CN109562155A - 激活猪属动物的免疫系统的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了激活猪属动物的免疫系统的方法。该方法包括在猪属动物出生后的有效时段内给予该猪属动物有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。
Description
背景技术
呼吸感染是导致约19天至约68天范围内的哺育年龄的乳猪死亡的主要原因，导致养猪业的重大经济损失。1例如，猪繁殖与呼吸综合综合征(PRRS)是一种全球性的猪慢性病毒性疾病。PRRS在大多数的产猪国家中是地方流行病，并且还是造成养猪业经济损失的主要原因，美国的年损失额估计为六亿六千四百万美元。2PRRS的临床症候包括呼吸及生殖功能障碍，并且致病原为PRRS病毒(“PRRSV”)。3PRRSV通过从最早两天开始就控制猪的免疫系统来形成疾病，并在感染之后持续七周。4
乳猪的疫苗接种是一种常用来对抗呼吸感染的手段；然而，利用疫苗接种方法来对新生仔畜实施保护的尝试被认为是无效的。5新生仔畜免疫系统的未成熟导致了在新生仔畜中难以成功地形成免疫作用，已知其免疫系统对产生涉及细胞毒性T细胞以及产生IFN-Y的T细胞(即T辅助(Th)1细胞)的细胞介导免疫反应的能力有限。因此，针对包括病毒在内的细胞内病原体的防御是无效的。6参与了获得性免疫的形成的新生仔畜抗原呈递细胞(“APC”)、淋巴细胞和先天性免疫系统的其他细胞的能力的代表性报告指出了对促分裂原的有限反应、细胞激素分布的差异、解剖结构的发展不足以及发展适合及保护性获得性免疫反应所需的膜受体的表达差异。7
新生动物中先天性免疫系统(其是实现对免疫接种的适合获得性免疫反应所必需的)的不完全在数量及质量两者方面由受损的疫苗诱导的抗体反应所体现。8针对猪流感病毒(“SIV”)疫苗的接种的抗体反应的大小的差异(其取决于新生猪只疫苗接种的年龄)体现了这一状况。在1周龄时初次接种疫苗的乳猪于第二次接种疫苗后产生较低的最大抗体效价，并且较在4或8周龄时初次接种疫苗的猪更早变为血清阴性。9类似地，在3周龄时针对猪圆环病毒病(“PCVD”)接种疫苗的乳猪较在1周龄时接种疫苗的猪对此病毒受到更好的保护。10因此，新生猪疫苗学中的一项主要挑战在于，生物制剂不能于生命早期诱出适当的保护免疫性，这是因为先天性免疫系统的初始(未激活的)状态无法对T细胞活化以及最佳细胞激素环境提供适当的信息传递来实现足够质量与强度的获得性免疫反应的发展，进而提供抗微生物保护免疫性。
由于新生猪的免疫系统不够成熟，其需要在出生后若干周准备好发育出对由疫苗所提供的抗原刺激的适当获得性免疫反应。因此，新生动物肺部重度依赖于先天性免疫系统来针对空气传播病原体提供保护。当前并无针对猪的病毒或细菌呼吸感染的完全有效疫苗或疗法。然而，已尝试用不同方法来解决这些问题。
试图解决这些问题的一种方法是给予无害但刺激免疫的物质来活化新生仔畜的先天性免疫路径，其通过促进其发育而将加速其成熟及功能性。已经探索促进新生猪的先天性免疫系统的发育的策略包括饮食补充β-葡聚糖(酵母细胞壁的组分)或不同的植物提取物。11虽然已报告了指示刺激全身性免疫刺激作用的结果，但是，饮食补充并未将其作用直接靶向于存在于呼吸道中的先天性免疫系统的细胞。
除了饮食补充外，另一种方法是直接激活(prime)存在于呼吸道中的先天性免疫的细胞。包括例如巨噬细胞及树状细胞的先天性免疫系统的细胞在介导保护免疫性或作为抗原呈递细胞(“APC”)中起直接作用。在人类中，将活细菌卡介菌(BacillusCalmette-Guerin)(“BCG”)在人类出生时规律地给予，其能够诱导强的Th1型免疫反应。不受限于任何理论，认为BCG疫苗的效用是归因于此微生物结合由APC表达的多种toll样受体(“TLR”)的能力，这因此产生促炎性细胞激素并促进Th1免疫性的发展。
试图解决这些问题的另一种方法是通过注射来给予用作免疫调节剂的微生物产物，包括，但不限于，痤疮丙酸杆菌的热致死或甲酸处理的悬浮液、微生物多醣、脂多醣、蛋白质结合多醣、胞壁酰二肽、脂质A以及去蛋白及去脂质的草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)细胞壁提取物(MCWE)。例如，美国专利第4,744,984号(Vetrepharm Research,Inc.)公开了治疗动物及人类病毒感染的方法，其包括向动物或人类注射在油及水乳液中的去蛋白细菌细胞壁悬浮液的步骤，并且该细菌细胞壁悬浮液可源自分枝杆菌(Mycobacterial)属。美国专利第5,759,554号(Vetrepharm Research,Inc.)公开了刺激人类或动物中的免疫系统的方法，其包括向该人类或动物给予不含油的不可溶细菌细胞壁部分的水性悬浮液，并且该不可溶细胞壁部分制备自分枝杆菌属得并经处理以由该部分提取脂质。美国专利第6,890,541号(Bioniche Life Sciences,Inc.)公开了活化新生动物的免疫系统以提高动物的生产效能的方法，其包括向该新生动物给予分枝杆菌细胞壁提取物。
然而，不幸地是，美国专利第4,744,984号、第5,759,554号和第6,890,541号中公开的方法具有显著的缺点。一个缺点是细胞壁悬浮液、细胞壁部分或细胞壁提取物的给予可能不如其他策略那样有效。例如，给予细胞壁悬浮液、细胞壁部分或细胞壁提取物仅限于细胞壁核心组分，并且可能不包括任何存在于分枝杆菌包膜的外部小叶中的结构组分。细胞壁结构仅是分枝杆菌包膜的一小部分。不受限于任何理论，相较于仅给予细胞壁核心组分，推测给予细胞壁核心组分与存在于分枝杆菌包膜的外部小叶中的结构组分的组合对于刺激新生动物的免疫系统将具有加成且可能增效的作用。
另一缺点在于，在美国专利第4,744,984号、第5,759,554号和第6,890,541号中的一些实施方式中，在细胞壁提取及分离过程期间，对细胞壁进行去脂质，其中分枝杆菌包膜的至少两种主要组分，即存在于包膜的外部小叶中且已知具有免疫刺激活性的TDM及LAM最可能在去脂质期间被去除。12在去脂质之后残留的组分由细胞壁核心结构所组成，其尽管是分枝杆菌包膜的重要部分，但却失去了外部小叶的重要分枝杆菌组分，例如，已知具有活化巨噬细胞的能力并因此触发先天性宿主反应(例如，产生炎性细胞激素)的TDM及LAM。
另外的缺点在于，仅给予细胞壁核心组分是不方便的。例如，分离或提取细胞壁核组分可以是耗时的，并且需要进行若干步骤。又一可能的缺点在于，细胞壁核心组分不可溶于水性制剂中而需要基于脂质或油的乳液来递送。
虽然可以采用用来解决前述问题(关于造成乳猪主要死亡的呼吸感染问题)的策略，但这些策略可能便利性不佳，存在缺陷，并且较其他策略无效。因此，仍需要用来对抗乳猪的呼吸感染的替代方案。优选地，这些替代方案较其他策略更有效，并且降低一或多种当前方法的不便及缺失。
发明内容
本公开通过提供激活猪属动物(Sus)的免疫系统的有效且高效的方法而解决前述问题，这些方法表现出期望性质，并且还提供了相关优点。在本公开的一些实施方式中，方法包括在猪属动物出生后的有效时段内向该猪属动物给予有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。
本公开的另一方面提供一种用于激活猪属动物的免疫系统的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物用于激活猪属动物的免疫系统包括在猪属动物出生后的有效时段内向该猪属动物给予有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。
本公开的另一方面提供一种分枝杆菌全细胞裂解物用于制造用来激活猪属动物的免疫系统的药剂的用途。在本公开的一些实施方式中，该用途包括在猪属动物出生后的有效时段内向该猪属动物给予有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。
本公开相较于领域中已利用的其他方法提供若干优点。根据一个实施方式的方法的一项优点是分枝杆菌全细胞裂解物的给予包含分枝杆菌包膜的结构组分的大部分(如果不是全部的话)。因此，相较于仅给予细胞壁组分，给予分枝杆菌全细胞裂解物(其包括分枝杆菌包膜的结构组分而非仅细胞壁核心组分)对于刺激猪属动物的免疫系统具有加成和可能的增效作用。
根据另一实施方式的方法的优点在于，根据本公开所利用的分枝杆菌全细胞裂解物不会去脂质。因此，不同于当制备细胞壁悬浮液、细胞壁部分或细胞壁提取物时所采用的脂质提取步骤，在本公开的分枝杆菌全细胞裂解物中具有强效免疫刺激活性的细胞壁核组分将不会丢失。
根据另一实施方式的方法的优点在于，分枝杆菌全细胞裂解物较细胞壁悬浮液、细胞壁部分或细胞壁提取物容易制备，这降低了其他方法的不便及低效。例如，制备包含分枝杆菌包膜的全部或基本上全部结构组分的分枝杆菌全细胞裂解物较分离或提取细胞壁组分需要更少的步骤及更少的时间。
根据另一实施方式的方法的优点在于，不同于制备细胞壁悬浮液、细胞壁部分或细胞壁提取物所需的过程步骤，制备分枝杆菌全细胞裂解物所需的过程步骤相较于传统工业发酵设施及设备可以容易地放大。
附图说明
结合附图，通过参照以下对实施方式的描述，各实施方式的上述方面将变得更明显并且将更好地被理解，其中：
图1示出了肺泡巨噬细胞对利用脂多醣(“LPS”)相较于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的粗全细胞裂解物的刺激的TNF-α反应。
图2示出了猪肺泡巨噬细胞对利用耻垢分枝杆菌的粗全细胞裂解物的刺激的TNF-α反应的动力学及用于生长细菌的培养基对WCL的效力的影响。使用三种不同类型的培养基7H9、GAS或NB来培养分枝杆菌，以制备用来获得粗全细胞裂解物的细菌细胞物质。
图3示出了耻垢分枝杆菌WCL的效力(由50％有效剂量指示的)可以受到用来培养耻垢分枝杆菌以制备用来制备WCL的细菌细胞物质的生长介质的类型的影响。
图4示出了粗耻垢分枝杆菌WCL相较于(1)来自耻垢分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚醣(“LAM-MS”)的市售制剂和(2)草分枝杆菌细胞壁提取物的市售制剂的相对效力。
图5示出了在猪中来自耻垢分枝杆菌WCL的给予的TNF-α刺激增强效应。
图6示出了在猪中来自耻垢分枝杆菌WCL的给予的自然杀伤亚群增强效应。
图7示出了在猪中来自耻垢分枝杆菌WCL的给予的B细胞亚群增强效应。
具体实施方式
下面描述的实施方式并非旨在穷举的或将本发明限制为在以下详细描述中公开的精确形式。相反，选择和描述实施方式以使得本领域其他技术人员可以明白并理解本公开的原理和实践。
由于呼吸道是新生猪中易发病的主要目标且由于已知分枝杆菌的结构组分与先天性免疫系统的若干路径结合，本公开通过以下解决此问题：递送分枝杆菌全细胞裂解物来直接激活新生猪的呼吸道的先天性免疫系统并增进其在此呼吸病原菌的关键入口处的防御机制。
