RU2640250C2 - Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма enterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях - Google Patents
Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма enterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях Download PDFInfo
- Publication number
- RU2640250C2 RU2640250C2 RU2015145759A RU2015145759A RU2640250C2 RU 2640250 C2 RU2640250 C2 RU 2640250C2 RU 2015145759 A RU2015145759 A RU 2015145759A RU 2015145759 A RU2015145759 A RU 2015145759A RU 2640250 C2 RU2640250 C2 RU 2640250C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bac
- dna
- enterococcus faecium
- vaccine
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims abstract description 41
- 241000982579 Enterococcus faecium L3 Species 0.000 title claims abstract description 38
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title description 13
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 title description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 title description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 74
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 53
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 32
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 claims description 13
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 9
- 101150084684 L3 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 25
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 17
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 4
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 4
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 3
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 3
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 description 2
- 101150025158 P6 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 2
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 2
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- KMEGBUCIGMEPME-LQYKFRDPSA-N (2s,5r,6r)-6-[[(2r)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;(1r,4s)-3,3-dimethyl-2,2,6-trioxo-2$l^{6}-thiabicyclo[3.2.0]heptane-4-carboxylic acid Chemical compound O=S1(=O)C(C)(C)[C@H](C(O)=O)C2C(=O)C[C@H]21.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 KMEGBUCIGMEPME-LQYKFRDPSA-N 0.000 description 1
- RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N (E)-roxithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=N/OCOCCOC)/[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N 0.000 description 1
- VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]ethyl (5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCCOC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010059574 C5a peptidase Proteins 0.000 description 1
- 206010009152 Chronic tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 1
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000000297 Erysipelas Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016228 Fasciitis Diseases 0.000 description 1
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000737574 Homo sapiens Complement factor H Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021531 Impetigo Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010036422 Postpartum sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 208000020264 Puerperal Infection Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 206010039587 Scarlet Fever Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010048960 Streptococcal sepsis Diseases 0.000 description 1
- 208000017757 Streptococcal toxic-shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 206010044251 Toxic shock syndrome streptococcal Diseases 0.000 description 1
- 201000008100 Vaginitis Diseases 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 1
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960002536 benzathine benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- BVGLIYRKPOITBQ-ANPZCEIESA-N benzylpenicillin benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C[NH2+]CC[NH2+]CC1=CC=CC=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BVGLIYRKPOITBQ-ANPZCEIESA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 1
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 101150016100 entF gene Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 102000045512 human CFH Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 230000007108 local immune response Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 108010091867 peptide P Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960005224 roxithromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу создания живой вакцины на основе биологически активного штамма Еnterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей антигена клинически актуального патогенного микроорганизма. Настоящий способ предусматривает получение слитого гена entF-bac, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика E. faecium L3 и фрагмента гена bac и имеющего нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 7а, его клонирование и выявление бактериальных клонов, экспрессирущих нужный белок в пилях. Изобретение также относится к рекомбинантной плазмидной ДНК pentF-bac. Настоящая ДНК pentF-bac предназначена для создания живой вакцины на основе биологически активного штамма Е. faecium L3. Указанная ДНК pentF-bac представляет собой суицидную плазмиду pT7ERMB, по сайтам BamHI и KpnI которой вставлена последовательность ДНК слитого гена entF-bac. Настоящее изобретение также относится к вакцинному препарату E. faecium L3 Вас+. Указанный вакцинный препарат получают путем электропорации E. faecium L3 плазмидной ДНК pentF-bac. Настоящее изобретение позволяет получать живую вакцину на основе биологически активного штамма Е. faecium L3. 3 н.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной генетики и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин против стрептококков Streptococcus agalactiae (стрептококков группы В (СГВ)) и Streptococcus pyogenes (стрептококков группы А (СГА)).
Проблема вакцинной профилактики инфекций, вызываемых стрептококками, стафилококками и пневмококками, только в последнее время стала рассматриваться в качестве актуальной проблемы в медицинской науке.
Streptococcus agalactiae или стрептококк группы В (СГВ) является основной причиной смерти новорожденных от сепсиса, менингита или бактериальной пневмонии. Новорожденные приобретают бактерии через родовой канал их матери, являющейся носителем СГВ или антенатально в случае бессимптомного носительства СГВ у матери. Стрептококковая инфекция у детей старшего возраста часто выражена в виде артрита, остеомиелита и поражения кожных покровов. СГВ также способны вызывать выкидыши, внутриутробное повреждение плода, послеродовой сепсис и другие патологии у взрослых. СГВ все чаще рассматривается как возбудитель урогенитальных инфекций у взрослых, а также септических процессов у лиц пожилого возраста.
Streptococcus pyogenes (СГА) являются широко распространенным патогеном для человека и приматов, инфицируя, главным образом, назофарингеальную слизистую и кожу. Стрептококки, инфицирующие слизистую человека, вызывают острую ангину, скарлатину, хронический тонзиллит и фарингит, которые часто сопровождаются серьезными осложнениями, такими как отит, ревматизм и гломерулонефрит. К кожным заболеваниям, вызываемым СГА, относятся импетиго, васкулиты, гнойные посттравматические и постожоговые поражения тканей, рожистое воспаление. В ряде случаев инфекции, вызванные СГА, переходят в более генерализованные формы: некротический фасцит, стрептококковый сепсис и токсический шоковый синдром. Эти заболевания характеризуются высоким процентом летальных исходов вследствие быстрого развития шока на фоне общей недостаточности работы органов человеческого организма.
Несмотря на профилактические меры, широкий спектр тяжелых заболеваний, вызываемый СГВ и СГА, рассматривается как существенная медицинская и эпидемиологическая социально-экономическая проблема в большинстве стран, в том числе и в развитых.
