CN104797269A - 用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于治疗或预防受试者的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)感染的方法和组合物。本文描述了包含免疫原性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和纳米粒子的组合物。本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以进一步包含一种或多种佐剂。佐剂可以是改进其它试剂，例如本文所描述的抗原的作用的任何组合物、药理或免疫剂。在一些实施方案中，本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以进一步包含结核分枝杆菌全细胞裂解物、耻垢分枝杆菌全细胞裂解物和母牛分枝杆菌全细胞裂解物。

Description

用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年4月24日提交的美国临时申请号61/637,547的权益，这个临时申请特此以其全文引用的方式并入本文中。
发明背景
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是在世界范围内猪的慢性病毒疾病。PRRS在大多数猪肉生产国家流行，并且其对养猪业的主要经济损失负责，据估计在美国年损失为6.64亿美元(8)。
自1990年代晚期以来，改性活的PRRSV(PRRS-MLV)和杀死的病毒疫苗已经可用于控制疾病，但其中没有一个对猪完全进行保护来对抗异种野外病毒(27)。如同野外病毒一样，PRRS-MLV也诱导免疫抑制(29、30)。此外，有几个报道是关于疫苗病毒逆转为病毒性的，导致严重的疾病爆发(31-34)。尽管杀死的PRRSV疫苗是安全的，但其具有较差免疫原性(35、36)。
PRRS的临床征象包含呼吸与繁殖功能障碍并且致病物是PRRS病毒(PRRSV)(28)。PRRSV早在在感染后两天并且持续几周通过调节猪的免疫系统来确立疾病(14、15)。PRRSV所提出的特别挑战是由PRRSV引起的免疫抑制，这归因于病毒介导的重要细胞因子(IFN-α、IFN-γ和TNF-α)的产生减少，其与白介素(IL)-10和转化生长因子β(TGF-β)的分泌增加以及Foxp3+T调控细胞(Tregs)群体的上调相关联(14)。另外，在受感染的猪中，病毒中和(VN)抗体出现延迟(3-4周)，而且其水平保持很低(86)。因此，在本领域中极大地需要提供针对PRRS的安全而有效的保护和治疗。
附图简述
图1示出了：(A)包封灭活的PRRSV的PLGA纳米粒子的形态。通过标准多重乳液法制备的PLGA纳米粒子的扫描电子显微照片。纳米粒子的尺寸似乎在200到600nm的范围内可变。(B)用包封在纳米粒子中的灭活的PRRSV(Nano-KAg)对猪进行粘膜接种疫苗截止PC15清除了病毒血症。猪未接种疫苗(n＝3)或者用杀死的PRRSV(K-Ag)(n＝3)或Nano-KAg(n＝3)经鼻内接种疫苗一次，并且在DPI 21时用PRRSV VR2332病毒株攻击。分析在指定的攻击后天数(PC)收集的血清样品以测量PRRSV滴度。每个条形代表了三只猪的平均值±SEM。
图2示出了经Nano-KAg接种疫苗的病毒攻击的猪的血清和肺中的增强的IgA和中和抗体滴度。进行分析以确定以下中的PRRSV中和抗体反应：(A)血清；(B)肺，通过免疫荧光分析法；以及(C)肺裂解物中的抗PRRSV IgA抗体反应，通过ELISA。图中的每个条形代表了来自三只猪的平均VN滴度或光密度值±SEM。字母‘a’、‘b’和‘c’分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异(p<0.05)。
图3示出了用Nano-KAg疫苗经鼻内接种疫苗的猪的血清和肺中的细胞因子反应。通过ELISA来分析在指定的PC时收集的血清样品的细胞因子：(A)IFN-γ和(B)TGF-β。通过ELISA来分析在尸检当天(PC 15)制备的肺裂解物的以下方面：(C)IFN-γ；(D)IL-6；(E)IL-10；(F)TGF-β；以及(G)IL-4。图中的每个条形或数据点代表了来自三只猪的平均VN滴度或光密度值±SEM。字母‘a’、‘b’和‘c’分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异(p<0.05)。
图4示出了PRRSV特异性回忆细胞因子反应的分析。再刺激指定的单核细胞，并且通过ELISA来分析所收集的培养上清液的细胞因子：(A到D)IFN-γ；(E到H)IL-12；(I和J)IL-6；以及(K和L)TGF-β。从测试值中扣除在没有灭活的PRRSV的情况下培养的免疫细胞分泌的细胞因子。图中的每个条形代表了来自三只猪的平均细胞因子量±SEM。字母‘a’、‘b’和‘c’分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异(p<0.05)。
图5示出了CD和CD8阳性T细胞亚群的细胞计数分析。对指定的单核细胞进行免疫染色以分析免疫细胞的频率：(A到D)CD3+细胞；(E到H)CD8+T细胞；(I到L)CD4+T细胞；以及(M到P)CD4+CD8+T细胞。图中的每个条形代表了来自三只猪的免疫细胞的平均百分比±SEM。字母‘a’、‘b’和‘c’分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异(p<0.05)。
图6示出了先天和调控T细胞的细胞计数分析。对指定的单核细胞进行免疫染色以确定免疫细胞的频率：(A到D)γδT细胞；(E到H)骨髓细胞；(I到K)树突状细胞富含部分；以及(L、M和N)Tregs。图中的每个条形代表了来自三只猪的免疫细胞的平均百分比±SEM。字母‘a’、‘b’和‘c’分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异(p<0.05)。
图7示出了在体外猪肺泡M s中的Nano-KAg的表征。(A)通过标准多重乳液法制备的包封PRRSV Ag的PLGA纳米粒子的扫描电子显微照片。共焦显微镜照片：(B)将Mф用杀死的PRRSV(K-Ag)、Nano-KAg处理，或用PRRSV感染，然后用PRRSV N蛋白质特异性mAb、接下来用Alexa 488抗小鼠抗体处理；PRRSV N蛋白质在的核内体中的共定位，(C)经Nano-KAg处理，以及(D)经PRRSV感染。(E)经Nano-KAg处理的骨髓细胞(CD172+)中CD80/86的上调。每个条形代表了从三只猪收集的模拟的、经K-Ag处理和经Nano-KAg处理的BAL细胞中对CD80/86标志物呈阳性的Mφ的平均百分比+/-SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异(p<0.05)。(F)示出如所指示经处理的Mφ中PRRSV-N蛋白质的存在的代表性直方图。在三个独立的试验中获得类似的结果。
图8示出了在攻击前研究中Nano-KAg引发增强的先天反应和抑制的调控反应。猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次。进行免疫染色以分析免疫细胞的频率：肺MNC中的(A)NK细胞，(B)树突状细胞，(C)γδT细胞，(D)Th/记忆细胞，(E)CD8+T细胞；以及PBMC中的(H)γδT细胞和(I)树突状细胞。通过ELISA来分析从再刺激的免疫细胞收集的培养上清液的细胞因子：肺MNC中的(F)IL-10和(G)IL-6；以及PBMC中的(J)IL-10；还有血清中的(K)IFN-α。每个条形代表了来自三只猪的平均量±SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异(p<0.05)。
图9示出了经Nano-KAg接种疫苗的MN184攻击的猪中减少的肺病变和病毒负荷。猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在PID 21时用PRRSV MN184病毒株攻击并且在DPC15时施以无痛致死术。(A)来自指定猪组的代表性猪肺H&E照片。(B)来自指定猪组的代表性肺免疫组织化学(IHC)照片，其示出了用诺瓦红(Nova red)染色的PRRSV N抗原阳性细胞(放大的图像中的星号)。(C)基于受影响的肺区域的百分比和炎性病变的严重程度对总体肺损伤进行评级。(D)在来自每只猪的10个随机场中对IHC中的PRRSV N抗原阳性细胞进行计数。通过免疫荧光分析法来测定在指定的DPC时(E)血清中以及在DPC 15时(F)肺中以荧光焦点单位表示的PRRSV滴度。每个条形代表了来自三只猪的平均值±SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异(p<0.05)。在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
图10示出了经Nano-KAg接种疫苗的MN184病毒株攻击的猪中增强的PRRSV特异性IgA和中和抗体反应。猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在PID 21时用PRRSVMN184病毒株攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术。通过ELISA来测定(A)肺、(D)血清和(G)鼻拭子中的抗PRRSV IgA抗体反应；以及(B)肺、(E)血清和(H)鼻拭子中的IgG抗体反应。通过免疫荧光分析法来测定(C)肺和(F)血清中的PRRSV中和抗体反应。每个条形代表了来自三只猪的平均光密度值或VN滴度±SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异(p<0.05)。在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
图11示出了Nano-KAg引发猪肺中增强的先天免疫反应。猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在PID 21时用PRRSV MN184病毒株攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术。通过ELISA来分析肺匀浆的细胞因子(A)IFN-α。通过流式细胞计数法来分析肺MNC的(B)NK细胞，(D)γδT细胞，(E)CD4+T细胞，以及(F)CD8+T细胞。通过LDH分析法从细胞毒性功能来分析存在于肺MNC中的(C)NK细胞。图中的每个条形或数据点代表了来自三只猪的平均值±SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异(p<0.05)。在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
图12示出了经Nano-KAg接种疫苗的MN184攻击的猪肺中免疫抑制反应的减少。猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在PID 21时用PRRSV MN184病毒株攻击并且在DPC15时施以无痛致死术。通过流式细胞计数法来分析肺MNC的(A)Tregs群体。分析肺匀浆的(B)IL-10，(C)TGF-β，以及(D)IFN-α。通过ELISA来分析从再刺激的肺MNC收集的培养上清液的细胞因子：(E)IL-10，(F)TGF-β，以及(G)IFN-γ。每个条形代表了来自三只猪的平均值±SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异(p<0.05)。在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
图13示出了经Nano-KAg接种疫苗的MN184病毒株攻击的猪的PBMC和TBLN中增加的PRRSV特异性回忆细胞因子反应。猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在PID 21时用PRRSV MN184病毒株攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术。通过ELISA来分析从再刺激的PBMC和TBLV MNC收集的培养上清液的细胞因子：(A和E)IL-10，(B)TGF-β，(C和F)IFN-γ，以及(D和G)IL-6。每个条形代表了来自三只猪的平均值±SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异(p<0.05)。在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
图14示出了通过ELISA针对指定的PRRSV结构蛋白质和总病毒蛋白质对猪的支气管肺泡灌洗液中PRRSV特异性IgA抗体产生的估算。
图15示出了通过ELISA针对总PRRSV蛋白质对血液中PRRSV特异性总IgG抗体滴度的估算。PC-攻击后天数；接种疫苗-第1次接种疫苗；加强-加强剂量。
图16示出了通过免疫荧光分析法对猪肺中PRRSV特异性中和滴度(VNT)的估算。
图17示出了通过免疫荧光分析法对猪的血液样品中PRRSV特异性中和滴度(VNT)的估算。PC-攻击后天数；接种疫苗-第1次接种疫苗；加强-加强剂量。
图18示出了通过ELISPOT分析法测定的在猪肺中对指定的PRRSV结构蛋白质和总病毒蛋白质具特异性的IFN-γ分泌细胞的频率。
图19(A和B)示出了通过定量实时PCR(qRT-PCR)对肺中PRRSV RNA拷贝数的测定，并且(C和D)示出了通过免疫荧光分析法测定的在猪肺中感染性PRRSV滴度的测定。
图20示出了通过免疫荧光分析法测定的在猪的血液样品中感染性PRRSV负荷的测定。
图21示出了通过免疫荧光分析法对猪肺中感染性PRRSV滴度的测定。A和B是阴性和阳性对照，并且C到H是500μg/猪的疫苗剂量类别的指定猪组(n＝3)的肺匀浆中病毒负荷的代表性照片。
图22示出了经纳米粒子包封的PRRSV K-Ag+结核分枝杆菌WCL接种疫苗并且经异种PRRSV攻击的猪中免疫反应和病毒清除的总结。
图23示出了用PLGA纳米粒子包封的PRRSV疫苗经鼻内接种疫苗并且用异种病毒攻击的猪中抗PRRSV免疫的示意图。
图24A、24B和24C示出了包封PRRSV KAg的PLGA纳米粒子(NP-KAg)的表征。(A)用20kV和30,000x放大率的Philips XL30-FEGSEM获取照片。(B)在正常生理条件下表现来自NP-KAg的PRRSV Ag的释放型态。(C)在处理后的指定时间点由猪的PAM细胞对NP-KAg的吸收。每个免疫荧光照片代表每个处理条件：(i)KAg；(ii)NP-KAg；(iii)假的NP；(iv)细胞对照；(v)经PRRSV(VR2332)感染。在其它两个独立的实验中获得类似的结果。
图25A-25F示出了经加佐剂的NP-KAg接种疫苗的猪中PRRSV特异性抗体的显著增加。猪用指定的疫苗与佐剂的组合接种疫苗或未接种疫苗并且用PRRSV MN184攻击。通过ELISA来分析在指定的PC时收集的肺和血液样品的病毒特异性IgA(A和C)和IgG(B、D、E和F)：(A和B)BAL液；(C、D)肺匀浆；(E、F)血浆样品。线图中的每个条形和每个符号指示了三只猪的平均值±SEM。星号和小写字母指示了如方法中所描述的指定组之间的统计显著差异。在另一个独立的实验中获得类似的结果趋势。
图26A-26F示出了经加佐剂的NP-KAg接种疫苗的猪中增强的异种和异基因型PRRSV中和抗体(VN)滴度。如图例25中所描述对猪接种疫苗并攻击。分析在指定的PC时收集的肺匀浆(A、B、E-H)和血浆(C、D)样品的PRRSV VN滴度：(A-D)针对攻击的PRRSV(MN184)的VN滴度；(E、F)PRRSV(1-4-4)；(G、H)PRRSV(SD03-15)。线图中的每个条形和每个符号指示了三只猪的平均值±SEM。星号和小写字母指示了如方法中所描述的指定组之间的统计显著差异。
图27A-27I示出了经加佐剂的NP-KAg疫苗(500μg/猪的类别)接种疫苗的猪中增强的Th1-Th2产生和抑制的免疫抑制性细胞因子。如图例25中所描述对猪接种疫苗并攻击。(A)用杀死的MN184Ag再刺激肺MNC并且通过ELISPOT来测量IFN-γ分泌细胞(ISC)的频率。通过ELISA来分析肺匀浆的以下方面：(B)IFN-γ；(D)IL-12；(C)IL-6；(E)TGF-β；(F)IL-10。用杀死的MN184Ag再刺激PBMC并且通过ELISA来分析上清液的以下方面：(G)IL-4；(H)IL-6；(I)IL-10。每个条形指示了来自三只猪的每百万个LMNC的ISC的平均数或细胞因子的平均值±SEM。星号指示了指定猪组之间的统计显著差异。在独立的第二个实验中获得类似的结果趋势。
图28A-28R示出了经加佐剂的NP-KAg疫苗(500μg/猪的剂量)接种疫苗的猪中显著增加的IFN-γ分泌淋巴细胞亚群和APC。如图例25中所描述对猪接种疫苗并攻击。用MN184Ag再刺激LMNC(A-I)和PBMC(J-R)，并且使用指定的细胞表面标志物和细胞内IFN-γ进行免疫染色，并且通过流式细胞计数法分析。分别存在于LMNC和PBMC中的总IFN-γ+细胞(Ai、Ji)的频率和IFN-γ+细胞(Aii和Jii)的代表性直方图。虚线：同型对照和实线：IFN-γ+特异性染色。在PC 15时分析存在于LMNC和PBMC中的IFN-γ+淋巴细胞亚群：CD4+IFN-γ+(B、K)；CD8+IFN-γ+(C、L)；CD4+CD8+IFN-γ+(D、M)；γδ+IFN-γ+(E、N)；NK(CD56+)(F、O)；以及CD56+IFN-γ+细胞(G、P)。还分析APC群体：MΦ富含群体(CD172+CD163+SLA-II+)(H、G)；以及DC富含群体(CD172+CD11c+SLA-II+)(I、R)。每个条形指示了来自三只猪的指定细胞的平均频率±SEM。星号指示了指定猪组之间的统计显著差异。
图29A-29K示出了来自经加佐剂的NP-KAg(500μg/猪的剂量)疫苗接种疫苗的猪的肺和血液的复制PRRSV的完全清除。如图例2中所描述对猪接种疫苗并攻击。通过间接免疫荧光分析法来分析在指定的PC时收集的(A、B)BAL液、(E、F)肺匀浆和(I、J)血浆样品的复制PRRSV滴度的存在。通过qRT-PCR来分析BAL液(C、D)和肺匀浆(G、H)中的PRRSV病毒RNA拷贝数。(K)经H&E染色的肺切片的代表性图像。每个条形或符号指示了三只猪的平均病毒滴度或病毒RNA拷贝数±SEM。星号或小写字母指示了如方法中所描述的指定猪组之间的统计显著差异。
