CN109078177B - 一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用 - Google Patents

一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109078177B
CN109078177B CN201810902885.2A CN201810902885A CN109078177B CN 109078177 B CN109078177 B CN 109078177B CN 201810902885 A CN201810902885 A CN 201810902885A CN 109078177 B CN109078177 B CN 109078177B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tuberculosis
vaccine
mycobacterium
protein
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810902885.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109078177A (zh
Inventor
张凯
程琛舒
钟再新
倪兰芳
吴德兰
沈煜
陈伟
韦芬
江秋虹
仇晶晶
朱银猛
梁永培
程兴
徐守腾
蒲江
卢锦标
都伟欣
王国治
徐苗
陶立峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co ltd
Chongqing Zhifei Biological Products Co Ltd
Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
National Institutes for Food and Drug Control
Original Assignee
Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co ltd
Chongqing Zhifei Biological Products Co Ltd
Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
National Institutes for Food and Drug Control
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co ltd, Chongqing Zhifei Biological Products Co Ltd, Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd, National Institutes for Food and Drug Control filed Critical Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN201810902885.2A priority Critical patent/CN109078177B/zh
Publication of CN109078177A publication Critical patent/CN109078177A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109078177B publication Critical patent/CN109078177B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用，属于治疗结核病潜伏感染药物领域。针对现有亚单位疫苗治疗结核菌潜伏感染人群无效或效果差、使用佐剂种类多、存在超敏反应及Koch反应风险问题，本发明提供了一种含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗，其包含Ag85b蛋白、ESAT6‑CFP10蛋白和母牛分枝杆菌菌体提取物。本发明的含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗用于治疗潜伏性结核感染，效果显著，同时只有一种佐剂，不存在超敏反应及Koch反应的风险。