Профилактику инфекционных заболеваний стрептококковой этиологии осуществляют с применением бензатин бензилпенициллина, эритромицина, ампициллина и сульбактама [Бурбелло А.Т. и др. Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 323-324, 332, 352 (2003)]. Для лечения больных с заболеваниями, вызванными СГВ, используют антибиотики [Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Соврем. Антимикроб. Химиотер., М.: Боргес, 1-432 (2002), Поляк М.С. Основы антибиотикотерапии, СПб: НИЦФ, 1-53 (2003)]. Наибольшее распространение получили представители группы пенициллинов - бензилпенициллин и ампициллин, а также макролиды: эритромицин, ванкомицин, азитромицин, кларитромицин, рокситромицин [(Семина Н.А., Сидоренко С.В. и др. Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. 6(4): 306-359 (2004), Зуева Л.П., Поляк М.С. и др. Микробиологический мониторинг, СПб: Медицинский информационно-аналитический центр, 1-72 (2004)].
Сложность при лечении и профилактике посредством антибиотикотерапии возникает в связи с многообразием побочных эффектов, проявляющихся у пациентов: негативное действие на центральную нервную и сердечно-сосудистую, иммунную системы организма, нарушение микробиоценоза организма, а также аллергические реакции. Неэффективность терапии с применением антибиотиков в ряде случаев обусловлена появлением антибиотико-резистентных штаммов СГВ и СГА.
Отсутствие безопасных и эффективных мер по профилактике и лечению заболеваний, вызываемых СГВ или СГА делает актуальным направление по разработке антибактериальных вакцин.
Разработка вакцинных препаратов для профилактики данных заболеваний идет в направлении создания различных форм рекомбинантных полипептидных и конъюгированных полисахаридных вакцин.
Группе исследователей удалось сконструировать ряд эффективных конъюгированных поливалентных СГВ вакцин на основе полисахаридных антигенов, соответствующих основным серотипам бактерий [Baker CJ., Paoleti L.C., Wessels M.R. et al., J. Infect Dis., 179: 142-150 (1999)].
Недостатком полисахаридных вакцин является низкая эффективность вследствие недостаточной иммуногенности самой полисахаридной капсулы, Т-независимого характера иммунного ответа и узкой типовой специфичности антител, поскольку существует одиннадцать различных серотипов СГВ [Lindahl G. и др. Clin Microbiol Rev. 18(1): 102-127 (2005); Slotved H.C., Kong F., и др. J Clin Microbiol. 45(9): 2929-36 (2007)].
Расширение пределов специфичности полисахаридных вакцин достигается за счет включения в вакцинный препарат полисахаридов, принадлежащих всем наиболее распространенным серотипам СГВ, что существенно удорожает стоимость вакцины. Наиболее хорошо разработаны и доведены до этапа клинических испытаний конъюгированные вакцины, представляющие собой комплекс полисахаридов СГВ и бактериальных токсинов и токсоидов, используемых в качестве адъювантов. Препятствием на пути применения препаратов подобного типа у людей является наличие иммунитета к адъювантным компонентам вакцины, что ощутимо снижает иммунный ответ на специфический полисахарид [Burrage M., Robinson A. и др. Infect Immun. 70: 4948-54 (2002)].
Ранее было показано, что поверхностные белки СГВ могут служить компонентами вакцины, эффективной против СГВ-инфекции [Грабовская К.Б., Леонтьева Г.Ф., Мерингова Л.Ф. и др. Медицинская иммунология, 6: 133-138 (2006)]. Используя генно-инженерные подходы, были созданы рекомбинантные конструкции, соответствующие иммуногенным участкам ряда стрептококковых поверхностных белков. Профилактическая вакцинация рекомбинантными полипептидами обеcпечила возможность защиты лабораторных животных от инфекции, вызванной различными серотипами СГВ [Суворов А.Н., Грабовская К.Б., Леонтьева Г.Ф и др. Журнал микробиол., 2: 44-50 (2010)].
В состав разработок СГВ вакцин на основе рекомбинантных белков входят рекомбинантные полипептиды, полученные на основе хорошо изученных поверхностных белков стрептококка группы В: Bac, Sip, Rib, C5a пептидазы, LrrP [Yang H.H., Madoff L.C. Inf. Immun. 75: 3455-61 (2007); Martin D., Rioux S. и др. Infect Immin. 70(9): 4897-4901 (2002); Stålhammar-Carlemalm M. и др. J Exp Med. 177(6): 159301603; Cleary P.P., Matsuka Y.V. и др., Vaccine 22(31032): 4332-41 (2004); Seepersaud R., Hanniffy S.B. Infect Immun. 73(3): 1671-83 (2005)].
Недостатком рекомбинантных моновакцин против стрептококков группы В является дифференциальная экспрессия различных поверхностных белков бактерий в зависимости от фазы роста, а также существование антигенной вариабельности белков среди бактериальных штаммов одного вида.
Другим недостатком рекомбинантных моновакцин является отсутствие экспрессии поверхностного белка, на основе которого была создана моновакцина, некоторыми стрептококковыми штаммами. Следствием этого станет неэффективность такой моновакцины в отношении определенных стрептококковых штаммов. Примером может служить Вас белок, который не продуцируется СГА штаммами.
Среди разработок СГВ вакцин получен четырехкомпонентный комплекс рекомбинантных полипептидов, полученных на основе четырех консервативных белков СГВ [Maione D., Margarit I. и др. Science 309 (5731): 148-150 (2005)]. Три из этих белков входят в состав пилей СГВ, четвертый белок был идентифицирован как Sip.
К недостаткам этого комплекса можно отнести использование в ходе иммунизации лабораторных животных адъюванта Фрейнда, который, как было продемонстрировано еще в 1993 г., является токсически активным веществом [Gupta R.k., Relyveld E.H. и др. Vaccine 11: 293-306 (1993)].
К недостаткам этого комплекса также относится отсутствие данных о синергетическом эффекте комплекса по отношению к синтезу специфических антител, а также высокая вариабельность белков пилей у штаммов СГВ.
Также недостатком комплекса является продемонстрированная протективность специфических антител только по отношению к стрептококку группе В.
