ES2386973T3 - Virus PRRS, clones infecciosos, mutantes de los mismos, y métodos de utilización - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido infeccioso que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identi-dad con la secuencia de la Figura 1A y una deleción de al menos 57 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2062 hasta el nucleótido 3864 de la secuencia de la Figura 1A.

Description

Virus PRRS, clones infecciosos, mutantes de los mismos, y métodos de utilización.

Datos de la solicitud continuada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los EE.UU. nº. de Serie 60/694.021, presentada el 24 de junio de 2005.

Antecedentes

El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) es el agente causal de una enfermedad caracterizada por trastornos respiratorios en los cerdos jóvenes e insuficiencia reproductiva en las marranas (Benfield et al.,

J. Vet. Diagn. Invest., 4:127-133 (1992); Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126 (1992); Wensvoort et al., Vet. Q., 13:121-130 (1991)) y es actualmente endémico en la mayoría de los países. Este síndrome fue reconocido por primera vez como una "enfermedad misteriosa del cerdo" en los Estados Unidos en 1987 y se descubrió en Europa en 1990. Las dos cepas virales prototipo (Lelystad VR-2332) difieren en la secuencia de nucleótidos aproximadamente en un 40% y representan dos genotipos distintos, a los que se hace referencia como cepas Europea (EU o Tipo 1, Lelystad; Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993)) y Norteamericana (NA o Tipo 2, VR-2332; Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)) (Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Mardassi et al., J. Gen. Virol., 75:681-5 (1994); Meng et al., Arch. Virol., 140:745-55 (1995); Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Se ha hecho referencia también a la enfermedad como síndrome de Wabash, enfermedad misteriosa del cerdo, síndrome reproductivo y respiratorio porcino, plaga de los cerdos, síndrome de aborto epidémico y respiratorio porcino, enfermedad de aborto azul, enfermedad azul del oído, aborto azul y aborto tardío epidémico porcino. La enfermedad se caracteriza por insuficiencia reproductiva en las marranas preñadas y problemas respiratorios en los cerdos de todas las edades. La enfermedad tiene un impacto negativo importante en la industria porcina.

PRRSV es un virus de RNA envuelto de sentido positivo perteneciente a la familia Arteriviridae perteneciente al orden Nidovirales (Cavanagh, Arch. Virol., 142:629:633 (1997)). EL genoma de PRRSV varía de 15,1 a 15,5 kb de longitud (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)). El primer 75% del genoma codifica la poliproteína replicasa esencial para la replicación del virus y está constituido por dos grandes marcos de lectura abiertos (ORFs) (1a y 1b) que son procesados cotraduccionalmente en proteínas más pequeñas por proteasas viralmente codificadas (Snijder et al., J. Gen. Virol., 79: 961-79 (1998)). Las proteínas estructurales están codificadas por siete ORFs aguas abajo y son traducidas por una serie anidada co-terminal 3' de mRNAs subgenómicos (sgmRNA) (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)). En la cepa VR-2332, la región codificante del genoma (15411 bases) está flanqueada por regiones 5' y 3' no traducidas de 189 y 151 nucleótidos, respectivamente.

La cepa VR-2332 de PRRSV ha sido bien caracterizada en términos de su secuencia genómica completa (Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)), la capacidad de PRRSV para producir constitutivamente especies de RNA subgenómicas defectuosas denominadas heteróclitos (en latín: formas poco comunes) (Yuan et al., Virology, 275:158169 (2000)); Yuan et al., Virus Research, 105:75-87 (2004)), y sus propiedades de crecimiento tanto in vitro como in vivo (Murtaugh et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 102:105-349 (2004)). Adicionalmente, un clon infeccioso de este genoma de 15,4 kb de NA PRRSV ha sido producido y examinado en cuanto a su capacidad para causar enfermedad en los cerdos (pVR-HN; Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)).

PRRSV continúa causando pérdidas económicas importantes en todo el mundo. Se dispone de vacunas, pero las mismas están basadas en una sola cepa de PRRSV, y existen pruebas de que las cepas de PRRSV varían a los niveles antigénico y genético. Adicionalmente, desde que el virus fue identificado en Europa y en los Estados Unidos, han continuado surgiendo nuevos fenotipos de la enfermedad.

Sumario de la invención

Informes previos habían sugerido que las deleciones y/o mutaciones de cualquier cepa del virus PRRS eran en muchos casos extremadamente perjudiciales para el crecimiento del virus. Específicamente, laboratorios individuales habían realizado mutaciones en el extremo 3' del virus, el virus resultante era inestable y volvía rápidamente a la secuencia de tipo salvaje, o crecía muy deficientemente o no crecía en absoluto (Lee et al., Virol., 331:47-62 (2005); Choi et al., J. Virol., 80:723-736 (2006); Lee et al., Virolog., 346:238-250 (2005)). Así, en la comparación de las secuencias de nucleótidos de la cepa europea (genotipo Tipo 1) y VR-2332 (genotipo Tipo 2), no se sabía dónde realizar mutaciones en VR-2332 nsp2 que no fueran extremadamente perjudiciales.

