TW517085B - Vaccines inducing an immunological response against viruses causing porcine respiratory and reproductive diseases, methods of protecting a pig against infection by a virus causing a respiratory and reproductive disease - Google Patents

Vaccines inducing an immunological response against viruses causing porcine respiratory and reproductive diseases, methods of protecting a pig against infection by a virus causing a respiratory and reproductive disease Download PDF

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Description

517085 經濟部中央標準局員工消費合作钍印製 A6 B6 五、發明説明（/) 本發明於1992年10月30日合胞申請且為编號為07 /969,071 (現今已棄放）申請案的部份連缜案。 發明背景 本發明是有關一保護豬隻免受由呼吸性及複製性病毒 所引起的疾病、一保護藉隻免受呼吸性及生殖性疾病、一 生産疫苗的方法，以及由導致豬隻呼吸性及生殖性疾病之 病毒所得的D N A。 背景討論 在近些年，北美及歐洲豬群十分容易為呼吸性及生殖 性病毒之新®株所感染（見於A.A.S.P.，九月/十月 1991, pp.7-11 ；The Veterinary Record, February 1, 1992, ρρ·87-89; Ibid·,十一月 30,1991，pp,495-49 6;Ibid,十月 26, 1993, p. 370; Ibid.,十月 19, 1991，pp.367-368;Ibid,八月 3, 1991, ρ· 102-.、 103;Ibid,七月 6， 1991;Ibid,六月 22， 1991， ρ· 578 ;Ibid,六月 15，1991, ρ· 574;Ibid,六月 8，1991， P. 536;Ibid,六月 1，1991, 511;Ibid,三月 2, 1991, p. 213;)。在這些薩洙中第一値體鑑定出的為一結 合著所謂的神秘豬隻疾病（Mystery Swine Disease, MSD) 或〃藍耳症〃（:b 1 u e - e a r e d s y n d r o m e )的病毒，該病徵即 為現今所知的豬隻不繁殖以及呼吸性症狀（S IRS )或豬隻 生殖性呼吸性病徵（PRRS )。在歐洲，此種疾病已被謂為豬 隻流行性流産及呼吸性病歡（PEARS)，藍色流産疾病（blue -3 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4現格（210 X 297公釐） 82. 9. 6,000
517085 A6 _B6_ 五、發明説明（>^ abort ion disease)、藍耳疾病（blue ear disease)、 abortus b 1 a u (荷蘭）及 Seuchenhater Spatabor t der schweine (德國），且其對對應的病毒稱為〃萊西斯倍 德（Lei ys tad)病毒。在美國，此疾病被稱為瓦伯許（ Wabash)疾病、神铋豬隻疾病（MPD)及豬隻斑點症。常 與PRRS相結合的疾病為增殖性且對間質組織有影響 的肺炎。 〃藍耳疾病〃的發生是在大英國協、德國、比利時、 及菏蘭的豬隻中發現。它的發生造成豬隻展示會的取消◊ 該PRRS的症狀包含不願意吃（厭食症）、輕擻發燒（發熱 )、末端為蒼藍症（顯箸的為淡藍色的身朵)•、死胎、流 産、對感染的小豬造成高死亡率、生出證弱的小豬以及母 豬不足月即生産。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 對已感染的母豬大部份生出還活著的小豬會在43小 時間死亡。PRRS的臨床徵狀包含類於輕徹的流行性感冒歡 狀、呼吸急促（t h u m p i n g )、一擴散於組織間隙中的局部 急性肺炎。PRRS病毒由與感染動物Η接諝後约有二二週的 培育期間，該病毒顯然是一具被膜的動脈病毒（ar ter卜 v i r u s ) ( I b丨d ·,二月1 , 1 9 91 )，該病毒成功地在猪陆跑呑 噬細胞中及CL1621领胞中生長（Benfidd等人，J. Vet, Diagn. Invest·, 4:127-133，1992; Collins等人，
Swine Infertility and Respiration Syndrome/ Myster y Swine Disease, . Proc·， Minnesota S w ί m e Conf eren-ce for Veterinarians, pp· 200-205, 1991)，且在 MARC -4 一 517085 、 A6 _B6_ 五、發明説明（今） -145細胞中生長（Joo, PRRS: Diagnosis, Proc·, Allen D. Leman Swine Conmference, Veterinary Continuing Education and Extension, University of Minnesota (1993) , 20 : 53-55) ◊對可造成SIRS之病毒成功的培養亦 在 Wensvoort等人（Mystery Swine Disease in the Nether 1 ands ： The Isolation of Lelystad Virus. Vet Quart, 13:12卜 130)中報導。 在美國發生的P R R S已經危害到繫隻農場工采上°在 加拿大，P R R S在母藉上會持續至多二週的厭食及發熱的特 徵，後期為流産、增加死胎率、生出譆弱的豬隻以及快速 的腹式呼吸及腹瀉而造成初生小豬死亡°從事於分離該造 成PRRS的病毒、診斷PRRS感染以及對抗PRRS病毒的疫苗的 發展皆已發表出（見於加拿大專利公開案第2076744號； PCT國際專利公開案W093/03760 ; PCT國際專利公開案W093 /0621 1;及PCT國際專利公開案ν〇93/0789δ) ·:， 在找尋PRRS的引起因子中發現的第二病毒鐘株為引起 現今所知的繁殖性及壞死性肺炎（ ΡΝΡ )之疾病：該Ρ丨IP的症 狀及造成該疾病的病毒之病因學顯然是相似於p R R s及其相 對應的病毒，但是在鑑定上郤有不同，例如’一般相信該 病毒為一非傳統的或非典型的豬隻流行性感染A病毒（ 經濟部中央標準局8工消費合作社印« aSIV 卜 . P IIP臨床上的主要徵狀為發燒、呼吸困難及腹式呼吸 對不同年龄的豬隻皆有影響，但該多的狀是發生在4 至1 6週大的豬隻上。被惑染豬隻的肺部在稠度上為散布著 32. 9. 6,000 517085 Α6 Β6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（么） 红色且為多肉（Col丨ins A· A.S. P.,九月/十月1991，pP 7-Π)。相反的，觀察為PRRS所影響的豬隻主要為初生的豬 隻（少於3週大），對其肺部傷害。 腦越心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus EMCV )是造成對間質組織有嚴重影響之肺炎的病毒，且其具有 對間質組織有嚴重影響性、壞死性及鈣化性心肌炎。在實 驗上’ EMCV造成被感染影響的母豬無法生育（Kis等人J. Vet· Diagn. Invest·,1:101-104 (1989);Links 等人，Aus t · V e r · J .，6 2 3 : 15 0 -15 2 (19 8 δ ) ; L o v e 等人，A u s t · V e t. J·，63 :128-129 (1986)。 近來，在美國中部，發生較具有病毒性形式的PRRS， 且在3-8週大的豬隻中發生率增加：一般而言，健康的3-5 週大豬斷奶，且其後5-7天即生病。對受感染的豬隻的組 織中病毒作例行的鑑定方法而顯示岀豬隻流行性感冒病毒 (S IV .) ·、偽狂犬病毒（p s e u d 〇 r a b i e s V i「u s P R V)及肺炎徵 漿菌並無法該新的PRRS形式相結合。 本發明主要是有關一疫苗，其可保護豬隻免受造成該 新且更具病毒性形式的PRRS的傳染因子所傳染，及産生與 施用該疫苗的方法，以及一编碼造成該新的PRRS形式傳染 因子的基因组之部份DN A。但是，一般相信，在發展本發 明的期間所得到的資料是可使吊於_發展保護豬隻對抗任一 且/或所有的豬隻呼吸性及生殖性疾病的疫苗與方法：洌 如，本發明的發明人定出至少一 PRRS病毒的病理學的特性 ，其是不同於見前所公開的PRRS病毒的病理學ί見於下表 (請先閲讀分面之注念事項再堉寫本 丨裝. 訂. l·線· 本紙張尺沒適用中國國家橒準（CNS)甲4规格（210 X 297 乂分） 32. 9. 6.000 517085 經济部中央標準局员工消費合作社印製 . A6 B6_五、發明説明（f) I )。因此本發明益不須限定於有関造成該新的PRRS形式 傳染性因子的疫苗及方法，然該新的PRRS形式被本發明發 明人稱為PRRS病毒（PRRSV)的〃愛荷華議株〃（I〇wa strain) 0 然而，在有関發展有效對抗豬病毒之技藝中已有悲觀 論及懷疑論的表示（The Veterinary Record, October 26 ,1991)。然而在此技藝中已存在人類流行性感冒疫苗可能 可提供一些對抗PRRS及PNP效用之保護的信念（例如見於 Ibid·,七月6,1991)。但是在一餵食的動物中使用人體 疫苗一般為管理機構所阻撓，且因此，該方法在真正的實 施上是不可行的（Ibid.)。· 該豬隻養殖工業已為且將會繼續為該些豬生殖性及呼 吸性疾病與其新變化所惑染，只要該疾病出現。令人驚訝 的是，在美國及世界各地中動物疫苗市場是大於人證疫苗 市場。因此，有一經濟上的誘因去發展出新的家畜疫苗， 及以因保護農場中動物免受該疾病所衍生出的實質上公眾 健康利益。 本發明摘要 因此，本發明之目的為提供一新穎疫S，其可保護豬 隻對抗造成豬呼吸性及生殖性疾病的病毒。 本發明更進一步之目的為提供一疫苗，其可保護豬隻 對抗PRRSV的愛苘華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一疫苗，其可引起一有 (請先閲讀分面之注意事項再塡寫本頁 d 丨裝· 訂. 本纸张尺/f適用中®國家橒準（CNS)甲4规格（210 X 297公分） S2. 9. 6,000 517085 A6 B6 五、發明説明（6) (請先閲讀咨面之注意事項再堉寫本頁j 效的免疫反應，以對抗造成豬呼吸性及生殖性疾病病毒， 更待別的是對抗PRRSV之愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一新穎方法，其可保護 豬隻對抗造成豬呼吸性及生殖性疾病病毒的惑染，更特別 的是對抗PRRSV之愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一新穎方法，其可在豬 隻中引起一有效的免疫反應，以對抗造成豬呼吸性及生殖 性疾病之病毒，更特別的是對抗PRRSV之愛荷華_株。 •裝- 本發明更進一步之目的為提供一抗體，其可在免疫上 可结合至造成豬呼吸性及生殖性疾病的病毒，更特別的是 PRRSV之愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一抗霞，其可在免疫上 可结合疫苗，該疫苗可保護豬隻對抗造成豬呼吸性及生殖 性疾病的病毒之感染。 本發明更進一步之目的為提供一抗疆，其可在免疫上 可结合疫苗，該疫苗可保護豬隻對抗PRRSV之愛荷華議株 本發明更進一步之目的為對患有豬隻呼吸性及生殖性 疾病的豬隻提供一治療方法，更特別的是對患有PRRSV之 愛荷華_株豬隻。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本發明更進一步之目的為提供分析豬隻呼吸性及生殖 性疾病的診斷組套，更持別的是對PRRSV之愛荷華_株的 診斷組套。 本發明更進一步之目的為提供由造成豬呼吸性及生殖 -8 - 82. 9. 6,000 本纸張尺度迺用中國國家標準（CNS)甲4規烙（210 X 297公釐） 517085 * A6 B6 五、發明説明（^ ) 性疾病的4毒或傳染性因子之基因組中分離出的聚核苷酸 ，更特別的是由PRRSV之愛荷華_株所得的聚核苷酸。 本發明更進一步之目的為提供由一或多编碼造成豬呼 吸性及生殖性疾病的病毒或傳染性因子的蛋白質之聚核苷 酸，更持別的是由PRRSV之愛荷華菌株所得的聚核苷酸。 本發明更進一步之目的為提供由一或多缳碼造成豬呼 吸性及生殖性疾病的病毒或傳染性因子中，更待別的是由 PRRSV之愛荷華顔株中，所得的一或多値抗原性胜肽。 本發明更進一步之目的為提供使用合適的細胞株培養 豬隻生殖性及呼吸性病毒或傳染因子。 在此及其它目的，於下.列較佳實施例説明下會被得明 白，該等目的是可藉由保護豬隻對抗由造成豬呼吸性及生 殖性疾病的病毒或傳染性因子之感染、一可對造成該些豬 隻疾病的病毒或傳染因子引起免疫上反應之組合物、保護 豬隻對抗造成該些豬隻疾病的病毒或傳染因子惑染而可避 免傳染、及以編碼造成呼吸性及生殖性疾病的病毒或傳染 因子之基因組的部份之DNA。 圖示的簡單說明 第1圖為産生修飾過之活疫Μ流程圖； 經濟部中央標準局R工消費合作社印製 第2圖為_産生修飾過之失去活性疫苗流程圖； -第3圖為産生次單元疫苗概要步翳的流程圖； 第4圖為産生基因工程疫苗槪要步驟的流程圖： 第5及6圖顯示以感染因子樣品惑染10天後傳统豬隻 -9 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7 五、發明説明（彳） 肺部的組織切面，該樣品是由M PRRSV之愛荷華_株所感 染之豬隻中分離； 第7圖顯示Μ感染因子樣品感染9天後gnotobi otic豬 隻肺部的組織切面，該樣品是由M PRRSV之愛荷華菌株所 感染之豬隻中分離； 第8圖顯示Μ感染因子樣品感染35天後生物有擇的（ gnotobiotic)豬隻心臟損害的情況，該樣品是由以PRRSV 之愛荷華菌株所感染之豬隻中分離； 第9圖顯示顯現出大量合包體的支氣管一肺胞的培養 物，其為Μ感染因子的肺部過濾樣品感染9天後由生物有 擇的（gnotobiotic)豬隻中製備的，該過據樣品是由Μ PRRSV之愛荷華麵株所感染之豬隻中分離； 第10圖為具被膜的病毒粒子電子顯微鏡圖，其直徑約 70nm，且具有短的表面針狀體，該病毒是在Μ與PRRSV之 愛荷華_株所感染之豬隻的肺包呑噬細胞培養物中發現； 第11圖為多形且具被膜的病毒粒子電子顯微鏡圖，其 大小約為80X320nm，且塗覆著抗體，該病毒是在以與 PRRSV之愛荷華菌株所感染之豬隻的肺包吞噬細胞培養物 中發現； 第12(A)至（C〉圖為一連串的顯示豬隻胞肺吞噬細胞培 養物的照片：未感染（A)、以ISU-12感染所得CPE(B)M及 MISU-12感染所得的IFA(C)(見於下述的實驗]I); 第13(A)至（D)圖為一連串的顯示PSP-36細胞培養物的 照片：未感染（A)、在4 DPI下MISU-12感染所得的CPE(B) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
~ 10- 517085 A6 B6 __ 五、發明説明（/C?) 基因組之31938bp 3’端的核苷酸序列。 第20圖顯示出藉由编碼第18圖的DHA所缤繹出的胺基 酸序列，其列於核苷酸序列下方； 第21圖比較愛荷華菌株（ISU-12)相结合的感染因子的 核苷酸序列，以及萊西斯倍德（Lelystad)病毒有關開放式 閲讀架構-5 (0RF-5)的核苷酸序列； 第22圖比較ISU-12病毒的ORF-6與萊西斯倍德（ L e丨y s t a d)病毒的0 R F - 6的核苦锻序列； 第23圖比較ISU-12病毒的0RF-7舆萊西斯倍德（ Lelystad)病毒的0RF-7的核苷酸序列； 第2 4圖比較IS U -1 2病毒與萊西斯倍德（L e 1 y s t a d )病毒 的3‘非轉譯區的核苷_序列； 第25圖顯示未惑染的1>丨以(^11^丨2^蛋細跑均質疲（ HI-FIVEH,Invetitrogen, San Diego, California) > 第26圖顏示以一含有ISU-12 ORF-6基因的重組捍狀病 毒所感染的H I-F IVE細跑，其亦顯示出細胞病態的效用； 第27圖顯示以一含有ISU-12 0RF-7基因的重組捍狀病 毒所感染的H I-F IVΕ細胞，其亦顯示出細胞病態的效兩； 絰濟部中央標準局員工消費合作社印製 第2 8圖顯示Η I ·* F IV Ε細胞’其以含有IS U - 1 2 0 R F - 6基 因的重組捍狀病毒所惑染、以豬隻對I s U - 1 2的抗血清加以 染色、而後以綴合螢光劑的抗豬隻1sG染色之’其中該昆 蟲細狍可藉由編碼該ISU-12 0RP-6基因而産生重Μ蛋白質 > 第29圖顯示HI-FIVE細胞’其以含有IS U-l 2 OR F-7基 -12 - 1517085 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五 - A6 _Ββ__ 發明説明（// ) 因的重組桿狀病毒所感染、以藉隻封IS Ιί - 1 2的抗血清加以 染色、而後以缀合螢光劑的抗豬隻IgG染色之，其中該昆 蟲細胞可藉由編碼該ISU-12 0RP-7基因而産生重組蛋白質 第30圖顯示使用ISU-12專一的引子作0RF-5 (道E) 、0RF-6 (道M)及0RF-7 (道NP) PCR放大的結果，其中道 SM含有分子量標準物； 第31圖顯示表現重組桿狀病毒傳遞載體PU1393的结 杲，在以BamHI及EcoRI限制酶裂解該質饅DNi\fe，其含有 ISU-12基因組的 0RF (道 E) 、0RF-6 (道 M)及 0RF-7 (道 NP)，道SM含有分子量標準物； 第3 2圖顯不IS ϋ 12 m R N A北方點墨结果； 第33A及33B圖顯示mRHA北方點墨结果，該mRNA是由P RRSV之愛荷華_株之其它分離菌株（ISU-22、ISU-55、ISU -79、ISU-1894 及 ISU-3927)所取得的； 第34圖為平均整個肺部受損程度的長條圖（受影響 的肺％ )，其為對3週大、P R R S V血清陰性反蘑、且專一為 不臭_原（SPF)的豬隻以鼻腔内接種（1丨'丨）或是肌肉注射（IM )施用本發明疫苗的實施例，以及一組控制組的豬隻（NV/ CHALL):， 較佳實施例的詳細說明 在本發明中，〃豬隻呼吸性及生殖性疾病"是指前所 述的PRRS、PNP及EMCV等疾病，該疾病是由PRRSV以及該疾 (4*.1先《讀背Φ之注意事項再塡寫本 ,1 -丨裝· 訂· .線. £ £ 女 517085 . A6 _B6_ 五、發明説明（/» 病十分相関的變種所導致的，該些變種是已出現，且是在 未來將會出現。 保護豬隻對抗由豬隻呼吸性與生殖性疾病病毒或感染 因子所引起的疾病，若在對感染的豬隻施用該疫苗後，在 肺中的損害程度或該疾病病徵不會出現或不會像感染且未 受保護的豬隻嚴重。且若在將該疫苗施用感染豬隻後，肺 中的損害程度或該疾病病徵是會被消除或是不會如感染且 未受保護的豬隻嚴重。一未感染的豬隻是一不曽暴露於該 呼吸性且生殖性疾病感染感因，或是曾暴露於該呼吸性且 生殖性疾病感染感因但無顯示岀該疾病病®的豬隻。一感 染豬隻是一顯出該疾病病歡的豬隻。該呼吸性及生殖疾病 可定量或定岀級數（例如溫度/發熱、肺的損害程度〔惑 染肺組識的百分率〕或半定量（例如壓迫穿迫的籟重性〔 詳細解釋如下〕。 〃豬隻呼吸性與生殖性疾病病毒或感染因子"造成如 上所述豬隻呼吸性及生殖性疾病。 造成新且更具病毒性形式的PRRS之因子已稱為PRRS病 毒的〃愛荷華〃菌株，其具有相同於，但比其它豬隻呼吸 性及生殖性疾病更嚴重的的病丨敦。臨床上的徵兆可能包含 昏睡、呼吸窘迫、〃聪呼急促（t h u m ρ i n g ) 〃 （闱力呼氣） 絰濟部中央標準局貝工消費合作社印製 ^ •、發燒、打噴涕、咳嗽、眼睛浮腫以及一般的結膜炎。其 損害包含整證且/或徵小的肺部損害或心肌炎。感染因子 可為一單一病毒或可與一或多額外的惑染因子相结合（㈣ 如其它病毒或細_ )。此外，已發現較低病毒性形式的愛 -14 一 32. 9. 6,000 本紙張尺度通用中國國家橒準（CNS)甲4規格（210 X 297公分） 517085 A6 B6 五、發明説明（/多） 荷華菌株，其可造成較次级的上述病徵或是根本不造成病 歡，但不論如何，其可眩據本發明加以使用，以提供對抗 生殖性及呼吸性疾病。 * 在各種発隻疾病中組織上的損害是不同的，表I為比 較由豬隻病毒造成的許多疾病結合的損害之生理上的觀察 以及病菌。
表I 豬隻病毒肺炎的病理比較 (¾先閲讀背面之注意事項再塡寫本
損害 PRRS(p) PHRS(o) SIV PNP PRCV PPMV « 菏華 型i 組織間質變厚 肺胞滲岀液 氣道壞死 合胞體 腦炎 心肌炎 + + + + -H- + 裝 -H- + + +/- -M* + 訂 線 其中”PRRS(p)”代表PRRS病毒已公開的病理結果，其中”PR RS (ο) ”代表本發明的發明人所觀察到的病理結果，”SIV” 代表豬隻流行性惑冒病毒，”PRCV”代表豬隻呼吸性冠狀病 毒，”PPMV”代表類黏液病毒，〃愛荷華"是指本案發明人 發現的_株，〃型2 "是指型3肺胞（在感染豬 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 紙 本 ft-r-T 匕B Γί 是 死 ： 隳度 的程 er'上較 nt端比 Γ 终性 ， 道 重 ) 氣嚴 的在的 ¾七ΤΞT 增是如 中- 指 隻死是 道 空 響 影 有 )¾ + 及 I 號 符 且 15 517085 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 . A6 _B6_五、發明説明（/0) (-:）： 陰性反應（未觀察到） ( + ): 輕徵反應（只比可觀察到略高） (+ + ): 中等反應 (+ + + ): 嚴重反應 (+ + + + ):十分嚴重反應。 PRRSV的愛荷華菌株已為本案發明人在美國中部加以鐙 定，其結合著PRRS。現在還不清楚當PRRSV的愛荷華菌株 自然地被發現是否有疾病與其相结合，而該疾病是因單一 病毒或是一或多額外的感染因子的结合。但是，PRRSV的 愛荷華園株斑點細化樣品顯然是一單旦ig —的病毒。因此 ，PRRSV的愛Μ華@株是指惟一、斑點纯化病毒或為由惑 染動物饅中所得的組織均質詨，該動物護含有一病毒以及 一（或多.）額外的感染因子，且，以PRRSV的愛苘華鍾洙 感染的豬隻，如前所述，顯示出由PRRSV的愛苘華菌株造 成的疾病一或多病歡的持歡。 近來的證據顯示PRRSV的愛荷華_株不同於造成傳统 PRRS的感染因子。例如，在感染豬隻中所觀察到的損害， 顯示出由PRRSV的愛苘華_株所造成的疾病病徵是比單獨 以傳統上、前述的PRRS病毒感染所觀察到的損害更為蔌重 ，且患有PRRSV的愛荷華_咮所造成疾病的豬隻對流行姓 感冒，包含结合著ΡΝΡ之病毒，為血清陰性反慝〃 見第1至4圖，其提供製備本發明所包含的各種形式 的疫苗之步驟流程圖，第1至4圖的流程可提供作為産生 本發明疫苗的例示方法，而非欲以任何的方式加以限制本 -16 - (請先閲讀背面乏注^事項再填寫本 裝· .ΤΓ· 丨線· 太柄饵尺垮τ·ϋ W + 玄过並甲4相技y ?Q7，,、哧、 R2. 9. 6.00Ω 517085 A6 ___B6_ 五、發明説明（/i^) 發明。 在詳述於第1至4圖的每一步驟之第一步翳是鑑定出 一細胞株’其十分容易為豬隻呼吸性及生殖性病毒或感染 因子所感染（為簡化有關疫苗製備的討論，〃病毒〃一詞 是指結合有豬隻呼吸性及生殖性疾病的病毒且/或感染成 因），而後製備可易感染的宿主細胞的主要細胞儲液（MCS )，下該易感染細胞鼠續的轉種超過MCS，工作細跑儲液（ yCK)是由在MCS與MCS + n間的轉種的細胞中加以製備而得的 〇 一主要的種子病毒在容易感染的绚胞，在MCS及MCS + n 間，較佳是WCS中增殖。該原始病毒是藉由該技衔中已知 的方法，由合適的且較佳是均質化的組缇樣品中分離出， 該樣品是採自於顯示出相對於由該有輿趣的病毒中所造成 的疾病病徵之感染豬隻。一合適的宿主鈿胞，較佳是WCS 的樣品，以原始病毒感染，而後培養之··其後由該感染的 培養細胞中藉由巳知方法分離且斑點纯化出該疫苗病毒。 較佳是，使甩於製備疫苗的病毒為斑點纯化三次的 經濟部中央標準局β：工消費合作社印製 而後藉由已知方法，由該斑點纯化病毒中製備出主要 的種子病毒（MSV)。該MSV(X.)在WCS中，绖由MSV(X+1)、MS C «·Χ + 2)、MSC (X + 3)及MSC (X + 4)病毒的轉種而作至少四次轉 種：該MSC (X+ 4)被認為是工作的種子病毒。較佳的’使用 豬隻研究及本發明的疫苗産物的轉種之病毒為MSC ( x + 5 ) ’ 第五次轉種的産物·:· 在與工作細胞儲液结合’該工作種子病毒是藉由已知 -17 - 32. 9. 6,000 本纸張尺度適用中S國家標準（CNS)甲4規格（21〇 X 2町公货 517085 A6 B6 五、發明説明（/厶） 方法用一足夠量加以培養，以製備一原型疫Μ，較佳是 MSC (Χ + 5)。在此的原型病毒疫苗可為任何合適使用於獸醫 醫學上之型。合適的型包含修飾過的活或減毒疫苗（第1 圖）、一失去活性或已死的疫苗（第2圖）、一次單元疫 苗（第3圖）、一基因工程疫苗（第4圖）、以及其它在 獸醫學疫苗技技中所認知的其它型疫苗死的疫苗可藉 由化學處理或加熱等，以熟習此技藝人士所知的方式，使 其失去活性。 在第1至4圖中每一個所列出的步認，而後製備一原 型的疫苗，豬隻有效模式及臨床分析是以在該技術中已知 的方法加以進行。例如，在進行真正的疫苗接種/有效研 究，被預防且/或被處理的疾病必須以其病、臨床分析 結果、及病況等加以界定。如上所述，结合於PRRSV愛苘 華菌株的感染因子以病歡及病況加以界定.。該結合於 PRRSV愛荷華菌株的感染因子的臨床分析在下的實施洌中 描述。 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 在疾病充份界定出及定出持性後，可對豬隻施周一 原型疫，而後將該豬隻暴露於造成該疾病的病毒或感染 因子中。此為已知技術中的挑戰（cha 1丨eng i ng )豬隻及其 免疫条統的有效性的方法：在觀察已受挑戰且暴露於病毒 或感染因子的豬隻，且分析該原型疫苗保護豬隻的能力後 ，可用在該技術中已知的方法作效力的研究。而级藉由在 該技術中已知方法， 在一分離步驟中發展出可能的分析 方法，且後可産生出一連串大量被認知的疫苗（pre H cenc -13 - 32. 9. 6,000 本纸張尺·度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 517085 A6 B6 f