图30A-30F示出了经加佐剂的NP-KAg接种疫苗的猪的血液中显著增加的PRRSV结构(GP5、M和N)蛋白质特异性IgG。猪用指定的疫苗与佐剂的组合接种疫苗或未接种疫苗并且用PRRSV MN184攻击。通过ELISA来分析在指定的天数收集的血液样品的针对GP5(A、B)、M(C、D)和N(E、F)蛋白质的IgG滴度。每个符号指示了指定组的三只猪的平均IgG滴度±SEM。小写字母指示了如材料与方法中所描述的两个指定猪组之间的统计显著(p<0.05)差异。在独立的第二个实验中获得类似的结果趋势。
图31A-31F示出了经加佐剂的NP-KAg疫苗接种疫苗的猪中产生的高亲合力PRRSV特异性抗体。猪用指定的疫苗与佐剂的组合接种疫苗或未接种疫苗并且用PRRSV MN184攻击。通过亲合力ELISA来分析肺和血液样品的PRRSV特异性IgA的亲合力：(A、B)BAL液；(C、D)肺匀浆；(E、F)血浆样品中的PRRSV特异性IgG。每个符号指示了三只猪的相较于对照(在0M下的NH4CN＝100％吸光度)的保留吸光度的平均百分比±SEM。在0M下的OD405指示了在0M下或没有硫氰酸铵处理的指定组的三只猪的平均OD±SEM。小写字母指示了如材料与方法中所描述的两个指定猪组之间的统计显著(p<0.05)差异。在独立的第二个实验中获得类似的结果趋势。
图32A和32B示出了经加佐剂的NP-KAg疫苗接种疫苗的猪中PRRSV特异性IgG2(Th1)和IgG1(Th2)抗体以及Th1-Th2平衡的反应的水平增加。猪用指定的疫苗与佐剂的组合接种疫苗或未接种疫苗并且用PRRSV MN184攻击。通过ELISA来分析肺匀浆和血浆样品的PRRSV特异性IgG1和IgG2同型特异性抗体。(A)每个条形指示了三只猪的平均OD值±SEM。(B)IgG1:IgG2的比率表示Th1或Th2偏向的反应。每个条形指示了平均比率并且趋势线指示了截止比率。>1和<1的比率分别指示了Th2和Th1偏向的反应。小写字母指示了如材料与方法中所描述的两个指定猪组之间的统计显著(p<0.05)差异。在独立的第二个实验中获得类似的结果趋势。
图33A-33I示出了经加佐剂的NP-KAg疫苗(100μg/猪的类别)接种疫苗的猪中增强的Th1-Th2产生和抑制的免疫抑制性细胞因子。如图例24中所描述对猪接种疫苗并攻击。(A)用杀死的MN184Ag再刺激肺MNC，并且通过ELISPOT来测量IFN-γ分泌细胞(ISC)的频率。通过ELISA来分析肺匀浆的以下方面：(B)IFN-γ；(D)IL-12；(C)IL-6；(E)TGF-β；(F)IL-10。用杀死的MN184Ag再刺激PBMC，并且通过ELISA来分析上清液的以下方面：(G)IL-4；(H)IL-6；(I)IL-10。每个条形指示了来自三只猪的每百万个LMNC的ISC的平均数或细胞因子的平均值±SEM。星号指示了指定猪组之间的统计显著差异。在独立的第二个实验中获得类似的结果趋势。
图34A-34R示出了经加佐剂的NP-KAg疫苗(100μg/猪的剂量)接种疫苗的猪中显著增加的IFN-γ分泌淋巴细胞亚群和APC。如图例25中所描述对猪接种疫苗并攻击。用MN184Ag再刺激LMNC(A-I)和PBMC(J-R)，并且使用指定的细胞表面标志物和细胞内IFN-γ进行免疫染色，并且通过流式细胞计数法分析。分别存在于LMNC和PBMC中的总IFN-γ+细胞(Ai、Ji)的频率和IFN-γ+细胞(Aii和Jii)的代表性直方图。虚线：同型对照和实线：IFN-γ+特异性染色。在PC 15时分析存在于LMNC和PBMC中的IFN-γ+淋巴细胞亚群：CD4+IFN-γ+(B、K)；CD8+IFN-γ+(C、L)；CD4+CD8+IFN-γ+(D、M)；γδ+IFN-γ+(E、N)；NK(CD56+)(F、O)；以及CD56+IFN-γ+细胞(G、P)。还分析APC群体：MΦ富含群体(CD172+CD163+SLA-II+)(H、G)；以及DC富含群体(CD172+CD11c+SLA-II+)(I、R)。每个条形指示了来自三只猪的指定细胞的平均频率±SEM。星号指示了指定猪组之间的统计显著差异。
图35A和35B示出了NP-KAg(或PLGA-NanoPRRS)显著降低肺和血液中的病毒负荷。如所指示对猪接种疫苗(100或500μg/猪的剂量)并且用有毒的异种PRRSV MN184攻击。通过间接免疫荧光分析法来测定PRRSV滴度：(A)肺裂解物样品(每克肺组织中的滴度)；(B)血液样品(每毫升血浆中)。每个条形或符号指示了三只猪的平均滴度±SEM。星号/字母指示了第6组的猪与其它测试组之间的结果的统计显著(p<.0.5)差异。
图36A和36B示出了NP-KAg(或PLGA-NanoPRRS)显著增加猪肺中的IFN-γ反应。如所指示对猪接种疫苗并且用有毒的异种PRRSVMN184攻击。用杀死的PRRSV Ag再刺激在PC 15时收集的肺MNC以分析：(A)IFN-γ+斑点，通过ELISPOT分析法；(B)IFN-γ+淋巴细胞，通过流式细胞计数法。每个条形指示了三只猪的平均百分比值±SEM。星号指示了第6组的猪与其它测试组之间的结果的统计显著(p<0.05)差异。
图37A和37B示出了NP-KAg(或PLGA-NanoPRRS)显著增加PRRSV中和(VN)滴度。如所指示对猪接种疫苗(100或500μg/猪的剂量)并且用有毒的异种PRRSV MN184攻击。分析在PC 15时制备的肺裂解物以及在指定的天数收集的血浆样品的针对以下中的PRRSVMN184的VN滴度：(A)肺裂解物和(B)血浆样品。每个条形或符号指示了第6组的猪与其它测试组之间的结果的统计显著(p<0.05)差异。
图38A和38B示出了NP-KAg(或PLGA-NanoPRRS)显著增加PRRSV特异性抗体的亲合力。如所指示对猪接种疫苗(500μg剂量)并且用有毒的异种PRRSV MN184攻击。通过ELISA来分析在PC 15时收集的血浆和肺裂解物样品的病毒特异性：(A)IgA和(B)IgG亲合力。每个符号指示了来自三只猪的相较于对照[在0M浓度下的硫氰酸铵(NH4CN)＝100％]的保留Ag-Ab复合物的平均百分比±SEM。字母指示了第6组的猪与其它测试组之间的结果的统计显著(p<0.05)差异。
发明详述
可以通过参考以下发明详述和其中所包括的实施例来更容易地理解本发明。
本文中在上文或下文所引用的所有专利、专利申请和公布特此以其全文引用的方式并入本申请中以更全面地描述如本领域的技术人员所知的到本文所描述和要求的发明日期为止的技术现状。
除非另有明确规定，否则本文所阐述的任何方法或方面决不打算被解释为要求以特定的次序进行其步骤。因此，在权利要求书或描述中的方法权利要求没有特别规定步骤限于特定的次序的情况下，决不打算在任何方面推断出次序。这支持了解释说明的任何可能的非明示基础，包括关于步骤安排或操作流程的逻辑问题、来源于语法组织或标点符号的显明意义，或本说明书中所描述的方面的数目或类型。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。在本文中实施方案的描述中所用的术语仅仅用于描述特定的实施方案并且不打算限制所公开的实施方案。除非上下文另有明确指示，否则如描述中所用的单数形式“一(a/an)”和“这”打算也包括复数形式。本文所提及的所有公布、专利申请、专利和其它参考文献都以其全文引用的方式并入。
除非另有指示，否则本公开中所用的表达成分的量、反应条件等等的所有数值应理解为在所有情况下用术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则本公开中所阐述的数值参数是可以变化的近似值，这取决于本公开所寻求获得的所需特性。最低限度地，并且不试图限制任何权利要求的范围的等同原则的应用，每个数值参数应根据有效数字的数值和一般舍入方法来解释。
范围可以在本文中被表达为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应了解，特定值形成另一个实施方案。应进一步了解，范围中的每一者的终点是有效的，其涉及到另一个终点，并且独立于另一个终点。还应了解，存在许多本文所描述的值，并且每个值在本文中除了值本身之外也被公开为“约”那个特定值。举例来说，如果公开了值“10”，那么也公开了“约10”。还应了解，当公开了一个值时，如本领域的技术人员适当理解，也公开了“小于或等于”这个值、“大于或等于这个值”以及值之间的可能范围。举例来说，如果公开了值“10”，那么也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应了解，在本申请的通篇，数据以许多不同的格式提供，并且这些数据代表了终点、起点，以及数据点的任何组合的范围。举例来说，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，那么应了解，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15被视为公开的，介于10与15之间也是这样。还应了解，也公开了两个特定单位之间的每个单位。举例来说，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。
术语“受试者”意味着个体。在一个方面，受试者是哺乳动物，如灵长类动物，并且更优选地是人类。仅举几例，非人类灵长类动物包括绒、猴、黑猩猩、大猩猩、类人猿和长臂猿。术语“受试者”还包括驯养动物，如猫、狗等、家畜(例如，牛(乳牛)、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如，白鼬、栗鼠、小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等)以及鸟禽物种(例如，家鸡、火鸡、鸭、雉、家鸽、斑鸠、鹦鹉、美冠鹦鹉、鹅等)。受试者还可以包括(但不限于)鱼(例如，斑马鱼、金鱼、罗非鱼、鲑鱼和鳟鱼)、两栖动物和爬行动物。如本文所用的“受试者”与“患者”相同，并且这些术语可以互换使用。
如本文所用的词语“或”意味着特定清单的任一个成员并且还包括那个清单的成员的任何组合。
如本文所用的术语“氨基酸序列”指的是代表氨基酸残基的缩写、字母、特征或词语的清单。本文所用的氨基酸缩写是用于氨基酸的常规单字母代码并且表达如下：A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸。
如本文所用的“多肽”指的是任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白质。多肽由连续的氨基酸组成。术语“多肽”涵盖天然存在或合成的分子。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用。
另外，如本文所用的术语“多肽”指的是通过肽键或经修饰的肽键彼此连接的氨基酸，例如肽电子等排物等，并且除了20个基因编码氨基酸以外可以含有经修饰的氨基酸。多肽可以通过天然过程(例如翻译后加工)，或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。相同类型的修饰可以按相同或不同的程度存在于给定多肽中的若干个位点处。而且，给定多肽可以具有许多类型的修饰。修饰包括(但不限于)乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、共价交联或环化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、二硫键形成、脱甲基化、半胱氨酸或焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化，以及转移RNA介导的氨基酸添加到蛋白质中，如精氨酰化。(参看Proteins-Structure and Molecular Properties第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；PosttranslationalCovalent Modification of Proteins,B.C.Johnson编,Academic Press,New York,第1-12页(1983))。
如本文所用的“经分离的多肽”或“经纯化的多肽”意味着基本上不含在自然界中多肽通常缔合的物质的多肽(或其片段)。本发明的多肽或其片段可以例如通过从天然来源(例如，哺乳动物细胞)中提取，通过表达编码多肽的重组核酸(例如，在细胞中或无细胞翻译系统中)，或通过化学合成多肽来获得。另外，多肽片段可以通过这些方法中的任一者，或通过裂解全长蛋白质和/或多肽来获得。
如本文所用的词语“或”意味着特定清单的任一个成员并且还包括那个清单的成员的任何组合。
如本文所用的短语“核酸”指的是天然存在或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA或RNA或DNA-RNA杂交体、单链或双链的、正义或反义的，其能够通过沃森-克里克碱基配对(Watson-Crickbase-pairing)与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物(例如，BrdU)，以及非磷酸二酯核苷酸间键联(例如，肽核酸(PNA)或硫二酯键联)。具体地说，核酸可以包括(但不限于)DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。
如本文所用的“经分离的核酸”或“经纯化的核酸”意味着不含在本发明的DNA所来源的生物体的天然存在的基因组中侧接基因的基因的DNA。这个术语因此包括例如重组DNA，其被并入到载体中，例如自主复制质粒或病毒；或并入到原核生物或真核生物的基因组DNA中(例如，转基因)；或以独立的分子形式存在(例如，通过PCR、限制性核酸内切酶消化或化学或体外合成所产生的cDNA或基因组或cDNA片段)。其还包括作为编码额外多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。术语“经分离的核酸”还指的是RNA，例如mRNA分子，其由经分离的DNA分子编码，或经化学合成，或与至少一些细胞组分分离或基本上不含至少一些细胞组分，例如其它类型的RNA分子或多肽分子。
如本文所用的“样品”意味着动物；来自动物的组织或器官；细胞(在受试者体内、直接从受试者获取，或维持在培养物中或来自经培养的细胞系的细胞)；细胞裂解物(或裂解物部分)或细胞提取物；或含有一种或多种来源于细胞或细胞物质(例如，多肽或核酸)的分子的溶液，其如本文所描述加以分析。样品还可以是含有细胞或细胞组分的任何体液或排泄物(例如(但不限于)血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁)。
如本文所用的“预防”意味着使得发展PRRS感染的易感性增加的受试者将发展PRRS感染的机会减到最低。
术语“多个”指的是两个或更多个。应进一步了解，对于核酸或多肽所给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值是近似值，并且是为了描述而提供。另外，关于物质(例如抗原)的浓度或水平所给出的数值限制规定为近似值。因此，在浓度指定为至少(例如)200pg的情况下，规定浓度应被理解为至少近似(或“约”)200pg。
尽管类似或等价于本文所描述的那些方法和材料可以在本公开的实践或测试中使用，但下文描述了适合的方法和材料。术语“包含”意味着“包括”。因此，除非上下文另有要求，否则词语“包含”将被理解为暗示包括规定的化合物或组合物(例如，核酸、多肽、抗原)或步骤，或化合物或步骤的组，但不排除任何其它化合物、组合物、步骤或其组。
“免疫原性组合物”是适合投予到人类或动物受试者(例如，在实验环境中)的物质组合物，其能够引发特异性免疫反应，例如针对病原体，如PRRSV。这样的话，免疫原性组合物包括一种或多种抗原(例如，完整的经纯化的病毒或其抗原亚单位，例如多肽)或抗原表位。免疫原性组合物还可以包括一种或多种能够引发或增强免疫反应的额外组分，如赋形剂、载剂和/或佐剂。在某些情况下，投予免疫原性组合物以引发保护受试者对抗由病原体诱发的症状或病状的免疫反应。在一些情况下，由病原体引起的症状或疾病是通过在受试者暴露于病原体之后抑制病原体的复制来预防(或治疗，例如减轻或改善)。在本公开的上下文中，术语免疫原性组合物将被理解为涵盖打算投予到受试者或受试者群体用于引发针对病毒的保护性或姑息性免疫反应的目的的组合物(即，疫苗组合物或疫苗)。
术语“纯化”(例如，关于病原体或含有病原体的组合物)指的是从组合物中去除组分的过程，这些组分的存在是不需要的。纯化是相对的术语，并且不需要从组合物中去除不合需要的组分的所有痕迹。在疫苗生产的情形中，纯化包括以下过程：例如离心、渗析、离子交换色谱以及尺寸排阻色谱、亲和纯化或沉淀。因此，术语“经纯化”不需要绝对纯度；相反地，其规定为相对的术语。因此，举例来说，经纯化的病毒制剂是病毒比在其生成环境中(例如在其自然复制的细胞或细胞群体内)或在人工环境中更加富集的制剂。基本上纯的病毒的制剂可以经过纯化，以使得所需的病毒或病毒组分代表制剂的总蛋白质含量的至少50％。在某些实施方案中，基本上纯的病毒将代表制剂的总蛋白质含量的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更高。
“经分离”的生物组分(例如病毒、核酸分子、蛋白质或细胞器)已经基本上与出现或产生这种组分的细胞和/或生物体中的其它生物组分分离或纯化分开。已经“分离”的病毒和病毒组分(例如蛋白质)包括通过标准纯化方法纯化的病毒和蛋白质。这个术语还涵盖通过在宿主细胞中重复表达而制备的病毒和病毒组分(例如病毒蛋白质)。
“抗原”是可以刺激动物中的抗体产生和/或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括被注射、吸收或以其它方式引入到动物体内的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。术语“表位”或“抗原决定簇”指的是B和/或T细胞响应的抗原上的位点。“优势抗原表位”或“优势表位”是对其作出功能显著的宿主免疫反应，例如抗体反应或T细胞反应的那些表位。因此，关于针对病原体的保护性免疫反应，优势抗原表位是当被宿主免疫系统识别时保护免受由病原体引起的疾病影响的那些抗原部分。术语“T细胞表位”指的是当结合到适当的MHC分子时由T细胞(经由T细胞受体)特异性结合的表位。“B细胞表位”是由抗体(或B细胞受体分子)特异性结合的表位。抗原还可以影响先天免疫反应。