分枝杆菌包膜的各种结构组分的免疫刺激活性已经确认了一段时间。13分枝杆菌细胞包膜是复杂的且由分层排列的脂质、多醣、醣脂和霉菌酸的厚蜡状混合物所组成。14这些层首先由包含常规极性脂质的内膜(“IM”)(其形成典型的膜双层)所组成，并且包括磷脂酰肌醇甘露糖苷(“HM”)作为主要组分。覆盖IM的是肽聚醣-阿拉伯半乳聚糖(“AGP”)复合物，其形成由螺旋形肽聚醣(“PG”)部分网络所组成的骨架，该网络散布有向多醣阿拉伯聚糖提供锚固的螺旋形半乳聚糖(半乳糖的聚合物)。当半乳聚糖与阿拉伯聚糖多醣组合时，组合的结构构成包膜的阿拉伯半乳聚糖(“AG”)组分。15继而，AG单元的远端阿拉伯糖部分经由共价键向分枝菌酸提供锚固。此细胞壁的下段称为细胞壁核心，即霉菌酰阿拉伯半乳聚糖-肽聚醣(“mAGP”)复合物。16分枝杆菌包膜最终被由可提取脂质构成的上层覆盖，其在领域中称为上段、外部小叶或外部膜。包膜的此外部小叶中的可提取脂质由不同类型的脂质构成，包括脂肪酸、脂寡醣(“LOS”)、三酰基脂肽、糖肽脂(“GPL”)、海藻糖二霉菌酸酯(“TDM”)及脂聚醣，即脂阿拉伯甘露聚醣(“LAM”)。17
OM的组分在分枝杆菌细胞壁中作为“游离”脂质(即作为非共价键连接至下方的肽聚醣-阿拉伯半乳聚糖(“AGP”)复合物的溶剂可提取的脂质)存在。18TDM及LAM的免疫刺激活性已经得到广泛地研究。TDB结合C型凝集素，Mincle(巨噬细胞可诱导的C-型凝集素)。19在TDB识别后，C型凝集素Mincle与Fc受体共同γ-链(“FcRγ”)相互作用，其通过Syk触发细胞内信号传导，导致CARD9依赖性的NF-κB活化。LAM是限于分枝杆菌属的脂聚醣，其作为宿主免疫反应的强效调节剂并存在于所有分枝杆菌属，如病原菌种结核分枝杆菌(M.tuberculosis)及麻风分枝杆菌(M.leprae)、疫苗菌种牛分枝杆菌(M.bovis)、机会性菌种鸟分枝杆菌(M.avium)及偶发分枝杆菌(M.foruitum)、以及非病原菌种耻垢分枝杆菌的包膜中。LAM根据其结构展现不同的免疫调节作用。PILAM(其是磷酸肌醇封端的LAM且存于非病原菌种(耻垢分枝杆菌)中)是促炎分子，而ManLAM(其是甘露糖封端的LAM且存于病原菌种(结核分枝杆菌)中)是抗炎分子。20PILAM以TLR2依赖方式活化巨噬细胞，其似乎涉及其他TLR，但不涉及TLR4。21
为界定具有免疫刺激活性的分枝杆菌结构组分，已采用各种技术来分离及纯化这些组分，从而可以单独地研究这些组分。这些技术大部分是基于细菌的机械分解，随后差速离心。在通过机械方式使细菌破碎后，可通过差速离心分离所得组分。在低速(3,000x g，其中g是重力场强度)下离心WCL导致除去未破碎的细胞，且细菌的所有其他结构组分保持于悬浮液中。另一方面，在27,000g的高速下离心WCL导致分离细胞壁，其将于离心后成球状落下，而膜及细胞液组分保持悬浮于上清液中。22所得的细胞壁团块包含mAGP复合物以及结合的LAM。23此类型的组成将仅存在在尚未于细菌分离程序期间的任何点处故意去脂质的WCL制剂中。否则，在去脂质后，通常构成外部小叶的可提取脂质分子如TDM及LAM会在提取程序期间丧失。实际上，已经显示去脂质的耻垢分枝杆菌不能被识别分枝杆菌TDM且是存在于分枝杆菌包膜的外部小叶上的游离脂质之一的巨噬细胞受体Mincle(巨噬细胞可诱导的C型凝集素)识别。24因此，预期分枝杆菌的天然全细胞裂解物将具有大部分(若非全部的话)已知存在于此类型细菌的分枝杆菌包膜中的大分子。
分枝杆菌的结构组分由多种在骨髓细胞(最显著地包括巨噬细胞及树状细胞)中表达的宿主受体、Toll样受体、核苷酸结合寡聚域(NOD)样受体(“NLR”)、C型凝集素受体(如Minicles及甘露糖受体(“CD207”))、树状细胞特异性细胞间黏着分子-3结合非整合素因子(“DC-SIGN.CD209”)及Dectin-1识别。25大部分由分枝杆菌激活的TLR依赖性信号为阳性，导致炎性及抗微生物先天性免疫反应的活化。例如，来自快速生长及无毒性物种(如耻垢分枝杆菌)的磷酸肌醇封端的LAM是刺激巨噬细胞生产肿瘤坏死因子(TNF)-α及IL-12的促炎分子。26虽然大部分细菌产生N-乙酰基MDP，但分枝杆菌产生MDP的非寻常改变形式，称为N-羟乙酰基MDP，其是I型干扰素(“IFN”)的强效的诱导物，且经证实对于流感病毒感染提供非常有效的保护。27此外，如前所述，分枝杆菌包膜外部小叶包含各种各样不同化学性的脂质及醣脂，其可能介导特定的宿主交互作用并经证实在体外针对真核细胞具有强效的生物活性。28
“激活猪属动物的免疫系统”是指刺激及/或活化猪属动物的免疫系统，且包括通过猪属动物的免疫系统的细胞引起免疫反应。“免疫反应”是免疫系统的细胞如B细胞、T细胞、单核细胞或其类似物对刺激的反应。免疫反应可是B细胞反应，其导致产生特定抗体，如抗原特异性中和抗体。免疫反应还可以是T细胞反应，如CD4+反应或CD8+反应。在一些情况下，反应是对特定抗原特异性的(即，“抗原特异性反应”)。免疫反应还可以包括先天性反应。在一些实施方式中，激活猪属动物的免疫系统包括激活巨噬细胞。在一些实施方式中，激活猪属动物的免疫系统包括激活肺泡巨噬细胞。在一些实施方式中，激活的肺泡巨噬细胞表现出响应于刺激的增强的TNF-α产生。如果抗原源自于病原体，则抗原特异性反应是“病原体特异性反应”。“保护性免疫反应”是抑制病原体的有害功能或活性、降低病原体感染或减少由被病原体感染所产生的症状(包括死亡)的免疫反应。保护性免疫反应可以例如通过于空斑减数试验(plaque reduction assay)或ELISA中和试验中抑制病毒复制或空斑形成，或通过测量体内对病原体攻毒的抗性来测量。在一些实施方式中，免疫反应是局部性的。在一些实施方式中，免疫反应是全身性的。
在本公开的一些实施方式中，“激活猪属动物的免疫系统”包括“对疫苗接种激活猪属动物的免疫系统”。可以想到，免疫接种可以针对任何类型的病毒、细菌、真菌、原生动物或其他可能感染猪属动物的寄生虫。疫苗接种可靶向的病毒的非限制性列表包括，但不限于，PRRSV、猪流感病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒(“PPV”)、传染性胃肠炎(“TGE”)病毒、猪流行性腹泻病毒(“PEDV”)、猪轮状病毒、猪副粘液病毒、假狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒(“ASFV”)、古典猪瘟病毒(“CSF”)、猪冠状病毒科、猪细环病毒、猪博卡病毒、猪环曲病毒(procine torovirus)、猪E型肝炎病毒、猪内生性反转录病毒、猪嗜淋巴球疱疹病毒、猪札幌病毒、猪瘟病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、邦果瓦纳病毒(Bungowannah virus)、梅南高病毒(Menangle virus)及三角洲冠状病毒(delta coronavirus)。
疫苗接种可靶向的细菌的非限制性列表包括，但不限于，猪附红细胞体(Mycoplasma suis)；溶血性巴氏杆菌(Pasteurella haemolytica)；睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)；流产布氏杆菌(Brucella abortus)；披衣菌；边虫；霉浆菌；胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)；猪放线杆菌(Actinobacillus suis)及马驹放线杆菌(Actinobacillus equuli)；支气管败血性波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)；猪布氏杆菌(Brucella suis)；大肠、空肠、猪肠弯曲杆菌(Campylobacter coli,jejunum,hyointestinalis)；大肠杆菌(E.coli)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)；克留氏属；劳索尼亚氏细胞内寄生菌(Lawsoniaintracellularis)；波莫纳钩端螺旋体(Leptospira pomona)布拉迪斯拉发/慕尼黑沙门氏杆菌钩端螺旋体(Leptospira bratislava/muenchen)；出血性黄疸螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagiae)；多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)(产毒素性)；多杀性巴氏杆菌(非产毒素性)；猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、德尔卑沙门氏菌(Salmonella derby)及其他；厌氧性肠道螺旋体(Brachyspira pilosicoli)；猪赤痢螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)；短螺旋体属(Brachyspira)(弱溶血性种类)；耶氏菌属(Yersinia species)；化脓放线菌(棒状杆菌)(Actinomyces(Corynebacterium)pyogenes)；炭疽杆菌(Bacillus anthracis)；猪布氏杆菌(Brucella suis)；鹦鹉披衣菌(Chlamydia psittaci)；诺维氏梭菌(Clostridiumnovyi)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；破伤风梭菌(Clostridium tetani)；猪真杆菌(棒状杆菌，真细菌)(Actinobaculum(Corynebacterium，Eubacterium)suis)；猪附红血球体(Eperythrozoon suis)；红斑丹毒丝状菌(Enysipelothrix rhusiopathia)；李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)；鸟/细胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium/intracellulare)；肺炎霉浆菌(Mycoplasma hyopneumoniae)；猪流行性肺炎霉浆菌(Mycoplasma flocculare)；猪鼻霉浆菌(Mycoplasma hyorhinis)；猪关节滑膜霉浆菌(Mycoplasma hyosynoviae)；猪葡萄球菌(Staphyloccus hyicus)；其他葡萄球菌；1型猪链球菌；2型、15型猪链球菌；以及其他类型的链球菌。
如本文所使用，“猪属动物”是指猪生物科成员的野生或家畜的任何动物，包括但不限于：巴比如萨猪鹿(Babyrousa babyrussa)或金色鹿豚(Golden Babirusa)、西里伯斯猪鹿(Babyrousa celebensis)或苏拉威西岛鹿豚(Sulawesi Babirusa)、托吉安猪鹿(Babyrousa togeanensis)或托吉安鹿豚(Togian Babirusa)、巨林猪(Hylochoerusmeinertzhageni)或大林猪(Giant Forest Hog)、荒漠疣猪(Phacochoerus aethiopicus)或荒漠疣猪(Cape Warthog、Somali Warthog、Desert Warthog)、非洲疣猪(Phacochoerusafricanus)或普通疣猪(Common Warthog)、姬猪(Porcula salvania)或侏儒猪(PygmyHog)、假面野猪(Potamochoerus larvatus)或薮猪(Bushpig)、布什猪(Potamochoerusporcus)或红河猪(Red River Hog)、巴拉望须猪(Sus ahoenobarbus)或巴拉望须猪(Palawan Bearded Pig)、婆罗猪(Sus barbatus)或须猪(Bearded Pig)、越南疣猪(Susbucculentus)或越南疣猪(Vietnamese Warty Pig)、卷毛野猪(Sus cebifrons)或苏拉威西疣猪(Visayan Warty Pig)、霍氏野猪(Sus heureni)或弗洛勒斯疣猪(Flores WartyPig)、奥氏疣猪(Sus oliveri)或民都洛疣猪(Mindoro Warty Pig)、菲律宾疣猪(Susphilippensis)或菲律宾疣猪(Philippine Warty Pig)、野猪或家猪、爪哇疣猪以及任何其他公猪、母猪、乳猪、仔猪、小猪、小母猪、阉猪、野猪、任一性别或任何年龄的猪、