r I 五、發明説明（/^7) i ng se i a 1 s) 0 在製備列大綱於第1圖的修飾活疫ffl中，一旦製備出 原型疫苗，細胞生長條件及病毒産生首先是要最適宜的， 而後藉由該技術中已知方法製備岀産生的槪要。一旦該生 産概要製備出，其後可藉由在技術中已知的方法作一連串 大量被認知的疫苗（prelicensing serials)。産生一連串 大量被認知的疫苗（P r e 1 i c e n c i n g s e i a 1 s )是指大量産生 一許可的原型疫苗，該疫苗可顯示作一連串的生産且合乎 標準。——製備原型活病毒的方法是使該病毒感染的細胞（ 較佳是主要種子細胞）經歴一或多次的冷凍及多凍的循環 ，以使該細胞溶胞。該冷凍且解冷的感染細胞培養物質可 冷凍乾燥以增強儲存上的保存性。在再度覆水後，該物質 可使用作為一活疫苗。 製備一連串大量被認知的失去活性疫苗的步驟（第2 圖）是相似於使用於修飾性活疫苗的製備方法，僅具有一 基本上的修飾。在使細胞生長筷件及病毒産生步驟最適i宜 化後，一病毒失去活性的步驟是必須在製備該合適的産生 概要前使其最最適宜化。使病毒失去活性的步驟及其最適 宜的方法一般為熟習此技藝人士所知嘵的，其可能以一已 知或預期的方法加以變it，此與所研究的特殊病毒有有_ Ο 製備一次單元疫苗（第3圖）是不同於修飾過活疫苗 或是失去活性的疫苗製備方法。在製晴該原型疫3前’該 疫苗病毒的保護性或抗原性成份必須先鐙定出。該保護性 _ 19 _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 32. 9. 6,000 (請t閲讀背¾之注专？事項再塡寫本頁1 裝· 訂· 517085 A6 B6 絰濟部中夹標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（/(f) 或抗原性成份包含一些胺基酸片斷或在病毒鞘蛋白的片斷 ，其可在豬隻中引起持別強的保護性或免疫性反應（其較 佳至少長度為5胺基酸，特別佳是長度為10胺基酸）。單 或多病毒鞘蛋白自己或其寡聚物，以及形成該病毒次結構 或可鑑定出的部份的病毒鞘蛋白之高级組合，或該次結構 的單元；在病毒表面或接近表面上存在的寡_苷酸、隨苷 化脂質或醣苷化蛋白，例如核蛋白；脂蛋白或與病毒相 結合的脂質等。該些成份藉由在該技術中已知的方法加以 鑑定。一旦鑑定出，其後藉由在該技術中已知的方法纯化 且/或選殖出該保護性或抗原性的病毒部份（該"次單元 ")〇 製備一連串大量被認知的次單元疫苗的步驟（第3圖 )是相似於使用失去活性疫苗的製備方法，但有些修飾： 例如，該次單元是藉由重組基因技術産生的，該選殖出的 次單元表現是可藉由在該技術中已知的方法使其最佳化的 (見於，例如M a n i a t ί s等人Μ ο 1 e c u丨a r C丨ο η丨n g : ή Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Cold Spring Harbor, Massachusetts相關部份 )。在另一方面，若所使用的次單元為代表該病毒整體结 構待性者，如鞘蛋白，由病毒中分離的步驟必須使其最適 宜化。在任何情況，在使其失去活性的步驟最適宜化徵’ 該次單元纯化步驟可在製備該産生槪要前使其最適宜化： 基因工程疫苗（第4圖）使用製備其它疫a —般的步 驟作修籂開始，在斑點纯化後，該野生型病毒可甶一合適 -20 - (請先閲讀脊面之注意事項再項寫本 丨裝· . 丨線. 本纸張尺片逋用中as玄櫺準（CNS)甲4找格（210 X 297公分） S2. 9. 6.000 517085 A6 B6 _ -- 11 _ " 1 ' " ......... -- 五、發明説明（/f) 的組織均質液中藉由該技術中已知的方法分離出，較佳是 藉由使用PSP-36或呑噬細胞作為宿主的傳統細胞培養方法 Ο 該RN A是藉由該技術中已知的方法，由生物上為純的病 毒或感染因子萃取出，較佳是使用商業上可取得的RN A分 析套組（例如，得自 Stratagene, La Jolla, Calif「nia) 藉由異硫氡酸胍方法，且藉由在該技術中已知的方法纯化 ，較佳是藉由在CsCl梯度中作超高度離心。RNA可藉由寡（ dT)-纖維素管柱層析法純化或增多c. 該病毒基因Μ還藉由在該技術中已知的方法殖入一合 適易宿主中（見上所引述的Maniatis等人），而後分析該 病毒基因以決定出産生病毒抗原部份的基因組中的必須區 域。此後，該步驟是相同於飾修過的活疫苗、失去活性的 疫苗或次單元疫苗的步驟。 經濟部中央標準局R工消費合作社印製 本發明的疫苗可保護豬隻對抗造成豬隻生殖控及呼吸 性疾病的病毒或感染因子。較佳是本發明疫S可保護豬隻 對抗與PRRSV愛荷華菌株结合的惑染因子°且，本發明的 疫苗亦可預期可保護豬隻對抗藉由將其暴露於與PRRSV愛 荷華®株相结合之感染因子的十分接近的變種所惑染◊ 相當少病毒是可作於.製備活病毒没:® °‘該活病壽S @ 的優點是在得至該疫苗後，可能活化免疫反應，其包含条 統性、局部性、體液及細胞居間的免疫反蘑。該活病毒疫 苗的缺點在於其有為活的偶發因子，如sv40或牛病毒性铜 疾的病毒（一通常污染胎牛血清）所污染的可能此危險 本纸张尺度適用中@國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 32 517085 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 _ A6 _B6 _ 五、發明説明（>〇) ，再加上該病毒可在該領域中可轉變成具病毒性或對胎兒 或幼動物不具減毒性的危險，是可能比活疫苗的優點更重 要。 失去活性病毒疫苗是藉由以失活試劑，如福馬林或有 機溶劑、酸等處理該病毒，藉由以紫外光或X-光照射、藉 由加熱等方法而加以製備。使其失去活性是以在該技術中 已知的方法加以進行。若一病毒不能感染易感染細胞，該 病毒被認為失去活性。洌如，在化學失去活性中，合適的 病毐含有病毒的血清樣品在足夠局（或低）的溫度或ρ Η 下，以足夠量或濃度的失活試劑處理足夠長的時間，以（吏 該病毒失去活性。藉由加熱而失去活性是可在一溫度下進 行足夠使病毒失去活性的足夠長時間。藉由使用光的一 波長或其能源照射進行足夠的長度，以使病毒失去活性。 人體之失去活性的疫苗之例子包含流行性感冒疫苗、小兒 癖痺症、狂犬病、Β型肝炎。使用於豬隻中的失去活性疫 苗之一成功且有效的例子為猪隻小病毒（P a r ν ο ν i r u s )疫苗 〇 次單7G病毒疫苗是藉由如在第3圖所討論的方法’由 纯化病毒次單元中加以製備而得的，例如由流行性惑冒病 毒中所分離的红血球凝集素以及由流行性惑冨病毒中分雞 出的神經氨酸苷誨表面抗原皆可製備出，且顯示出比整體 病毒更低的毒性。或者，該次單元可由高度纯it的病毒次 單元中加以製備，在人疆中的例子為人饅B型肝炎的22-η m表面抗原。人證單純疱疹病毒的次單元及其許多其它使 -22 - (請先閱讀谇面之注意事項再塡寫本一一 丨裝· 訂· .線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公坌） S2. 9. 6,000 517085 A6 B6 蛵濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明) 用於人證中次單元疫苗的例子已知的。 減毒病毒疫苗可在自然中發現且為自然發生的基因刪 除（gene deletion.)或者，可藉由各種已知方法，如在細 胞培或組織培養中作一連串的轉種，加以製備。病毒可藉 由基因刪除或基因突變而造成減毒。 基因工程疫苗可藉由在該技術中已知方法加以産生， 該些技術包含使用重組DM技術及使用活病毒技衔·:·例如 ，一些病蛋白質毒基因可鑑定出為编碼在豬隻中引發較能 免疫或保護性反應的蛋白質基因。該鑑定#的基因可選殖 入一合適的表現載體，例如捍狀病毒載體，且使闱其去感 染合適的宿主細胞（見於，例如(TReiHy等人"Baculo-virus Expression Vecors: A Lab Manual , f,Freeman & Co . Π992)。培養該宿主細胞，而後表現出所欲的疫苗蛋 白質，其可純化至所欲的程度，再使用於保護豬隻避免呼 吸性及生殖性疾病。。 基因工程的蛋白質可在昆蟲細跑中、酵母菌或哺乳動 物細胞中表現。該基因工程蛋白質，其藉由傳统方法純化 且/或分雞，而後可直接接種於動物中而使動物受保護以 對抗豬隻生殖性及呼吸疾病。由豬隻生殖性及呼吸疾病惑 染因子或病毒所得的被膜蛋白可使m於疫苗中以産生可中 _ 和的抗體。豬隻生殖性及呼吸疾病惑-染因子所得的核蛋白 亦可使用於疫苗中以引發細胞性免疫反應。 較佳是，本發明以一含有由PRRSV愛苘華菌株所得的 聚核苷酸的轉移載體性狀轉變昆蟲細胞洙（HI-FIVE) ’較 -23 - (請先閱讀资面之注意事項再填寫本 ,¾ •裝. 訂· 線· 本紙張尺度適用中®國家橒準（CNS)甲4规格（210 X 297公分） S2. 9. 6.000 517085 . A6 _B6_ 五、發明説明（）>) 佳的是，本發明的轉移載體包含直線形的桿狀病毒DN A及 一含有由PRRSV愛荷華議株所得的聚核苷酸的質證。該宿 主細狍可與一直線形的桿狀病毒DN A及一質體共同作性狀 感染，如此可製出重组的捍狀病毒。更特别且較佳的是， 本發明的聚核苷酸編碼一‘或多PRRSV愛荷華鐘株的蛋白質 〇 或者，由一豬隻生殖性及呼吸性疾病感染因子或病毒 中所得之編碼一或多被膜蛋白且/或核蛋白的RNA或DHA可 以插入活載體中，例如天花病毒或痲疹病毒，且可使用作 為一疫苗。 因此，本發明更進一步是有關一由含有造成呼趿性及 生殖性疾病的病毒之基因组的一部份所分離岀的聚核苷_ ，較佳是該聚核苷酸是由PRRSV愛苘華菌株的基因组所分 離而得。此一詞〃聚核苷酸〃是指RKA或DNA，以及相對隋 或互補於由感染因子所得的RN A或DNA之RM或cDHA。本發 明的聚核苷酸可作為産生本發明疫苗的工具、篩選或鑑定 感染動物的工具，以及鑑定出相關的病毒及惑染因子等實 闱性。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 在本發明的一實施例中，該聚核苷該编碼一或多造成 呼啜性及性殖性疾病的病毒的蛋白質，較佳是一或多該病 毒的膜（被膜）蛋白以及該鞘蛋白（核蛋白.）。更持別佳 的是，本發明聚聚合钧是由基因組3 端的2kbH斷所取得 ，且編碼一或多由0RF-5及0RF-6所編的被膜蛋白且/或 由PRRSV愛荷華菌株基因組的0RF-7所編碼的核蛋白質◊最 一 24 - 32. 9. 6,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 517085 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（>子） 佳的是，該聚核苷酸是由一與PRRSV愛荷華菌株相結合的 感染因子之基因組分離而得的；例如，在下實驗I 一 I ( ISU-12)如所述的因，子Μ及選自由0RF-5 (序列辨識編號 :10)、0RF-6 (序列辨識编號：13)、0RF-7 (序列辨識 編號：16)及ISU-12基因組的1938bp之3’端序列（序列辨 識編號：8)。 在本申請案的下文中，由病毒或感染因子得至的RN4 且/或DNA所編碼之蛋白質或胜呔，若該聚核苷酸與編碼 免疫抗原蛋白質或胜肽的聚核苷酸有大於90%的相似性， 則被認為是〃在免疫上是相當的〃。在本申請案中的〃相 似性"是指在二或多因感染因子病毒中完全相同的核苷酸 或胺基酸序列。因此，本發明的另一方面包含一分離的聚 核苷酸，其至少有90%相似於由造成呼吸性及生殖性疾病 病毒的基因組所得的聚核苷酸，較佳是由與PRRSV愛荷華 菌株相結合的感染因子基因組所得的聚核苷酸。 在病毒基因組中聚核苷酸相當短的片斷（約20bp或更 長）可使用於篩選或鑑定感染動物，且/或鑑定出相關病 毒，其可藉由在此所述或熟習此技藝人士已知的方法加以 達成。因此，本發明的另一方面包含一分離（且若想要的 活，為純）的聚核苷酸，其基本上是由造成呼吸性及生殖 性疾病病毒的基因組之一部份得到的Η斷所組成，較佳是 由與PRRSV愛荷華菌株相結合的感染因子基因組所得的聚 核苷酸，其長度至少為20核苷酸，較佳是長度為20至100 核苷酸。更佳的是，本發明之分離聚核苷酸是由ISU-12基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 25 517085 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（:>幺） 因（序列辨識編號：8)的1938bp之3’端序列，最佳的則 為選自由序列辨識编號：1、序列辨識编號：2、序列辨識 編號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5、序列辨 識编號·· 6及序列辨識编號：7所組成的一族。 本發明的分離聚核苷酸片斷可由Μ合適的限制酶對相 對應（互補於）病毒聚核苷酸之cDNA作分解而得，或可使 用商業上可得的自動聚核苷酸合成器加以合成而得。 在本發明另一實施例中，聚核苷酸編碼一或多由造成 呼吸性及生殖性疾病病毒所得的抗原性肽，較佳是一或多 由與PRRSV的愛荷華菌株相結合的感染因子所得胜肽。如 上所述，本發明的聚核苷酸編碼一或多由造成呼吸性及生 殖性疾病病毒所得蛋白質的抗原一部份，較佳由與PRRSV 的愛荷華菌株相結合的感染因子所得者，其長度至少為5 胺基酸，較佳為長度至少10胺基酸。決定蛋白質上抗原部 份是熟習此技藝人士所熟知的。 本發明侑關藉由一或多PRRSV的愛荷華麵株之0RF ’ s編 碼的蛋白質，較佳的是，該蛋白質為由選自序列辨識編號 :8、序列辨識编號：13、序列辨識编號：15、序列辨識 编號：18及序列辨識编號：19 (見於序列辨識编號·· 9，11 ，14與17)所組成之一族之聚核苷酸序列所編碼者。本發 明的蛋白質及抗原胜呔可使用於對對暴露於PRRSV ，特別 是PRRSV的愛荷華菌株，的豬隻作血清測試。 本發明更進一步是有關造成豬隻生殖性及呼吸性疾病 的病毒或感染因子之生物上純的樣品，該疾病可藉由下列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 26 517085 A6 B6 絰濟部中央標準局员工消費合作社印製 第82110515號專利申請案之修正頁 修正曰：83年4月 五、發明説明（力T) 病徵加以定出持性：昏睡、呼吸窘迫、用力呼氣/發燒、 毛髮變粗、打噴涕、咳嗽、眼睛浮腫以及一般的結膜炎 。本發明病毒及感染因子的生物上纯樣品可更進一步的特 歡在於其可造成豬隻生殖性及呼吸性疾病，該疾病包含下 列組織上的損害：含整饅且/或微小的肺部損害、型]I肺 細胞、心肌炎、腦議炎、肺胞流出物的形成以及合胞體的 形成。〃生物上純的〃的一詞是指一病毒或惑染因子樣品 ，其是由單一親代所衍生的子代。通常，一"生物純〃的 樣品可藉由在細胞培養作3X斑點純化加以達成。更特別的 是，本發明的生物上纯病毒或感染因子是豬隻生殖性及呼 吸性病徵的愛荷華菌採，其樣品已寄存在布達偶斯協约下 的American Type Culture Collection’ 12301 Parkiawη D r i v e，R o c k v i Π e , M a r y 1 a n d 2 0 8 5 2 美 _ ’ 其於 1 9 9 2 年 10月2δ日寄存，所取得的編號VR 2385、VR 2386以及在 1993年 9 月 29 曰寄存者為的VR. 2428、VR 2429 、VR 2430-及 VR 2431 ： P R R S V的愛荷華菌株亦可以其111R Η A的北方點墨法疋出 持歡，例如，PRRSV的愛荷華窗株含有7或9 mRHA’s，其 在此為可能已刪除者。更待別的，在下實驗中述及的’該 PRRSV的愛荷華Μ株的mRNA含有至多4値可剛除區：· 本發明是有關一保護豬隻避免病毒惑染的組合物，其 為在一生理上可接受的載§1中包含有效量之本發明疫苗’ 以引起對造成豬隻生殖性及呼吸性疾病的病毒的免疫反應 - 27 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本 丨裝. 訂· .線· ^ ^ Ψ 4 (^]〇 V 9Q7 -Λ*ϋΡ· 'i 517085 A6 B6 經濟部中央標準局β工消費合作社印¾ 五、發明説明（Y) 本發明疫苗一有效量是可足份地對疫苗作免疫反應的 一量，其可引起保護一暴露於造成豬隻生殖性及呼吸性疾 病或相關疾病的病毒下之豬隻。較佳者，該豬隻是可保護 至一程度，可其顯著降低所預防疾病的一或所有的在生理 上有害的病徵或作用（例如肺部損害）。 該組合物以單一劑量或以重覆的劑量施給病人。該割 量包含，例如1至1000微克的病毒為基.礎的抗原（疫苗） ，且應不含有足夠造成一有害反應或感染生理上病徵的病 毒為基礎的抗原量。在該技術中用於決定活性抗原劑之合 適劑量的方法是已知的。 包含本發明疫苗的組合物可與佐劑一起施用，佐劑為 一物質，當結合於疫苗時，其可增加對本發明疫Μ的免疫 反蘑。該佐劑可與疫苗在同時、同處加以施甩或是不同時 ，例如，追加注射加以施用。佐劑較佳是對一動物於不同 於疫苗施用的方式、位置或定位之一方式或一位置或一定 位加以施用。佐劑包含氫氯化鋁、硫薛鋁鉀、熱不安定或 熱安定之由大腸捍菌所得的外毒素、霍亂毒素或其Β次單 元、白喉毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、F r e u η (Γ s不完 全佐劑、Freund · s完全佐劑及其類似物。毒素為基礎的佐 劑，如白喉毒素、破傷風毒素及百日咳毒素可在使用前度 其失去活性，例如以甲醛處理：‘ 本發明亦有關保護一豬隻避免感染而可對抗造成豬隻 呼吸性及生殖性疾病的病毒的方法，其包含施予有效量的 疫苗，該疫苗可對須要保護的豬隻引起抗該病毒的免疫叉 -28 - (請先閲讀t面之注念事項再堉寫本 裝· 訂· .線· ΓΓΝ.ς) Ψ ά 41 (?}〇 V ?Q7 Fi non 517085 A6 B6_ 五、發明説明 應，而可對抗該病毒的感染。藉由"保護豬隻避免感染" 以對抗該豬隻呼吸性及性殖性病毒或感染因子，其意味著 在本發明的疫苗施甩於豬隻後，該豬隻顯示，與控制組（ 感染豬隻）相比，可使該相對應疾病的病徵降低較不嚴重 或是不具臨床病徵（如發熱）。該臨床病徵可定量（例如 ，發燒、計算抗體且/或肺部的損害）t或半定量（例如 呼吸窘迫的嚴重性）。 在本發明中，計算在惑染豬隻中呼吸窘迫的条統是發 展出來的，本發明的臨床上呼吸分级条統是藉囱下洌標準 評估受感染豬隻的呼吸窘迫性： 〇二無疾病，正常呼吸 1 =當該豬隻受壓迫時（在大量的積體旦/或在一加 快的速度強迫下）有輕微的呼吸困難及呼吸急促 2二當豬隻在休息時，有輕徵的呼吸困難及呼吸急促 3 =當豬隻受壓迫時，有中等的呼吸困難及呼吸急促 4 =當豬隻在休息時，有中等的呼吸困難及呼吸急促 5 =當豬隻受壓迫時，有嚴重的呼吸困難及呼吸急浞 6 =當豬隻在休息時，有單重的呼吸困難及呼吸急促 本發明臨床上呼吸分级条統，分數"0 "為正常，且 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 顯示該豬隻並未為豬隻呼吸性及生殖性疾病所惑染，分數 〃 3 〃顯示該豬隻中等的呼吸性及生殖性疾病，分數6 〃顯示該豬隻簌重的呼吸性及生殖性疾病：若给予疫a或 組合物之同樣相受挑戰的一組豬隻顯示比不给予疫®或組 合物之同樣受挑戰的一組豬隻更低的平均臨床上病徽’則 -29 - 本紙張尺彦適用中國國家橒準（CNS)甲4規格（210 X 297公分） 32. 9. 6.000 517085 A6 Ββ_ 五、發明説明（^7) 本發明疫苗或組合物的量是認為有效的。（一豬隻被認為 "受挑戰"乃為當其暴露於足夠在一非接種疫苗的動物中 造成疾病的感染因子的濃度）。 較佳者為，本發明疫苗組合物為直接施予一尚未暴露 於造成生殖性及呼吸性疾病病毒之豬隻。本發明疫苗可口 服或腸胃道外施用。例如以腸胃道外路徑加以施用的例子 包含皮膚内、肌肉内、靜脈内、腹膜内、皮下及鼻内路徑 加以施用。 當以溶液加以施用時，本發明疫苗可以水溶液的形式 加以製備，可為一耱漿、香油或一酊劑。該配方是在該技 術中已知的，且可藉由在合適的溶劑条統中溶解抗原及其 它合適的添加劃加以製備。該溶_包含水、鹽水、乙ΐ享、 乙二醇、甘油、Α1流護等。在該技術中的合適的添加劑包 含一合格的染劑、香料、甜味劑及抗徵生物的防腐劑，如 t h i mr 〇sa 1 (乙基汞硫代水揚馥納.）。該溶液可安定化， 例如藉由加入部分水解的凝鏐、山梨諄或細跑培養培養基 ，其可使用該技術中已知的試劑，例如磷酸氫鈉、㈣酸二 氫銷、礤氫鉀且/或磷酸二氫鉀，藉由已知的方法加以 缓衝。 經濟部中央標準局8工消費合作社印製 液體配方可包含懸浮液及乳化液在該技術中，懸浮 液的製備，例如使用一嘐鏡粉碎器，及乳化液，例如使用 一均質器，皆為已知的。 等張性質是可以以氛化納及其它所需的S加以調整·： 其它溶劑，如乙醇或丙二諄，可使甩以增加該組合物成份 -30 - 太蝌徉尺垮鴂玥Φ«1Θ0它过迤甲4祚这y ?Q7 5、馑、 ^.9 q a non 517085 經濟部中夹標準局貝工消費合作社印製 - A6 _ B6_五、發明説明（>$ 的溶解度及該溶液的安定性。更進一步可使用於本發明配 方中的添加劑包含葡萄耱、傳統的抗氧化劑及傳統的螯合 劑，如乙撑基二胺四乙酸（EDTA)。 本潑明亦有關一産生本發明疫苗的方法，其包含下列 步驟： (A) 收集造成豬隻呼吸性及生殖性疾病的病毒或感染因 子，且 (B) 以下列所述的方式加以處理該病毒或感染因子，該 方式是選自由（i )斑點純化病毒或感染因子，（ii )在一溫 度下加熱該病毒及感染因子一段時間以fe該病毒或感染因 子失去活性，（m )將該病毒或感染因子暴露於一足夠使該 病毒或感染因子失去活性量的失活化學物或是與該量的失 活化學物混合，（iv .)將該病毒或感染因子分解成其相對應 的次單元，且分離出至少該次單元之一者，及（V )合成或 分離出編碼該病毒或感染因子的表面蛋白之聚核苷酸，以 該聚核苷酸感染一合適的宿主細胞，培養該宿主細咆，且 由該培養物中分離出該表面蛋白，等方式組成的一族。 較佳者，該病毒或感染因子是由培養物的培養基中藉 由下列步驟收集，該步驟（i )沈殼受感染的細胞，（u )將 該沈澱細胞溶胞以及（iii )在其後的處理前，先將該病毒或 感染因子離心。更佳的是，該病毒或感染因子所惑染的宿 主細胞在收集前，先培養在一合適的培養基中。 較佳的是，在培養該受感染的宿主細胞後，該受感染 的宿主細胞藉由將傳統上使用的聚（乙二醇）(PEG)溶液 (請先《讀背两之注意事項再堉寫本