Description

一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用
技术领域
本发明属于治疗结核病潜伏感染药物领域，具体地说，涉及一种含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗及其制备方法和应用、一种预防结核病联合用药物及应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的呼吸道传播为主的慢性传染病，它曾经严重危害着人类健康。自发现病原体以来，已开发出卡介苗用于结核病的治疗和预防及多种抗结核药物。但由于耐药菌株的出现以及卡介苗免疫效果的自身局限性，结核病并未得到有效控制，20世纪80年代中期以来，结核病疫情在世界范围内出现大幅度回升，其发病和流行仍是当今全球最为主要的公共卫生问题之一。
结核病的控制必须依靠有效的预防性疫苗。我国结核疫苗研究正由早期单一寻找优于BCG的替代疫苗，逐渐过渡到针对BCG本身的缺陷以及我国的疫情状况与不同人群的预防需求、研究不同用途类型的结核疫苗。针对卡介苗丢失部分结核杆菌有效抗原研究重组卡介苗用于BCG初免用疫苗、针对卡介苗免疫保护周期短研制BCG初免后加强型疫苗、针对卡介苗对已经感染人群无效的缺陷研究结核菌潜伏感染人群预防用治疗型疫苗(卢锦标，赵爱华，王国治等，对我国结核病免疫预防策略的探讨[J]，中国防痨杂志，2014，36(11)：927-929)，这也是当前国际结核疫苗研究的方向。
初免用新型结核疫苗研制的失败，研究表明控制结核病疫情，必须针对不同的人群实施不同免疫预防策略(卢锦标，赵爱华，王国治等，对我国结核病免疫预防策略的探讨[J]，中国防痨杂志，2014，36(11)：927-929)。通常传染性疾病的免疫预防主要针对未感染人群，而新型结核病疫苗的接种对象分为三类人群：(1)未接种过卡介苗或卡介苗接种后阴转的未感染人群；(2)卡介苗接种后维持阳性的未感染人群；(3)结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)潜伏感染者。因此，结核病免疫预防体系的核心要素是：通过对接种人群进行Mtb感染与BCG接种效果的筛查，对未接种BCG或BCG接种后阴性人群、BCG接种后依然维持阳性人群及Mtb潜伏感染人群应该分别采用不同的免疫预防措施预防结核病。
潜伏性结核感染是宿主感染结核杆菌后尚未发病的一种特殊状态，潜伏性结核感染者的临床表现为皮肤结核菌素试验阳性而无活动性结核。由于大多数活动性结核是潜伏感染的结核杆菌重新被激活所致，潜伏性结核感染者已经成为结核患者的重要来源。2016年世界卫生组织(WHO)在制定结核病预防策略中首次将潜伏性结核感染者的预防列为策略重点。
WTO推荐的潜伏性结核感染的治疗方案有服用6个月异烟肼或9个月的异烟肼或三个月每周规则服用利福喷汀加异烟肼或3～4个月的异烟肼加利福平，或3～4个月仅利福平。上述治疗方案有众多的不足之处：①具有明显的毒副作用，常有呕吐症状出现，对肝功能有损伤；服药过程需抽血进行肝功能检测2～3次；②服用疗程长，服用者往往难以坚持，预防过程中要严格执行DOTS(Directly Observed Treatment Short-Course的缩写，简称为督导短程化疗)程序，不利于操作；疗程长，漏服率高达30％，化学药物的预防性治疗因依从性差往往使得服用者难以坚持，不容易推广普及；③易诱导产生耐药性，耐药菌株的出现还使得化学药物的预防性治疗可能无效且不适用于非PPD强阳性的高危人群预防用药。
目前国内外研制成功的唯一的结核病疫苗——卡介苗(BCG)被列为我国计划免疫疫苗，在新生儿中广泛接种。卡介苗对婴幼儿重型结核病有显著预防效果，但对全人群的总体保护效果不佳，主要体现在两大方面：一是BCG保护效果差、有效保护时间短、对成人肺结核的保护效率差别很大(0％-80％)(Tyagi,AnilK,et al.Development of vaccinesagainst tuberculosis[J].Tuberculosis,2011,91(5):469-478)；表现在新生儿接种BCG后15年内的免疫保护力约为82％，15-24岁人群降至67％，25岁以上人群则降至20％左右，即免疫保护力会随着年龄的增大而下降，对学龄儿童或成人再次接种卡介苗并不能提高其免疫保护力。二是BCG对预防原发性结核病有效，对已感染结核分枝杆菌的患者几乎无预防作用(Brandt L,Feino Cunba J,et al.Failure of the Mycobacterium bovis BCGvaccine:some species of environmental mycobacteria block multiplication ofBCG and induction of protective immunity to tuberculosis[J].Infect Immun,2002,70(2):672-678)。
《2017年全球结核病报告》显示十多个结核病疫苗处于I、II、III期临床研究中，主要有3类：病毒载体疫苗、分枝杆菌类疫苗、亚单位蛋白疫苗。其中病毒载体疫苗主要处于临床Ⅰ期(安全性评价阶段)，分枝杆菌类疫苗、亚单位蛋白疫苗大多数处于临床Ⅱ、Ⅲ期阶段。其中亚单位蛋白疫苗是研究重点。
亚单位疫苗所用的抗原多为结核杆菌保护性抗原，主要包括结核杆菌分泌蛋白(多由RD1区基因编码)和细胞壁蛋白。采用几个保护性抗原或抗原表位组成亚单位疫苗，所引起的保护性免疫应答也高度集中；几种主要的候选疫苗均采用了将单抗原与多聚蛋白融合的方法，这样不仅增强了单抗原的免疫力，也易于进行规模生产。另外，亚单位疫苗安全性好，但须与佐剂联用才能有效。已有若干个亚单位疫苗已通过小鼠和豚鼠的初步药效学评价和部分安全性评价，并显示出对结核病有较好的保护效果。
对潜伏性结核感染者接种疫苗时，存在Koch反应的副作用风险。
1890年，在世界医学大会上，Robert Koch报道制备了可完全治愈豚鼠晚期结核病的结核杆菌培养滤液(后称为旧结核菌素)，但其后用于治疗人类结核病时出现“科赫现象”(Koch phenomenon)，许多患者治疗后临床症状恶化，少数患者死亡。学者认为“科赫现象”生产原因是机体对初次感染结核时，机体产生免疫反应，致敏淋巴球和吞噬细胞将结核菌局限形成结核结节，并目逐渐愈合或成为钙化点。当再感染结核菌时，由于有免疫力的存在，有可能不发病，或如感染量大，也可能再度激活免疫淋巴细胞，就可以使局部组织在3～5日内发生剧烈反应，如充血水肿、淋巴细胞和单核细胞增加，全身发热等反应。这种再感染后的超敏反应亦即所谓“Koch反应”。
美国肺结核研究专家Ian Orme等在对伦敦的国家药物研究所研发的DNA疫苗进行疫苗效力评价时发现，该疫苗对未感染动物免疫接种后预防结核病是非常安全的，而用于已经感染结核杆菌的动物时，诱发动物肺部产生许多环状的溃烂病灶，动物死于Koch反应。Ian Orme教授认为当结核杆菌潜伏感染动物再次接触结核杆菌抗原时，可能产生有害病理变化的Koch反应，他对用于结核杆菌暴露后疫苗的安全性问题提出了警告，因此用于潜伏感染人群的疫苗，除了考虑其必须有强的诱导机体清除胞内结核杆菌的能力外，还应考虑疫苗免疫原性过强导致的免疫损伤问题。
中国专利，申请号CN2013102733939，公开日2017-02-08，一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗，其公开了一种疫苗，该疫苗含Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白为抗原成份，以铝和PolyIC为复合佐剂。
中国专利，申请号CN2014101945592，公开日2014-05-09，一种增强型结核亚单位疫苗，其公开了一种疫苗，该疫苗含结核分枝杆菌抗原Ag85b蛋白、重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白、BCG-CpG佐剂、铝佐剂以及PolyIC佐剂。
中国专利，申请号CN2013102733939，中国专利，申请号CN2014101945592，以上两种专利，使用了两种及两种以上的单一成分佐剂，制剂配方复杂，治疗效果有待提升，治疗周期长。其中，铝盐佐剂会增加超敏反应的危险，对巨噬细胞有毒害作用，在超过一定的使用剂量后，铝盐的佐剂效用会降低，此外，铝盐佐剂不能采用低温冻干技术生产，也不能冷冻保存，这些限制了含有铝盐佐剂疫苗的保质期。另外，佐剂的安全性需要进一步验证。
综上所述，现有亚单位疫苗治疗结核菌潜伏感染人群无效或效果差，使用佐剂种类多，存在超敏反应，Koch反应的副作用风险的缺陷。
发明内容
1、要解决的问题
针对现有亚单位疫苗治疗结核菌潜伏感染人群无效或效果差、使用佐剂种类多、存在超敏反应及Koch反应风险问题，本发明提供了一种含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗。本发明的含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗用于治疗潜伏性结核感染，效果显著，同时只有一种佐剂，不存在超敏反应及Koch反应的风险。同时本发明还提供了一种含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗的制备方法及应用、一种预防结核病联合用药物及应用。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
结核病防治的机理，就是通过刺激机体的免疫应答，预防或者清除体内的结核分枝杆菌，达到防治结核病的目的。