本公开的方法利用分枝杆菌全细胞裂解物。如本文所使用，“全细胞裂解物”，其通常简称为“WCL”，具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含意。在一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物是粗分枝杆菌全细胞裂解物。在一些实施方式中，天然分枝杆菌全细胞裂解物包括例如，除了移除未破裂的细胞以外，没有从其中移除任何结构组分或经过分离，且无其他物理或化学性质的分割、提取或分离的溶解分枝杆菌细胞。在一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物包括死亡的且不再可复制，但包含预裂解的细胞的所有组分的裂解细胞。在一些实施方式中，全细胞裂解物是WCL的非变性的上清液。在一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物是佐剂。
在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物未经历纯化。在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物经历纯化。如本文所使用，“纯化”是指由分枝杆菌全细胞裂解物移除不期望组分的过程。纯化不需将所有微量的不期望组分都从分枝杆菌全细胞裂解物中移除。纯化技术包括，但不限于，细胞分级分离、离心、透析、离子交换层析、粒径排阻层析以及亲和性纯化或沉淀。在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物是未分级分离的。在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物是未去脂质的。在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物是未去蛋白质的。在一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物单独给予。在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物与一种或多种针对猪病毒疾病的适当疫苗共同给予。
在本公开的方法中使用的分枝杆菌全细胞裂解物可以由任何分枝杆菌组成。如本文所使用，“分枝杆菌”是指任何来自分枝杆菌科或分枝杆菌属的原核生物。可利用于本公开的方法中的分枝杆菌的非限制性列表包括，但不限于，牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacteriummicrotti)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、卡氏分枝杆菌(Mycobacteriumcanettii)、海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、鸟细胞内分枝杆菌(Mycobacteriumaviumintracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、异型分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、偶然分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、鼻疽分枝杆菌(Mycobacterium farcinogenes)、黄色分枝杆菌(Mycobacterium flavum)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophitum)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、塞内加尔分支杆菌(Mycobacterium senegalense)、猿分支杆菌(Mycobacterium simiae)、耐热分枝杆菌(Mycobacterium thermoresistible)、牝牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)、猪分枝杆菌(Mycobacterium porcinum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessu)、罕见分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、蜂房分枝杆菌(Mycobacterium alvei)以及异型分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)。
在本公开的方法中使用的分枝杆菌全细胞裂解物可以使用任何将由普通技术人员考虑的适用途径给予，包括，但不限于，经口、静脉内(“IV”)、皮下(subcutaneous)(“SC”)、肌肉内(“IM”)、腹膜内、皮内、眼内、肺内、鼻内、经皮、真皮下(subdermal)、局部、黏膜、鼻、压至皮肤内、阴道内、子宫内、子宫颈内以及直肠。在本公开的一些实施方式中，鼻内给予途径包括鼻内滴剂。在本公开的一些实施方式中，鼻内给予途径包括鼻内气溶胶递送。在本公开的一些实施方式中，鼻内气溶胶传递包括鼻喷雾递送。
在实施本公开的方法时，向猪属动物给予有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。在给予的上下文中的术语“有效量”是指当给予猪属动物时足以激活猪属动物的免疫系统的分枝杆菌全细胞裂解物量。此量应不会在处理的猪属动物中产生不良事件或产生极少的不良事件。类似地，此量应不会导致或导致极少的毒性作用。如熟悉本领域的技术人员将会理解的，分枝杆菌全细胞裂解物的量将视许多因素而改变，包括，但不限于，经处理猪属动物的类型、猪属动物的年龄、体型、重量及一般身体状况以及给药方案。
在本公开的一些实施方式中，待递送给猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的有效量可以通过确定每公斤猪属动物体重的分枝杆菌全细胞裂解物的微克数来定量。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约0.00001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约1至约600μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约1至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约100至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约100至约300μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约1至约100μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约1至约75μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约1至约50μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开内容的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约1至约25μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每公斤猪属动物体重约25至约50μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
在本公开的一些实施方式中，待递送给猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的有效量可通过确定每毫升药用载体的分枝杆菌全细胞裂解物的微克数来定量。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约0.0001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约1至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约1至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约25至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开内容的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约400μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约250μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约300μg的分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约100至约400μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物在给予前是包含于多剂量瓶中。包含本公开的分枝杆菌全细胞裂解物的多剂量瓶可以由玻璃、塑料或其他材料制成。在一些实施方式中，多剂量瓶包括约1至约1000剂量的分枝杆菌全细胞裂解物。在一些实施方式中，多剂量瓶包括约1至约500剂量的分枝杆菌全细胞裂解物。在一些实施方式中，多剂量瓶包括约1至约250剂量的分枝杆菌全细胞裂解物。在一些实施方式中，多剂量瓶包括约1至约100剂量的分枝杆菌全细胞裂解物。在一些实施方式中，多剂量瓶包括约1至约50剂量的分枝杆菌全细胞裂解物。在一些实施方式中，多剂量瓶包括约1至约25剂量的分枝杆菌全细胞裂解物。
在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物作为多剂量方案给予。在本公开的一些实施方式中，多剂量方案是约7天的时段。在本公开的一些实施方式中，多剂量方案是约14天的时段。在本公开的一些实施方式中，多剂量方案是约一个月的时段。在本公开的一些实施方式中，多剂量方案是约两个月的时段。在本公开的一些实施方式中，多剂量方案是大约个月的时段。在本公开的一些实施方式中，多剂量方案是约四个月的时段。在本公开的一些实施方式中，多剂量方案是约五个月的时段。在本公开的一些实施方式中，多剂量方案是约六个月的时段。