•裝· 訂· •線· -31 - 517085 A6 B6 五、發明説明（今〇) 以一足夠使該受感染細胞沈澱的量加入該培養基中，以使 其沈澱。該沈餿的受感染細胞可更進一步藉由離心纯化。 該沈黯的細胞可藉由熟習此技藝人士已知的方法加以溶胞 。較佳的，該細胞藉由重覆的冷凍及解凍（較佳的是三次 的冷凍與解凍循環）使其溶胞。溶胞的沈穀細胞會釋出病 毒，而後將病毒收集，較佳藉由是離心收集。該病毒可藉 由在C s C 1梯度下離心加以分離及純化，而後由該C s C丨梯度 中回收合適的含有病毒帶。 或者，該病毒培養物可冷凍及解凍的方式以溶胞該細 胞，該冷凍及解凍細胞培養物可直接作為一活疫苗。但是 ，較佳是，該冷凍及解凍細胞培養物的物質冷凍乾燥（作 儲存），而後作為一疫苗時再將其再度水化。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 該培養物的培養基可含有缓衝鹽水·、基本的營養物及 在該技術中認知的合適的磺及氮源，其濃度為可使病毒感 染的細胞生長。合適的培養用的培養基包含Dul becoo’s基 本培養基（DMEM)、.Eag le ’ s基本培養基（MEM)、HanT s培養 基、培養基199、胎牛血清（f eta I bov i ne serum)、胎牛 血清（f e t a 1 c a If s e r u m)、及其它可支持病毐惑染細胞生 長的相當培養基c該培養用的培養基可添加胎牛血清（直 多10%)旦/或卜麩胺酸（至多2πιΜ)，或其它合適的添加 物，如傳統上生長添加物或/且抗生素°較佳的培養’基為 DMEM - 較佳的是，本發明疫苗為培養在合適細胞洙中的病毒 或感染因子。該細胞株較佳的是psp-36或可為病毒 -32 - 32. 9. 6,000 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 x 297公釐） 517085 A6 B6 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 五、發明説明（>/ ) 所感染之相當的細胞株，且將其培養。一相當於PSP-36的 細胞株的例子為細胞株PSP-36-SAH，其寄存在布達龈斯協 约下的 American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive, Rockville，Maryland 20852 美國，其 於1992年10月28日寄存，寄存編號CRL 11171。另一相當 的細胞株為MA-104，其可在商業上由Whittaker Bio -products, Inc (Walkersville, Maryland.)取得。初步的 結杲顯示該與PRRSV的愛荷華菌株相結合的感染因子可在 豬隻的鼻甲細胞中培養。在斑點純化後，該舆PRRSV的愛 荷華菌株相結合的感染因子産生具有如上表1所列之以" 愛苘華"標題者相同持性的損害，且顯示於第5 — 8圖。 因此，本發明亦有關培養一病毒或感染因子的方法， 較佳是在選自由PSP-36及及可為病毒所感染之相當的細跑 株所組成的一族，且將其培養。依據本發明的培養病毒或 感染因子之方法包含感染PSP-36及可為造成豬隻呼吸性及 生殖性疾病的病毒所感染之相當的細胞株，且在合適的培 養基中培養該受感染的細跑株。 細胞株MA-104是由猴子腎臓細胞所得的，為其類似上 皮細胞。MA-104細胞在含有Dubecco’s基本培養基及10%F BS (胎牛血清）的培養瓶中可形成匯合的單層：，富該單層 形成時，該細胞以10%均質化的組識樣品加以接種，該樣 器是來自於一感染豬隻的合適組織（如肺臟且/或心驗） 。較佳的是有合適的抗生素存在，以使可病毒及宿主細孢 生長，且可抑制並非宿主細胞的細跑生長且/或存活（Μ (請先《讀背而£注'意事項再填寫本 丨裝· 訂- r線. -33 - 517085 - A6 _Ββ_ 五、發明説明（>彡） 如細菌或酵母麵）。 PSP-36及ΜΑ-104二者可使PRRS病毒的分雞株生長成高 價數（超過107TCID5Q/ml)。PSP-36及ΜΑ-104亦可使與 PRRSV的愛荷華菌株相結合的感染因子生長。MA-101亦可 使螺旋病毒（r 〇 t a v i r u s e s) ·、脊髓灰質炎病毒及其它病毒 生長0 CL2621細胞一般相信是非豬隻來源，且為類似上皮細 胞的，並為專利的（Boehringer - Mannheim)。與 PSP-36 及 MA-104相反的，造成PRRS的病毒樣品無法成功地在CL2621 細胞中培養（B a u s t i s t a 等人，A m e r i c a n A s s 〇 c i a t 丨 ο η 〇 f Swine Practitioners News 1 etteer, 4 , ♦ 32, 1992) 0 CL2621細胞的基本特徵為非豬隻來源，且為類似上皮 細胞的，生長於MEM培養基中。但是，Benf ield等人（J . Vet. Diagn. Invest.，1992; 4:1 27 - 1 33)已報導使用 CL2621細胞繁衍PRRS病毒，但是MA-104是使用於控制脊貧遑 灰質炎病毒的繁衍，因此推論該CL2621是不同於MA-104’ 且相同的細胞不繁衍二種病毒 經濟部中央標準局Λ工消費合作社印製 PRRSV的愛苘華菌株相结合的感染因孑一般無法在非 PSP-36 ·、PSP-36-SAH及MA-104細胞株中生長‘：但是’如上 所述，造成PRRS的病毒已報導可在CL2621及原始肺胞 呑噬細胞中生長，雖然PRRS病毒_的一些並不在PSP-36、 MA-104或CL262 1細跑中生長。 本發明疫苗可使用於製備抗體，該抗爨對一暴露& :病 毒或感染因子的病患（在此例中，為i豬隻）可提丨共免® -34 - * «^ ^ si ononf»rr^Q) ¢7 ί ia/οιπ v 〇〇7 *j. \ 517085 絰濟部中央標準局Λ工消費合作社印製 - A6 _B6 _ 五、發明説明Ο >) 抗性。本發明所包含的抗護可在免疫上（1)與可保護一豬 隻對抗造成呼吸性及生殖性疾病的病毒或感染因子相結合 者，或是（2)與造成豬隻呼吸性及生殖性疾病的病毒或感 染因子相結合者。本發明抗體具有作為決定一豬隻是否已 暴露於呼吸性及生殖性疾病的病毒或感染因子上之診斷劑 以及在本發明疫苗製備上的使用性。該抗護藉由已知方法 製備為免疫親和管柱，且該免疫親和管柱可使.用於分離該 病毒或感染因子或其之蛋白質。 為引發對該疫苗或病毒的抗體，必須對一合適的宿主 種物，如老鼠、免子或其它可用於接種的動物，以使用於 製備疫苗的蛋白質加以免疫·。該宿主動物而後以如上所述 的疫苗中之一型加以免疫（注射），適意的施用如上所述 •免疫增強劑（佐劑.）。該宿主動物其後較佳是在一定的一 段期間，較佳為每1至4週，最佳是每2週，作1至5次的免 疫◊而後將該宿主動物犧性，收集其血清。再藉由已知技 術由收集的全血中分離出血清，該血清含有對該疫苗的抗 Μ。該抗體可藉由已知的方法加以純化以提供免疫球蛋白 G ( IgG)抗 a ·:· 本發明亦包含對抗本發明疫苗且/或病毒的單株抗g ，該單株抗腹可藉*KohUr等人niauture V0丨· 256 (1 9 75 )p.- 495-497)的方法加以産生，基本上’免疫化宿主動 物之脾臟的全細狍製備而得的免疫細跑（如上·所，述）藉由 傳統步.驟與骨£1廇細胞融合以産生融合瘤’培養該融合13 ，所得的培養液，而以其對抗帶有感染因子（病毒或疫Μ -35 - (請先閲讀背面之注念事項再填寫本 ,¾ 丨裝· 訂- 本纸伕尺斤逋用中S國玄橒準（CNS)甲4说格（210 X 297公皆） 32. 9. 6.000 517085 A6 ___B6_ 五、發明説明 )的液B或接種物加以篩選。將該融合瘤送入宿主動物的 腹膜中以使該融合廇在腹膜中生長。收集該宿主動物的腹 水，以提供由融合瘤所産生的可對抗感染因子之單株抗體 樣品。同時，由融合瘤細胞培養物中所得的懸浮液亦可使 用為作單株抗體的來源，其藉由熟習此技藝人士已知的方 法加以分離，較佳是，本發明的抗證為免疫球蛋白之IgG 或IgM型。 本發明亦有關一治療一患有呼吸性及生殖性疾病的豬 隻之方法，其包含施甩有效量的抗體，該抗護在免疫上可 與造成豬隻呼吸性及生殖性疾病結合，或是與可保護豬隻 對抗藉由豬隻呼吸性及生殖性病毒感染的疫苗結合，若有 所需其可在一對豬隻為生理上可接受的載體中。 本發明的疫苗亦有関一分析造成豬隻呼吸性疾病、豬 隻生殖性疾病或豬隻呼吸性及生殖性疾病的診斷套組，其 包含如上所述的抗《及一可與該抗體反慝而顯示出陽性免 疫反應的診斷劑試。 本發明診斷套組較佳是基於對已知免疫螢光分析（IFA )、免疫過氯化氫_分析（IPA)羽與酵素結合的免疫吸附分 析（EL ISA)步驟加以修飾° 在IFA中，受感染細胞以乙国及甲醇溶丨夜加以固定，且 絰濟部中央標準局貝工消費合作社印製 - 受感染豬隻在復原期的抗體與受感染細胞培育’較佳是在 37 °C下约30分鐘。一陽性免疫反應為可病毒感染細胞相结 合者，但其不會绖由其後的清洗步驟（通常以P B s缓衝液 清洗三次）加以丨先去，而後加入以一螢光劑（卩1T c)作標記 ~ 36 - S2. 9. 6,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 517085 、 A6 ' B6 五、發明説明（>/ί 的二级抗饅（抗一抗護）培育，較佳為另一次30分鐘。一 陽性免疫反應可使得二级抗體在清洗後與胶然保存的一级 抗體相結合，且會導致螢光的發生，該螢光可撿測且半定 量。一陰性免疫反應為造成很少或沒有抗原與感染細胞相 結合。因此，該螢光劑標記的二级抗體無法與之結合，該 螢光標記會被清冼出，且若與一合適的陽性控制組比較， 其為撿測出很少或沒有螢光。 ΙΡΑ及ELISA套組是相似於IFA套組，除了該二级抗S 是以特定酵素取代該螢光劑。因此，當加入合適的結·合於 二级抗體的酵素的酶質，可造成呈色産物的産生，而後例 如利用呈色計量加以撿測且定量。 本發明的其它特徵在下例示實施例說明下會變得明白 ，該些實施例僅為例示說明本發明，而非想要限制本發明 (請先閲讀t面乏注1Γ事項再堉寫本 •裝· 訂· 經濟部中央標準局R工消費合作社印製 實驗1 在實施例1中，調查在5 -8週大豬隻的地方性肺炎的 例子。在豬隻中所觀察之PRRSV愛荷華_株的微部損害是 與病毒的病因學相配合（因此，在此，為簡化討論，"病 毒"及〃病毒性"是在本發明中如上所述的指病毒或感染 因子，或其特性）。在實驗上使用由感染豬隻且藉由〇 . 22 um過濾加以分離而得的肺部均質詨，將該疾病傳給傳统及 生物有擇（g η 〇 t 〇 b i 〇 t i c )藉隻。非未顯示出一般発隻病毒 性呼吸性病因。在細胞培養中得到二型的病毒粒子◊一型 - 37 - 517085 A6 __ _B6__ 五、發明説明（孑乙） 直徑约為70·，其為具有被膜，且具有小的表面針狀物。 另一型具有被膜、長形、多形，計算约δ0Χ320ηπι，且為抗 體所包圍。 (I )物質及方法 (A )由自然發生肺炎感染的豬隻中得到的物質 收集且研究在西南部的愛荷華州上餵養900隻豬的濃 場上之6週大受感染之豬隻中所得的組織。先觀察該農場 豬隻，其顯示在斷奶後5至7天，50-70%相同受感染的豬 隻變得厭食、毛髮變粗且經過昏睡、咳嗽、發燒及〃呼吸 急促（thuniping) 〃。约10-25%的受感染感染具有結膜炎 。大部份的惑染豬隻在7-10天内恢復。但是10至15%由於 細菌的二次感染而造成嚴重的生長阻礙，且不合適作為餵 養的豬隻加以銷售。豬隻無法生育，包含死胎、木乃伊化 的胎兒及不孕症，是在豬隻農場上該疾病發生原始點上發 生，其後會隨時間而減少。在餵奶期間呼吸性疾病是會持 續的。 觀察藉由增生的細支氣管炎及肺狍定出具持徵之肺部 的損害，該纸織是由四隻不同6週大豬隻且以福馬林加以 固定而得的組織。嘗試要去分離出S IV、、偽狂犬病毒（ P s e u d 〇 r a b i e s v i r u s P R V )及 心肌炎病毐（E n c e p h a 1 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -m y o c a r d i t i s v i r u s E M C V )但不成功。對於猪隻流行性惑 冒病毒（S IV :)、偽迀犬病毒（P s e u d 0 r a b i e s V i r u s P R v )及 肺炎黴漿菌的肺部冷凍切H之免疫螢光撿查為陰性反應：· P a s t e u r ] 1 1 a m u 1 t o c i d a 是由鼻腔由離而得， -38 ~ B2. 9. 6.000 517085 A6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（7) Hammer oh i 1 us parasuis^:由肺中分離而得。 其後由該農場中得到五隻真正受感染的5-6週大的豬 隻（其已斷奶10天），所有的豬隻皆發燒且溫度至少40.5 °C。將該等豬隻解剖，且收集由該豬隻所得的整體具有典 型病毒性肺炎之損害的肺部組織樣品，加以装以馬上接 種至傳統上為專一不具病原（SPF)的豬隻中。由所有五隻 真正受感染的5 -6週大豬隻所得肺部、肝臟、腎臟、脾臟 、腦及心臟組識加以培養作一般細菌性及病毒性病原培養 。收集相同的組織切片，且在1 0%中性缓衝液中福馬林中 作組織病原撿驗。 (B)在傳統上豬隻實驗上的傳染 (1) 實驗上的豬隻 10隻5週大由農上上所得的不具有徽漿_、PRV、 豬隻呼吸性冠狀病毒及傳染性腸胃炎病毒（TG£V) °將八豬 隻置於每一値為4X5尺的分離的二間中’其具有水泥®及 自動通風裝Ϊ .:，該錯隻靜食1 〇 %室白質玉米一大豆輯食3己 額及任意的水。 (2) 實驗設計 在對具有自然發生肺炎的豬隻作馬上解剖後’製備出 在Dulbecco，s修飾過$Eagle/s基本培養基中的均質液 ~ ，在1 〇 〇 〇 x g澄清10分鐘，而後在1 〇 〇 〇 〇 X g 1 〇分鐘。該澄清 的上清液經由0.22um濾紙加以過瀘。將八隻控制組的堯隻 加以5ml由一正常感染未的豬隻生物有擇的豬隻中藉由如 上所述加以製備的肺部均質液作鼻腔内接種°每天監割及 -39 - (請先W閲讀Α面之注念事項再塡寫本頁一 丨裝· ，ΤΓ· 本纸張尺度迺用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297 乂釐） 32. 9. 6,000 517085 ' A6 ____B6 五、發明説明（#) 記錄臨床上的歡兆及溫度。在接種後（[^1)第5、7、10及1 5天分別由每一組中取一隻作安樂死，且解剖。在解剖時 收集組織以作喃氯及厭氯細菌的分離步驟.、黴漿_分離、 對肺炎黴漿a、SIV、PRV、對流行性感冒病毒型3 (PI-3) ’及牛呼吸性合飽性病毒（BRSV)的抗原檢測及病毒的分離 。該組織以10%中性缓衝之福馬林加以固定以作組織病原 性的撿驗。在解剖時，該肺部以福馬林灌注。 (C )在生物有擇豬隻實驗上的傳染 (1.)實驗上的豬隻 8隻斷初乳，且剖腹生産（CDCD)而得雜種一天大的生 物有擇豬隻隨機分生二{®分離中（一分離114隻豬隻） 。該豬隻以鐵強化、無_、罐頭液髓牛乳替代品加以餵食 (SPF-LAC,Pet-Ag, Elgin, Illinois) 0 (2)實驗設計 四隻主要的豬隻在3天大時，以過濾過（0.22 am)的均 質液作鼻腔内接種（3ml )及口服接種（lml ):'該過濾液是由 一實驗上受感染的豬隻肺部加以製備而得，該肺部是$ ^ 染後（DP I)第7天收集四隻控制組豬隻是以正常的生·物有 擇豬隻製得的肺部均質詨加以接種。 絰濟部中央標準局A工消費合作社印製 每一組的一豬隻是分別在第5、9、23及35DPI下殺死 。收集肺.、肝、腦.、脾、胸腺.、鼻部的#甲、心臓及小腸 ，且將其固定於10%中性缓衝的福馬林中加以固定‘：收集 肺、腦·、脾及心臟作病毒的分_。收集肺、肝及脾臟作嗤 顏體的分雞.:，將肺臓收集至丨I s培養基以作潋發菌的分 -40 - 517085 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 - A6 _ B6__ 五、發明説明 離或在-7(TC下冷凍。 (D )徽生物分析 (1)病毒分離 (10% v/v)在1000Xg下澄清的組織懸浮液接種至細胞 單層上，且觀察細胞病理上的作用。初级胎兒豬隻腎臓培 養、初级豬隻肺胞呑噬細胞的培養及所建立的PK15細胞株 、胎牛的鼻甲、幼黃金鼠的腎臟（BHK)、Vero及豬睪丸皆 嘗試使用去分離病毒。直接的支氣管一肺胞灌洗培養物是 由受感染及控制組的生物有擇的豬隻中加以製備而得·:·使 用參考用的生物有擇之過度免疫或恢復間豬隻血清（該血 清是對抗豬隻小病毒（parvovirus PPV)、S IV ·、胎牛病毒 性腹瀉病毒、红血球凝集化腦脊髓病毒（HEV)、TGEA及EMC V)，藉由間接免疫螢光嘗試作病毒撿測：·該過濾藉由在 10天大的雞蛋胚胎尿膜内及尿囊液中接種，以在每次轉種 後作红血球凝集活性測試。 (2 )黴漿_的分離 肺部懸浮液被接種至黴漿菌内汁培養基F「Π s ( Fr ί i s (1975，Acta Vet. Scand. 27，337 )BHI-TS，D-TS(R_oss等 人（1971), Joural of Bacterology, 103， 707)及 BHL( Y a m a ni o t o 等人 Π 9 8 2 ) P r o c，I n t, P I g V e t · S o c ί e t y C ο n g「ess, P· 94)。當生長是明顯的或是在第3、7、14¾ 21天 辜I由外免疫螢光法加以鑑定其（De 1 g i ucHce等人ί 1967 ) Jounal of Bacteriology, 93, 1 205 )為生長時，將該培 養物轉種。 (請先《讀^'面£注'意事項再堉寫本
W -裝· 訂- -41 - 517085 . A6 _____B6_ 一 五、發明説明（C(?) (3)細鐘的分離 擦拭鼻部的鼻甲棉花棒在二血液瓊脂培養盤以及 M a c C ο n k e y，T e r g i t ο 1 - 7 及 P M D 瓊脂培養盤(作 Ρ · 1 toe ids的分離）上接種。該血液瓊脂培養盤之一者為 在37 °C下於C0 2及Η 2的厭氯環境下接種。該第二培養盤是 以一金黃葡萄球菌(Staph loooccus epidermirHf；)的保亩 菌落加以交錯劃線，再以另一培養盤於空氣中且37 °C下作 接種。 肺部如鼻部鼻甲棉花棒於培養盤上培養。肝及膊臟是 在2値血液瓊脂培養盤（好氯及厭氧:）以及Tergi to 1-7培 養盤上培養：所有的細菌分離株是藉由標準方法（ Biberstein (1990)，In: Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology ed· Carter寺 人，5th et.PP. 139-142， Academic Press Inc·, San Diago,Cal.及Carter (1990)，In: Diagnostic Procedures i n Veterinary Bacteriology and Mycology ed· Carter G.R·及Cole J. R., 5th ed·，pp. 129·142， Academic Press Inc.,San Diego，Cal·)加以達疋 (4 )血清學 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 血清中和測試是使甩去测試對PSV、TGEV及EMCV的抗 體。红血球_凝集作用的抑制性測試是使用去測試血清對 E M C V及Η E V的抗疆。間接的兄疫螢光丨則试疋使用fe <·則血丨3 對BRSV、P卜3、S IV及TGEV的抗鏡‘:使用細胞株CL2621作 間接的免疫螢光分析是使用作對PRRSV抗ϋ的撿測：· -42 - S2. 9. 6,000 •纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 517085 A6 ____B6_ 五、發明説明（“y) (2 )結果 (A )自然發生的肺炎 由真正受感染的豬隻中所得的的肺部並未陷落。大 髏上，該肺部有中等程度的肺葉中間的浮腫以及有關肺葉 陷落的線性區域的癒合之多値病巢處。有5-15%的具有顱 部及中間部份的肺葉之顱腹部強化° 組織原病原上的撿查顯示中等程度、急性且為擴散的 增生性細支氣管炎及齒槽炎。有輕徵的多處病巢性的淋巴 漿細胞（1 y m P h ο p 1 a s m a c y t i c)心肌炎°觀察其它官器並無 損害。 嘗試由原始的案例以及其後由農場中所得的簌重感染 豬隻中受分離出腺病毒、PRV、S IV、HEV、豬隻呼吸性冠 病毒（PRCV.)、豬隻小病毒（parvov irus PPV.)、EMCV及腸病 毒，结果為陰性反隱。免疫螢光撿查該冷凍的肺臟切Η並 未顯示出其具有肺炎黴漿菌、S IV、胎牛呼及性合胞疆病 毒（BRSV)、偽流行性感冒病毒-3 (ΡΙ-3)、PRV或TGEV)的抗 原。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 由上第I節（Α)中的五隻傳統SPF豬隻之一隻中所 得的血清以稀釋度為1 : 20下利用間接免疫螢光法對PRRSV 件測定，産生出陽性的免疫反應。且分别由該豬隻的_部 的鼻甲部及肺部中分雞出Pasterel la mu I toe i da,型D及 Haemophilus p ^ r a s u is :.由所選用的嚴重感染的3¾隻之肺 部作均質化且接種，並未分離出任何好氯及厭氯的細菌（ 見於方法及物質，上述第（C ) (2)節）。 -43 - S2. 9. 6,000 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 517085 經濟部中央標準局貝工消費合^:社印製 A6 _JB6__ 五、發明説明 (Β )傳統的豬隻研究 在7 DP I時，所有的豬隻基本上皆發燒至40至41 · 1°C ’ 且經歴過中等程度的呼吸窘迫，該豬隻厭食且昏睡°在第 15 DPI，該豬隻則恢復。 巨觀在肺部的改變之特徵在於無法陷落、中等程度的 肺葉間的浮腫及肺部20-40%為病巢性之陷落灰褐線性區 域。 徼觀檢視7 DP I的肺部顯示岀一 Η片的組織間質肺炎 ，其以在肺胞管中型I肺炎細胞的生殖、混合著發炎細跑 壞死細胞的碎屑之累積以及在肺胞隔膜中的呑噬細胞及淋 巴球的滲入。一般而言，類偶合胞護細跑是在肺胞管及沿 著該隔膜可見。 第5圖顯示由傳統豬隻10 DP I的肺部得到的切Η所顏 示出的組織切片、其在肺跑間隙中（箭頭處）有延長型Ε 肺炎細胞增生（箭頭）及壞死細胞的碎屑。在第10天所 觀察到的損害的情況及外表是相似於第7天所觀察到的。 第6圖顯示由傳統豬隻10 DP I的肺部得到的第二組織 切片，其使用蘇木紫及伊红作染劑，其在肺胞間隙中（箭 頭處）出現有類似合咆證細胞.:·在第10天所觀察到的肺炎 增生及合胞體是比第7天所觀察到的為多·:_ 在15 DP I僅為中等駸重的損害‘，但該豬隻在臨床上為 正常。無有細菌或是徵漿_可由該肺部份分離出·:·作對 Ε Μ V C、P R V、P R C V、腺病毒及s IV等病毒之分離结果皆為陰 性反應。作冷凍肺部切片的免疫螢光撿視並未顯示岀具有 (請先《讀背面£注_意事項再瑣寫本_
丨装. 訂.