“免疫反应”是免疫系统的细胞，如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激物作出的反应。免疫反应可以是B细胞反应，其使得特异性抗体产生，如抗原特异性中和抗体。免疫反应还可以是T细胞反应，如CD4+反应或CD8+反应。在一些情况下，反应对特定抗原具特异性(即，“抗原特异性反应”)。免疫反应还可以包括先天反应。如果抗原来源于病原体，那么抗原特异性反应是“病原体特异性反应”。“保护性免疫反应”是抑制病原体的有害功能或活性，降低由病原体引起的感染，或减少由病原体引起的感染所致的症状(包括死亡)的免疫反应。保护性免疫反应可以例如通过在空斑减少分析法或ELISA中和分析法中病毒复制或空斑形成的抑制，或通过测量对体内病原体攻击的抗性来测量。
本文所公开的免疫原性组合物适合于预防、改善和/或治疗由病毒感染引起的疾病。
缩写“KAg”表示杀死的抗原并且代表杀死的或灭活的PRRSV。灭活的PRRSV包含一种或多种免疫原性PRRS病毒蛋白质并且因此灭活的PRRSV可以被视为杀死的抗原。
缩写“NP-KAg”表示纳米粒子-杀死的抗原。这代表经纳米粒子囊封的灭活的PRRSV。
如本文所用的术语“病毒样粒子”或“VLP”指的是非复制的病毒外壳。VLP一般由一种或多种与病毒表面衣壳结构相关联的病毒蛋白质组成，例如，但在PRRSV的情况下不限于PRRSV的结构蛋白质GP3、GP4、GP5以及基质蛋白质或其组合。VLP可以在适当表达系统中重组表达蛋白质后自发地形成。VLP当投予到动物时，可以是免疫原性的并且因此可以在动物体内引起保护性或治疗性免疫反应。产生VLP的方法在本领域中一般是已知的并且在下文更全面地讨论。在重组表达病毒蛋白质之后VLP的存在可以使用本领域中已知的常规技术来检测，例如通过电子显微术、生物物理表征等等。参看例如Baker等人,Biophys.J.(1991)60:1445-1456；Hagensee等人,J.Virol.(1994)68:4503-4505。举例来说，VLP可以通过密度梯度离心来分离和/或通过特征性密度条带来鉴别。
尽管阐述本公开的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但特定实例中所阐述的数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地含有由其相应的测试测量中所发现的标准偏差必然引起的某些误差。在本说明书通篇所给出的每个数值范围将包括属于这样的较宽数值范围内的每个较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
另外，在本发明的特征或方面依据马库西组(Markush group)或替代物的其它组来描述的情况下，本领域的技术人员将认识到，本发明由此还依据马库西组或其它组的任何个别的成员或成员的子组来描述。
组合物
当人类或非人类动物受外来生物体/病原体攻击时，受攻击的个体通过发动可以是保护性的免疫反应来作出响应。这种免疫反应是用先天与后天免疫反应系统的协同相互作用来表征。
先天免疫反应形成针对外来生物体/病原体的防御的第一线。先天免疫反应可以在感染几分钟内以抗原非依赖性、但病原体依赖性的方式触发。先天的并且确实是自适应的免疫系统可以通过由存在于大多数宿主细胞上的模式识别受体识别对于微生物来说独特的病原体相关的分子模式来触发。一旦触发，先天系统即产生炎性反应，这种炎性反应活化细胞和体液的自适应免疫反应系统。
自适应免疫反应经过几天或几周变得有效并且提供了控制并且通常消除外来生物体/病原体所需的抗原特异性反应。自适应反应是由对病原体显现出特异性的T细胞(细胞介导的免疫)和B细胞(抗体介导的免疫或体液免疫)来介导。一旦活化，这些细胞即对同一种病原体具有持久的记忆。
个体对外来生物体/病原体产生免疫，从而预防或至少减少受外来生物体/病原体感染的机会的能力是疾病控制中的强有力的工具并且是接种疫苗背后的原理。
疫苗通过使免疫系统准备好对病原体作出反应来发挥功能。典型地，疫苗包含抗原，其为外来生物体/病原体或由生物体/病原体产生的毒素或其一部分，其以无毒、非感染性、非致病性的形式被引入到将接种疫苗的受试者的体内。疫苗中的抗原使得受试者的免疫系统对抗原所来源的生物体/病原体“致敏”或“敏感”。受试者的免疫系统随后暴露于生物体/病原体或毒素引起快速而稳固的特异性免疫反应，这种免疫反应在生物体/病原体或毒素可以倍增并且感染或损害宿主生物体中足够多的细胞以导致疾病症状之前控制或破坏这种生物体/病原体或毒素。
在许多情况下，有必要增强对存在于疫苗中的抗原的免疫反应以刺激免疫系统到足以使得疫苗有效的程度，即，赋予免疫。为此，已经设计出被称为佐剂(或免疫增强剂)的添加剂，其增强了对疫苗组合物中的抗原的体内免疫反应。
佐剂组分相对于由单独的抗原引发的免疫反应可以增加对抗原的免疫反应的强度和/或持续时间。佐剂组分所需的功能特征是其增强对靶抗原的适当免疫反应的能力。
本文描述了用于制备所公开的组合物的组分以及用于本文所公开的方法中的组合物本身。本文公开了这些和其它材料，并且应了解，当公开了这些材料的组合、亚群、相互作用、组等时，尽管可能未明确地公开这些化合物的每个不同的个别和集体的组合和排列的特定参考，但本文中特别涵盖和描述每一者。因此，如果公开了一类分子A、B和C并且公开了一类分子D、E和F以及组合分子A-D的一个实例，那么即使没有个别地叙述每一者，也个别地并且集体地涵盖每一者，这意味着组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F被视为公开的。同样地，也公开了这些的任何亚群或组合。因此，举例来说，A-E、B-F和C-E的子组应被视为公开的。这个概念适用于本申请的所有方面，包括(但不限于)制造和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在多种可以进行的额外步骤，那么应了解，这些额外步骤中的每一者可以与所公开的方法的任何特定的实施方案或实施方案的组合一起进行。
本文描述了包含免疫原性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和纳米粒子的组合物。
本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以进一步包含一种或多种佐剂。佐剂可以是改进其它试剂，例如本文所描述的抗原的作用的任何组合物、药理或免疫剂。佐剂的实例包括(但不限于)分枝杆菌裂解物(包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)全细胞裂解物)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(包括耻垢分枝杆菌全细胞裂解物)、霍乱毒素B亚单位以及大肠杆菌(E.coli)热不稳定突变毒素。佐剂的其它实例包括进化上保守的分子，所谓的PAMP，其包括脂质体、脂多糖(LPS)、抗原的分子笼、细胞细胞壁的组分，以及内吞的核酸，如双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)和含有未甲基化的CpG二核苷酸的DNA。佐剂的额外实例包括(但不限于)含铝佐剂，其包括抗原吸附在上面的矿物(或矿物盐，如氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝)的悬浮液。佐剂的额外实例包括(但不限于)无铝佐剂，其在没有任何这样的铝盐的情况下配制。无铝佐剂包括油和水乳液，如油包水和水包油(以及其变型，包括双重乳液和可逆乳液)、脂糖、脂多糖、免疫刺激核酸(如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)，以及这些组分的各种组合。
在一些实施方案中，本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以进一步包含结核分枝杆菌全细胞裂解物、耻垢分枝杆菌全细胞裂解物和母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)全细胞裂解物。
本文所描述的组合物、免疫原性组合物和疫苗可以包含一种或多种纳米粒子。纳米粒子(与术语“纳米载体”可互换使用)的实例可以见于例如美国专利申请20100233251中。纳米载体的实例包括(但不限于)由一种或多种聚合物组成的纳米载体。在一些实施方案中，一种或多种聚合物是水溶性的、非粘附性的聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙烯(PEO)。在一些实施方案中，聚合物是聚烷二醇或聚氧化烯。在一些实施方案中，一种或多种聚合物是可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，一种或多种聚合物是生物相容的聚合物，其为水溶性的、非粘附性的聚合物与可生物降解的聚合物的偶联物。在一些实施方案中，可生物降解的聚合物是聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)或聚(乳酸/乙醇酸)(PLGA)。在一些实施方案中，纳米载体由PEG-PLGA聚合物组成。
在一些实施方案中，纳米载体通过自组装而形成。自组装指的是以可预测的方式使用将自身定位的组分形成纳米载体的过程，从而可预测地并且可再现地形成纳米载体。在一些实施方案中，纳米载体是使用自身相对于彼此定位的两亲生物材料形成，以形成可预测的尺寸、成分和成分布置的纳米载体。在一些实施方案中，纳米载体是微米粒子、纳米粒子或皮米粒子。在一些实施方案中，微米粒子、纳米粒子或皮米粒子是自组装的。
在一些实施方案中，纳米载体具有正ζ电势。在一些实施方案中，纳米载体在中性pH下具有净正电荷。在一些实施方案中，纳米载体在其表面处包含一个或多个胺部分。在一些实施方案中，胺部分是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施方案中，胺部分是脂族胺。在一些实施方案中，纳米载体包含含胺聚合物。在一些实施方案中，纳米载体包含含胺脂质。在一些实施方案中，纳米载体包含在中性pH下带正电荷的蛋白质或肽。在一些实施方案中，纳米载体是乳胶粒子。在一些实施方案中，在其表面上具有一个或多个胺部分的纳米载体在中性pH下具有净正电荷。
纳米粒子可以帮助递送灭活的PRRSV和/或也可以是免疫原性的。递送可以到达所关注的特定部位，例如粘膜。在一些实施方案中，纳米粒子可以建立灭活的PRRSV的延时释放以增强和/或延长免疫反应。在一些实施方案中，纳米粒子与灭活的PRRSV缔合以使得组合物可以引发免疫反应。缔合可以是例如其中纳米粒子与灭活的PRRSV偶合或偶联。偶合和偶联意味着纳米粒子与灭活的PRRSV之间存在化学键联。在一些实施方案中，灭活的PRRSV被包封或囊封在纳米粒子内。在一些实施方案中，灭活的PRRSV通过水/油/水乳液法被包封在纳米粒子内。在一些实施方案中，纳米粒子是聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。取决于用于聚合的丙交酯与乙交酯的比率，可以获得和利用不同形式的PLGA。这些形式典型地关于所用的单体的比率加以鉴别(例如，PLGA 75:25鉴别为组合物是75％乳酸和25％乙醇酸的共聚物)。在本发明中可以使用不同比率，例如90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90，以及高于这些比率和在这些比率之间的数值。适合的纳米粒子的额外实例包括甲壳素(chitosin)、磷酸钙、各种细菌如大肠杆菌、分枝杆菌、钩端螺旋体的脂质以及其混合物。在一个实例中，组合物可以通过混合约180mgPLGA与约5mg灭活的PRRSV(或约36mg PLGA与1mg灭活的PRRSV)而得到。灭活的PRRSV的包封(囊封)效率可以变化。在一个实施方案中，基于包封中所用的总PRRSV蛋白质的量计算，纳米粒子是50-55％包封/囊封的。经包封的灭活的PRRSV可以作为包封/囊封的抗原与未包封/未囊封的抗原的混合物来投予，或可以进一步纯化包封/囊封的抗原。
在一些实施方案中，抗原来源于灭活的或杀死的PRRSV。在一个实施方案中，PRRSV用UV光灭活或杀死。其它灭活手段包括化学、热或放射能。
任何适当免疫原性的灭活的PRRSV或PRRSV抗原可以用于组合物中。PRRS病毒的完整基因组序列的大小为约15kb并且含有7个开放阅读框架(ORF)。六个较小的ORF 2-7编码与病毒粒子缔合的结构蛋白质并且是可以用于本发明的组合物中的实例。免疫原性抗原的实例包括GP2、3、4、5、M19、N15、其混合物，等等。PRRSV抗原可以重组得到。
所公开的组合物可以包含免疫原性的灭活的PRRSV。所公开的组合物还可以包含灭活的PRRSV，这种灭活的PRRSV包含PRRSV抗原。举例来说，PRRSV抗原可以是PRRSV表面糖蛋白。
公开了包含病毒样粒子(VLP)和纳米粒子的组合物。所公开的组合物可以包含免疫原性的VLP。VLP类似病毒，但是非感染性的，因为其不含有任何病毒遗传物质。病毒结构蛋白质(如衣壳蛋白)的表达可以促成VLP的自组装。VLP可以在多种细胞培养系统中产生，包括哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母和植物细胞。举例来说，VLP可以由杆状病毒或植物系统产生。VLP可以是免疫原性的。所公开的纳米粒子中的任一者可以用于包封PRRSV VLP。举例来说，公开了包封在PLGA纳米粒子中的PRRSV VLP。
在一些实施方案中，所公开的组合物进一步含有植物凝集素荆豆凝集素I(Ulex Europaeus Agglutinin-I；UEA)。UEA可以与灭活的PRRSV或VLP一起被包封在纳米粒子中并且还可以表面锚定到纳米粒子。M细胞是覆盖粘膜淋巴滤泡的特化内皮细胞，被称为滤泡相关的上皮细胞(FAE)，并且含有结合到UEA的α-1岩藻糖受体。因此，UEA的存在可以有助于将组合物或疫苗引导到粘膜特化滤泡或上皮细胞。
本文描述了包含于载体中的本发明的组合物的疫苗，其中这种疫苗针对PRRSV感染提供保护。如本文所用的术语“免疫原性载体”可以指的是第一多肽或其片段、变异体或衍生物，其增强了第二多肽或其片段、变异体或衍生物的免疫原性。“免疫原性载体”可以融合到或偶联/偶合到所需的多肽或其片段。参看例如欧洲专利号EP 0385610B1，这个专利以其全文引用的方式并入本文中用于教示多肽融合、偶联或偶合到载体。“免疫原性载体”的一个实例是PLGA。在一些实施方案中，疫苗可以包含经PLGA和载体囊封的全病毒灭活的PRRSV。在一些实施方案中，疫苗可以进一步包含结核分枝杆菌全细胞裂解物。
方法
本文描述了引发猪体内针对PRRSV的免疫反应的方法，其包括向猪投予本发明的组合物。免疫反应可以是保护性的。这种方法可以进一步包括向猪投予有毒的PRRSV以监测疫苗功效。有毒的PRRSV可以是PRRSV的MN184病毒株、PRRSV的有毒的和遗传变异的病毒株。
本文描述了减少猪的繁殖或呼吸衰竭的方法，其包括以下步骤：提供本文所提供的组合物；以及将这种组合物投予到猪。这种方法可以进一步包括向猪投予有毒的PRRSV以监测疫苗功效。有毒的PRRSV可以是例如PRRSV的MN184病毒株。还描述了刺激猪体内的免疫反应的方法，其包括：向所述猪投予本文所提供的疫苗或组合物。
本文描述了投予本文所阐述的组合物和方法用于完全清除PRRSV病毒血症的方法。还描述了可以用于在经免疫的同种病毒攻击的猪中相较于杀死的PRRSV疫苗抗原(K-Ag)增加(例如，增加0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍等)抗PRRSV体液和细胞介导的免疫反应的方法和组合物。本文所描述的方法和组合物还可以用于在经免疫的同种病毒攻击的猪中相较于杀死的PRRSV疫苗抗原(K-Ag)提供肺和血液中的病毒中和抗体和IgA反应的显著增加(例如，增加0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍等)。本文所描述的方法和组合物还可以用于相较于对照猪组提供具有更高水平(例如，增加0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍等)的IFN-γ和IL-12以及更低水平(例如，减少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍等)的免疫抑制性介体(IL-10和TGF-β)的经Nano-KAg接种疫苗的猪的肺裂解物和血清。本文所描述的方法和组合物还可以用于提供具有增加的频率(例如，增加0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍等)的CD4+、CD8+、CD4+CD8+T细胞、γδT细胞、骨髓细胞和树突状细胞富含部分的来自经Nano-KAg接种疫苗的猪的肺、血液、BAL、TBLN和血液的单核细胞。这些方法和组合物还可以用于提供Foxp3+T调控细胞的减少(例如，减少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍等)。这些组合物和方法还可以用于提供经PLGA纳米粒子包封的PRRSV杀死的疫苗的鼻内递送，其引发在粘膜和全身部位处足以清除猪体内的病毒血症的免疫反应。
还提供了可以用于提供针对PRRSV的保护性全身和粘膜免疫反应的组合物和方法，这些免疫反应可以清除感染后早期，例如感染后三周、两周和一周(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30天)的病毒血症。
疫苗或组合物还可以按例如介于100ug/猪与1mg/猪之间的剂量投予。其它实例包括包含50ug/猪和500ug/猪的剂量。组合物或疫苗可以例如以单次剂量，或以两次或更多次剂量投予。在一个实施方案中，两次剂量是以两周的时间间隔投予。组合物或疫苗可以例如经鼻内投予。替代性的免疫途径的额外实例包括肌肉内、皮下、鼻内滴剂和鼻内气雾剂递送。
组合物和方法还可以按具有小于1×108TCID50的PRRSV的疫苗或免疫原的剂量使用。还提供了小于1×107、1×106和1×105TCID50的PRRSV的剂量。本文进一步公开的每个剂量可以为约5×106TCID50的PRRSV。还提供了介于1×108TCID50的PRRSV与1×105TCID50的PRRSV之间、介于1×107与1×105TCID50的PRRSV之间、介于1×106与5×106TCID50的PRRSV之间的剂量的实例。剂量可以来源于经UV处理的PRRSV。剂量可以按单次减少的病毒剂量投予以引发保护性免疫反应。
实施例
实施例1：经纳米粒子囊封的杀死的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗引发猪体内充足的免疫反应