在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物作为单一剂量给予。在本公开的又一实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物作为单一单位剂量给予。如本文所使用，术语“单位剂量”是预定量的分枝杆菌全细胞裂解物。分枝杆菌全细胞裂解物的量一般等于将给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的剂量或该剂量的便利的分数，例如，该剂量的一半或三分之一。根据本公开的方法，术语“单一剂量”及“单一单位剂量”包括其中组成物可作为单次给予及作为多次给予的实施方式。
在本公开的一些实施方式中，分枝杆菌全细胞裂解物作为在初次使用前经由水或其他水性介质还原的干粉末或颗粒提供。在一些实施方式中，以水或其他水性介质还原形成水悬浮液。在一些实施方式中，水悬浮液包含于如本文描述的多剂量瓶中且具有如本文描述的任何数目剂量的分枝杆菌全细胞裂解物。在一些实施方式中，水悬浮液如本文描述的作为单一剂量给予。在一些实施方式中，水悬浮液如本文描述的作为单一单位剂量给予。本领域普通技术人员理解的是，本公开设想利用任何尺寸、形状、体积等的干粉末或颗粒。本公开涵盖如于医药工业中所使用且由技术人员理解的“瓶中粉末”过程，包括其的任何变化。
在本公开的一些实施方式中，每剂量给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的体积是变化的。例如，用来给予分枝杆菌全细胞裂解物的给予途径及装置可以导致每剂量给予猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的体积的变化。在本公开的一些实施方式中，每剂量的体积是每剂量约0.001毫升至约50毫升。在本公开的一些实施方式中，每剂量的体积是每剂量约0.01毫升至约25毫升。在本公开的一些实施方式中，每剂量的体积是每剂量约0.1毫升至约10毫升。在本公开的一些实施方式中，每剂量的体积是每剂量约0.1毫升至约5毫升。在本公开的一些实施方式中，每剂量的体积是每剂量约1毫升至约5毫升。在本公开的一些实施方式中，每剂量的体积是每剂量约1毫升至约2毫升。在本公开的一些实施方式中，每剂量的体积是每剂量小于约1毫升。
本公开的方法利用猪属动物出生后的有效时段内向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物来激活猪属动物的免疫系统。如本文使用的，术语“有效时段”是指足够长以提供期望的给予来获得期望的激活结果的时段。在本公开的一些实施方式中，在猪属动物出生后立即至约1时龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约1时龄至约24时龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约24时龄至约1周龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约1周龄至约1月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约1月龄至约2月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约2月龄至约3月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约3月龄至约4月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约4月龄至约8月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约8月龄至约12月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约12月龄至约24月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约24月龄至约36月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。在本公开的一些实施方式中，在约36月龄至约48月龄向该猪属动物给予分枝杆菌全细胞裂解物。
在一些实施方式中，本公开的方法可以根据表1中示出的剂量鼻内给予猪属动物。
表1
周数：猪属动物的周龄
重量：猪属动物的重量
μg：：分枝杆菌WCL的μg
μg/kg：每kg猪属动物体重的分枝杆菌WCL的μg
μg/mL：每mL药用载体的分枝杆菌WCL的μg
在本公开的方法中利用的分枝杆菌全细胞裂解物可以可选地与一或多种药用载体组合。可以利用于本公开的方法中的药用载体的非限制性列表包括，但不限于，水或盐水、凝胶、膏剂、溶剂、油、稀释剂、流体软膏基质、脂质体、胶束、巨胶束、合成聚合物、乳液、由脂质制成的固体颗粒及其类似物。如技术人员所理解的，根据本公开可以利用领域中已知的任何稀释剂。在本公开的一些实施方式中，稀释剂是水溶性的。在本公开的一些实施方式中，稀释剂是不溶于水的。如本文所使用，术语“稀释剂”包括，但不限于，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、右旋糖、甘油、乙醇、醋酸钠或醋酸铵缓冲溶液或其类似物及其组合。
还涵盖了以下实施方式：
1.一种激活猪属动物的免疫系统的方法，该方法包括在猪属动物出生后的有效时段内向该猪属动物给予有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。
2.条款1的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物制备自耻垢分枝杆菌。
3.条款1或条款2的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过纯化。
4.条款1至3中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过分级。
5.条款1至4中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过去脂质。
6.条款1至5中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过去蛋白质。
7.条款1至6中任一项的方法，其中该给予选自由口腔、静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内、眼内、肺内、鼻内、经皮、真皮下、局部、黏膜、鼻、压至皮肤内、阴道内、子宫内、子宫颈内及直肠组成的组。
8.条款1至7中任一项的方法，其中该给予是黏膜。
9.条款1至8中任一项的方法，其中该给予是鼻内。
10.条款1至9中任一项的方法，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约0.0001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
11.条款1至10中任一项的方法，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
12.条款1至11中任一项的方法，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约100至约400μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
13.条款1至12中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为单一剂量给予。
14.条款1至13中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为单一单位剂量给予。
15.条款1至12中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为多剂量方案给予。
16.条款1至9中任一项的方法，其中每剂量的体积是每剂量约0.001毫升至约50毫升。
17.条款1至9中任一项的方法，其中每剂量的体积是每剂量约0.01毫升至约25毫升。
18.条款1至9中任一项的方法，其中每剂量的体积是每剂量约0.1毫升至约10毫升。
19.条款1至9中任一项的方法，其中每剂量的体积是每剂量约1毫升至约5毫升。
20.条款1至9中任一项的方法，其中每剂量的体积是每剂量约1毫升至约2毫升。
21.条款1至20中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在出生后立即至约1时龄该猪属动物。
22.条款1至20中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1时龄至约24时龄给予该猪属动物。
23.条款1至20中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约24时龄至约1周龄给予该猪属动物。
24.条款1至20中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1周龄至约1月龄给予该猪属动物。
25.条款1至20中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1月龄至约2月龄给予该猪属动物。
26.条款1至20中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约2月龄至约3月龄给予该猪属动物。
27.条款1至20中任一项的方法，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约3月龄至约4月龄给予该猪属动物。
28.条款1至27中任一项的方法，其中激活猪属动物的免疫是统包括激活白血球。
29.条款1至27中任一项的方法，其中激活猪属动物的免疫是统包括激活T细胞。
30.条款1至27中任一项的方法，其中激活猪属动物的免疫是统包括激活单核细胞。
31.条款1至27中任一项的方法，其中激活猪属动物的免疫是统包括激活巨噬细胞。
32.条款1至27中任一项的方法，其中激活猪属动物的免疫是统包括激活肺泡巨噬细胞。
33.条款1至28中任一项的方法，其中激活的白血球表现出响应于刺激增强的干扰素γ产生。
34.条款1至9中任一项的方法，其中分枝杆菌全细胞裂解物与药用载体组合。
35.条款1至34中任一项的方法，其中猪属动物是猪。
36.—种分枝杆菌全细胞裂解物，用于激活猪属动物的免疫系统，包括在猪属动物出生后的有效时段内向该猪属动物给予有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。
37.根据条款36使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物制备自耻垢分枝杆菌制备得。
38.根据条款36或条款37使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过纯化。