-44 - 517085 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 . A6 __ B6__五、發明説明（ejo BRSV、PI-3病毒、PRV、SIV、TGEG或肺炎撤漿菌之抗原。 在控制組豬隻中無有觀察到整證或微觀的損害。 (:C )生物有擇豬隻的研究 所有接種過的豬隻在5 DPI前是經歴過嚴重的吸呼窘 迫及呼吸急促。溫度是在40.5 2 °C或更高，且該豬隻厭食 且昏睡。在8 DPI時就有臨床上的改進，且在15 DPI時在 臨床上顯得正常。無有豬隻死亡。控制組的豬隻以正常 的均質過濾液加以接種，其依然保持臨床上為正常的。 5 DP I的巨觀損害之持徵在於無法陷落、肺部有多痼 病巢之陷落灰褐線性區域及中等程度的肺葉間的浮腫。徵 觀而言，其為具有肺胞隔膜的單核細胞的滲入之多値病巢 區的中等擴散性的組織間質肺炎以及中等程度的型I[肺炎 增生。在肺胞管中具有發炎細胞、壞死細胞的碎屑以及蛋 白質性的流饅。在其它器管中無觀察到損害。 在9 DP I，該無法陷落的肺部具有中等程度的肺葉間 的浮腫，以多病巢性的1 -3cni之堅固的灰红血陷落區：·第 7圖顯示由在9 DP I生物有擇的豬隻肺部中所得的組織切 片，其使用蘇木紫及伊红染色，其具有型I肺炎的增生（ 箭頭處）及類似合胞體細跑形成處（箭頭）：徵觀而言， 該損害是相似於在5 DP I所觀察到的’除了其型S肺炎增 生是較顯餐的，且在沿箸肺跑及隔膜及在肺胞管中有中等 數目的類似合胞體細胞腎贜有膨脹的腎小管，其含有一 些淋巴漿細胞滲出物及細胞碎屑：‘ 在2 8 D P I，在其它的肺葉中有2 〇 %的顧腹部二倒的 -45 - (請先»讀背面之注意事項再堉寫本頁) 丨裝· .ΤΓ. 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） S2. 9. 6,000 517085 Α6 Β6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（_) 陷落，其是有關在肺葉的頂部及中間，且具有Ucm多病 黛的陷落處。微觀而言，該肺部的損害是相似於在9DP I 所觀察者，但此外，其會有中等程度的細支氣管周圍及肺 胞周圍淋巴漿細胞的聚集。輕徵至中等程度的淋巴細胞及 漿細胞的滲入是在脈絡網狀組織·、腦膜、肌心及鼻部箅甲 組織上多病巢的存在。 第8圖顯示35DP I，該肺部的損害是較不嚴重的，但 有顯示的多病黛性的淋巴漿細胞心肌炎。嘗試作對PRV、S IV ·、腺病毒、EMCV、HEV、PPV、腸病毒及PRCV的病毒分離 皆未成功。在豬隻肺胞的呑噬細胞中可觀察到細胞病原的 作用，其特擻在於在細跑變圓、溶胞以及細狍死亡。顯示 出延伸性的合胞體之直接支氣管肺胞灌洗培養物是在第6 圖顯示，而由控制組豬隻所得的相似培養中未觀察該現.象 。利甩免疫電子顯微鏡作負染色加以撿驗該等培養物顯示 有二型的類似病毒的粒子‘:· 一型，顯示於第10圖，其直徑 約70nm，具被膜且具有短的表面突起。另一型，顯示於第 11圖，其具被膜，多形饅，约80X320nm，其以抗饅包圍·： 由肺、肝、脾及或腦中無有分離出細菌。 在28及35 PUI下所收集的血清對SIV、EMCV、TGEV、 BRSV、HSV或PI-3病毒無有抗疆價數·:·這些血清對PRRS病 -毒為陽性反應（1:1280)。 ~ 控制組的豬隻難整個研究中砍然保持正常，且在任何 組織中無整體或微觀的損害。無細菌或病毒由控制組中分 離出。 -46 - (請先¾讀背、面之注兔事項再堉寫本頁j 丨裝· 訂·
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公梦） 32. 9. 6,000 517085
經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（么门 (m討論 ή λ有自然發生的地區性肺炎的豬隻所得的肺過濾濾 物可在s驗上接種過的傳统及生物有擇的豬隻中造成肺部 .及心.臟的損害。在二者自然與實驗上的疾病所觀察到的損 害是與一病毒之病因學相互吻合C, $ in地，先前所鑑定出的豬隻病毒呼吸性病原分離出 °且觀察到其細胞病因的作用，其待徵在於對初级豬隻肺 胞呑噬細胞培養物可造成細胞溶胞，其與γοοη等人（ Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, vo 1· 4 (1992) p.139)之PRRS病毒感染的報告相吻合◊但是 ，在本研究中所觀察到的在直接灌洗友氣管肺跑培養物中 的大量合胞體卻是無在先前有闊PRRS中報導中提出。 感染細胞培養物的電子顯徽鏡的觀察顯示出二型類似 病毒的粒子，一為具有短小表面突起之70ηπι被膜類似病毒 麝 粒子顯然是與 Benfield 等人（Jo unal of Veterinary Oia gnostic Investigation, vo 1. 4 (1992), p.117)有 If PR RV病毒的報造相吻合，其是另一類（以病毒粒子的顯然是有 分別的，:，無有一豬隻發展出對SIV、PRV、TGEV(PRCV)或 EMCV之抗a債數但是’該生物有擇藉隻將血清轉為對抗 PRRS病毒的： 在實驗I中的臨床上疾病是—藉由在種過的生物月擇 及.(專统的努隻中在5 DP I下有中等到嚴重的呼吸窘迫加以 分類的。在該實驗中的疾病是比以前貫繫·（' C 0 Η丨n s寺人 及γ〇〇η等人，supra )中所觀察到的為嚴重。 (請先閱讀、背面乏注«事項再填寫本 丨裝， 訂· —線· -47 - 517085 A6 B6 五、發明説明（么/) 近用來鑑定型A SIV變異種（aS IV或與其相関的疾病 )的氣道终端上表面的壤死以及增生（MOrin等人 Canandian Veterinary JOunal, vol. 31(1991), p.837) 是未在實驗I中觀察到。血纖雒蛋白沈積，且該透明的膜 沿著該肺胞隔膜與sS IV相结合（Morin等人及Girard等人， supra)皆本觀察到。在實驗該些存活超過15 DPI的豬隻 中觀察到非化膿性的心肌炎，該心肌炎不與aS IV相結合（M 〇 r i η等人及G i r a r d等人，s u p r a )。藉隻不會血清轉變成對 S IV的，藉由在胚胎化的雞蛋中轉種亦撿測無有S IV。 在PRRS疾病的發生及實驗上的接種中所見的主要肺部 損害是顯著地有以單核細胞在組識間質中滲入（Co U丨ns等 人，p〇丨等人，supra)。在實驗I中受感染豬隻所觀察到 的型Π肺炎細胞的增殖、合胞體細跑形成及心肌炎是在其 它的豬隻未觀察到的。以實驗I中過濾的感染因子所産生 的損害教示該在此研究所描述的疾病，即為所稱的PRRSV 的愛荷華株菌，是由一單一病毒性因子或是一 PRRS病毒與 另一感染因子結合所引起的。 實驗Ε 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (I )物質及方法-(A :)領域中病症物質及歴史 由經歴P R R S且在哺乳期持缭著有簌重的肺炎的農場 中所得的豬隻，其所生産的42小豬隻中僅有2〇隻存活。將 該豬隻解剖，且該肺部組織樣品加以收集，且以標準的方 -48 - 82. 9. fi.000 本纸張尺度適用中國國家橒準（CNS)甲4規格（210 X 297公犛） 517085 A6 B6 五、發明説明（1) 式，FJI為無_的均質化技術，加以均質化。該肺部的均質 液（10 w / v〉在E a g丨e · s基本培養基（Μ E Μ)中加以製’且& 由0.22uin的濾紙過濾，而後用來接種。 (Β )細胞 在由ΜΑ-104中衍生之稱為PSP-36的連續細胞株中（其 購自 Whittaker Bioproduct, Inc ( Waikersvilie, Maryland.).) 。 PSP-36細胞樣 品增殖 ，且 該細胞 株稱為 PSP-36-SAH。豬隻肺胞呑噬細胞及約九種其它的細胞株，例如在 表I所述的例子，使用作病毒的分離。
表H C請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝 猴, 狗 $Β 鼠 人類 黃金鼠 ST-SAH Vero 76 NLDK CRFK MT U937 BKK-21 ST-ATCC BGM-70 CK65D FKCU P388D1 Hep 2 CHO-K1 ST-ISU BSC-1 MDCK FL IC-21 ST-UNE PSP 36 CT-60 NCE PU5-18 PD5 3201 L929 SL0 PSP 29 PSP 30 PSP 31 IBRS2D10 AG08114 AG08116 訂 經濟部中央標準局R工消費合作社印製 牛.* 無脊椎動物 鵪鶉 雞 MDBK ASE QT-6 CU10 TAE QT-3 5 LMH AVE HD 11 BGE BM2L HZM - IDE2 IDE8 RAE RK13 兔子 蠕is
TblLu 49 517085 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 A6 ___^__ B6__ 五、發明説明（<) (C )病毒分離 上述製備而得的肺部均質液於4 °C下在2000xg或 3000rpm下15分鐘加以澄清。該上清液經0.22um的濾紙加 以過濾。將該過濾液接種到在第（B )節所述的每一細胞 株中：·在合適且含有0-4%胎牛血清（FBS)及抗生素之培養 基中維持其生存·。每天監測該細胞的細胞病理效用（CPE) 。若CPE在8-9天内未觀察到，該培養物盲目迪作2-3次的 轉種。若觀察到可能的CPE，該培養以復原期豬隻之對ISU -12的抗血清作間接的免疫螢光分析（IF A)加以撿查。 (D )病毒價數 IS U - 12分離株一連串10倍的稀釋液是在含有2 .¾ F B S及 1 X抗生素之D u 1 b e c c 〇 ’基本培養基（D Μ E Μ ):>每一稀釋攸（ 0. 2ml二重覆地接種於在Lak-Tel槽中作為種子的PSP-36細 胞以及豬^肺胞呑噬細胞培養物的每孔中，在感染後3天（ 3 DPI)，該該槽以冷的80%丙調及20%甲醇在4C下加以 固定15分鐘。而後該鎮槽使用復原期ISU-12抗血清及抗PR RS病毒血清在一 IFA中加以染色° (E )間接免疫螢光分析（IF A) 該PSP-36細胞及豬隻肺咆呑噬細胞培養锪以ISU-12分 離株加以感染，在感染後20及48小時’該培養物以冷的80 %丙S及20%甲諄溶液在4t〕下固定分鐘。使用ISU-12 復原期血清、抗-PRRSV血清及購自s〇Mh Dakota State Uni versitu，Brookings，South Dakota 的 i/lkRRSV 單株 抗疆進行IFA。未受感染的PSp"*36細胞及呑噬键胞培養使 -50 - (請先fl讀背面之注！事項再填寫本頁】 裝· 、11·
本紙張尺·度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） S?. 9. 6,000 517085 A6 B6
五、發明説明（么7) 用作為控制組。 (F )放射免疫沈毅分析（RIP) 經濟部中夬標準局貝工消費合作社印製 分肖S株及ί吴威支感染P S P - 3 6細胞是以3 5 S ~甲硫胺_ & 35S-胱胺酸加以標記。在25cm3三角瓶中的3天大PSP-36細 胞以0.5ml的1〇4 TCIDu之ISU-12病毒加以感染。感染後 24小時，該培養基以缺甲硫胺酸及缺胱胺酸的DMEM取代， 該培養在37 t培養14小.時。而後該培養基以新鮮的具有 100uci/m丨的35S-甲硫胺酸及35-S胱胺酸之甲硫胺酸缺少 及胱胺酸缺少的培養基加以取代。在加入3 5 Me t及3 5 Cys五 小時後，該細胞以冰冷的磷酸緩衝溶液（PBS pH7 · 2)清洗 三次，而後由三角瓶中將其剝落下，且在lOOOxg離心410 分鐘使其形成塊狀物，含有標示的病毒蛋白質及模擬感染 細胞塊狀物的細跑塊狀物以溶狍緩衝液加以破壞，而後該 細胞殘餘物依據 Zhu 等人（Am. J. \/et. Res., 51 -232-238 (1990))的步驟離心加以澄清。該溶咆液以復原期的血清 及抗PRRS病毒血清加以培育（該血清先以冷的正常卩$卩-36 細胞溶胞液在41：下預吸附過夜）。藉由加入S e p h a r 〇 s e蛋 白質 A 粒子（得自 sigma Chemical Co·, St.Louis· Missouri)帶室溫下2小時後，收集該免疫複合體，且該S e p h a r 〇 s e蛋白質A粒子與免疫複合體之混合液以溶胞缓 衝液清洗三次，以蒸黯_水清洗三次，該混合液再懸浮於 5 Onl樣品缓衝液，且如Zhu等人USP「a所述的在SDS-PAGE 凝膠上進行電泳。 (G )電子顯徵鏡（EM) -51 - ^7氏张尺度適用中國國家橒準（CNS)甲4蜆格（210 X 297 2法） 82. 9. 6,000 ί請先，閲讀休面之注意事項再¾¾本 bm .裝， •線. 517085 A6 B6 五、發明説明（0) 该PSP-36細跑仕25cm2二角瓶中以ISU-12病毒加以感 染，感染後48小時，該感染細胞以3¾戊二經（pH7. 2)在41： 下固定2小時，該細胞後而由三角瓶中剝落，且離出形成 塊狀物，該細胞塊狀物加工且使塑膠埋入其中，該塑膠埋 入的細胞塊狀物作薄層切片。染色，在一如pau丨等人（Ααι. J· Vet· Res·, 38: 311-315 (1976))之穿透性電子顯徽 鏡可見到。
(I )該豬隻生殖性及疾病在實驗上的再現性 (A )實驗 92· 1 SPF 由ISU-12所的肺部過濾液在六隻為專一不具病原（SPF )的五週大豬隻中作鼻腔内接種。該豬隻在接種後（DP I) 3 ·、5、10、2 8及4 3天殺死。
(B .)實驗 92. 3SPF 六隻雜交豬隻在五週大時以受USU-12肺部過濾液所感 染的豬隻肺胞作呑噬細胞物質加以作鼻腔雨接種，該isu 一 12接種的豬隻在1〇及28天解剖之。
(C )實驗 92· 10 SPF 三隻5週大的4豬隻以在？$卩-363(11丨增殖的1$1]-12(含 有TC ID 5 α / m 1病毒）加以作鼻腔内接種：二藉隻作為未接 種的控制組·:. 一心4豬隻在DP I 5、1〇及28時解剖，控制組 的豬隻在DPI _ 5及10加以解剖。 '
(D )實驗 92.12 SPF 22隻五週大的豬隻分成六組，組1 ’六隻是以31"丨在 含有105TICD5 α/ml病毒之PSP-36中增殖之的斑點纯化的 (請先《讀t面之注恚事項再填寫本頁d 丨裝. 、ΤΓ. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 9 6,000 517085 A6 B6 蛵濟部中央標準局R工消費合作社印製 五、發明説明（t/) ISU-12 (斑點代號1)病毒加以接種。組丑，6豬隻是以 控制組的細胞培養物培養其加以接種。在M 21 (斑點代號 3 )及組V (斑點代號5 )的每一組中，二豬隻以斑點纯 化的ISU-12接種。在組V中，2豬隻是以未作斑點純化的 加以接種，在〇在組VI，中三豬隻以IS ϋ-12的組織過濾液 加以接種。 由組I及ϋ中的二隻主要及二隻控制組豬隻在5、0 及25 DP I下解剖，該以斑點代號2及代號3所接種的二豬 隻每一隻在10 DP I下解剖，由組V及VI每一組中所得的一 豬隻是在5、10及25 DPI下解剖。 (E )微觀的檢查 肺、腦、心及脾是在解剖時收集，以10%緩衝中和的 福馬林加以固定，埋入石纖中，且以蘇木紫及伊红加以染 色。 (I )結果 (A .)細胞的培養 (1) ISU _ 1 2在豬隻肺胞呑噬細胞培養物中的培養 以在開始2-3DPI的ISU-12肺部過濾物感染的豬隻肺跑 呑噬細胞培養物中觀察細跑病理作用（CPE) ◊ CPE之恃歡在 於由其呑噬細胞的聚集及溶胞。在ISU-12惑染的培養物中 约90%的呑噬細胞培養物在4-5DP I時顯示出CPE :，·第12 U) 圖顯示在未感染呑噬細胞培養物中觀察到無有CPE。該ISU -1 2病毒在呑噬細咆培養物中第三次轉種的價數為10 4 - 10 5 (請先閲讀^*面乏注**事項再堉寫本 1 丨裝· 訂. -53 - 517085 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 ___ B6 _五、發明説明（〇 TCISDso/ml 〇 病毒性抗原是藉由在ISU-1 2感染的豬隻肺胞呑噬細胞 培養物之胞體漿中，使用得自生物有擇的豬隻之ISU-12復 原期血清而作的IF A撿測，其顯不於第12 (. C)圖。 (2)在連續細胞株中ISU-12分離株的培養 約90細胞株作測試（見.於上述節（B )的物質及方法） ，病毒複製的的證據是顯著顯示於六値細胞株中’值得注 意的為PSP -36、PSP-36-SAH、MA-104、滑液細胞、肺胞 呑噬細胞及豬隻鼻甲細胞。 第13(B)圖顯示在2 DPI該CPE開始，旦具有下列待歡： 降低、細胞變圓以及細胞聚集。在3-4 DP I，圓形的細胞 聚集叢數目增加，該聚集叢融合在一起。許多圚的細胞由 該細胞單層中分離出，且後其導致該單層的崩解。在5DP I 後C P E變得十分廣泛，且典型地是超過9 5 %的單層為如此 ，在控制PSP-36細胞中未觀察到CPE，其顯示於第13 ( A)圖 中。該ISU-12分離株在PSP-36細胞中生長成高價數，在第 11次細胞轉種培養物中约10 s-10 7 TC ID 5 Q/ml。 病毒的抗原在受感染的細胞中跑漿護中以.由實驗上以 ISU-12肺部過濾液接種的生物有擇的豬隻於恢復期所得的 血清加以作檢測（見於第14 ( B)圖）:，在控制組PSP-36中 無有觀察到螢光（第丨4(A)圖）。 (瓜）病毒持性 (A ) ISU-12對PRRS病毒在抗原上的相關性 ~ 54 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4说格（210 X 297公犛〉 32·9· 6,0〇〇 (請先ffi讀忆面之注意事項再填寫本頁1 -裝· 訂
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 ___ —_B7 _ 五、發明説明（r3) 對PRRS病毒分離株VR-2332 (購自Dr· Benfiled， South Dakota)的單株抗體及抗PRRSV血清（得自USDA National Veterinary Seerv i ces Laboratory, Ames, Iowa)與ISU-12感染 PSP-36細胞反應，其證據為在IFA 期間有光亮的胞漿體螢光反應（見於第14(C)圖），但不 與未感染的PSP-36細胞反應。 (B )病毒蛋白 抗-1SU-12恢復期的血清及抗PRRS病毒血清是使用去 分析病毒蛋白，該二血清認知至少4蛋白質，其分別為分 子量為19、24、32及61kD (第15圖）。在第15圖，模擬的 感染（道1及2)或ISU-12感染（道3與4)者皆Μ抗-PRRSV多株型抗血清（道1及3)或復原期的血清（道2 及4)予以免疫沈澱之。 (C )病毒結構 典型病毒粒子是在55-85nm間，其亦在ISU-12感染PSP - 36細胞中觀察到。該病毒粒子為具被膜，為球形且存在 於ISU感染之PSP-36細胞之細胞質載體中。
(IV )疾病在實驗上的再現性 (Α)實驗 92.1SPF 由上ISU_ 12所得的肺部過濾液作鼻內接種至6隻專 一不具病原（SPF)的五週大豬隻。該豬隻在接種後（DPI 3、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 5 5 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4517085 Α6 Β6 五、發明説明（&) (請^«讀背面之注意事項再填寫本 丨裝- 5、10、28及43天殺死。在3 DPI時，該ISU-12的豬隻顯示 出嚴重的呼吸窘迫以及發熱。這些歡兆持績10-14天，整 讀肺部的損害是分類為60%的肺部單重的多病籮性的灰褐 色的強化。此亦有中等的心臟擴大症及腹水的聚集。徼觀 的改變的特擻為嚴重的具有型ϋ肺炎細胞增殖的增殖性組 織間質肺炎、合胞體細胞的形成肺跑的·彦出及輕徼具有單 核細胞的組織間質變薄。其具有非化膿性的心肌炎、駸重 的腦炎以及中等的淋巷巴漿細胞腎炎。該isU-12實驗上的 豬隻在10及28天解剖，其血清轉變成對PRRS因子的，當其 藉由NVSL加以確認。
(B )實驗 92. 3 SPF 丨線. 所有ISU-12接種的SPF豬隻在3天内顯示轂重的呼吸性 疾病，其持繼超過14天，整鏡的損害可分為肺部的充血、 浮腫以及顯著的多個病巢性一擴散性肝變化。微觀而言， 駸重的增殖性組缇間質肺炎、中等的腎炎及輕微的腦炎皆 可被觀察到0該ISU-12接種的鍺隻在10及28 DPI解剖，其 具有血清轉變成對PRRS，其由NVSL加以確認。
(C )實驗 92. 10 SPF 蛵濟部中央標準局貝工消費合作社印製 接種的豬隻之臨床上的徵兆包含嚴重的昏睡、發燒及 中等的厭食，中等到嚴重的呼吸性窘迫，在5-22 DPI觀察 到。帶整膣實驗中該豬隻為中等的迀暴。微觀的損害包含 在5 DP I輕徵的增殖性組識間質肺炎及嚴重的化獲性扁桃 腺炎：.中等程度具有型E增殖性的多（1病黛之p IP，肺胞 滲出物、多核化的巨大細胞及合胞Η形成是在1 〇 D P I時觀 - 56 - S2. 9. 6.0ΠΓ) 517085 A6 Ββ 五、發明説明（^) 察到。具有血管周圍袖口及膠質變樣的中等病巢性腦炎亦 在10 DP I時觀察到，中等的門靜脈周圍的消：巴呑噬細跑肝 變樣、輕徽非化膿性心肌炎以及鼻炎在10 DP I撿測。在26 DP I，其有嚴重的組織間質肺炎，其可分為多値病黛性的 組識間質薄層，其具有單層細胞、中等的多病巢性型S肺 炎細胞的增殖，中等量的混合之肺胞滲出液以及淋巴細胞 及呑噬細胞之鬆支氣管周圍袖口。其亦有中等病m性心肌 炎、中輕徼的肝炎I一徽輕的腎炎以及扁桃腺炎。該二ISU -12接種的豬隻在10 DPI血清轉變成對PRRS。 該控制組豬隻在實驗期間保然為臨床上正常，且顯示 無整體或微觀的損害，其亦保持對PRRS血清陰性反應。
(D )實驗 92· 12SPF 生物上未選殖的ISU12對SPF豬隻為病原倥，且産生如 上實驗92 , 10SPF中所産生的組識間質肺炎、心肌炎及腦炎 ◊以ISU-12生物上的殖株（斑點代號1 、2及3 )接種的 豬隻産生輕徼組織間質肺炎，但在該些豬隻中並未撿測 出有型I的肺炎細胞增殖、肺胞滲出物且/或腦炎◊所有 以ISU-12接種的豬隻，無論選殖或未選殖，皆在10DPI血 清轉變為對PRRS。該控制組的豬隻砍然保持不具有病毒感 染及疾病。 蛵濟部中央標準局R工消費合作社印製 (v ) aijg 、 具有自然發生感染的豬隻（ISU - 1 2 )所得的肺及心過濾 液（0.2211111)之五週大的$卩卩豬隻可在實驗上再現出11重的 肺炎‘:，該肺炎是由P R R S V愛荷華麵株（IS U - 1 2 )所産生，其 -57 - 太饫馁尺斥·:4用申a a它过並ίΓΝ.ς) Ψ 4 «这Y ?Q7 λ、替、 R2. 9. 6.000 517085 A6 B6 絰濟部中夬標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（%) 特歡為組織間質肺炎、型I肺炎細胞增殖以及合胞體的形 成。在受感染豬隻中覲察到心肌炎及腦炎：，ISU-12在豬隻 • 肺胞呑噬細胞培養物以及一連續的細胞株PSP-36中産生細 胞病理效用。病毒的抗體可藉由間接免疫螢光法在ISU-12 -感染培養物中撿測出，但在未感染的細胞則撿測不出。 使用多株及單株抗體藉由免疫螢光法得知ISU-12在抗原性 上是與PRRS病毒菌株VP-2330有關。但是在以非斑點純化I SU-12的感染的豬隻中之微觀損害上是觀察出有不同處， 此教示在PSP-36中可能有另一病毒或感染因子生長，且該 另一病毒或感染因子可能是愛苘華菌株所造成疾病與損害 不同於且比在文獻中對PRRS病毒更嚴重之原因。所有以IS U -12接種的豬隻，無論選殖或無選殖，在10DPI皆血清轉 變為對PRRS的。該控制組的豬隻欣然無有病毒感染或疾病 ·:· 實驗瓜 與豬隻呼吸及生殖病症的愛荷華菌株相結合的感染因 3 ’端之分子上的選Μ以及核苷酸序列 (I )物質及方法 (A )病毒的繁殖及純化 此後，為了解化討論，本申請案中"病毒〃或〃病毒 性〃等詞為上述的一病毒或感染因子的意思或是一病毒或 感染因子的待性。 一連續的細胞株，PSP-36，使甩於分_以及繁殖ISU-1 2分離株（與P R R S V愛荷華菌株相結合者）°該IS U - 1 2病 -58 - (請先閲讀背面之注意事項再堉寫本頁1 裝· 、ΤΓ. h. 本纸後尺片这用中®®玄揉進（CNS)甲4找格（210 X 分） S2. 9. fi 000 517085 Α6 Β6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（q) 毒在PSP-3&S胞中斑點純化三次，而後該PSP-36細胞是以 斑點純化後的病毒加以感染。當70%的感染細胞顯示出細 胞病理上的改變時，該培養物冷凍且解凍三次。藉由在4 °C下低速離心（ 5000Xg) 10分鐘而使該培養物培養基澄清 ，而後以7%PEG-8000 2.3%NaC丨在4°C下攪拌過夜加以沈潑 ，且該沈澱物藉由離心而結成塊狀。再將病毒塊狀物懸浮 於2m丨的tris-EDTA緩衝鄉液。是倒在CsCl悌度（0.1245-1.2858g/mn的頂上。於20°C下在28000rpm下超高速離心8 小時後，清楚可觀察到具有密度為帶，且 可回收，該帶的感染價數藉由IF A加以法定，該價數為10 s TC ID 5 Q /m 1 :典型的病毒粒子可藉由負染色電子顯徼鏡加 以觀察。 (B )病毒RNA的分離 _ 整饅RN A是由在CsCl梯度中含有病毒帶中以一商業上 的R N A分離套組（得自S t r a t a g e n e)加以分離出。聚（A) RN A可藉由寡（dT)-纖維管柱層析法依然該管柱（In vitro-gen)製造者所述的步驟加以處理而增加。 (D ) ISU-12cDNA λ基因庫的建立 一般建立cDN Α人基因庫的流程步驟是顯示於第16圖。 由mRNA合適第一股cDMA是使用具有Xho I限制區的寡（dT) 引子藉由反轉錄_加以進行y該核苷酸含有正常的dATP、 dGTP、dTTP ;a bba 5_甲基-dCTP (可保護(：[)“避免其後選 殖步驟中制限誨的作用）。 第二股cDNA的合成是以RNase Η及DNA聚合酶I加以進 -59 - 太鉍沐史泠；逢田4» a ®β f Γ V 〇轵4邛伙ί 9 1 r> Y 9Q7 Λ、β^ (請先閲讀背面乏注意事項再填寫本 i 丨裝· 、11· -線. 517085 Λ Α6 Β6 五、發明説明（#) 行。該cDNA以T4 DNA聚合酶使其平頭化（端點為平頭）， 而以T4連接酶與EcoRI接合子（adaptor)接合，而後以T4 聚核苷酸激酶作使活化（也就是磷馥化）。該cDNA以 Xho分解，該分解過的cDNA在瓊脂凝膠上作大小的選擇。 選甩大小大於lkb之分解過DN A，且藉由一商業上可得的 DNA純化套組（Geneclean,得自 BI0 101, Inc., La Jolia ，C a丨i f o r n i a )加以純化。 純化的cDNA接合至λ噬菌體載證臂，經由基因工程修 飾而具有Xhol與EcoRI的連接端。以人萃取物將達接後的 載體包裝入感染性的人噬菌護中。該大腸捍菌細胞的SURE 菌株（得自Stratagene)是使周作性狀感染，而將該λ基 因庫放大且在XL-1藍色細胞株中測定出價數。 (D )藉由區別性雜合方式篩-選出人基因庫 藉由區別性雜合加以鑑定出PIP病毒ISU-12菌株的可 信殖株之流程步驟是顯示於第17圖，且如上所述。該，\基 因庫是培養於XL-1藍細胞中，該噬議饅吸在函籠膜上二重 覆，且以0.5NNa0H以傳統的方法變性。由病毒感染的PSP-36細胞 以及未 感染的 PSP-36所得 的記號 RNA是 藉甴寡 （dT) 纖維管柱層析法（如管柱製造者所述的，Invitrogen.)加 以分離。 互補DN A探針是由分離於病毒感染的PSP-36細狍以及 正常PSP-36細胞niRNA，利用隨機引子且在32P-dCTP存在下 ，胶據製造者所述的步驟（Amersham)加以合成的。二種探 針（第一是由病毒感染的PSP-36細跑，另一為正常且非感 *〇〇* 32- 9. 6,000 (請先免讀^:面之注务事項再填寫本頁1 丨裝·