在这个实施例中，开发了经PLGA[聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)]纳米粒子包封的候选杀死的PRRSV疫苗(Nano-KAg)，并且经鼻内投予，并且评估经同种病毒攻击的猪体内的免疫相关性。经Nano-KAg接种疫苗的猪的结果相较于未接种疫苗并且经杀死的PRRSV疫苗抗原(K-Ag)免疫的同种病毒攻击的猪，鉴别出与增加的抗PRRSV体液和细胞介导的免疫反应相关的病毒血症的完全清除。在免疫学上，经Nano-KAg免疫的猪具有肺和血液中的病毒中和抗体和IgA反应的显著增加。经Nano-KAg接种疫苗的猪的肺裂解物和血清相较于对照猪组具有更高水平的IFN-γ和IL-12以及更低水平的免疫抑制性介体(IL-10和TGF-β)。来自经Nano-KAg接种疫苗的猪的肺、血液、BAL、TBLN和血液的单核细胞具有增加的频率的CD4+、CD8+、CD4+CD8+T细胞、γδT细胞、骨髓细胞和树突状细胞富含部分；并且相反地Foxp3+T调控细胞减少。总体来说，结果示出了经PLGA纳米粒子包封的PRRSV杀死的疫苗的鼻内递送是安全的，并且其引发在粘膜和全身部位处足以清除猪体内的病毒血症的充足的免疫反应。
材料与方法
细胞、PRRSV和聚合物
稳定的无支原体MARC-145细胞(37)用于制备疫苗和体外分析法。将细胞维持于含10％胎牛血清(Atlanta Biologicals)的DMEM(Lonza)中。病毒感染培养基是补充有2％马血清的DMEM。为了制备纳米粒子，使用PLGA 50:50(分子量40-75kDa)、聚乙烯醇(分子量30-70kDa)(Sigma-Aldrich)、二氯甲烷(Acros Organics)和BCA(二喹啉甲酸)蛋白质分析试剂盒(Pierce)。
动物
将3-4周龄的常规大白-杜洛克(Large White-Duroc)杂种断奶无特定病原体的猪圈养在FAHRP,OARDC的BSL-2设施中。确认猪群对PRRSV、猪呼吸道冠状病毒、传染性胃肠炎病毒和猪圆环病毒2呈血清阴性。确认在到达时收集的仔猪的血液样品对PRRSV抗体呈阴性。所有动物都随意接受食物和水。
制备灭活的PRRSV
用北美原型PRRSV病毒株VR2332病毒株(38)以0.01MOI(感染复数)感染MARC-145细胞单层，并且当观察到>80％的细胞病变效应时冻融三次。使所收集的受感染的细胞培养液以2000xg澄清，然后使用20％的蔗糖覆盖以100,000xg进行超速离心2小时。使汇集的粗病毒团块悬浮于无菌PBS中并且进行滴定。将团块用UV照射(254nm，持续1小时)，确认灭活，进行声波处理，使用BCA试剂盒(Pierce)估算蛋白质含量，并且储存在-70℃下。以相同的方式使用未受感染的MARC-145细胞来制备对照抗原。
制备PLGA纳米粒子
通过标准双重乳液溶剂蒸发法(40)来制备纳米粒子。简单地说，将15％的PLGA 50/50(750mg)溶解于5ml二氯甲烷中，并且添加100μl杀死的VR2332蛋白质(5mg)。使用Brinkman Polytron均化器以6000rpm将混合物均化90秒。将均化的混合物添加到60ml聚乙烯醇(10％PVA)水溶液中，并且均化5分钟。最后，在室温(RT)下搅拌制剂过夜以使溶剂蒸发。在蒸馏水中洗涤纳米粒子三次，并且将湿的纳米粒子冷冻干燥并储存在4℃下。
测定纳米粒子的尺寸、形态和蛋白质包封效率
使用扫描电子显微术(Hitachi S-3500N)来检测纳米粒子的尺寸和形态。简单地说，将经冷冻干燥的纳米粒子安放于在真空下使用离子涂布机用金铂涂布的粘附剂残根上。在10KV的显微镜下检查经涂布的样本。如先前所描述(41)来测定纳米粒子中经包封的灭活的PRRSV的量。
猪与接种
将猪(n＝12)分成四个组(每组n＝3只猪)。第I组-模拟的猪；第II组-用生理盐水接种；第III组-用杀死的VR2332抗原(K-Ag)接种；第IV组-用经纳米粒子包封的杀死的VR2332抗原(Nano-KAg)接种。每个疫苗(Nano-KAg和K-Ag)剂量是含有等价于约5×106TCID50的灭活的病毒的1mg粗病毒制剂。在免疫后(DPI)21天用PRRSV VR2332(1×106TCID50/ml，每只猪2ml)攻击第II组、第III组和第IV组，并且在攻击后(DPC或PC)15天施以无痛致死术。通过鼻内途径进行这项研究中的所有接种一次。在病毒攻击的动物之前独立地对模拟接种的猪施以无痛致死术。
收集血液和肺样品用于分析
为了评估病毒血症并且为了滴定PRRSV特异性VN抗体，在DPI0和21以及DPC 7和15时收集3到5ml血液样品，并且将血清样品等分并保持在-20℃下。制备肺匀浆用于细胞因子和病毒评估(46、12)。
分离PBMC、肺MNC、BAL、TBLN细胞
按照所描述的程序(20、21)进行PBMC、肺单核细胞(肺MNC/LMNC)和气管支气管淋巴结(TBLN)MNC的分离。使用含有EDTA(0.03％)的无菌冰冷PBS对气道进行灌洗以收集BAL细胞(49)。
病毒滴定、病毒中和测试(VNT)和同型特异性抗体分析
通过间接免疫荧光分析法(IFA)(37、48)来分析血清中和肺裂解物中的PRRSV滴度和VN抗体滴度。通过ELISA(95)来分析血清和肺裂解物中的PRRSV特异性IgA抗体。为了消除背景活性，还使用非PRRSV特异性抗原涂布的对照板，进行阻断，并且用测试样品并行地处理。从对照板扣除从实验板获得的OD值。
PRRSV特异性回忆/记忆免疫反应
如所描述(48)在不存在或存在杀死的粗PRRSV VR2332抗原(Ag)(50μg/ml)的情况下使五百万个猪PBMC、TBLN MNC和肺MNC经受离体再刺激，并且分析所收集的上清液以测量细胞因子。
细胞因子反应的分析和免疫细胞的流式细胞计数分析
通过ELISA(48)来分析血清样品、所收集的培养上清液和肺裂解物的Th1(IFN-γ和IL-12)、Th2(IL-4)、促炎性(IL-6)和免疫抑制性(IL-10和TGF-β)细胞因子。将存在于肺裂解物中的细胞因子的量转换成皮克/克肺组织。如所描述(48)通过多色免疫分析法进行流式细胞计数分析以测定不同免疫细胞的表型和频率。
统计分析
所有数据都表示为三只猪的平均值+/-SEM。使用GraphPadInStat(用于windows的软件版本5.0)，使用单因子变异数分析(ANOVA)继之以事后图基氏检验(post-hoc Tukey's test)来进行统计分析以确立实验组之间的差异。统计显著性被评定为P<0.05。
结果
表征包封灭活的PRRSV的纳米粒子
假的以及灭活的PRRSV负载的纳米粒子的尺寸在200到600nm的范围内(图1A)。基于所用的PLGA聚合物的量计算，所制备的纳米粒子的产率是82.32±3.3％。含有灭活的PRRSV的纳米粒子的形态是球形的而没有表面不连续性(图1A)。基于包封中所用的总PRRSV蛋白质的量计算，纳米粒子中灭活的PRRSV的包封效率是50-55％。
猪体内的病毒负荷和体液免疫反应
相较于两个对照猪组，经Nano-KAg接种疫苗的猪在PC 8时病毒血症减少超过1个对数并且截止DPC 15病毒血症完全清除(图1B)。
相较于两个对照猪组，经Nano-KAg接种疫苗的猪在PC 0和7时在显著更高的水平下在血清中具有始终增加的水平的VN抗体(图2A)。类似地，相较于两个对照猪组，检测到在PC 15时在接受Nano-KAg的猪的肺裂解物中显著增加的VN抗体滴度(图2B)。然而，相较于未接种疫苗的经病毒攻击的动物，经K-Ag接种疫苗和经Nano-KAg接种疫苗的猪的肺都具有显著增加的PRRSV特异性IgA滴度(图2C)。
经Nano-KAg接种疫苗的猪中分泌增加的Th1、减少的Th2和免疫抑制性细胞因子
在未接种疫苗的猪的血清中Th1细胞因子IFN-γ是不可检测的，并且其在经K-Ag免疫、病毒攻击的猪的血清中处于较低水平下。然而，在经Nano-KAg接种疫苗的猪中，相较于两个对照组，在PC 7和15时检测到显著增加的水平的IFN-γ(图3A)。类似地，经Nano-KAg免疫的猪肺在PC 15时具有比两个对照猪组显著更高水平的IFN-γ分泌(图3C)。
相较于其它实验组，在PC 0时经K-Ag接种疫苗的猪的血清中具有显著增加的TGF-β水平。未接种疫苗的经病毒攻击的猪在PC 7和PC-15时也具有血清TGF-β水平增加的趋势(图3B)。然而，经Nano-KAg接种疫苗的猪在PC 7和15时在血清中具有显著降低的TGF-β水平(图3B)。相较于未接种疫苗的猪，在PC 15时经Nano-KAg免疫和经K-Ag免疫的猪的肺中的促炎性细胞因子IL-6显著减少。此外，经Nano-KAg接种的猪中IL-6的减少显著低于经K-Ag免疫的猪(图3D)。相较于未接种疫苗的猪，在PC 15时经Nano-KAg免疫和经K-Ag免疫的猪的肺中的两种免疫抑制性细胞因子(IL-10和TGF-β)以及Th2细胞因子IL-4显著减少(图3E、F和G)。
经Nano-KAg接种疫苗的猪中增强的Th1和减少的促炎性回忆细胞因子反应
相较于未接种疫苗的经病毒攻击的猪，观测到在经Nano-KAg免疫的猪的LMNC、PBMC、BAL和TBLN中Th1细胞因子(IL-12和IFN-γ)的分泌显著增加(图4A到H)。此外，在PBMC、BAL和TBLN培养物中，经Nano-KAg接种疫苗的猪中分泌的Th1细胞因子的量显著高于接受K-Ag的猪(图4A到H)。在接受K-Ag的猪中，BAL和TBLN培养物的培养上清液中的IFN-γ以及BAL培养物中的IL-12的量显著高于未接种疫苗的经病毒攻击的猪(图4CD和G)。
相较于未接种疫苗的猪和经K-Ag免疫的猪，在经Nano-KAg免疫的猪的PBMC和LMNC中促炎性细胞因子IL-6的分泌显著更少(图4I和J)。相较于两个对照组，经Nano-KAg免疫的猪的LMNC和BAL-MNC培养物分泌显著更少量的TGF-β(图4K和L)。
不同免疫细胞的表型分析
相较于未接种疫苗的组，在经Nano-KAg免疫和经K-Ag免疫的猪的BAL-MNC中总淋巴细胞群体(CD3+)的频率显著增加(图5C)。相较于未接种疫苗的经病毒攻击的猪，检测到在经Nano-KAg免疫的猪的LMNC中CD4+、CD8+和CD4+CD8+T细胞的频率显著更高(图5F、J和N)。在接受Nano-KAg的猪的BAL-MNC中，观测到淋巴细胞亚群的类似的显著增加。另外，CD4+CD8+T细胞的增加显著高于经K-Ag接种疫苗的猪(图5K)。
相较于未接种疫苗的猪，在接受Nano-KAg和接受K-Ag的猪中，LMNC、PBMC、BAL和TBLN-MNC中的T细胞(TcR1N4+CD8+)的频率显著更高(图6ABC和D)。另外，在Nano-KAg猪的PBMC和BAL-MNC中其群体显著高于经K-Ag接种疫苗的猪(图6C)。经Nano-KAg接种疫苗的猪的PBMC和LMNC中的骨髓细胞和DC富含部分显著高于经K-Ag接种疫苗的猪(图6EFI和J)。而且，在经Nano-KAg接种疫苗和经K-Ag接种疫苗的猪的LMNC中，骨髓细胞和DC富含部分显著高于未接种疫苗的猪(图6E和I)。然而，发现BAL和TBLN中的骨髓细胞和DC富含部分没有变化(图6GH和K)。
相较于未接种疫苗的猪，在经Nano-KAg免疫的猪中，LMNC中的Tregs的频率显著更低(图6L)。然而，相较于未接种疫苗的组，在经K-Ag免疫的猪中，检测到LMNC中Tregs的频率显著更高(图6L)。相较于对照组，在经Nano-KAg免疫的猪中，PBMC中的Tregs频率显著降低(图6M)。而且，相较于经K-Ag免疫的猪，检测到在经Nano-KAg免疫的猪的TBLN中Tregs的群体显著减少(图6N)。
尽管定期使用现有的PRRSV疫苗，但疾病的预防和控制仍然是一个挑战。据报道，经活的疫苗免疫的猪群中PRRS的爆发与在相同的养殖场所中未接种疫苗的母猪中的复原病毒的分离相关联(32、96、97)。
PRRSV中和抗体保护猪对抗病毒血症、肺中的病毒复制、病毒的经胎盘扩散以及繁殖障碍(98、99)。但是，可用的杀死的PRRSV疫苗诱导可忽略的VN抗体滴度(35、36、100)。一项研究已经证实，有可能通过使用UV或二乙烯亚胺(BEI)使病毒灭活并且共同投予疫苗与有效的佐剂来引发针对杀死的PRRSV疫苗的VN抗体的增加(100)。经UV或BEI处理的疫苗的每个剂量具有1×108TCID50的经蔗糖梯度纯化的PRRSV(100)。如本文所公开，每个疫苗具有约5×106TCID50的经UV处理的PRRSV。这显示了在猪体内使用纳米粒子介导的对杀死的PRRSV疫苗进行粘膜递送的优点，其中单次减少的病毒剂量引发保护性免疫反应。
经免疫和受感染的猪中的不完全抗PRRSV免疫与低水平的IFN-γ产生相关联(77)。增强的IFN-γ反应和抗原特异性T细胞反应(CD4+和CD8+T细胞)是抗PRRSV免疫的特点(104、105)。检测到在经Nano-KAg接种疫苗的猪的肺和血液中IFN-γ水平以及CD4+和CD8+T细胞群体的显著增加。具有CD4+CD8+表型的T淋巴细胞亚群在猪体内是丰富的，并且其具有记忆、T辅助细胞和细胞溶解特性(106)。在经Nano-KAg免疫的猪中，肺和血液中的CD4+CD8+T细胞的群体显著增加。在受PRRSV的欧洲病毒株感染的猪中，据报道在感染后14天和24天在CD4+CD8+T细胞的频率与病毒血症之间存在负相关性，这指示了其在抗PRRSV免疫中的保护作用(107)。在经Nano-KAg免疫的猪的LMNC、PBMC、BAL和TBLN-MNC中的回忆细胞因子反应揭示了显著增加的Th1细胞因子(IFN-γ和IL-12)的分泌。细胞因子IL-12在针对病毒感染的宿主防御中起重要作用(108)。
在经Nano-KAg免疫的猪的肺中免疫抑制性细胞因子(IL-10和TGF-β)的显著减少与肺和血液中增强的IFN-α产生相关联。在猪中，IL-10据报道抑制T细胞产生IFN-γ(109)，并且在受PRRSV感染的猪中报道了其减少IFN-γ产生的免疫抑制功能(77、78)。在受感染的猪肺微环境中Tregs的浸润有助于高水平的IL-10和TGF-β的分泌(75)。报道了在受PRRSV感染的猪中Tregs的频率增加(48、110)；但在经Nano-KAg(而不是K-Ag)免疫的猪中，观测到LMNC、PBMC和TBLN中Tregs群体的减少。猪具有相对大的γδT细胞群体，并且其被视为在粘膜部位处重要的先天免疫细胞(111)。在受PRRSV感染的猪中，γδT细胞分泌IFN-γ(73)。在经Nano-KAg接种疫苗的猪中，肺、血液和TBLN中γδT细胞的频率增加，这指示了γδT细胞在PRRSV免疫中所起到的保护作用。
总之，纳米粒子介导的对杀死的PRRSV疫苗进行鼻内递送引发针对PRRSV的保护性全身和粘膜免疫反应，并且可以在感染后早期清除病毒血症。
实施例2：经可生物降解的纳米粒子包封的疫苗诱导针对猪体内有毒的异种呼吸道病毒感染的交叉保护性免疫反应
材料与方法
细胞、PRRSV和可生物降解的聚合物
支持PRRSV生长的稳定的无支原体MARC 145细胞(非洲绿猴肾细胞系)(37)用于制备PRRSV储备液、杀死的病毒Ag，以及用于免疫分析法。在37℃、5％CO2下，将细胞维持于含10％胎牛血清(Atlanta Biologicals)的达尔伯克最低必需培养基(DMEM，Lonza)中。对于病毒感染和滴定来说，所用的感染培养基是补充有2％马血清的DMEM。北美原型PRRSV病毒株VR2332用于制备疫苗，并且对于病毒攻击研究来说，使用抗原上高度分歧的有毒的异种PRRSV病毒株MN184(38)。为了制备纳米粒子，使用PLGA[聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)50:50，分子量40-75kDa)、聚乙烯醇(分子量30-70kDa)(Sigma-Aldrich)、二氯甲烷(Acros Organics)和BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce)。
制备PRRSV Ag
在滚瓶或T150组织培养瓶中用VR2332病毒株(38)以0.001MOI(感染复数)感染MARC-145细胞单层(>90％汇合)，并且在细胞显示大于80％的细胞病变效应(约3-4天)之后冻融三次。使所收集的受感染的细胞培养液以2000xg澄清15分钟，并且在40℃下使用20％的蔗糖覆盖以100,000xg超速离心2小时。使汇集的粗病毒团块悬浮于无菌PBS中并且进行滴定以测定病毒滴度，并且用UV照射(254nm，持续1小时)以使病毒灭活，进行声波处理(80％振幅的探针式声波处理器，30秒持续3个周期)，并且使用BCA试剂盒(Biorad)估算蛋白质含量。将粗病毒团块等分并且储存在-70℃下。类似地使用未受感染的MARC-145细胞来制备对照抗原。
制备经PLGA纳米粒子包封的杀死的PRRSV疫苗(Nano-KAg)
通过标准双重乳液溶剂蒸发技术(40、39)来制备纳米粒子。简单地说，将15％的PLGA 50/50(750mg)溶解于5ml二氯甲烷中，并且添加100μl杀死的VR2332蛋白质(5mg)。使用Brinkman Polytron均化器以6000rpm将混合物均化90秒。将均化的混合物添加到聚乙烯醇(10％PVA)的水溶液中，并且均化5分钟。最后，在室温(RT)下搅拌制剂过夜以使溶剂蒸发；并且通过以11,000xg离心在蒸馏水中洗涤纳米粒子三次，冷冻干燥并储存在4℃下。
测定纳米粒子中PRRSV蛋白质的包封效率
如先前所描述(41)来测定纳米粒子中经包封的PRRSV蛋白质的量。简单地说，将经冷冻干燥的Nano-KAg(10mg)在37℃下用0.1NNaOH处理1小时，进行涡旋，并且将所收集的上清液集中起来并分析蛋白质浓度，包括在BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,USA)中于0.1N NaOH中制备的一系列BSA标准物。
测定PLGA纳米粒子的形态
通过扫描电子显微术(Hitachi S-3500N)来测定纳米粒子的尺寸和形状。简单地说，将经冷冻干燥的纳米粒子安放于在真空下使用离子涂布机用金铂涂布的粘附剂残根上，并且在10KV的显微镜下检查。
通过共焦显微术表征Nano-KAg
加工从三只4-6周龄的健康的SPF猪收集的支气管肺泡灌洗液(BAL)以分离单核细胞(BAL-MNC)(42)。将以每毫升1×106个的浓度涂于含有经多聚-L-赖氨酸涂布的盖玻片的24孔板中的BAL-MNC在37℃下于5％CO2的孵育箱中孵育1小时。抽吸出非粘附细胞，并且将具有粘附细胞的盖玻片用PBS轻轻地洗涤并且用于研究中。使含有不同浓度的PRRSV蛋白质(0.2μg/ml)的经冷冻干燥的Nano-KAg悬浮于含有10％FBS的DMEM中，并且添加到含有BAL细胞的板中并且在37℃下孵育3小时。未受感染的或用PRRSV(MN184病毒株)以0.1MOI感染12小时的BAL-MNC包括在分析法中。将细胞在冰上于3％多聚甲醛中固定15分钟，进行渗透(0.1％Triton X-100，持续15分钟)并阻断(含有5％BSA和0.2％triton X-100的PBS，在室温下持续1小时)。随后，在室温下用含有1％BSA和0.1％triton X-100的PBS中的抗PRRSV核衣壳特异性mAb SDOW17(RuralTechnologies,Inc.)和早期核内体交叉反应性抗猪人类抗体(Santa-Cruz)处理细胞1小时。接下来用山羊抗小鼠IgG Alexa Flour488和驴抗山羊Alexa flour 633(Invitrogen)处理并且在室温下孵育1小时。在处理步骤之间洗涤细胞，并且用含有2.5％DABCO(Sigma)的封固剂处理。将使用透明指甲油染色的盖玻片安放在清洁的玻璃载片上并且在Leica共焦显微镜下观察。使用Leica共焦软件分析所撷取的图像。以每96孔1×106个浓度涂于以类似方式处理和染色的U底板中的BAL-MNC也得到可比的结果。