39.根据条款36至38中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过分级分离。
40.条款36至39中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过去脂质。
41.条款36至40中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过去蛋白质。
42.根据条款36至41中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该给予是选自由口腔、静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内、眼内、肺内、经皮、真皮下、局部、黏膜、鼻、及压至皮肤内组成的组。
43.根据条款36至42中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中给予是黏膜。
44.根据条款36至43中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中给予是鼻内。
45.根据条款36至44中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约0.0001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
46.根据条款36至45中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
47.根据条款36至46中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约100至约400μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
48.根据条款36至47中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为单一剂量给予。
49.根据条款36至48中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为单一单位剂量给予。
50.根据条款36至47中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为多剂量方案给予。
51.根据条款36至44中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中每剂量的体积是每剂量约0.001毫升至约50毫升。
52.根据条款36至44中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中每剂量的体积是每剂量约0.01毫升至约25毫升。
53.根据条款36至44中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中每剂量的体积是每剂量约0.1毫升至约10毫升。
54.根据条款36至44中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中每剂量的体积是每剂量约1毫升至约5毫升。
55.根据条款36至44中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中每剂量的体积是每剂量约1毫升至约2毫升。
56.根据条款36至55中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在出生后立即至约1时龄给予该猪属动物。
57.根据条款36至55中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1时龄至约24时龄给予该猪属动物。
58.根据条款36至55中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约24时龄至约1周龄给予该猪属动物。
59.根据条款36至55中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1周龄至约1月龄给予该猪属动物。
60.根据条款36至55中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1月龄至约2月龄给予该猪属动物。
61.根据条款36至55中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约2月龄至约3月龄给予该猪属动物。
62.根据条款36至55中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约3月龄至约4月龄给予该猪属动物。
63.根据条款36至62中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活白血球。
64.根据条款36至62中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活T细胞。
65.根据条款36至62中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活单核细胞。
66.根据条款36至62中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活巨噬细胞。
67.根据条款36至62中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活肺泡巨噬细胞。
68.根据条款36至63中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中激活的白血球表现出响应于刺激增强的干扰素γ产生。
69.根据条款36至44中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中分枝杆菌全细胞裂解物与药用载体组合。
70.根据条款36至69中任一项使用的分枝杆菌全细胞裂解物，其中猪属动物是猪。
71.分枝杆菌全细胞裂解物用于制造用于激活猪属动物的免疫系统的药剂的用途，包括在猪属动物出生后的有效时段内向该猪属动物给予有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。
72.条款71的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物制备自耻垢分枝杆菌。
73.条款71或条款72的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过纯化。
74.条款71至73中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过分离。
75.条款71至74中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过去脂质。
76.条款71至75中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物未经过去蛋白质。
77.条款71至76中任一项的用途，其中该给予选自由口腔、静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内、眼内、肺内、经皮、真皮下、局部、黏膜、鼻、及压至皮肤内组成的组。
78.条款71至77中任一项的用途，其中该给予是黏膜的。
79.条款71至78中任一项的用途，其中该给予是鼻内的。
80.条款71至79中任一项的用途，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约0.0001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
81.条款71至80中任一项的用途，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
82.条款71至81中任一项的用途，其中给予该猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约100至约400μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
83.条款71至82中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为单一剂量给予。
84.条款71至83中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为单一单位剂量给予。
85.条款71至82中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物作为多剂量方案给予。
86.条款71至79中任一项的用途，其中每剂量的体积是每剂量约0.001毫升至约50毫升。
87.条款71至79中任一项的用途，其中每剂量的体积是每剂量约0.01毫升至约25毫升。
88.条款71至79中任一项的用途，其中每剂量的体积是每剂量约0.1毫升至约10毫升。
89.条款71至79中任一项的用途，其中每剂量的体积是每剂量约1毫升至约5毫升。
90.条款71至79中任一项的用途，其中每剂量的体积是每剂量约1毫升至约2毫升。
91.条款71至90中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在出生后立即至约1时龄给予该猪属动物。
92.条款71至90中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1时龄至约24时龄给予该猪属动物。
93.条款71至90中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约24时龄至约1周龄给予该猪属动物。
94.条款71至90中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1周龄至约1月龄给予该猪属动物。
95.条款71至90中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约1月龄至约2月龄给予该猪属动物。
96.条款71至90中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约2月龄至约3月龄给予该猪属动物。
97.条款71至90中任一项的用途，其中该分枝杆菌全细胞裂解物在约3月龄至约4月龄给予该猪属动物。
98.条款71至97中任一项的用途，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活白血球。
99.条款71至97中任一项的用途，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活T细胞。
100.条款71至97中任一项的用途，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活单核细胞。