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公芨） 517085 經濟部中央標準局R工消费合作社印製 A6 B6 __ ____________ 晒 I -------- 丨丨丨丨丨丨 ' ' ----五、發明説明（0) 染PSP-36細胞所合成的）分別使用Sephadex，G50管柱層析 法加以纯化，:，該探針於50¾甲莛胺下，於42 t’下·分別與該 二重覆的爾龍蹬雜交。分離出舆由該感染細胞所製得的探 針雜交但不與由正常細胞所製得者雜交的斑點。含有cDNA 插入體的的噬小髓（Phagemids)藉由試管中以G408輔肋噬 菌饅加以輔助解救。該解求的噬小歴Phagem ids在XL-1藍 細胞中放大。該含有病毒DN A插入體的質謾藉由Q i age η管 柱層析法純化，其後定出序列。 (Ε )定出序列及序列分析 含有病毒c D Ν Α插入譆的質護藉由Q i a g e η管柱層析法純化 ，藉由Sanger、去二氯方法使甩一般引子與反引子，以及 各種内祁的寡核苷酸引子定岀引子：.序列是至少甶二値分 別的殖株加以得到的。當所得的序列資料不清楚時是須定 出頷外的殖株或區域的序列該核苷酸序列資料可使用二電 腦軟程式GENE WORK S(Intell 丨 Genetics, Inc. , Mountain Biotechnologies，Inc.，New Haven, Conncticut)組合 且分別的分析 V i e w，Ca 1 i f orn i a )及 MAC VETOR ( International Biotechnologies, Inc. , H e v Haven, C ο η n c t i c u t)組合且分別的分析：· (F )寡核苷酸引子 使用自動化DNA合成器（App丨ied b iosystems)合適作_ 單股DA之寡核苷53，且以Η P L C纯化：寡核苷誌p p 2 3 4 ( 5* -CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT-3*;^ PP285 ( 5’-CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG-5，；序列辨議编號 -61 - 太怀 •芡垮硗珀 Φκ® 玄授1 尹·ι 相技 y ?Q7 ' ' ---Γ (請先閱讀背面；疋注意事項再項寫本5,) 丨裝· 訂. •線. 517085 絰濟部中央櫺準局S工消費合作社印製 A6 ____B6_ 五、發明説明 :2 )合成作PCR的放大。一 DNA探針是以由該病毒基因 組3 ·端所得二引子産生以作北方點墨分析（見下述討論） 。寡核苷酸 PP286 ( 5’-GCCGCGGAAC CATCAAGCAC-3’； 序列辨識編號：3 )及PP287 ( 5’_CAACTTGACG (：1^0了0 41；}〇3’；序列辨識编號：4)合成作？〇[^放大。由 該二引子産生的DNA探針更進使用於篩選該λ基因摩·。寡 核苷酸（5 f -GCGGTCTGGA TTGACGACAG-3 f ;序列辨議编號： 5 ) , PP289 (5 ’ - GACTGCTAGG GCTTCTGCAC-3 ’ ；序列辨議编 號：6) ，PP386(5’-GCCATTCAGC TCACATAGCG-3’；序列辨 識編號：7 ) ，PP286及PP287是使用作為定出序列的引子 以得内部的序列。 (G >北方點墨分析 由ISD-12 cDNA殖株的V讀所得的專一 DNAM斷藉由PC R以引子PP284及PP285放大。該DNASH斷是可藉ή 一商業 上可取得的DNA純化套組（GENECLEAH，得自Bio 101)由瓊 脂凝膠中得回，且藉由引隨引子的延長方法（:使用得自 A m e e r s h a m的套組）以3 2 P - d C T P作標記·:·整體R N A是由ί S U -12感染的PSP-36細胞於感染後36小時加以分離的（其（¾ 用一商業上可得之整M RN A分離套組，其可欣然製造所述 的步驟（S t「a t a g e n e.)加以進行）。該IS U - 1 2次基因組Hi R Η A 種類是以6 Μ戊二S及DMS0加以變性，且在1¾的瓊脂凝P 上分離。（以1 . 5¾瓊脂凝膠進行相（以的步驟所得的结杲是 述於下實驗VI且顯示於第35圖），而後將該分離出的次基 因組mRNA使用P0STBL0T壓力點墨器（Stratagene)轉至兩龍 -52 - 太枝贫尺泞滴用申a a玄垃μ f ris：q)甲4 ;夂ί μγ» y 9Q7 d (請洗閲讀背面；之注意事項再塡寫本頁 丨裝. 訂·
517085 A6 B6 五、發明説明) 膜上。雜交是在423C及50%甲證胺下於一雜交的烤箱中周 管狀的瓶子進行。 结杲 (A) ISU-12 3，端基因組的選殖、鑑定及序列的定出 由得自ISU-12感染的PSP-36細胞所得的部份纯化之病 毒加以建構出寡（dT)作為引子的cDNA人基因庫。在以基於 萊西斯倍德病毒序列的探針作該cDN A人基因庫篩選是會面 對一些問題。製婧三組引子，第一組為（ΡΡ1·〇5及PP106， 序列辨識編號：2卜22 )，其相對應於萊西斯倍德病毒基因 組序列（位於核鞘基因區域）的14577至14596以及14977 至14995 •第二組為（ΡΡ106及ΡΡ107，序列辨議编號23-23) ，其相對應於萊西斯倍德病毒皇因組序列（倒面的PRP s 6及7)的14977至14995以及：14054至1 4072。第三組為（ ΡΜ541及ΡΜ542，序列辨識編號24-25)，其相對蔭於萊西斯 倍德病毒基因組序列（位在ORF-lb區域）的1171δ至11737 以及 11394至 11413。 PP105: 5 r-CTCGTCAAGT ATGGCCGGT-3 7 序列辨議編號：21 PP106: 5 Λ-GCCATTCGCC TGACTGTCA-3 > 序列辨議編號：22 PP107: 5 x-TTGACGAGGA CTTCGGCTG-3/ 序列辨議編號：23 PM541: 5;-GCTCTACCTG CAATTCTGTG-3 7 序列辨議编號：24 PM542： 5,-GTGTATAGGA CCGGCAACCG-3 7 序列辨議編號：25 所有？i由使闬該三組引子而利周PCR方法，由ISU-12 -63 - (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁 丨裝· 訂· .線· 517085 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 感染因產生探針的嘗試皆不成功，在使用區別性雜交技 術的嘗試後，該代表ISU-12專一的cDNA之可信斑點是可使 用由ISU-12-感染的PSP-36細胞及正常PSP-36細胞所製備 的探針加Μ分離出。有關區別性的雜交步驟是述於且列於 第17圖。 開始先鑑定三個陽性反應的斑點（λ-4、λ-5及λ-9 1)。在c(噬_體中含有病毒cDNA揷入體的噬小體phage-mi dM C405輔助噬菌體的幫助藉由在試管中刪除作用的加 Μ解救。該陽性反性殖株的插入體限制酶分解Μ及端部的 序列定出加以分析。該cDNA®株的專一性更進一步藉由與 由M PRRSV的愛荷華_株感染的PSP-36細胞所得的mRNA雜 交，但不與正常PSP-36細胞所的mRNA雜交的技術加Μ確認 。一 DNA探針由該殖株λ -75的5’端藉由使用引子ΡΡ286與 ΡΡ287作PCR加Μ生產生。所有使用去得到3’端核苷酸序列 的λ cDNA是呈現於第18圖中。至少是三個不同的殖株加Μ 定出序列Μ消除任何的錯誤，有任何不清楚的序列資料 情況下，額外的殖株Μ及內部的引子（ΡΡ288、ΡΡ289、ΡΡ2 86、ΡΡ287及ΡΡ386)是使用去定出該序列。該1938bp3’端 的序列（序列辨識編：8)是呈現於第19圖，且其推縯出 的胺基酸序列SEQ ID N0S:9,11,14與17是呈現於第20圖。 (B )次_因組的mRNA的巢狀組 由病毒感染的PSP-36細胞在1%戊二醛/DMS0瓊脂凝 膠整體分別，且點墨至耐龍膜上。一 cDNA探針藉由在病毒 基因組的3’端點區或上的引子（PP284及PP285)使用PCR方 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •W裝· 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 64 517085 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（〇) 法加Μ產生。該探針含有3’非轉譯序列Μ及大多的0RF-7 序列。北方點墨雜合的結果顯示由M PRRSV愛荷華菌株感 染的PSP-36細胞中所得的mRNA種類之形式是枏似於由萊西 斯倍德病毒（LV)、馬動脈炎病毒（EAV)、乳酸去氫酶病毒（ LDV)及冠狀病毒所得者，在該等病毒的複製需至次基因組 mRNA的形成。 該結果顯示ISU-12-專一的次基因組niRNA代表該mRNA的 巢狀組，因為該北方點墨探針只代表該3’端之端部的序列 。ISU-12病毒基因（14kb)及六次基因組mRNA (RNA2(3.0kb) 、RNA3(2.5kb)、RNA4(2.2kb)、RNA5(1.8kb)、ΙΙΝΑ6(1·6 kb)及RNA7(0.98kb)的大小相似於LV者（第18圖）雖然在 該基因組上及次基因組RNA的種類上有不同。該相當量的次
基因組mRNA可觀察出其不同處，RNA7為主要的次基因組mRNA 0 (C)由次基因組的RNA编碼的開放式閲讀書架之分析 該三個PRF是發現於序列辨識编號：8 :0RF-5(nt 239-901，序列辨識編號：10) 。0RF-6(nt 889-1403，序列辨 識編號：13)及0RF-7(nt 1403-1771，序列辨識編號：16) 。0RF-4位在所得序列的5’端，在序列辨識編號：8 1938 bp 3’端的序列中為不完整的。0RF 5、6及7每個皆有編碼 多於100個胺基酸的能力，且0RF 5與6是有彼此有10bp的 交集處，0RF 6與7是有彼此有5bp的交集處。完全位在0RF 7內二個小0RF亦被發現，其分別僅编碼37aa及43aa。另 二値短的0RF完全與0RF 5相交集。該二0RF的编碼能力分 本紙張尺度適用中國國家標準·（ CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 65 517085 蛵濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 _B6 _ 五、發明説明（όβ) 別為29aa及44aa。由北方點墨分析，沒有專一的次基因組 iaRNA征與標的PRF相關連的。0RF 6及7—般相信為分別编 碼病毒膜蛋白及鞘蛋白。 (D )引導子（leader)接合處之一致（consensus)的序列 序列分析顯示該一短的序列動因處（mot if) AACC可作 為在次基因组mRNA處，該處引導子於轉錄時加入（接合處 )。0RF 6的接合處是由ATG起始碼上游21bP處發現，0RF 7的接合處是由ATG起始碼上游13bp處發現。在0PR 5中無 鑑定出AACC—致的序列，雖然在LV的0RF 5中是有發現的 :‘相似的接合處序列亦是在LDV及E AV中發現。 (E ) 3 ’ -非轉譯區的序列及聚（A)尾端 在0RF 7的停止碼後的核苷g§長之非轉譯區序列在ISU -12病毒的基因組中鑑定出（其上與在LV中的114nt、LDV 中80nt以及EAV中的59nt相比）。該聚（A)尾端的長度至少 13核苷酸。在PIP病毒、ISU-12、LV及LDV在接近該聚U) 的尾端處有一致的序列CCGG/AAATT-聚（A)。 (卩）在0以5,6及7與非轉譯區序列上1311-12與[^/基因組 的序列比較 ISϋ-12與萊西斯倍德病毒的基因中ORF-5區的比較是 顯示於第21圖。0RF-6區、，0RF-7區以及非轉譯區序列的相 對比較分別顯示於第22、23及24圖|:· 比較的结果代於下表EI。與上述相符的，一病毒被|δ 為是免疫上相等的，若與一免疫原性的病毒其有90%或 高相似性。在LV及ISU-12之0RF 5、0RF6、0RF7上的核苦 -66 - .9· 6.〇〇〇 本纸張尺度適用中國國家橒準（CNS)甲4規格（210 X 297 ϋ ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· •freJ· 線· 517085 A6 B6 五、發明説明（（Γ) 酸序列以及非轉譯區序列相似性分別為60%、68¾、60¾以 及 58%。 在LV中的0RF 5及6的大小為61nt，其比在ISU-12中的 0RF 5及6分別小3nt。相反的，在LV中0RF 7是比在ISU-12 中的大15nt。同時3’端的非轉譯區的序列在長度上是不同 的（在ISU-12中為150nt，但在LV中為114nt)。同於LV， 該接合處序列AACC亦是在PRRS病毒分離株ISU-12的基因組 中鑑定出（除了 0RF 5外）·:’在ISU-12中0RF 6接合處序 列是由起ATG始碼的上游21nt處，然而在LV中0RF 6的接合 處序列是在ATG上游處28nt。 (請洗¾讀背面；足注薏事項再堉寫本頁〕 ’裝· 訂· 線· 絰濟部中央標準局R工消費合作社印製 517085 A6 B6 五 、發明説明Αέο 差 1 來西斯倍德病毒舆ISU-2之ORFs 和非轉譯區序列的特徵 萊西斯倍德病毒「us PRRSV I S U-12 大小（bp) 接合序列< Seq.( nt 由 atg) Sequence Homology (°/〇) 大小（bp) 接合序列 Seq. ( nt 由 ATG) ORF-5 6 0 5 AACC (ATG-36) 6 0 6 6 6 No ? ORF-6 (Env) 5 2 1 AACC (ATG-28) 6-8 5 2 5 AACC (ATG-21) ORF-7 (NP) 3 8 6 AACC (ATG-1 3) 60 3 7 1 AACC (ATG-1 3) NT 113 5 8 15 0 請 閲 讀 之 事 項 再 填 寫 本 頁 裝 訂 m 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 68 - 太蛾饵尺庁滴用伞K®玄过並（CISiS)甲4 «这X川7，、瞀、 S2. 9. fi-000 517085 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 _ B6_ 五、發明説明（^) 實驗IV 在昆蟲細胞中愛荷華菌株的惑染因子的表現 (A )重組捍狀病毒的産生 0RF-5、0RF-6及0RF-7的序列是分別地藉由使兩基於 ISU-12基因組核苷酸序列的引子作PCR加以放大。0RF-5的 放大是使用下列引子： 5 ,-GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-3,(序列辨識編號：26 ) 3 ’ -GGGAATTCGC CAAGAGCACC TTTTGTGG-5，（序列辨識综號：2 7 ) ' 0RF-6的放大是使用下列引子： 5 ,-GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-37 (序列辨識編號：28 ) 3，-GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5，（序列辨識编號：29 ) 0RF-7的放大是使用下列引子： 5 ,-GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-3，（序歹ii # 議編號：30 ) 3 7 -GGGAATTCAC CACGCATTC-5， （序歹[J 辨識缀號：3 1 ) 放大的DN AM斷選殖入捍狀病毒傳遞載謾PVL1393 (得自 Inv i trogene) ：r 將一 徼克的直線化的桿狀病毒AcMMPV (得 自 P h a r m i n g e n , S a n D i e g 〇 , C a i f 〇 r n i a j & 2 徵克的 P C R .ώ 大選殖之含有c D H A載iM建1·冓iS與5 0 u丨的1丨p o f e 11 n混合’ 且在2 2 °C下培育1 〇分鐘，以製備一性狀感染的混合物° 在播灑H I-F IVE細胞後1小時’該培養基·以新鮮的Exc ell 400毘蟲細胞培養基（得自Scientific Co.)取代 ，且該性狀惑染混合物是以滴入的加式邡入。所得的混合 物在2δϊ:下培育6小時，而後’去除該性狀惑染培養基， 加入新鲜的Ε X c e U 4 0 0昆蟲細跑培養基：、而後所得的混合 -69 - (請先«讀谇面之注意事項再填寫本頁) 裝- · 線. 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 x 297公笔) 32. 9. 6,000 517085 A6 B6_ 五、發明説明（&) 在28 °C下培育。 性狀感染後五天，收集該培養基且使其澄清。上清詨 10倍的稀釋液接種至Η I - F IV E細跑且在室溫下培育6 0分鐘 ，將1 . 25¾的瓊脂覆蓋層應用於該細胞上，在28 :C下進行 培育4天，此後，選擇出澄清的斑點，且以無菌的巴氏德 滴管挑出。每一斑點是與lml的Grace’s毘蟲培養基混合至 一 5m I之可関上蓋子的試管中，且置於一冷藏室中過夜， 以由該瓊脂中釋出病毒。試管在2000g下離心30分鐘以去 除瓊脂，且該上清液轉至一新的無菌試管中。重覆斑點纯 化步顏三次去避免可能發生的野生種病毒的污染◊纯的重 組的殖株在-80 C下保存以作更進一步的調查。 (B )重組愛荷華謹株感染因子蛋白質的纯化。 間接的免疫螢光反應分析以及放射性性免疫沈黯測試 為使用作其表現的評估。 間接的免疫螢光分析：顯示於第25圖之在24孔細跑培 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印4i 養盤上的H i -F i、/e昆蟲細跑以野生型的桿狀病毒或重組捍 狀病毒作感染或作模擬感染：·在72小時後，固定該細狍且 以合適稀釋度的福隻抗-IS U - 1 2多株抗證·(牛染色，Γίϋ 以 螢光素-異氰酸g旨標記的（FITO標記）抗豬隻IgG染色： 如第26-29圖所示，在以重組病毒所惑染的細胞中可産生 免疫螢光反應，但在模擬的感染細胞以及以野生型桿狀病 毒接種者則不會産生。例如，第26圖示以含有ISU-12 0RF-6基因重組桿狀病毒（&aculo.PRRSV.6)感染的HI-FIVE可顯示出一細狍病理效用◊第27圖以含有ISU-12 -70 - S2. 9. 6.000 本纸張尺/f適用中as玄橒準（CNS)甲4规格（210 X 297 517085 Α6 Β6 五、發明説明 01^-7基因重組捍狀病毒（&^111〇.?{^517)感染的111-F IVE其亦顯示忠一細胞病理效用。相似的结果可以含有以 含有ISU-12 0RF-6基因重組捍狀病毒（BacuIo.PRRSV.6) 感染的HI-FIVE可顯示出一細跑病理效拐。第27圖以含有I SU-120RF-5基因重組桿狀病毒（Baculo.PRRSV.5，結杲 未顯示）可得相似的結果。第28及29圖顯示以分別含有工SU -12 0RF-6以及ISU-12 0RF-7基因的重組捍跃病毒所感染 的HI-FIVE以豬隻對ISU-12的抗血清加以染色，而後以螢 光素-缀合的抗-豬IgG加以染色，其中該昆蟲細狍會産生 重組愛荷華菌株感染因子蛋白。相同的结果是可以含有 0 F: F - 5之重組捍狀病毒中得到。 放射性免疫沈潑法：放射性免疫沈證法是.以每一重組 病毒（B a c u i 〇 . P R R S V · 5、B a c u 1 ο · P R R S V . 6 及 B a c u 1 〇 . P R R S V · 7)加以進行，以更進一步決定該重組蛋白的抗原性以及真 實性。HI-FIVWE昆蟲細胞是模擬感染或是以每一種重組捍 狀病毒感染。感染後2天，加入不含字硫胺酸的培養基加 入。每一混合物培育2小時，而後加入_記蛋白質的3 SS-甲硫胺酸（Adiersham) ··且該混合物額外再於28°C下培育四 小時。藉由三次的冷凍解冷的循環製睛出放射性標記的細 胞溶胞液，且該細胞溶胞液與預免疫或免疫的抗-ISU-12 抗血清_培育：·該免疫複合物以蛋白質A瓊脂加以沈殿，且 於沸騰後在SDS-PAGE上作分析：於-30%下將X-光Η暴露 .於該凝嘐上，且展開。預期大小的染色帶撿測岀為0RF-6 (第30圖）以及0RF-7 (第31圖）産物： (請¾閲讀背面之注意事項再堉寫本頁1 丨裝· 、ΤΓ. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 -71 - 517085 A6 _B6_ 五、發明説明γ 實驗v 如在下表4所列的其它PRRSV樣品是斑點純化三次的， 斑點純化的進彳Ί是藉由在P S P - 3 6 - S A Η細胞中培養澄清的組 織均質液，且選出一單一的斑點，且推論該斑點是由單一 病毒所産生的。培養該選出的斑點，且再選出一單一的斑 點，而後培養，再度再選出單一斑點，而後作第三次的培 養。IFΑ是 ί吏用購自 South Dakota State University， B r ο o k i n g s , S o u t h D a k o t a 的抗-P R R S V 單株抗 fl 加以進行 一選用作更進一步研究的些分雞樣品是鄕鑑定tb如下 表5，且以其病原性以及mR Η A數目加以分類。 (請“先閱tt'背面之注意事項再堉寫本 丨裝- ,ΤΓ. :線‘ 經濟部中央標準局兵工消費合作社印製 -72 - 517085 A6Ββ 五、發明説明
Vi 表4PRRSV三次斑點纯化的分離株 PRRSV 製備冷凍儲 PRRS單株抗體 償數 5 分離株 液之日期 結果 TCID5〇/rnl ISU-22 9/15/92 + 1〇5·57 土 0.15 ISU-28 9/15/92 十 1〇5·14 土 0.23 工SU-12 9/17/92 + 1〇4·33 土 0.21 ISU-3927 9/21/92 十 1〇3·56 土 0.17 10 ISU-984 9/21/92 + 1〇3·89 土 〇.24 ISU-7229 9/22/92 + 1〇3·45 土〇·2〇 ISU-92-11581 9/22/92 十 1〇2·39 土 〇·17 ISU-695 10/01/92 + 1〇4·49 土 〇.2〇 ISU-79 10/01/92 十 1〇5.69 土 〇·25 15 ISU-412 10/01/92 1〇5 · 31 土 〇 # 5〇 ISU-55 10/01/92 + 105·54 土 0.10 ISU-33 10/05/92 • 十 105 * 36 + 0.21 ISU-1894 10/27/92 1〇5·18 土 〇.33 ISU-〇4 10/27/92 - 1〇5.73 ± 〇^24 20 ISU-51 2/07/93 1〇4,59 二 0.15 ISU-30262 4/01/93 1〇5*99 +0.24 ；~ 株是 (請tM讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝· φ 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 73 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公分） 32. 9. 6.000 517085 A6B6 五、發明説明 表 5 分離株 焉原性 • inRHiTs的數目 ISU-12 非常具病原性 7 ISU-984 非常具病原性 7 ISU-3927 輕徼病原性 Ί* 工SU-51 輕微病原性 1 7 ISU-22 非常具病原性 9 ISU-55 /輕微病原性 9 ISU-79 非常具病原性 9 此 5是閲栽背面之：¾意專再填寫本頁 丨裝· ’ s顯示出有剛 未斑點纯化的ISU-12、斑點纯化ISU-12、ISU-22、ISU-51以及131]-3927皆在布達顚斯協約在寄存於/\^「〇：丨^
Type Culture Collection, 12301 Park lawn Drive, Rockville，Maryland 20 850，U.S. A.，前二者是在 1992 年10月28日寄存，且寄存編號為VR 2385、VR2386，旦後 四者是在1992年九月30日寄存，且寄存编號分別為VR 2428 、VR 2429、VR 243Q 及VR 2431 〇 在iSU-3927之mRHA中顯示在iriimRHA中的四彳固有_除 鼂 的現象：：ISU-3927的mRNA 4、5、6、及7之移動比ISU -12者為诀，因此，是比ISU-12為小：該持ί教可能是與該 ISU-3927具有較低的病毒性有闊。 訂. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 74 517085 A6 B6 五、發明説明) 六値分離株的病原是是在五週大的CDCD豬隻中作比較 ，15隻豬隻接種l〇5TCID5c^病毒。1〇隻豬隻在1〇 DPI時 解剖，五隻在2δ DPI時解剖。病毒分離株IDU-12 ·、ISU-22 以及ISlj-28是最具病原性的，然而ISSU-51以及ISU-55是 具有低的病原性。在先前的研究中，該ISU-3928對五週大 的豬隻僅為輕徵病原性的。 由ISU -22以及未斑點純化（也就是未斑點纯化之分難 出的感染因子）ISU-12所造成的損害持續較長的斑點純化 的分離株産生輕徵的心肌炎以及腦炎。未斑點-鍵化病毒 産生稍徼比其相對斑點純化分雞株榖重的疾病。 CDCD小豬提供一對病原性以及可能作為疫苗之效周上 的評估之一良好模式。該分離株ISU-1.2、ISU-22以及ISU-984産生相似損害，且可使闱以> 估疫苗效闬（基於整證 以及徵觀上的損害之撿驗）。該ISU-3927較不具病毒性， 但是一足以評估作為對抗P R R S V病原®株的疫苗。 以斑點纯化ISU-12惑染的豬在23天内所得到的重量约 為9.9磅，比控制組為少（.以未感染的卩$卩-36細跑加以 作用）。初期的结果顯示在2-10DP I有淋巴球減少症以及 嘻中性白血球增多症。 經濟部中央標準局Λ工消費合作社印« 僅該些以未斑點纯化ISU-12感染的豬隻發展岀顯著的 腦炎，:在任何以生物上選殖出（斑點-純化）愛苘華菌株 分離株作周的豬隻中並無鼻炎的發生.:，相反的，當組過 濾液《未斑點-純化分雞株）使甩作為接種物，鼻炎是十 分嚴重的。 -75 - 517085
A
6 B 五、發明説明 以ISU-12未斑點斑點、ISU-12斑點純化、ISU-22、IS 1]-984、1$11-3927以及未感染的？$卩-36細跑所感染的〇0(：[) 豬隻之病原性以及組織學上结杲是摘錄於下表6 — 12。 在該些表中，整饅肺部損害分數代表肺结實化的的膾分率 (也就是具有肺炎疾病的肺部組織百分率，顯示出損害性 )。分數是基於〇至100%的肺結實化的程度。”ND”是指整 體肺部的損害的分數是未定出的。 (請^Mitt面之注乞事項再填寫本頁)‘ 表6 分離株 3 DPI 平均分數 7 DPI 平均分數 ίο Dpi 平均分數 21 DPI 平均分數 28 DPI 争均分數 36 D?工 未斑點純化之 ISU-12 29 56.3 77.3 37.25 6.0 ND ISU-12 20.5 35.5 77.5 25.0 0.0 〇 ISU-22 26.5 35.0 64.75 36.5 11.0 〇 ISU-984 7.25 21·7 5 76.0 21.0 0.5 〇 ISU-3927 13.5 20.0 10.5 0 0.0 0 PSP-36 0 0 0 0 0 〇 未接種 〇 〇 〇 ----- 0 0 〇 丨裝.