结核杆菌潜伏感染人群已经过Mtb致敏，当再次接触Mtb抗原时，比如疫苗接种，可能产生有害病理变化的Koch反应，因此对Mtb潜伏感染人群采用潜伏感染类疫苗评价时，除了考虑其应有较强的诱导机体清除胞内Mtb的能力外，还应考虑疫苗免疫原性过强可能导致的免疫损伤。Mtb为结核分枝杆菌。
由于亚单位结核疫苗的有效保护性抗原分子小、纯化程度高、免疫原性较差等特点，因此需要安全有效的佐剂来增强疫苗的效力。由于重组结核杆菌蛋白制成的亚单位疫苗可用于加强免疫与潜伏感染人群的预防，是结核病新疫苗研究的热点与重点；高效的亚单位疫苗是由高免疫原性的抗原与强免疫刺激功能的佐剂联合来实现。在目前已经批准或即将批准进入临床研究的重组类疫苗抗原基本都采用具有强免疫活性的Ag85和卡介苗中丢失的RD1区的蛋白。近十年来在疫苗研究没有突破性进展的前提下，各国之间的结核病亚单位疫苗核心技术竞争是佐剂技术的竞争。
由于亚单位疫苗中的蛋白主要作为外来抗原，可被细胞识别，引起体液免疫反应，但是由于抗原很难被主要组织相容类分子所识别提呈，所以作为抗原的蛋白质进入体内后很难诱导出强的细胞应答反应，要想解决这一问题，就必须和佐剂进行联合使用。而佐剂的选择是亚单位疫苗的关键。
目前国内外研究的佐剂很多，但能进入临床研究的很少，主要原因是佐剂的副反应大，无法确定其安全性是制约佐剂的一个重要因素。
本发明是以重组大肠杆菌表达的结核杆菌Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10蛋白作为有效抗原成分，佐以与结核分枝杆菌相同种属来源的母牛分枝杆菌菌体提取物，与其它非特异性佐剂，如铝盐佐剂、MF59佐剂相比具有更好的免疫原性、清除结核杆菌的能力更强，因而用于结核杆菌潜伏感染者进行结核病的预防。将目前国际上预防结核新疫苗类型中重组蛋白联合佐剂的亚单位疫苗和非结核分枝杆菌灭活菌体疫苗优势联合，兼具两种疫苗优势。
分枝杆菌菌体组分疫苗富含有细胞壁为主的强佐剂成分、以蛋白为主的细胞因子诱导物质以及具有强效免疫刺激活性的CpG DNA，具有双向免疫调节功能：能够促进染菌小鼠天然免疫细胞尤其是γδT细胞和NK细胞比例上升和Th1细胞合成分泌γ-干扰素，从而激活巨噬细胞产生过氧化氢和一氧化氮，增强其杀灭结核杆菌的能力，促进T淋巴细胞增殖反应；同时由于具有和结核分枝杆菌相同的种属来源减轻结核杆菌引起的病理性免疫反应，可明显抑制结核杆菌感染豚鼠反应，抑制或杀死结核杆菌感染动物体内的结核杆菌，减轻脏器病变程度、降低病理指数；对免疫功能低下小鼠淋巴细胞转化、巨噬细胞吞噬功能具有明显增强作用。这类疫苗安全性好，临床试验证实对结核病患者有辅助治疗作用，具有良好的免疫调节作用，可用于结核病潜伏感染者的预防。
而母牛分枝杆菌提取物就属于分枝杆菌菌体组分疫苗，来源于母牛分枝杆菌，该菌种与结核分枝杆菌来源于同一纲、目、科、属，具有相同的结核杆菌特异性抗原蛋白，母牛分枝杆菌提取物中含有蛋白、多糖、核酸等多种混合成分，吴高达(吴高达，叶建华.5104人次微卡菌苗安全性的临床观察[J].临床肺科杂志,2004,9(2):193)等经过5104人次的临床观察，该提取物的副反应率仅为0.137％，副反应较少见，且较轻微。临床试验证实该提取物的安全性好，对结核病患者有辅助治疗作用，具有良好的免疫调节作用。同时母牛分枝杆菌提取物具有一定的佐剂效用。
中国专利，申请号CN2014101945592，治疗结核菌潜伏感染的方案为：以BCG-CpG、Al(OH)3、PolyIC为佐剂，佐剂为3种，共注射6针，每针间隔2周，末次免疫后1周后解剖，分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。疫苗治疗时间为10周。详见该专利申请文件0061～0081段，实施例2。
中国专利，申请号CN2013102733939，治疗结核菌潜伏感染的方案为：以Al(OH)3和PolyIC为复合佐剂，佐剂有2种，共注射6针，每针间隔2周，末次免疫后1周后解剖，分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。疫苗治疗时间为10周。详见该专利申请文件0058～0069段，实施例3。
本发明疫苗的佐剂成分为不含铝盐佐剂的母牛分枝杆菌提取物，该提取物含有蛋白、多糖、核酸等多种混合成分，具有结核杆菌相同的特异性抗原蛋白和佐剂效用。本发明治疗结核菌潜伏感染的方案为：本发明的疫苗共注射6针，每针间隔1周，末次免疫后3周后解剖，分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量，本发明的疫苗治疗时间为5周，与申请号CN2014101945592、申请号CN2013102733939相比，疫苗治疗时间大大减少，减少了5周，且治疗效果显著，治疗效果见实施例中的相关数据。
进一步的，与申请号CN2014101945592、申请号CN2013102733939相比，本发明的佐剂，在本疫苗中的重量比例，大大减小，且不含铝盐成分，降低了铝对人体的伤害。尤其对于潜伏感染者，先进行化疗药物进行干预治疗2～4周后，再使用本发明的结核病疫苗进行治疗模式，则可以显著降低Koch反应风险。
WTO推荐的潜伏性结核感染的治疗方案有服用6个月异烟肼或9个月的异烟肼或三个月每周规则服用利福喷汀加异烟肼或3～4个月的异烟肼加利福平，或3～4个月仅利福平。上述治疗方案有众多的不足之处：①具有明显的毒副作用，常有呕吐症状出现，对肝功能有损伤；服药过程需抽血进行肝功能检测2～3次；②服用疗程长，服用者往往难以坚持，预防过程中要严格执行DOTS(Directly Observed Treatment Short-Course的缩写，简称为督导短程化疗)程序，不利于操作；疗程长，漏服率高达30％，化学药物的预防性治疗因依从性差往往使得服用者难以坚持，不容易推广普及；③易诱导产生耐药性，耐药菌株的出现还使得化学药物的预防性治疗可能无效且不适用于非PPD强阳性的高危人群预防用药。
本发明与WTO推荐的潜伏性结核感染的治疗方案相比，本发明的治疗方案为先进行2～4周的化药治疗，再进行本发明疫苗治疗，共注射6针，每针间隔1周，治疗方便，整个治疗周期为7～9周，治疗时间大大减少，同时化药服用2～4周，疫苗每周只要注射一次，用药方便，不存在漏服的风险，且母牛分枝杆菌提取物的临床安全性已经被证实，副作用较轻微。
在本发明中，母牛分枝杆菌菌体提取物的重量是以母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的重量折算，折算方法如下，比如母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的浓度为1mg/mL，取母牛分枝杆菌菌体提取物22mL，则该母牛分枝杆菌菌体提取物的重量就为22mL×1mg/mL＝22mg。
一种含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗，包含Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10蛋白和母牛分枝杆菌菌体提取物。
优选的，所述Ag85b蛋白：ESAT6-CFP10蛋白：母牛分枝杆菌菌体提取物的重量比为(5～20)：(5～20)：(11～27)。
优选的，所述Ag85b蛋白：ESAT6-CFP10蛋白：母牛分枝杆菌菌体提取物的重量比为10：10：22.5。
一种含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制含稳定剂的疫苗原液：取Ag85b蛋白原液、ESAT6-CFP10蛋白原液、母牛分枝杆菌菌体提取物原液，加入稳定剂，使稳定剂的终浓度为20～60g/L；
(2)冻干：不高于-45℃下预冷冻，-30～-20℃升华干燥，20～30℃下解析干燥得到所述含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗。
优选的，步骤(1)中所述Ag85b蛋白终浓度为10～40μg/mL，所述ESAT6-CFP10蛋白终浓度为10～40μg/mL，所述母牛分枝杆菌菌体提取物终浓度为22～54μg/mL。
优选的，所述稳定剂为葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、纤维素、果胶、甘露醇、山梨醇、丙三醇中的一种或几种。
一种预防结核病联合用药物，包括第一制剂和第二制剂，所述第一制剂为上述任意一种所述含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗，所述第二制剂为异烟肼、利福平和利福喷汀中一种或几种，所述第二制剂中的活性成分以游离形式或药学上可接受的盐的形式存在。
优选的，所述第一制剂使用剂量为21～67μg/剂，第二制剂使用剂量为300～600mg/日。
优选的，所述第一制剂的剂型为口服制剂或注射剂，所述第二制剂的剂型为口服制剂或注射剂。
优选的，所述的包含Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10蛋白和母牛分枝杆菌菌体提取物的组合物在制备结核病药物中的应用。
优选的，所述的包含Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10蛋白和母牛分枝杆菌菌体提取物的组合物在制备结核病药物中的应用，其特征在于，所述结核病包括活动性结核病和潜伏性感染者。
