del pulmón gruesa promedio (porcentaje del pulmón afectado) para grupos de cerdos de 3 semanas de edad, VSRRP- seronegativos, libre de patógenos específicos (LPE) administrados con una modalidad de la presente vacuna intranasalmente (IN) ó intramuscularmente (IM) , y un grupo de cerdos de control (NV/CHALL) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS En la presente invención, una "enfermedad respiratoria y reproductora porcina" se refiere a las enfermedades de SRRP, NPN y VEMC descritas anteriormente, la enfermedad causada por la cepa de Iowa del VSRRP, y las variantes estrechamente relacionadas de estas enfermedades que se han presentado y que se presentarán en el futuro. Una vacuna "protege a un cerdo contra una enfermedad causada por un virus ó un agente infeccioso de una enfermedad respiratoria y reproductora porcina" si después de la administración de la vacuna a un cerdo no afectado, no se presentan las lesiones en el pulmón ó los síntomas de la .enfermedad, ó no son tan severos como en los cerdos infectados no protegidos, y si después de la administración de la vacuna a un cerdo afectado, se eliminan las lesiones en el pulmón ó < los síntomas de la enfermedad, ó no son tan severos como en los cerdos infectados no protegidos. Un cerdo no afectado es un cerdo que no ha sido expuesto a un agente infeccioso de una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, ó que se ha expuesto a un agente infeccioso de una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, pero no muestra los síntomas de la enfermedad. Los síntomas de la enfermedad respiratoria y reproductora porcina se pueden cuantificar ó calificar (por ejemplo, temperatura/fiebre, lesiones de los pulmones it [porcentaje de tejido pulmonar infectado]), ó semicuantificar (por ejemplo, severidad en la insuficiencia respiratoria [se explica con detalle más adelante]). Un "virus ó agente infeccioso respiratorio y reproductor porcino" causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, como se describió anteriormente. El agente que causa la nueva forma más virulenta de SRRP, se ha llamado la cepa de "Iowa" de VSRRP. La enfermedad causada por algunos aislados de la cepa de "Iowa" del virus de VSRRP tiene síntomas similares, pero más severos que otras enfermedades respiratorias y reproductoras porcinas. Los signos clínicos pueden incluir letargía, insuficiencia respiratoria, "agitación" (expiración forzada), fiebres, pelambre rugosas, estornudos, tos, edema de los ojos, y ocasionalmente conjuntivitis. Las lesiones pueden incluir lesiones gruesas y/ó microscópicas de los pulmones y miocarditis. El agente infeccioso puede ser un solo virus, ó puede combinarse con uno * * ó más agentes infecciosos adicionales (por ejemplo, otros virus ó bacterias) . En adición, se han descubierto formas menos virulentas y no virulentas de la cepa de Iowa, las cuales pueden causar una subserie de los síntomas anteriores, ó pueden no causar síntomas del todo, pero que se pueden emplear de conformidad con la presente invención para proporcionar protección contra las enfermedades reproductoras y respiratorias porcinas de todas maneras.

Las lesiones histológicas en las diferentes enfermedades porcinas son distintas. La Tabla I siguiente compara las observaciones fisiológicas y la patología de las lesiones asociadas con un número de enfermedades causadas por i 1 virus porcino: 9f fr TABLA 1 PATOLOGÍA COMPARATIVA DE NEUMONÍA VIRAL DE CERDOS Lesión SRRP(p) SRRP (o) VIC NPN CVRB PMPV Iowa Tipo II + +++ + +++ ++ ++ ++++ SL Espesamiento ínter. ++++ + + + ++ ++ + Exudado alveolar + +++ ++ ++ ++ ++ +++ Necrosis de las vías aéreas - ++++ ++++ +++ + - Sincitios - ++ +/- ++ + + +++ Encefalitis + +++ - ++ + Miocarditis +/- ++ +++ " " " En donde "SRRP(p)" representa la patología publicada del virus de SRRP, "SRRP(o)" representa la patología del virus de SRRP observado por los presentes inventores, "VIC" representa virus de influenza de cerdo A, "CVRP" representa coronavirus respiratorio porcino, "PMVP" representa paramixovirus porcino, "Iowa" se refiere a la nueva cepa de VSRRP descubierta por los presentes inventores, "Tipo II" se refiere a los neumocitos Tipo II (que se proliferan en cerdos infectados), "ínter" se refiere a intersticial, "Necrosis de las Vías Aéreas" se refiere a necrosis en las vías aéreas ~* terminales, y los símbolos (-) y (+) hasta (++++) se refieren a una escala de severidad comparativa, como sigue: (-) : negativo (no observado) (+) : ligero (justo arriba del umbral de observación) . (++) : moderado (+++) : severo (++++) el más severo La cepa de Iowa de VSRRP ha sido identificada por los presentes inventores en el medio oeste de los Estados Unidos, en asociación con SRRP. Todavía no está claro si la enfermedad asociada con la cepa de Iowa de VSRRP, como se encuentra naturalmente, se debe a un virus único, o a una combinación de un virus con uno (o más) agentes infecciosos adicionales. Sin embargo, las muestras purificadas de placa de la cepa de Iowa de VSRRP, parecen ser un solo virus único. Por « fr consiguiente, "la cepa de Iowa VSRRP", se refiere bien sea a un virus purificado de placa único, o a un homogenato de tejido a partir de un animal infectado que puede contener una combinación de un virus con uno (o más) agentes infecciosos adicionales, y un cerdo infectado con la cepa de Iowa de VSRRP, muestra uno o más de los síntomas característicos de la enfermedad causada por la cepa de Iowa de VSRRP, como se describió anteriormente. La evidencia reciente indica que la cepa de Iowa de VSRRP, difiere del agente infeccioso que causa SRRP convencional. Por ejemplo, las lesiones observadas en cerdos infectados que exhiben síntomas de la enfermedad causada por la cepa de Iowa de VSRRP, son más severas que las lesiones observadas en cerdos infectados con un virus de SRRP convencional, anteriormente descrito solo, y los cerdos que sufren de la enfermedad causada por la cepa de Iowa de VSRRP, también son seronegativos para influenza, incluyendo los virus asociados con NPN. Haciendo ahora referencia a las Figuras 1 a 4 , se proporcionan diagramas de flujo de los procedimientos para la preparación de diferentes tipos de vacunas abarcadas por la presente invención. Los diagramas de flujo de las Figuras 1 a 4 se proporcionan como métodos de ejemplo para producir las presentes vacunas, y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera. La primera etapa en cada procedimiento detallado en las Figuras 1 a 4 es identificar una línea celular susceptible de infección con un virus o un agente infeccioso respiratorio y reproductivo porcino. (Para simplificar la discusión con respecto a la preparación de la vacuna, el término "virus" significa virus y/u otro agente infeccioso asociado con una enfermedad respiratoria y reproductora porcina) . Entonces se prepara un material de células maestras (MCM) de la célula fr huésped susceptible. Las cálulas huéspedes susceptibles continúan pasándose más allá del MCM. El material celular de trabajo (MCT) se prepara a partir de los pasos de las células entre el MCM y el MCM+n. Se propaga un virus de siembra maestro sobre la línea celular huésped susceptible, entre MCM y MCM+n, de preferencia sobre MCT. El virus crudo se aisla mediante métodos conocidos en este campo, a partir de muestras de tejido apropiadas, de preferencia homogeneizadas, tomadas de cerdos infectados que exhiben síntomas de enfermedad correspondientes a los causados por el virus de interés. Una célula huésped adecuada, de preferencia una muestra del MCT, se infecta con el virus crudo, y luego se cultiva. El virus de vacuna se aisla subsecuentemente y se purifica de placas a partir de la célula huésped infectada cultivada, mediante métodos conocidos en este campo. De preferencia, el virus que ^ * fgg, se va a utilizar para preparar la vacuna, se purifica de placas tres veces. Entonces se prepara el virus de siembra maestra (VSM) a partir del virus purificado de placas, mediante métodos conocidos en este campo. El VSM(X) se pasa entonces en el MCT cuando menos cuatro veces a través de los pasos de irus VSM(X+l) , VSM(X+2), VSM(X+3) , y VSM(X+4) . El VSM(X+4) se considera como el virus de siembra de trabajo. De preferencia, -•^ ^_ el paso de virus que se va a utilizar en los estudios de * *. cerdos y en el producto de vacuna de la presente invención, es VSM(X+5) , el producto del quinto paso. En conjunto con el material celular de trabajo, el virus de siembra de trabajo se cultiva mediante métodos conocidos, en cantidades suficientes para preparar una vacuna prototipo, de preferencia VSM(X+5) . Las presentes vacunas prototipo pueden ser de cualquier tipo adecuado para utilizarse en el campo de la medicina veterinaria. Los tipos adecuados incluyen una vacuna viva modificada o atenuada (Figura 1) , una vacuna inactivada o aniquilada (Figura 2) , una vacuna subunitaria (Figura 3) , una vacuna genéticamente diseñada (Figura 4) , y otros tipos de vacunas reconocidos en la técnica de las vacunas veterinarias. Una vacuna aniquilada se puede hacer inactiva a través de tratamiento químico o de calor, etc., de una manera conocida para el técnico de experiencia ordinaria. En los procedimientos ilustrados por cada una de las Figuras 1 a 4, en seguida de la preparación de una vacuna prototipo, se conducen ensayos de modelos de agresión de cerdos y clínicos mediante métodos conocidos en este campo. Por ejemplo, antes de realizar los estudios reales de vacunación/agresión, se debe definir la enfermedad que se va a prevenir y/o a tratar en términos de sus síntomas, resultados del ensayo clínico, condiciones, etc. Como se describió anteriormente, el agente infeccioso asociado con la "# ifc cepa de Iowa de VSRRP se ha definido en términos de sus síntomas y condiciones. El análisis clínico del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP, se describe en los siguientes ejemplos. Después de que se define y se caracteriza de una manera suficiente la enfermedad, se puede administrar una vacuna prototipo a un cerdo, y luego se expone al cerdo al virus o al agente infeccioso que causa la enfermedad. Esto se conoce en la técnica como "agresión" del cerdo y de su sistema inmunológico. Después de observar la respuesta del cerdo agredido a la exposición al virus o al agente infeccioso, y de analizar la capacidad de la vacuna prototipo para proteger al cerdo,, se realizan estudios de eficacia mediante los métodos conocidos en este campo. Luego se desarrolla un ensayo de potencia en un procedimiento separado mediante métodos conocidos en este campo, y entonces se producen seriales de licencia previa. En la preparación de una vacuna viva modificada como se ilustra en la Figura 1, una vez que se prepara una vacuna prototipo, primero se optimizan las condiciones del crecimiento celular y la producción del virus, y luego se prepara una línea de producción mediante métodos conocidos en este campo. Una vez que se prepara la línea de producción, se preparan subsecuentemente seriales de licencia previa mediante métodos conocidos en este campo. Los seriales de licencia previa se refieren a una producción a gran escala de una vacuna prototipo prometedora, que demuestra la capacidad para producir los seriales con estándares consistentes. Un enfoque para preparar una vacuna viva prototipo, es sujetar a las células infectadas con virus (de preferencia, las células infectadas con el virus de siembra maestro) a uno o más ciclos de congelación y descongelación, para lisar las células. El material de cultivo celular infectado congelado y descongelado, se puede liofilizar (secar por congelación) para mejorar la posibilidad de conservación en almacenamiento. Después de la rehidratación subsecuente, se utiliza entonces el material como una vacuna viva. El procedimiento para la preparación de los seriales de licencia previa para una vacuna inactivada (Figura 2) es similar al empleado para la preparación de una vacuna viva modificada, con una modificación primaria. Después de la optimización de las condiciones del cultivo celular y del protocolo de producción del virus, se debe optimizar entonces un protocolo de inactivación del virus antes de la preparación de una línea de producción adecuada. Los protocolos de inactivación del virus y su optimización, son generalmente conocidos por los expertos en este campo, y pueden variar de una manera conocida o predecible, dependiendo del virus particular que se esté estudiando. La preparación de una vacuna subunitaria (Figura 3) * > difiere de la preparación de una vacuna viva modificada o de una vacuna inactivada. Antes de la preparación de una vacuna prototipo, se deben identificar los componentes protectores o antigénicos del virus de la vacuna. Estos componentes protectores o antigénicos incluyen ciertos segmentos de aminoácido o fragmentos de las proteínas de recubrimiento viral que elevan una respuesta protectora o inmunológica particularmente fuerte en los cerdos (que son de preferencia * ^ de cuando menos 5 aminoácidos de longitud, y de una manera particularmente preferible de cuando menos 10 aminoácidos de longitud) ; las proteínas de recubrimiento viral sencillas o múltiples mismas, los oligómeros de las mismas, y las asociaciones de orden más alto de las proteínas de t recubrimiento viral que forman las subestructuras del virus o las partes identificables o las unidades de estas subestructuras; oligoglicósidos, glicolípidos, o glicoproteínas presentes sobre o cerca de la superficie del # fr virus o en las subestructuras virales, tales como el nucleocáptido; lipoproteínas o grupos de lípidos asociados con el virus, etc. Estos componente se identifican mediante métodos conocidos en este campo. Una vez identificados, subsecuentemente las partes protectoras o antigénicas del virus (la "subunidad") se purifican y/o se clonan mediante métodos conocidos en este campo. La preparación de los seriales de licencia previa * * para una vacuna subunitaria (Figura 3) es similar al método empleado para una vacuna inactivada (Figura 2), con algunas modificaciones. Por ejemplo, si la subunidad se está produciendo a través de técnicas genéticas recombinantes, la expresión de la subunidad clonada se puede utilizar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, las secciones pertinentes de Maniatis y colaboradores , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) , Cold Spring Harbor, Massachusetts) . Por otra parte, si la subunidad que se está empleando representa una característica restructural intacta del virus, tal como una proteína de recubrimiento entera, el procedimiento para su aislamiento del virus debe optimizarse entonces. En cualquier caso, después de la optimización del protocolo de inactivación, se puede optimizar el protocolo de purificación de la subunidad antes de la preparación de la línea de producción. Las vacunas genéticamente diseñadas (Figura 4) empiezan con una modificación del procedimiento general empleado para la preparación de las otras vacunas. Después de la purificación de placas, el virus de tipo silvestre puede aislarse de un homogenato de tejido adecuado, mediante métodos conocidos en este campo, de preferencia mediante métodos de cultivo celular convencionales, utilizando células PSP-36 o macrófagas como huéspedes. * El ARN se extrae del virus biológicamente puro o del agente infeccioso, mediante métodos conocidos en este campo, de preferencia mediante el método de isotiocianato de guanidina, utilizando un estuche de aislamiento de ARN comercialmente disponible (por ejemplo, el estuche disponible en Stratagene, La Jolla, California) , y se purifica mediante métodos conocidos en este campo, de preferencia mediante ultracentrifugación en un gradiente de CsCl. El ARN se puede * purificar o enriquecer adicionalmente mediante cromatografía de columna de oligo (dT) -celulosa. Entonces se clona el genoma viral en un huésped adecuado mediante métodos conocidos en este campo (ver Maniatis y colaboradores, citado anteriormente) , y luego se analiza el genoma del virus para determinar las regiones esenciales del genoma para producir partes antigénicas del virus. Posteriormente, el procedimiento es generalmente el mismo que para una vacuna viva modificada, una vacuna inactivada, o una vacuna subunitaria. La presente vacuna protege a los cerdos contra un virus o agente infeccioso que causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina. De preferencia, la presente vacuna protege a los cerdos contra el agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP. Sin embargo, también se espera que la presente vacuna proteja a un cerdo contra la infección por la exposición a variantes fr estrechamente relacionadas del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP. Relativamente pocos virus son susceptibles de producción de vacunas de virus vivos. Las ventajas de las vacunas de virus vivos, es que se activan todas las respuestas inmunes posibles en el receptor de la vacuna, incluyendo las respuestas inmunes sistémicas, locales, humorales, y mediadas por las células. Los inconvenientes de las vacunas de virus vivos, están en el potencial de contaminación con agentes adventicios vivos, tales como el virus SV40, y el virus de diarrea viral bovina, un contaminante común del suero fetal bovino. Este riesgo, más el riesgo de que el virus pueda revertirse en virulencia en el campo, o pueda no atenuarse con respecto al peso, a los animales jóvenes, y a otras especies, pueden superar las ventajas de una vacuna viva.