猪Mφ对Nano-KAg的体外吸收以及通过流式细胞计数法测定CD80/86表达
将BAL-MNC以每毫升1×106个的密度接种于24孔板中，并且未加处理或用K-Ag或Nano-KAg(含有2、0.2和0.02μg/ml的PRRSV蛋白质)处理，并且在37℃下于5％CO2的孵育箱中孵育3小时。未受感染的或在37℃下于5％CO2的孵育箱中用PRRSV(MN184病毒株)以0.1MOI感染12小时的细胞充当对照。用抗PRRSV N的mAb、接下来用山羊抗小鼠IgG Alexa Flour488处理细胞，洗涤并且在洗涤之前固定。为了评定CD80/86在专职性抗原提呈细胞(APC)上的表达，如上述在37℃下于5％CO2的孵育箱中处理BAL-MNC 16小时，洗涤并且使用生物素化的人类CTLA4-小鼠免疫球蛋白融合蛋白质(Ancell,MN)和经PE偶联的CD172(Southern Biotech)(43)、接下来用抗生蛋白链菌素percpcy5.5染色。使用1％多聚甲醛固定细胞并且使用FACS Aria II(BD Biosciences)流式细胞计数器来分析。
猪与接种
将3-4周龄的常规大白-杜洛克杂种断奶无特定病原体的猪运输到BSL-2设施(FAHRP,OARDC)中。确认猪群对针对PRRSV、猪呼吸道冠状病毒、传染性胃肠炎病毒和猪圆环病毒2的抗体呈血清阴性。确认在到达时从猪收集的血液样品对PRRSV抗体呈阴性。使猪再适应一周，其随意接受食物和水并且维持在兽医的监督下。
在攻击前研究中，将猪(n＝9)随机分成三组(每组n＝3)。第I组-用DMEM和PBS接种的模拟的猪；第II组-用K-Ag接种；第III组-用Nano-KAg接种，经鼻内接种一次。每个疫苗(Nano-KAg和K-Ag)剂量具有1mg的粗病毒制剂，其含有约5×106TCID50的灭活的病毒。在免疫后(DPI)15天对所有猪施以无痛致死术并且评估先天和PRRSV特异性免疫反应。在攻击后研究中，将猪(n＝12)随机分成四组(每组n＝3)。第I组-模拟的猪；第II组-用生理盐水接种；第III组-用K-Ag接种；第IV组-用Nano-KAg接种。如上文所描述，每个疫苗剂量具有相同量的Ag。在DPI 21时用PRRSV MN184(0.5×106TCID50/ml，每只猪2ml)攻击第II组、第III组和第IV组，并且在攻击后(DPC或PC)15天施以无痛致死术。通过鼻内途径进行所有接种一次。在处死经病毒攻击的动物之前独立地对模拟接种的猪施以无痛致死术。
(1)大体和组织学分析
对所有猪进行尸检并且在大体上和组织学上检查肺和淋巴结。如先前所描述(44)，基于个别肺叶中的实质化病变的百分比来给出宏观肺病变的估算评分。如先前所描述(44)，将从尾叶收集的肺组织样品固定于10％中性缓冲福尔马林中，加工成石蜡块，切割成切片(3μm)并且使用苏木精与伊红(hematoxylin-and-eosin；H&E)染色。如先前所描述(45)对冷冻的肺切片(3μm)进行免疫染色。简单地说，使切片脱腊，脱水，淬灭，在PBS中洗涤，使用2％山羊血清阻断，并且用PRRSV核衣壳蛋白特异性mAb(SDOW17)(Rural Technologies,Inc.)或同型对照mAb处理。用ABC过氧化酶染色试剂盒(Vectastain Elite,VectorLabs)处理切片，并且通过应用DAB(3,3'-二氨基联苯胺)底物(VectorLaboratories)使标记“可见”，并且用苏木精复染。由无偏见的经过认证的兽医病理学家检查经免疫染色的肺载片以针对PRRSV Ag的存在进行评分。
收集血液和肺样品用于分析
为了评估病毒血症以及为了滴定PRRSV特异性血清中和抗体，在DPI 0和21以及DPC 7和15时收集3到5ml血液样品。将经分离的血清等分并且保持在-20℃下。如早先所描述(46、12)制备肺匀浆用于细胞因子和病毒评估。
分离PBMC、肺MNC和TBLN细胞
为了分离PBMC，在酸柠檬酸盐葡萄糖溶液中从施以无痛致死术的猪收集血液，并且如所描述(47)进行加工。按照所描述的程序(48)从个别的猪中分离肺单核细胞(肺MNC/LMNC)。使用含有EDTA(0.03％)的无菌冰冷PBS对气道进行灌洗以收集BAL细胞(49)。在DMEM中收集气管支气管淋巴结(TBLN)、髂淋巴结(ILN)和扁桃体的样品，并且如先前所描述(48)分离MNC。
病毒滴定和病毒中和测试(VNT)
如先前所描述(37)通过间接免疫荧光分析法(IFA)来分析血清中和肺裂解物中的PRRSV滴度和病毒中和抗体滴度。简单地说，对于病毒滴定，将96孔微量滴定板中的MARC-145细胞的汇合的单层用血清的10倍稀释液处理48小时。为了测量血清和肺裂解物中的VN滴度，将样品热灭活，用UV处理，进行两倍稀释，并且在37℃下与等体积的每孔250TCID50的PRRSV(MN184)一起孵育2小时。将100微升的悬浮液转移到含有MARC-145细胞的汇合的单层的96孔板中，在37℃下于CO2孵育箱中孵育24小时。将细胞用80％丙酮固定，并且用抗PPRSV N的mAb(SDOW-17)和经Alexa-488偶联的抗小鼠IgG(H+L)染色。使用甘油-PBS将板封固，并且在荧光显微镜下检查病毒斑。
在肺和血液中的PRRSV特异性同型抗体分析
通过ELISA来分析血清和肺裂解物中PRRSV特异性IgA和IgG抗体的存在。简单地说，在4℃下于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中用预先滴定量的粗的杀死的PRRSV(MN184)Ag(10μg/ml)涂布ELISA板过夜，洗涤，并且在室温下用阻断缓冲液(PBS中的1％BSA和0.1％Tween 20)处理2小时；添加血清(1:100)和肺裂解物(0.5mg/ml，w/v)样品并且在室温下孵育2小时。使用与HRP(KPL)偶联的抗猪IgA和IgG二级抗体检测经结合的病毒特异性同型抗体。最后，使用发色团TMB使板显色并且在450nm下读取。为了消除背景活性，还包括非PRRSV特异性抗原涂布的对照板，进行阻断，并且用测试样品并行地处理。从对照板扣除从实验板获得的OD值。
PRRSV特异性回忆细胞因子反应
如先前所描述(48)在不存在或存在杀死的粗PRRSV MN184Ag(50μg/ml)的情况下使五百万个猪PBMC、TBLN MNC和肺MNC经受离体再刺激，并且分析所收集的上清液以测量细胞因子。从对应的测试值扣除由不存在PRRSV Ag的情况下培养的免疫细胞分泌的细胞因子。
细胞因子反应的分析和免疫细胞的流式细胞计数分析
通过ELISA(48)来分析血清样品、所收集的培养上清液和肺裂解物的Th1(IFN-γ和IL-12)、Th2(IL-4)、促炎性(IL-6)和免疫抑制性(IL-10和TGF-β)细胞因子。将存在于肺裂解物中的细胞因子的量标准化为皮克/克肺组织。如先前所描述(48)通过多色免疫分析法进行流式细胞计数分析以测定不同免疫细胞的表型和频率。简单地说，使用FACS Aria II(BD Biosciences)流式细胞计数器撷取经免疫染色的细胞的50,000个事件并且使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)分析。完成分析以基于下列表型来确定不同的免疫细胞群体：NK细胞富含部分(CD3-CD4-CD8+)；T辅助细胞(CD3+CD4+CD8-)；CD8+T细胞(CD3+CD4-CD8+]；T辅助/记忆细胞(CD3+CD4+CD8+)；γδT细胞(CD8+TcR1N4+)；T调控细胞(CD4+CD25+Foxp3+)；骨髓细胞(CD172+)；以及树突状细胞富含部分(CD172+CD11C+SLAII+)。
统计分析
所有数据都表示为三只猪的平均值+/-SEM。使用GraphPadInStat(软件版本5.0)，使用单因子变异数分析(ANOVA)继之以事后图基氏检验来进行统计分析以确立K-Ag与Nano-KAg猪组之间的差异。统计显著性被评定为P<0.05。
结果
包封PRRSV的纳米粒子的体外表征
通过扫描电子显微术(SEM)来测定假的以及包封PRRSV Ag的PLGA纳米粒子的形态，其揭示了粒子的尺寸为200-600nm(图7A)。纳米粒子中的平均蛋白质含量或核心负荷是0.50-0.55％(w/w)，其代表了50-55％的囊封效率。Nano-KAg再分散于PBS中之后，在最初的48小时内缓慢释放PRRSV蛋白质，之后在接下来的5周观测到逐步释放型态。
使用从三只健康的SPF猪收集的BAL-MNC来研究APC对Nano-KAg的吸收。共焦图像揭示了APC优先吸收Nano-KAg，而不是未包封的病毒Ag(K-Ag)，并且受PRRSV感染的细胞充当阳性对照(图7B)。包裹的纳米粒子将PRRSV Ag递送到早期核内体并且其可比得上受病毒感染的对照(图7C和D)。此外，如相较于经K-Ag处理的细胞，CD80/86在APC上显著增加的表达所指示，包裹Nano-KAg的APC经历了成熟(图7E)。另外，57％的经Nano-KAg处理的BAL-MNC对PRRSV蛋白质呈阳性，这可比得上受病毒感染的细胞(图7F ii和iv)。相比之下，仅9％的经K-Ag处理的BAL-MNC对病毒蛋白质呈阳性(图7F iii)。结果显示，在纳米粒子中递送的PRRSV Ag被APC吞噬并且在核内体内发现所释放的蛋白质。
包封PRRSV Ag的纳米粒子(Nano-KAg)作为候选疫苗的潜力
在攻击前研究中，Nano-KAg的鼻内递送将会诱导粘膜和全身部位处的先天免疫反应，这由NK细胞、DC和γδT细胞的频率显著增加来指示。另外，免疫的自适应臂中所涉及的免疫细胞，如Th/记忆细胞和CD8+T细胞，相较于经K-Ag免疫的猪在Nano-KAg的肺中显著增加(图8A-E)。类似地，经Nano-KAg接种疫苗的猪的PBMC显示了γδT细胞和DC的频率显著增加(图8H和I)。令人感兴趣的是，经K-Ag接种疫苗的猪的肺中NK细胞和Th/记忆细胞的频率下降(图8A和D)。此外，来自经Nano-KAg免疫的猪的肺MNC和PBMC分泌显著降低的水平的细胞因子IL-10，并且在回忆反应中分泌更高量的IL-6(图8F、G、J)。另外，在经Nano-KAg而不是K-Ag免疫的猪中分泌先天细胞因子IFN-α(图8K)。
经Nano-KAg接种疫苗的猪中肺病变和病毒负荷的显著减少
最初，在猪体内使用每只猪0.2和1mg的剂量(约1×106和5×106TCID50的灭活的病毒)进行针对Nano-KAg候选疫苗的剂量依赖性反应，并且在1mg的剂量下检测到明显的免疫反应。因此，以每只猪1mg的剂量进行所有后续试验。在攻击后研究中，经Nano-KAg免疫的、经MN184攻击的猪在临床上是健康的，没有发热或呼吸窘迫。相比之下，K-Ag和未接种疫苗的、经MN184病毒攻击的猪在攻击后的第一周期间有发热，伴有采食量减少。在尸检期间，相较于另两个经病毒攻击的组，在经Nano-KAg免疫的组中观测到显著减少的大体肺损伤(图9C)。未接种疫苗和经K-Ag接种疫苗的、经MN184攻击的猪的经H&E染色的肺切片的显微镜检查显示有严重的肺损伤，伴有单核细胞的大规模浸润和大的受感染区域。相比之下，在经Nano-KAg免疫的、经病毒攻击的猪中观测到显著减少的肺损伤(图9A)。
免疫组织化学分析已经揭示了相较于Nano-KAg猪组，未接种疫苗和经K-Ag免疫的、经MN184病毒攻击的猪的肺切片中大量的灭活的PRRSV阳性细胞(图10B和D)。血清样品和肺匀浆中的PRRSV病毒滴度已经指示了相较于经K-Ag接种疫苗和未接种疫苗的猪，在经Nano-KAg接种疫苗的猪中，在攻击后(DPC或PC)7天病毒负荷减少超过1个对数并且截止DPC 15病毒完全清除(图9E)。经K-Ag接种疫苗的猪也比未接种疫苗的猪更好地清除病毒血症(图9E)。类似地，相较于经K-Ag免疫的、经MN184病毒攻击的猪，在Nano-KAg中也减少了肺中的PRRSV负荷(图9F)。而且，相较于对照猪，在经Nano-KAg免疫的猪中血清和肺匀浆中的PRRSV滴度值(TCID50/ml)显示出降低。
血清、肺和鼻拭子中的体液免疫反应
相较于未接种疫苗或经K-Ag免疫的、经MN184攻击的猪，经Nano-KAg免疫的猪的肺匀浆含有显著更高的水平的经分泌的病毒特异性IgA和IgG抗体(图10A和B)。相较于未接种疫苗或经K-Ag免疫的、经MN184攻击的猪，检测到在经Nano-KAg免疫的猪的血清样品中在PC 0时IgA抗体水平增加，并且在PC 15时显著增加(图10D)。在DPC 15时，相较于经K-Ag免疫的猪，在经Nano-KAg免疫的猪中，血清中的PRRSV特异性IgG抗体水平(图10E)以及鼻拭子中的IgA和IgG水平(图10G和H)显著更高。尽管在DPC 15时检测到肺和血清中增加的PRRSV特异性中和抗体(VN)滴度，但数据不是统计显著的(图10C和F)。
基于纳米粒子的PRRSV疫苗显示出在猪体内增强的先天免疫反应
接受Nano-KAg疫苗的、经MN184病毒攻击的猪的肺中具有显著增加的先天IFN-α产生(图11A)。相较于模拟的猪，在经K-Ag免疫、经病毒攻击的猪中检测到NK细胞频率下降四倍；相比之下，在经Nano-KAg疫苗接种的猪中NK细胞群体可比得上模拟的猪(图11B)。此外，在未接种疫苗和经K-Ag免疫的、经MN184病毒攻击的猪中完全抑制肺NK细胞的细胞毒性功能；然而，在接受Nano-KAg的猪中部分降低(图11C)。相较于K-Ag和未接种疫苗的、经病毒攻击的猪，在经Nano-KAg接种疫苗的动物的肺中γδT细胞和CD4+(而不是CD8+)T细胞的频率显著增加(图11DE和F)。观测到在经Nano-KAg免疫的猪的周边血液中DC的频率显著增加，以及在TBLN中DC和γδT细胞的频率显著增加(表1)。
表1示出了未接种疫苗或用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次并用PRRSV病毒株MN184攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术的猪。通过流式细胞计数法来计算存在于PBMC和TBLN MNC中的不同免疫细胞亚群。a门控CD172+细胞以计算CD11c和SLAII表达，并且示出了DC富含部分(CD172+CD11c+SLAII+)的百分比。b门控CD3-细胞以计算CD4和CD8α表达，并且示出了NK细胞富含部分(CD3-CD4-CD8α+)的百分比。c门控CD25+细胞以计算CD4和Foxp3表达，并且示出了CD4+CD25+Foxp3+细胞的百分比。每个数值是来自三只猪的平均百分比+/-SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异(p<0.05)。
表1.经Nano-KAg接种疫苗的猪的PBMC和TBLN中免疫细胞的频率
用Nano-KAg抑制免疫抑制性细胞因子但加强IFN-γ反应
经Nano-KAg疫苗免疫的猪显示了在肺中显著减少的Treg群体，这可比得上模拟的猪(图12A)。相比之下，未接种疫苗和经K-Ag免疫的、经MN184病毒攻击的猪相较于Nano-KAg组具有更高水平的Treg细胞(图12A)。在经Nano-KAg接种疫苗的猪中强有力地抑制了免疫抑制性细胞因子反应，这由肺匀浆中显著降低的水平的IL-10和TGF-β来指示；而且，相较于未接种疫苗和经K-Ag免疫的、经病毒攻击的猪，在经Nano-KAg接种疫苗的猪中观测到肺MNC的回忆反应中其分泌的增加(图12B、C、E和F)。相比之下，相较于对照猪，在经Nano-KAg接种疫苗的猪中检测到肺匀浆中显著增加的IFN-γ以及其在肺MNC的回忆反应中的分泌(图12D和G)。
相较于未接种疫苗和经K-Ag免疫的、经MN184攻击的猪，经Nano-KAg免疫的猪的经培养的、经再刺激的免疫细胞分泌显著减少的IL-10(PBMC和TBLN-MNC)和TGF-β(PBMC)以及增加的IFN-γ分泌(PBMC和TBLN-MNC)(图13A、B、C、E和F)。相较于经K-Ag免疫的、经病毒攻击的猪，在Nano-KAg中的PBMC和TBLN-MNC中显著降低了回忆反应中促炎性细胞因子IL-6的水平(图13D和G)。
如本文所公开，观测到肺APC对Nano-KAg疫苗的快速吸收，接下来病毒Ag易位到核内体区室中，并且活化标志物CD80/86在APC上的表达增加。这些资料显示，病毒特异性自适应免疫反应可以在猪的呼吸道中使用基于PLGA纳米粒子的杀死的PRRSV疫苗来引发。从健康的小鼠、人类和猪收集的BAL液的分类细胞计数已经指示出超过90％的细胞是肺泡巨噬细胞(62；63；64)，这显示了经鼻内递送的Nano-KAg被充当肺中的主要APC的肺泡巨噬细胞吞噬。
本文所公开的攻击前研究已经证实了经鼻内递送的候选Nano-KAg疫苗显著增加CD8+T细胞、Th/记忆细胞的频率的能力，伴有先天的(IFN-β)、促炎性(IL-6)和Th1(IFN-γ)细胞因子的分泌增加。
使用有毒的异种PRRSV的攻击后研究已经证实了Nano-KAg疫苗诱导猪体内更好的交叉保护性免疫的能力。在免疫学上，PRRSV通过阻碍IFN-α产生来调节猪的先天免疫功能，减少NK细胞群体和其细胞毒性功能，这导致了弱的/延迟的自适应免疫反应(28、57)。然而，用Nano-KAg经鼻内接种疫苗的猪阻止了大多数病毒诱导的免疫抑制性机制，伴有先天性和病毒特异性自适应免疫反应的加强。γδT细胞是粘膜部位处重要的先天免疫细胞，并且其具有非MHC I类细胞溶解活性。在经Nano-KAg免疫的猪中，在粘膜和全身部位处都检测到除了NK细胞、CD4+和CD8+T细胞之外的γδT细胞的群体增加，以及IFN-γ的分泌增加。
受PRRSV感染的猪可能由于Tregs的群体和免疫调控性细胞因子IL-10和TGF-β的分泌增加(28、75)以及猪体内IFN-γ产生的抑制(77、109、78)而受免疫抑制。相较于未接种疫苗和经K-Ag接种疫苗的、经病毒攻击的猪，经Nano-KAg免疫的猪肺、TBLN和血液具有显著减少的Tregs，这与减少的IL-10和TGF-β以及增加的IFN-γ分泌相关联。在攻击前研究中，经Nano-KAg免疫的猪中促炎性细胞因子IL-6的分泌增加似乎涉及到其自适应免疫反应的起始，并且其在经免疫的攻击后的猪中的产生减少与减轻的炎性肺病变相关联。
在经Nano-KAg免疫的猪中，观测到肺、血液和洗鼻液中增加的水平的PRRSV特异性IgA、IgG和VN抗体滴度。粘膜免疫可以诱导在远端组织处产生IgA抗体和效应反应(21)。IgA抗体针对多种病毒感染有保护性并且其在粘膜表面和血液处都具有显著的病毒中和活性(50-53)。