优选的，所述的预防结核病联合用药物在制备预防结核潜伏感染药物中的应用。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)一种治疗结核用药物，包含Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10蛋白和母牛分枝杆菌菌体提取物。本发明的佐剂为母牛分枝杆菌菌体提取物，只有一种，不含铝盐佐剂，所以不存在超敏反应的风险，同时母牛分枝杆菌提取物就属于分枝杆菌菌体组分疫苗，来源于母牛分枝杆菌，该菌种与结核分枝杆菌来源于同一纲、目、科、属，具有相同的结核杆菌特异性抗原蛋白，母牛分枝杆菌提取物中含有蛋白、多糖、核酸等多种混合成分，吴高达等经过5104人次的临床观察，该提取物的副反应率仅为0.137％，副反应较少见，且较轻微。极大的降低了Koch反应风险，风险几乎为零。本发明治疗结核杆菌潜伏感染效果显著，详见本发明实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6相关数据。
(2)中国专利，申请号CN2014101945592，所述Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、BCG-CpG佐剂、铝佐剂以及PolyIC佐剂的重量比为5～15:5～15:50～100:100～300:5～100；
中国专利，申请号CN2013102733939，所述Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、铝佐剂和PolyIC佐剂的重量比为1～50:1～50:100～1000:1～100；
本发明的药物中所述Ag85b蛋白：ESAT6-CFP10蛋白：母牛分枝杆菌菌体提取物的重量比为(5～20)：(5～20)：(11～27)；
从上可以看出，本发明佐剂在本发明的疫苗中的绝对使用量大大减少，进一步大大降低了Koch反应风险，同时治疗时间为5周，与中国专利，申请号CN2014101945592，中国专利，申请号CN2013102733939相比，治疗周期减少了5周，大大缩短了治疗时间，同时本发明治疗结核杆菌潜伏感染效果显著，详见本发明实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6相关数据。
(3)本发明的所述Ag85b蛋白：ESAT6-CFP10蛋白：母牛分枝杆菌菌体提取物的重量比为10：10：22.5，本发明的佐剂为母牛分枝杆菌菌体提取物，从上可以看出，本发明佐剂在本发明的疫苗中的绝对使用量大大减少，进一步大大降低了Koch反应风险，同时治疗时间为5周，与中国专利，申请号CN2014101945592，中国专利，申请号CN2013102733939相比，治疗周期减少了5周，大大缩短了治疗时间，同时本发明治疗结核杆菌潜伏感染效果显著，详见本发明实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6相关数据。
(4)本发明治疗结核杆菌潜伏感染的方案为：本发明的疫苗共注射6针，每针间隔1周，末次免疫后3周后解剖，治疗时间为5周，与中国专利，申请号CN2014101945592，中国专利，申请号CN2013102733939相比，治疗周期减少了5周，大大缩短了治疗时间。中国专利，申请号CN2014101945592和中国专利，申请号CN2013102733939都是使用了铝盐佐剂，不能采用冻干技术生产，也不能冷冻保存，而本发明未采用铝盐佐剂，采用的是母牛分枝杆菌菌体提取物为佐剂，可以采用冻干技术生产，可以冷藏或者冷冻方式保存，保存时间长，运输方便。
附图说明
图1为重组结核杆菌Ag85b蛋白SDS-PAGE图谱，图中01行代表低分子量的蛋白marker；02、03行为Ag85b蛋白的图谱；
图2为重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白SDS-PAGE图谱，图中01行代表低分子量的蛋白marker；02行为ESAT6-CFP10蛋白的图谱；
图3为含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗脏器综合病变指数评分，疫苗组与对照组相比，P＝0.008；
图4为含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗的脾、肺活菌分离数，疫苗组与对照组相比，P＝0.009；
图5为含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与亚单位结核疫苗脏器综合病变指数评分，疫苗组与对照组相比，P＝0.024；
图6为含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与亚单位结核疫苗的脾、肺活菌分离数，疫苗组与对照组相比，P＝0.023；
图7为含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与分枝杆菌灭活菌体结核疫苗脏器综合病变指数评分；
图8为含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与分枝杆菌灭活菌体结核疫苗的脾、肺活菌分离数；
图9为含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与卡介苗脏器综合病变指数评分；
图10为含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与卡介苗的脾、肺活菌分离数；
图11含有分枝杆菌类微生物复合佐剂结核病疫苗的联合用药物与化学药物对结核分枝杆菌潜伏感染动物脏器综合病变指数评分，疫苗组与对照组相比，P＝0.014；
图12含有分枝杆菌类微生物复合佐剂结核病疫苗的联合用药物与化学药物对结核分枝杆菌潜伏感染动物脾、肺活菌分离数，疫苗组与对照组相比，P＝0.008。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗的制备
1.Ag85b蛋白的制备过程
从GeneBank中查找Ag85b蛋白基因序列，并设计引物如下：见表1。
表1 Ag85b目的基因的引物序列、酶切位点、保护碱基
Figure BDA0001759880450000091
备注：下划线分别为内切酶的酶切位点，斜体部分为起始密码子。
以结核分枝杆菌H37Rv全基因组为模板，对Ag85b基因进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL(ddH2O 30μL、10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、P1引物4μL、P2引物4μL、DNA模板2.5μL、DNA聚合酶0.5μL)，扩增条件为：96℃预变性3分钟；96℃变性45秒、62℃退火45秒、72℃延伸1分钟，共30次循环；72℃延伸7分钟。
对PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行胶回收，得到Ag85b目的基因片段。在DNA连接酶的催化下，将经过NdeI和EcoRI双酶切的Ag85b基因片段与pET-30a克隆表达载体，在16℃条件下连接过夜。再转化到DH5α感受态细胞中，接种于LB固体培养基上，37℃条件下培养过夜，挑选单克隆菌落于LB液体培养基中进行扩增，提取质粒，经PCR扩增和凝胶电泳鉴定，质粒测序验证，并确认Ag85b基因序列正确。提取测序正确的菌落质粒，转化到BL21感受态细胞中，即为Ag85b重组菌株。将该菌株置于LB液体培养基中培养，待菌液的吸光值A600nm达到2.5～4.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.4～0.8mmol/L，诱导表达3～6h。
离心收集培养的菌体，经T-E缓冲液(Tris 50mmol/L，EDTA 2mmol/L)洗涤重悬，高压均质机破碎后，离心弃上清。沉淀用含2M尿素的T-E缓冲液重悬后洗1-3遍，离心弃上清。沉淀用含8M的T-E缓冲液重悬，离心去沉淀。将上清用T-E缓冲液稀释30～100倍后，静置12～48h，再用中空纤维柱浓缩30～100倍。
浓缩后的溶液，经Q Sepharose High Performance离子交换柱进行纯化，先用A液(20mM Tris)平衡色谱柱，再用0～20％B液(20mM Tris和1M NaCl)进行线性梯度洗脱，并收集蛋白峰，经SDS-PAGE电泳(见图1)确定分子量和N-端氨基酸序列测定，结果为分子量：34KD，N-端氨基酸序列：MTDVSRKIRAWGRRL。
2.ESAT6-CFP10蛋白的制备过程
从GeneBank中查找ESAT6和CFP10蛋白基因序列，并设计引物如下：ESAT6-CFP10的ESAT6的上游引物为P1、下游引物为P2；CFP10的上游引物为P3、下游引物为P4。见表2。
表2 ESAT6和CFP10目的基因的引物序列、酶切位点、保护碱基
Figure BDA0001759880450000101
备注：下划线分别为内切酶的酶切位点，斜体部分为起始密码子。
以结核分枝杆菌H37Rv全基因组为模板，对ESAT6基因进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL(ddH2O 30μL、10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、P1引物4μL、P2引物4μL、DNA模板2.5μL、DNA聚合酶0.5μL)，扩增条件为：96℃预变性3分钟；96℃变性45秒、62℃退火45秒、72℃延伸1分钟，共30次循环；72℃延伸7分钟。