Las vacunas de virus inactivados pueden prepararse M¡¿ ft mediante el tratamiento de virus con agentes inactivadores, \ tales como formalina o solventes hidrofóbicos, ácido, etc., mediante irradiación con luz ultravioleta o rayos X, mediante calentamiento, etc. La inactivación se conduce de una manera que se entiende en la técnica. Un virus se considera inactivado si es incapaz de infectar una célula susceptible de infección. Por ejemplo, en la inactivación química, una muestra de virus adecuada o una muestra de suero que contenga ¡2 el virus, se trata durante un tiempo suficiente con una fr cantidad o concentración suficiente de agente inactivador, a una temperatura o pH suficientemente altos (o bajos, dependiendo del agente inactivador) para inactivar al virus. La inactivación mediante calentamiento se conduce a una i temperatura y durante un tiempo suficientes para inactivar al virus. La inactivación mediante irradiación se conduce utilizando una longitud de onda de luz u otra energía durante a- un tiempo suficiente para ináctivar al virus. Los ejemplos de las vacunas inactivadas para uso humano incluyen vacuna de influenza, poliomielitis, rabia, y hepatitis tipo B. Un ejemplo de éxito y efectivo de una vacuna inactivada para utilizarse en cerdos, es la vacuna de parvovirus porcino. Las vacunas de virus subunitarias se preparan a partir de subunidades de virus semipurificadas mediante los métodos descritos anteriormente en la discusión de la Figura 3. Por ejemplo, la hemaglutinina aislada del virus de fr influenza y los antígenos superficiales de neuraminidasa aislados del virus de influenza se han preparado, y han demostrado que son menos tóxicos que el virus entero. De una manera alternativa, las vacunas subunitarias se pueden preparar a partir de subunidades altamente purificadas del virus. Un ejemplo en seres humanos es el antígeno superficial de 22-nm del virus de hepatitis B humano. Se conocen las subunidades del virus de herpes simplex humano, y muchos otros ejemplos de vacunas subunitarias para utilizarse en seres humanos . Las vacunas de virus atenuados se pueden encontrar en la naturaleza, y pueden tener supresiones de genes que se presentan naturalmente, o de una manera alternativa, se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos, tales como el paso en serie en cultivos celulares o en cultivos de tejido. Los virus también se pueden atenuar mediante supresión . de genes o mutaciones de genes. fr Las vacunas genéticamente diseñadas se producen mediante técnicas conocidas por los expertos en este campo. Estas técnicas incluyen las que utilizan. ADN recombinante, y las que utilizan virus vivos. Por ejemplo, se pueden identificar ciertos genes de virus que codifican para las proteínas responsables de inducir una respuesta inmune o protectora más fuerte en cerdos. Estos genes identificados se pueden clonar en los vectores de expresión de proteína, tales como el vector de vaculovirus, y se utilizan para infectar fr células huéspedes apropiados (ver, por ejemplo, O'Reilly y colaboradores . "Bacolovirus Expression Vectors : A Lab Manual," Freeman & Co. (1992)). Las células huéspedes se cultivan, expresando de esta manera las proteínas de vacuna deseadas, las cuales se pueden purificar hasta un grado deseado, y luego se utilizan para proteger a los cerdos de una enfermedad respiratoria y reproductora. Las proteínas genéticamente diseñadas se pueden * fr expresar en células de insectos, células de levadura, o células de mamíferos. Las proteínas genéticamente diseñadas, las cuales se pueden purificar y/o aislar mediante métodos convencionales, se pueden inocular directamente en los i animales, para conferir protección contra las enfermedades reproductoras y respiratorias porcinas. Se utilizan proteínas de envoltura a partir de un agente infeccioso de una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, en una vacuna, fr para inducir anticuerpos neutralizantes. Se utilizan nucleoproteínas a partir de un agente infeccioso o virus de enfermedad respiratoria y reproductora porcina en una vacuna, para inducir inmunidad celular. De preferencia, la presente invención transforma una línea celular de insecto (HI-FIVE) con un vector de transferencia que contiene ácidos polinucleicos obtenidos a partir de la cepa de Iowa de VSRRP. De preferencia, el presente vector de transferencia incluye ADN de vaculovirus # fr linealizado y un plásmido que contiene ácidos polinucleicos obtenidos a partir de la cepa de Iowa de VSRRP. La línea celular huésped puede cotransfectarse con el ADN de vaculovirus linealizado y un plásmido, de tal manera que se hace un vaculovirus recombinante. De una manera particularmente preferible, el presente ácido polinucleico codifica una o más proteínas de la cepa de Iowa de VSRRP. De una manera alternativa, el ARN o el ADN del agente infeccioso o virus de enfermedad reproductora y respiratoria porcina que codifica una o más proteínas de envoltura y/o nucleoproteínas, se puede insertar en los vectores vivos, tales como virus de viruela o un adenovirus, y se utilizan como una vacuna. Por consiguiente, la presente invención se refiere además a un ácido polinucleico aislado a partir de una parte del genoma de un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora, de preferencia un ácido polinucleico aislado a partir de una parte del genoma de la cepa de Iowa de VSRRP. La frase "éido polinucleico" se refiere' a ARN o a ADN, así como a ARN y cADN correspondiente a, o complementario a, el ARN o el ADN del agente infeccioso. El presente ácido polinucleico tiene utilidad como un elemento para producir la presente vacuna, como un elemento para clasificar o identificar a los animales infectados, y como un elemento para identificar los virus y agentes infecciosos relacionados. En una modalidad de la presente invención, el ácido polinucleico codifica una o más proteínas de un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora, de preferencia una o ambas de la proteína de membrana viral (envoltura) y la proteína de capsido (nucleoproteína) . De una manera particularmente preferible, el presente ácido polinucleico se toma a partir de un fragmento de 2 kb desde el extremo 3* del genoma, y codifica una o más de las proteínas de envoltura codificadas por el MLA-5 o el MLA-6, y/o la nucleoproteína codificada por el MLA-7 del genoma de la cepa de Iowa de VSRRP. De una manera más preferible, el ácido polinucleico se aisla del genoma de un agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP; por ejemplo, el agente descrito en los experimentos I-III más adelante (ISU-12) , se selecciona a partir del grupo que consiste en MLA-5 (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 10) , MLA-6 (NUMERO DE fr IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 12), MLA-7 (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 15), y la secuencia 3' -terminal de 1938 bp del genoma ISU-12 (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8) . En el contexto de la presente solicitud, las proteínas o los péptidos codificados por ARN y/o ADN de un virus o agente infeccioso, se consideran "inmunológicamente equivalentes" si el ácido polinucleico tiene el 90 por ciento o más de homología con el ácido polinucleico que codifica la ' w proteína o el péptido inmunogénico. "Homología" en esta solicitud, se refiere al porcentaje de secuencias de nucleótido o de aminoácidos idénticas entre dos o más virus o agentes infecciosos. De conformidad con lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención abarca un ácido polinucleico aislado que es cuando menos el 90 por ciento homólogo a un ácido polinucleico obtenido a partir del genoma de un virus que causa una enfermedad respiratoria y fr reproductora, de preferencia un ácido polinucleico obtenido a partir del genoma del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP. Se pueden utilizar segmentos relativamente cortos de ácido polinucleico (de aproximadamente 20 bp o más largos) en el genoma de un virus, para clasificar o identificar animales infectados, y/o para identificar virus relacionados, mediante los métodos descritos en lá presente y conocidos por los expertos ordinarios en este campo. De conformidad con lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención abarca un ácido polinucleico aislado (y si se desea, purificado) que consiste esencialmente en fragmentos aislados obtenidos a partir de una parte del genoma de un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora, de preferencia un ácido polinucleico obtenido a partir de una parte del genoma del agente infeccioso asociado con la cepa d Iowa de VSRRP. que es de cuando menos 20 nucleótidos de longitud, de preferencia de 20 a 100 nucleótidos de longitud. De una manera particularmente preferible, los presentes fragmentos de ácido polinucleico aislados se obtienen a partir de la secuencia 3' -terminal de 1938 bp del genoma ISU-12 (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8) , y de una manera más preferible, se seleccionan a partir del grupo gue consiste en el NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1, NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2, NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3, NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4, NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5, NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6, Y NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7. Los presentes fragmentos de ácido polinucleico aislados se pueden obtener mediante la digestión del cADN correspondiente a (complementario a) los ácidos polinucleicos virales, con una o más enzimas de restricción apropiadas, o se pueden sintetizar utilizando un sintetizador de fr polinucleótidos automatizado comercialmente disponible. En otra modalidad de la presente invención, el ácido polinucleico codifica uno o más péptidos antigénicos a partir de un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora, de preferencia uno o más péptidos antigénicos a partir del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP. Como se describió anteriormente, el presente ácido polinucleico codifica una parte antigénica de una proteína a partir de un virus que causa una enfermedad respiratoria y W *? reproductora, de preferencia a partir del agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP, de cuando menos 5 aminoácidos de longitud, de una manera particularmente preferible, de cuando menos 10 aminoácidos de longitud. Los métodos para determinar la parte antigénica de una proteína son conocidos por los expertos ordinarios en este campo. La presente invención se refiere adicionalmente a una muestra biológicamente pura de un virus o agente • fr infeccioso que causa una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en el NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8, NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 10, NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 12, NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 15, y NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 16. Las presente proteínas y péptidos antigénicos son útiles en las pruebas serológicas para clasificar cerdos para exponerse a VSRRP, particularmente a la cepa de Iowa de VSRRP. La presente invención se refiere adicionalmente a una muestra biológicamente pura de un virus o agente infeccioso que causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, caracterizada por los siguientes síntomas y signos clínicos: letargía, insuficiencia respiratoria, espiración forzada, fiebres, pelambre rugosa, estornudos, tos, edema de los ojos, y ocasionalmente conjuntivitis. La presente muestra biológicamente pura de un virus o agente infeccioso, se puede caracterizar adicionalmente porque causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, que puede incluir las siguientes lesiones histológicas: lesiones del pulmón gruesas y/o microscópicas, neumocito Tipo II, miocarditis, encefalitis, encefalitis, formación de exhudado alveolar, y formación de sincitios. La frase "biológicamente puro", se refiere a una muestra de un virus o agente infeccioso en donde toda la * progenie se deriva de un solo padre. Normalmente, una muestra "biológicamente pura" se logra mediante purificación de placa 3 x en el cultivo celular. En particular, el presente virus o agente infeccioso biológicamente puro es la cepa de Iowa del síndrome reproductor y respiratorio porcino, cuyas muestras se han depositado según los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, / y • La cepa de Iowa de VSRRP también se puede caracterizar por manchas Northern de su mARN. Por ejemplo, la cepa de Iowa de VSRRP puede contener 7 ó 9 mARN's, que también puede tener supresiones en el mismo. En particular, como se describirá en los experimentos que están más adelante, los mARN's de la cepa de Iowa de VSRRP, pueden contener hasta cuatro supresiones. La presente invención se refiere adicionalmente a una composición para proteger a un cerdo de una infección viral, la cual incluye una cantidad de la presente vacuna, efectiva para elevar una respuesta inmunológica para un virus que causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, en un vehículo fisiológicamente aceptable. Una cantidad efectiva de la presente vacuna es una .^- en la cual se eleva una respuesta inmunológica suficiente a la "' W^~ vacuna para proteger a un cerdo expuesto a un virus que causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, o una enfermedad relacionada. De preferencia, el cerdo se protege hasta un grado en el cual se reduce de una manera significativa uno o todos los síntomas o efectos fisiológicos adversos (por ejemplo, lesiones de los pulmones) de la enfermedad que se va a prevenir. ^ La composición se puede administrar en una sola ^^ dosis, o en dosis repetidas. Las dosificaciones pueden contener, por ejemplo, de 1 a 1000 microgramos de antigeno basado en virus (vacuna) , pero no debe contener una cantidad de antígeno basado en virus suficiente para dar como resultado una reacción adversa o síntomas fisiológicos de infección. Se conocen métodos en la técnica para determinar dosificaciones adecuadas del agente antigénico activo.

La composición que contiene a la presente vacuna se ^ puede administrar en conjunto con un adyuvante. Un adyuvante ^ fs es una sustancia que incrementa la respuesta inmunológica a la presente vacuna cuando se combina con la misma. El adyuvante se puede administrar al mismo tiempo y en el mismo sitio que la vacuna, o en un tiempo diferente, por ejemplo, como un elevador. Los adyuvantes también se pueden administrar convenientemente al animal de una manera, o en un sitio o localización diferentes de la manera, sitio, o localización en -^ que se administra la vacuna. Los adyuvantes incluyen hidróxido ^. ^ de aluminio, sulfato de potasio de aluminio, enterotoxinas lábil al calor o estable al calor aislada de Escherichia coli , toxina de cólera o la subunidad B de la misma, toxina de difteria, toxina de tétanos, toxina de tos ferina, adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, y similares. Los adyuvantes basados en toxina, tales como toxina de difteria, toxina de tétanos, y toxina de tos ferina, se pueden inactivar antes de usarse, por ejemplo, mediante su tratamiento con formaldehído. La presente invención también se refiere a un método para proteger a un cerdo de la infección contra un virus que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, el cual incluye administrar una cantidad efectiva que eleva una respuesta inmunológica contra ese virus, a un cerdo que necesite esa protección contra la infección por ese virus.

Mediante "protección de un cerdo de la infección" contra un t, virus o agente infeccioso respiratorio y reproductor porcino, queremos decir que después de la administración de la presente vacuna a un cerdo, el cerdo muestra síntomas reducidos (menos severos) o no clínicos (tales como fiebre) asociados con la enfermedad correspondiente, en relación con los cerdos de control (infectados) . Los síntomas clínicos se pueden cuantificar (por ejemplo, fiebre, cuenta de anticuerpos, y/o lesiones de los pulmones) , o semicuantificar (por ejemplo, -g^ v severidad de la insuficiencia respiratoria) . ¡J En la presente invención, se ha desarrollado un sistema para medir insuficiencia respiratoria en cerdos afectados. El presente sistema de calificación respiratoria clínica evalúa la insuficiencia respiratoria de los cerdos 1 afectados mediante la siguiente escala: 0 = sin enfermedad; respiración normal. 1 = difnea y polifnea ligera cuando los cerdos sé tensan (son forzados a respirar fr en grandes volúmenes y/o a una velocidad acelerada) . 2 = difnea y polifnea ligera cuando los cerdos están en reposo. 3 = difnea y polifnea moderada cuando los cerdos se tensan. 4 = difnea y polifnea moderada cuando los cerdos están en reposo. 5 = difnea y polifnea severa cuando los fr fr cerdos se tensan. 6 = difnea y polifnea severa cuando los cerdos están ,en reposo.

En el presente sistema de calificación respiratoria clínica, una calificación de "0" es normal, e indica que el cerdo no está afectado por una enfermedad respiratoria y productora porcina. Una calificación de "3" indica una * » enfermedad respiratoria moderada, y una calificación de "6" indica una enfermedad respiratoria muy severa. Una cantidad de la presente vacuna o composición, se puede considerar efectiva si un grupo de cerdos agredidos que reciben la vacuna o composición, muestran una calificación respiratoria clínica promedio más baja que un grupo de cerdos idénticamente agredidos a los que no se les da la vacuna o la composición. (Un cerdo se considera "agredido" cuándo se expone a una concentración de un agente infeccioso suficiente para causar la enfermedad en un animal no vacunado) . De preferencia, la presente composición de vacuna se administra directamente a un cerdo que todavía no se expone a un virus que causa una enfermedad reproductora o respiratoria. La presente vacuna se puede administrar oralmente o parenteralmente. Los ejemplos de las vías de administración parenterales incluyen las vias de administración intradérmica, '-z-x ^ intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, e fr intranasal. Cuando se administra como una solución, la presente vacuna se puede preparar en la forma de una solución acuosa, un jarabe, un elíxir, o una tintura. Estas formulaciones se conocen en la técnica, y se preparan mediante la disolución del antigeno y otros aditivos apropiados en los sistemas de solvente apropiados. Estos solventes incluyen agua, suero, ,g etanol, etilenglicol, glicerol, fluido de Al, etc. Los ?v j ?jfr adi•ti•vos adecuados conocidos en la técnica incluyen colorantes certificados, saborizantes, edulcorantes, y conservadores antimicrobianos, tales como timerosal (etilraercuritiosalicilato de sodio) . Estas soluciones se pueden estabilizar, por ejemplo, mediante la adición de gelatina parcialmente hidrolizada, sorbitol, o un medio de cultivo celular, y se pueden regular mediante métodos conocidos en este campo, utilizando reagentes conocidos en la ß técnica, tales como hidrogenfosfato de sodio, dihidrogenfosfato de sodio, hidrogenfosfato de potasio, y/o dihidrogenfosfato de potasio. Las formulaciones líquidas también pueden incluir suspensiones u emulsiones. La preparación de suspensiones, por ejemplo, utilizando un molino de coloide, y de emulsiones, por ejemplo, utilizando un homogeneizador, es conocida en la técnica. Las formas de dosificación parenterales, diseñadas • para inyectarse en sistemas del fluido corporal, requieren de una isotonicidad apropiada y de un pH que se regule hasta los niveles correspondientes de., los fluidos corporales porcinos. Las formulaciones parenterales también deben esterilizarse antes de usarse. La isotonicidad se puede ajustar con cloruro de sodio y otras sales, según sea necesario. Se pueden utilizar otros solventes, tales como etanol o propilenglicol, para » fr incrementar la solubilidad de los ingredientes de la composición, y la estabilidad de la solución. Otros aditivos que se pueden utilizar en la presente formulación, incluyen dextrosa, antioxidantes convencionales, y agentes de quelación convencionales, tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) . La presente invención también se refiere a un método 81 para producir la presente vacuna, el cual incluye las etapas de: (A) recolectar un virus o agente infeccioso que cause una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, y (B) tratar el virus o al agente infeccioso de una manera seleccionada a partir del grupo que consiste en: (i) purificación de placas del virus o del agente infeccioso, (ii) calentamiento del virus o del agente infeccioso a una temperatura y durante un tiempo suficientes para desactivar el virus o el agente infeccioso, (iii) exponer o mezclar el virus o el agente infeccioso con una cantidad de un producto químico inactivador suficiente para inactivar el virus o el agente infeccioso, (iv) descomponer el virus o el agente infeccioso en sus subunidades correspondientes, y aislar cuando menos una de las subunidades, y (v) sintetizar o aislar un ácido polinucleico que codifique una proteína superficial del virus o del agente infeccioso, infectar una célula huésped adecuada con el ácido polinucleico, cultivar la célula huésped, y * * aislar la proteína superficial a partir del cultivo. De preferencia, el virus o el agente infeccioso se recolecta a partir de un medio de cultivo mediante las etapas de (i) precipitar las células huéspedes infectadas, (ii) lisar las células precipitadas, y (iii) centrifugar el virus o el agente infeccioso antes de la siguiente etapa de tratamiento. De una manera particularmente preferible, las células huéspedes infectadas con el virus o con el agente infeccioso •¿ se cultivan en un medio adecuado antes de recolectarse. De preferencia, después de cultivar las células huéspedes infectadas, las células huéspedes infectadas se precipitan mediante la adición de una solución de un poli (etilenglicol) (PEG) convencionalmente utilizado, al medio de cultivo, en una cantidad suficiente para precipitar las células infectadas. Las células infectadas y precipitadas se pueden purificar adicionalmente mediante centrifugación. Las ^J~ Jfr" células precipitadas se lisan entonces mediante métodos conocidos por los expertos ordinarios en este campo. De preferencia, las células se lisan mediante una congelación y descongelación repetidas (se prefieren particularmente tres ciclos de congelación y descongelación) . El lisado de las células precipitadas libera al virus, el cual entonces se puede recolectar, de preferencia mediante centrifugación. El virus se puede aislar y purificar mediante centrifugación en un gradiente de CsCl, y luego se recupera la banda que fr fr contiene el virus apropiado a partir del gradiente de CsCl. De una manera alternativa, el cultivo celular infectado se puede congelar y descongelar para lisar las células. El material del cultivo celular congelado y descongelado se puede utilizar directamente como una vacuna viva. Sin embargo, de preferencia, el material del cultivo celular congelado y descongelado se liofiliza (para su almacenamiento) , y luego se réhidrata para utilizarse como una # fr vacuna . El medio de cultivo puede contener suero regulado, nutrientes, esenciales, y fuentes adecuadas de carbono y nitrógeno reconocidas en la técnica, en concentraciones suficientes para permitir el crecimiento de las células infectadas con virus. Los medios de cultivo adecuados incluyen medio esencial mínimo de Dulbecco (MEMD) , medio esencial mínimo de Eagle (MEM), medio de Ham, medio 199, suero bovino fetal, suero de becerro fetal, y otros medios equivalentes que t fr apoyan el crecimiento de las células infectadas con virus. El medio de cultivo puede complementarse con suero bovino fetal (hasta el 10 por ciento) y/o L-glutamina (hasta 2 mM) , u otros aditivos apropiados, tales como complementos para el crecimiento y/o antibióticos convencionales. Un medio preferido es el MEMD. De preferencia, la presente vacuna se prepara a partir de un virus o agente infeccioso cultivado en una línea fr celular apropiada. La línea celular de preferencia es PSP-36 o una línea celular equivalente capaz de infectarse con el virus y de cultivarse. Un ejemplo de una línea celular equivalente a PSP-36, es la línea celular PSP-36-SAH, que se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A., el 28 de octubre de 1992, bajo el numero de depósito CRL 11171. Otra línea celular fr equivalente es MA-104, disponible comercialmente en Whittaker Bioproducts, Inc. (Walkersville, Maryland) . Los resultados preliminares indican que el agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP, se puede cultivar en células de turbinato porcinas. Después de la purificación de placas, el agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP, produce las lesiones caracterizadas bajo el encabezado de "Iowa" en la Tabla I anterior, y mostradas en las Figuras 5 a 8. 4 * De conformidad con lo anterior, la presente invención también se refiere a un método para cultivar un virus o agente infeccioso, de preferencia en una línea celular seleccionada a partir del grupo que consiste en PSP-36 y líneas celulares equivalentes capaces de infectarse con el virus y de cultivarse. El método para cultivar un virus o agente infeccioso de conformidad con la presente invención, incluye infectar la linea celular PSP-36 o una línea celular fr fr equivalente capaz de infectarse con un virus o agente infeccioso que cause una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, y de cultivarse, y cultivar la línea celular infectada en un medio adecuado. i De preferencia, el virus o agente infeccioso es la cepa de Iowa de VSRRP, o causa una enfermedad seleccionada a partir del grupo que consiste en SRRP, NPN, y enfermedades relacionadas. De una manera particularmente preferible, la * fr presente vacuna se prepara a partir de la cepa de Iowa de VSRRP, y se cultiva en células de PSP-36. La línea celular MA-104 se obtiene a partir de células de riñon de mono, y es de forma epitelial. Las células MA-140 forman una sola capa confluente en los matraces de cultivo que contienen medio esencial mínimo de Dulbecco, y el 10 por ciento de SBF (suero bovino fetal) . Cuando se forma la única capa, las células se inoculan con una muestra de tejido homogeneizado al 10 por ciento, se toman de un tejido apropiado (tal como el pulmón y/o el corazón) de un cerdo infectado. De preferencia, hay antibióticos apropiados presentes, para permitir el crecimiento del virus y de las células huéspedes, y para suprimir el crecimiento y/o la viabilidad de las células diferentes que no sean las células huéspedes (por ejemplo, bacterias o levaduras) . Ambas células PSP-36 y MA-140 crecen en algunos aislados del virus de SRRP hasta altas titulaciones (sobre 107 TCID50/ml) . Las células PSP-36 y MA-104, también harán crecer al agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP. Las células MA-104 también son capaces de hacer crecer a rotavirus, poliovirus, y otros virus. Se cree que las células CL2621 son de un origen no porcino, y son de forma epitelial, y son propietarias (Boehringer-Mannheim) . En contraste con las PSP-36 y MA-140, algunas muestras del virus que causa SRRP, se han cultivado sin éxito en células CL2126 (Bautista y colaboradores, American Association of Swine Practitionere Newsletter, 4 :32, 1992) . Las características primarias de la CL2621, son que no es de origen de cerdo, y tiene forma epitelial, y se cultiva en medio MEM. Sin embargo, Benfield y colaboradores (J. Vet. Diagn. Invest., 1992; 4:127-133) han reportado que las células CL2621 se utilizaron para propagar virus de SRRP, 4- .fr pero las células de MA-104 se utilizaron para controlar la propagación del virus de polio, infiriendo de esta manera que la CL2621 no es la misma que la MA-104, y que la misma célula no puede propagar a ambos virus. El agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa de VSRRP, generalmente no puede crecer en otras líneas celulares que no sean PSP-36, PSP-36-SAH y MA-104. Como se describió anteriormente, sin embargo, algunos virus que causan SRRP han sido reportados por crecer tanto en SL2621, como en macrófagos * fr alveolares de cerdos primarios, aunque algunas cepas del virus de SRRP no crecen en células PSP-36, MA-104, o CL2621. La presente vacuna se puede utilizar para preparar anticuerpos, los cuales pueden proporcionar una resistencia inmunológica a un paciente (en este caso, un cerdo) expuesto a un virus o agente infeccioso. Los anticuerpos abarcados por la presente invención se enlazan inmunológicamente bien sea con: (1) una vacuna que protege a un cerdo contra un virus o agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora o (2) el virus o agente infeccioso respiratorio y reproductor porcino mismo. Los presentes anticuerpos también tienen utilidad como un agente de diagnóstico para determinar que un cerdo se ha expuesto a un virus o agente infeccioso respiratorio y reproductor, y en la preparación de la presente vacuna. El anticuerpo se puede utilizar para preparar una columna de inmunoafinidad mediante métodos conocidos, y la fr- columna de inmunoafinidad se puede utilizar para aislar el virus o el agente infeccioso, o una proteína del mismo. Para elevar los anticuerpos para estas vacunas o virus, se debe inmunizar un animal huésped apropiado, tal como un ratón, conejo, u otros animales utilizados para esta inoculación, con la proteína utilizada para preparar la vacuna. El animal huésped se inmuniza entonces (se inyecta) con uno de los tipos de vacunas descritos anteriormente, administrando opcionalmente un agente mejorador inmune * fc (adyuvante) , tal como los descritos anteriormente. El animal huésped de preferencia se inmuniza subsecuentemente de 1 a 5 veces a ciertos intervalos de tiempo, de preferencia cada 1 a 4 semanas, más preferiblemente cada 2 semanas. Entonces los animales huéspedes se sacrifican, y se recolecta su sangre. Luego se separan los sueros mediante técnicas conocidas a partir de la sangre entera recolectada. El suero contiene anticuerpos para las vacunas. Los anticuerpos también se pueden purificar mediante métodos conocidos para proporcionar anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) . La presente invención también- abarca anticuerpos monoclonales para las presentes vacunas y/o virus. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante el método de Kholer y colaboradores (Nature, volumen 256, 1975) , páginas 495-497) . Básicamente, las células inmunes de una preparación celular entera del baso del animal huésped inmunizado ]feh, (descrito anteriormente) se funden con células de mieloma fc- # mediante un procedimiento convencional para producir hibridomas, Los hibridomas se cultiva, y el fluido del cultivo resultante se clasifica contra el fluido o inoculo que lleva al agente infeccioso (virus o vacuna) . La introducción del hibridoma en el peritoneo del animal huésped, produce un crecimiento peritoneal del hibridoma. La recolección del fluido de ascitas del animal huésped, proporciona una muestra del anticuerpo monoclonal para el agente infeccioso producido * por el hibridoma. También, el sobrenadante del cultivo celular del hibridoma, se puede utilizar como un agente del anticuerpo monoclonal, la cual se aisla mediante métodos conocidos por los expertos ordinarios en este campo. De preferencia, el presente anticuerpo es del tipo de inmunoglobulina IgG o IgM. La presente invención también se refiere a un método para el tratamiento de un cerdo que sufre de una enfermedad respiratoria y reproductora, el cual incluye administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo que se enlaza inmunológicamente con un virus que causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, o a una vacuna que protege a un cerdo contra la infección por un virus respiratorio y reproductor porcino en un vehículo fisiológicamente aceptable, a un cerdo que lo necesite. El presente método también se refiere a un estuche de diagnóstico para ensayar un virus que causa una enfermedad 2--* * } "9 &* respiratoria porcina, una enfermedad reproductora porcina, o una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, el cual incluye al presente anticuerpo descrito anteriormente, y a un agente de diagnóstico que indica una reacción inmunológica positiva con ese anticuerpo. El presente estuche de diagnóstico de preferencia se basa en modificaciones a los procedimientos conocidos de ensayo de inmunofluorescencia (EIF) , ensayo de inmunoperoxidasa (EIP) , y ensayo inmunosorbente enlazado con * fr enzima (EISEE) . En el EIF, las células infectadas se fijan con soluciones de acetona y metanol, y los anticuerpos para los sueros convalescientes de los cerdos infectados, se incuban con las células infectadas, de preferencia durante aproximadamente 30 minutos a 37°C. Una reacción inmunológica positiva es una en la cual el anticuerpo se enlaza con las ¿^ células infectadas con virus, pero no se lava mediante las etapas de lavado subsecuentes (normalmente un regulador de SBF 3 X) . Entonces se agrega un segundo anticuerpo (un antianticuerpo) etiquetado con un reagente fluorescente (FITC) , y se incuba, de preferencia, durante otros 30 minutos. Una reacción inmunológica positiva da como resultado que el segundo anticuerpo se enlace con el primero, el cual se retiene después del lavado, y da como resultado una señal fluorescente, la cual se puede detectar y semicuantificar . Una reacción inmunológica negativa da como resultado poco o ningún • fr enlace del anticuerpo con la célula infectada. Por consiguiente, el segundo anticuerpo fluorescentemente etiquetado no se enlaza, se lava la etiqueta fluorescente, y se detecta poca o ninguna fluorescencia, comparándose con un control positivo apropiado. Los estuches de EIP y EISEE, son similares al estuche EIF, excepto que el segundo anticuerpo se etiqueta con una enzima específica, en lugar de un reagente fluorescente. Por consiguiente, se agrega un substrato apropiado para la enzima enlazada con el segundo anticuerpo, lo cual da como resultado la producción de un producto coloreado, el cual entonces se detecta y se cuantifica mediante colorimetría, por ' ejemplo. Otras características de la presente invención llegarán a quedar más claras en el curso de las siguientes descripciones de las modalidades de ejemplo, las cuales se dan # para ilustración de la invención, y no pretenden ser limitantes de la misma.