对于养猪人和研究人员来说的一个重要发现是经Nano-KAg疫苗免疫的猪在两周内清除了有毒的异种PRRSV的病毒血症。经Nano-KAg免疫的猪中的微观肺研究与保护性免疫相关性和肺中降低的病毒负荷相关联。
实施例3：基于纳米粒子的加佐剂的灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗引发猪体内优良的交叉保护性免疫
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)对美国猪肉行业中6.64亿美元的直接年损失负责(8)。致病物PRRS病毒(PRRSV)是属于动脉炎病毒科的包膜正链RNA病毒。存在两种已知的PRRSV基因型，欧洲(I型)和北美(II型)，其基因型之间和内部的基因和抗原多样性有变化，这表示PRRSV的极端诱变性质(38)。
大约最近的20年来，改性活的(PRRS-MLV)和灭活的PRRSV疫苗已经投入使用，但PRRS的控制仍然并不成功。此外，PRRS-MLV已经牵涉到突变的疫苗病毒传播给易受感染的猪(32)。可用的灭活的疫苗是安全的，但具有较差免疫原性(117)。因此，有充分理由来开发有效的灭活的PRRSV疫苗。PRRSV主要通过呼吸道和生殖器粘膜感染猪，并且其主要目标是巨噬细胞(118)。疫苗的鼻内递送是非侵入性的，并且具有不仅在呼吸道，而且在生殖道和全身刺激保护性免疫反应的能力(119)。PRRSV的UV照射或BEI灭活保留了功能性免疫原性表位(100)。有效的诱导Th1反应的佐剂在亚单位/灭活的疫苗中是必需的(120)。最近，鉴别了结核分枝杆菌全细胞裂解物(WCL)对PRRS-MLV的有效辅助性(28)。
基于可生物降解的PLGA(聚丙交酯-共-乙交酯)的微米/纳米粒子广泛用于药物和疫苗的靶向/持续递送(121)。PLGA是FDA和欧洲药品管理局(European Medicines Agency；EMEA)批准的试剂(92)。经鼻内递送的颗粒性抗原由鼻淋巴组织的M细胞采样，继而递送到呼吸道中下伏的专职性抗原提呈细胞(APC)(122)。最近已经显示，经鼻内递送给猪的单次剂量的基于PLGA纳米粒子(NP)的灭活的PRRSV(NP-KAg)疫苗引发免疫反应，伴有实质性的病毒清除(123)。NP-KAg疫苗与经纳米粒子包封/未包封的结核分枝杆菌WCL经鼻内共同投予两次可以引发猪体内稳固的抗PRRSV交叉保护性免疫，伴有完全病毒清除。这些结果证实，与未包封的结核分枝杆菌WCL共同投予的NP-KAg疫苗从肺和全身完全清除了感染性异种PRRSV。
材料与方法
试剂
MARC 145细胞(14)用于制备PRRSV储备液和分析法。将细胞维持于含10％FBS的DMEM中。对于病毒感染来说，使用含2％马血清的DMEM。北美原型PRRSV病毒株VR2332(15)以及PRRSVMN184(15)用于疫苗制备。如先前所描述(21)来制备结核分枝杆菌全细胞裂解物(结核分枝杆菌WCL)。
制备疫苗抗原和基于PLGA纳米粒子的疫苗配方
如先前所描述使PRRSV病毒株VR2332(38)抗原生长并且用UV杀死(KAg)以用于疫苗中(123)。如所描述(123、41)通过双重乳液法(w/o/w)来制备包封有KAg(NP-KAg)或结核分枝杆菌WCL(NP-结核分枝杆菌WCL)的PLGA NP。
测定蛋白质包封效率和表征NP-KAg
如所描述(123)来估算NP中经包封的蛋白质。使用20kV、30,000x放大率的Philips XL30-FEG扫描电子显微镜(SEM)来观测Nano-KAg的形态。使用NICOMP 370粒度分析仪(Particle Sizing Systems,CA)来测量假的或包封KAg的NP的粒度分布。用ZetaPALS(BrookhavenInstruments Corp.,NY)测定NP的ζ电势。
测定从NP-KAg疫苗的体外蛋白质释放
如先前所描述(124)来进行分析法。简单地说，使50mg NP-KAg悬浮于1ml PBS中，并且立即收集上清液以估算突发释放。使NP-KAg的团块反复再悬浮于1ml PBS中，并且在第1、5、10、15、20、25和30天收集上清液并储存在-20℃下。第30天，使未降解的NP裂解以回收蛋白质，并且通过BCA方法来估算所有样品的蛋白质浓度。
PAM细胞对Nano-KAg的体外吸收
使含有2μg PRRSV KAg的Nano-KAg疫苗悬浮于1ml RPMI中，并且与PAM细胞(3D4/2，ATCC)一起孵育0、5、20、30分钟、3、12和24小时。包括用PRRSV VR2332病毒株(MOI＝1)感染24小时的KAg(2μg)、假的NP以及细胞作为对照。洗涤细胞并用丙酮固定，并且与PRRSV N的mAb SDOW17(Rural Technologies,Inc.,SD)、接下来与抗小鼠IgG(H+L)Alexa-488(Life Technologies,Grand Island,NY)一起孵育，并且在倒置荧光显微镜下观测。
猪与接种
从对PRRSV、PRCV、TGV和PCV2抗体呈血清阴性的猪群获得常规大白-杜洛克杂种无特定病原体断奶(3-4周)的仔猪。将总共30只猪随机分到10个组中的一组中(3只猪/组)，并且以两周的时间间隔接种指定的疫苗配方(2ml)(表2)。除了第1组的猪以外，所有其它组都在接种疫苗后28天用有毒的异种北美PRRSV(II型)病毒株MN184(5×105TCID50/猪)攻击(38)。佐剂和疫苗在经鼻内投予之前被独立地包封并组合起来。早先测试佐剂和NP-KAg的剂量(123、95)。在攻击后(PC)15天对猪施以无痛致死术。按照俄亥俄州立大学(TheOhio state University)的机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and use Committee)批准的方案，将动物随意用食物和水来维持，收集样品并且施以无痛致死术。
表2示出了将总共30只猪(N＝30)分成十组，每组有三只猪(n＝3)。第1组和第2组分别充当模拟的和模拟接种疫苗-经攻击的。其它8个组分成如上文所详述的100或500μg/猪的疫苗剂量的两个剂量类别。对于统计比较来说，在两个类别下考虑第1组和第2组。
表2.实验中所用的猪组
收集血液和肺样品用于分析
在121攻击/感染后6到15天检测血液、淋巴组织和肺中的最大PRRSV负荷(125)。因此，在接种疫苗当天以及PC 0、6、10和15时收集肝素化血液样品(3-5ml)，并且将血浆等分并保存在-70℃下。每天监测猪的呼吸道疾病和直肠温度，并且每周记录体重两次。
制备肺匀浆以及从肺和血液中分离MNC
如所描述(19)来制备肺匀浆。用含有抗生素的冷PBS对肺进行灌洗，并且将支气管肺泡灌洗(BAL)液回收、澄清、等分并储存在-70℃下。在ACD溶液中收集血液并分离周边血液单核细胞(PBMC)(20)，并且从肺组织样品中分离肺MNC(LMNC)(52)。
分析PRRSV特异性抗体
如先前所描述(53)来进行分析法。简单地说，在碳酸盐缓冲液中用预先滴定的MN184Ag或用PRRSV重组N、M或GP5蛋白质涂布ELISA板。对于血浆来说，30个PRRSV阴性样品的10倍稀释液的平均OD值加上2倍标准偏差(SD)被视为阳性-阴性截止。具有高于截止OD的OD值的血浆样品的最高稀释度的倒数被视为终末滴度。如所描述(54)来分析肺和血浆样品中的PRRSV特异性IgG1和IgG2抗体。
PRRSV特异性IFN-γ分泌细胞(ISC)和细胞因子估算
如所描述(55)来进行ELISPOT分析法以分析ISC。在回忆细胞因子反应中，如所描述(56)通过ELISA来分析从使用杀死的MN184Ag再刺激的PBMC培养物收集的上清液的IL-4、IL-6和IL-10。通过ELISA(21)来分析肺匀浆的IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-10和TGF-β。
肺和血液中的PRRSV特异性抗体的亲合力
如所描述(57)并略加修改来进行分析法。简单地说，向经PRRSVAg涂布的板中添加测试样品1:100稀释的血浆、1:10肺匀浆或未经稀释的BAL液并培育；随后，添加连续两倍稀释的NH4CN(5M到0.313M)。未经NH4CN处理(0M)的孔中测试样品的OD值被视为100％，并且计算经NH4CN处理的孔中测试样品的OD值以揭示保留Ag-Ab复合物的百分比，用百分比表示。
肺组织的苏木精与伊红染色
将从右前叶收集的肺组织样品固定在10％中性缓冲福尔马林中并且加工成石蜡块。切割5微米切片，并且如先前所描述(58)进行苏木精与伊红(H&E)染色。
病毒滴定和病毒中和分析法
通过间接免疫荧光分析法(37、48)来分析肺匀浆和血浆样品中的PRRSV滴度和病毒中和抗体(VN)滴度。对于VN分析法来说，将连续稀释的样品与PRRSV的128个病毒株中的一者一起孵育，即，MN184(250TCID50)、PRRSV 1-4-4(入藏号10-16734)(126)(100TCID50)或SD03-15(21)(200TCID50)。测定每克肺组织或每毫升血浆中的PRRS病毒滴度，以及病毒特异性VN滴度。
测定PRRSV RNA
如所描述(128)通过定量实时PCR来检测肺匀浆(每克肺组织)和BAL液(每毫升)中的病毒RNA拷贝数。
统计分析
数据表示为三只猪的平均值±SEM。使用GraphPad Instat3软件，通过单因子ANOVA继之以图基氏t检验(Tukey's t-test)来进行统计分析。在下面所提及的不同处理组之间进行比较，并且p<0.05被视为统计显著性(字母a到j)。
a→第2组对比第3组，b→第2组对比第4组，c→第2组对比第5组
d→第2组对比第6组，e→第3组对比第4组，f→第3组对比第5组
g→第3组对比第6组，h→第4组对比第5组，i→第4组对比第6组，以及
j→第5组对比第6组
结果
NP-KAg疫苗被猪肺泡巨噬细胞(PAM)快速内吞以及经包封的Ag经过几周持续释放
NP介导的药物或疫苗递送的效力取决于其负载容量和尺寸(129)。NP中杀死的PRRSV(KAg)和结核分枝杆菌WCL的包封效率为约50-60％。假的或包封的NP粒子是具有光滑表面的圆形(图24A)。NP的动态光散射(DLS)测量其基于直径的分布，并且假的、NP-KAg和151NP-结核分枝杆菌WCL的平均直径±SD分别为480±53、520±41和650±98nm。此外，85％的假的NP、92％的NP-结核分枝杆菌WCL和78％的NP-KAg在400-700nm的尺寸范围内。令人感兴趣的是，如通过ζ电势所测量，在所有三种NP之间关于表面静电势(-26mV)不存在差异，这指示了经包封的蛋白质的差异表面电荷不影响最终形成的NP的净静电势。
经纳米粒子包封的灭活的PRRSV(NP-KAg)的体外蛋白质释放型态
纳米粒子中的表面相关蛋白质相当于在时间零点(即，在PBS中复原之后立即)释放的蛋白质的量，称为突发释放(130)；并且其在NP-KAg疫苗中为9.5％。在复原之后最初的24小时期间的释放为30.5％(图24B)，并且在30天后释放61％的经包封的蛋白质(图24B)。在未裂解的NP中回收剩余39％的病毒Ag。甚至储存在-20℃下一年的NP-KAg仍具有13.6％的突发释放，并且截止30天释放76％的抗原，这指示了PLGA NP保留经包封的疫苗超过一年并且使其在正常生理条件下经过几周的时段持续释放(图24B)。因此，结果指示，如所预期，PLGA纳米粒子可以经过一段很长的时间有效地保留并允许持续释放经包封的PRRSV Ag。
PAM细胞对NP-KAg疫苗的体外吸收
PRRSV是宿主特异性的，只感染猪并且这种病毒感染肺泡巨噬细胞(PAM)。用疫苗制剂处理PAM细胞揭示了未包封的KAg经过24小时很少被吸收(图24Ci)。相比之下，NP-KAg早在5分钟时就被快速吸收并且截止30分钟达到峰值，接下来在处理后3小时之后荧光信号逐渐下降(图24Cii)；这可能是由于Ag的降解。经对照假的纳米粒子处理和未经处理的PAM细胞没有显示任何荧光信号(图24Ciii和Civ)，而受PRRSV感染的细胞具有病毒特异性绿色信号(图24Cv)。
在经加佐剂的NP-KAg免疫的猪中气道表面中的PRRSV特异性IgA以及肺实质中的IgA和IgG的产生增加
相较于其它测试组，在PC 15时(在100和500μg疫苗剂量下)第6组的猪的BAL液和肺匀浆中的PRRSV特异性IgA反应显著更高(图25A和C)。相比之下，在所有疫苗试验组的BAL液中检测到可比水平的病毒特异性IgG(图25B)。在肺匀浆中，在猪组4和6中观测到显著更高水平的病毒特异性IgG(图25D)。结果指示，在经加佐剂的NP-KAg接种疫苗的猪中，病毒特异性IgA是肺泡表面中的主要抗体同型，而IgA和IgG是肺实质中的主要抗体同型。在第6组的猪的血浆中(两种疫苗剂量)，相较于第2组的猪，从PC 0到15的IgG反应显著更高(图25E和F)。总体来说，在经NP-KAg+结核分枝杆菌WCL接种疫苗的猪中产生显著增加的水平的PRRSV特异性抗体。此外，评估针对重组结构蛋白质的PRRSV特异性IgG反应，并且发现可比水平的针对病毒表面糖蛋白GP5和M蛋白质的IgG滴度(图30A、B、C和D)。而在第6组的猪中PRRSV核衣壳(N)蛋白质特异性IgG抗体显著很高(图30E和F)。这些结果指示，NP-KAg+结核分枝杆菌WCL诱导很强的体液免疫反应。
由加佐剂的NP-KAg引发的广泛交叉保护性PRRSV中和反应
中和抗体在PRRSV感染的清除中起重要作用(131)。相较于其它组，在第6组的猪中，肺中针对MN184病毒株的病毒中和(VN)滴度显著更高，其中接受100和500μg疫苗剂量的猪中的平均滴度分别为16和27(图26A和B)。相较于其它组，第6组的猪的血浆(在两种疫苗剂量下)具有显著更高的VN滴度(图26C和D)。相较于100μg疫苗剂量，在第6组的猪中500μg剂量引发血浆VN滴度的稳定增加(图26D)。分别相较于第5组和第3组，针对另外的抗原上分歧的II型PRRSV病毒株1-4-4和I型PRRSV病毒株SD03-15(这两种病毒株与VR2332和MN184病毒株在遗传上高度分歧)，在第6组的猪的肺匀浆中(只有在500μg剂量下)检测到显著增加的VN滴度(图26F和H)。而针对PRRSV 1-4-4和SD03-15病毒株的VN滴度在血浆中直到PC 10为止保持不可检测；并且只有在第6组的猪中(500μg剂量)，在PC 15时检测到针对SD03-15的VN滴度为8。这些结果指示，加佐剂的NP-KAg可以引发交叉反应性VN反应。
经加佐剂的NP-KAg接种的猪中下调的免疫抑制性和增强(以及平衡)的Th1-Th2细胞因子反应
相较于第3组、第4组和第5组，第6组的猪(两种疫苗剂量)在肺单核细胞(LMNC)中具有显著增加的干扰素-γ分泌细胞(ISC)(图27A和33A)。在500μg剂量类别中相较于第4组和第5组(图27B)，并且在100μg剂量类别中仅相较于第5组(图33B)，在第6组的猪中在PC 15时肺匀浆中的IFN-γ产生显著增加。在第4组和第2206组的猪中(500μg剂量)，另一个重要的Th1细胞因子IL-12的产生显著增加(图27D)。相较于第2组，在所有疫苗试验组中，肺中促炎性细胞因子IL-6的产生显著减少(图27C和33C)。细胞因子TGF-β和IL-10在性质上被视为免疫调控性和免疫抑制性的。相较于第2组，在第6组的猪的肺中TGF-β的产生显著减少(图27E和33E)，并且在PC 15时在所有测试组中IL-10的水平是可比的(图27F和33F)。相较于第2组(500μg剂量)，由第6组的猪的经再刺激的PBMC分泌的IL-6显著减少(图27H)。令人感兴趣的是，在两种疫苗剂量类别中，相较于第2组和第3组，在第6组的猪中在回忆反应中由PBMC分泌的IL-10显著减少(图27I和33I)。细胞因子IL-4是Th2反应的重要指示物，并且相较于接受500μg剂量的疫苗的所有其它组，在第6组的猪中观测到由经再刺激的PBMC分泌的IL-4显著增加(图27G)。这些资料明显地指示，加佐剂的NP-KAg诱导增加的Th1和Th2以及减少的免疫抑制性细胞因子产生，这与平衡的Th1-Th2抗体同种亚型的产生相关联(图32A和B)。
经加佐剂的NP-KAg免疫的猪中IFN-γ分泌淋巴细胞和APC的频率增加
对LMNC和PBMC进行免疫染色并且分析淋巴细胞和骨髓细胞以及IFN-γ+细胞。第6组的猪显示出在LMNC和PBMC中总的IFN-γ产生细胞的显著更高的群体(图28A和J以及34A和J)。猪组3、4和6(500μg剂量)在LMNC中具有显著增加的经活化的CD4细胞(CD4+CD8-CD25+241)(表3，B)，但只有在第6组的猪中LMNC和PBMC中的IFN-γ+CD4+细胞显著增加(图28B和K)。在第6组的猪中LMNC和PBMC中的IFN-γ+CD8+细胞显著增加(图28C和L)。在肺中，在第6组的猪中IFN-γ+CD4+CD8+细胞显著高于所有其它测试组(图28D)，并且相较于第3组和第5组在PBMC中的IFN-γ+CD4+CD8+细胞显著更高(图28M)。相较于其它组，在第6组的猪中检测到第6组的猪中经活化的γδT细胞的频率增加(表3，A和B)。在LMNC和PBMC中，检测到第6组的猪中显著增加的IFN-γ+γδT细胞群体(图28E和N)。尽管NK(CD56+)细胞频率没有显著差异(图28F和O)，但相较于其它测试组，在第6组的猪中检测到IFN-γ+250NK细胞频率的显著增加(图28G和P)。关于LMNC中的骨髓细胞，相较于第5组，检测到第6组的猪中显著增加的SLAII+巨噬细胞(MΦ)(CD172+CD163+SLAII+)(图28H)，但在PBMC中没有检测到(图28Q)。另外，相较于第5组在LMNC中(图28I)，并且相较于所有其它测试组在PBMC中(图28R)，第6组的猪中的树突状细胞(DC)富含群体(CD172+CD11c+SLAII+)显著更高。观测到在接受100μg/猪的剂量的第6组的猪中淋巴细胞和骨髓细胞的频率的类似趋势(但在一些组中并不显著)(图34和表3，A)。
表3示出了在无痛致死当天存在于用指定的疫苗与佐剂的组合接种疫苗或未接种疫苗并且用PRRSV MN184攻击的猪的LMNC(A)和PBMC(B)中的指定经活化的(CD25+)淋巴细胞亚群的频率。每个数值是来自三只猪的指定免疫细胞的平均频率±SEM。小写字母指示了如材料与方法中所描述的两个指定猪组之间的统计显著(p<0.05)差异。
表3.经活化的淋巴细胞亚群的群体
经加佐剂的NP-KAg接种疫苗的猪中的肺病变减少、复制PRRSV完全清除以及病毒RNA负荷降低