Наиболее востребованными вакцинами, специфичными в отношении СГА, являются вакцины на основе различных производных антифагоцитарного М белка. В литературе описаны вакцинные препараты на основе консервативного эпитопа пептида P 145, локализованного в области C повторов и расположенного проксимально по отношению к клеточной стенке бактерии; на основе полипептида, соответствующего полноразмерному участку С-повторов; а также рекомбинантного полипептида, составленного из N-терминальных последовательностей М белков, принадлежащих 26 различным М-серотипам СГА [Good M., Cleary P. и др. New generation vaccines, M.M. Levine (ed.), NY, 695-710 (2004); (Fischetti V.A. ASM News 62: 405-410 (1996); Hu M.C., M.A. Walls и др. Infect. Immun. 70: 2171-2177 (2002)].
Вакцины на основе М белка СГА являются средством борьбы с инфекциями, вызываемыми стрептококком группы А, и не эффективны для профилактики СГВ инфекций.
Вакцинные препараты на основе других поверхностных белков СГА, в том числе общих для стрептококков групп А и В, находятся на начальных стадиях разработки [Hae-Sun Park H.S., Cleary P.P. Infect. Immun. 73(12): 7878-7886 (2005); Schulze Kai, Eva Medina и др. Vaccine 21(17-18): 1958-1964 (2003)].
Эффективное применение и белковых и полисахаридных вакцинных препаратов предусматривает двух- или трехкратную иммунизацию путем подкожных или внутримышечных инъекций с адъювантом, что может быть сопряжено с осложнениями и требует серьезных организационных и финансовых затрат.
Альтернативой использованию химических адъювантов для вакцинации является применение так называемых живых бактериальных вакцин на основе пробиотиков. Живые вакцины применяют, как правило, однократно, вводят подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины перорально и ингаляционно. Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ.
Пробиотики - препараты, оказывающие общее благотворное влияние на организм человека (чаще всего молочнокислые бактерии). Установлено, что некоторые пробиотики являются эффективными неспецифическими стимуляторами выработки специфических иммуноглобулинов против различных инфекций [Vintini E.O., Medina M.S., BMC Immunol., 12: 46 (2011), Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011)]. Пробиотики стали использоваться в качестве векторов, в часть из которых успешно внесены плазмидные конструкции, обеспечивающие зкспрессию антигенов патогенных бактерий [ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].
Разработана вакцина против Enterohemorrhagic Escherihia coli (EHEC), вызывающей уремический синдром [Ahmed, M. Loos, D. Vanrompay, E. Cox. Vaccine, 32: 3909-3916 (2014). Он является причиной острой почечной недостаточности у детей и пожилых людей. В своей вакцине авторы используют пробиотический штамм Lactococcus lactis, который является безопасной бактерией и может служить платформой для пероральной вакцинации. В работе создан рекомбинантный штамм, в котором Lactococcus lactis экспрессирует антиген EHEC, EspB, в цитоплазме. Эта вакцина может быть особенно полезна для детей и пожилых людей, находящихся в группе высокого риска заболеваемости.
Персистенция подобных вариантов пробиотиков в организме способна не только стимулировать выработку протективных иммуноглобулинов, специфичных в отношении целевых антигенов возбудителя, но и обеспечить благоприятный фон для борьбы с инфекцией за счет усиления защитных реакций врожденного иммунитета.
Описано создание живой вакцины на основе штамма пробиотика Еnterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiae. [Гупалова Т.В., Леонтьева Г.Ф., Ермоленко Е.И. и др. Медицинский академический журнал, 13: 64-70, (2013)]. На основе штамма пробиотика Еnterococcus faecium L3 сконструирована первая генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка патогенного Streptococcus agalactiae.
Эта живая вакцина принята в качестве прототипа заявляемого изобретения.
В представленном изобретении для создания живой вакцины против СГВ в настоящей заявке использовался подход, основанный на введении bac гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 при экспрессии в пилях. Пили из энтерококков являются идеальными кандидатами для вакцин из-за их экспозиции на клеточной поверхности. Они выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство белков-антигенов. Пили состоят из мономеров, способных к агрегации, за счет чего увеличивается доза антигена, что способствует увеличению титров антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ. Поэтому способ введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 выгодно отличается от прототипа заявляемого изобретения, в котором рекомбинантный белок экспрессировался не на поверхности, а в цитоплазме бактерии.
В патенте представлены данные по конструированию и проверке иммуногенных и протективных свойств новой живой вакцины против Streptococcus agalactiae.
Для профилактики инфекций, передающихся половым путем, требуются безопасные и эффективные вакцины, способные стимулировать иммунную защиту на слизистых оболочках генитального тракта. Пробиотические микроорганизмы рассматриваются в настоящее время как хорошая основа для получения рекомбинантных живых вакцин, экспрессирующих вакцинные антигены возбудителей актуальных инфекций [Vintini E.O., Medina M.S., BMC Immunol., 12: 46 (2011); Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011); ME Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].
Отличие данного исследования от других экспериментальных работ с живыми вакцинами на основе пробиотиков заключается в том, что обычно пробиотики используют в качестве природных адъювантов иммунного ответа, а антиген вводится отдельно. Другой подход заключается во введении гена целевого белка непосредственно в пробиотик в составе экспрессионной плазмиды. Настоящее исследование представляет собой способ интеграции участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент белка патогенного микроорганизма, в структуру хромосомной ДНК энтерококка. При этом задача генетической части работы состояла в осуществлении интеграции гетерологичного участка ДНК в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF. В данном исследовании в качестве бактерии-реципиента использовался хорошо изученный пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, обладающий целым рядом уникальных биологических свойств.