EXPERIMENTO 1 En el Ejemplo 1, se investigó un caso de neumonía • endémica en cerdos de 5 a 8 semanas de edad. Las lesiones microscópicas de la cepa de Iowa de VSRRP observadas en los cerdos, fueron compatibles con una etiología viral. (De conformidad con lo anterior, posteriormente en la presente, para simplificar la discusión, los términos "virus" y "viral" se referirán a un virus o agente infeccioso en el significado descrito anteriormente para la, presente solicitud, o una propiedad de la misma) . La enfermedad se transmitió experimentalmente a cerdos convencionales y gnotobióticos utilizando un homogenato de pulmón aislado de cerdos infectados, filtrado a través de un filtro de 0.22 mieras. No se demostraron patógenos respiratorios virales de cerdos fr # comunes. Se observaron dos tipos de partículas de virus en el cultivo celular mediante microscopía de electrones. Un tipo fue de aproximadamente 70 nanómetros de diámetro, estaba envuelto, y tenía espículos superficiales cortos. El otro tipo estaba envuelto, alargado, pleomórfico, y midió 80 por 320 nanómetros, y estaba recubierto por anticuerpos.

(I) MATERIALES Y MÉTODOS §L Jp. (A) Material de Cerdos Infectados con Neumonía que se Presenta Naturalmente. Se recolectaron y se estudiaron tejidos de tres cerdos de 6 semanas de edad infectados, a partir de un rebaño de 900 cerdos paridos de cerdas para cría, en Iowa del Sur. Las observaciones previas del rebaño mostraron que de 5 a 7 días después del destete, del 50 al 70 por ciento de los cerdos similarmente infectados, llegaron a estar anoréxicos, tenían el pelambre rugoso, y experimentaron letargía, tos, fiebre, y "agitación". Aproximadamente del 10 al 25 por ciento de los cerdos infectados tenían conjuntivitis. La mayoría de los cerdos infectados se recuperaron en 7 a 10 días, pero del 10 al 15 por ciento estaban severamente atrofiados debido a las infecciones bacterianas secundarias, y no eran adecuados para la venta como cerdos de criadero. En el momento del brote original de la enfermedad en este rebaño, se había presentado un fracaso reproductor de los cerdos, incluyendo una mayor cantidad de nacimientos muertos, fetos momificados, e infertilidad, pero posteriormente disminuyeron con el tiempo. La enfermedad respiratoria en la etapa de la cría ha sido persistente. Se observaron lesiones del pulmón caracterizadas por bronquiolitis proliferativa y alveolitis en los tejidos fijados con formalina de 4 cerdos diferentes de 6 semanas de edad. Los intentos por aislar el VIC, el virus de seodurrabia (VSR) , y el virus de encefalomiocarditis (VEMC) , no tuvieron éxito. El examen de inmunofluorescencia de las secciones congeladas del pulmón para el virus de influenza de cerdo (VIC) el virus de seudorrabia (VSR) , y Mycoplasma hyopneumoniae , fueron negativos. Se aisló Pasteurella multocida tipo D, a partir de las cavidades nasales, y se aisló Haemophilus parasius a partir de los pulmones.

Subsecuentemente se obtuvieron del rebaño 5 cerdos 4- de 5 a 6 semanas de edad agudamente afectados, los cuales se habían destetado durante 10 días. Todos los cerdos tuvieron fiebres de cuando menos 40.5°C. Los cerdos se necropsiaron, y se recolectaron y se prepararon muestras de tejido del pulmón a partir del cerdo con lesiones gruesas más típicas de una neumonía viral, para una inoculación inmediata en los cerdos libres de patógenos específicos (LPE) convencionales. Se cultivaron muestras de tejido de pulmón, hígado, riñon, bazo, cerebro, y corazón, a partir de los 5 cerdos de 5 a 6 semanas de edad agudamente afectados, por patógenos bacterianos y virales comunes. Las secciones de los mismos tejidos se recolectaron y se fijaron en formalina regulada neutra al 10 por ciento para el examen histopatológico.

(B) Transmisión Experimental en Cerdos Convencionales. (1) Cerdos Experimentales * fr Se obtuvieron 16 cerdos de 5 semanas de edad a partir de un rebaño libre de micoplasmas, VSR, coronavirus respiratorio porcino (CVRP) , y virus de gastroenteritis transmisible (VGET) . Se colocaron 8 cerdos en cada uno de dos cuartos aislados de 4 x 5 metros con pisos de concreto y ventilación automatizada. Los cerdos se alimentaron con una ración de alimento de maíz-soya con el 18 por ciento de proteína, y agua al gusto. (2) Diseño Experimental Inmediatamente después de la necropsia de los cerdos con neumonía que se presentó naturalmente, se preparó un homogenato de pulmón al 10 por ciento en medio esencial minimo de Dulbecco y de Eagle modificado, se aclaró a 1000 x g durante 10 minutos, seguido por centrifugación a 10,000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante aclarado se filtró a través de un filtro de 0.22 mieras. Ocho cerdos se inocularon fr intranasalmente con 5 mililitros de homogenato de pulmón filtrado. Ocho cerdos de control se inocularon intranasalmente con 5 mililitros de homogenato de pulmón filtrado preparado como se describió anteriormente, a partir de un cerdo gnotobiótico no infectado normal. Los signos clínicos y las temperaturas se supervisaron y se registraron diariamente. Un cerdo de cada grupo se eutanizó u se le hizo la necropsia a los 5, 7, 10 y fr 15 días después de la inoculación (DDI) , respectivamente. Los tejidos se recolectaron en el momento de la necropsia para los procedimientos de aislamiento bacteriano aeróbico y anaeróbico, aislamiento de micoplasma, detección de antigenos para Mycoplasma hyopneumoniae. VIC, VSR, virus de parainfluenza tipo 3 (PI-3) , y virus sincitial respiratorio bovino (VSRB), y para el aislamiento del virus. Los tejidos se fijaron en formalina regulada neutra al 10 por ciento para el examen histopatológico. Los pulmones se fijaron mediante fr fr inflación con formalina en el momento de la necropsia. (c) Transmisión Experimental en cerdos Gnotobióticos (1) Cerdos Experimentales Ocho cerdos privados de calostros, derivados de cesácera (CDCD) , de cría cruzada, gnotobióticos, de un día de edad, se dividieron al azar en dos aisladores (4 cerdos en fr fr cada aislador) . Los cerdos se alimentaron con un reemplazador de leche líquido enlatado, esterilizado, fortificado con hierro (SPF-LAC, Pet-Ag Inc, Elgin, Illinois) . (2) Diseño Experimental Cuatro cerdos principales se inocularon con un homogenato de pulmón filtrado (0.22 mieras) intranasalmente (3 mililitros) y oralmente (1 mililitro) a los 3 días de edad. fr Este filtrado se preparó a partir de un pulmón de un cerdo convencional experimentalmente infectado, el cual se había recolectado 7 días después de la infección (DDI) . Cuatro cerdos de control se inocularon con el homogenato de pulmón preparado a partir de un cerdo gnotobiótico normal. Un cerdo de cada grupo se sacrificó a los 5, 9, 28, y 35 DDI, respectivamente. Se recolectaron el pulmón, el hígado, el riñon, el cerebro, el bazo, el timo, los turbinatos nasales, el corazón, y los intestinos, y se fijaron en fr fr formalina regulada neutra al 10 por ciento para el examen histopatológico. El pulmón, el cerebro, el bazo, y el corazón, se recolectaron para el aislamiento del virus. El pulmón, el hígado, y el bazo, se recolectaron para el aislamiento bacteriológico. El pulmón se recolectó inmediatamente en un medio Friis para el aislamiento de micoplasma, o se congeló a -70°C. fr (D) Ensayos Microbiológicos (1) Aislamiento del irus Se inocularon suspensiones de tejido (10 por ciento en peso/volumen) aclaradas a 1,000 x g, sobre monocapas celulares, y se observaron por el efecto citopático. Se utilizaron cultivos de riñon de cerdo fetal primarios, cultivos de macrófagos alveolares porcinos primarios, y lineas celulares establecidas de PK15, turbinato bovino, riñon de * hámster bebé (RHB) , Vero, y testículos de cerdos (TC) , para los intentos de aislamiento del virus. Se prepararon cultivos de lavado bronquio-alveolar directos a partir de los cerdos gnotobióticos infectados y de control. Los intentos para detectar el virus se hicieron mediante inmunofluorescencia indirecta, utilizando suero de cerdo hiperinmune o convalesciente gnotobiótico de referencia para parvovirus porcino (PVP) , VIC, virus de diarrea viral bovina, virus de encefalomielitis de hemaglutinación (VEH) , (VGET) , y VEMC. Los # fr filtrados se pasaron ciegamente tres veces por inoculación intraalantoica de huevos de pollo embrionados desde 10 días de edad, y fluido alantoico probado por la actividad de la hemaglutinación después de cada paso. (2) Aislamiento del Micoplas a Se inocularon suspensiones de pulmón en medio de caldo de micoplasma Friis (Friis (1975), Acta Vet . Scand . , 27, 337) , BHI-TS, D-TS (Ross y colaboradores, (1971), Journal of Bacteriology, 103, 707) y BHL (Yamamoto y colaboradores, (1982) , Proc. Int. Pig Vet. Society Congress, página 94) . Los cultivos se pasaron cuando fue evidente el cultivo en el día \ 3, 7, 14, y 21, y se identificaron mediante epiinmunofluorescencia. (Del Giudice y colaboradores (1967) , Journal of Bacteriology, 93, 1205) . (3) Aislamiento de Bacterias Se inocularon cotonetes de turbinato nasal en dos placas de ágar sanguíneo, así como sobre ágares MacConkey, Tergitol-7, y PMD (para el aislamiento de P. multocida) . Una de las placas de ágar sanguíneo se incubó a 37 °C en un medio ambiente anaeróbico de C02 y H2. La segunda placa se cruzó con una colonia criadora de Staphylococcus epidermidis, y se incubó con las otras placas en aire a 37 °C. Los pulmones se recubrieron exactamente como los fr cotonetes de turbinato nasal. El higado y el bazo se cultivaron sobre dos placas de ágar sanguíneo aeróbico y anaeróbico) , y una placa de Tergitol-7. Todos los aislados bacterianos se identificaron mediante métodos estándares (Biberstein (1990) , En: Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology, ed. Cárter y colaboradores, 5^ edición, páginas 129-142, Academic Press Inc., San Diego, Cal.; y Cárter (1990) En: Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology, ed. Cárter G.R. y Colé J.R., 5a edición, páginas 129-142, Academic Press Inc., San Diego, Cal.) . (4) Serología Se utilizó la prueba de neutralización de suero para probar los anticuerpos de suero para VSR, VGET, y VEMC. Se utilizó la prueba de inhibición de hemaglutinación para probar los anticuerpos del suero para VEMC y VEH. Se utilizó la prueba de inmunofluorescencia indirecta para detectar los anticuerpos del suero para VSRB, PI-3, ' VIC, y VGET. Se probaron los sueros gnotobióticos por anticuerpos para VSRRP. Se utilizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta utilizando la línea celular CL2621 para la detección de los anticuerpos de VSRRP.

(II) RESULTADOS (A) Neumonía que se Presenta Naturalmente Los pulmones de los cerdos agudamente afectados no se colapsaron. Gruesamente, los pulmones tuvieron un edema interlobular moderado, y áreas lineales multifocales a coalescentes de atelectasis que involucraron a todos los lóbulos de los pulmones. Hubo una consolidación craneoventral del 5 al 15 por ciento de los lóbulos craneales y medios. El examen histopatológico reveló una bronquilitis y alveolitis proliferativa difusa aguda, moderada. Hubo una miocarditis linfoplasmacítica multifocal ligera. No se vieron lesiones en otros órganos. Los intentos de aislamiento del virus para adenovirus, VSR, VIC, VEH, coronavirus respiratorio porcino (CVRP) , parvovirus porcino (PVP) , VEMC, y enterovirus, fueron negativos desde el sometimiento del caso original, así como a partir de los cerdos agudamente afectados posteriormente obtenidos del rebaño. fr El examen de inmunofluorescencia de las secciones congeladas del pulmón, no reveló los antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae f VIC, virus sincitial respiratorio bovino (VSRB) , virus de parainfluenza 3 (PI-3) , VSR ó VGT. El suero de uno de los 5 cerdos LPE convencionales de la sección (I) (A) anterior, dio una reacción inmunológica positiva en una dilución de 1:20 para VSRRP mediante inmunofluorescencia indirecta. Se aisló Pasteurella multocida tipo D y Haemophilus parasuis. respectivamente, a partir de los turbinatos nasales y del pulmón de este cerdo. No se aislaron bacterias aeróbicas o anaeróbicas a partir del pulmón de cerdo agudamente afectado seleccionado para la homogeneización y el inoculo (ver Métodos y Materiales, Sección (C) (2) anterior) .

(B) Estudio de Cerdo Convencional Para los 7 DDI, todos los cerdos principales tenían * « fiebres de 40 a 41.1°C, y estaban experimentando una v insuficiencia respiratoria moderada. Los cerdos estaban anoréxicos y letárgicos. Para los 15 DDI, los cerdos se habían recuperado. Los cambios macroscópicos en los pulmones se caracterizaron por fracaso para colapsarse, edema interlobular ligero, y áreas lineales bronceadas-grises de atelectasis que i- involucraban multifocalmente del 20 a 40 por ciento del pulmón. El examen microscópico de los pulmones a los 7 DDI, reveló una neumonía intersticial parchada caracterizada por proliferación de neumocitos tipo II, acumulación de células inflamatorias mixtas y desecho celular necrótico en la lúmina alveolar, e infiltración de macrófagos y linfocitos en la septa alveolar. La lúmina alveolar contuvo fluido proteináceo.