101.条款71至97中任一项的用途，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活巨噬细胞。
102.条款71至97中任一项的用途，其中激活猪属动物的免疫系统包括激活肺泡巨噬细胞。
103.条款71至98中任一项的用途，其中激活的白血球表现出响应于刺激增强的干扰素γ产生。
104.条款71至79中任一项的用途，其中分枝杆菌全细胞裂解物与药用载体组合。
105.条款71至104中任一项的用途，其中猪属动物是猪。
提供了分枝杆菌全细胞裂解物以及制备该分枝杆菌全细胞裂解物的方法的实例。通过以下产生种子储液(seed stock)：在Middlebrook7H9Broth及OADC(7H9+OADC)培养基中生长耻垢分枝杆菌，菌种名称mc2155(第一代)，以产生50至100个种子储液用来进一步处理，如储存冷冻的种子储液，用于未来的接种培养基。耻垢分枝杆菌mc2155的可商购来源是耻垢分枝杆菌(Trevisan)Lehmann and Neumann(700084TM)。适用于本公开的Middlebrook7H9Broth的可商购来源是BD(Becton,Dickinson,and Company)DifcoTMMiddlebrook7H9Broth。
如本领域普通技术人员知晓的，OADC是油酸、白蛋白、右旋糖及催化酶的缩写，其用于分枝杆菌属的培养基。OADC补充物包括表2中所示出的量的组分。
表2
| 组分 | 0.25L | 0.5L | 0.75L | 1L |
| 水(mL) | 237.5 | 475 | 712.5 | 950 |
| NaCl(g) | 2.025 | 4.05 | 6.075 | 8.1 |
| BSA(g) | 12.5 | 25 | 37.5 | 50 |
| D-葡萄糖(g) | 5 | 10 | 15 | 20 |
| 油酸钠(mL) | 7.5 | 15 | 22.5 | 30 |
通过首先基于表2中所提供的组分的量将NaCl在适当尺寸的容器中溶解于水中来制备OADC补充物。缓慢地添加BSA，并且搅拌该组合直至BSA溶解，其可能耗时至多一小时。将D-异构体葡萄糖(“D-葡萄糖”)添加至该组合。通过添加适量的NaOH将该组合的pH调整至7。在第二个容器中，制备油酸钠，并且其组分包括240毫升的水、4.8毫升的6M NaOH和4.8毫升的油酸。使组分升温至56℃并涡漩直至组分变为澄清溶液。将油酸钠溶液添加至OADC补充物。在通风橱中，将组合过滤至无菌瓶中。用铝箔覆盖瓶，储存于4℃下。
通过以表3中示出的量使用组分来制备7H9+OADC培养基。7H9培养基通过首先将甘油、培养基和水添加至经高温灭菌的锥形瓶中并混合这些组分来制备。将OADC补充物添加至组合，并混合该组合。在通风橱中，将培养基过滤至无菌瓶中。用铝箔覆盖瓶，储存于4℃下。
表3
| 组分 | 0.5L | 1L | 1.5L | 2L | 2.5L | 3L |
| 7H9(g) | 2.35 | 4.7 | 7.05 | 9.4 | 11.75 | 14.1 |
| OADC(mL) | 50 | 100 | 150 | 200 | 250 | 300 |
| 水(mL) | 450 | 900 | 1350 | 1800 | 2250 | 2700 |
| 甘油(mL) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
耻垢分枝杆菌mc2155的培养物可以使用耻垢分枝杆菌mc2155的第一代储液在7H9+OADC培养基或GAS培养基上生长。第一步骤是通过制备待使用的生长培养基(7H9或GAS)并将10毫升至50毫升的等份置于管中来开始培养。起始培养物通过快速解冻耻垢分枝杆菌种子培养物并将1毫升冷冻储液无菌转移至10毫升培养介质来接种。将培养管在37℃下培育24至72小时，直至分枝杆菌生长明显且稳固为止。
下一步骤是传代培养。在自冷冻储液开始后，通过移除生长中的分枝杆菌培养物并以总最终体积的10％添加至新鲜生长培养基来扩增培养物。例如，将10毫升生长中的种子添加至100毫升的新培养基。使新接种的培养物回复至在37℃下培育24至72小时。
下一步骤是最终培养。一旦在传代培养方法后达到分枝杆菌培养物的最终总体积，使生产发酵容器在37℃下在充气及混合下进行后接种72小时。
下一步骤是收获。将含有分枝杆菌的培养基从发酵容器移除并在3000rpm(2000xg)下离心15分钟，以使细胞形成团块。可替换地，可以使培养物静置10至15分钟，使得较重的分枝杆菌沉降至收集容器的底部。通过倒掉液体或由沉降/离心的团块的上方抽吸液体来移除上清流体。添加磷酸盐缓冲盐水至沉降/离心的团块，进而洗涤分枝杆菌。再次通过沉降/离心移除PBS，并在冷冻/溶解之前洗涤团块总共3次。
下一步骤是冷冻/裂解。可以将收集及洗涤的团块冷冻直至进一步处理，或者可以不经冷冻而立即处理团块。使团块悬浮于裂解缓冲液(具有8mM EDTA的PBS)、蛋白酶抑制剂、250ug/mL的脱氧核糖核酸酶和250ug/mL的核糖核酸酶中，以使每毫升裂解缓冲液包含2克(湿重)分枝杆菌。使用物理剪切力如声波处理、高压均质化或利用氧化锆珠的实验室规模均质化来使分枝杆菌细胞破裂。将细胞制剂添加至等体积的氧化锆/硅石珠(0.1mM)中且混合至多达30分钟。
下一步骤是澄清。在分枝杆菌细胞裂解后，通过使较大的珠及未破碎的细胞组分在容器中沉降来使物料再次澄清。也可使用离心来加速沉降。在澄清后，使所得物料过滤通过0.22微米过滤器并以等份在-20℃或更低温度下冷冻储存。
最终步骤是分析测试。测试最终冷冻物料的内毒素、TNF-α刺激能力、总蛋白质和无菌性。
本公开通过以下非限制性实施例来进一步描述。肺泡巨噬细胞(AMΦ)是在气道中维持免疫稳态的先天性免疫系统细胞的主要类型。不受限于任何理论，在发展针对呼吸病毒感染的获得性免疫反应中，认为由响应于微生物产物的AMΦ所产生的促炎性环境是关键的。为了测试耻垢分枝杆菌WCL在AMΦ中刺激促炎性反应的能力，可以进行研究来测量猪AMΦ对耻垢分枝杆菌WCL暴露的肿瘤坏死因子(TNF)-阿尔法(“TNF-α”)反应。此类型细胞的代表性取样是由猪AMΦZMAC细胞所组成。
TNF-α主要是源自巨噬细胞的细胞激素。其诱导NF-κB的信号转导、活化和转位，NF-κB作用为用于转活化许多涉及介导先天性宿主防御的细胞激素基因的“主开关”。连同其他促炎性细胞激素如INFγ及IL-12，TNF-α参与活化巨噬细胞及嗜中性粒细胞、扩增专业吞噬细胞依赖性功能以及引导细胞介导的免疫性。
猪肺泡巨噬细胞
猪AMΦD细胞系ZMAC-4可以源自猪胚胎的肺，并且由表达包括CD14、CD45、CD163和CD172的AMΦ的多种表面标记特征的吞噬细胞所组成。ZMAC细胞已经证实有效地支持PRRSV的生长。ZMAC细胞可以在含有l-麸胺酸(其可商购自许多来源，包括Mediatech，Herndon，VA，USA)且补充有10％胎牛血清(FBS)(其可商购自Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)、1mM丙酮酸钠和1x非必需胺基酸(其可商购自Mediatech及其他来源)的RPMI-1640培养基中培养并在5％CO2环境中维持于37℃下。维持ZMAC细胞还需要包含每毫升10纳克(ng/mL)的重组小鼠巨噬细胞群落刺激因子(“M-CSF”)(其可商购自Shenandoah Biotechnology，Inc.TM，Warwick，PA，USA)。
猪AMΦ的刺激
在48孔板(New York，USA)的各个孔中以5X10^5个细胞每毫升(细胞/mL)培养ZMAC细胞，并且随后使其暴露至模拟培养基，100ng/mL脂多醣(“LPS”)或5、1.67或0.56mcg/mL的来自耻垢分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚醣(LAM-MS；InvivoGen，SanDiego，CA)或将10、5、1.67或0.56mcg/mL的粗耻垢分枝杆菌WCL培养6小时、12小时或24小时。在这些时间点的其中一个，收获培养物上清液，并将其储存于-20℃下直至测试。
TNF-α的定量
通过使用特异性的酵连免疫吸附试验(“ELISA”)，对用来培养已经模拟处理或用LPS、纯化LAM或粗耻垢分枝杆菌WCL处理的猪肺泡巨噬细胞的培养基测定TNF-α的存在。为了检测TNF-α，将已在4℃下用50微升(μl)0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的每毫升32微克(μg/mL)的猪TNF-αMAb(克隆103304，其可商购自R&D systems，Minneapolis，MN，USA)涂覆16小时的NuncImmulon 4HBX 96孔板(Thermo Fisher Scientific)的各个孔用含有0.05％Tween20的PBS(PBS-T)洗涤3次，并且用封闭溶液(PBS-T中的1％BSA)在RT下温育1小时。在用PBS-T洗涤三次后，将50μl的培养物上清液及稀释于RPMI完整培养基中的TNF-α标准物(R&D systems)添加至复制孔，并在RT下留置2小时。在用PBS-T洗涤5次后，各孔用50μl的含有2.5μg/mL生物素标记的猪TNF-αMab(克隆103302，其可商购自R&D systems)和0.5％的BSA封闭溶液的PBS-T在RT下温育1.5小时。在用PBS-T洗涤5次后，各孔用50μl的含有20ng/mL HRP结合的链霉亲和素(其可商购自Thermo Fisher Scientific)的PBS-T在RT下温育20分钟，然后再次用PBS-T洗涤5次。在RT下通过添加每孔100μl的TMB基质(其可商购自KPL，Gaithersburg，MD，US)开始显色，并且使用100μl的1M磷酸终止。利用PlusMicroplate Reader(其可商购自Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)在450nm下测定光学密度。对结果进行平均，并通过与由利用已知量的TNF-α获得的值所产生的标准曲线比较来确定TNF-α的量。
实施例1
通过用耻垢分枝杆菌WCL刺激的猪AMΦ显著产生TNF-α
已经在之前的硏究中显示出ZMAC细胞响应于LPS产生TNF-α的能力。为了测试耻垢分枝杆菌WCL的免疫刺激活性，使ZMAC细胞暴露至在对分枝杆菌培养物优化的7H9培养液中生长的耻垢分枝杆菌WCL。开始使用高浓度的10ug/mL的耻垢分枝杆菌来刺激细胞12及24小时。如图1所示，结果表明了相较于当使猪AMΦZMAC暴露至细菌产物脂多醣(LPS)(其是TNF-α产生的强效刺激剂)时的TNF-α的较低产生，当使猪肺泡巨噬细胞(AMΦ)ZMAC暴露至耻垢分枝杆菌WCL时的肿瘤坏死因子(TNF)-α的爆发产生。
实施例2
通过AMΦ响应于耻垢分枝杆菌WCL的大部分TNF-α产生在刺激之后的前6小时内发
生
虽然之前实验的数据显示刺激后的12小时产生显著量的TNF-α，但似乎在12小时至24小时的时段期间未进一步产生此细胞激素。此发现使得本公开的发明人质疑TNF-α对耻垢分枝杆菌WCL的反应是否类似于已对此细胞激素对LPS刺激的反应所观察到的类似表达动力学，其通常于刺激后的4-6小时内达到峰值。因此，设置时间分析来建立响应于耻垢分枝杆菌WCL的刺激的TNF-α产生动力学。在此实验中，本公开的发明人还包括制备自相同的耻垢分枝杆菌但在不同培养液类型中培养的两种其他WCL。如图2所示，此时间分析的结果证实，大部分的TNF-α表达活性是在刺激后的6小时内发生，并且此表达动力学对所有三种测试的耻垢分枝杆菌WCL制剂的反应类似。巨噬细胞对三种不同WCL制剂的TNF-α反应的类似动力学及强度相似，且这些结果表明，所有三种制剂就其刺激巨噬细胞产生TNF-α的能力而言具有类似的组成。