Штамм Еnterococcus faecium L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [Yermolenko E., Suvorov A., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)]. Осуществлено физическое картирование штамма Еnterococcus faecium L3 [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potencial for human health, 104-112, (2011)]. В экспериментах на здоровых самках мышей показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма Еnterococcus faecium L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но и не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [Суворов А., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)], способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном S.agalactiae и Staphylococcus aureus [Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)]. В штамме Еnterococcus faecium L3, как и у других грамположительных бактерий, были найдены пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 μm и диаметром 2-10 nm [Telford JL, Barocchi MA, Margarit I et al. Nature Reviews Microbiology 4: 509-519, (2006)]. Это длинные белок подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезиии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [Camille Danne, Shaynoor Dramsi. Research in Microbiology, 163: 645-658, (2012)]. Пили из энтерококков являются идеальными кандидатами для вакцин из-за их экспозиции на клеточной поверхности.
В качестве существенного фактора вирулентности СГВ рассматривается уникальный поверхностный протеин - Вас белок, или β антиген (130 kDa), экспрессируемый многими штаммами СГВ серотипов Ia, Ib, II и V, не имеющий гомологов среди других бактериальных белков. Отличительной особенностью Bac белка является способность связывать Fc-часть IgA человека, основным иммуноглобулином, обеспечивающим защиту слизистых от проникновения микроорганизмов. [Jerlstrom p.G., Talay S.R. и др. Infect. Immun. 64: 2787-2793 (1991)]. Также Вас белок взаимодействует с фактором H (FH) человека - белком плазмы крови, связывание которого приводит к инактивации альтернативного пути комплемента и способствует адгезии микроорганизма к человеческим клеткам. Способность вступать во взаимодействие с двумя указанными компонентами иммунной системы человека позволяет СГВ уклоняться от иммунного ответа [Eur. J. Immunol. - 1985. - №15. - P. 893-899; Adv. in host defense mechanisms. - 1985. - V. 4. - P. 31-61]. Распространенность среди штаммов СГВ, важная роль в обеспечении вирулентности бактерий, консервативность структуры белка обусловили выбор Вас как основы для создания потенциальных компонентов вакцинных препаратов. Кроме того, ранее было показано, что рекомбинантный дериват белка Bac - полипептид Р6, обладает хорошими иммуногенными свойствами, а стимулированный его введением иммунитет обеспечивает защиту от летальной СГВ-инфекции [Грабовская К.Б., Леонтьева Г.Ф., Мерингова Л.Ф. и др. Медицинская иммунология, 6: 133-138, (2006)].
Задачей данного изобретения явилась разработка способа создания живой вакцины на основе биологически активного штамма Еnterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей антигена клинически актуального патогенного микроорганизма. Предложенный способ основан на введении участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент различных белков патогенных микроорганизмов, в структуру пилей пробиотика и создании вакцины против инфекций, вызываемых СГА, СГВ или пневмококками.
Задача решалась конкретно на примере введения bac гена патогенных СГB в хромосомную ДНК пробиотического штамма Еnterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях:
а) получение слитого гена entF-bac и его клонирование;
б) выявление бактериальных клонов, экспрессирущих Bac белок в пилях;
в) иммунизация мышей живой пробиотической вакциной/
г) определение Bac-специфических антител в крови и вагинальных смывах.
Сущностью предлагаемого изобретения является создание уникальной живой вакцины, обладающей выраженным иммуногенным и протективным эффектами.
Авторами заявляемого изобретения на основе штамма пробиотика Еnterococcus faecium L3, содержащего пили на своей поверхности, сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена Вас патогенного Streptococcus agalactiae. Интравагинальное введение вакцины Еnterococcus faecium L3- Вас+ стимулировало развитие системного иммунного ответа. На модели острой вагинальной инфекции у беспородных мышей аппликация живой пробиотической вакцины приводила к защите от летальной СГВ-инфекции. Конструирование живых вакцин на основе биологически активных пробиотических штаммов за счет включения в их структуру антигенов клинически актуальных патогенных микроорганизмов позволяет объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула. Подобные вакцинные препараты могут быть полезны для профилактики острых и лечения хронических инфекций, передаваемых половым путем.
Поставленная задача решалась получением слитого гена entF-bac и его клонированием. Для этого были сконструированы уникальные праймеры, представленные в таблице.
Таблица. Олигонуклеотидные праймеры
Название | Ориентация | Нуклеотидная последовательность от 5' к 3' |
А1 | прямой |
GGGGTACCCCCGATGAGAGCAGCTGGTATTG
|
B1 | обратный | CAGAATCATTTGTTTCATCAAACAATGCGCCATCATAGTTT |
C1 | прямой | TGGAGCAGGTTGAGAAGGAAGGTTCTGCGCGAGTGATAGAT |
D1 | обратный | CAACAAGCTTCAAAGCATCGTTGG |
E1 | прямой | TTGATGAAACAAATGATTCTGATG |
F2 | обратный | TTCCTTCTCAACCTGCTCCA |
D2 | обратный | CAACAGGATCCAAAGCATCGTTGG |
B3 | прямой | TCAGCAACGTGTGTCTTGGT |
B4 | обратный | CGAACCTTTACTTCGGCATC |
Подчеркнутые звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции.
Фрагменты ДНК, соответствующие фрагментам гена Enterococcus faecium L3 и фрагменту гена bас, были амплифицированы в ПЦР с помощью Tag полимеразы («Ampli Tag», Perkin-Elmer, Cetus, USA) и амплификатора (BIO-RAD, USA). Проведена амплификация отдельных двух фрагментов гена Enterococcus faecium L3 с праймерами А1 и В1 и с праймерами С1 и D1 и фрагмента гена P6 с праймерами E1 и F1. Синтез слитого фрагмента осуществляли с праймерами A1 и D1. Одна пара праймеров представлена одновременно участком ДНК энтерококков, а другая участком гена bac. Дизайн праймеров предполагал образование слитого гена без стоп-кодонов в местах сшивок. В результате постановки двух последовательных этапов ПЦР сначала получены отдельные части конструкции, а затем и целый слитый фрагмент ДНК. Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2, используя Clone JET™ PCR Cloning Kit (Fermentas). В результате клонирования была создана уникальная гибридная ДНК entF-bac с использованием плазмиды pJET1.2. Клон, содержащий гибридную ДНК entF-bac, обладал IgA связывающей способностью. Гибридная ДНК entF-bac из плазмиды pJET1.2 была переклонирована в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину. Для этого была проведена амплификация гибридной плазмиды с праймерами A1 и D2. В результате клонирования была получена плазмида pentF-bac с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину и обладала IgA-связывающей активностью.