为了评定疫苗组合的功效，在经异种病毒攻击的猪的BAL液、肺实质和血液中估算病毒清除。相较于第2组的动物，在第4组和第6组的猪(100μg剂量)的BAL液中复制病毒滴度降低，但可比得上其它接种疫苗组。然而，相较于第2组的猪，在第6组的猪的肺匀浆中病毒滴度显著降低(图29A和E)。在猪组4和6中(500μg剂量)，复制266病毒在BAL液中缺乏(图29B)；但其只有在第6组的猪的肺(肺匀浆)中完全清除(图29E和F)。此外，在第4组和第6组中(100μg剂量)，BAL液和肺匀浆中的病毒RNA拷贝数减少(图29C和G)。而在500μg疫苗剂量下的相同组中，相较于第2组的猪，检测到病毒RNA负荷的显著降低(图29D和H)。资料指示，加佐剂的500μg的NP-KAg疫苗剂量对于来自猪肺和来自循环的复制攻击的异种PRRSV的总体清除是有效的。相较于第2组和第3组，在PC 10时，在猪组4、5和6(100μg剂量)的血液中检测到显著降低的PRRSV滴度(图29I)。此外，在第6组的猪中(500μg剂量)，在所有测试的PC时，复制PRRSV在经病毒攻击的猪的血液中完全缺乏(图29J)。
在第2组和第3组的猪中，经H&E染色的肺切片的显微镜检查揭示了严重的肺损伤，伴有单核细胞的大规模浸润与围管现象(perivascular cuffing)。相比之下，相较于所有其它组，观测到接受加佐剂的500μg的NP-KAg疫苗剂量的猪的炎性细胞浸润显著减少(图29K)。
加佐剂的NP-KAg诱导高亲合力PRRSV特异性抗体
异质多克隆抗体对同源抗原的结合强度被定义为亲合力(151)。相较于其它测试组，在PC 15时，检测到在第6组的猪中PRRSV特异性肺IgA和血浆IgG的亲合力增加(图31)。具体地说，相较于其它测试组，检测到在第6组的猪中的BAL和肺匀浆中显著更高的IgA亲合力(图31A、B和C)。类似地，相较于其它测试组，在第6组的猪的肺匀浆中观测到可比地增加的IgG亲合力。令人惊讶地，在猪组4和6中，血浆中的IgG亲合力很高并且是可比的(图31E和F)。然而，在PC 0和6时，在所有测试组之间的血浆中的IgG亲合力没有差异。总体来说，这些资料指示，在经加佐剂的NP-KAg接种疫苗的猪中的肺和血液中高亲合力PRRSV特异性抗体的产生增加。
加佐剂的NP-KAg诱导指示IgG同型的平衡的Th1和Th2反应
典型地，杀死的疫苗主要引发Th2反应，但基于NP的疫苗驱动Th1-Th2平衡的或Th1偏向的反应(138)。因此，定量PRRSV特异性IgG同种亚型，并且在猪中更高的IgG1和IgG2水平分别指示Th2和Th1偏向的反应(149)。在猪组2到5中的血浆(PC 0)和肺匀浆(PC 15)中PRRSV特异性IgG1和IgG2的水平很低并且是可比的，但相较于其它组，在第6组的猪(500μg疫苗剂量)的血浆(PC 15)中其水平显著更高(图32A)。为了评定Th2或Th1偏向的反应，评定IgG1/IgG2的比率，其中>1或<1的比率分别指示Th2或Th1偏向的反应。在第6组的猪中，在PC 15时，在血浆和肺匀浆中检测到平衡的反应(比率接近于1)，而第3组和第4组的猪具有Th2偏向的抗体反应(图32B)。在接受100μg疫苗剂量的猪中观测到类似的趋势(图32A和B)。资料指示，加佐剂的NP-KAg引发Th1-Th2平衡的反应。
讨论
PLGA纳米粒子具有介导活化、成熟和由APC进行抗原提呈的能力(132)。其有助于疫苗Ag的持续释放并且介导稳固的B和T细胞反应的诱导(133)。PLGA(75:25)用于包封UV灭活的PRRSV(VR2332)Ag，并且来自包封的纳米粒子的体外蛋白质释放型态与其它研究一致(134)。NP的尺寸和表面特征在其调理作用和清除动力学中起重要作用(135)。NP-KAg的直径是400-700nm，这对于由粘膜M细胞和APC吸收是理想的(136)。相较于较早的研究对NP-KAg制剂作出少许改变(123)，旨在增强疫苗的免疫原性。将NP-KAg制成亲水的(用Polaxamer 188)以有助于由APC容易地吸收(41)，蔗糖用作稳定剂并且Mg(OH)2用来缓冲在PLGA水解期间产生的酸性pH(137)。经鼻内递送的这种经修饰的NP疫苗引发增强和延长的IgG和IgA产生(138)。
与有效的佐剂共同投予的PLGA疫苗引发保护性免疫反应(119)。佐剂结核分枝杆菌WCL经证实加强PRRS-MLV的功效(28)，而且单次剂量的NP-KAg引发猪体内部分交叉保护性免疫(123)。为了进一步加强NP-KAg的功效，将疫苗与包封/未包封的结核分枝杆菌WCL共同投予，并且评估在经异种PRRSV(MN184)攻击的猪中保护的各种免疫相关性。结果指示，未包封的结核分枝杆菌WCL显著加强NP-KAg疫苗的免疫原性(第6组的猪)，如由以下免疫相关性来指示：(i)增加的PRRSV特异性IgG和IgA滴度与增强的抗体亲合力；(ii)平衡的Th1和Th2反应与增加的VN滴度；(iii)增加的Th1(IL-12和IFN-γ)和Th2(IL-4)细胞因子分泌与增加的频率的ISC和IFN-γ产生CD4+、CD8+、CD4+CD8+T细胞、γδ+305T细胞和NK细胞，以及扩展的频率的APC；(iv)减少的免疫抑制性细胞因子(IL-10和TGF-β)产生，以及重要地(v)复制攻击的病毒从肺和血液中的完全清除。
PRRSV主要感染间质和肺泡Mφ(118)，并且超过90％的BAL细胞是Mφ(62)，而肺MNC富含于间质Mφ和淋巴细胞中。CD11c+APC存在于BAL液和肺实质中，但其在抗原提呈潜力方面不同，前者只活化抗原致敏的T细胞并且后者活化天然的和抗原致敏的T细胞(139)。因此，分析BAL液、肺匀浆和肺MNC中的反应。
在经加佐剂的NP-KAg接种疫苗(第6组)的猪的粘膜部位和血液中，检测到显著提高的水平的抗PRRSV抗体，以及增加的抗体亲合力和VN滴度。显示在接种疫苗或受感染的动物中的多克隆抗体的亲合力与VN滴度成正相关(140)。与先前的报道一致，在第6组的猪的血浆中PRRSV特异性IgG的亲合力水平逐渐增加并且在攻击后15天达到峰值，这是由于分泌高亲和力抗体的B细胞克隆体逐渐占主导(140)。已经显示，纳米粒子与APC(B细胞)上的病原体识别受体相互作用，这促成高亲合力抗体的亲和力成熟和产生(141)。此外，亲合力结果与粘膜表面(IgA)和肺实质(IgA和IgG)的PRRSV VN滴度相关联，这有助于保护。
典型地，杀死的疫苗主要引发Th2反应，但为了有效地清除受病毒感染的细胞，平衡的Th1和Th2反应是必需的(142)。基于NP的疫苗驱动平衡的或Th1偏向的反应(138)。在第6组的猪中，检测到增强和平衡的Th1-Th2体液和细胞介导的免疫(CMI)反应。针对PRRSVGP5和M糖蛋白上的假定中和表位的VN抗体在PRRSV清除中起重要作用(131)。在第6组的猪中，针对攻击的PRRSV病毒株(MN184)检测到高水平的交叉中和VN滴度，而且针对其它遗传上分歧的病毒(包括I型病毒株)检测到增加的VN滴度，这指示了由加佐剂的NP-KAg引发的广泛反应性VN反应的存在。
NK细胞是抗病毒防御中主要的先天免疫作用物。在第6组的猪中，IFN-γ+NK细胞的群体显著上调。PRRSV抑制NK细胞活性(95、143)，但加佐剂的NP-KAg似乎补救NK细胞功能。在第6组的猪的肺中增加的IL-12产生可以影响NK细胞功能。γδT细胞以高频率存在于猪中并且涉及到先天和自适应免疫中。在第6组的猪中观测到经活化的γδT细胞的频率增加。稳固的CMI反应对于针对PRRSV感染的完全保护是重要的(28)。关键的Th1细胞因子IFN-γ是由NK细胞、γδT细胞、CD4+和CD8+T细胞以及CD4+CD8+T细胞产生。在第6组的猪中，鉴别出IFN-γ分泌淋巴细胞和其亚群的频率增加。另外，在第6组的猪中显著减少的IL-6产生指示了在PC 15时在第6组的猪中不存在炎性反应。在接受NP-KAg的猪中观测到的增强的CMI反应可能是由于在体内PLGA介导的由APC交叉提呈经包封的Ag到CD8+T细胞(144)。增强的记忆反应与高亲合力抗体的产生以及增强的B和T细胞反应相关联(145)。因此，在攻击后的猪中的免疫反应结果指示，在接受加佐剂的NP-KAg的猪中可能诱导很强的记忆反应。
未包封的有效佐剂的即时可用性对经鼻内递送的NP-KAg疫苗的重要性对于引发稳固的免疫反应是关键的，因为早先在只有NP-KAg疫苗的情况下(123)并且现在在接受NP-KAg和NP-结核分枝杆菌WCL的猪中(第5组)观测到不充足的抗PRRSV反应伴有部分病毒清除。与这些结果一致，与经囊封的佐剂共同投予的经PLGA包封的乙型肝炎亚单位疫苗未能诱导充足的抗体反应(146)。此外，疫苗和佐剂未包封的配方(第4组的猪)引发稳固的Th2偏向的反应伴有攻击的PRRSV的不完全清除，这确认了PLGA系统递送PRRSV KAg的必要性。与经加佐剂的NP-KAg接种疫苗(第6组)的猪肺中低PRRSVRNA拷贝数的存在和复制病毒的缺乏一致，先前的报道已经显示，qRT-PCR未能区分感染性和非感染性病毒并且灭活的PRRSV在环境中是相对稳定的(125)。具有低水平的PRRSV RNA拷贝的样品未能在细胞培养物中复制(56)。
结果已经显示，如结核分枝杆菌WCL的有效佐剂可以通过PLGA-NanoPRRS诱导更好的交叉保护性免疫。但是，结核分枝杆菌在培养物中生长缓慢并且其为3级生物安全水平(BSL-3)的病原体。因此，结核分枝杆菌WCL的大规模生产代表了风险、时间和成本。因此，与PLGA-NanoPRRS一起使用的有成本效益的有效替代佐剂是理想的。已经鉴别出分枝杆菌的四种非病原性种类，其细胞壁和蛋白质组成与结核分枝杆菌是可比的。其包括耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、蜂房分枝杆菌(M.alvei)和诡诈分枝杆菌(M.fallax)。这四种分枝杆菌种类是快速生长的、非病原性的，如同结核分枝杆菌一样，其具有索状构造的粗糙型菌落形态，接近于结核分枝杆菌的细胞壁特征，是猪的非共生物，BSL1设施足以使其生长，并且在美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection；ATCC)可得(112)。此外，耻垢分枝杆菌制剂用作候选佐剂以产生针对病原体的保护性免疫反应(113、114)。在初步研究中，将PRRS-MLV和耻垢分枝杆菌WCL经鼻内共同投予到猪并且用异种病毒攻击；在临床上猪没有PRRS症状，并且相较于对照PRRS-MLV组，在免疫学上检测到增强的IFN-γ和IL-12产生。母牛分枝杆菌制剂用作口服疫苗中的佐剂(115、116)。
基于PLGA的递送系统使所需的疫苗剂量减小几倍，最近以基于PLGA NP的肿瘤肽疫苗来证明，其中减小63倍的疫苗剂量引发可比的反应(147)。因为PLGA NP正得到全球认可，所以其为用于灭活的粘膜疫苗的有效递送系统，此外，其尺寸、含量和细胞靶向特性可以经过工程设计(119)。总之，有效加佐剂的经PLGA纳米粒子包封的灭活的PRRSV疫苗向猪的鼻内递送具有诱导优良的交叉保护性免疫的潜力。涉及大量猪的这种疫苗配方的进一步验证将对其应用领域提出设想。这种策略还可以应用于控制重要的人类呼吸道病原体。
实施例4：PRRSV VLP
PRRSV从所有身体分泌物中以低水平排出，或可能在唾液、鼻分泌物、尿液、乳汁、初乳、受感染的猪的粪便中以及受感染的公猪的精液中间歇地排出[174-179]。PRRSV在受感染的猪中引发较弱的先天和自适应免疫反应[57、180、181、12]，这与增强的免疫抑制反应相关联[77、182、183、48、95]。因此，在受PRRSV感染的猪中，将存在不完全的病毒清除并且对二次微生物感染的易感性增加[125、165、12、184、15]。自二十世纪九十年代以来，在PRRSV基因型(欧洲I型和北美II型)内，在美国已经不断地出现若干种遗传变异的亚型和病毒株，这使得其在猪体内的病原性显示出显著差异[38]。因此，在猪体内由一种PRRSV病毒株诱导的免疫可能对再感染提供部分保护乃至没有保护[185、186、117、187]。在北美PRRSV分离株内，遗传变异是84-100％，并且一种这样的野外分离株MN184是有毒的并且遗传上高度变异的病毒株[38]。尽管许多报道已经证实了在生长中的猪体内由MLV-PRRS诱导的令人满意的免疫，但其它报道了疫苗病毒的病毒性逆转并且传播给未接种疫苗的猪和母猪[96、32、97]；而且，疫苗与野外病毒株之间发生重组[188、88]。因此，防止病毒从受感染的猪群传播对于控制PRRS是关键的。所有这些限制使得研究优先考虑开发更好的交叉保护性的杀死的PRRSV疫苗。
在粘膜部位处经活化的先天免疫反应在针对肠道和肺感染的粘膜免疫中起主要作用[189]。由有效的粘膜疫苗引发的免疫反应与增强的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和中枢记忆免疫反应相关联，靶向更多数量的病毒结构蛋白质以及许多保守的表位，从而使得针对遗传上分歧的野外病毒株的交叉保护性免疫增强[190、191、54、192-194]。纳米技术已经成为未来疫苗学方法的重要的研究努力方向之一。纳米粒子提供了增加药物和疫苗递送的效力的优点，具有佐剂特性，并且由此改善疫苗功效[60]。归因于APC容易吞噬颗粒结构的固有能力，基于PLGA纳米粒子的疫苗和VLP致敏持久的抗体和T细胞反应[195-197]。此外，归因于PLGA纳米粒子保护经包封的疫苗抗原免受粘膜表面处蛋白酶介导的降解的性质，基于纳米粒子的疫苗递送对于诱导保护性粘膜免疫获得了越来越多的关注。包封在纳米粒子中并且经鼻内投予到小鼠、兔和猪的杀死的流感病毒疫苗诱导保护性免疫，并且在猪体内通过鼻内递送而引发的免疫反应显著高于肌肉内免疫[25]。递送到小鼠的粘膜部位的含有乙型肝炎、轮状病毒、流感病毒或副流感病毒的经PLGA纳米粒子包封的疫苗产生保护性免疫[54、25、55、102]。可生物降解并且生物相容的PLGA纳米粒子没有任何毒性并且已经证实在人类中使用是安全的。PLGA聚合物用于制备缝合材料并且是由美国食品和药物管理局(U.S Food and DrugAdministration)批准的材料[198、90、92]。已经证实，针对PRRSV的交叉保护性免疫可以在基于PLGA纳米粒子的PRRSV疫苗的帮助下引发。然而，对于这种颗粒疫苗的大规模生产，在疫苗抗原的批量制备中有成本效益的策略是必需的。
重组杆状病毒介导的昆虫细胞产生技术允许快速产生病毒样粒子(VLP)[199]。这种技术已经证实对包膜和无包膜病毒有效，如杯状病毒、流感病毒、细小病毒、多瘤病毒、呼肠孤病毒、副粘病毒、正粘病毒、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒(Ebola)、马尔堡病毒(Marbug)、屈公病毒(Chikungunya)、SARS冠状病毒(SARS corona)等(在[200、201]中评述)。多种(2到4种)病毒表面蛋白质的共表达仍然得到与真正的病毒粒子不能区分的VLP[202、203]。另外，可能用基于VLP的亚单位疫苗来产生具有DIVA(区分受感染动物与接种疫苗动物)潜力的疫苗。使用已经公布的标准程序，可以制备PRRSV-VLP。基于VLP的疫苗具有优于常规的疫苗抗原的几个优点；这些优点如下。(i)极大量的正确折叠的重组蛋白质可以在高密度细胞培养条件下于真核细胞中产生，因此杆状病毒系统可以按比例扩大用于大规模的疫苗生产[204]。(ii)基于昆虫细胞的疫苗生产可以在不需要源自哺乳动物细胞的补充物下完成，由此使得共同培养机会性病原体的风险降到最低。(iii)没有来自接种疫苗的个体中的杆状病毒的威胁，因为这种病毒在少数物种中具有极窄的宿主范围。(iv)VLP是相当稳定的，甚至在室温下储存9周后仍没有粒子形态的变化或免疫原性的降低[205]。(v)为了进一步加强疫苗效力，PRRSV-VLP可以被包封在PLGA纳米粒子中并且经鼻内递送给猪。(vi)不同于源自MARC-145细胞的半纯化的粗灭活的PRRSV，Nano-PRRSV-VLP疫苗中VLP的剂量是可定量的。
VLP促进免疫原性并且已经被开发用于几种病毒疫苗。乳头瘤病毒VLP疫苗得到许可在人类中使用，并且少数其它VLP疫苗处于I期临床试验中[201]。发现使用矿物油包水乳液佐剂中的小于10μg剂量的猪细小病毒VLP对猪接种疫苗具有高度免疫原性，而且有效防止经胎盘病毒传播和小母猪中的许多繁殖障碍[206]。已经发现包封在PLGA纳米粒子中的乙型肝炎表面抗原的VLP在疫苗的经粘膜递送中是有效的，这代表了一种递送VLP的方法[207]。而且，基于PLGA纳米粒子的疫苗以受控的方式将相关的VLP递送到免疫系统持续长达14天，而对其免疫原性没有任何损害[207]。经PLGA纳米粒子包封的PRRSV-VLP疫苗的递送可以引发猪体内充足的交叉保护性免疫反应，这由增强的中和抗体滴度和攻击的有毒异种PRRSV的清除增加来指示。
用于候选疫苗构筑的PRRSV分离株
可以使用I型病毒SD01-08和II型病毒SD09-28。SD01-08分离株代表了一组在北美新兴的I型PRRSV，其已经在先前的研究中用于疫苗开发[170、171]。PRRSV SD09-28最初在2009年从受PRRSV感染的农场获得，其代表了当前的野外循环病毒株(在ORF5中含有1-8-4RFLP模式)。
在杆状病毒系统中克隆PRRSV表面蛋白质基因以及产生PRRSV-VLP
重组杆状病毒蛋白质表达系统是已经确立的系统[208、209]。四种重要的PRRSV表面蛋白质基因GP3、GP4、GP5和基质蛋白质可以通过RT-PCR从病毒RNA扩增，并且使用快速连接试剂盒(PromegaCorp.)亚克隆到杆状病毒转移载体‘pAcAB4’(BD Biosciences,BDBAculoGoldTM目录号554770)中。早先，已经展示了在昆虫细胞中3到4种病毒衣壳蛋白的共表达来制造流感病毒[210]和蓝舌病毒[211]的VLP。为了产生PRRSV-VLP，可以使用线性化杆状病毒DNA转染试剂盒(BD Biosciences,BD BaculoGoldTM)将含有正确定向的PRRSV基因构筑体的pAcAB4载体共转染到Sf9昆虫细胞中。为了检测所产生的PRRSV-VLP，可以使用PCR针对重组杆状病毒中PRRSV核苷酸序列的存在来检查来自经转染的Sf9细胞的培养基。此外，可以在透射电子显微镜(TEM)(Hitachi S-3500N)的帮助下，通过与蔗糖纯化的野生型PRRSV并行地比较，来观测PRRSV-VLP。
制备Nano-PRRSV-VLP
可以如先前所描述[60、198]来制备基于PLGA纳米粒子的PRRSV疫苗。简单地说，可以通过双重乳液法，独立地将两种PRRSV病毒株的PRRSV-VLP包封在PLGA纳米粒子中。可以使用以下化学品来制造亲水和稳定的纳米粒子，如泊洛沙姆188(poloxamer 188)、蔗糖、Mg(OH)2、聚乙烯醇[212、41、213]。简单地说，可以将15％的PLGA(75/25)溶解于二氯甲烷和PRRSV-VLP中，并且可以通过声波处理来均化混合物，然后添加到聚乙烯醇的水溶液中，并且再次均化。可以在室温下搅拌Nano-PRRSV-VLP，洗涤，冷冻干燥，并且储存在4℃下。为了用于对照的猪，可以通过类似的方法制备空的PLGA纳米粒子。
表征Nano-PRRSV-VLP：