Ocasionalmente, se vieron células de forma sincitial adentro de la lúmina alveolar y a lo largo de la septa. fr fr La Figura 5 muestra una sección histológica a partir del pulmón de un cerdo convencional 10 DDI, utilizando mancha de hematoxilina-eosina. Hubo una extensa proliferación de neumocito tipo II (flecha) y desecho celular necrótico en los espacios alveolares (puntas de flecha) . La condición y la apariencia de las lesiones observadas en el día 10, fueron similares a las observadas en el día 7. La Figura 6 muestra una segunda sección histológica fr a partir del pulmón de un cerdo convencional, 10 DDI, utilizando mancha de hematoxilina-eosina. Las células en forma sincitial (flechas) están presentes en los espacios alveolares. Se observa una proliferación de neumocitos tipo II pronunciada, y más sincitios, en el día 10 que en el día 7. Las lesiones todavía estaban moderadamente severas a los 15 DDI, y no obstante, los cerdos parecían clínicamente normales. No se aislaron bacterias ni micoplasmas de los * pulmones. Los intentos de aislamiento del virus para VEMC, VSR, CVRP, adenovirus, y VIC, fueron negativos. El examen de inmunofluorescencia de las secciones congeladas del pulmón, n demostró antígenos de VSRB, virus PI-3, VSR, VIC, VGET, o Mycoplasma hiopneumoniae. No se vieron lesiones gruesas o microscópicas en los cerdos de control.

(C) Estudio de Cerdo Gnotobiótico M-. Todos los cerdos principales inoculados estaban fr experimentando severas insuficiencias respiratorias y "agitación" para los 5 DDI. Las temperaturas eran de 40.5°C o mayores, y ios cerdos estaban anoréxicos y letárgicos. Los cerdos mejoraron clínicamente para los 8 DDI, y parecieron clínicamente normales para los 15 DDI. No murieron cerdos. Los cerdos de control inoculados con el filtrado del homogenato de pulmón normal, permanecieron clínicamente normales. 'Z /*= Las lesiones macroscópicas para los 5 DDI, se ? caracterizaron por un pulmón que fracasaba para colapsarse, atelectasis bronceada-roja multifocal ligera, y edema interlobular ligero. Microscópicamente, hubo una neumonía intersticial difusa ligera con áreas multifocales de infiltración celular mononuclear de los septos alveolares, y proliferación de neumocitos de tipo II moderada. Hubo una acumulación de células inflamatorias, desecho celular necrótico, y fluido proteináceo en la lümina alveolar. No se vieron lesiones en otros órganos. Para los 9 DDI, el pulmón fracasó para colapsarse, tuvo un edema interlobular moderado, y áreas de 1 a 3 centímetros multifocales de atelectasis bronceada-roja firme. La Figura 7 muestra una sección histológica del pulmón de un cerdo gnotobiótico a los 9 DDI, utilizando mancha de hematoxilina-eosina. Hay una proliferación moderada de neumocitos tipo II (puntas de flecha) , y formación de células de configuración sincitial (flechas) . Microscópicamente, las lesiones fueron similares a las observadas en el día 5 DDI, excepto que la proliferación de neumocitos tipo II fue más pronunciada, y hubo números moderados de células de configuración sincitial a lo largo del septo alveolar y en la lúmina. El riñon tuvo tübulos renales dilatados, conteniendo algunos un exhudado linfoplasmacítico y desecho celular. Para los 28 DDI, hubo un 20 por ciento de t ^ atelectasis bilateral craneoventral, que involucró a los ¿ 'O- lóbulos apical y medio con áreas de 1 a 2 centímetros focales de atelectasis en otros lóbulos. Microscópicamente, las lesiones del pul ón fueron similares a las observadas a los 9 DDI, pero en adición, hubo una ligera acumulación linfoplasmacítica peribronquiolar y periarteriolar. Hubo infiltrados ligeros a moderados de linfocitos y células de plasma presentes multifocalmente en el plexo coroide, en las ^ meninges, en el miocardio, y en los turbinatos nasales. S> La Figura 8 muestra que para los 35 DDI, las lesiones del pulmón eran menos severas, pero la miocarditis linfoplasmacítica multifocal estaba pronunciada. Los intentos de aislamiento del virus por VSR, VIC, adenovirus, VEMC, VEH, PVP, enterovirus, y CVRP, no tuvieron éxito. Se observó un efecto citopático en los macrófagos alveolares porcinos, caracterizado por un redondeo celular, lisis, y muerte celular. En la Figura 9 se muestran los cultivos del lavado ^^ ^k bronquio-alveolar directos que exhiben extensos sincitios, los cuales no se observaron en cultivos similares preparados a partir de cerdos de control. Los exámenes de estos cultivos mediante microscopía de electrones inmune de manchado negativo, revelaron dos tipos de partículas en forma de virus. Un tipo, mostrado en la Figura 10, fue de aproximadamente 70 nanómetros de diámetro, estaba envuelto, y tenía espículos superficiales cortos. El otro tipo, mostrado en la Figura 11, estaba envuelto, era pleomórfico, de aproximadamente 80 x 320 nanómetros, y estaba recubierto con anticuerpos. No se aislaron bacterias del pulmón, del hígado, del bazo, o del cerebro. El suero recolectado a los 28 y a los 35 DDI, no i tuvo ninguna titulación de anticuerpos para los virus de VCI, VEMC, VSR, VGET, VSRB, VEH, O PI-3. Estos sueros fueron positivos (1:1280) para el anticuerpo para el virus de SRRP. Los cerdos de control permanecieron normales a ^k fr través de todo el estudio, y no tuvieron lesiones gruesas ni microscópicas en ningún tejido. No se aislaron bacterias ni virus a partir de los cerdos de control. - (III) DISCUSIÓN Los filtrados de pulmón de cerdos con neumonía endémica que se presenta naturalmente, produjeron lesiones del pulmón y del corazón en los cerdos gnotobióticos y convencionales experimentalmente inoculados. Las lesiones observadas tanto en la enfermedad natural como experimental, fueron consistentes con una etiología viral. No se aislaron patógenos respiratorios virales de cerdo previamente identificados. Se observó un efecto citopático, caracterizado por lisis celular de los cultivos de macrófagos alveolares porcinos primarios, consistente con el reporte de las infecciones de virus de SRRP por Yoon y colaboradores (Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, volumen 4, (1992), página 139). Sin embargo, los grandes sincitios en los cultivos dé lavado bronquio-alveolar directos vistos en este estudio, no se han reportado anteriormente con SRRP. La microscopía de electrones del cultivo celular infectado, muestra dos partículas en forma de virus. Una partícula en forma de virus envuelta de 70 nanómetros con cortos espícuíos superficiales, parece ser compatible con el virus de SRRP, como se reporta por Benfield y colaboradores, (Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, volumen 4, (1992) , página 117) , pero la otra partícula en forma de virus parece ser distinta. Ninguno de los cerdos desarrollaron titulaciones de anticuerpos para VIC, VSR, VGET (CVRP) , o VEMC. Sin embargo, los cerdos gnotobióticos sí seroconvierten al virus de SRRP.

La enfermedad clínica reproducida en el experimento |L j fc i se caracteriza por una insuficiencia respiratoria moderada a severa en todos los cerdos gnotobióticos inoculados y convencionales dentro de 5 DDI. La enfermedad en este experimento es más severa que la observada en los experimentos anteriores (Coolins y colaboradores, y Yoon y colaboradores, supra) . La necrosis epitelial de las vías aéreas terminales y la proliferación, descrita para la variante de VIC tipo A # '4=k " recientemente identificada (aVIC o una enfermedad relacionada r-^ con la misma, supra) por Morin y colaboradores (Canadian Veterinary Journal, volumen 31 (1990), página 837), no se observó en el experimento I. Los depósitos de fibrina y las membranas de hialina a lo largo del septo alveolar, asociadas con aVIC (Morin y colaboradores, y Girard y colaboradores, supra) no se observaron. La miocarditis no supurante severa observada en los cerdos que vivieron más allá de 15 DDI en el experimento I, no está asociada con aVIC (Morin y ^R fr colaboradores . y Girard y colaboradores, supra) . Los cerdos no seroconvirtieron en VIC, y no se detectó nada de VIC mediante el paso a huevos de pollo embrionados. La lesión del pulmón predominante vista en los brotes de SRRP, y las inoculaciones experimentales, es una notable infiltración intersticial con células mononucleares (Collins y colaboradores. Pol y colaboradores, supra) . La proliferación de neumocitos tipo II, la formación de células sincitiales, y la miocarditis observadas en los cerdos infectados del experimento I, no han sido observadas por otros. Las lesiones consistentemente reproducidas con el agente infeccioso filtrable del experimento I, sugieren que la enfermedad descrita en este estudio, a la que designamos la cepa de Iowa de VSRRP, es causada por un agente viral único, o por una combinación de un virus de SRRP con otro agente infeccioso.

EXPERIMENTO II (I) MATERIALES Y MÉTODOS (A) Material e Historia del Caso de Campo Se obtuvo un cerdo de un rebaño que experimentó SRRP con una severa neumonía de la cría persistente, y que tenía solamente 20 cerdos viables de las últimas 42 camadas paridas. Se hizo la necropsia del cerdo, y se recolectaron las muestras del tejido del pulmón y se homogeneizaron utilizando técnicas de homogeneización estéril estándar. El homogenato del pulmón (10 por ciento en peso/volumen) preparado en medio esencial mínimo (MEM) de Eagle, y filtrado a través de un filtro de 0.22 mieras, se utilizó como el inoculo.

(B) Células Se derivó una línea celular continua, designada como w PSP-36, a partir de células MA-104, las cuales se adquirieron en Whittaker Bioproducts Inc. (Walkersville, Maryland) . Se propagaron por separado una muestra de células PSP-36, y esta línea celular se designó como PSP-36-SAH. Se utilizaron macrófagos alveolares de cerdo y aproximadamente otras 90 líneas celulares, cuyos ejemplos se describen en la siguiente Tabla II, para el aislamiento del virus. fr TABLA II fr fr fr (C) Aislamiento del Virus Los homogenatos de pulmón preparados como se describió anteriormente, se aclararon bien sea en 2,000 x g, o en 3 000 rpm a 4°C durante 15 minutos. Los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0.22 mieras. Los filtrados se inocularon sobre cada una de las líneas celulares descritas en la sección (B) anterior. Los cultivos se mantuvieron fr fr entonces en medios apropiados con del 0 al 4 por ciento de suero de bovino fetal (SBF) y antibióticos. Las líneas celulares se supervisaron diariamente por los efectos citopáticos (ECP) . Si los ECP no se observaban dentro de 8 ó 9 días, los cultivos se pasaban ciegamente de 2 a 3 veces. Si se observaban ECP sospechosos, los cultivos se examinaban en un ensayo de inmunofluorescencia indirecto (EIF) utilizando antisuero de cerdo convalesciente para ISU-12. (D) Titulación del Virus Se prepararon diluciones en serie de 10 veces del aislado de ISU-12 en medio esencial mínimo de Dulbecco (MEMD) con el 2 por ciento de SBF y 1 x antibióticos. Cada dilución (0.2 mililitros) se inoculó por duplicado sobre cada pozo de células PSP-36, y los cultivos de macrófagos alveolares de cerdos se sembraron en cámaras Lab-Tek. A los 3 días después de la infección (DDI) , las cámaras se fijaron con una solución fría del 80 por ciento de acetona y 20 por ciento de metanol a 4°C durante 15 minutos. Luego las cámaras se mancharon en un EIF utilizando antisuero de ISU-12 convalesciente, y suero contra virus de SRRP.

(E) Ensayo de Inmunofluorescencia Indirecto (EIF) Las células PSP-36 y los cultivos de macrófagos alveolares de cerdos, se infectaron con el aislado de ISU-12.

A las 20 y 48 horas después de la infección, los cultivos se fijaron con una solución fría del 80 por ciento de acetona y r el 20 por ciento de metanol a 4°C durante 15 minutos. El EIF se llevó a cabo utilizando suero convalesciente ISU-12, suero contra VSRRP, y anticuerpo monoclonal contra VSRRP adquirido en la South Dakota State University, Brookings, Dakota del Sur. Las células PSP-36 no infectadas, y los cultivos de fr macrófagos, se utilizaron como controles.

(F) Ensayo dé Radioinmunoprecipitación (RIP) Las células aisladas de ISU-12 y de PSP-36 infectadas falsamente, se etiquetaron con 35S-metionina y 35S- cisteína. Las células PSP-36 de 3 días de edad en matraces de 25 centímetros cúbicos, se infectaron con 0.05 mililitros de 104 TCID50 de virus ISU-12. A las 24 horas después de la infección, el medio fue reemplazado con MEMD deficiente en metionina y deficiente en cisteína, y los cultivos se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Entonces el medio fue reemplazado con MEMD deficiente en metionina y deficiente en cisteína fresco, con 100 µci/ l de la 35S-metionina y 35S- cisteína (35cis) . 5 horas después de la adición de 35Met y 35cis, las células se lavaron tres veces con suero regulado 11 con fosfato frío (SRF) , con un pH de 7.2, luego se rasparon de los matraces, y se granularon mediante centrifugación a 1,000 x g durante 410 minutos. Los granulos de células que contenían las proteínas virales etiquetas, y los granulos de células infectadas falsamente, se alteraron entonces con regulador de lisis, y los residuos celulares se aclararon mediante centrifugación de conformidad con el procedimiento de Zhu y colaboradores (Am. J.Vet. Res., 51:232-238 (1990)). Entonces los lisatos se incubaron con suero convalesciente de ISU-12 y suero contra virus de SRRP, se preabsorbieron con lisatos fr celulares PSP-36 normales fríos a 4°C durante la noche. Los complejos inmunes se recolectaron mediante la adición de granulos de cefarosa-proteína A (obtenidos en Sigma Chemical Co. , St. Luois, Missouri) durante 2 horas a la temperatura. La mezcla de granulos de cefarosa-proteína A y de complejo inmune, se lavó entonces con regulador de lisis, y tres veces con agua destilada. La mezcla se volvió a suspender en 50 microlitros de regulador de muestra, y se ejecutó sobre un gel SDS-PAGE como es descrito por Zhu y colaboradores, supra.

(G) Microscopía de Electrones (ME) Las células PSP-36 se infectaron con virus ISU-12 en un matraz de 25 centímetros cuadrados. A las 48 horas después de la infección, las células infectadas se fijaron con el 3 por ciento de glutaraldehído (pH de 7.2) a 4°C durante 2 horas. Luego las células se rasparon del matraz y se 4^' ^ granularon mediante centrifugación. Los granulos celulares se procesaron y se empotraron en plástico. Los granulos celulares empotrados en plástico se seccionaron delgados, se mancharon, y luego se visualizaron bajo un microscopio de electrones de transmisión, como es descrito por Paul y colaboradores (Am. J. Vet. Res., 38:311-315 (1976)).

(II) REPRODUCCIÓN EXPERIMENTAL DE LA ENFERMEDAD 9^' ^V REPRODUCTORA Y RESPIRATORIA PORCINA (A) Experimento 92.1 LPE El filtrado de pulmón del ISU-12 anterior, se inoculó intranasalmente en 6 cerdos libres de patógeno específico (LPE) que tenían 5 semanas de edad. Los cerdos se sacrificaron a los 3, 5, 10, 28, y 43 días después de la inoculación (DDI) . frá (B) Experimento 92.3 LPE Seis cerdos de cría cruzada LPE, se inocularon intranasalmente a las 5 semanas de edad, con un material de macrófago alveolar porcino infectado con filtrado de pulmón ISU-12. Los cerdos inoculados con ISU-12 pasaron por necropsia a los 10 y a los 28 DDI.

(C) Experimento 92.10 LPE fr Tres cerdos de 5 semanas de edad, se inocularon intranasalmente con 3 mililitros de ISU-12 propagado sobre PSP-36, conteniendo 105 TCID50/ml de virus. Dos cerdos sirvieron como controles no inoculados. Un cerdo principal pasó por necropsia a los 5, 10, y 28 DDI . Un cerdo de control pasó por necropsia en cada uno de 5 y 10 DDI .

(D) Experimento 92.12 LPE fr Veintidós cerdos de 5 semanas de edad se dividieron en seis grupos. En el grupo I, 6 cerdos (principales) se inocularon intranasalmente con 3 mililitros de ISU-12 purificado de placas (placa no. 1) , propagado sobre PSP-36 conteniendo 105 TCID50/ml del virus. En el grupo TI, 6 cerdos se inocularon con el medio de cultivo celular de control. En cada uno del grupo III (placa no. 2) y el grupo IV (placa no. 3) , 2 cerdos se inocularon con ISU-12 purificado de placas. En fr el grupo V, 3 cerdos se inocularon con ISU-12, el cual no estaba purificado de placas. En el grupo VI, 3 cerdos se inocularon con el filtrado de tejido de ISU-12. Dos cerdos principales y 2 cerdos de control pasaron necropsia de cada uno de los grupos I y II en cada uno de los 5, 10, y 25 DDI . Dos cerdos se inocularon con las placas No. 2 y no. 3, y se pasaron por necropsia a los 10 DDI. Un cerdo de cada uno de los grupos V y VI, pasó por necropsia en cada uno de los 5 , 10 , y 25 DDI . fr (E) Examen Microscópico Se recolectaron el pulmón, el cerebro, el corazón, y el bazo en la necropsia, se fijaron con formalina regulada neutra al 10 por ciento, se empotraron en parafina, y se mancharon con hematoxilina y eosina.

(III) RESULTADOS fr fr (A) cultivo del Virus (1) Cultivo del Aislado I8U-12 en Cultivos de Macrófagos Alveolares de Cerdos Se observó un efecto citopático (ECP) en los cultivos de macrófagos alveolares de cerdos infectados con filtrado de pulmón ISU-12 empezando a los 2-3 DDI . El ECP se caracterizó por una formación de grumos de los macrófagos y lisis celular. Aproximadamente el 90 por ciento de los cultivos de macrófagos en los cultivos infectados con ISU-12 mostraron un ECP para los 4-5 DDI. La Figura 12 (A) muestra que no se observó ningún ECP en los cultivos de macrófagos no infectados. La titulación del virus ISU-12 en los cultivos de macrófagos en el tercer paso, fue de 144105 TCID50/ml.

Se detectaron antígenos virales mediante EIF en el fr citoplasma de cultivos de macrófagos alveolares de cerdos infectados con ISU-12, utilizando suero convaleciente de ISU-12 a partir de cerdos gnotobióticos, como se muestra en la Figura 12 (C). No se detectó ninguna inmunofluorescencia en los cultivos de macrófagos no inoculados. (2) Cultivo del Aislado de ISU-12 sobre Líneas Celulares Continuas De las aproximadamente 90 líneas celulares probadas fr fr (ver la Sección (B) de "Materiales y Métodos" anterior) , se notó una evidencia de la réplica viral en seis líneas celulares, notablemente PSP-36-SAH, MA-104, células sinoviales, células macrófagas alveolares y células de turbinato porcino. La Figura 13 (B) muestra que el ECP se inició a los 2 DDI, y se caracterizó por la degeneración, el redondeo de las células, y la acumulación de células. A los 3-4 DDI, el número se incrementó el número de acumulaciones de células redondeadas, y se fundieron algunas acumulaciones. Muchas células redondeadas se separaron de la monocapa celular, y condujeron a la desintegración subsecuente de la monocapa. Después de 5 DDI, el ECP llegó a ser muy extenso, e involucró más del 95 por ciento de la monocapa típicamente. No se observó ningún ECP en las células PSP-36 de control, como se muestra en la Figura 13 (A) . El aislado de ISU-12 creció hasta altas titulaciones sobre células PSP-36, aproximadamente 106-107 fr TCID50/ml, en el lld paso del cultivo celular. Se detectaron antígenos virales en el citoplasma de las células infectadas con sueros convalecientes a partir de cerdos gnotobióticos experimentalmente inoculados con filtrado de pulmón ISU-12 (ver la Figura 14 (B) ) . No se observó ninguna fluorescencia en las células PSP-36 de control (Figura 1 (A) ) .