В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой получены трансформанты. Отобранный Bac+ клон проверяли в реакции ПЦР со специально сконструированными праймерами для секвенирования B3 и B4. ДНК-секвенирование подтвердило соответствие теоретически запланированной схемы экспериментально полученным участкам слияния гена entF с фрагментом гена bac (entF-bac). Этот клон энтерококков, экспрессирующий Bac белок, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.
Иммуногенные свойства вакцинного штамма Еnterococcus faecium L3- Bac+ и протективную эффективность вакцинации изучали на двух равных группах самок беспородных мышей. В этих целях опытной группе мышей вводили Еnterococcus faecium L3- Bac+, а контрольной группе мышей вводили исходный штамм Еnterococcus faecium L3 орально в составе питьевой воды на 1, 2, 3, 6, 7, 22, 23 и 24 в дозе 2×108 на мышь в день. С этой целью суспензию бактерий помещали в бутылку с водой и заменяли ее только после того, как содержимое было полностью выпито. Обе экспериментальные группы находились в течение всего эксперимента на одной и той же диете. Через 40 дней от начала эксперимента две группы мышей, получавшие Enterococcus faecium L3 и Еnterococcus faecium L3-Bac+ соответственно, были заражены внутрибрюшинно Streptococcus agalactiae Н36 (Ibc) в дозе 3×107/мышь в объеме 0,5 мл. В каждую группу входило 20 мышей. Через 5, 24 и 48 часов от начала инфекции определяли содержание бактерий в селезенках 5-6 мышей из группы. На 35 день от начала эксперимента у 10 мышей из каждой группы проводили забор крови из подчелюстной вены. Титр Р6-специфических антител определяли общепринятым методом ИФА.
Через 35 дней от начала эксперимента в крови мышей, получавших вместе с питьевой водой штамм Еnterococcus faecium L3-Bac+, содержащий в составе пилей полипептид Р6 СГВ, были обнаружены Р6- специфические антитела класса G (фиг. 8).
После внутрибрюшинного заражения Streptococcus agalactiae Н36 (Ibc) в дозе 3×107/мышь выявлены различия в динамике очищения мышей от инфекции. Если в группе мышей, получавших «вакцинный» вариант Еnterococcus faecium L3-Bac+, наблюдалось неуклонное снижение содержания бактерий в селезенке, то в группе мышей с исходным вариантом пробиотика отмечено постепенное накопление СГВ (фиг. 9).
Таким образом, мышам вместе с питьевой водой per os в три приема продолжительностью два-три дня вводили генетически модифицированный штамм пробиотика Еnterococcus faecium L3-Bac+, в структуру пилей которого был инкорпорирован полипептид Р6 СГВ.
Анализ сывороток крови исследуемых животных через 35 дней от начала эксперимента позволил обнаружить циркуляцию Р6-специфических IgG и заключить, что присутствие вакцинного варианта Еnterococcus faecium L3-Bac+ в желудочно-кишечном тракте стимулировало развитие Р6-специфического системного иммунного ответа. Мыши этой группы при сравнении с контролем оказались более устойчивыми к внутрибрюшинному заражению штаммом Н36 СГВ, несущим в своем составе белок Bac, антигенно аналогичный полипептиду Р6. Последнее позволяет заключить, что иммунный ответ, вызванный приемом модифицированного полипептидом Р6 пробиотика, имеет очевидную протективную эффективность в отношении генетически гомологичного возбудителя.
Таким образом, на основе штамма пробиотика Еnterococcus faecium L3 сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка Bac патогенного Streptococcus agalactiae. Белок Bac был встроен в структуру пилей. Интравагинальное введение вакцины Еnterococcus faecium L3-Bac+ стимулировало развитие системного и местного иммунного ответа. На модели острой вагинальной инфекции у беспородных мышей аппликация живой пробиотической вакцины приводила к защите от летальной СГВ-инфекции.
Описан способ создания живой вакцины на основе биологически активного штамма за счет включения в его структуру антигена клинически актуального патогенного микроорганизма. Этот способ основан на введении слитого гена, состоящего из двух участков гена энтерококка и фрагмента гена, кодирующего нужный белок патогенных микроорганизмов в структуру пробиотиков.
Пример 1. Получение фрагментов гена Еnterococcus faecium L3 и фрагмента гена bac
Для работы были выбран пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, хромосомную ДНК которого использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выделения хромосомной ДНК клетки микроба лизировали 50 мM ЭДТА (Serva, Германия) и лизоцимом в концентрации 1 мг/мл. ДНК депротеинезировали фенолом и хлороформом, а затем экстрагировали спиртом. Для амплификации фрагмента гена bac использовали плазмидную ДНК Р6.
Фрагменты ДНК, соответствующие фрагментам гена Enterococcus faecium L3 и фрагменту гена bac, были амплифицированы в ПЦР с помощью Tag полимеразы («Ampli Tag», Perkin-Elmer, Cetus, USA) и амплификатора (BIO-RAD, USA). Олигонуклеотидные праймеры представлены в таблице 1. Проведена амплификация отдельных двух фрагментов гена Enterococcus faecium L3 с праймерами А1 и В1 и с праймерами С1 и D1 и фрагмента гена P6 с праймерами E1 и F1. В пробирки с 0,25 мкг геномной ДНК добавляли по 10 μМ каждого из специфических праймеров, фланкирующих исследуемую последовательность, буфер с магнием для полимеразы, по 0,2 мМ четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, объем доводили водой до 25 мкл и добавляли 0,5 мкл термостабильной Tag полимеразы. Пробирки помещали в амплификатор и инкубировали при 94°С 2 мин. Программа ПЦР состояла из: денатурации при 94°С - 30 сек, отжига праймеров - 55°С - 1 мин и синтеза - 72°С - 1 мин. Этот цикл повторялся 30 раз, после чего смесь инкубировалась при 72°С 10 мин. ПЦР продукты разделяли в 1% агарозном геле в горизонтальном электрофорезе. Выделение амплифицированных участков ДНК проводили с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, CША). Анализ размера полученных фрагментов ДНК проводили, исходя из сравнения их электрофоретических подвижностей с элетрофоретической подвижностью маркера молекулярных весов (100 п.н. ДНК-маркер, Хеликон).