以结核分枝杆菌H37Rv全基因组为模板，对CFP10基因进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL(ddH2O 28μL、10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、P3引物5μL、P4引物5μL、DNA模板2.5μL、DNA聚合酶0.5μL)，扩增条件为：95℃预变性3分钟，95℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共30次循环，72℃延伸5分钟。
对PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，分别进行胶回收，得到ESAT6和CFP10目的基因片段。在DNA连接酶的催化下，先将经过NdeⅠ和KpnⅠ双酶切的ESAT6基因片段与pET-30a克隆表达载体，在16℃条件下连接过夜，即得到pET-30a-ESAT6质粒；再将经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的CFP10基因片段与pET-30a-ESAT6质粒，在16℃条件下连接过夜，即得到pET-30a-ESAT6-CFP10质粒。再转化到DH5α感受态细胞中，接种于LB固体培养基上，37℃条件下培养过夜，挑选单克隆菌落于LB液体培养基中进行扩增，提取质粒，经PCR扩增和凝胶电泳鉴定，质粒测序验证，并确认ESAT6-CFP10基因序列正确。提取测序正确的菌落质粒，转化到BL21感受态细胞中，即为ESAT6-CFP10重组菌株。将该菌株置于LB液体培养基中培养，待菌液的吸光值A600nm达到1.0～3.0时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.4～0.8mmol/L，诱导表达6～11h。
离心收集培养的菌体，经磷酸盐缓冲液洗涤重悬，高压均质机破碎后，离心留上清，经Q Sepharose High Performance离子交换柱进行纯化，先用A液(20mM PB)平衡层析柱，再用0～100％B液(20mM PB和1M NaCl)洗脱，并收集蛋白峰，经SDS-PAGE电泳(见图2)确定分子量和N-端氨基酸序列测定，结果为分子量：23KD，N-端氨基酸序列：MAEMKTDAATLAQEAG。
3.母牛分枝杆菌菌体提取物(MV)的制备过程
取1mL母牛分枝杆菌菌种，接种于罗氏鸡蛋培养基上，于37～39℃下培养3～7天后，收集菌体，经生理盐水洗涤重悬后，配制成10mg/mL的菌液，采用高压均质机破碎后，于40Mpa以上的压力下均质后，离心留上清，再经高压灭菌后，即为母牛分枝杆菌菌体提取物(MV)。
4.含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗的制备过程
在本发明中，母牛分枝杆菌菌体提取物的重量是以母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的重量折算，折算方法如下，母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的浓度为1mg/mL，取母牛分枝杆菌菌体提取物22mL，则该母牛分枝杆菌菌体提取物的重量就折算为22mL×1mg/mL＝22mg。
(1)制备Ag85b蛋白：ESAT6-CFP10蛋白：母牛分枝杆菌菌体提取物的重量比为5：5：11的疫苗
取浓度为1mg/mL的Ag85b蛋白10mL、浓度为1mg/mL的ESAT6-CFP10蛋白10mL、母牛分枝杆菌菌体提取物22mL(菌体蛋白浓度为1mg/mL)，甘露醇20g，配制成总体积为1L的溶液，分装至安瓿瓶或者西林瓶中，每瓶0.5mL，在-45℃下预冷冻，-30℃下升华干燥，20℃下解析干燥后得到疫苗成品。
在本发明中，母牛分枝杆菌菌体提取物的重量是以母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的重量折算，折算方法如下，比如在该例中，母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的浓度为1mg/mL，取母牛分枝杆菌菌体提取物22mL，则该母牛分枝杆菌菌体提取物的重量就折算为22mL×1mg/mL＝22mg，则1L该疫苗制剂中的组分含量为Ag85b蛋白10mg、ESAT6-CFP10蛋白10mg、母牛分枝杆菌菌体提取物22mg。
本例中的甘露醇可以为葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、纤维素、果胶、甘露醇、山梨醇、丙三醇中的一种或几种。
(2)制备Ag85b蛋白：ESAT6-CFP10蛋白：母牛分枝杆菌菌体提取物的重量比为10：10：22.5的疫苗
取浓度为1mg/mL的Ag85b蛋白20mL、取浓度为1mg/mL的ESAT6-CFP10蛋白20mL、取浓度为1mg/mL的母牛分枝杆菌菌体提取物45mL，甘露醇40g，配制成总体积为1L的溶液，分装至安瓿瓶或者西林瓶中，每瓶0.5mL，在-45℃下预冷冻，-25℃下升华干燥，25℃下解析干燥后，得到疫苗成品。
在本发明中，母牛分枝杆菌菌体提取物的重量是以母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的重量折算，折算方法如下，比如在该例中，母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的浓度为1mg/mL，取母牛分枝杆菌菌体提取物45mL，则该母牛分枝杆菌菌体提取物的重量就折算为45mL×1mg/mL＝45mg，则1L该疫苗制剂中的组分含量为Ag85b蛋白20mg、ESAT6-CFP10蛋白20mg、母牛分枝杆菌菌体提取物45mg。
本例中的甘露醇可以为果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、纤维素、果胶、甘露醇、山梨醇、丙三醇中的一种或几种。
(3)制备Ag85b蛋白：ESAT6-CFP10蛋白：母牛分枝杆菌菌体提取物的重量比为20：20：27的疫苗
取浓度为1mg/mL的Ag85b蛋白40mL、取浓度为1mg/mL的ESAT6-CFP10蛋白40mL、取浓度为1mg/mL的母牛分枝杆菌菌体提取物54mL，甘露醇60g，配制成总体积为1L的溶液，分装至安瓿瓶或者西林瓶中，每瓶0.5mL，在-45℃下预冷冻，-20℃下升华干燥，30℃下解析干燥后，即为疫苗成品。
在本发明中，母牛分枝杆菌菌体提取物的重量是以母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的重量折算，折算方法如下，比如在该例中，母牛分枝杆菌菌体提取物中的菌体蛋白的浓度为1mg/mL，取母牛分枝杆菌菌体提取物54mL，则该母牛分枝杆菌菌体提取物的重量就折算为54mL×1mg/mL＝54mg，则1L该疫苗制剂中的组分含量为Ag85b蛋白40mg、ESAT6-CFP10蛋白40mg、母牛分枝杆菌菌体提取物54mg。
本例中的甘露醇可以为葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、纤维素、果胶、甘露醇、山梨醇、丙三醇中的一种或几种。
实施例2
含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗的动物保护力试验
1、实验方法
Mtb感染豚鼠的免疫治疗
SPF级Hartley豚鼠16只(300～350g/只)，雌雄各半，分成两组(疫苗组、对照组)，每组8只。将疫苗组和对照组豚鼠于皮下攻毒5.0×103CFU Mtb，4周后，疫苗组注射本疫苗进行治疗，共6针，每针间隔1周，每针剂量为[Ag85b(10μg)+EC(10μg)+MV(22.5μg)]/0.5mL/只。对照组豚鼠注射等量的生理盐水作为对照。Mtb感染12周后，解剖豚鼠。分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。Mtb为结核分枝杆菌，MV为母牛分枝杆菌菌体提取物，EC为ESAT6-CFP10蛋白。
脏器综合病变指数评分
Mtb感染的豚鼠解剖后，先对肝、脾、肺脏器按轻、中、重进行分级，然后按《现代结核病学》中《结核菌感染后病变指数评分标准》进行评分。
脾、肺活菌分离
剪取1/2的脾脏或肺置于研磨器中，加入3mL生理盐水研磨均匀，进行10倍系列稀释，根据脏器病变程度接种不同的稀释度，每个稀释度接种罗氏培养基2支，0.1mL/支，37℃培养，4周后进行菌落计数。
统计分析
双样本t检验法进行统计分析。
2、结果及分析
结果如表3和图3～4所示，可得出：与对照组相比经疫苗治疗6针后，疫苗组各项指标均显著降低。这表明，本疫苗可显著减轻Mtb感染豚鼠各脏器的病变程度，并有效抑制或杀死豚鼠体内结核分枝杆菌。
表3含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗的动物保护力试验结果
Figure BDA0001759880450000141
实施例3
含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与亚单位结核疫苗的动物保护力比较试验
1、实验方法
Mtb感染豚鼠的免疫治疗