实施例3
用于生长耻垢分枝杆菌的培养介质影响WCL的TNF-α诱导能力
尽管表达动力学与耻垢分枝杆菌的生长条件无关，但注意到最大TNF-α反应与如图2中所示的裂解物制剂不同。这些结果表明，用于生长耻垢分枝杆菌的培养基可能会影响WCL诱导AMΦ细胞的TNF-α反应的效力。为了测试此理论，在效力分析中建立各WCL的剂量反应曲线。如图3所示，虽然结果指示所有三种裂解物都能够诱导AMΦ的良好的TNF-α反应，但效力的解释因所产生TNF-α总量的些微差异而变得复杂。在此研究中，例如，图3示出了由在NB培养液中生长的耻垢分枝杆菌制备的裂解物产生最低的半有效剂量(ec50＝1.2ug/mL)，表明此裂解物的较大效力。然而，可以理解的是，由该裂解物引起的最大反应是由制备自在7H9或GAS培养液中生长的耻垢分枝杆菌的WCL所引起的那些反应的约80％。
通过排除制备自NB培养液的裂解物，去除了效力的复杂的解释。根据此分析，合理地作出了如下推论：制备自在7H9培养基中生长的耻垢分枝杆菌的裂解物比制备自在GAS培养基中生长的细菌的耻垢分枝杆菌略微更有效力。因此，如图3所示，此研究表明，耻垢分枝杆菌WCL提取物的效力(如由50％有效剂量所指示的)可以受到用来培养耻垢分枝杆菌以制备用来制备WCL的细菌细胞物质的生长介质的类型所影响。在所测试的三种不同培养基中，GAS培养基似乎为最佳，具有4.79mcg/mL的50％有效剂量，其次为7H9培养基，具有3.19mcg/mL的50％有效剂量，随后为NB培养基，具有1.2mcg/mL的50％有效剂量。
实施例4
耻垢分枝杆菌WCL较纯化的分枝杆菌细胞壁组分LAM-MS引起明显更大的TNF-α反
应
已知分枝杆菌细胞壁的若干组分具有免疫刺激活性，其包括例如胞壁酰二肽(MDP)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)及分枝杆菌细胞壁脂阿拉伯甘露聚醣(“LAM”)。已知源自分枝杆菌的LAM(其由所有分枝杆菌种类表达)通过结合存于分枝杆菌细胞中的toll样受体(TLR)-2而活化巨噬细胞。
LAM是最具特征的分枝杆菌细胞壁组分，已知其经由TLR2路径诱导包括TNF-α的促炎性细胞激素产生。此研究比较ZMAC细胞响应于由耻垢分枝杆菌WCL的刺激相对于由纯化自耻垢分枝杆菌的LAM(“LAM-MS”)的刺激的TNF-α反应。
在耻垢分枝杆菌WCL与分枝杆菌LAM-MS的相同刺激浓度下，由ZMAC细胞响应于用耻垢分枝杆菌WCL的刺激所产生的TNF-α的观察量比由相同的细胞响应于用可商购的LAM-MS(InVivoGen)的刺激所产生的TNF-α的量高约四倍，其在图4中示出。由于耻垢分枝杆菌的LAM仅是耻垢分枝杆菌WCL的一部分，这些结果表明，耻垢分枝杆菌的除LAM之外的其他组分可能会通过存于耻垢分枝杆菌WCL中的组分的复杂混合物之间的加成且可能增效的机制促进TNF-α产生。
实施例5
耻垢分枝杆菌WCL相较于去蛋白质和去脂质的分枝杆菌细胞壁提取物(MCWE)引起
明显更大的TNF-α反应
将ZMAC细胞响应于用耻垢分枝杆菌WCL的刺激的TNF-α反应利用Equimune I.V.(可商购自Bioniche Animal Health USA,Inc.(Athens,Georgia)的市售产品，具有美国兽医执照号289)的刺激作比较。Equimime I.V.产品也由到期的美国专利第4,744,984号所涵盖。Equimime I.V.是一种已经由草分枝杆菌提取的纯化分枝杆菌细胞壁的乳液。由于在市售产品中未指示出细胞壁提取物的浓度，测试一系列稀释液的刺激通过ZMAC细胞产生TNF-α的能力。此实验的结果在图4中示出。虽然由于不知晓Equimune I.V.产品中细菌提取物的量而无法直接比较Equimune I.V.与耻垢分枝杆菌WCL的效力，但显而易见的是，少至1.67μg/mL的耻垢分枝杆菌WCL刺激了比Equimune I.V.更强的TNF-α反应。因此，这些结果表明，相较于给予可能仅具有细胞壁组分的Equimune I.V.，给予包括分枝杆菌包膜的结构组分的分枝杆菌全细胞裂解物对ZMAC细胞具有加成且可能增效的作用。
实施例6
向猪给予耻垢分枝杆菌WCL导致猪的免疫系统的刺激
进行概念研究的论证来评估耻垢分枝杆菌WCL对猪的免疫学作用。基本研究设计在表4中示出。
表4
基本设计方案
将16只猪随机地指派至2组的8只猪中并用耳标标识。将猪一起混杂于一个围栏中或位于相同生产设施中的不超过2个围栏中。如表4中所述的来处理猪。在整个研究期间内将猪圈养于生产设施中。所有猪的硏究在生产设施处进行。在完成研究时，使猪回到其畜群来正常地进行例行整理及加工。在处理当天早晨的处理后的12-18小时间及在处理后3天收集血液。
提出的计划如下。在第0天早晨时，随机地选择猪来进行研究、标记和抽血。在收集后立刻将血液送至Champaign，Illinois的Aptimmune Biologies Inc.。将血液储存于环境温度下。在第0天下午，将耳标编号送至Aptimmune Biologies,Inc.，以将猪随机指派至研究组A和B。若使用了两个围栏，则在两个围栏间随机地分配猪。在第0天下午，向每组指派各8只猪给予处理A和B(目标在3至5PM完成处理)。在第1天清晨，在当天尽可能早地对所有猪抽血，目标是在处理后的12-18小时。将所有血液样本送至Aptimmune Biologies,Inc.，并储存于环境温度下。在第3天早晨，在早晨对所有猪抽血并尽可能快速地在环境温度下将血液送至Aptimmune Biologies,Inc.。
分析测试方案
从每只猪收集1x 10mL全血样本，收集至含有肝素的管中来防止凝结，并用耳标号及日期标识。收集经肝素处理的血液并分析(1)TNF-α刺激；(2)自然杀伤亚群；以及(3)B细胞亚群。将测试样本送至Aptimmune Biologies,Inc.并立即处理。
活动安排
在第0天早晨，将16头猪标记独特编号的标签，以登录在研究中。不使用不健康的动物。当标记动物时，将10毫升血液样本收集至肝素管(绿色顶盖)中。将各管标记上动物编号及样本收集日期。在未填充任何冰块的冷却器中(保持于避光环境下)，将血液样本送至Aptimnnme Biologies,Inc.。
在第0天下午，依照猪到A组或B组的随机指派，用1毫升处理剂经鼻内对猪进行处理。将所有动物置于相同围栏内，或者如果分配于2个围栏间，则将每组的4头处理的动物随机地分配至2个围栏中的一个。在未填充任何冰块的冷却器中(保持于避光环境下)，将血液样本送至Aptimnnme Biologies,Inc.。
在第1天早晨(目标是处理后的12-18小时)，观察研究猪的总体健康状况并记录任何不寻常的观察(如果检测到的话)。将10毫升血液样本收集至肝素管(绿色顶盖)中。将各管标记上动物编号及样本收集日期。在未填充任何冰块的冷却器中(保持于避光环境下)，将血液样本送至Aptimnnme Biologies,Inc.。
在第3天早晨，观察研究猪的总体健康状况并记录任何不寻常的观察(如果检测到的话)。将10毫升血液样本收集至肝素管(绿色顶盖)中。将各管标记上动物编号及样本收集日期。在未填充任何冰块的冷却器中(保持于避光环境下)，将血液样本送至AptimnnmeBiologies,Inc.。
结果/分析
TNF-α刺激的数据和结果示出于表5及图5中。数据以TNF-α的纳克/毫升示出。
表5
| 第0天 | 第1天 | 第3天 | |
| A | 0.521125 | 0.81675 | 0.955875 |
| B | 1.0475 | 1.4605 | 1.493 |
观察到B组中的TNF-α刺激相较于A组增加。结果表明，B组中的耻垢分枝杆菌WCL组分在经暴露的猪中影响TNF-α的输出。
自然杀伤亚群的数据及结果示出于表6及图6中。数据以外周血单核细胞(PBMC)群体的百分比(％)示出。
表6
| 第0天 | 第1天 | 第3天 | |
| A | 5.87375 | 5.1925 | 3.585 |
| B | 7.00375 | 7.57 | 3.8225 |
在第1天观察到B组中自然杀伤亚群的增加。虽然不希望受限于任何理论，但可以假定，在B组中响应于耻垢分枝杆菌WCL组分的接种发生全身性免疫刺激作用。
B细胞亚群的数据及结果示出于表7及图7中。数据以PBMC群体的百分比(％)示出。
表7
| 第0天 | 第1天 | 第3天 | |
| A | 30.9025 | 31.0375 | 28.54375 |
| B | 31.94 | 36.61125 | 36.19375 |
在第1天观察到B组中的B细胞亚群相较于A组的增加。
虽然上文已经公开了实施方式，但是本发明不限于所公开的实施方式。相反，本申请旨在涵盖本发明的使用其一般原理的任何变型、用途或改造。此外，本申请旨在覆盖处于本发明所属领域中的已知或惯常实践内且落入所附权利要求的范围内的本公开的这些偏离。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种激活猪属动物的免疫系统的方法，所述方法包括在所述猪属动物出生后的有效时段内给予所述猪属动物有效量的包含分枝杆菌全细胞裂解物但不含任何能够导致病原体特异性免疫反应的疫苗组分的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物由耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)制备。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物未经过纯化。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物是未分级分离的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物是未去脂质的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物是未去蛋白质的。