На фиг. 1 (Электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов)
1 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
2 - продукт ПЦР с праймерами А1 и В1
3 - продукт ПЦР с праймерами С1 и D1
4 - продукт ПЦР с праймерами E1 и F1
Пример 2. Получение слитого гена entF-bac и его клонирование.
Синтез слитого фрагмента осуществляли с праймерами A1 и D1. Программа ПЦР состояла из: денатурации при 94°С - 30 сек, отжига праймеров - 55°С - 1 мин и синтеза - 72°С - 2 мин. Этот цикл повторялся 30 раз, после чего смесь инкубировалась при 72°С 10 мин. ПЦР продукты разделяли в 1% агарозном геле в горизонтальном электрофорезе. Выделение амплифицированного участка ДНК проводили с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, CША). Анализ размера полученного фрагмента ДНК проводили, исходя из сравнения их электрофоретических подвижностей с элетрофоретической подвижностью маркера молекулярных весов (100 п.н. ДНК-маркер, Хеликон).
На фиг. 2 (Электрофореграмма амплифицированного слитого фрагмента ДНК):
1 - Продукт ПЦР (слитый фрагмент)
2 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
Пример 3. Клонирование слитого фрагмента ДНК
Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2, используя Clone JET™ PCR Cloning Kit (Fermentas). Реакционная смесь состояла из 1мкл PCR- продукта, 1 мкл ДНК-вектора pJET1.2 (50 ng/μl), 10 мкл лигазного буфера, 1 мкл T4 ДНК-лигазы и 7 мкл бидистиллированной воды. Лигазную смесь инкубировали при 220 С 5 мин. Лигазную смесь использовали для трансформации в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора трансформантов содержала 100 мкг/мл ампициллина. Получили 14 трансформантов, из которых были выделены плазмидные ДНК (фиг. 3).
На фиг. 3. (Электрофореграмма плазмид, выделенных из 14 трансформантов).
1-7 - плазмиды 1-7
8-14 - плазмиды 8-14
К - плазмида pJET1.2.
Как следует из чертежа, вставку содержали плазмиды 1, 4, 9, 10, 12 и 13.
Эти плазмиды были рестрицированы ферментами KpnI и HindIII (фиг. 4).
На фиг. 4. (Электрофореграмма рестрицированных плазмид KpnI и HindIII).
1 - плазмида 1, 2 - плазмида 4, 3 - плазмида 9, 4 - плазмида 10, 5 - плазмида 12, 6 - плазмида 13.
7 - 1 kb маркер (сверху вниз: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 и 250 нуклеотидных пар).
Как следует из чертежа, нужный фрагмент содержала плазмида 4. Клон, содержащий 4 плазмиду, обладал IgA-связывающей способностью.
Гибридная ДНК (entF-bac) была переклонирована в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину. Для этого была проведена амплификация плазмиды 4 с праймерами A1 и D2. ПЦР-продукт и плазмида pT7ERMB были рестрицированы ферментами BamHI и KpnI. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК рестрикты выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора содержала 5 мкг/мл эритромицина. Из трансформантов были выделены 44 плазмиды. 11 плазмид содержали ожидаемую вставку и ген устойчивости к эритромицину и клоны, содержащие эти плазмиды, обладали IgA-связывающей активностью (фиг. 5).
На фиг. 5. (Электрофореграмма плазмид, выделенных из 21 трансформанта с 24 по 44 (из 44 полученных клонов).
1-21 - плазмиды 24-44
22 - эритромициновая плазмида pT7ERMB
Как следует из чертежа, вставка есть в 24, 26, 31, 33, 34, 40, 42, 43 и 44 плазмидах.
Рестрикция этих плазмид KpnI и BamHI подтвердили наличие нужной вставки (фиг. 6).
На фиг. 6. (Электрофореграмма рестрицированных плазмид KpnI и BamHI)
1 - исходная плазмида (нерестрицированная), 2 - 24, 3 - 25, 4 – 26, 5- 29, 6 - 31, 7 - 33, 8 - 34, 9 - плазмида pJET1.2.
1kb маркер (сверху вниз: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 и 250 нуклеотидных пар). Для дальнейшей работы выбрали плазмиду, выделенную из клона 34 и обозначенную как pentF-bac.
Плазмидную ДНК pentF-bac использовали как матрицу в ПЦР с праймерами B3 и B4. Амплификат выделяли после электрофореза в 1% агарозном геле и секвенировали. Нуклеотидная последовательность соответствовала известной нуклеотидной последовательности двух фрагментов гена энтерококка и встроенному между ними фрагменту bac гена [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potencial for human health, 104-112, (2011), Heden L.O., Frithz E., Lindahl G. Eur. J. Immunol., 21: 1481-1490, (1991)].
На фиг. 7а представлена нуклеотидная последовательность, состоящая из 1689 п.н. плазмидной ДНК pentF-bac.
На фиг. 7б показана аминокислотная последовательность слитого белка, состоящая из 563 аминокислотных остатков.
Пример 4. Электропорация энтерококков.
Для электропорации энтерококков культуру Еnterococcus faecium L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (THB) («HiMedia», Индия) и выращивали в течение ночи при 37°С, затем пересевали в 50 мл бульона THB 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности 650 нм 0.3. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерола при температуре 4°С, полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали и конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разлили по 50 мкл в пробирки и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В. Во льду к клеткам добавили ДНК (pentF-bac плазмиду, 300 нг). Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл THB, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 2.5 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа.