(III) CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS (A) Relación Antigénica del ISU-12 con el Virus de SRRP El anticuerpo monoclonal para el aislado VR-2332 del virus de SRRP (adquirido de Dr. Benfield, Universidad del Estado de Dakota del Sur, Brookings, Dakota del Sur) , y los sueros contra VSRRP (obtenidos del USDA National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa) , reaccionaron con células PSP-36 infectadas con ISU-12, y fueron evidenciados por una brillante fluorescencia citoplásmica durante el EIF (ver la » Figura 14 (C), pero no reaccionaron con las células PSP-36 no infectadas.

(B) Proteínas Virales Se utilizaron sueros convalecientes contra ISU-12 y sueros contra virus de SRRP para analizar las proteínas virales. Ambos sueros reconocieron cuando menos 4 proteínas, que tenían respectivamente pesos moleculares de 19, 24, 32 y 61 kD (Figura 15) . En la Figura 15, las células infectadas falsamente (pistas 2 y 3) , ó las células infectadas con ISU-12 fr "fr (pistas 4 a 7) se inmunoprecipitaron con el suero contra ISU-12 (pistas 2 y 5) , suero contra VSRRP (pistas 3 y 4) , anticuerpo monoclonal contra VSRRP (pista 6) , ó suero de conejo contra VSRRP (obtenido de Dr. Benfield, Universidad del Estado de Dakota del Sur, Brookings, Dakota del Sur) . Las pistas 1 y 8 tienen marcadores de peso. Estas proteínas no fueron evidentes en las células PSP-36 infectadas falsamente. fr fr (C) Estructura Viral Se observaron partículas de virus típicas de 55 a 85 nanómetros en las células PSP-36 infectadas con ISU-12. Las partículas del virus eran envueltas, esféricas, y estaban presentes en las vesículas citoplásmicas de las células PSP-36 infectadas con ISU-12.

(IV) REPRODUCCIÓN EXPERIMENTAL DE LA ENFERMEDAD fr (A) Experimento 92.1 LPE El filtrado de pulmón a partir de ISU-12 anterior, se inoculó intranasalmente en seis cerdos libres de patógenos específicos (LPE) que tenían 5 semanas de edad. Los cerdos se sacrificaron a los 3, 5, 10, 28 y 43 días después de la inoculación (DDI) . Para los 3 DDI , los cerdos de ISU-12 habían exhibido una severa insuficiencia respiratoria y pirexia. Estos signos persistieron durante 10 a 14 días. Las lesiones .r pulmonares gruesas se caracterizaron por una severa consolidación gris-bronceada multifocal del 60 por ciento de los pulmones. También hubo una cardiomegalia moderada y acumulación del fluido abdominal. Los cambios microscópicos se caracterizaron por una severa neumonía intersticial proliferativa con la proliferación de neumocitos de tipo II, formación de células sincitiales, exudación alveolar, y espesamiento intersticial ligero con las células mononucleares. Hubo una miocarditis no supurativa ligera, una severa fr fr encefalitis, y una nefritis linf plasmacítica moderada. Los cerdos experimentales de ISU-12 pasaron por la necropsia a los 10 y 28 días, y se habían seroconvertido al agente de SRRP, como fue confirmado mediante NVSL. (B) Experimento 92.3 LPE Todos los cerdos LPE inoculados con ISU-12, exhibieron una severa enfermedad respiratoria dentro de 3 días, persistiendo por más de 14 días. Las lesiones gruesas se fr caracterizaron por congestión pulmonar, edema y hepatización difusa multifocal marcada. Microscópicamente, se observó una severa neumonía intersticial proliferativa, nefritis moderada, miocarditis moderada, y encefalitis ligera. Los cerdos inoculados con ISU-12 pasaron por necropsia a los 10 y 28 DDI, y habían seroconvertido en SRRP como fue confirmado mediante NVSL.

(C) Experimento 92.10 LPE Los signos clínicos de cerdos inoculados incluyeron severa letargía y pirexia, anorexia moderada, e insuficiencia respiratoria moderada a severa, que se observaron de 5 a 22 DDI. Estuvo presente un lagrimeo moderado en estos cerdos a través de todo el experimento. Las lesiones microscópicas incluyeron neumonía intersticial proliferativa ligera y amigdalitis necropurulenta severa a los 5 DDI. A los 10 DDI se observó una NIP multifocal moderada con proliferación de tipo II, exudación alveolar, células gigantes multinucleadas, y fr fr formación de células sincitiales. También se observó una encefalitis multifocal moderada con puños y gliosis perivasculares a los 10 DDI . Se detectó hepatitis linfo acrofágica periportal ligera, miocarditis no supurativa ligera, y rinitis a los 10 DDI . A los 26 DDI , hubo una neumonía intersticial severa, caracterizada por un marcado espesamiento intersticial multifocal con las células mononucleares, una # proliferación moderada de neumocitos tipo II multifocal, fr cantidades moderadas de exudado alveolar mixto, y puños peribronquioleares flojos de linfocitos y macrófagos. También hubo una miocarditis multifocal moderada, una hepatitis ligera, y una nefritis ligera, y amigdalitis. Los dos cerdos inoculados con ISU-12 seroconviertieron en SRRP a los 10 DDI . Los cerdos de control siguieron siendo clínicamente normales durante la duración del experimento, y no exhibieron lesiones gruesas ni microscópicas. También siguieron siendo seronegativos para SRRP.

(D) Experimento 92.12 LPE El ISU-12 biológicamente no clonado, fue patogénico para los cerdos LPE, y produjo neumonía intersticial, miocarditis y encefalitis, como se describió anteriormente para el Experimento 92.10 LPE. Los cerdos inoculados con los tres clones biológicos de ISU-12 (placas Nos. 1, 2 y 3) produjeron neumonía intersticial ligera, pero no se detectó evidencia de proliferación de neumocitos de tipo II, exudación alveolar, miocarditis y/ó encefalitis en estos cerdos. Todos los cerdos inoculados con ISU-12, bien sea clonados ó no clonados, seroconvirtieron en SRRP a los 10 DDI. Los cerdos de control permanecieron libres de infección de virus y de enfermedad.

(V) R E S U M E N ^^ Se reprodujo experimentalmente una neumonía severa en fr cerdos LPE de 5 semanas de edad con filtrados de pulmón y de corazón (0.22 mieras) a partir de cerdos naturalmente afectados (ISU-12) . La neumonía producida por la cepa de Iowa de VSRRP (ISU-12) se caracteriza por neumonía intersticial, proliferación de neumocitos tipo II, y formación de células sincitiales. Se observó miocarditis y encefalitis en los cerdos afectados. El ISU-12 produjo efectos citopáticos (ECP) en los cultivos de macrófagos alveolares de cerdos, y una línea fr celular continua, PSP-36. Se detectaron antígenos virales mediante inmunofluorescencia indirecta en los cultivos infectados con ISU-12, pero no en las células no infectadas. El ISU-12 está antigénicamente relacionado con el virus de SRRP, cepa VR-2332, mediante inmunofluorescencia indirecta, utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales. Sin embargo, se observaron diferencias en las lesiones microscópicas de los cerdos infectados con ISU-12 no purificado de placas, indicando de esta manera gue puede cultivarse otro virus ó agente infeccioso en PSP-36, y que el otro virus ó agente infeccioso puede ser la razón de que la enfermedad y las lesiones causadas por la cepa de Iowa de VSRRP sean diferentes de, y más severas que, las reportadas para el virus de SRRP en la literatura. Todos los cerdos inoculados con ISU-12, bien sea clonado ó no clonado, seroconvirtieiron en SRRP a los 10 DDI . Los cerdos de control permanecieron libres de la infección del virus y de la enfermedad.

EXPERIMENTO III CLONACIÓN MOLECULAR Y SECUENCIAMIENTO DE NUCLEOTIDO DE LA REGIÓN 3 ' -TERMINAL DEL AGENTE INFECCIOSO ASOCIADO CON LA CEPA DE IOWA DEL SÍNDROME RESPIRATORIO Y REPRODUCTO PORCINO (I) Materiales y Métodos (A) Propagación y Purificación del Virus Posteriormente en la presente, para simplificar la discusión, los términos "virus" y "viral", se referirán a un virus ó a agente infeccioso en el significado descrito anteriormente para la presente solicitud, ó á una propiedad del virus ó del agente infeccioso. Se utilizó una línea celular continua, PSP-36, para aislar y propagar el aislado de ISU-12, asociado con la cepa de Iowa de VSRRP. El virus de ISU-12 se purificó de placas tres fr fr veces sobre células PSP-36. Entonces las células PSP-36 se infectaron con el virus purificado de placas. Cuando más del 70 por ciento de las células infectadas mostraron cambios citopáticos, el cultivo se congeló y descongeló tres veces. Luego el medio de cultivo se aclaró mediante centrifugación de baja velocidad a 5,000 X g durante 15 minutos a 4°C. Entonces el virus se precipitó con el 7 por ciento de PEG-8000 y el 2.3 por ciento de NaCl a 4°C durante la noche con agitación, y el precipitado se granuló mediante centrifugación. Luego los granulos del virus se volvieron a suspender en 2 mililitros de regulador tris-EDTA, y se pusieron en capas sobre la parte superior de un gradiente de CsCl (1.12245-1.2858 gramos/mililitro). Después de la ultracentrifugación a 28,000 rpm durante aproximadamente 8 horas a 20°C, se observó y se cosechó una banda clara con una densidad de 1.15-1.18 gramos/mililitro. La titulación de infectividad de esta banda frfe se determinó mediante EIF, y se descubrió gue la titulación fue de 10 TCID50/ml. Las partículas de virus típicas también se observaron mediante necroscopia de electrones de mancha negativa (ME) .

(B) Aislamiento del ARN Viral El ARN total se aisló de la banda que contenía al virus en el gradiente de CsCl, con un estuche de aislamiento de ARN comercialmente disponible (obtenido en Stratagene) .

W f Entonces el Poli (A) ARN se enriqueció mediante cromatografía de columna de (dT) -celulosa de conformidad con el procedimiento descrito por el fabricante de la columna (Invitrogen) .

(C) Construcción de la Biblioteca del cADN ? de ISU-12 En la Figura 16 se muestra un procedimiento esguemático general para la construcción de una biblioteca cADN ?. La síntesis del primer cordón de cADN a partir de mARN * fr se condujo mediante transcripción inversa utilizando un preparador de oligo (dT) que tenía un sitio de restricción Xho I. La mezcla de nucleótido contuvo dATP, dGTP, dTTP normales, y el dCTP de 5-metilo análogo, el cual protege al cADN de las enzimas de restricción utilizadas en las siguientes etapas de clonación. La síntesis del segundo cordón del cADN se condujo entonces con ARNsa H y polimerasa de ADN I. Los términos de cADN se hicieron romos (extremos romos) con polimerasa de ADN T4 , se ligaron con adaptadores EcoR I con ligasa de ADN T4 , y subsecuentemente se quinasaron (es decir, se fosforilaron) con quinasa de polinucleótido T4. El cADN se digirió con Xho I, y el cADN digerido se seleccionó en su tamaño sobre un gel de agarosa. El cADN digerido mayor de un tamaño de 1 kb, se seleccionó y se purificó mediante un estuche de purificación de ADN comercialmente disponible (GENECLEAN, disponible en BIO 4# 101, Inc., La Jolla, California). Entonces el cADN purificado se ligó en brazos de vector de fago lambda, se diseño con extremos cohesivos Xho I y EcoR I. El vector ligado se empacó en fagos lambda infecciosos con extractos lambda. La cepa SURE (disponible en Stratagene) de células de E . Colli , se utilizó para la transfección, y luego la biblioteca lambda se amplificó y se tituló en la cepa de células azules L-l. ^^ fr (D) Clasificación de la Biblioteca ? Mediante Hibridización Diferencial En la Figura 17 se muestra un procedimiento esquemático general para identificar los clones auténticos de la cepa de PIP del virus ISU-12, mediante hibridización diferencial, y se describe más adelante en la presente. La biblioteca ? se cubrió sobre células azules XL-1, se levantaron las placas sobre membranas de nylon en duplicados, y se desnaturalizaron con 0.5 N de NaOH mediante una metodología convencional. Los ARN mensajeros tanto de las células PSP-36 infectadas con virus, como de las células PSP-36 no infectadas, se aislaron mediante cromatografia de columna de oligo (dT) celulosa, como fue descrito por el fabricante de la columna (Invitrogen) . Se sintetizaron sondas de ADN complementario a partir del mARN aislado de las células PSP-36 infectadas con virus y de las células PSP-36 normales, utilizando preparadores aleatorios en la presencia de 32P-dCTP de conformidad con el procedimiento descrito por el fabricante (Amersham) . Entonces se purificaron individualmente dos sondas (la primera sintetizada a partir de las células PSP-36 infectadas con virus, la otra a partir de células PSP-36 no infectadas, normales), mediante cromatografía de columna Sephadex G-50. Las sondas se hibridizaron con las membranas de nylon duplicadas, respectivamente, a 42 °C, en el 50 por ciento de formamida. Se fr aislaron las placas que se hibridizaron con la sonda preparada a partir de células infectadas con virus, pero no con la sonda preparada a partir de células normales. Los fagémidos que contenían insertos de cADN viral se rescataron mediante separación in vitro con ayuda del fago auxiliar G408. Los fagémidos rescatados se amplificaron entonces sobre células azules XL-1. Los plásmidos que contenían insertos de cADN viral se aislaron mediante cromatografía de columna Qiagen, y subsecuentemente se secuenciaron. fr \ (E) Secuenciamiento del Nucleótido y Análisis de Secuencia Los plásmidos que contenían insertos de cADN viral se purificaron mediante cromatografía de columna Qiagen, y se secuenciaron mediante el método de didesoxi de Sanger con preparadores universales e inversos, así como una variedad de fr fr preparadores de oligonucleótidos internos. Las secuencias se obtuvieron a partir de cuando menos tres clones separados. Los clones ó regiones adicionales se secuenciaron cuando se obtuvieron los datos de secuencia ambiguos. Los datos de secuencia del nucleótido se ensamblaron y se analizaron de una manera independiente, utilizando dos programas de software de computación GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc. , Mountain View, California) y MACVECTOR (International Biotechnologies, Inc., New Haven, Connecticut) .

(F) Preparadores de Oligonusleótido Los oligonucleótidos se sintetizaron como ADN de un solo cordón utilizando un sintetizador de ADN automatizado (Applied Biosystems) y se purificaron mediante HPLC. Se sintetizaron los oligonucleótidos PP284 (5 ' -CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT-3»; No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1) y PP285 (5 ' -CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG-3 * : No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2) para la amplificación de PCR. Se generó una sonda de ADN con estos dos preparadores a partir del extremo 3 ' del genoma viral para el análisis de mancha Northern (ver la discusión más adelante) . Se sintetizaron los oligonucleótidos PP286 ( 5 • -GCCGCGGAAC CATCAAGCAC-3 ' -; No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3) y PP287 (5 ' -CAACTTGACG CTATGTGAGC-3 » ; No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4) para la amplificación de PCR. Se utilizó una sonda de ADN generada por estos dos preparadores para clasificar adicionalmente la biblioteca ?. Se utilizaron los oligonusleótidos PP288 (5 • -GCGGTCTGG? TTGACGACAG-3 • ; No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5), 00289 (5 ' -GACTGCTAGG GCTTCTGCAC-3 ' ; No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6), PP386 (5 * -GCCATTCAGC TCACATAGCG-3 ' ; No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7), PP286 y PP287, como los preparadores de secuenciamiento para obtener secuencias internas.

(G) Análisis de Mancha Northen Un fragmento de ADN específico desde el extremo 3 ' del clon de cADN de ISU-12 se amplificó mediante PCR con los preparadores PP284 y PP285. El fragmento de ADN se separó de un gel de agarosa con un estuche de purificación de ADN comercialmente disponible (GENECLEAN, obtenido de Bio 101) , y se etiquetó con 32P-dCTP mediante extensión del preparador al azar (utilizando un estuche disponible en Amersham) . El ARN total se aisló a partir de células PSP-36 infectadas con ISU-12 '<j^- a ías 36 horas después de la infección, utilizando un estuche comercialmente disponible para el aislamiento del ARN total de conformidad con el procedimiento descrito por el fabricante (Stratagene) . Las especies de mARN subgenómicas de ISU-12 se desnaturalizaron con 6 M de glioxal y DMSO, y se separaron sobre un gel de agarosa al 1 por ciento. (Los resultados de un procedimiento similar que sustituye un gel de agarosa al 1.5 por ciento, se describen en Experimento VIII más adelante, y se muestran en la Figura 32) . Los mARN subgenómicos separados se transfirieron entonces sobre membranas de nylon utilizando un manchador de presión POSIBLOTMR (Stratagene) . La hibridización se llevó a cabo en un horno de hibridización con botellas de rodillos a 42 °C y con el 50 por ciento de formamida.

R E S U L T A D O S (A) Clonación, Identificación y Secuenciamiento del Genoma 3' -Terminal de ISU-12 Se construyó una biblioteca ? de cADN preparada con oligo (dT) a partir de un virus parcialmente purificado, obtenido a partir de células PSP-36 infectadas con ISU-12. Se encontraron problemas en la clasificación de la biblioteca ? de cADN con sondas basadas en la secuencia de virus Lelystad. Se prepararon tres series de preparadores. La primera serie (PP105 y PP106; Nos. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 18-19) corresponde a las posiciones 14577 a 14596, y 14977 a 14995 de w - fflr la secuencia genómica Lelystad, localizada en la región del gen de nucleocápsido. La segunda serie (PP106 y PP107, Nos. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 19-20) corresponde a las posiciones 14977 a 14995, y 14054 a 14072 de la secuencia genómica Lelystad, flanqueando a los MLA 6 y 7. La tercera serie (PM541 y PM542; Nos. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 21-22) corresponde a las posiciones 11718 a 11737, y 11394 a 114Í3 de la secuencia genómica Lelystad, localizada en la W ? región del MLA-lb. PP105: 5 ' -CTCGTCAAGT ATGGCCGGT-3 ' (No. DE ID. DE SEC: 18) PP106: 5 • -GCCATTCGCC TGACTGTCA-3 • (No. DE ID. DE SEC: 19) PP107: 5 ' -TTGACGAGGA CTTCGGCTG-3 ' (No. DE ID. DE SEC: 20) PM541: 5 ' -GCTCTACCTG CAATTCTGTG-3 ' (No. DE ID. DE SEC: 21) PM542: 5'GTGTATAGGA CCGGCAACCG-3 ' (No. DE ID. DE SEC: 22) Todos los intentos por generar sondas mediante PCR a partir del agente infeccioso ISU-12 utilizando estas tres ^- ffT series de preparadores, no tuvieron éxito. Sin embargo, después de varios intentos utilizando la técnica de hibridización diferencial, se aislaron las placas auténticas que representan el cADN específico de ISU-12, utilizando las sondas preparadas a partir de células PSP-36 infectadas con ISU-12, y células PSP-36 normales. Los procedimientos involucrados en la hibridización diferencial se describen y se estipulan en la Figura 17.

Se identificaron inicialmente tres placas positivas fr (? -4, ?-75 y ?-91) . Se rescataron los fagémidos que contenían insertos de cADN viral dentro del fago ?, mediante separación in vitro , con ayuda de los fagos auxiliares G408. Los insertos de los clones positivos se analizaron mediante digestión de enzima de restricción y secuenciamiento terminal. La especificidad de los clones de cADN se confirmó adicionalmente mediante hibridización con ARN a partir de células PSP-36 infectadas con la cepa de Iowa de VSRRP, pero con ARN a partir de células PSP-36 normales. Entonces se generó una sonda de ADN fr; # a partir del extremo 5' del clon ?-75 mediante PCR, con los preparadores PP2856 y PP287. Se identificaron otras placas positivas (?-229, ?-268, ?-275, ?-281, ?-323 y ?-345) utilizando esta sonda. Todos los clones de cADN ? utilizados para obtener las secuencias del nucleótido 3 '-terminal, se presentan en la Figura 18. Se secuenciaron cuando menos tres clones separados para eliminar cualesquiera errores. En el caso de datos de secuencia ambiguos, se utilizaron clones * fr adicionales y preparadores internos (PP288, PP289, 00286, 00287 y 00386) para determinar la secuencia. La secuencia 3' -terminal de 1938-bp (No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8) se presenta en la Figura 19, y la secuencia del aminoácidos deducida (No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 9) se presenta en la Figura 20.