7.根据权利要求所述的方法，其中，所述给予选自由口腔、静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内、眼内、肺内、鼻内、经皮、真皮下、局部、黏膜、鼻、压至皮肤内、阴道内、子宫内、子宫颈内和直肠组成的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述给予是黏膜的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述给予是鼻内的。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物进一步包含药用载体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每kg猪属动物体重约0.00001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每kg猪属动物体重约1至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每kg猪属动物体重约1至约250μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每kg猪属动物体重约1至约125μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约0.0001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约1至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约300μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物作为单一剂量给予。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物作为单一单位剂量给予。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物作为多剂量方案给予。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约0.001至约50毫升。
23.根据权利要求1所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约0.01至约25毫升。
24.根据权利要求1所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约0.1至约10毫升。
25.根据权利要求1所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约1至约5毫升。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约1至约2毫升。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在出生后立即至约1时龄给予所述猪属动物。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在约1时龄至约24时龄给予所述猪属动物。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在约24时龄至约1周龄给予所述猪属动物。
30.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在约1周龄至约1月龄给予所述猪属动物。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在约1月龄至约2月龄给予所述猪属动物。
32.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在约2月龄至约3月龄给予所述猪属动物。
33.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物在约3月龄至约4月龄给予所述猪属动物。
34.根据权利要求1所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活白血球。
35.根据权利要求1所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活T细胞。
36.根据权利要求1所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活单核细胞。
37.根据权利要求1所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活巨噬细胞。
38.根据权利要求1所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活肺泡巨噬细胞。
39.根据权利要求1所述的方法，其中，激活的肺泡巨噬细胞表现出响应于刺激增强的TNF-α产生。
40.根据权利要求1所述的方法，其中，所述猪属动物是猪。
Claims (40)
1.一种激活猪属动物的免疫系统的方法，所述方法包括在所述猪属动物出生后的有效时段内给予所述猪属动物有效量的分枝杆菌全细胞裂解物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物由耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)制备。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物未经过纯化。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物是未分级分离的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物是未去脂质的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物是未去蛋白质的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述给予选自由口腔、静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内、眼内、肺内、鼻内、经皮、真皮下、局部、黏膜、鼻、压至皮肤内、阴道内、子宫内、子宫颈内和直肠组成的组。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述给予是黏膜的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述给予是鼻内的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物与药用载体组合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每kg猪属动物体重约0.00001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每kg猪属动物体重约1至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每kg猪属动物体重约1至约250μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每kg猪属动物体重约1至约125μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约0.0001至约1000μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
16.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约1至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
17.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约500μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
18.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，给予所述猪属动物的分枝杆菌全细胞裂解物的量是每剂量每毫升药用载体约50至约300μg的分枝杆菌全细胞裂解物。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物作为单一剂量给予。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物作为单一单位剂量给予。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物作为多剂量方案给予。
22.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约0.001至约50毫升。
23.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约0.01至约25毫升。
24.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约0.1至约10毫升。
25.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约1至约5毫升。
26.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，每剂量体积是每剂量约1至约2毫升。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物在出生后立即至约1时龄给予所述猪属动物。
28.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物在约1时龄至约24时龄给予所述猪属动物。
29.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物在约24时龄至约1周龄给予所述猪属动物。
30.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物在约1周龄至约1月龄给予所述猪属动物。
31.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物在约1月龄至约2月龄给予所述猪属动物。
32.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物在约2月龄至约3月龄给予所述猪属动物。
33.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述分枝杆菌全细胞裂解物在约3月龄至约4月龄给予所述猪属动物。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活白血球。
35.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活T细胞。
36.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活单核细胞。
37.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活巨噬细胞。
38.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中，激活猪属动物的免疫系统包括激活肺泡巨噬细胞。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中，激活的肺泡巨噬细胞表现出响应于刺激增强的TNF-α产生。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中，所述猪属动物是猪。
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