經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 在上表6中，” u η P 1 ”是指未斑點纯化者，” u n i 〇 c . ”是 指未接種◊ 在上表6的结杲中顯示ISU〜12以及[slj-22産生的損害 是比其它分離株持續更長：·由ISU-12以及1SU-22以及1SU- —76〜 本纸張尺度迺用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 32. 9. 6,000 517085 A6 B6 五、發明説明（fjT) 9δ4産生的損害性具有相似的損害性。由ISU-3927産生的. 撗害是不太嚴重，且是比其它分離株所産生的損害更早可 解決。所有整Η的損害是可在36 D0PI時解決。 該病原性的結果是呈現於下表7 -1 2 (其基於在上表 1所提出的簌重程度為基礎）。在下表7 -12 thi ck”意指組織間質變厚，”alv. exud.”意指肺胞滲出液， 且” e n c e p h a 1 ”意指腦炎。 (請洗閲讀背A之泫意事項再堉寫本頁！ •裝. 訂. 線- 經濟部中央標準局兵工消費合作社印製 77 - 517085 A6 Ββ 五、發明説明 -fcr ί-ρ 在3 D?1[的徹觀損害 損害 ISU-12 斑點純化 ISU-12 ISU-22 ISU- 984 ISU-: 3927 PSP-36 控制組 型S + + + + + - + - 合胞證 + + + - - 一 組鐵間質變厚 + + + - + - 肺胞滲出液 + + + - + - 心肌炎 - - - - - 一 腦炎 i - - - - - - 表 8 在7 DPI的微觀損害 (請先M讀背面；之注意事項再填寫本頁^ -裝. · 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 損害 ISU-12 斑點纯化 ISU-12 ISU-22 ISU -984 ISU- 3927 PSP-36 控制組 \m I + + + + + + + + + + + + + + + + - 合胞證 + + + + + + 丨"_ - 組織間質變厚 + + + + + + + + + + + + + - 肺胞滲出液 +十+ + + + + + + + + + + - 心肌炎 - 一 - - - - 腦炎 - - - - - - -78 - 線. 太K從，1?泠硗珀Φ a ®玄过進ί广Νς )甲!邛这f ?】D V 9Q7 '、哧、 π Ο η. 000 517085 A6 B6 五、發明説明 (”) 表 9 在10 DPI的徼觀損害 損害 ISU-12 ^斑點純化 ISU-12 ISU-22 ISU- 984 ISU -3927 PSP-36 控制組 型E + + + + + + + + + + + + + + - 合胞體 + + + + + + + + - - 組識間質變厚 + + + + + + + + + + + + + + - ,肺胞滲S詨 + + + + + + + + + + + + + - 心肌炎 + - - ! - - - 腦炎 + 一 - - - - 表 10 在21 DPI的徹觀損害 經 濟 部 中 央 標 準 消 費 合 作 社 印 製 損害 ISU-12 斑點純化 ISU-12 ：ISU-22 ISU- 934 ISU- 3927 PSP-35 控制組 型E + + + + 十+ + + + + + + + + - 合胞證 1 + + + + + + + + 一 組織間質變厚I + + + + + + + + + + + + + + 一 肺胞滲岀液 + + + + + + + + +十 1 I - 心肌炎 + + + + + 1 + + 1 +十 + 一 腦炎 i + + 一 - ^7- ) - -79 - 517085 A6 Ββ 五 發明説明（4#) 表 11 在28 DPI的徼觀損害 損 害 ISU-12 斑點純化 ISU-12 ISU-22 ISU -934 ISU -3927 PSP-36 控制組 型H +屮 + + + 〇. + - 合胞體 + + + + + - 篇鐵間質變厚 + + + + + + - 肺胞滲出液 + + + + + + + + - 心肌炎 + +十+ +十 + + + + +十 + - 腦炎 + 一 - - 表12 在36 DPI的徹觀損害 損害 ISU-12 斑點纯化 ISU-12 ISU-22 ISU -934 ISU- 3927 PSP-36 控制組 型I ND + /- + /- + /- + /- - 合胞體 ND — - - 1 - 組織間質變厚 ND + /- + /一 + - - 肺胞滲出液 ND - + /- , + /- 1 - 心肌炎 丨 HD丨+/_ - 丨 1 卜二」， 腦炎 ND | - - + /- -卜 1 8( 517085 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 __Ββ_五、發明説明 在7 DPI，由ISU-12、ISU-22以及ISU-984産生的肺部 損害是嚴重的，且彼此相似的。在7DPI時，由ISU-3927産 生的肺部損害僅是輕微或是中等簌重的 在 10 DPI，由 ISU-12、ISU-22 以及 ISU-984 産生的肺 部損害相似於7 DP I，更為駸重。僅有以未斑點純化ISU -12感染的豬隻顯示出輕徼的腦炎以及心肌炎。在10 Df I， 由ISU-3927産生的損害是近乎被解決的。 在21 DPI，由末斑點純化的ISU-12産生的心肌炎是嚴 重的，而由ISU-12 ·、ISU-22以及ISU-984産生的心肌炎是 中等的。在21 DPI，僅有由未斑點純化的ISU-12之豬隻具 有中等程度的腦炎。 在28 DPI，肺部損害在以未斑點純化的ISU-12以及 ISU-22所感染的豬隻中具有中_程度的肺部損害。該些分 離株在28 DPI産生嚴重的心肌炎。但是，由ISU-12、ISU-984以及ISϋ-3927所産生的肺部損害是在28 DPI時近乎解 決。 在36 DP I，所有的損害基本上皆被解決，每組僅有一 隻豬隻在36 DPI撿驗。 實驗VI 在活體中進行交叉中和研究，c DCD豬隻-首先在内箅腔 内以選自ISU-12、ISU-934以及ISU_39272®株接種·，然 後四週後，該豬隻再以ISU_12加以作闬在以ISU-12作周 後，於8 D P I時撿查其肺部損害以及其它疾病病症。控制 (請先閲諫背面之注意事項再填寫本頁一 丨装· 訂· Μ線· -81 - 517085 Α6 Β6 五、發明説明（j>〇) 組僅以ISU-12作用，其结果呈現於下表13 ° 下表13所呈現的病原性结果是基於相同於表1所呈現 的嚴重程度。在下表13中，，” I n t · t h i c k ”意指組織間質 變厚，”alv. exud.”意指肺胞·彦出液，旦”encephal”意指 腦炎。 表 13 在活體中交叉相和反應 (請杰閣讀·背面之注·意事項再填寫本頁)為 損害 I -12 而 後 1-12 控制組 而後1-12 1-22 而 後 I-12 I-934而 後 I-12 3927 而 後 1_12 型I + + + + + + + + + + 合胞 - +十 + + + + 組織間質變厚i + /- + + + + + + + 肺胞議出液: + + + + + + + + + + 心肌炎 ; + - + + + + + /- + 腦炎 : + + - - - - 1裝· 訂. •線. 在上表13中的資料中顯示ISU-12提供保護以對抗由 1$1]-12所引起的豬隻疾病病症。1$1]-984提供保護，以對 抗由ISU-12引起的PRRS—些病症以及臨床上的徵典：，ISU-12是已知的PRRSV病毒中最具病毒性的菌株之一 但是，ISU-3927，是PRRS病毒愛荷華菌硃輕徽病原f生 的變種，其可提供該等分離株的最大的保護，該分離株可 研讀作為對抗其後以ISU-12作用疫Μ 因此，ISU-3927 太尺斥漓闱中《固玄樣準（CNS)甲Ο見格（210 297公分 32. 9. 6,000 517085 A6 __ _ B6_ 五、發明説明（<?7) 使用作為活疫苗的商業上使用的c_ 實驗 10 CDCD豬隻的一组以列於下表14的PRRSV愛菏華菌株 的分離株加以接種，或以未感染的PSP-36細胞作為控制組 ，該豬隻五週大時，以列於下表14的每一種病毒分離株 10 5 TC IDs Q自鼻腔内接種，該豬隻在10 DPI時解剖。 在10 DP I時的平均整體肺部損害分數是提供於下表13 作為該分離株的病原性的指標：·該標準偏差（SD )是提供作 為該平均整體肺部損害分數在統計意義上的指標 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 S3 517085 A6 B6 五、發明説明（P>) TA3LS 14 接種 N 在10 DPI平均整 體肺部損害分數 SD PSP-36 10 0.0 0.0 ISU-28 10 62.4 20.9 ISU-12 10 54.3 9.8 ISU-79 10 51.9 13.5 ISU-1894 10 27.4 11.7 ISU-55 10 20.8 15.1 ISU-51 10 16.7 9.0 (請tw讀背面之注意事項再塡寫本頁1 •裝. 下表15提供整體肺部損害分數统計上的比較 *ΤΓ. 表15 整體肺部損害分數的比較 蛵濟部中央標準局貝工消費合作社印製 比 較 -t的 值：t P > 丨七丨 控制組與 12 9 .43 P < .001 控制組與 28 10 • 83 P < .001 控制組與 51 2 .89 P < • 01 控制組與 55 3 . 61 _ P < .001 控制組舆1894 ‘4 • 76 P < .001 控制組舆 79 9 • 00 P < .001 12 - 舆 28 1 .41 P < 2 -84 - •線. k iliZt P sn tb QST IX! 4* -；u f Γ\Ό.\ Φ ^ i0 ^ ^ 9 1 Π V 907 A' \ 517085
A
6 B 五、發明説明（5$) 12 舆 51 6.54 P < .001 12 舆 55 5.82 P < .001 12 舆 79 0.43 P > .5 12 , 舆 1894 4.76 P < • 001 28 •舆 51 7.94 P < • 001 28 舆 55 7.22 P < • 001 28 與 79 1.83 P. < • 1 28 與 1894 6.06 P < • 001 51 m ；55 0.72 P < .5 51 與 79 ' 6.11 P < .001 51 與 1894 1.87 · P < .1 55 與 79 5.39 P < • 001 55 與 1894 1.15 P < .3 79 舆 1894 4.24 P < .001 (請先•閲讀ir面y注意事項再堉寫本頁)痛 丨裝· 、Tr· 丨線· 經濟部中央標準局R工消費合作社印製 -85 - 太鉍汴芡逢闳伞团®玄ϋ進（W«0甲4 49这（210 乂扣7 Λ、替） S? Q fi 000 517085 C6 D6 五、創作説明（#) 此外，每組的豬隻作呼吸窘迫的撿驗，該呼吸窘迫的 檢驗為ί衣如上所述的據臨床上呼吸分级条统（見於下表1 6 臨床上分數平均值）。整Si分數是指如上所述的整謾肺部 損害的分數。” Enceph.”，”myocard.”及” rhinitis”是指在 每組分別顯示出腦炎、心肌炎以及鼻炎的豬隻數目。”微 數目（Micro score) ”是指基於下列程度而評定的分數.，其 使用於評估且比較在肺組織中組識間質肺炎的微觀損害： 〇=無疾病；肺部組織正常 1 =輕徵多膣病m性的擻觀損害 2=輕微擴散性的微觀損害 - 3二中等多値病巢性的徼觀損害 4 =中等擴散性的徼觀損害 5 =駸重多値病《性的徽Μΐ損害 6 =翳重擴散性的徵觀損害 微觀的損害是可在不顯示出整il損害的組織中觀察到 ，因此，該”微數目”提供一頷外的平均值，號以評估且比 較該些分離株的病原性，此外，亦可評估且比較整疆肺部 的損周、呼吸窘迫、發熱等。 (請先閲讀、背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝· 訂- 經濟部中央標準局员工消费合作社印« -86 - •k ZL ΰ> rfi tb WT 4* -；tl i r N： Q ^ Tp d -10 f ^ 1 Π V 9Q7 ) 517085 A6 B6 五、發明説明（Μ 經濟部中央標準 消 費合作社印
#炎丨 LH ιΗ «Η CN *Η rH κη *—Η \ νο 叫 σ\ LH rH in rH CO 心肌炎 in rH 守 <Ν CN ιη ιΗ ν〇 11/15 vn fH cn 10/15 鉍‘ m m rH ♦Η 2/12 丨 ΙΟ *Η αο , ιη rS 卜 un r-i in i-H 10/15 28 DPI微 觀分數平 均值 CN Ο Ο ν〇 rH CN o m o n σ\ 28 DPI整 體分數平 均值 ο ο ο rH Μ Ο ν〇 o CN m v£) m <r O CO 掛. ο \Τ) CN ΧΓί CN m CN CN n 〇 CO 10 DPI整 體分數平 均值 ο 々 0^ •Η Ο CN •Η ν〇 CS C7N rH in \Ti un 〇 10 DPI嗎 床上分藏 的平均值 ο CN Ο LO rH rH r-( cr* CM y * m 5DPI_lf 上分滅尚 平均值 ο fH ο rH ι-ί L〇 CN in rn L〇 r-i O 分離株 PSP-36 ι -1 ISU-51 ISU-55 ISU-1894 ISU-79 CN I 3 c〇 H ISU-2Q 請 «讀背之注意事項再寫
裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7 五、發明説明（抓） 實驗· 由每一 ISU-12、ISU-22、ISU - 55、ISU-79、ISU-1894 以及ISU-3927所感染之PSP-36細胞中分離出mRNA ’且在 1. 5 %的瓊脂上作分離’去逹成較佳次基因組的分離°可觀 察到二組的移動型式° 組 I 包含 ISU-12、ISU-1894、ISU-3927以及可能的 ISU-51。ISU-12的北方點墨結果顯示於第32圖’ ISU-1894 、：[S U - 3 9 2 7以及IS U - 5 1的北方點墨結果顯示於第3 3圔，類 似於萊西斯倍德病毒七個次基因組的fflRNA (在第32及33圔 中標記1至7 )為該分離株的每一個，該次基因組ffl R N A的大 小（s g R N A)是相似於萊西斯倍德病毒者。 組I[包含分離株ISU-22、ISU-55及ISU-79’其具有 九個SgRNA而非t個，組2 SgRNA 1、2、3、6及7是相同於 組I 1但二個額外的s g R N 8 A S是在組I S g R N A 3及6間的’ 在第3 3圖以箭頭加以顯示。 初始的結果顯示組2的病毒比4組I的分離株複製的 更佳，但可能在P S P - 3 6細胞的IS U -1 2為例外。然而’在一 些例子中，若與組2的分離株相比，IS U - 1 2的複製是非常 差的。
實驗K
在三週大的P R S S V血清陰性反應的S P F豬隻中進行豬隻 生殖性以及呼吸性病症病毒（PRRSV)修飾過的活疫苗較力 的研究。該疫苗由每2mi中為10「8TCID5df點純化PRRSV 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
517085 經濟部中央標準局R工消费合作社印製 A6 _B6_五、發明説明（7) ISU-12 (愛荷華菌株.）的劑量所組成◊九隻豬隻藉由鼻腔 内路徑（ΠΓ)施予單一的疫苗劑量，且九隻作不接種疫苗的 之作用以作為控制組（HV/CHALL)。接種疫苗組以及控制組 在接種後35天作效用對有效性作測試，而後在有效性測試 後10天計算出整體肺部損害的分數（肺部受惑染的百分率 )0 每一組豬隻的平均肺部整體損害的分數是藉由在第3 4 圖中的每一長條之數目加以顯示出。疫S的效力評估是藉 由在肺部損害分數的降低加以評估。受接種的二組顯著的 比無接種的控制組更低（ρ<〇 . 01)整肺部損害分數。在接 種的二組中分數上並無顎著的不同，ISU-12 PRRSV疫苗被 證實在三週大的豬隻中以10 5 ‘ 3 TC ID ^劑量是具有效闱的 其它的觀察 ISU-12病毒為具被膜的，且是對氯仿處理敏惑，ISU-12的複製對5-溴去氯尿苷處理是具有抗性，因此，ISU-12 並非一 D Ν Α病毒。IS U - 1 2缺少红血球凝集活性： 頻然的，因上述的教示使得本發明可能有許多修飾與 變化，其是可被了解的，且在所附的申請專利範圍中，除 非在此有待別的敘述_，一般本發明是可實施的。 (請洗閲請背面；足注•意事項再堉寫本頁一 丨裝· 、Tr· 線- 太鉍邙疋泠硗珀Φ»®它过迮f 甲4抽这V ?Q7 Λ、昝、 q non 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7 五、發明説明（你） 序列耒 U) —般資料： (i )申請人：普倫S ·保羅 派屈克G .哈伯 孟祥進 楊格S .萊歐 梅麗莎A .蘭姆 (ii )發明名稱： 引起對抗導致豬呼吸性及生殖性疾病病毒之免疫 反應的疫苗，保護豬免受由呼吸性及生殖性病毒 所引起的疾病之方法，引起對抗導致豬呼吸性及 生殖性疾病的病毒之免疫反應的疫苗之製法，以 及培養病毒的方法 · (註··本案之發明名稱與本案之美國相關申請案的 發明名稱不盡相同，因此，上述發明名稱偽 以本案所具者為準） (m )序列數目：31 (iv )聯絡住址： U)聯絡人：oblon，spivak, McClelland，
MAIER & NEUSTADT (B) 街名：S.傑弗遜戴維斯高路1755號400室 (C) 市名：阿靈頓市 (D) 州名：維吉尼亞 (E) 國家名：美國 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）_ 90 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
517085 A7 B7 五、發明説明（) (F)郵遞區號：22202 (v )電腦可讀取的型式： (A)媒體型式：軟碟 (B )電腦·· IΒ Μ P C可相容的
(C) 操作条統：PODOS/MS-DOS (D) 軟體：Patentln Release tfl.O，版本ίί1·25 (vi )現今的申請資料： (A)申請案號：USSN 08/131 , 625 (B )申請日：1993年10月5曰 (C)分類： (vii )先前申請資料·· (A)申請案號：USSN 07/969,071 (B )申請日：1992年10月30曰 (viii )專利代理人資料： (A) 姓名：拉維雷依，珍-保羅M.P. (B) 註册號碼：31,451 (C) 參考 / 檔案編號·· 4625-016-55X CIP (ix )電傳資料： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (A) 電話··（703) 413-3000 (B) 傳真：（703) 413-2220 (C) 電報·· 248855 OPAT UR (2)序列辨識編號1之資料： (i )序列的特徵： (A)長度：22個氮鹼對 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7 五、發明説明 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) _株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號1 CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT (2)序列辨識編號2之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：22個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型··單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) M株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號2 CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG (2)序列辨識編號3之資料： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 92 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ♦衣·
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7__ 五、發明説明（) (i )序列的待徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) _株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號3 GCCGCGGAAC CATCAAGCAC (2)序列辨識編號4之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式·· cDNA (vi )原始來源： (A )器官··豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B ) _株··愛荷華 (C)各別的分離株·· ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）-93- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 517085 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（p) CAACTTGACG CTATGTGAGC (2)序列辨識編號5之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 U )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官··豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) g株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號5 GCGGTCTGGA TTGACGACAG (2)序列辨識編號6之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類··核苦酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式·· cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) _株：愛荷華 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐）-94 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7 五、發明説明（作） (C)各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號6 GACTGCTAGG GCTTCTGCAC (2)序列辨識編號7之資料： (i )序列的特徽： (A)長度：20個氮鹼對 (B )種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii)分子型式：cDNA * (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號7 GCCATTCAGC TCACATAGCG (2)序列辨識編號8之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：2062個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：雙股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -95 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
517085 A7 B7 五、發明説明（〆〆） (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (ix )特徵：
(A) 名稱/索引：CDS (B) 位置：2 · · 41 2 (X i)序列的描述：序列辨識編號8 G GCA GGC TTT GCT GTC CTC CAA GAC ATC AGT TGC CTT AGG CAT CGC 46
Ala Gly Phe Ala Val Leu Gin Asp lie Ser Cys Leu Arg His Arg 15 10 15 AAC TCG GCC TCT GAG GCG ATT CGC AAA GTC CCT CAG TGC CGC ACG GCG 94
Asn Ser Ala Ser Glu Ala lie Arg Lys Val Pro Gin Cys Arg Thr Ala 20 25 30 ATA GGG ACA CCC GTG TAT ATC ACT GTC ACA GCC AAT GTT ACC GAT GAG 142 lie Gly Thr Pro Val Tyr lie Thr Val Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu 35 40 45 AAT TAT TTG CAT TCC TCT GAT CTT CTC ATG CTT TCT TCT TGC CTT TTC 190
Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe 50 55 60 TAT GCT TCT GAG ATG AGT GAA AAG GGA TTT AAG GTG GTA TTT GGC AAT 238
Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn 65 70 75 GTG TCA GGC ATC GTG GCA GTG TGC GTC AAC TTC ACC AGT TAC GTC CAA 286
Val Ser Gly He Val Ala Val Cys Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gin 80 85 90 95 CAT GTC AAG GAA TTT ACC CAA CGT TCC TTG GTA GTT GAC CAT GTG CGG 334
His Val Lys Glu Phe Thr Gin Arg Ser Leu Val Val Asp His Val Arg 100 105 110 CTG CTC CAT TTC ATG ACG CCC GAG ACC ATG AGG TGG GCA ACT GTT TTA 382 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu 115 120 125 GCC TGT CTT TTT GGC ATT CTG TTG GCA ATT TGAATGTTTA AGTATGTTGG 432
Ala Cys Leu Phe Gly lie Leu Leu Ala lie 130 135 GGAAATGCTT GACCGCGGGC TGTTGCTCGC AATTGCTTTT TTTGTGGTGT ATCGTGCCGT 492 CTTGTTTTGT TGCGCTCGTC AGCGCCAACG GGAACAGCGG CTCAAATTTA CAGCTGATTT 552 ACAACTTGAC GCTATGTGAG CTGAATGGCA CAGATTGGCT AGCTAATAAA TTTGACTGGG 612 CAGTGGAGTG TTTTGTCATT TTTCCTGTGT TGACTCACAT TGTCTCTTAT GGTGCCCTCA 672 CTACTAGCCA TTTCCTTGAC ACAGTCGGTC TGGTCACTGT GTCTACCGCT GGGTTTGTTC 732 ACGGGCGGTA TGTTCTGAGT AGCATGTACG CGGTCTGTGC CCTGGCTGCG TTGATTTGCT 792 - - - ____________：_______________ ---..— ' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）- 96 - 517085 A7 B7 五、發明説明（^Γ) TCGTCATTAG GCTTGCGAAG AATTGCATGT CCTGGCGCTA CTCATGTACC AGATATACCA 852 ACTTTCTTCT GGACACTAAG GGCAGACTCT ATCGTTGGCG GTCGCCTGTC ATCATAGAGA 912 AAAGGGGCAA AGTTGAGGTC GAAGGTCACC TGATCGACCT CAAAAGAGTT GTGCTTGATG 972 GTTCCGCGGC TACCCCTGTA ACCAGAGTTT CAGCGGAACA ATGGAGTCGT CCTTAGATGA 1032 CTTCTGTCAT GATAGCACGG CTCCACAAAA GGTGCTCTTG GCGTTTTCTA TTACCTACAC 1092 GCCAGTGATG ATATATGCCC TAAAGGTGAG TCGCGGCCGA CTGCTAGGGC TTCTGCACCT 1152 TTTGGTCTTC CTGAATTGTG CTTTCACCTT CGGGTACATG ACATTCGTGC ACTTTCAGAG 1212 TACAAATAAG GTCGCGCTCA CTATGGGAGC AGTAGTTGCA CTCCTTTGGG GGGTGTACTC 1272 AGCCATAGAA ACCTGGAAAT TCATCACCTC CAGATGCCGT TTGTGCTTGC TAGGCCGCAA 1332 GTACATTCTG GCCCCTGCCC ACCACGTTGA AAGTGCCGCA GGCTTTCATC CGATTGCGGC 1392 AAATGATAAC CACGCATTTG TCGTCCGGCG TCCCGGCTCC ACTACGGTCA ACGGCACATT 1452 GGTGCCCGGG TTAAAAAGCC TCGTGTTGGG TGGCAGAAAA GCTGTTAAAC AGGGAGTGGT 1512 AAACCTTGTT AAATATGCCA AATAACACCG GCAAGCAGCA GAAGAGAAAG AAGGGGGATG 1572 GCCAGCCAGT CAATCAGCTG TGCCAGATGC TGGGTAAGAT CATCGCTCAC CAAAACCAGT 1632 CCAGAGGCAA GGGACCGGGA AAGAAAAATA AGAAGAAAAA CCCGGAGAAG CCCCATTTCC 1692 CTCTAGCGAC TGAAGATGAT GTCAGACATC ACTTTACCCC TAGTGAGCGT CAATTGTGTC 1752 TGTCGTCAAT CCAGACGGCC TTTAATCAAG GCGCTGGGAC TTGCACCCTG TCAGATTCAG 1812 GGAGGATAAG TTACACTGTG GAGTTTAGTT TGCCTACGCA TCATACTGTG CGCCTGATCC 1872 GCGTCACAGC ATCACCCTCA GCATGATGGG CTGGCATTCT TGAGGCATCC CAGTGTTTGA 1932 ATTGGAAGAA TGCGTGGTGA ATGGCACTGA TTGACATTGT GCCTCTAAGT CACCTATTCA 1992 ATTAGGGCGA CCGTGTGGGG GTAAGATTTA ATTGGCGAGA ACCACACGGC CGAAATTAAA 2052 ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 2062 (2)序列辨識編號9之資料： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (i )序列的特徵： (A) 長度：137値胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)型態：直線形 (ii )分子型式：蛋白質 (X i)序列的描述：序列辨識編鱗9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐）-97 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7 五、發明説明（％)
Ala Gly Phe Ala Val Leu Gin Asp lie Ser Cys Leu Arg His Arg Asn 1 5 10 15
Ser Ala Ser Glu Ala lie Arg Lys Val Pro Gin Cys Arg Thr Ala lie 20 25 30
Gly Thr Pro Val Tyr lie Thr Val Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Asn 35 40 45
Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe Tyr 50 55 60
Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val 65 70 75 ' 80
Ser Gly He Val Ala Val Cys Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gin His 85 90 95
Val Lys Glu Phe Thr Gin Arg. Ser Leu Val Val Asp His Val Arg Leu 100 105 110
Leu His Phe Met Thr Pro Glu Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu Ala 115 120 125
Cys Leu Phe Gly lie Leu Leu Ala lie 13 0 135 ________ (2)序列辨識編號10之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：603個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (ix )持擻：
(A) 名稱/索引：CDS (B) 位置：1· ·600 (X Γ)序列的描述：序列辨識編號10 ATG TTG GGG AAA TGC TTG ACC GCG GGC TGT TGC TCG CAA TTG CTT ΤΤΤ 48