SPF级Hartley豚鼠16只(300～350g/只)，雌雄各半，分成两组(疫苗组、对照组)，每组8只。将疫苗组和对照组豚鼠于皮下攻毒5.0×103CFU Mtb，4周后，疫苗组注射本疫苗进行治疗，共6针，每针间隔1周，每针剂量为[Ag85b(10μg)+EC(10μg)+MV(22.5μg)]/0.5mL/只。对照组豚鼠注射等量的亚单位结核疫苗([Ag85b(10μg)+EC(10μg)+BCG-CpG-DNA(75μg)+Al(OH)3(200μg)]/0.5mL/只)作为对照。Mtb感染12周后，解剖豚鼠。分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。Mtb为结核分枝杆菌，MV为母牛分枝杆菌菌体提取物，EC为ESAT6-CFP10蛋白。
脏器综合病变指数评分
Mtb感染的豚鼠解剖后，先对肝、脾、肺脏器按轻、中、重进行分级，然后按《现代结核病学》中《结核菌感染后病变指数评分标准》进行评分。
脾、肺活菌分离
剪取1/2的脾脏或肺置于研磨器中，加入3mL生理盐水研磨均匀，进行10倍系列稀释，根据脏器病变程度接种不同的稀释度，每个稀释度接种罗氏培养基2支，0.1mL/支，37℃培养，4周后进行菌落计数。
统计分析
双样本t检验法进行统计分析。
2、结果及分析
结果如表4和图5～6所示，可得出：与对照组相比经疫苗治疗6针后，疫苗组各项指标均显著降低。这表明，与亚单位结核疫苗相比，本疫苗可显著减轻Mtb感染豚鼠各脏器的病变程度，并有效抑制或杀死豚鼠体内结核分枝杆菌。
表4含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与亚单位结核疫苗的动物保护力试验结果
Figure BDA0001759880450000151
中国专利，申请号CN2014101945592，以BCG-CpG、Al(OH)3、PolyIC为佐剂，佐剂为3种，共注射6针，每针间隔2周，末次免疫后1周后解剖，分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。治疗时间为10周，所用佐剂存在Koch反应风险。详见该专利申请文件0061～0081段，实施例2。
中国专利，申请号CN2013102733939，以Al(OH)3和PolyIC为复合佐剂，佐剂有2种，共注射6针，每针间隔2周，末次免疫后1周后解剖，分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。治疗时间为10周，所用佐剂存在Koch反应风险。详见该专利申请文件0058～0069段，实施例3。
本发明疫苗的佐剂只有一种，共注射6针，每针间隔1周，末次免疫后3周(也即Mtb感染12周)后解剖，分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量，本发明的疫苗治疗时间为5周，与申请号CN2014101945592、申请号CN2013102733939相比，佐剂只有一种，不存在Koch反应风险，治疗时间大大减少，减少5周，且治疗效果显著。
进一步的，与申请号CN2014101945592、申请号CN2013102733939相比，本发明佐剂在本发明的疫苗中的重量比例，大大减小，进一步大大降低了Koch反应风险。
进一步的，与申请号CN2014101945592、申请号CN2013102733939相比，本发明佐剂在本发明的疫苗中的绝对使用量大大减少，进一步大大降低了Koch反应风险。
实施例4
含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与分枝杆菌灭活菌体结核疫苗的动物保护力比较试验
1、实验方法
Mtb感染豚鼠的免疫治疗
SPF级Hartley豚鼠24只(300～350g/只)，雌雄各半，分成三组(结核病疫苗组、分枝杆菌疫苗组、对照组)，每组8只。将所有豚鼠于皮下攻毒5.0×103CFU Mtb，4周后，结核病疫苗组注射本疫苗进行治疗，共6针，每针间隔1周，每针剂量为[Ag85b(10μg)+EC(10μg)+MV(22.5μg)]/0.5mL/只。分枝杆菌疫苗组，注射等量的母牛分枝杆菌灭活菌体提取物(22.5μg)/0.5mL/只。对照组豚鼠注射等量的生理盐水作为对照。Mtb感染12周后，解剖豚鼠。分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。Mtb为结核分枝杆菌，MV为母牛分枝杆菌菌体提取物，EC为ESAT6-CFP10蛋白。
脏器综合病变指数评分
Mtb感染的豚鼠解剖后，先对肝、脾、肺脏器按轻、中、重进行分级，然后按《现代结核病学》中《结核菌感染后病变指数评分标准》进行评分。
脾、肺活菌分离
剪取1/2的脾脏或肺置于研磨器中，加入3mL生理盐水研磨均匀，进行10倍系列稀释，根据脏器病变程度接种不同的稀释度，每个稀释度接种罗氏培养基2支，0.1mL/支，37℃培养，4周后进行菌落计数。
统计分析
双样本t检验法进行统计分析。
2、结果及分析
结果如表5和图7～8所示，可得出：经6针治疗后，与对照组相比，分枝杆菌疫苗组和结核病疫苗组的各项指标均有下降，其中，结核病疫苗组的指标降低显著。这表明，本疫苗可显著减轻Mtb感染豚鼠各脏器的病变程度，并有效抑制或杀死豚鼠体内结核分枝杆菌；与分枝杆菌疫苗相比，动物保护的效果更好。
表5含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与分枝杆菌灭活菌体结核疫苗的动物保保力试验结果
Figure BDA0001759880450000161
注：*表示与对照组进行比较；**表示与分枝杆菌疫苗组进行比较
实施例5
含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与卡介苗的动物保护力比较试验
1、实验方法
Mtb感染豚鼠的免疫治疗
SPF级Hartley豚鼠24只(300～350g/只)，雌雄各半，分成三组(结核病疫苗组、卡介苗组、对照组)，每组8只。将所有豚鼠于皮下攻毒5.0×103CFU Mtb，4周后，结核病疫苗组注射本疫苗进行治疗，共6针，每针间隔1周，每针剂量为[Ag85b(10μg)+EC(10μg)+MV(22.5μg)]/0.5mL/只。对照组豚鼠注射等量的生理盐水作为对照。卡介苗组豚鼠注射1次卡介苗，剂量为0.05mg/0.1ml/只。Mtb感染12周后，解剖豚鼠。分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。Mtb为结核分枝杆菌，MV为母牛分枝杆菌菌体提取物，EC为ESAT6-CFP10蛋白。
脏器综合病变指数评分
Mtb感染的豚鼠解剖后，先对肝、脾、肺脏器按轻、中、重进行分级，然后按《现代结核病学》中《结核菌感染后病变指数评分标准》进行评分。
脾、肺活菌分离
剪取1/2的脾脏或肺置于研磨器中，加入3mL生理盐水研磨均匀，进行10倍系列稀释，根据脏器病变程度接种不同的稀释度，每个稀释度接种罗氏培养基2支，0.1mL/支，37℃培养，4周后进行菌落计数。
统计分析
双样本t检验法进行统计分析。
2、结果及分析
结果如表6和图9～10所示，可得出：与对照组和卡介苗组相比，结核病疫苗组各项指标均显著降低。这表明，本疫苗可显著减轻Mtb感染豚鼠各脏器的病变程度，并有效抑制或杀死豚鼠体内结核分枝杆菌。同时也表明，卡介苗对于Mtb感染豚鼠来说，无法有效抑制或杀死豚鼠体内结核分枝杆菌。
表6含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的结核病疫苗与卡介苗的动物保护力试验结果
Figure BDA0001759880450000171
注：*表示与对照组进行比较；**表示与卡介苗组进行比较
实施例6
含有分枝杆菌类微生物复合佐剂结核病疫苗的联合用药物与化学药物对潜伏感染动物保护力比较试验
1、实验方法
Mtb感染豚鼠的免疫治疗
SPF级Hartley豚鼠16只(300～350g/只)，雌雄各半，分成两组(疫苗组、对照组)，每组8只。将疫苗组和对照组豚鼠于皮下攻毒5.0×103CFU Mtb，2周后，均给予异烟肼治疗(化疗)，每周3次，共治疗2周，每只豚鼠每次给药剂量为5mg/0.5mL/只。疫苗组于化疗结束后，开始注射本疫苗进行治疗，共6针，每针间隔1周，每针剂量为[Ag85b(10μg)+EC(10μg)+MV(22.5μg)]/0.5mL/只。对照组继续使用异烟肼治疗(化疗)，每周3次，共治疗2周，每只豚鼠每次给药剂量为5mg/0.5mL/只。Mtb感染12周后，解剖豚鼠。分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。Mtb为结核分枝杆菌，MV为母牛分枝杆菌菌体提取物，EC为ESAT6-CFP10蛋白。
脏器综合病变指数评分
Mtb感染的豚鼠解剖后，先对肝、脾、肺脏器按轻、中、重进行分级，然后按《现代结核病学》中《结核菌感染后病变指数评分标准》进行评分。
脾、肺活菌分离
剪取1/2的脾脏或肺置于研磨器中，加入3mL生理盐水研磨均匀，进行10倍系列稀释，根据脏器病变程度接种不同的稀释度，每个稀释度接种罗氏培养基2支，0.1mL/支，37℃培养，4周后进行菌落计数。
统计分析
双样本t检验法进行统计分析。
2、结果及分析
结果如表7和图11～12所示，可得出：与对照组相比，疫苗组各项指标均显著降低。这表明，与单一使用化学药物相比，含有本疫苗的联合用药物可显著减轻Mtb感染豚鼠各脏器的病变程度，并有效抑制或杀死豚鼠体内结核分枝杆菌。
表7含有分枝杆菌类微生物复合佐剂结核病疫苗的联合用药物与化学药物的动物保护力试验结果
Figure BDA0001759880450000181
Figure BDA0001759880450000191
当把异烟肼换成利福平或利福喷汀也能取得相似的治疗效果，实验中，仅用异烟肼进行化疗，但是可以从理论上推测出其他化疗药物也可以达到类似治疗效果。