可以如先前所描述[41]使用BCA蛋白质分析试剂盒(Biorad,CA)来测定Nano-PRRSV-VLP中VLP的浓度。可以通过在真空下在离子涂布机的帮助下用金铂涂布经冷冻干燥的疫苗粉末来测定Nano-PRRSV-VLP的形态(尺寸和形状)并且使用10KV的TEM来检查。此外，可以通过用经冷冻干燥的Nano-PRRSV-VLP或PRRSV-VLP处理BAL细胞来测定猪肺泡MΦ对Nano-PRRSV-VLP的吞噬，并且进行免疫染色用于共焦显微术(Leica共焦显微镜)。此外，为了测定Nano-PRRSV-VLP诱导的肺泡MΦ活化，可以使用FACS Aria II(BDBiosciences)流式细胞计数器对经处理的BAL细胞进行表型分析。
评估猪体内Nano-PRRS-VLP疫苗的功效
可以从俄亥俄州立大学(OARDC)的没有PRRS的SPF猪群获得常规4-6周龄的健康的猪(n＝35)。可以确认在开始研究之前收集的血清样品对PRRSV抗体呈阴性。猪可以未接种疫苗(第1组)，用空的纳米粒子接种疫苗(第2组)，用等量的两种病毒基因型的Nano-PRRS-VLP接种疫苗(第3组和第4组)，用PRRS-VLP接种疫苗(第5组和第6组)，或用商业的杀死的PRRSV疫苗接种疫苗(第7组)，以2周的时间间隔接种两次(表4)。在接种疫苗后(DPV)28天，可以使用异种PRRSV病毒株MN184[38、214](1×106pfu/猪)攻击猪。可以每天监测动物的临床疾病和直肠温度，并且每3天记录体重。如所指示(表4)可以在不同DPV时收集血清样品，等分并且储存在-70℃下。可以在DPV 42(攻击后2周)对猪施以无痛致死术，并且可以检查肺和淋巴结的大体损伤。可以在中性缓冲福尔马林中收集肺组织样品用于组织学研究。在尸检期间，可以收集血液、支气管肺泡灌洗(BAL)液、气管支气管淋巴结(TBLN)、扁桃体和肺组织用于病毒检测；而且分离PBMC、TBLN单核细胞(MNC)、BAL细胞和肺MNC用于免疫学研究[47、162、95]。
表4.评估猪体内Nano-PRRS-VLP的功效。第2组-第6组：两次剂量的疫苗，经鼻内投予第1次剂量，并且在2周后通过肌肉内途径投予第2次剂量(加强)。第7组：通过肌肉内途径投予。
检测保护与交叉保护性免疫的免疫相关性
测定体液免疫
为了比较体液免疫反应，可以使用IDEXXPRRS3XR ELISA和病毒中和分析法[179、165、164]来评估所有血清样品(表4)。为了评定经Nano-PRRS-VLP接种疫苗的猪中诱导的交叉保护性中和抗体滴度，可以在分析法中使用一组六种野外分离株。自2010年以来，已经在SD动物疾病诊断实验室(SD Animal DiseaseDiagnostic Laboratory)收集了23种野外PRRSV分离株。可以将GP5序列资料输入到当前的PRRSV资料库(prrsvdb.org/)中用于使用先前所描述的方法(127)进行系统发育分析。可以选择代表当前的循环野外病毒株(最近进化的PRRSV)的六种分离株，并且用于分析法中以评估疫苗诱导的保护深度。
定量组织和病毒血症中的病毒负荷
为了定量PRRSV RNA以及测定病毒负荷，可以通过定量RT-PCR和细胞培养免疫荧光分析法[214、163、215]来分析血清样品和组织样品(肺、扁桃体和TBLN)。
免疫细胞的表型分析
可以对TBLN-MNC、BAL细胞、肺MNC和PBMC进行免疫染色以通过流式细胞计数法[48]测定淋巴和骨髓免疫细胞的频率。
细胞因子分析：
可以通过ELISA[48]来分析血清和BAL样品的细胞因子：先天的(IFN-α)；促炎性(IL6)；T辅助细胞1(Th1)(IFN-γ和IL-12)；以及免疫抑制性(IL-10和TGF-β)。
NK细胞-细胞毒性分析法
如先前所描述[12]，可以使用肺MNC和PBMC作为NK细胞(效应子)的来源针对K-562靶细胞来测定先天NK细胞介导的细胞毒性。
结果
可以使用非参数统计检验(GraphPad prism 5)来分析研究的结果。基于临床参数、病毒负荷、不同免疫细胞的频率、细胞因子型态和NK细胞功能，可以测定接种疫苗的经病毒攻击的动物中保护的免疫相关性。
可以检测到用Nano-PRRSV-VLP接种疫苗的猪中针对一组野外PRRSV分离株的不同程度的交叉中和抗体反应。用两次剂量的Nano-PRRSV-VLP疫苗接种疫苗可以使得相较于初步资料中所示的结果，从猪的血清和肺中更好地清除病毒。而且，在接种疫苗的经病毒攻击的猪中，可以检测到与存在于全身和粘膜部位处的淋巴细胞上细胞因子的产生增加以及CD4和CD8标志物的表达上调相关联的PRRSV特异性自适应免疫反应增加。类似于已经公布的在猪体内使用细小病毒VLP的疫苗研究，可以实现增强单独的PRRS-VLP的功效或作为与有效佐剂共同投予的候选疫苗[206]。
实施例5：UEA在PLGA-NanoPRRS疫苗中的作用
NP-KAg可以靶向存在于猪的上呼吸道中的M细胞。早先的报道已经显示，经鼻内接种到小鼠的包封UEA(内部)的PLGA纳米粒子疫苗显著增强特异性SIgA的产生。假想地，纳米粒子疫苗中表面锚定的UEA应比经包封的UEA在递送其货物到M细胞方面更好。在人类中，纳米粒子介导的药物和生物标志物的靶向递送是通过用靶向分子表面锚定纳米粒子来实现(152、153)，这还显著降低所需的剂量。因此，为了增强NP-KAg疫苗的功效以及使其有成本效益，将在猪系统中测试两种策略。
基于先前的结果(123)和其它的结果(154-158)；毫无疑问，NP-KAg疫苗具有提供针对PRRS的交叉保护性免疫的潜力。体外研究的结果可以帮助理解UEA在NP-KAg靶向递送到M细胞中的作用。这项研究可以帮助降低疫苗剂量并且进一步增强对PRRSV的交叉保护性功效。另外，使用NP-KAg的研究指示，有效的佐剂可以用于引发更好的免疫反应以及从肺和循环中的病毒清除。佐剂结核分枝杆菌WCL可以用另一种候选的有效佐剂替换。这些研究分析源自四种所选的非病原性分枝杆菌种类的WCL的佐剂作用，其经鼻内与NP-KAg-UEA共同投予。
实验方法
动物组与接种
将不含PRRSV抗体的4-6周龄的SPF猪(n＝60，每组6只猪)随机分配到10个组中的一组中。按照统计检力分析(ebook.stat.ucla.edu/cgi-bin/engine.cgi)，每组六只猪可以提供至少0.8的检力(α＝0.05)。猪可以未接种疫苗(模拟的-第1组)，或用假的纳米粒子接种疫苗(第2组)，用杀死的PRRSV接种疫苗(第3组和第4组)，或用指定的NP-KAg制剂接种疫苗(第5组-第10组)(表5)。猪可以用每只猪5×105TCID50(约100μg)(第3组、第5组、第7组和第9组)或2.5×106TCID50(约500μg)(第4组、第6组、第8组和第10组)剂量的指定NP-KAg疫苗配方接种疫苗，这些疫苗配方以两周的时间间隔与结核分枝杆菌WCL(1毫克/猪)经鼻内共同投予两次。注意，100和500μg的疫苗剂量指的是NP-KAg的蛋白质当量。就在接种疫苗之前，可以在PBS中复原经冷冻干燥的疫苗和佐剂，并且可以混合每种疫苗剂量所需的量，并且在PBS中将量调整到4ml。猪组2到10可以在加强后两周[28dpv(接种疫苗后天数)]使用有毒的异种PRRSV病毒株MN184(38)(5×105TCID50，4ml)经鼻内攻击；而模拟的组可以接受等量的MARC-145细胞培养上清液。
表5.
临床监测、血液和组织采样
可以在PRRSV攻击之后每天监测猪的疾病症状，如呼吸窘迫、咳嗽和食物摄取。可以在最初的7天期间每天记录体温，并且每周测量体重直到dpv 56。可以在0、3、7、14、21、28、28、35、42、49和56dpv时在EDTA中收集血液样品，并且可以将血浆等分并储存在-70℃下。可以在攻击后四周(56dpv)对猪施以无痛致死术，并且可以对肺和肺引流气管支气管淋巴结(TBLN)的宏观病变进行评分(159)。可以在中性缓冲福尔马林中收集肺样品，切片(5μm)，并且可以在进行H&E和免疫组织化学染色之后检查微观病变(121)。在不提供采样史的情况下，可以由经过专业认证的兽医病理学家对载片进行评分。可以冷冻肺、扁桃体和TBLN的样品以稍后测定PRRSV滴度。可以在同一天加工在抗凝剂溶液中收集的血液样品以及在DMEM中收集的肺组织样品以分离相应的单核细胞(160、161、162)。可以将从肺样品和BAL液制备的肺裂解物等分并且储存在-70℃下(12、48)。
定量病毒负荷
可以通过用RT-PCR(163)估算病毒RNA来定量血浆和组织样品(肺、扁桃体和TBLN)中的PRRSV负荷和滴度，而且通过间接免疫荧光分析法来测定复制病毒滴度(48)(图35)。
评估先天、体液和细胞介导的免疫反应
为了分析交叉保护性免疫反应，可以基于GP5序列资料来选择六种遗传变异的PRRSV分离株，其代表了来自资料库(prrsvdb.org)的在野外的当前循环PRRSV。从六种野外PRRSV分离株制备的半纯化的粗PRRSV Ag可以用于刺激PBMC和肺MNC以通过ELISPOT分析法(128)分析IFN-γ+淋巴细胞的频率(图36)。作为对照，可以包括受PHA(10μg/ml)刺激或未受刺激的细胞。可以使用用于病毒抗体的IDEXXPRRS 2XR ELISA(48)来评估血浆样品。可以针对六种PRRSV野外分离株来测定在0、28、42和56dpv时收集的血浆样品以及在dpv 56时收集的肺裂解物中的交叉保护性VN滴度(164、165)(图37)。将测定BAL液、肺裂解物和血浆样品中PRRSV特异性IgA和IgG的亲合力(166、167)(图38)。将通过ELISA(12)来分析在dpv 0、3、7、14、21、28、28、35、42、49和56时收集的血浆样品、以及肺裂解物的以下方面：先天的(IFN-α、IFN-β)；促炎性(IL1β、IL6和TNFα)；T辅助细胞1(Th1)(IFN-γ和IL-12)；Th2(IL-4)；以及免疫抑制性(IL-10和TGF-β)细胞因子。
非病原性分枝杆菌佐剂对NP-KAg-UEA疫苗的佐剂作用
实验方法
产生WCL
可以使四种所选的非病原性分枝杆菌种类(表6)在如ATCC所推荐的液体培养基中生长，并且可以如先前所描述(168)来制备WCL。简单地说，可以收集活的细菌并使用PBS(pH 7.4)洗涤两次，并且悬浮(2g/ml)于含有8mM EDTA、蛋白酶抑制剂、DNase和RNase的PBS中。可以通过使用珠磨器(Bead Beater)破坏细胞直到获得约90％的破碎度(通过抗酸染色来监测)，以3,000×g离心来团化未破碎的细胞和不可溶的细胞壁组分，并且可以收集上清液(WCL)。可以使用试剂盒来定量WCL中的蛋白质含量和内毒素水平，并且将等分试样储存在-70℃下。分枝杆菌WCL制剂含有水溶性蛋白质、脂质和碳水化合物。
表6.
动物组与接种
将不含PRRSV抗体的4-6周龄的SPF猪(n＝60，6只猪/组)随机分配到10个组中的一组中(表6)。猪可以未接种疫苗(模拟的-第1组)，用假的纳米粒子接种疫苗，或用每只猪5×105TCID50(约100μg)剂量(第3组、第5组、第7组和第9组)或每只猪2.5×106TCID50(约500μg)剂量(第4组、第6组、第8组和第10组)的NP-KAg-UEA疫苗接种疫苗，这种疫苗以两周的时间间隔与源自指定的非病原性分枝杆菌种类的WCL(第3组到第10组，1毫克/猪)经鼻内共同投予两次。就在接种疫苗之前，可以在PBS中复原经冷冻干燥的疫苗和指定的佐剂制剂，并且可以混合每种疫苗剂量所需的量，并且在PBS中将量调整到4ml。猪组2到10可以在加强后两周[28dpv(接种疫苗后天数)]用有毒的异种PRRSV病毒株MN184(38)(5×105TCID50，4ml)经鼻内攻击；而模拟的组可以接受细胞培养上清液。可以如上文所描述来进行临床征象的监测、血液和组织样品的收集、病毒负荷的定量，以及体液、先天和细胞介导的免疫反应的评估。
经加佐剂的纳米粒子-PRRSV接种疫苗的猪中针对不同的抗原上 分歧的病毒的交叉保护性免疫的广度
这项研究可以确定加佐剂的NP-KAg-UEA疫苗帮助诱导更好的交叉保护性免疫的程度，这是通过临床症状、病毒清除，并且通过生长中的猪体内的免疫相关性来测量。在怀孕母猪中，可以研究疫苗配方是否可以减少攻击的病毒垂直传播给仔猪。
实验方法：
动物组与接种
可以将不含PRRSV抗体的4-6周龄的SPF猪(n＝66)和怀孕55天的怀孕母猪(n＝9)随机分配到指定组中的一组中(表7)。猪可以未接种疫苗(模拟的-第1组)，使用假的纳米粒子接种疫苗，或用NP-KAg-UEA疫苗接种疫苗(表7a和7b)，这种疫苗以两周的时间间隔与所选的非病原性分枝杆菌种类WCL(1毫克/猪)经鼻内共同投予两次。就在接种疫苗之前，可以在PBS中复原经冷冻干燥的疫苗和佐剂制剂，并且可以混合所需的量，并且在PBS中调整到4ml。
表7a.
表7b.
作为对照，猪组9到11可以按照制造商的建议使用PRRS-MLV接种疫苗。猪组2到11(表7a)以及第2组和第3组(表7b)可以在加强后两周(28dpv)(5×105TCID50，4ml)用指定的PRRSV病毒株经鼻内攻击；而模拟的组可以接受等量的MARC-145细胞培养上清液。
攻击病毒株PRRSV 10-398(D6)(入藏号10-16734)在ORF5中含有1-4-4RFLP模式(169)，并且其在2010年从受感染的母猪中分离出，代表在俄亥俄州和其它州中极其有毒的当前野外病毒株，其杀死了10％的受感染母猪。PRRSV病毒株SD01-08代表在北美新兴的I型PRRSV(170、171)。还可以包括同种病毒(VR2332病毒株)(164、172)。可以如上文所描述来进行临床征象的监测、血液和组织样品的收集、病毒负荷的定量，以及体液、先天和细胞介导的免疫反应的评估。
怀孕母猪的临床监测、血液和组织采样
可以每天监测怀孕母猪的临床征象，并且将在怀孕60天(dpv 0)、88天以及无痛致死当天收集血液样品。可以如早先所描述(173)对母猪和猪仔施以无痛致死术并且收集样品。简单地说，在怀孕109天与112天之间，可以对母猪施以无痛致死术，并且可以立即对子宫角进行尸检，并且可以记录活的和死产的胎儿的数目。可以从每个胎儿收集血液样品，并且可以将血浆等分并储存在-70℃下。可以收集母体和胎儿组织(TBLN、扁桃体和肺)并且储存在福尔马林中用于组织学研究，而且可以通过qRT-PCR来分析在RNA later(Ambion)中收集的类似组织样品的PRRSV RNA和细胞因子mRNA。
统计分析
可以使用SAS进行数据分析。可以通过变异数分析(ANOVA)来进行病毒负荷、细胞因子水平和VN滴度的比较，当ANOVA检验指示出显著差异时使用邓肯氏多重比较检验(Duncan's multiplecomparison test)。可以使用克-瓦二氏非参数检验(Kruskal-Wallisnon-parametric test)来进行抗体反应的比较。
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Claims (26)

1.一种组合物，其包含灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纳米粒子。
2.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含佐剂。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述佐剂是分枝杆菌裂解物。
4.如权利要求2或3中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是结核分枝杆菌全细胞裂解物。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述佐剂是选自由以下组成的组：耻垢分枝杆菌全细胞裂解物、霍乱毒素B亚单位和大肠杆菌热不稳定突变毒素。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述纳米粒子是免疫原性的。
7.如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子与所述灭活的PRRSV缔合。
8.如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子与所述灭活的PRRSV偶联。
9.如权利要求1到6中任一项所述的组合物，其中所述灭活的PRRSV被包封在所述纳米粒子内。
10.如权利要求1到9中任一项所述的组合物，其中所述灭活的PRRSV通过水/油/水乳液法被包封在所述纳米粒子内。
11.如权利要求1到10中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子是聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述PLGA是50/50PLGA。
13.如权利要求1到10中任一项所述的组合物，其中所述纳米粒子是选自由以下组成的组：甲壳素、磷酸钙、各种细菌如大肠杆菌、分枝杆菌、钩端螺旋体的脂质以及其混合物。
14.如权利要求1到12中任一项所述的组合物，其比率为约180mg PLGA比约5mg灭活的PRRSV。
15.如权利要求1到14中任一项所述的组合物，其中所述灭活的PRRSV是PRRSV的MN184病毒株。
16.如权利要求1到15中任一项所述的组合物，其中所述灭活的PRRSV是用UV光灭活。
17.一种疫苗，其包含于载体中的如权利要求1到16中任一项所述的组合物。
18.一种引发猪体内针对PRRSV的免疫反应的方法，其包括向所述猪投予如权利要求1到16中任一项所述的组合物或如权利要求17所述的疫苗。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述免疫反应是针对PRRSV感染的保护。
20.一种减少猪的繁殖或呼吸衰竭的方法，其包括以下步骤：
b.提供如权利要求1到16中任一项所述的组合物或如权利要求17所述的疫苗；以及
c.将所述组合物或疫苗投予到猪。
21.一种刺激猪体内的免疫反应的方法，其包括：向所述猪投予如权利要求1到16中任一项所述的组合物或如权利要求17所述的疫苗。
22.如权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述组合物或疫苗是以介于100ug/猪与500ug/猪之间的剂量投予。
23.如权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述组合物或疫苗是以单次剂量投予。
24.如权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述疫苗是以两次剂量投予。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述两次剂量是以约两周的时间间隔投予。
26.如权利要求18到25中任一项所述的方法，其中所述组合物或疫苗经鼻内投予。
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