(B) Una Serie Anidada de mARN Subgenómico El ARN total a partir de las células PSP-36 infectadas con virus, se separó sobre gel de agarosa del 1 por ciento de glioxal/DMSO, y se manchó sobre membranas de nylon. Se generó una sonda de cADN mediante PCR con una serie de preparadores (PP284 y PP285) que flanqueaban la región 3'- terminal del extremo del genoma viral. La sonda contiene una secuencia 3' no traslacional, y la mayor parte de la secuencia fl$ del MLA-7. Los resultados de la hibridización de mancha Northen, muestran que el patrón de la especie de mARN a partir de células PSP-36 infectadas con la cepa de Iowa de VSRRP, es muy similar a la del virus Lelystad (VL) , a la del virus de arteritis equina (VAE) , a la del virus elevador de deshidrogenasa de lactato (VDL) y a la del coronavirus, en que la réplica del virus requirió de la formación de mARN subgenómicos . Los resultados también indican que los mARB fr subgenómicos específicos de ISU-12, representan una serie 3'- anidada de mARN, debido a que la sonda de mancha Northern representa solamente la secuencia 3 '-terminal de extremo. El tamaño del ARN genómico viral del ISU-12 (14 kb) y 6 mARN subgenómicos (ARN 2 (3.0 kb), ARN 3 (2.5 kb) , ARN 4 (2.2 kb) , RN 5 (1.8 kb) , ARN 6 (1.3 kb) y ARN 7 (0.98 kb) ) se parecen a los de VL (Figura 18) , aunque hay diferencias tanto en el geno- ma como en la especie de ARN subgenómica. También se observaron diferencias en las cantidades relativas de los mARN subgenómifr fr cos, siendo el ARN 7 el mARN subgenómico más predominante.

(E) Análisis de Marcos de Lectura Abierta Codificados por el ARN Subgenómico Se han descubierto tres MLA grandes en el No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8 :MLA-5 (nt 239-901; No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 10) , MLA-6 (nt 889-1403; No. DE " ( IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA; 12) y MLA-7 (nt 1403-1771; No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 15) . El MLA-4 , localizado en el extremo 5' de la secuencia resultante, está incompleto en la secuencia 3- 'terminal de 1938-bp del No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8. Los MLA 5, 6 y 7, tienen cada uno, una capacidad de codificación de más de 100 aminoácidos. El MLA 5 y el MLA 6 se traslapan uno al otro por 10 bp, y el MLA 6 y el MLA 7 se . traslapan uno al otro por 5 bp. También se han descubierto dos ~^ Sr MLA más pequeños localizados enteramente adentro del MLA 7, que codifican solamente para 37 aa y 43 aa, respectivamente. Otros dos MLA cortos se traslapan completamente con el MLA 5. La capacidad de codificación de estos dos MLA es solamente de 29 aa y 44 aa, respectivamente. No se correlacionó ningún mARN subgenómico específico para estos MLA más pequeños mediante análisis de mancha Northern. Se cree que el MLA 6 y el MLA 7 codifican la proteína de membrana viral y la proteína de cápsido, respectivamente. fr (D) Secuencia en Consenso para la Unión Líder El análisis de secuencia muestra que un corto motivo de secuencia, AACC, puede servir como el sitio en el mARN subgenómico en donde el líder se agrega durante la transcripción (el sitio de unión) . El sitio de unión del MLA 6 se encuentra 21 bp corriente arriba desde el codón de inicio de ATG, y el sitio de unión del MLA 7 se encuentra 13 bp corriente arriba desde el codón de inicio ATG, respectivamente. No se ha identificado ninguna secuencia en consenso de AACC en el MLA 5, aunque se ha descubierto en el MLA 5 de VL. Se han descubierto secuencias de unión similares en VDL y VAE. (E) Secuencia 3' -No Traslacional y Cola de Poli (A) Se ha identificado una secuencia no traslacional de 150 nucleótidos de largo (150 nt) enseguida del codón de detención del MLA 7, en el genoma del virus de ISU-12, comparado con 114 nt en VL, 80 nt en VDL, y 59 nt en VAE. La * fr longitud de la cola de poli (A) es de cuando menos 13 nucleótidos. Hay una secuencia en consenso, CCGG/AAATT-poli (A) entre el virus PIP del ISU-12, VL y VDL, en la región adyacente a la cola de poli (A) . (F) Comparación de Secuencia de Genomas de ISU-12 y VL entre los MLA 5, 6 y 1 , y entre las Secuencias No Traslacionales En la Figura 21 se muestra una comparación de las fr fr regiones: de MLA-5 de los genomas de ISU-12 y de los virus Leíysta!; Las comparaciones correspondientes de la región de MLA-6, ia región de MLA-7, y las secuencias ho traslacionales, se muestran respectivamente en las Figuras 22, 23 y 24. Los resultados de la comparación se presentan en la Tabla III más adelante. Consistentemente con la descripción anterior, un virus se considera inmunológicamente equivalente si tiene el 90 por ciento ó más de homología con un virus «f inmunogénico. Las homologías de la secuencia de nucleótidos entre VL e ISU-12 del MLA 5, MLA 6 y MLA 7, y las secuencias no traslacionales, son del 60 por ciento, del 68 por ciento, del 60 por ciento y del 58 por ciento, respectivamente. De conformidad con lo anterior, el VL y el ISU-12 no son equivalentes inmunogénicos. El tamaño de los MLA 5 y 6 en VL es de 61 nt , y 3 nt más pequeño que los MLA 5 y 6 del ISU-12 , respectivamente. En fr contraste, el tamaño del MLA 7 en VL es 15 nt más grande que en ISU-12. También, la secuencia no traslacional 3 '-terminal es de una longitud diferente (150 nt en ISU-12, pero solamente 114 nt en VL) . Como en el VL, la secuencia de unión, AACC, también se ha identificado en el genoma de la cepa de Iowa del virus SRRP aislado de ISU-12, excepto para el MLA 5. La secuencia de unión del MLA €> en ISU-12 está 21 nt corriente arriba desde el codón de inicio de ATG, mientras que la secuencia de unión del MLA 6 íoi está 28 ht corriente arriba desde el ATG del VL. TABLA III CARACTERÍSTICAS DE LOS MLA Y DE LA SECUENCIA NO TRASLACIONAL DEL VIRUS LELYSTAD E ISU-12 ¡f * EXPERIMENTO IV . EXPRESIÓN DE LOS GENES DEL AGENTE INFECCIOSO DE LA CEPA DE XOWA EN CÉLULAS DE INSECTOS (A) Producción de Baculovirus Recombinante Las secuencias de MLA-5, MLA-6 y MLA-7 se amplificaron individualmente mediante PCR, utilizando preparadores basados en la secuencia de nucleótido genómica del ISU-12. El MLA-5 se amplificó utilizando los siguientes # § preparadores : 5 ' -GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-3 ' (No. ID. SEC: 23) 3 ' -GGGAATTCGC CAAGAGCACC TTTTGTGG-5' (No. ID. SEC: 24) El MLA-6 se amplificó utilizadno los siguientes preparadores : 5 ' -GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-3 ' (No. ID. SEC: 25) 3 • -GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5 ' (No. ID. SEC:26) El MLA-7 se amplificó utilizando los siguientes preparadores: 5 • -GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-3 ' (No. ID. SEC: 27) 3 ' -GGGAATTCAC CACGCATTC-5' (No. ID. SEC: 28) Los fragmentos de ADN amplificados se clonaron en el vector de transferencia de baculovirus pVL1393 (disponible en Invitrogen) . Un microgramo de ADN de AcMNPV de baculovirus linealizado (comercialmente disponible en Pharmingen, San Diego, California) , y 2 microgramos de construcciones de vector que contienen cADN clonado amplificado con PCR, se mezclaron con 50 microlitros de lipofectina (Gibco), - y se incubaron a 22°C durante 15 minutos, para preparar una mezcla de transfección. Una hora después de sembrar las células HI-FIVE, el medio fue reemplazado con medio de cultivo celular de insecto Excell 400 fresco (disponible en JR Scientific Co.), y la mezcla de transfección se agregó gota a gota. La mezcla resultante se incubó a 28°C durante seis horas. Después, la se removió el medio de transfeccidn, y se agregó el medio de # tf cultivo celular de insecto Excell 400 fresco. Luego, la mezcla de resultante se incubó a 28 °C. Cinco días después de la transfección, el medio de cultivo se recolectó y se aclaró. Se inocularon diluciones de diez veces de los sobrenadantes sobre células HI-FIVE, y se incubaron durante 60 minutos a la temperatura ambiente. Después de que se desechó el inoculo, se aplicó una sobrepuesta del * 1.25 por ciento de agarosa sobre las células. Se condujo una incubación a 28°C durante 4 días. Posteriormente, se seleccionaron las placas claras y se recogieron utilizando una pipeta Pasteur estéril. Cada placa se mezcló con un mililitro de medio de insecto de Grace en un tubo de tapa instantánea de 5 mililitros, y se colocó en Un refrigerador durante la noche para libera al virus de la agarosa. Los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a 2000 x g para remover la agarosa, y los sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos estétiles. Las etapas dé purificación de placas se repitieron tres veces para evitar ühá posible contaminación con virus de tipo silvestre. Los clones recombinantes puros se almacenaron a -80°C para otra investigación.

(B) Expresión de las Proteínas del Agente Infeccioso de la Cepa de owa Recombinante Se utilizaron el ensayo de inmunofluorescencia fl indirecta y las pruebas de radioinmunoprecipitación, para evaluar la expresión. Ensayo de Inmunofluorescencia Indirecta: Las células de insecto HI-FIVE, mostradas en la Figura 25, en una placa de acumulación de cultivo celular de 24 pozos, se infectaron con baculovirus de tipo silvestre ó baculovirus recombinante, ó se infectaron falsamente. Después de 72 horas, las células se fijaron y se mancharon con diluciones apropiadas de anticuerpos poiiclonales contra ISU-12 de cerdo, seguido por IgG contra # cerdo etiquetada con isotiocianato de fluoresceína (etiquetada con FITC). Como se muestra en las Figuras 26-29, la inmunoflüorescencia se detectó en las células infectadas con los virus recombinantes, pero no en las células infectadas falsamente, ó en las células inoculada con el baculovirus de tipo silvestre. Por ejemplo, la Figura 26 muestra las células HI-FIVE infectadas con el baculovirus recombinante que contiene al gen de MLA-6 de ISU-12 (Báculo.VSRRP.6) , que exhibe un efecto citopático. La Figura 27 muestra células HI-FIVE infectadas con otro baculovirus recombinante que contiene al gen de MLA-7 de ISU-12 (báculo.VSRRP.7) , que también exhibe un efecto citopático. Se obtuvieron resultados similares con el baculovirus recombinante que contiene MLA-5 (Báculo.VSRRP.5 , no se muestran los datos) . Las Figuras 28 y 29 muestran células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene al gen de MLA-6 del ISU-12, y al gen de MLA-7 del ISU-12, respectivamente, se mancharon con antisuero de cerdos para fc ISU-12, seguido por IgG contra cerdos conjugada con fluoresceína, en donde las células de insectos están produciendo la proteína del agente infeccioso de la cepa de Iowa recombinante. Se obtuvieron resultados similares con el baculovirus recombinante que contiene MLA-5. Radioinmunoprecipitación: La radioinmuno- precipitación se llevó a cabo con cada virus recombinante (Báculo.VSRRP.5, Báculo. SRRP.6 y Báculo.VSRRP.7) , para determinar adicionalmente la antigenicidad y la autenticidad de las proteínas recombinantes. Las células de insecto HI-FIVE se infectaron falsamente, ó de una manera alternativa, se infectaron con cada uno de los baculovirus recombinantes. Dos días después de la infección, se agregó medio libre de metionina. Cada mezcla se incubó durante dos horas, y luego se agregaron las proteínas etiquetadas con 35S-metionina ^., (Amershápt) , y la mezcla se incubó durante cuatro horas * J adicionales a 28 °C. Se prepararon lisatos celulares radioetíquetados mediante tres ciclos de congelación y descongelación, y los lisatos celulares se incubaron con antisuero preinmune ó anti-ISU-12 inmune. Los complejos inmunes se precipitaron con agarosa de proteína A, y se analizaron sobre SDS-PAGE después de hervir. Se expuso una película de Rayos X a los geles a -80°C, y se reveló. Se detectaron bandas del tamaño esperado con los productos de MLA-6 (Figura 30) y Vr MLA-7 (Figura 31) .

EXPERIMENTO V Otras muestras de VSRRP, descritas en la siguiente Tabla 4, se purificaron de placas tres veces. La purificación de placas se realizó cultivando un homogenato de tejido aclarado sobre células PSP-36-SAH, y seleccionando una sola placa, asumiendo que se produce una placa por un solo virus. Luego la placa seleccionada se cultivó, y nuevamente se seleccionó una sola placa, y luego se cultivó una tercera vez. El EIF se llevó a cabo utilizando anticuerpo monoclonal contra VSRRP, adquirido en la Universidad del Estado de Dakota del Sur, Brookings, Dakota del Sur. Algunas muestras aisladas seleccionadas para otro estudio se identifican en la siguiente Tabla 5, y se caracterizan por su patogenicidad y el número de mARN.

TABLA 4 AISLADOS DE VSRRP PURIFICADOS DE PLACAS TRES VECES Aislado Fecha en que se preparó Resultado de EIF Titulación de el material congelado del SRRP monoclonal TCID /ml bü VSRRP ISU-22 9/15/92 + 10 5.57 0.15 ISU-28 9/15/92 + 105.14 + 0.28 ISU-12 9/17/92 4- 10 4.33 + 0.21 ISU-3927 9/21/92 10 3.56 ± 0.17 ISU-984 9/21/92 + 10 3.89 ± 0.24 ISU-7229 9/22/92 + 10 3.45 + 0.20 ISU-$2-Ü58l 9/22/92 10 2.39 + O; 17 ISIÍ-69S 10/0Í/92 • 104.49 + 0.20 ÍSU-79 ÍO/01/92 105.69 + 0.25 ISU-412 10/01/92 10 5.31 ± 0.50 ISU-55 10/01/92 + 10 5.54 + 0.10 ISU-33 10/05/92 105.36 + 0.21 ISU-1894 10/27/92 10 5.18 + 0.33 ISU-04 Í0/27/92 + 10 5.78 + 0.24 ISÜ-5Í 2/07/93 -t- 10 4.59 ± 0.15 99 ISU-30262 4/01/93 10 5. + 0.24 NOTA: Todos los aislados de virus se purificaron de placas y se propagaron sobre células PSP-36-SAH.

TABLA 5 * * Los mARN del ISU-3927, exhibieron supresiones en # cuatro de los siete mARN. Los mARN 4, 5 6 y 7 del ISU-3927, * emigraron más rápidamente que los del ISU-12 , y por consiguiente, son más pequeños que los del ISU-12. Esta característica posiblemente puede estar relacionada con la virulencia más baja del ISU-3927. Se comparó la patogenicidad de seis aislados en cerdos CDCD de cinco semanas de edad. Quince cerdos se inocularon con lo5 TCID50 del virus. Diez cerdos pasaron por *f necropsia a los 10 DDI, y cinco cerdos pasaron por necropsia a los 28 DDI. Los aislados de virus ISU-12, ISU-22 e ISU-28, fueron los más patogénicos, mientras que los ISU-51 e ISU-55 fueron de baja patogenicidad. En un estudio anterior, el ISU- 3927 fue solamente ligeramente patogénico para cerdos de cinco semanas de edad. Las lesiones causadas por el ISU-22 y por el ISU-12 no purificado de placas (es decir, agente infeccioso aislado tf que no se ipurifico de placas) , persisten durante períodos más largos que las causadas por los virus purificados de placa. Los aislados purificados de placas producen una ligera miocarditis y encefalitis. Los aislados no purificados de placas produjeron una enfermedad ligeramente más severa que los aislados purificados de placas correspondientes. Los lechones CDCD proporcionan un excelente modelo para la evaluación de la patogenicidad y la eficacia de las vacunas candidatas. Los aislados de ISU-12¿ ISU-22 e ISU-984, t* # producen lesiones similares, y se pueden utilizar para evaluarla eficacia de la vacuna, basándose en los exámenes de las lesiones gruesas y microscópicas. El ISU-3927 es menos virulento, pero es adecuado para evaluar una vacuna contra las cepas patogénicas de VSRRP. Los cerdos infectados con ISU-12 purificados de placas, ganaron un promedio de 4.5 kilogramos menos que los cerdos de control (agredidos con células PSP-36 no infectadas) - sobre un período de tiempo de 28 días. Los resultados preliminares indican que se presenta una linfopenia y neutrofilia de 2 a 10 DDI. Solamente los cerdos infectados con ISU-12 no purificado de placas, desarrollaron encefalitis significativa. No se observó rinitis en ningún cerdo agredido con los aislados de la cepa de Iowa biológicamente clonados (purificados de placas) . En contraste, la rinitis fue severa cuando se utilizaron filtrados de tejido (aislados no purificados de placas) como el inoculo. La patología e histología de los cerdos CDC infectados con ISU-12 no purificado de placas, ISU-12 purificado de placas, ISU-22, ISU-984, ISU-3927 y células PSP-36 ho infectadas, se resumen en las siguientes Tablas 6 a 12. En estas Tablas, los puntajes de una lesión gruesa del pulmón representan el porcentaje de la consolidación del pulmón (es decir, el porcentaje de tejido de pulmón enfermo de neumonía, que muestra lesiones) . Un puntaje se basa en una * * escala del 0 al 100 por ciento de consolidación. "ND" significa que no se determinó el puntaje de la lesión gruesa del pulmón.

TABLA 6 En la Tabla 6 anterior, "sin pl." significa purificado sin placas, y "no ihoc." significa no inoculado. Los resultados en la Tabla 6 anterior muestran que el ÍSU-12 y el ISU-22 producen lesiones que persisten durante más tiempo que otros aislados. Las lesiones producidas por ISU-12, ISU-22 e ISU-984, son de una severidad similar. Las lesiones producidas por ISU-3927 son mucho menos severas, y se resuelven más temprano que las lesiones producidas por otros aislados. Todas las lesiones gruesas se resolvieron para los 36 DDI. Los resultados de patología presentados en las Tablas 7, a 12 más adelante, se basan en la misma escala de severidad presentada para la Tabla 1 anterior. En las Tablas 7 a 12 más adelante, "esp. int." significa espesamiento intersticial, "exud. alv." significa exudado alveolar y "encefal." significa encefalitis.

TABLA 7: TABLA 8 LESIONES MICROSCÓPICAS A LAS 7 DDI TABLA 9 TABLA 10 LESIONES MICROSCÓPICAS A LAS 21 DDI TABLA 11 TABLA 12 LESIONES MICROSCÓPI CAS A LAS 36 DDI f Para los 7DDI, las lesiones del pulmón producidas por ISU-12, ISU-22 e ISU-984 son severas, y similares unas a otras. Las lesiones del pulmón producidas por ISU-3927 son solamente ligeras, ó moderadamente severas para los 7 DDI. Para los 10 DDI, las lesiones del pulmón producidas por ISU-12, ISU-22 e ISU-984 son similares a las de los 7 DDI , pero un poco más severas. Solamente los cerdos infectados por el ISU-12 no purificado de placas, exhiben una ligera encefalitis y miocarditis. Para los 10 DDI, casi se resuelven "f las lesiones producidas por ISU-3927. Para los 21 DDI, la miocarditis producida por el ISU-12 no purificado de placas es severa, mientras gue la miocarditis producida por ISU-12, ISU-22 e ISU-984, es moderada; Solamente los cerdos infectados por ISU-12 no purificado de placas, exhiben una encefalitis moderada a los 21 DDI. A los 28 DDI, las lesiones del pulmón son todavía moderadas en los cerdos infectados por ISU-12 e ISU-22 no purificados de placas. Estos aislados también producen una severa miocarditis a los 28 DDI . Sin embargo, casi se resuelven las lesiones del pulmón producidas por ISU-12, ISU-984 e ISU- 3927, a los 28 DDI . Para los 36 DDI , se resuelven esencialmente todas las lesiones. Solamente se examinó un cerdo por grupo a los 36 DDI .