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe 1 5 10 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-98 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 訂 517085 A7 B7 五、發明説明（f?) TTG TGG TGT ATC GTG CCG TCT TGT TTT GTT GCG CTC GTC AGC GCC AAC 96 Leu Trp Cys lie Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Asn 20 25 30 GGG AAC AGC GGC TCA AAT TTA CAG CTG ATT TAC AAC TTG ACG CTA TGT 144 Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 GAG CTG AAT GGC ACA GAT TGG CTA GCT AAT AAA TTT GAC TGG GCA GTG 192 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 GAG TGT TTT GTC ATT TTT CCT GTG TTG ACT CAC ATT GTC TCT TAT GGT 240 Glu Cys Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gl/ 65 70 75 80 GCC CTC ACT ACT AGC CAT TTC CTT GAC ACA GTC GGT CTG GTC ACT GTG 288 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 TCT ACC GCT GGG TTT GTT CAC GGG CGG TAT GTT CTG AGT AGC ATG TAC 336 Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Met Tyr 100 105 110 GCG GTC TGT GCC CTG GCT GCG TTG ATT TGC TTC GTC ATT AGG CTT GCG 384 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125 AAG AAT TGC ATG TCC TGG CGC TAC TCA TGT ACC AGA TAT ACC AAC TTT 432 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 CTT CTG GAC ACT AAG GGC AGA CTC TAT CGT TGG CGG TCG CCT GTC ATC 480 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160 ATA GAG AAA AGG GGC AAA GTT GAG GTC GAA GGT CAC CTG ATC GAC CTC 528 He Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu He Asp Leu 165 170 175 AAA AGA GTT GTG CTT GAT GGT TCC GCG GCT ACC CCT GTA ACC AGA GTT 576 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val 180 185 190 TCA GCG GAA CAA TGG AGT CGT CCT TAG 603 Ser Ala Glu Gin Trp Ser Arg Pro 195 200 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2)序列辨識編號11之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：200個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)型態：直線形 (ii )分子型式：蛋白質 (X i)序列的描述：序列辨識編號11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-99 - __ 517085 A7 B7 五、發明说明（对） Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys 工le Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Asn 20 25 30 Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Cys Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Met Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160 He Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu He Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val 180 185 190 ---：------- (諳先閲缋背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
Ser Ala Glu Gin Trp Ser Arg Pro 195 200 (2)序列辨識編號12之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：606個氮鹼對. (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 (ϋ )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) Μ株：萊西斯倍德 (X i)序列的描述：序列辨識編號12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）-100- 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 517085 A 7 B7 五、發明説明（竹） ATGAGATGTT CTCACAAATT GGGGCGTTTC TTGACTCCGC ACTCTTGCTT CTGGTGGCTT 60 TTTTTGCTGT GTACCGGCTT GTCCTGGTCC TTTGCCGATG GCAACGGCGA CAGCTCGACA 120 TACCAATACA TATATAACTT GACGATATGC GAGCTGAATG GGACCGACTG GTTGTCCAGC 180 CATTTTGGTT GGGCAGTCGA GACCTTTGTG CTTTACCCGG TTGCCACTCA TATCCTCTCA 240 CTGGGTTTTC TCACAACAAG CCATTTTTTT GACGCGCTCG GTCTCGGCGC TGTATCCACT 300 GCAGGATTTG TTGGCGGGCG GTACGTACTC TGCAGCGTCT ACGGCGCTTG TGCTTTCGCA 360 GCGTTCGTAT GTTTTGTCAT CCGTGCTGCT AAAAATTGCA TGGCCTGCCG CTATGCCCGT 420 ACCCGGTTTA CCAACTTCAT TGTGGACGAC CGGGGGAGAG TTCATCGATG GAAGTCTCCA 480 ATAGTGGTAG AAAAATTGGG CAAAGCCGAA GTCGATGGCA ACCTCGTCAC CATCAAACAT 540 GTCGTCCTCG AAGGGGTTAA AGCTCAACCC TTGACGAGGA CTTCGGCTGA GCAATGGGAG 600 GCCTAG 606 (2)序列辨識編號13之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：526個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：c D Η A (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) _株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (ix )特徵：
(A) 名稱/索引：CDS (B) 位置：2, ·523 (X i)序列的描述：序列辨識編號13
A ATG GAG TCG TCC TTA GAT GAC TTC TGT CAT GAT AGC ACG GCT CCA A
Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro 15 i〇 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-101 - L.^-----Φ------、玎------ΛΨ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 517085 A7 B7 五、發明説明（广〇〇) 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 CAA AAG GTG CTC TTG GCG TTT TCT ATT ACC TAC ACG CCA GTG ATG ATA Gin Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser lie Thr Tyr Thr Pro Val Met lie 20 25 30 TAT GCC CTA AAG GTG AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT Tyr Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu 35 40 45 TTG GTC TTC CTG AAT TGT GCT TTC ACC TTC GGG TAC ATG ACA TTC GTG Leu Val Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val 50 55 60 CAC TTT CAG AGT ACA AAT AAG GTC GCG CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTT His Phe Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val 65 70 75 GCA CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC Ala Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala lie Glu Thr Trp Lys Phe lie 80 85 90 95 ACC TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAC ATT CTG GCC Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr lie Leu Ala 100 105 110 CCT GCC CAC CAC GTT GAA AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA Pro Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro lie Ala Ala 115 120 125 AAT GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTC Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val 130 135 140 AAC GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTA AAA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AGA Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg 145 150 錢 155 AAA GCT GTT AAA CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTT AAA TAT GCC AAA TAA Lys Ala Val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 160 165 170 (2)序列辨識編號14之資料： (i )序列的特徵：. (A) 長度：174値胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)型態：直線形 (ii )分子型式：蛋白質 (X i)序列的描述：序列辨識編號14 Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gin 15 10 15 Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser lie Thr Tyr Thr Pro Val Met lie Tyr 20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 Val Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val His 50 55 60 94 142 190 238 286 334 382 430 478 526 L·;--^------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -S-T» 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-l〇2 - 517085 A7 B7 五、發明説明（Μ/)
Phe Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala lie Glu Thr Trp Lys Phe lie Thr 85 90 95 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr lie Leu Ala Pro 100 105 HO Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro He Ala Ala Asn 115 120 125 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160
Ala Val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170 (2)序列辨識編號15之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：522個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 (ϋ )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官 (B) _ 株 豬生殖性與呼吸性症候群病毒 何爭 ί ^^-----— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (C)各別的分離株：ISU-12 (X ί)序列的描述：序列辨識編號15 ATGGGAGGCC TAGACGATTT TTGCAACGAT CCTATCGCCG CACAAAAGCT CGTGCTAGCC TTTAGCATCA CATACACACC TATAATGATA TACGCCCTTA AGGTGTCACG CGGCCGACTC CTGGGGCTGT TGCACATCCT AATATTTCTG AACTGTTCCT TTACATTCGG ATACATGACA TATGTGCATT TTCAATCCAC CAACCGTGTC GCACTTACCC TGGGGGCTGT TGTCGCCCTT CTGTGGGGTG TTTACAGCTT CACAGAGTCA TGGAAGTTTA TCACTTCCAG ATGCAGATTG TGTTGCCTTG GCCGGCGATA CATTCTGGCC CCTGCCCATC ACGTAGAAAG TGCTGCAGGT CTCCATTCAA TCTCAGCGTC TGGTAACCGA GCATACGCTG TGAGAAAGCC CGGACTAACA TCAGTGAACG GCACTCTAGT ACCAGGACTT CGGAGCCTCG TGCTGGGCGG CAAACGAGCT GTTAAACGAG GAGTGGTTAA CCTCGTCAAG TATGGCCGGT ΑΑ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）一 ι〇3 一 60 120 180 240 300 360 420 480 522 517085 A7 B7 五、發明説明（(〇之) (2)序列辨識編號16之資料： (i )序列的特徵： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (A)長 度： 3 72個 氮鹼對 (B)種 類： 核 苷酸 (c)股 型： 不 詳 (D)型 態： 不 詳 (ii )分 子型式 :C DNA (vi )原 始來源 ： (A)器 官： 豬 生殖性 與呼吸1 1 生症 :候群病 毒 (B)_ 株： 愛 荷華 (c)各 別的分 離株： ISU -12 (ix )特 徵： (A)名 稱/索 引： CDS. (B)位 置： 1 . .369 (xi)序 列的描 述： 序 列鑑識: 編m ：16 ATG CCA AAT AAC ACC GGC AAG CAG CAG AAG AGA AAG AAG GGG GAT丨 GGC 48 Met Pro Asn Asn Thr Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG ATG CTG GGT AAG ATC· ATC GCT CAC 96 Gin Pro Val Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys lie lie Ala His 20 25 30 CAA AAC CAG TCC AGA GGC AAG GGA CCG GGA AAG AAA AAT AAG AAG AAA 144 Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTC CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA 192 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 CAT CAC TTT ACC CCT AGT GAG CGT CAA TTG TGT CTG TCG TCA ATC CAG 240 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser lie Gin 65 70 75 80 ACC GCC TTT AAT CAA GGC GCT GGG ACT TGC ACC CTG TCA GAT TCA GGG 288 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCT ACG CAT CAT ACT GTG 336 Arg lie Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 CGC CTG ATC CGC GTC ACA GCA TCA CCC TCA GCA TGA 372 Arg Leu lie Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 104 - 517085 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（（呤） (2)序列辨識編號17之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：123個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)型態：直線形 (ii )分子型式：蛋白質 (X i)序列的描述：序列辨識編號17
Met Pro Asn Asn Thr Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15
Gin Pro Val Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys lie lie Ala His 20 25 30
Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser lie Gin 65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95
Arg lie Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110
Arg Leu lie Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2)序列辨識編號18之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：387個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-1〇5 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 517085 A7 _ B7_ _ 五、發明説明（I 〇⑷ (8)_株··萊西斯倍德 (X i)序列的描述：序列辨識編號18 ATGGCCGGTA AAAACCAGAG CCAGAAGAAA AAGAAAAGTA CAGCTCCGAT GGGGAATGGC 60 CAGCCAGTCA ATCAACTGTG CCAGTTGCTG GGTGCAATGA TAAAGTCCCA GCGCCAGCAA 120 CCTAGGGGAG GACAGGCCAA AAAGAAAAAG CCTGAGAAGC CACATTTTCC CCTGGCTGCT 180 GAAGATGACA TCCGGCACCA CCTCACCCAG ACTGAACGCT CCCTCTGCTT GCAATCGATC 240 CAGACGGCTT TCAATCAAGG CGCAGGAACT GCGTCGCTTT CATCCAGCGG GAAGGTCAGT 300 TTTCAGGTTG AGTTTATGCT GCCGGTTGCT CATACAGTGC GCCTGATTCG CGTGACTTCT 360 ACATCCGCCA GTCAGGGTGC AAGTTAA 387 (2)序列辨識編號19之資料： (i )序列的特徵： (A)長度：164個氮鹼對 (B )種類：核苦酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式·· cDNA (vi )原始來源： 、 (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B )菌株：愛荷華 (C)各別的分離株·· ISU-12 (X ί)序列的描述：序列辨識编號19 TGGGCTGGCA TTCTTGAGGC ATCCCAGTGT TTGAATTGGA AGAATGCGTG GTGAATGGCA 60 CTGATTGACA TTGTGCCTCT AAGTCACCTA TTCAATTAGG GCGACCGTGT GGGGGTAAGA 120 TTTAATTGGC GAGAACCACA CGGCCGAAAT ΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑ 164 (2)序列辨識編號20之資料： (i )序列的特徵： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-106 - LJI.-----餐------1T------S, - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 ____ B7 五、發明説明（（〇f) (A) 長度·· 127個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式·· c D N A (vi )原始來源： (A) 器官：豬隻生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) _株：萊西斯倍德 (X i)序列的描述：序列辨識編號20 TTTGACAGTC AGGTGAATGG CCGCGATTGG CGTGTGGCCT CTGAGTCACC TATTCAATTA 60 GGGCGATCAC ATGGGGGTCA TACTTAATCA GGCAGGAACC ATGTGACCGA AATTA2UVAAA 120 AAAAAAA 127 (2)序列辨識編號21之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：19個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：萊西斯倍德
(X ί)序列的描述：序列辨識編號21 CTCGTCAAGT ATGGCCGGT 本纸張尺度適用中家標準（CNS ) Α4規格（2l〇x297公釐）—107 - ---：------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7 五、發明説明（/〇έ) (2)序列辨識編號22之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：19個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)說明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (X i )序列的描述：序列辨識編號22 GCCATTCGCC TGACTGTCA (2)序列辨識編號23之資料： (i )序列的特徵： U)長度：19個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)說明：DNA (合成的） (vi )原始來源：
(A)器官；豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (xi)序列的描述：序列辨識編號23 TTGACGAGGA CTTCGGCTG 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-108 - —II----f------IT------f 1 ί (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 _ B7 五、發明説明（（D^)) (2)序列辨識編號24之資料： (i )序列的特擻： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態·♦ i線形 (ii :)分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (X i)序列的描述：序列辨識編號24 . GCTCTACCTG CAATTCTGTG (2)序列辨識編號25之資料： (i )序列的特徵： (A)長度：20個氮鹼對 (B )種類：核脊酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式··其它的核苷酸； (A)説明：DHA (合成的） (vi )原始來源：
(A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (X i)序列的描述：序列辨識編號25 GTGTATAGGA CCGGCAACAG 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）-109 - 1IH----1-------、玎------f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A7 B7 五、發明説明（（OcT) (2)序列辨識編號26之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：26個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)說明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (8)_株：愛荷華 (C)各別的分離株：ISU-12 (X i )序列的描述：序列辨識編號26 GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC (2)序列辨識編號27之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：28個氮_對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-110 - ---：------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 517085 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（丨叫） (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號27 GGTGTTTTCC ACGAGAACCG CTTAAGGG (2)序列辨識編號28之資料： (i )序列的特徵： (A )長度：2 1個氮ϋ對 (Β)種類··核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) M株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (xi)序列的描述：序列辨識編號28 GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G (2)序列辨識編號29之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：25個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D )型態：直線形 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 臂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-111 - 517085 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（"β) (ϋ )分子型式：其它的核苷酸； (A)說明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) _株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號29 CAGTTAGTCG ACACGGTCTT AAGGG (2)序列辨識編號3〇之資料·· (i )序列的特徵： (A) 長度：22個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； • (A)説明：DNA (合成） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X ί)序列的描述：序列辨識編號30 GGGGATCCTT GTTAAATATG CC (2)序列辨識編號31之資料·· (i )序列的特徵： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ¢. 、11 零· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 112 - 517085 A7 B7 五、發明説明（，//) (A) 長度：19個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D )型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 麵株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12
(X i)序列的描述：序列辨識編號3 1 CTTACGCACC ACTTAAGGG (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）- 113 -

Claims (1)

  1. 51708(5
    A8 B8 C8 D8
    、申請專利範圍 修正日期:91年07月 第82110515號專利再審查案申請專利範圍修正本 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一種分離的聚核苻酸，其基本上由下列所構成： (a ) —種擇自於下列群中的聚核苷酸： 序列辨識编號8 : G GCA GGC TTT GCT GTC CTC CAA GAC ATC AGT TGC CTT AGG CAT CGC 46 Ala Gly Phe Ala Val Leu Gin Asp lie Ser Cys Leu Arg His Arg 15 10 15 AAC TCG GCC TCT GAG GCG ATT CGC AAA GTC CCT CAG TGC CGC ACG GCG 94 Asn Ser Ala Ser Glu Ala lie Arg Lys Val Pro Gin Cys Arg Thr Ala 20 25 30 ATA GGG ACA CCC GTG TAT ATC ACT GTC ACA' GCC AAT GTT ACC GAT GAG 142 lie Gly Thr Pro Val Tyr lie Thr Val Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu 35 40 45 AAT TAT TTG CAT TCC TCT GAT CTT CTC ATG CTT TCT TCT TGC CTT TTC 190 Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe 50 55 60 TAT GCT TCT GAG ATG AGT GAA AAG GGA ΤΊΤ AAG GTG GTA TTT GGC AAT 238 Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn 65 70 75 GTG TCA GGC ATC GTG GCA GTG TGC GTC AAC TTC ACC AGT TAC GTC CAA 286 Val Ser Gly lie Val Ala Val Cys Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gin 80 85 90 95 CAT GTC AAG GAA TTT ACC CAA CGT TCC TTG GTA GTT GAC CAT GTG CGG 334 His Val Lys Glu Phe Thr Gin Arg Ser Leu Val Val Asp His Val Arg 100 105 110 CTG CTC CAT TTC ATG ACG CCC GAG ACC ATG AGG TGG GCA ACT GTT TTA 382 Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu 115 120 125 gcc τστ ctt* ttt ggc att ctg ttg gca att tgaatgttta agtatgttgg 432 Ala Cys Leu Phe Gly 工le Leu Leu Ala lie 130 135 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 GGAAATGCTT GACCGCGGGC TGTTGCTCGC AATTGCTTTT TTTGTGGTGT ATCGTGCCGT 492 CTTGTTTTGT TGCGCTCGTC AGCGCCAACG GGAACAGCGG CTCAAATTTA CAGCTGATTT 552 ACAACTTGAC GCTATGTGAG CTGAATGGCA CAGATTGGCT AGCTAATAAA TTTGACTGGG 612 CAGTGGAGTG TTTTGTCATT TTTCCTGTGT TGACTCACAT TGTCTCTTAT GGTGCCCTCA $72 CTACTAGCCA TTTCCTTGAC ACAGTCGGTC TGGTCACTGT GTCTACCGCT GGGTTTGTTC 732 ACGGGCGGTA TGTTCTGAGT AGCATCTACG GGGTCTGTGC CCTGGCTGCG TTGATTTGCT 792 TCGTCATTAG GCTTGCGAAG AATTGCATGT CCTGGCGCTA CTCATGTACC AGATATACCA 852 ACTTTCTTCT GGACACTAAG GGCAGACTCT ATCGTTGGCG GTCGCCTGTC ATCATAGAGA 912 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1Χ 5 5OQ,---ί, 7 ABCD 六、申請專利範圍