В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой pentF-bac были получены трансформанты. Отобранный Bac+ клон 2 дополнительно проверяли в реакции ПЦР с праймерами, соответствующими последовательности bac гена и последовательности ДНК энтерококков. Для этого из клона 2 выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Реакция ПЦР, а также ДНК-секвенирование подтвердило, что полученный клон кодируется слитым геном, имеющим последовательность гена bac, и фрагментов гена энтерококков, такую же, как и полученную при секвенировании плазмидной ДНК pentF-bac. Клон энтерококков, экспрессирующий Bac, был обозначен как Еnterococcus faecium L3 Bac+ и выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.
Пример 5. Иммунизация мышей живой пробиотической вакциной.
Иммуногенные свойства вакцинного штамма Еnterococcus faecium L3- Bac+ и протективную эффективность вакцинации изучали на двух равных группах самок беспородных мышей. В этих целях опытной группе мышей вводили Еnterococcus faecium L3-Bac+, а контрольной группе мышей вводили исходный штамм Еnterococcus faecium L3 орально в составе питьевой воды на 1, 2, 3, 6, 7, 22, 23 и 24 в дозе 2×108 на мышь в день. С этой целью суспензию бактерий помещали в бутылку с водой и заменяли ее только после того, как содержимое было полностью выпито. Обе экспериментальные группы находились в течение всего эксперимента на одной и той же диете. Через 35 дней от начала эксперимента в крови мышей, получавших вместе с питьевой водой штамм Еnterococcus faecium L3-Bac+, содержащий в составе пилей полипептид Р6 СГВ, были обнаружены Р6- специфические антитела класса G (фиг.8).
На фиг. 8. (Средний титр специфических IgG в сыворотках крови мышей после введения живой вакцины и пробиотика per os).
1 столбик - живая вакцина Еnterococcus faecium L3- Bac+
2 столбик - пробиотик Еnterococcus faecium L3
По оси ординат - 1/титр
Через 40 дней от начала эксперимента две группы мышей, получавшие и Еnterococcus faecium L3- Bac+ и исходный штамм Еnterococcus faecium L3, были заражены внутрибрюшинно Streptococcus agalactiae Н36 (Ibc) в дозе 3×10 7/мышь в объеме 0,5 мл. В каждую группу входило 20 мышей. Через 5, 24 и 48 часов от начала инфекции определяли содержание бактерий в селезенках 5-6 мышей из группы. С этой целью селезенки разрушали на измельчителе в одинаковых условиях и гомогенаты высевали на плотной среде кровяного агара капельным методом для дальнейшего подсчета. Количественные показатели выражали в абсолютных значениях -КОЕ/селезенку.
После внутрибрюшинного заражения Streptococcus agalactiae Н36 (Ibc) в дозе 3х107/мышь выявлены различия в динамике очищения мышей от инфекции. Если в группе мышей, получавших вакцинный вариант Еnterococcus faecium L3- Bac+, наблюдалось неуклонное снижение содержания бактерий в селезенке, то в группе мышей с исходным вариантом пробиотика Еnterococcus faecium L3 отмечалось постепенное накопление СГВ (фиг. 9).
На фиг. 9. (Содержание СГВ в селезенке инфицированных мышей).
По оси ординат - КОЕ × 104
По оси абсцисс - время инфекции, 2 часа и 24 часа, 1 и 3 столбики Еnterococcus faecium L3- Bac+, 2 и 4 - Еnterococcus faecium L3.
Таким образом, анализ сывороток крови исследуемых животных через 35 дней от начала эксперимента позволил обнаружить циркуляцию Р6-специфических IgG и заключить, что присутствие вакцинного варианта Еnterococcus faecium L3- Bac+ в желудочно-кишечном тракте стимулировало развитие Р6-специфического системного иммунного ответа. Мыши этой группы при сравнении с контролем оказались более устойчивыми к внутрибрюшинному заражению штаммом Н36 СГВ, несущим в своем составе белок Bac, антигенно аналогичный полипептиду Р6. Последнее позволяет заключить, что иммунный ответ, вызванный приемом модифицированного полипептидом Р6 пробиотика, имеет очевидную протективную эффективность в отношении генетически гомологичного возбудителя.
Claims (3)
1. Способ создания живой вакцины на основе биологически активного штамма Е. faecium L3 за счет включения в структуру его пилей антигена клинически актуального патогенного микроорганизма, заключающийся в получении слитого гена entF-bac, имеющего нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 7а, и его клонировании, выявлении бактериальных клонов, экспрессирущих нужный белок в пилях, иммунизации мышей живой пробиотической вакциной и определении белок-специфических антител в крови и вагинальных смывах.
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-bac, представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена bac и имеющего нуклеотидную последовательность, представленную на фиг.7а, в суицидную плазмиду pT7ERMB по сайтам BamHI и KpnI, используемая для создания живой вакцины по п. 1.