EXPERIMENTO VI Se realizó un estudio de neutralización cruzada en vivo. Se inocularon cerdos CDCD intranasalmente, primero con un aislado seleccionado a partir de ISU-12, ISU-22, ISU-984 e ISU-3927, y luego, cuatro semanas más tarde, los cerdos fueron agredidos con ISU-12. Se examinaron las lesiones del pulmón y otros síntomas de enfermedad 8 días DDI después de la agresión con ISU-12. Los cerdos de control solamente se agredieron con ISU-12. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 13. Los resultados de la patología presentados en la siguiente Tabla 13, se basan en la misma escala de severidad presentada para la Tabla 1 anterior. En la Tabla 13 más adelante, "es. int." significa espesamiento intersticial, "exud. alv." significa exudado alveolar, y "encefal." significa encefalitis. i TABLA 13 ff NEUTRALIZACIÓN CRUZADA EN VIVO ^* ^.

Los datos de la Tabla 13 anterior demuestran que el ISU-l? proporciona proteccidn para los cerdos contra la mayoria de ios singas de la en£ermedad causada por ISU-12. E1 Isu_984 proporciona protección contra algunos sintomas y slg„os clínicos de SRRP causados por ISD-». que est-S entre las cepas mas virulentas de virus de VSRRP conocidas.

Sin embargo, el ISU-3927, una variante ligeramente patogénica de la cepa de Iowa del virus SRRP, proporciona la # # mayor protección de los aislados estudiados como una vacuna viva contra una agresión subsecuente con ISU-12. Por consiguiente, el ISU-3927 puede mostrar una promesa comercial para utilizarse como una vacuna viva.

EXPERIMENTO VII Se inocularon grupos de diez cerdos CDCD con aislados de la cepa de Iowa de VSRRP listados en la Tabla 14 más adelante, ó con células PSP-36 no infectadas como un control. Los cerdos eran de cinco semanas de edad cuando se agredieron intranasalmente con 105 TCID50 de cada aislado de virus listado en la siguiente Tabla 14. Los cerdos se pasaron por necropsia a los 10 DDI. En la Tabla 13 más anterior se proporciona el puntaje de lesión de pulmón gruesa promedio a los 10 DDI, como una indicación de la patogenicidad del aislado. La desviación estándar (DE) se proporciona como una indicación del significado estadístico del puntaje de lesión de pulmón gruesa promedio.

TABLA 14 En la -siguiente Tabla 15 se proporciona Una comparación estadística de los puntajes de lesión del pulmón gruesas .

TABLA 15 COMPARACIÓN ESTADÍ STI CA DE LOS PUNTAJES DE LESIÓN DEL PULMÓN GRUESA * • 12Í * * En adición, cada grupo de cerdos se examinó por insuficiencia respiratoria de conformidad con el sistema de calificación respiratorio clínico descrito anteriormente (ver "Promedio de puntaje clínico" en la siguiente Tabla 16) . "Puntaje Grueso" se refiere al puntaje de la lesión del pulmón gruesa descrito anteriormente, "encef.", "miocard." y "rinitis" se refieren al número de cerdos de cada grupo que exhibieron í 122 lesiones de encefalitis, miocarditis y rinitis, respectivamente. "Micropuntaje" se refiere a un puntaje basado en la siguiente escala, utilizado para evaluar y comparar las lesiones microscópicas de la neumonía intersticial en el tejido pulmonar: 0 = sin enfermedad; tejido pulmonar normal 1 = lesiones microscópicas multifocales ligeras 2 = lesiones microscópicas difusas ligeras 3 = lesiones microscópicas multifocales moderadas « 4 = lesiones microscópicas difusas moderadas 5 = lesiones microscópicas multifocales severas 6 = lesiones microscópicas difusas severas Se pueden observar lesiones microscópicas en los tejidos que no exhiben lesiones gruesas. Por consiguiente, el "micropuntaje" proporciona un elemento adicional para evaluar y comparar la patogenicidad de estos aislados, en adición a las lesiones del pulmón gruesas, a la insuficiencia respiratoria, a la fiebre, etc.

EXPERIMENTO VIII El mARN de células PSP-36 infectadas con cada uno de * « ISU-12, ISU-22, ISU-55, ISU-79, ISU-1894 e ISU-3927, se aisló y se separó sobre un gel de agarosa al 1.5 por ciento, para alcanzar una mejor separación de los mARN subgenómicos. Se observaron dos grupos de patrones de emigración. El Grupo I incluye los aislados ISU-12, ISU-1894, ISU-3927 y posiblemente ISU-51. La mancha Northern del ISU-12 se muestra en la Figura 32, y las manchas Northern del ISU- 1894, ISU-3927 e ISU-51 se muestran en la Figura 33. Como el * # virus Lelystad, se encontraron siete mARN subgenómicos (etiquetados de 1 a 7 en las Figuras 32 y 33) en cada uno de estos aislados. Los tamaños de los mARN subgenómicos (ARNSg) son similares a los del virus Lelystad. El Grupo II incluye los aislados ISU-22, ISU-55 e ISU-79. Cada uno de estos aislados tiene nueve ARNSg, en lugar de siete. Los ARNSg 1, 2, 3, 6 y 7 del Grupo II, son los mismos que los del Grupo I, pero se encontraron dos ARNSg adicionales I» entre los ARNSg 3 y 6 del Grupo I, indicados por las flechas de la Figura 33. Los resultados preliminares indican que el virus del Grupo II puede replicarse mejor que los aislados del Grupo I, con la posible excepción del ISU-12 en las células PSP-36. Sin embargo, en algunos casos, inclusive el ISU-12 puede replicarse pobremente, comparándose con los aislados del Grupo II.

EXPERIMENTO VIII Se condujo un estudio de eficacia de vacuna viva modificada de virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) en cerdos SPF, VSRRP-seronegativos, de tres semanas de edad. La vacuna consistió en lo5'8 TCID50 de ISU-12 de VSRRP purificado de placas (cepa de lowá) por dosis de 2 mililitros. A nueve cerdos se les dio una sola dosis de vacuna mediante la vía intranasal (IN) , a siete cerdos se les dio una sola dosis de vacuna por la vía intramuscular (IM) , y nueve cerdos sirvieron como controles de agresión no vacunados (NV/AGRESION) . Los vacunados y los controles se agredieron en el día 35 después de la vacunación, y luego se clasificaron por las lesiones pulmonares gruesas (porcentaje de pulmón afectado) en el día 10 después de la agresión. En la Figura 34 se muestran, mediante el número arriba de cada barra, los puntajes de la lesión pulmonar gruesa promedio para cada grupo de cerdos. La eficacia de la vacuna se evaluó por la reducción en el puntaje de la lesión pulmonar. Ambos grupos vacunados demostraron puntajes de lesión pulmonar gruesa significativamente más bajos (p < 0.01) gue los controles no vacunados. No se encontraron diferencias significativas en los puntajes entre los grupos vacunados. La vacuna de VSRRP de ISU-12 probó ser eficaz en cerdos de tres semanas de edad, en la dosis de 105*8 TCID50.

OTRAS OBSERVACIONES r ^ El virus ISU-12 está envuelto, ya gue es sensible al tratamiento con cloroformo. La réplica de ISU-12 es resistente al tratamiento con 5-bromodesoxiuridina. Por consiguiente, el ISU-12 no es un virus de ADN. El ISU-12 carece de la actividad de hemaglutinación. Obviamente, son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por consiguiente, debe entenderse que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la presente invención se puede practicar de otra manera diferente a la específicamente descrita en la presente. 1 LISTADO DE SECUENCIA * * (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: PAUL, PREM S. HALBUR, PATRICK G. MENG, XIANG-JIN LUM, MELISSA A. LYOO, YOUNG S. (II) TITULO DE LA INVENCIÓN: VACUNAS QUE ELEVAN UNA # » RESPUESTA INMUNOLOGICA CONTRA VIRUS QUE CAUSAN ENFERMEDADES RESPIRATORIAS Y REPRODUCTORAS PORCINAS, MÉTODOS PARA PROTEGER A UN CERDO CONTRA UNA ENFERMEDAD CAUSADA POR UN VIRUS RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO, UN MÉTODO PARA PRODUCIR UNA VACUNA QUE ELEVA UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA CONTRA UN VIRUS QUE CAUSA UNA ENFERMEDAD RESPIRATORIA Y REPRODUCTORA PORCINA, Y ADN OBTENIDO A PARTIR DE UN VIRUS QUE CAUSA UNA ENFERMEDAD RESPIRATORIA Y REPRODUCTORA PORCINA, (iii) NO. DE SECUENCIA: 28 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DIRIGIDO: OBLON, SPIVAK, McCLELLAND, MAIER & NEUSTADT, P.C. (B) CALLE: 1755 S. Jefferson Davis Highway, Suite 400.