Claims (9)

1.一种含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗，其特征在于，包含Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10蛋白和母牛分枝杆菌菌体提取物；
所述Ag85b蛋白:ESAT6-CFP10蛋白:母牛分枝杆菌菌体提取物的重量比为10:10:22.5；
所述母牛分枝杆菌菌体提取物通过以下方法制备得到：取母牛分枝杆菌菌种接种于罗氏鸡蛋培养基上，培养后收集菌体，重悬后配制成菌液，破碎，均质，离心留上清，灭菌，得到所述母牛分枝杆菌菌体提取物。
2.一种权利要求1所述含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制含稳定剂的疫苗原液：取Ag85b蛋白原液、ESAT6-CFP10蛋白原液、母牛分枝杆菌菌体提取物原液，加入稳定剂，使稳定剂的终浓度为20～60g/L；
(2)冻干：不高于-45℃下预冷冻，-30～-20℃升华干燥，20～30℃下解析干燥得到所述含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗。
3.根据权利要求2所述的含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述Ag85b蛋白终浓度为10～40μg/mL，所述ESAT6-CFP10蛋白终浓度为10～40μg/mL，所述母牛分枝杆菌菌体提取物终浓度为22～54μg/mL。
4.根据权利要求2所述的含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗的制备方法，其特征在于，所述稳定剂为葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、纤维素、果胶、甘露醇、山梨醇、丙三醇中的一种或几种。
5.一种预防结核病联合用药物，其特征在于，包括第一制剂和第二制剂，所述第一制剂为权利要求1所述含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗，所述第二制剂为异烟肼、利福平和利福喷汀中一种或几种，所述第二制剂中的活性成分以游离形式或药学上可接受的盐的形式存在。
6.根据权利要求5所述的预防结核病联合用药物，其特征在于，所述第一制剂的剂型为口服制剂或注射剂，所述第二制剂的剂型为口服制剂或注射剂。
7.根据权利要求1所述的含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗在制备预防结核病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的含有分枝杆菌类微生物复合佐剂的预防结核病疫苗在制备预防结核病药物中的应用，其特征在于，所述结核病包括活动性结核病和潜伏性感染者。
9.根据权利要求5或6任意一项所述的预防结核病联合用药物在制备预防结核潜伏感染药物中的应用。
CN201810902885.2A 2018-08-09 2018-08-09 一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用 Active CN109078177B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810902885.2A CN109078177B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810902885.2A CN109078177B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109078177A CN109078177A (zh) 2018-12-25
CN109078177B true CN109078177B (zh) 2022-07-08