3. Вакцинный препарат Enterococcus faecium L3 Вас+, полученный после электропорации плазмидной ДНК pentF-bac по п. 2, в котором Enterococcus faecium L3 экспрессирует слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 7б, способный вызывать синтез анти-Р6, причем образующиеся специфические антитела обладают протективными свойствами в отношении Streptococcus agalactiae.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015145759A RU2640250C2 (ru) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма enterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015145759A RU2640250C2 (ru) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма enterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015145759A RU2015145759A (ru) | 2017-04-26 |
RU2640250C2 true RU2640250C2 (ru) | 2017-12-27 |
Family
ID=58642060
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015145759A RU2640250C2 (ru) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма enterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2640250C2 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2701733C1 (ru) * | 2018-12-14 | 2019-10-01 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Живая вакцина на основе штамма пробиотиков ENTEROCOCCUS FAECIUM L3 для профилактики инфекции, вызванной STREPTOCOCCUS PNEUMONIE |
RU2745626C1 (ru) * | 2020-12-05 | 2021-03-29 | Суворов Александр Николаевич | Способ создания живой вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 и живая вакцина Enterococcus faecium L3-pentF-covid-19 |
RU2776479C1 (ru) * | 2020-09-18 | 2022-07-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Живая пробиотическая вакцина, содержащая консервативные эпитопы вируса гриппа А (LAH+4M2e), для профилактики гриппозной инфекции |
-
2015
- 2015-10-23 RU RU2015145759A patent/RU2640250C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Ma Y. et al. Construction of Bifidobacterium infantis as a live oral vaccine that expresses antigens of the major fimbrial subunit (CfaB) and the B subunit of heat-labile enterotoxin (LTB) from enterotoxigenic Escherichia coli, Microbiology, 2012. * |
Vintini E.O. et al. Host immunity in the protective response to nasal immunization with a pneumococcal antigen associated to live and heat-killed Lactobacillus casei, BMC immunology, 2011. * |
Гупалова Т.В. и др. Создание и опыт применения живой вакцины на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiae. Медицинский академический журнал, 2013. * |
Гупалова Т.В. и др. Создание и опыт применения живой вакцины на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiae. Медицинский академический журнал, 2013. Ma Y. et al. Construction of Bifidobacterium infantis as a live oral vaccine that expresses antigens of the major fimbrial subunit (CfaB) and the B subunit of heat-labile enterotoxin (LTB) from enterotoxigenic Escherichia coli, Microbiology, 2012. Vintini E.O. et al. Host immunity in the protective response to nasal immunization with a pneumococcal antigen associated to live and heat-killed Lactobacillus casei, BMC immunology, 2011. * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2701733C1 (ru) * | 2018-12-14 | 2019-10-01 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Живая вакцина на основе штамма пробиотиков ENTEROCOCCUS FAECIUM L3 для профилактики инфекции, вызванной STREPTOCOCCUS PNEUMONIE |
RU2777061C2 (ru) * | 2019-11-22 | 2022-08-01 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Живая пробиотическая вакцина для профилактики инфекции, вызванной вирусом гриппа |
RU2776479C1 (ru) * | 2020-09-18 | 2022-07-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Живая пробиотическая вакцина, содержащая консервативные эпитопы вируса гриппа А (LAH+4M2e), для профилактики гриппозной инфекции |
RU2745626C1 (ru) * | 2020-12-05 | 2021-03-29 | Суворов Александр Николаевич | Способ создания живой вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 и живая вакцина Enterococcus faecium L3-pentF-covid-19 |
RU2782529C1 (ru) * | 2021-12-23 | 2022-10-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ создания живого штамма энтерококка L3-SARS на основе биологически активного штамма Е. faecium L3 |
RU2820058C1 (ru) * | 2022-12-15 | 2024-05-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ создания рекомбинантного штамма энтерококка L3-SARSN1 на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2015145759A (ru) | 2017-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Cheng et al. | Removal of group B streptococci colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme | |
US8066990B2 (en) | Lysin protein having broad antibacterial activity specific to bacteria | |
JP6054371B2 (ja) | 病原性疾患における細菌mamポリペプチドの調節 | |
Zhang et al. | GapA, a potential vaccine candidate antigen against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) | |
Wang et al. | Phosphoglycerate kinase enhanced immunity of the whole cell of Streptococcus agalactiae in tilapia, Oreochromis niloticus | |
KR20140017554A (ko) | 폐렴 구균에 대한 백신 및 조성물 | |
Aliramaei et al. | Expression of Helicobacter pylori CagL gene in Lactococcus lactis MG1363 and evaluation of its immunogenicity as an oral vaccine in mice | |
Hoang et al. | Recombinant resuscitation-promoting factor protein of Nocardia seriolae, a promissing vaccine candidate for largemouth bass (Micropterus salmoides) | |
RU2640250C2 (ru) | Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма enterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях | |
WO2006130925A1 (en) | Genetic manipulation of clostridium difficile | |
EP2597151A2 (en) | Recombinant microorganisms, methods for preparing vaccine strains, antigens, and vector vaccine compositions of same, uses thereof, and related antibodies, diagnostic kit, and treatment and/or prophylactic methods | |
Riquelme-Neira et al. | Vaccination with DNA encoding truncated enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) factor for adherence-1 gene (efa-1′) confers protective immunity to mice infected with E. coli O157: H7 | |
CN113329766A (zh) | 艰难梭菌多组分疫苗 | |
Daifalla et al. | Commensal Streptococcus mitis is a unique vector for oral mucosal vaccination | |
KR20210029217A (ko) | 염증성 장 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 | |
KR20200076551A (ko) | 마이코플라즈마 폐렴 및 흉막폐렴 예방용 백신 조성물 | |
Fischetti et al. | 12 The Use of Phage Lytic Enzymes to Control Bacterial Infections | |
RU2701733C1 (ru) | Живая вакцина на основе штамма пробиотиков ENTEROCOCCUS FAECIUM L3 для профилактики инфекции, вызванной STREPTOCOCCUS PNEUMONIE | |
TW201718001A (zh) | 豬物種中增強之免疫反應 | |
Israr et al. | Lactic acid bacteria as vectors: a novel approach for mucosal vaccine delivery | |
Roth et al. | Evaluation of the humoral immune response in BALB/c mice immunized with a naked DNA vaccine anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus | |
EP2450053B1 (en) | Novel antigen of enterococcal pathogens and use thereof as vaccine component for therapy and/or prophylaxis | |
Liu et al. | Construction and characterization of recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing the babA2/ureI fusion gene of Helicobacter pylori | |
CA2739688C (en) | Composition comprising sortase anchored surface proteins of streptococcus uberis | |
RU2782529C1 (ru) | Способ создания живого штамма энтерококка L3-SARS на основе биологически активного штамма Е. faecium L3 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181024 |