    AAAGGGGCAA AGTTGAGGTC GAAGGTCACC TGATCGACCT CAAAAGAGTT^GTG.CT^ATG 972 • *， 、 . 1 1 GTTCCGCGGC TACCCCTGTA ACCAGAGTTT C^GCGGAACA ATGGAGTCGT CCTTAGATGA 1032 CTTCTGTCAT GATAGCACGG CTCCACAAAA GGTGCTCTTG GCGTTTTCTA TTACCTAC^C 1092 GCCAGTGATG ATATATGCCC TAAAGGTGAG TCGCGGCCGA CTGCTAGGGC TTCTGCACCT 1152 TTTGGTCTTC CTGAATTGTG CTTTCACCTT CGGGTACATG A'CATTCGTGC ACTTTCAGAG 1212 ，： TACAAATAAQ. GTCGCGCTCA. CTATGGGAGC AGTAGTTGCA. CTCCTTTGGG GGGTGTACTC 1272 AGCCATAGAA ACCTGGAAAT TCATCACCTC CAGATGCCGT TTGTGCTTGC TAGGCCGCAA 1332 GTACATTCTG GCCCCTGCCC ACCACGTTGA AAGTGCCGCA GGCTTTCATC CGATTGCGGC 1392 AAATGATAAC CACGCATTTG TCGTCCGGCG TCCCGGCTCC ACTACGGTOV ACGGCAOVTT' 1452 ^ t ' GGTGCCCGGG TTAAAAAGCC TCGTGTTGGG TGGCAGAAAA GCTGTTAAAC AGGGAGTGGT 1512 AAACCTTGTT AAATATGCCA AATAACACCG GCAAGCAGCA GAAGAGAAAG AAGGGGGATG 1572 GCCAGCCA.GT CAATCAGCTG TGCCAGATGC TGGGTAAGAT CATCGCTCAC CAAAACCAGT 1632 CCAGAGGCAA GGGACCGGGA AAGAAAAATA AGAAGAAAAA CCCGGAGAAG CCCCATTTCC 1692 CTCTAGCGAC TGAAGATGAT GTCAGACATC ACTTTACCCC TAGTGAGCGT CAATTGTGTC^ . 1752 TGTCGTCAAT.CCAGACCGCC TTTAATCAAG GCGCTGGGAC TTGCACCCTG TCAGAlTtiG 1812 GGAGGATAAG TTACACTGTG GAGTTTAGTT TGCCTACGCA TCATACTGTG CGCCTGATCC 1872 ,GCGTCACA.GC ATCACCCTCA GCATGATGGG CTGGCATTCT TGAGGGATCC CAGTGTTTGA 1932 ATTGGAAGAA TGCGTGGTGA ATGGCACTGA TTGACATTGT GCCTCTAAGT CACCTATTCA 1992 ATTAGGGCGA CCGTGTGGGG GTAAGATTTA ATTGGCGAGA ACCACACGGC CGAAATTAAA 20 5,2 2062 序列辨識編號1 0 : ----------裝-- (請先閎讀背面之注意事項再填炙本頁) 訂 ----線 經濟部中夫標率.局t工消費合呤'£i 卩 *?!- ATG TTQ GGG AAA TGC TTG ACC GCG GGC TGT TGC TCG CAA TTG CTT ΤΤΓ 赛 4 8 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe ' 1 5 10 15 TTG TGG TGT ATC GTG CCG TCT TGT TTT GTT GCG CTC GTC AGC GCC AAC 96 Leu Trp Cys lie Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Asn 20 .25 30 GGG AAC AGC GGC TCA AAT TTA CAG CTG ATT TAG AAC TTG ACG CTA TGT 144 Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys ' 3 5 40 45 .、 ， 1 · y : * : GAG CTG AAT GGC ACA GAT TGG CTA GCT AAT AAA TTT GAC TGG GCA GTG 192 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 5 5 ^ 60 ** GAG TGT TTT GTC ATT TTT CCT GTG TTG ACT CA.C ATT GTC TCT TAT GGT 240 Glu- Cys Phe Val Ils Phe Pro Val Leu Thr His Ue Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 GCC CTC ACT ACT AGC CAT TTC CTT GAC ACA GTC GGT CVG GTC ACT GTG 288 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐）-2 - 517085 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 TCT ACC GCT GGG TTT GTT CAC GGG CGG TAT GTT CTG AGT AGC ATG TAC Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Met Tyr 100 105 110 GCG GTC TGT GCC CTG GCT GCG TTG ATT TGC TTC GTC ATT AGG CTT GCG Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val 工le Arg Leu Ala 1X5 120 125 AAG AAT TGC ATG TCC TGG CGC TAC TCA TGT ACC AGA TAT ACC AAC TTT Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 CTT CTG GAC ACT AAG GGC AGA CTC TAT CGT TGG CGG TCG CCT GTC ATC Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160 ATA GAG AAA AGG GGC AAA GTT GAG GTC GAA GGT CAC CTG ATC GAC CTC 工le Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu lie Aso Leu 165 170 175 AAA AGA GTT GTG CTT GAT GGT TCC GCG GCT ACC CCT GTA ACC AGA GTT Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val 180 185 190 TCA GCG GAA CAA TGG AGT CGT CCT TAG Ser Ala Glu Gin Trp Ser Arg Pro 195 200 336 384 432 480 528 576 603 I _ n n I n I I I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 序列辨識編號1 2 : ATGAGATGTT CTCACAAATT GGGGCGTTTC TTGACTCCGC TTTTTGCTGT GTACCGGCTT GTCCTGGTCC TTTGCCGATG TACCAATACA TATATAACTT GACGATATGC GAGCTGAATG CATTTTGGTT GGGCAGTCGA GACCTTTGTG CTTTACCCGG CTGGGTTTTC TCACAACAAG CCATTTTTTT GACGCGCTCG GCAGGATTTG TTGGCGGGCG GTACGTACTC TGCAGCGTCT GCGTTCGTAT · GTTTTGTCAT CCGTGCTGCT AAAAATTGCA ACCCGGTTTA CCAACTTCAT TGTGGACGAC CGGGGGAGAG ATAGTGGTAG AAAAATTGGG CAAAGCCGAA GTCGATGGCA GTCGTCCTCG AAGGGGTTAA AGCTCAACCC TTGACGAGGA GCCTAG ACTCTTGCTT CTGGTGGCTT GCAACGGCGA CAGCTCGACA GGACCGACTG GTTGTCCAGC TTGCCACTCA TATCCTCTCA GTCTCGGCGC TGTATCCACT ACCGCGCTTG TGCTTTCGCA TGGCCTGCCG CTATGCCCGT TTCATCGATG GAAGTCTCCA ACCTCGTCAC CATCAAACAT CTTCGGCTGA GCAATGGGAG 60 120 180 240 300 3β0 420 480 540 600 606 #1. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 517085 ABCD 六、申請專利範圍 尸尸yu研5沉i 〇 · 、、 \ ^ A ATG GAG TGG TCC TTA GAT GAC TTC TGT CAT GAT AGC ACG GCT CCA Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro 1 5 10 15 CAA AAG GTG CTC TTG GCG TTT TCT ATT ACC TAC ACG CCA GTG ATG ATA Gin Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser He Thr Tyr Thr Pro Val Met: lie 20 25 30 TAT GCC CTA AAG GTG AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT Tyr Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu 35 40 45 0 46 94 142 TTG GTC TTC CTG AAT TGT GCT TTC ACC TTC GGG TAC ATG ACA TTC GTG Leu Val Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val 50 55 60 CAC TTT GAG AGT ACA AAT AAG GTC GCG CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTT His Phe Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val 65 70 75 GCA CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC Ala Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala lie Glu Thr Trp Lys Phe lie 80 85 . 90 95 190 23 Q 286 (請先閲讀背面之注意事項再填筠本頁) ACC TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAC ATT CTG GCC Thr Ser Arqr Cvs Ara Leu Cvs Leu Leu Glv Arc Lvs Tvr lie Leu Ala 334 气 100 V 1Q5 . ' ▲ Λ ，110、;’、 CCT GCC CAC CAC GTT GAA AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA 382 Pro Ala'His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro He Ala Ala 115 120 1?5 AAT GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTC 430 Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val 130 135 140 AAC GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTA AAA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AGA 478 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg 145 150 .., . 155 AAA GCT GTT AAA CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTT AAA TAT GCC AAA TAA 526 Lys.Ala Val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 160 165 170 . * • ’ 序列辨識編號1 5 : ATGGGAGGCC TAGACGATTT TTGCAACGAT CCTATCGCCG CACAAAAGCT CGTGCTAGCC 60 TTTAGCATCA CATACACACC TATAATGATA TACGCCCTTA AGGTGTCACG CGGCCGACTC 120 CTGGGGCTqT TGCACATCCT AATATTTCTG AACTGTTCCT. TTACATTCGG ATACATGACA 1^0 ； -,, . ' * TATGTGCATT TTCAATCZCAC CAACCGTGTC GCACTTACCC TGGGGGCTGT TGTCGCCCTT 240 CTGTGGGGTG TTTACAGCTT CACAGAGTCA TGGAAGTTTA TCACTTCCAG ATGCAGATTG 300 TGTTGCCTTG GCCGGCGATA CATTCTGGCC CCTGCCCATC ACGTAGAAAG TGCTGCAGGT 360 CTCCATTCAA TCTCAGCGTC TGGTAACCGA GCATACGCTG TGAGAAAGCC- CGGACTAACA 420 TCAGTGAACG GCACTCTAGT ACCAGGACTT CGGAGCCTCG TGCTGGGCGG CAAACGAGCT 480 GTTAAACGAG GAGTGGTTAA CCTGGTCAAG TATGGCCGGT AA 522 C張尺i適用中®國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐)~~Γ~4~~^ ' 517085 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 序列辨識編號16 ATG CCA AAT AAC ACC GGC AAG CAG CAG AAG AGA AAG AAG GGG GAT GGC Met; Pro Asn Asn Thr Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 15 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG ATG CTG GGT AAG ATC ATC GCT CAC Gin Pro Val Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys lie lie Ala His 20 25 30 CAA AAC CAG TCC AGA GGC AAG GGA CCG GGA AAG AAA AAT AAG AAG AAA Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTC CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60· cat cac τττ acc cct agt gag cgt CAA TTG TGT CTG TCG TCA ATC CAG His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser lie Gin S5 70 75 80 ACC GCC TTT AAT CAA GGC GCT GGG ACT TGC ACC CTG TCA GAT TCA GGG Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCT ACG CAT CAT ACT GTG Arg lie Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 48 96 144 192 240 288 336 I.—^-----螓 |丨(請先閲讀背面之注意事項再填寫本貢) 100 105 110 CGC CTG ATC CGC GTC ACA GCA TCA CCC TCA GCA TGA Arg Leu lie Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 372 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 序列辨識编號1 8 : ATGGCCGGTA AAAACCAGAG CCAGAAGAAA AAGAAAAGTA CAGCTCCGAT CAGCCAGTCA ATCAACTGTG CCAGTTGCTG GGTGCAATGA TAAAGTCCCA CCTAGGGGAG GACAGGCCAA AAAGAAAAAG CCTGAGAAGC CACATTTTCC GAAGATGACA TCCGGCACCA CCTCACCCAG ACTGAACGCT CCCTCTGCTT CAGACGGCTT TCAATCAAGG CGCAGGAACT GCGTCGCTTT CATCCAGCGG TTTCAGGTTG AGTTTATGCT GCCGGTTGCT CATACAGTGC GCCTGATTCG ACATCCGCCA GTCAGGGTGC AAGTTAA序列辨識編號1 9 : TGGGCTGGCA TTCTTGAGGC ATCCCAGTGT TTGAATTGGA AGAATGCGTG GTGAATGGCA CTGATTGACA TTGTGCCTCT AAGTCACCTA TTCAATTAGG GCGACCGTGT GGGGGTAAGA TTTAATTGGC GAGAACCACA CGGCCGAAAT TAAAAAAAAA AAAA GGGGAATGGC GCGCCAGCAA CCTGGCTGCT GCAATCGATC GAAGGTCAGT CGTGACTTCT 60 120 180 240 300 360 387 60 120 164 Φ— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）- 517085 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍(b ) —锺互補於（a )中所界’定的聚核苷酸之核苻瑟序列；a (c ) 一種具有相同於（a )中所界定的聚核苷駿之遣傳.密既簡% .. , . υ.、併ft的核苷酸序列。 2.如申請專利範圍第1項之分離的聚核苷酸，：其主要偽由一 擇自於下列群中的核苷酸序列所溝成：序列辨識编號8、 序列辨識編號1 〇、序列辨識编號1 2、序列辨識編號1 3、序 列辨識编號1 5、序列辨識编號1 6、序列辨識编J虎1 8與序列 辨識编號1 9。 c3 . —種蛋白質，其傜擇自於下列群中： 序列辨識编號9 : Ala Gly 1 . Ser Ala Gly Thr Tyr Leu 50 Ala Ser 55 Ser Gly Val Lys Leu His Phe Ala Val 5 Ser Glu Ala • "'· 20 Pro Val Tyr 35 His Ser Ser Glu Met Ser Leu Gin Asd Ila 工le Arg Lys Val 1 25 Ser Cys 10 Pro Gin 工le Thr Val Thr Ala Asn 40 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) -裝· _____W. Cys Leu 130 lie Val Ala Θ5 Glu Phe Thr 100 r Phe Met Thr 115 Phe Glv lie Asp Leu Leu Met: "55 Glu Lys Gly Phe 70 Val Cys Val Asn Gin Arg Ser Leu • 105 Pro Glu Thr Met 120 Leu Leu Ala lie 135 Leu Ser Lys Val 75 Phe Thr 90 Val Val Arg Trp Leu Arg His Cys Arg Thr 30 Val Thr Asp 45 Ser Cys Leu 60 * Val Phe Gly Ser Tyr Val Arg Asn 15 A：la lUj Gl\i Asn Phe Tyr Asp His Val 110 Ala Thr Val 125 Asn Val 80 Gin His 95 Arg Leu Leu Ala 序列辨識编號1 1 : . Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe 15 l〇 15 Leu Τγό Cys lie Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Asn .20 25 30 Gly Asn Ser Glv Ser Asn Leu Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 ^ 40 45 υ 訂 線 i---- ------- m I . .B -I .....— · .張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 517085 A8 Βδ C8 D8 申請專利範圍 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Τγό Leu Ala 50 ~ 5*5 Glu Cys Phe Val lie Phe Pro Val Leu 65 . 70 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp 85 Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg 100 105 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie 115 120 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser 130 135 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr 145 150 lie Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val 165 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala 180 1B5 Ser Ala Glu Gin Trp Ser Arg Pro 195 200 序列辨識編號14 : Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val 60 Thr His He Val Ser Tyr Gly 75 80 Thr Val Gly Leu Val Thr Val 90 95 Tyr Val Leu Ser Ser Met Tyr 110 Cys Phe Val 工le Arg Leu Ala 125 Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 140 Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 155 160 Glu Gly Kis Leu lie Asd Leu 170 175 Ala Thr Pro Val Thr Arg Val 190 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中夬標準局員工消費合作社印裝 Met Glu Ser Ser Leu Aso Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gin 1 5 10 15 Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser lie Thr Tyr Thr Pro Val Met lie Tyr 20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 Val Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val His 50 55 60 Phe Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala lie Glu Thr Trp Lys Phe lie Thr 85 90 95 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr lie Leu Ala Pro 100 105 110 Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro He Ala Ala Asn 115 120 125 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn ^ 130 135 140 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val. Leu Gly Gly Arg Lys 145· / ' 155 160 二..- Ala Val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） 517085 … A8 B8 C8 D8 六、申請專扣範圍 ' 序列辨識編號1 7 : Met Pro Asn Asri' Thr Gly Lys Gin Gin Lvs Arg Lys Lys Gly Asd Gly 15 10 15 , i ， Pro Val Asn Gin Leu Cys Gin Met: Leu Gly Lys lie- Il^ Ala t\Js , 20 ‘ （， 25 30 Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 * 45 _ Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asd Asd Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser lie Gin b5 70 75 , 30 Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cvs Thr Leu Ser Asd Ser Gly 85 一 90 / 95 Arg lie Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 ,.1 . * l Arg Leu lie Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 - 4.—種分離的聚核苦酸，其主要係由一得自於如申請專利範圍 第1項中所界定的序列辨識編號8之長度為20至100個核苷 酸的聚核苷酸η段所構碑.者。 ——心 υ ’’ 5 .如申請專利範圍第4項之分離的聚核苷酸，其主要偽由一 '擇自於下列群中的核苷酸序列所溝成： 序列辨識编號 1 (CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA_ AT)、 序列辨識編號 2 丨CCCCATTTCC CTCTCGCGAC TG)、 序列辨識編號 3 (GCCGCGG/W\C CATCAAGCAD、 序列辨識編號 4 (OAACTTGACG CTATGTGAGC :)、 ( 序列辨識編號5 (GCGGTCTGGA TTGACGACAG)、 序列辨識編號 6 (GACTGATAGG GCTTCTGCAC)與 序列辨識編號7 tGCCATTCAGC TCACATAGCG). 6 . —種用以培養一會造成一豬呼吸性與生殖性疾病'的ii毒之U' 方法，其包含·. :又度適用中國國家標準（〇犯）八4規格（210'乂297公釐）一 8 — ---------^------1T!----^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 517085 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 以該病毒來感染一擇自於下列群中的細胞株：PSP-36 、PSP-36-SAH、MA-104以及與此等細胞株之子代細胞， 以及 在一合適的培養基中培養該等被感染的細胞株。 7 .如申請專利範圍第6項之方法，其中病毒會造成一擇自於 下列群中的疾病：豬呼吸性與生殖性症候群、增殖性與隳 死性肺炎以及非典型的豬流行性感冒。 8 .如申請專利範圍第7項之方法，其中該病毒係為豬呼吸性 與生殖性症候群病毒之一愛荷華菌株。 9 . 一種用以産生一用以防止豬感染病毒疾病之藥學組成物的 方法，其包含T列步.驟·· (A)收集一足夠大量之一種自然發生的分離豬隻呼吸性與生殖性症候群病毒， 其中該病毒是PRRS病毒之愛荷華(Iowa)菌株，相較於其它豬隻病毒，其在 受該病毒感染之豬隻中產生下列病狀和臨床徵兆:形成嚴重第Π型肺炎細| 胞、心肌炎、形成肺泡滲出液以及形成融合細胞體、輕度組織間變厚和腦 炎以及無氣道壞死，以及 (B)以（i )繼代培養該病毒或者（u )合成或分離出一编碼 該病毒之一表面蛋白的聚核苷酸，以該聚核苷酸來感 染一合適的宿主細胞，細胞培養該宿主細胞以及將表 面蛋白從該細胞培養物中分離出來。 10 .如申請專利範圍第9項之方法，其中該豬呼吸性與生殖性 症候群病毒造成的疾病更進一步具有下列病徵以及臨床徵 兆之待歡：昏睡、呼吸窘迫、用力呼氣、發燒、毛髮變粗 、打噴涕、咳嗽以及輕微的組織間質變厚。 11.如申請專利範圍第10項之方法，其中該豬呼吸性與生殖性 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-9 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 訂 517085 A8 B8 C8 ____ D8 六、申請專利範圍， 《 . 症候群病毒傜為：（i >被寄存在位於美國馬利闡州；S兒菲 立帕克隆道1 2 3 0 1號的美國類型培養收集中心（A T C C )之寄 存编號為 VR 2385、VR 2386、VrR 2428、VR 2429、V R 2430 或VR、、243 1的一種諸_呼吸性與生殖性症候群病毒之愛苘華 鐘株，或（u ) —展現出該寄存的豬呼吸性與生殖性症候群 .病毒的愛荷華菌株之鑑定待歡的病毒。 1 2 ·如申請專利範圍第9、丨〇或丨丨項之方法，其中該病毒在解 讀架構5、6與7之任一者中，對於萊西W倍德lys tad) 病毒具有低於90¾的聚核苷酸相同性：ι , ,* . , % 13..如申請專利範圍第9、丨0或丨丨項之方法，其中該豬呼吸性 與生殖性症候群病毒被培養在一擇自於下列群中的細胞侏 内:PSP - 36、PSP-36-SAH與 MA-10 4:* 、:. ·, a y/ U · 1 4 .如申請專利範圍第9項乏方法，其中該病毒係收集自一細 胞培養物之培養基、被該病毒所感染的細胞，或是一細胞 培養物之培養基以及被該病毒所感染的細胞此二者 1 5 ·如申請專利範圍笔9項之方法，其在該收集步驟之前另芭 含於一合適的培養碁内細胞培養該病毒之步.驟* 16.—種會免疫地結合一種_然發生的分離豬隻呼吸性與生殖性症候群病毒之 抗體.，其中該病毒是PRR^病毒之愛荷華(Iowa)菌株，相較於其它豬隻病毒， 其在受該病毒感染之豬隻中產生下列病狀和臨床徵兆:形成嚴重第II型肺炎細 胞、心肌炎、形成肺泡滲出液以及形成融合細胞體、輕度組織間變厚和腦炎以 及無氣道壞死。 ·如斤請專利範圍第1 6項之抗體，其中該豬呼吸性與、生殖& - 症候群病毒造成的疾病更進一步具有下列病徵以及臨床徵 欠尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -1〇 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} •裝 、11 _____^---- .In I · • II · 517085 A8 B8 C8 D8 ____ 六、申請專利範圍 兆之持徵：昏睡、呼吸窘迫、用力呼氣、發嬈、毛髮變粗 、打噴涕、咳嗽以及輕微的組織間質變厚。 1 8 ·如申請專利範圍第1 6項之抗體，其中該豬呼吸性與生殖性 症候群病毒ί%為：（i )被寄存在位於美國馬利蘭州洛克菲 立帕克隆道1 230 1號的美國類型培養收集中心（ATCC)之寄 存编號為 VR 2385、VR 2386、VR 2428、VR 2429、VR2430 或VR 2431的一種豬呼吸性與生殖性症候群病毒之愛苘華 菌株，或（u ) —展現出該寄存的豬呼吸性與生殖性症候群 病毒的愛荷華謹株之鑑定持徵的病毒。 19. 一種用以防止豬感染病毒疾病之藥學組成物，其包含有一 有效量之如申請專利範圍第1 6項的抗體以及一生理上可接 受的載劑，俾以防止豬被豬呼吸性與生殖性症候群病毒所 感染或是治療一患有豬呼吸性與生殖性症候群之豬。 20 · —種用以分析一會造成豬呼吸性疾病、豬生殖性疾病或豬 呼吸性與生殖性疾病的檢驗套組，其包含有如申請專利範 圍第16項之抗體以及一供作為和該抗體起陽性免疫反應之 顯7Γ：劑的撿驗試劑： 21 .如申請專利範圍第20項之撿驗套組，其中該該病毒所引起 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之疾病具有下列病歡以及臨床徵兆之待徵：第ϋ型肺炎細 胞形成、心肌炎、腦炎、肺胞滲出液的形成以及融合細胞體的 形成。 22 .如申請專利範圍第2 1項之檢驗套組，其中該豬呼吸性與生 殖性症候群病毒造成的疾病更進一步具有下列病歡以及臨 床徵兆之持歡：昏睡、呼吸窘迫、用力呼氣、發燒、毛髮 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 517085 A8 B8 C8 D8 ； 六、申請專利範圍 變粗、打噴涕、咳嗽以及輕微的組織間質變厚： 23.如申請專利範圍第21項之撿驗套組，其中該豬呼吸性與生~ 殖性症候群病毒係為：（i )被寄存在位於美國馬利蘭州洛 克菲立帕克隆道1230 1號的美國類型培養收集中心（ATCC) 之寄存编號為 VR 2385、VR 2386、VR 2428、VR 2429、VR 2430或VR 2431的一種豬呼吸性與生殖性症候群病毒之愛 荷華菌株，或Ui )—展現出該寄存的豬呼吸性與生殖性症 候群病毒的愛荷華菌株之鑑定持歡的病毒： ^ 請先·;Μ^背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-12 -
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