Family

ID=64834366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810902885.2A Active CN109078177B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109078177B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1613456A (zh) * 2003-11-03 2005-05-11 安徽龙科马生物制药有限责任公司 冻干母牛分枝杆菌制剂（微卡）及其制备方法和用途
CN100999550A (zh) * 2006-01-10 2007-07-18 解放军总医院第二附属医院 结核分枝杆菌融合蛋白及其应用
CN101518549A (zh) * 2008-02-26 2009-09-02 中国人民解放军总医院第二附属医院 分枝杆菌提取物的研究和应用
CN101745104A (zh) * 2010-02-09 2010-06-23 中国药品生物制品检定所 含有复合佐剂的结核亚单位疫苗
WO2013163337A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-31 The Ohio State University Compositions and methods for treating and preventing porcine reproductive and respiratory syndrome
CN103386128A (zh) * 2013-07-02 2013-11-13 中国食品药品检定研究院 一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗
CN104027802A (zh) * 2014-05-09 2014-09-10 中国食品药品检定研究院 一种增强型结核亚单位疫苗
CN111655281A (zh) * 2018-01-26 2020-09-11 加利福尼亚大学董事会 用于结核病的含环二核苷酸佐剂的疫苗的鼻内递送

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL2023863B1 (en) * 2019-09-20 2021-05-25 Univ Griffith Protein particles and uses thereof

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1613456A (zh) * 2003-11-03 2005-05-11 安徽龙科马生物制药有限责任公司 冻干母牛分枝杆菌制剂（微卡）及其制备方法和用途
CN100999550A (zh) * 2006-01-10 2007-07-18 解放军总医院第二附属医院 结核分枝杆菌融合蛋白及其应用
CN101518549A (zh) * 2008-02-26 2009-09-02 中国人民解放军总医院第二附属医院 分枝杆菌提取物的研究和应用
CN101745104A (zh) * 2010-02-09 2010-06-23 中国药品生物制品检定所 含有复合佐剂的结核亚单位疫苗
WO2013163337A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-31 The Ohio State University Compositions and methods for treating and preventing porcine reproductive and respiratory syndrome
CN103386128A (zh) * 2013-07-02 2013-11-13 中国食品药品检定研究院 一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗
CN104027802A (zh) * 2014-05-09 2014-09-10 中国食品药品检定研究院 一种增强型结核亚单位疫苗
CN111655281A (zh) * 2018-01-26 2020-09-11 加利福尼亚大学董事会 用于结核病的含环二核苷酸佐剂的疫苗的鼻内递送

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ag85b/ESAT6-CFP10 adjuvanted with aluminum/poly-IC effectively protects guinea pigs from latent mycobacterium tuberculosis infection;Chunhua Wang 等;《Vaccine》;20190629;第37卷(第32期);第4477-4484页 *
Poly I：C 联合 BCG-CpG 复合佐剂对结核亚单位疫苗免疫效果的影响;卢锦标 等;《微生物学免疫学进展》;20140630;第42卷(第3期);第6-12页 *
Recombinant Mycobacterium smegmatis expressing an ESAT6-CFP10 fusion protein induces anti-mycobacterial immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice;H Zhang 等;《Scand J Immunol》;20101031;第72卷(第4期);第349-357页 *
产品及研发管线存在显著预期差，疫苗绝对龙头长期市值有望突破2000亿;智飞生物;《新时代证券》;20190628;第1-56页 *
结核分枝杆菌重组Ag85A、Ag85B蛋白联合母牛分枝杆菌免疫原性的研究;尹文东;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)医药卫生科技辑》;20121015(第10（2012）期);前言、摘要，正文第8、19页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109078177A (zh) 2018-12-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Malley et al. Intranasal immunization with killed unencapsulated whole cells prevents colonization and invasive disease by capsulated pneumococci
US8741313B2 (en) Polypeptide vaccine and vaccination strategy against mycobacterium
JP4940479B2 (ja) マイコバクテリウム・ツベルクローシス融合蛋白質及びその応用
CN101745104B (zh) 含有复合佐剂的结核亚单位疫苗
US20170106074A1 (en) Influenza Vaccine, Composition, and Methods of Use
CN103386128B (zh) 一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗
US11339194B2 (en) Truncated rotavirus VP4 protein and application thereof
Riffo‐Vasquez et al. Effect of Mycobacterium tuberculosis chaperonins on bronchial eosinophilia and hyper‐responsiveness in a murine model of allergic inflammation
JP6195089B2 (ja) ストレプトコッカス・ニューモニエによる肺炎に対するキメラタンパク質ワクチン
US20220387575A1 (en) Construction method of recombinant drug-resistant mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin (bcg) strain and pharmaceutical composition for treating tuberculosis (tb)
EP4137506A1 (en) African swine fever vaccine composition
CN109078177B (zh) 一种预防结核病的疫苗及联合用药物和制备方法、应用
CN101518549A (zh) 分枝杆菌提取物的研究和应用
CN103118702A (zh) 活动性结核病的治疗性接种
US6514499B1 (en) Compositions exhibiting ADP-ribosyltransferase activity and methods for the preparation and use thereof
RU2640250C2 (ru) Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма enterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях
JPWO2008065752A1 (ja) ｄｉＲＮＡを有効成分とする免疫治療用薬剤
RU2701733C1 (ru) Живая вакцина на основе штамма пробиотиков ENTEROCOCCUS FAECIUM L3 для профилактики инфекции, вызванной STREPTOCOCCUS PNEUMONIE
Weiss Antituberculous vaccination in the guinea pig with non-living vaccines
CN108524550B (zh) Seb类毒素疫苗气溶胶肺递送免疫小鼠模型的制备方法
CN113046384A (zh) 一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法
US20150238590A1 (en) Use of the salmonella spp type iii secretion proteins as a protective vaccination
Janeway Jr et al. Manipulating the immune response to fight infection
Gaspari Application of prime-boost as a novel vaccination strategy against microbial pathogens
US9409956B2 (en) Salmonella typhi Ty21a expressing Yersinia pestis F1-V fusion protein and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 230000, No. 5008 Mingzhu Avenue, Hefei City, Anhui Province

Patentee after: ANHUI ZHIFEI LONGCOM BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Patentee after: CHONGQING ZHIFEI BIOLOGICAL PRODUCTS CO.,LTD.

Patentee after: BEIJING ZHIFEI LVZHU BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Patentee after: NATIONAL INSTITUTES FOR FOOD AND DRUG CONTROL

Address before: 230088 No.100 Fushan Road, high tech Zone, Hefei City, Anhui Province

Patentee before: ANHUI ZHIFEI LONGCOM BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Patentee before: CHONGQING ZHIFEI BIOLOGICAL PRODUCTS CO.,LTD.

Patentee before: BEIJING ZHIFEI LVZHU BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Patentee before: NATIONAL INSTITUTES FOR FOOD AND DRUG CONTROL

CP02 Change in the address of a patent holder