(C) CIUDAD: Arlington ~tf (D) ESTADO: Virginia < (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 22202 (V) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 * * (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 07/969,071 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de octubre de 1992 (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Lavalleye, Jean-Paul M.P. (B) No. DE REGISTRO: 31,451 (C) No. DE REFERENCIA/CASO: 4625-016-55X CIP (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (703) 413-3000 (B) TELEFAX: (703) 413-2220 (C) TELEX: 248855 OPAT UR (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DJE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1: 22 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de base * (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y * fi respiratorio porcino. (B) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SEC:1 CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT 22 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE * SECUENCIA: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN % * (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SEC: 2 CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG 22 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida # (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Io a (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 V (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SEC: 3: GCCGCGGAAC CATCAAGCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de base * (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ü) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (Vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. Í32 (B) CEPA : Iowa ^'---PS-, 4| (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SEC: 4: CAACTTGACG CTATGTGAGC 20 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de base & # (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SEC: 5: GCGGTCTGGA TTGACGACAG 20 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE ? SECUENCIA: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SEC: 6: GACTGCTAGG GCTTCTGCAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: lowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SEC: 7: GCCATTCAGC TCACATACG 20 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 38 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: doble (D) TOPOLOGÍA: desconocida ? (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (ix) CARACTERÍSTICAS: 'f (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION:' 1...1938 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SEC: 8: GGC ?CG AGC TTT GCT GTC CTC CA? G?C ATC AGT TGC CTT ?GG C?T CGC 4S Gly Thr Ser Phe Ala Val Leu Gln Asp He Ser Cys Leu Arg His Arg 1 5 10 15 ?AC TCG GCC TCT G?G GCG ATT CGC AAA GTC CCT CAG TGC CGC ACG GCG 95 ?sn Ser ?la Ser Glu ?la He ?rg Lys Val Pro Gln Cys Arg Thr Ala 20 25 30 ACC GAT GAG 144 Thr ?sp Glu AAT T?T TTG CAT TCC TCT GAT CTT CTC ATG CTT TCT TCT TGC CTT TTC 192 Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe 50 55 60 TAT GCT TCT GAG ATG AGT GAA A?G GGA TTT AAG GTG GTA TTT GGC ?AT 240 Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn 65 70 75 80 GTG TCA GGC ATC TTT T?G CCT GTC TTT TTG CGA TTC TGT TGG CAÁ TTT 233 Val Ser Gly He Phe * Pro Val Phe Leu Arg Phe Cys Trp Gln Phe 85 90 95 TTG CTC 335 Leu Leu GCA ATT GCT TTT TTT GTG GTG TAT CGT GCC GTC TTG TTT TGT TGC GCT 384 Ala He Ala Phe Phe Val Val Tyr ?rg Ala Val Leu Phe Cys Cys Ala 115 120 125 CGT CAG CGC CAÁ CGG GAA CAG CGG CTC ??A TTT ACÁ GCT GAT TTA CAÁ 43T" Arg Gln ?rg Gln Arg Glu Gln ?rg Leu Lys Phe Thr Ala ?sp Leu Gln .130 135 140 CTT GAC GCT ATG TGA GCT GAA TGG CAC AGA TTG GCT AGC TAA TAA ATT 48Ü Leu ?sp ?la Met * ?la Glu Trp His ?rg Leu Ala Ser * * He 145 150 155 160 TG? CTG GGC AGT GGA GTG TTT TGT CAT TTT TCC TGT GTT GAC TCA CAT 523 576 Cys Leu Leu Trp Cys Pro His Tyr * Pro Phe Pro * His Ser ?rg 180 185 190 TCT GGT C?C TGT GTC TAC CGC TGG GTT TGT TCA CGG GCG GTA TGT TCT 624 Ser Gly His Cys Val Tyr Arg Trp Val Cys Ser ?rg Ala Val Cys Ser 195 200 205 GAG TAG CAT GTA CGC GGT CTG TGC CCT GGC TGC GTT GAT TTG CTT CGT 672 Glu * His Val Arg Gly Leu Cys Pro Gly Cys Val Asp Leu Leu Arg 210 215 220 CAT TAG GCT TGC GA? GAA TTG CAT GTC CTG GCG CTA CTC ATG TAC CAG 12 Ü: 763 He Tyr Gln Leu Ser Ser Gly His * Gly Gln Thr Leu Ser Leu Ala 245 250 255 GTC GCC TGT CAT CAT AGA GAA AAG GGG C?A AGT TGA GGT CGA AGG TCA 81-S Val Ala Cys His His Arg Glu Lys Gly Gln Ser * Gly Arg Arg Ser 260 265 270 CCT GAT CGA CCT CAÁ A?G AGT TGT GCT TGA TGG TTC CGC GGC TAC CCC 864 Pro Asp Arg Pro Gln Lys Ser Cys Ala * Trp Ph?. ?rg Gly Tyr Pro 275 280 285 TGT AAC CAG AGT TTC AGC GGA ACÁ ATG G?G TCG TCC TTA GAT GAC TTC 912 Cys Asn Gln Ser Phe Ser Gly Thr Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe 290 295 300 * # TGT CAT GAT AGC ACG GCT CC? C?A A?G GTG CTC TTG GCG TTT TCT ATT 9 ß ú Cys His ?sp Ser Thr ?la Pro Gln Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser He 305 310 315 320 ACC TAC ACG CCA GTG ?TG ATA TAT GCC CTA AAG GTG AGT CGC GGC CGA 1003 Thr Tyr Thr Pro Val Met He Tyr Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg 325 330 335 CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT TTG GTC TTC CTG AAT TGT GCT TTC ACC 1056 Leu Leu Gly Leu Leu His LeU Leu Val Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr 340 345 350 TTC GGG TAC ATG ACÁ TTC GTG CAC TTT CAG AGT ?CA AAT AAG GTC GCG 110* Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val Hís Phe Gln Ser Thr Asn Ly3 Val Ala 355 360 365 CTC ACT ATG GGA GC? GTA GTT GCA CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC 1152 Val Tyr Ser Ala TTG TGC TTG CT? 1200 Leu Cys Leu Leu 400 GGC CGC A?G TAC ?TT CTG GCC CCT GCC CAC CAC GTT GAA ?GT GCC GCA 1248 Gly Arg Lys Tyr He Leu Ala Pro Ala His His Val Glu Ser Ala Ala 405 410 415 GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA AAT GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG 1296 Gly Phe His Pro He Ala Ala Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg 420 425 430 CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTC A?C GGC ?C? TTG GTG CCC GGG TTA AAA 1344 Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys GTG GTA AAC 1392 er Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys Ala Val Lys Gln Gly Val Val ?sn 450 455 460 CTT GTT AAA T?T GCC AAA TAA CAC CGG CA? GCA GCA GAA GAG AAA GAA 1440 Leu Val Lys Tyr Ala Lys * His ?rg Gln Ala Ala Glu Glu Lys Glu 465 470 475 480 GGG GGA TGG CCA GCC AGT CAÁ TCA GCT GTG CCA GAT GCT GGG TAA GAT 1488 Gly Gly Trp Pro Ala Ser Gln Ser ?la Val Pro Asp Ala Gly * Asp 485 490 495 C?T CGC TCA CCA AAA CCA GTC CAG ?GG C?A GGG ACC GGG AAA G?A AAA 153 G His Arg Ser Pro Lys Pro Val Gln ?rg Gln Gly Thr Gly Lys Glu Lys 500 505 510 ~T?A G?A GM AA? CCC GG? GA? GCC CCA TTT CCC TCT AGC GAC TGA AGA 1534 * Glu Glu Lys Pro Gly Glu Ala Pro Phe Pro Ser Ser Asp * Arg 515 * 520 525 TGA TGT C?G ACÁ TCA CTT TAC CCC TAG TGA GCG TCA ATT GTG TCT GTC 1632 * Cys Gln Thr Ser Leu Tyr Pro * * Ala Ser He Val Ser Val 530 535 540 GTC AAT CCA GAC CGC CTT TAA TCA ?GG CGC TGG GAC TTG CAC CCT GTC 1680 Val Asn Pro Asp Arg Leu * Ser Arg Arg Trp Asp Leu His Pro Val 545 550 555 560 AG? TTC AGG GAG GAT A?G TT? C?C TGT GGA GTT TAG TTT GCC TAC GCA 1728 ?rg Ph& Arg Glu ?sp Lys Leu His Cys Gly Val * Phe Ala Tyr Ala 565 570 575 TCA TAC TGT GCG CCT GAT CCG CGT C?C AGC ATC ACC CTC AGC ATG ATG 1776 Ser Tyr Cys ?la Pro Asp Pro ?rg His Ser He Thr Leu Ser Met Met r<_, , tíá 58° 585 590 ™ GGC' TGG C?T TCT TGA GGC ATC CCA GTG TTT GAA TTG GAA G?A TGC GTG 1324 Gly Trp His Ser * Gly He Pro Val Phe Glu Leu Glu Glu Cys Val 595 600 605 GTG A?T GGC ?CT GAT TGA CAT TGT GCC TCT A?G TCA CCT ATT CAÁ TT? 1872 Val ?sn Gly Thr Asp * His Cys Ala Ser Lys Ser Pro He Gln Leu 610 615 620 GGG CGA CCG TGT GGG GGT AAG ATT TAA TTG GCG AG? ACC AC? CGG CCG 1920 Gly Arg Pro Cys Gly Gly Lys He * Leu Ala Arg Thr Thr ?rg Pro 625 630 635 640 AAA TTA AAA ?AA AAA AAA 1938 Lys Leu Lys Lys Lys Lys EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 646 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína ' ?) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. ID. SEC.:9: Arg * Ala He Gly Thr Pro Val Tyr He Thr Val Thr ?la Asn Val Thr Asp Glu 35 40 45 Asn Tyr Leu His Ser Ser Aep Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe 50 55 60 Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn 65 ' 70 75 80 Val Ser Gly He Phe * Pro Val Phe Leu ?rg Phe Cys Trp Gln Phe 85 90 95 Glu Cys Phe Lys Tyr Val Gly Glu Met Leu ?sp Arg Gly Leu Leu Leu 100 105 110 Ala He Ala Phe Phe Val Val Tyr Arg Ala Val Leu Phe Cys Cys ?la 0 115 120 125 Arg Gln Arg Gln Arg Glu Gln Arg Leu Lys Phe Thr Ala Asp Leu Gln 130 135 140 Leu Asp Ala Met * ?la Glu Trp His ?rg Leu Ala Ser * * He 145- 150 155 160 * Leu Gly Ser Gly Val Phe Cys His Phe Ser Cys Val Asp Ser Hís 165 170 > ' 175 Cys Leu Leu Trp Cys Pro His Tyr * Pro Phe Pro * His Ser Arg 180 185 190 Ser Gly His Cys Val Tyr ?rg Trp Val Cys Ser ?rg Ala Val Cys Ser 195 200 205 Asp Leu Leu Arg His * Ala Cys Glu Glu Leu His Val Leu Ala Leu Leu Met Tyr Gln 225 230 235 240 He Tyr Gln Leu Ser Ser Gly His * Gly Gln Thr Leu Ser Leu ?la 245 250 255 Vai ?la cys His His Arg Glu Lys Gly Gln Ser * Gly Arg Arg Ser 260 265 270 Pro Asp Arg Pro Gln Lys Ser Cys Ala * Trp Phe Arg Gly Tyr Pro 275 280 285 Thr Tyr Thr Pro Val Met He Tyr Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg 325 330 335 Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu Val Phe Leu ?sn Cys Ala Phe Thr 340 345 350 Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val His Phe Gln Ser Thr Asn Lys Val Ala 355 360 365 Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser ?la 370 375 380 Gly Phe His Pro He Ala Ala Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg 420 425 430 Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val ?sn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys 435 440 445 Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys ?la Val Lys Gln Gly Val Val Asn 450 455 460 Leu Val Lys Tyr Ala Lys * His Arg Gln Ala Ala Glu Glu Lys Glu 465 470 475 480 Gly Trp Pro Ala Ser Gln Ser Ala Val Pro Asp Ala Gly * Asp *# 485 490 495 His Arg Ser Pro Lys Pro Val Gln Arg Gin Gly Thr Gly Lys Glu Lys 500 505 510 * Glu Glu Lys Pro Gly Glu ?la Pro Phe Pro Ser Ser Asp ? Arg 515 520 525 * Cys Gln Thr Ser Leu Tyr Pro * A Ala Ser He Val Ser Val 530 535 540 Val Asn Pro Asp Arg Leu * Ser ?rg Arg Trp Asp Leu His Pro Val 545 550 555 560 ^. ?rg Phe Arg Glu Asp Lys Leu His Cys Gly Val ? Phe Ala Tyr Ala t ÉÍl 565 570 575 Ser Tyr Cys Ala Pro Asp Pro Arg His Ser He Thr Leu Ser Met Met 580 585 590 Gly Trp His Ser DV. C-l G1?. Glu Cvs Val 595 600 605 Val Asn Gly Thr ?sp * His Cys Ala Ser Lys Ser Pro He Gln Leu 610 615 620 Gly Arg Pro Cys Gly Gly Lys He * Leu Ala Arg Thr Thr Arg Pro 625 630 635 640 Lys Leu Lys Lys Lys Lys 645 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 10 : i Br (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: f (A) LONGITUD: 667 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Iowa (C) AISLADO INVIDIVUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 10 : t fGTGTC?G GCATCTTTTA GCCTGTCTTT TTGCGATTCT GTTGGCAATT TGAATGTTTT 60 AAGTATGTTG GGGAAATGCT TGACCGCGGG CTGTTGCTCG CA?TTGCTTT TTTTGTGGTG 120 TATCGTGCCG TCTTGTTTTG TTGCGCTCGT CAGCGCCAAC GGGK CAGCG GCTCAAATTT 180 AC?GCTGATT TACAACTTGA CGCTATGTGA GCTGAATGGC ACAGATTGGC TAGCTAATAA 240 ?TTTGACTGG GCAGTGGAGT GTTTTGTCAT TTTTCCTGTG TTGACTCACA TTGTCTCTTA 300 TGGTGCCCTC ACTACTAGCC ATTTCCTTGA CACAGTCGGT CTGGTCACTG TGTCTACCGC 360 TGGGTTTGTT CACGGGCGGT ATGTTCTGAG TAGCATGTAC GCGGTCTGTG CCCTGGCTGC 420 GT GATTTGC TTCGTCATTA GGCTTGCGAA GAATTGCATG TCCTGGCGCT ACTCATGTAC 480 : C ??ATATACC AACTTTCTTC TGGACACTAA GGGCAGACTC TATCGTTGGC GGTCGCCTGT 540 CATCATAGAG AAAAGGGGC? AAGTTG?GGT CGAAGGTC?C CTGATCGACC TCAAAAGAGT 600 TGTGCTTGAT GGTTCCGCGG CTACCCCTGT AACCAGAGTT TCAGCGGAAC ?ATGGAGTCG 660 TCCTT?G 667 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 11 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD í 605 pares de base (13) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: t (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. ,_ (B) CEPA: Lelystad (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 11 : ?TG?GATGTT CTC?CAAATT GGGGCGTTTC TTGACTCCGC ?CTCTTGCTT CTGGTGGCTT 60 TTTTGCTGTG TACCGGCTTG TCCTGGTCCT TTGCCG?TGG CAACGGCGAC AGCTCGACAT 120 ACCAATACAT ATAT??CTTG ACGATATGCG AGCTGAATGG GACCG?CTGG TTGTCCAGCC 180 ATTTTGGTTG GGCAGTCG?G ACCTTTGTGC TTTACCCGGT TGCCACTCAT ?TCCTCTCAC 240 TGGGTTTTCT C?CAACA?GC CATTTTTTTG ?CGCGCTCGG TCTCGGCGCT GTATCC?CTG 300 TGGCGGGCGG TACGTACTCT GC?GCGTCT? CGGCGCTTGT GCTTTCGCAG 360 TTTTGTCATC CGTGCTGCTA AAAATTGCAT GGCCTGCCGC TATGCCCGTA 420 CCCGGTTTAC CAACTTCATT GTGGACGACC GGGGGAGAGT TCATCGATGG A?GTCTCC?A 480 TAGTGGTAGA AAAATTGGGC ?AAGCCGAAG TCGATGGCAA CCTCGTCACC ATCAAAC?TG 540 TCGTCCTCGA AGGGGTTAA? GCTCAACCCT TGACGAGGAC TTCGGCTGAG CAATGGGAGG 600 CCT?G 605 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 12 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD» 526 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (VÍ) v-ru- de .l„ r«. reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 ( i) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 12 : A?TGG?GTCG TCCTTAGATG ACTTCTGTCA TGAT?GCACG GCTCCACAA? ?GGTGCTCTT 60 GGCGTTTTCT ATTACCT?C? CGCC?GTG?T GAT?T?TGCC CTA?AGGTGA GTCGCGGCCG 1 r ACTGCTAGGG CTTCTGC?CC TTTTGGTCTT CCTG?ATTGT GCTTTCACCT TCGGGTACAT 130 CACTTTCAGA GTACAAAT?A GGTCGCGCTC ACT?TGGG?G CAGTAGTTGC 240 GGGGTGTACT CAGCC?TAGA AACCTGGAAA TTCATCACCT CCAGATGCCG 300 TTTGTGCTTG CTAGGCCGCA AGT?CATTCT GGCCCCTGCC C?CCACGTTG AAAGTGCCGC 360 AGGCTTTCAT CCG?TTGCGG CAA?TGATAA CCACGC?TTT GTCGTCCGGC GTCCCGGCTC 420 CACTACGGTC AACGGCAC?T TGGTGCCCGG GTTAAAAAGC CTCGTGTTGG GTGGCAGAAA 480 AGCTGTTAAA CAGGGAGTGG TAAACCTTGT TAA?TATGCC A?ATA? 526 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 13 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 522 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Lelystad (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : No . DE ID . DE SECUENCIA : 13 : ATGGGAGGCC TAGACGATTT TTGCAACGAT CCTATCGCCG C?CAAAAGCT CGTGCTAGCC 60 MfTJ fA?CA CATACACACC TATAATGATA TACGCCCTTA AGGTGTCACG CGGCCGACTC 120 CTGGGGCTGT TGCACATCCT AATATTTCTG A?CTGTTCCT TTAC?TTCGG ATACATGACA 180 TATGTGCATT TTC?ATCCAC CAACCGTGTC GCACTTACCC TGGGGGCTGT TGTCGCCCTT 240 CTGTGGGGTG TTTACAGCTT CACAGAGTCA rGGAAGTTTA TCACTTCCAG ATGCAG?TTG 300 TGTTGCCTTG GCCGGCGATA CATTCTGGCC CCTGCCCATC ACGTAGAAAG TGCTGCAGGT 3 60 CTCCATTCAA TCTCAGCGTC TGGTAACCGA GCATACGCTG TGAGAAAGCC CGGACT?ACA 4 20 TCAGTG?ACG GCACTCT?GT ACCAGGACTT CGG?GCCTCG TGCTGGGCGG CAAACGAGCT 480 GTTA?ACGAG GAGTGGTTAA CCTCGTCA?G TATGGCCGGT AA 522 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 14 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 372 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Lelystad (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 14 : ATgjCA?ATA ACÁCCGGCAA GCAGCAG?AG AGAAAGAAGG GGGATGGCCA GCCAGTCA?T 60 ^'AGCTGTGCC ?G?TGCTGGG TAAGATC?TC GCTCACCA?? ACC?GTCCAG AGGCAAGGGA 120 CCGGGAAAGA AA?ATAAGAA G?AAAACCCG GAGAAGCCCC ATTTCCCTCT AGCGACTGAA 180 GATGATGTCA GACATCACTT TACCCCTAGT GAGCGTCAAT TGTGTCTGTC GTCAATCCAG 240 ?CCGCCTTTA ATCAAGGCGC TGGGACTTGC ACCCTGTC?G ATTCAGGGAG GAT?AGTTAC 300 ?CTGTGGAGT TTAGTTTGCC TACGCATCAT ACTGTGCGCC TGATCCGCGT CACAGCATCA 360 CCCTCAGCAT GA 372 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 15 : I (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 387 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 15 : ATGGCCGGTA AAAACCAGAG CCAGAAGA?A AAGAAA?GTA CAGCTCCGAT GGGGAATGGC CAGCCAGTCA ATCAACTGTG CCAGTTGCTG GGTGC?ATGA TAAAGTCCCA GCGCCAGCAA 120 CC32&GGGAG G?CAGGCCA? A??G????AG CCTGAGAAGC CAC?TTTTCC CCTGGCTGCT 180 G??GATG?CA TCCGGCACCA CCTCACCCAG ACTGAACGCT CCCTCTGCTT GC?ATCGATC 240 C?G?CGGCTT TCA?TCAAGG CGCAGGAACT GCGTCGCTTT CATCCAGCGG GAAGGTCAGT 300 TTTCAGGTTG AGTTT?TGCT GCCGGTTGCT CATACAGTGC GCCTGATTCG CGTG?CTTCT 360 ?CATCCGCCA GTCAGGGTGC AAGTTAA 387 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: Í64 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: VirUs de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 16: TGGGCTGGCA TTCTTGAGGC ATCCCAGTGT TTGAATTGGA AG?ATGCGTG GTGAATGGCA 60 TTGTGCCTCT AAGTCACCTA TTCA?TTAGG GCGACCGTGT GGGGGTAAGA 120 GAGAACCACA CGGCCGAAAT T?AAAAAAAA ?AA? 164 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 17 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 127 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Lelystad (xi ) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : No . DE ID . DE SECUENCIA : 17 : CCGCGATTGG CGTGTGGCCT CTGAGTC?CC TATTCAATTA 60 GGGCGATCAC ATGGGGGTCA TACTTAATCA GGCAGGAACC ATGTCACCGA AATTAAAA?A 120 AAAAAAA 127 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 18 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de base lí * (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) ( i) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (B) CEPA: Lelystad (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 18 CTCGTCAAGT ATGGCCGGT 19 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 19 : # (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino, (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 19 : GCCATTCGCC TGACTGTCA 19 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 20 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico # #- (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TÍPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 20: ¡-^ m_ TTGACGAGGA CTTCGGCTG 19 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 21 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal 4« (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 21 : GCTCTACCTG CAATTCTGTG 20 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 22 : # (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: ¿v (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino, (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 22 : GTGTATAGGA CCGGCAACAG 2D (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 23 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (C) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 23 : GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC 25 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 24 : 2L. jff (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (C) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 24 : GGTGTTTTCC ACGAGAACCG CTTAAGGG 2B (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 25 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. A (C) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 25 : GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G 21 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 26 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. # (C) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 26: CAGTTAGTCG ACACGGTCTT AAGGG 25 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 27 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de base s. (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino.

(C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 27 GGGGATCCTT GTTAAATATG CC 22 (2) INFORMACIÓN PARA EL No. DE ID. DE SECUENCIA: 28 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: ADN (sintético) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. (C) CEPA: Iowa (C) AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: No. DE ID. DE SECUENCIA: 28 : CTTACGCACC ACTTAAGGG 19 154 ^ reivindicación 1, caracterizada porque la vacuna se prepara a H partir de un virus cultivado en una línea celular seleccionada a partir del grupo que consiste en PSP-36 , PSP-36 -SAH y MA-104. 6. Una muestra biológicamente pura de un virus ó agente infeccioso que causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, caracterizada por los siguientes síntomas y signos clínicos: Formación de neumocitos Tipo II, miocarditis, encefalitis, formación de exudado alveolar, y formación se sincitios. 7. El virus ó agente infeccioso biológicamente puro de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, caracterizado adicionalmente por los siguientes síntomas y signos clínicos: letargía, insuficiencia respiratoria, expiración forzada, fiebre, pelambre rugosa, estornudos, tos y espesamiento intersticial ligero. 8. El virus biológicamente puro de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 7, caracterizado porque la muestra biológicamente pura es el agente infeccioso asociado con la cepa de Iowa del síndrome reproductor y respiratorio porcino, depositada en la American Type Culture Collection, bajo el número de acceso . 9. Una composición para proteger a un cerdo de la infección viral, la cual incluye una cantidad de la vacuna de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, efectiva 155 para elevar una respuesta inmunológica para un virus que causa £j ?Z una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, en un vehículo fisiológicamente aceptable. 10. Un método para proteger a un cerdo de la infección contra un virus que causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, el cual incluye administrar una cantidad efectiva de la vacuna de conformidad con lo reclamado la reivindicación 1, a un cerdo que necesite protección contra la infección por ese virus. s^ Ote 11* El método de conformidad con lo reclamado en la W reivindicación 10, caracterizado porque la vacuna se administra oral ó parenteralmente. 12. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 11, caracterizado porque la vacuna se administra intramuscularmente, intradérmicamente, intravenosamente, intraperitonealmente, subcutáneamente ó intransalmente. 13. El método de conformidad con lo reclamado en la - j ^ reivindicación 10, caracterizado porque la vacuna se administra t^ a una cerda que necesite protección contra la infección por ese virus. 14. Un método para producir la vacuna de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque incluye las etapas de: (A) Recolectar una muestra suficientemente grande de un virus ó agente infeccioso que cause una enfermedad 156 respiratoria y reproductora porcina; y ^^-- (B) tratar este virus ó agente infeccioso de una manera seleccionada a partir del grupo gue consiste en: (i) Purificación de placas del virus ó del agente infeccioso, (ii) calentamiento del virus ó agente infeccioso a una temperatura y durante un tiempo suficientes para ináctivar al virus ó al agente infeccioso, (iii) exponer ó mezclar al virus ó al agente infeccioso a una cantidad de un producto químico inactivador suficiente para inactivar al virus ó al agente infeccioso, (iv) descomponer el virus ó el agente infeccioso en sus subunidades correspondientes, y aislar cuando menos una de estas subunidades, y (v) sintetizar ó aislar un ácido polinucleico que codifique una proteína superficial del virus ó del agente infeccioso, infectar una célula huésped adecuada con este ácido polinucleico, cultivar la célula huésped, y aislar la proteína superficial de este cultivo. 15. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, caracterizado porque el virus ó agente infeccioso se recolecta desde una fuente seleccionada a partir del grupo que consiste en un medio de cultivo, células infectadas con este virus ó agente infeccioso, y tanto un medio de cultivo como células infectadas con el virus ó agente infeccioso. 16. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 15, caracterizado porgue adicionalmente incluye 157 la etapa de cultivar el virus ó el agente infeccioso en un ^ w9 medio adecuado, antes de la etapa de recolección. W- w 17. Un anticuerpo gue se enlaza inmunológicamente con la vacuna de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1. 18. Un método para el tratamiento de un cerdo gue sufre de una enfermedad respiratoria y reproductora, el cual incluye administrar una cantidad efectiva del anticuerpo de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, en un vehículo fisiológicamente aceptable, a un cerdo gue lo necesite. 19. Un estuche de diagnóstico para ensayar un virus que causa una enfermedad respiratoria porcina, una enfermedad reproductora porcina, ó una enfermedad reproductora y respiratoria porcina, el cual incluye al anticuerpo de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, y un agente de diagnóstico que indica una reacción inmunológica *> positiva con ese anticuerpo. 20. Un polinucleótido aislado que es cuando menos 90 por ciento homólogo con un polinucleótido obtenido a partir de una parte del genoma de un virus ó agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina. 21. El polinucleótido aislado de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, caracterizado porque el virus ó el agente infeccioso está asociado con la cepa de Iowa 158 del síndrome reproductor y respiratorio porcino. 22. El polinucleótido aislado de conformidad con lo % reclamado en la reivindicación 21, caracterizado porque consiste esencialmente en una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en el No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8, No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 10, No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 12 , No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 15, y No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 16. 23. Una proteína codificada por el polinucleótido aislado de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 22. 24. Un ácido polinucleico aislado que consiste esencialmente en un fragmento de polinucleótido obtenido a partir del genoma de un virus ó agente infeccioso que causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina, que es de 20 a 100 nucleótidos de longitud. 25. El polinucleótido aislado de conformidad con lo ß ^ reclamado en la reivindicación 24, caracterizado porque el virus ó el agente infeccioso es la cepa de Iowa del virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. 26. El fragmento de polinucleótido aislado de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 24, caracterizado porque consiste esencialmente en una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en el No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA:!, No. DE IDENTIFICACIÓN DE 159 SECUENCIA: 2, No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 3, No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4, No. DE IDENTIFICACIÓN DE & # SECUENCIA: 5, No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6 y No. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7. 27. Un método para cultivar un virus, el cual incluye: Infectar una línea celular seleccionada a partir del grupo que consiste en PSP-36, PSP-36-SAH, MA-104, y líneas celulares equivalentes a las mismas, capaces de ser infectadas « con el virus, y de cultivarse, y cultivar la línea celular infectada en un medio adecuado, en donde el virus causa una enfermedad respiratoria y reproductora porcina. 28. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 27, caracterizado porque la línea celular adecuada se selecciona a partir del grupo que consiste en •W" ' f PSP-36, PSP-36-SAH y MA-104. 29. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 27, caracterizado porque el virus es la cepa de Iowa del virus de síndrome respiratorio y reproductor porcino, ó causa una enfermedad seleccionada a partir del grupo que consiste en síndrome respiratorio y reproductor porcino, neumonía proliferativa y necrotizante, e influenza de cerdos atípica.

Claims

153 >*!-*- NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Una vacuna que eleva una respuesta inmunológica efectiva en un cerdo contra la exposición a un virus gue causa una enfermedad reproductora y respiratoria porcina. 2. La vacuna de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizada porque el virus causa una enfermedad caracterizada por los siguientes síntomas y signos clínicos: Formación de neumocitos Tipo II, miocarditis, encefalitis, formación de exudado alveolar y formación de sincitios. 3. La vacuna de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizada porgue el virus causa una enfermedad caracterizada adicionalmente por los siguientes síntomas y signos clínicos: letargía, insuficiencia respiratoria, expiración forzada, fiebre, pelambre rugosa, estornudos, tos y espesamiento intersticial ligero. 4. La vacuna de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3, caracterizada porque la enfermedad es causada por la cepa de Iowa del virus de síndrome reproductor y respiratorio porcino. 5. La vacuna de conformidad con lo reclamado en la 30. El método de conformidad con lo reclamado en la «JÉ- reivindicación 29, caracterizado porque el virus es la cepa de Iowa del virus de síndrome respiratorio y reproductor porcino. EN TESTIMONIO DE LO CUAL, he firmado la anterior descripción y Novedad del Invento, como Apoderado de IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC., y SOLVAY ANIMAL HEALTH, INC., en la ciudad de México, D.F., a los veintinueve días del mes de octubre de mil novecientos noventa y tres. p.p. IOWA STATE UNIVERSITY R-ESEARCH FOUNDATION, INC. y SOLVAY ANIMAL HEALTH, INC. SAMUEL DORANTES R.