Sin embargo, la alineación de las secuencias genómicas completas de los nuevos virus PRRS Tipo 2 con VR-2332 comenzó a proporcionar ideas en cuanto a dónde podrían producirse mutantes viables. La mutagénesis de deleción ulterior demostró que la región entre los aminoácidos 324-813 de nsp2 no era necesaria para crecimiento in vitro.

La presente invención proporciona un polinucleótido infeccioso que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad con la secuencia de la Figura 1A y una deleción de al menos 57 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2062 hasta el nucleótido 3864 de la secuencia de la Figura 1A. Se proporciona también un polinucleótido infeccioso que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad con la secuencia de GenBank nº. de acceso M96262.2 y una deleción de al menos 57 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2061 hasta el nucleótido 354 de la secuencia de GenBank nº. de acceso M96262.2. El polinucleótido puede estar presente en un vector, en una partícula de virus, presente en una célula, o una combinación de los mismos. Cuando está presente en un vector, un promotor de RNA-polimerasa puede estar enlazado operativamente al polinucleótido. El polinucleótido puede ser un RNA. El polinucleótido puede incluir dos o más deleciones, y cada deleción puede ser independientemente de al menos 57 nucleótidos consecutivos. El polinucleótido puede incluir adicionalmente un polinucleótido exógeno presente en la deleción, y el polinucleótido exógeno puede codificar un polipéptido, tal como un marcador detectable.

La presente invención proporciona también un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad con la secuencia de la Figura 1A y al menos una deleción de al menos 57 nucleótidos consecutivos correspondientes a los nucleótidos 2062 a 3864 de la secuencia de la Figura 1A, y en donde el polinucleótido se replica y produce partículas infecciosas de virus cuando se introduce en una célula. Se proporciona también un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad con la secuencia de GenBank nº. de acceso M96262.2 y al menos una deleción de al menos 57 nucleótidos consecutivos correspondientes a los nucleótidos 2061 a 3545 de la secuencia de GenBank nº. de acceso M96262.2, en donde el polinucleótido se replica y produce partículas infecciosas de virus cuando se introduce en una célula. El polinucleótido puede estar presente en un vector, en una partícula de virus, presente en una célula, o una combinación de los mismos. Cuando está presente en un vector, puede estar enlazado operativamente al polinucleótido un promotor de RNA-polimerasa. El polinucleótido puede ser un RNA. …El polinucleótido puede incluir dos o más deleciones, y cada deleción puede ser independientemente de al menos 57 nucleótidos consecutivos. El polinucleótido puede incluir adicionalmente un polinucleótido exógeno presente en la deleción, y el polinucleótido exógeno puede codificar un polipéptido, tal como un marcador detectable.

Se proporciona también por la presente invención un polinucleótido infeccioso que comprende la secuencia de nucleótidos de Figura 1E, Figura 1F, Figura 1G, Figura 1H, Figura 1I, Figura 1J, Figura 1K, Figura 1L o Figura 1M, y un polipéptido nsp2 codificado por un polinucleótido infeccioso que comprende la secuencia de nucleótidos de Figura 1G, Figura 1H, Figura 1I, Figura 1J, Figura 1K, Figura 1L o Figura 1M.

Los términos "comprende" y variaciones del mismo no tienen un significado limitante en los casos en que aparecen estos términos en la descripción y las reivindicaciones. A no ser que se especifique otra cosa, "un", "uno/a", "el/la" y "al menos uno/a" se utilizan de modo intercambiable y significan uno o más de uno.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. A. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) del polinucleótido infeccioso VR-V7 (al que se hace referencia también en esta memoria como V6G7475A). B. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) del polinucleótido infeccioso VR-V5. C. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) del polinucleótido infeccioso VR-V5G7475A. D. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 4) del polinucleótido infeccioso VR-V6. E. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) del polinucleótido infeccioso MN184A. F. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:6) del polinucleótido infeccioso MN184B. G. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:7) del polinucleótido infeccioso nsp2 Δ324-434. H. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:8) del polinucleótido infeccioso nsp2 Δ324-523. I. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:9) del polinucleótido infeccioso nsp2 Δ543-632. J. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:10) del polinucleótido infeccioso nsp2 Δ633-726. K. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:11) del polinucleótido infeccioso nsp2 Δ543-726. L. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:12) del polinucleótido infeccioso nsp2 Δ727-813. M. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:13) del polinucleótido infeccioso nsp2 Δ324-726.

Figura 2. Ensamblaje de los clones de longitud total de la cepa VR-2332 de PRRSV. El genoma 15.4 se amplificó en 4 secciones (I-IV) que incorporaban sitios singulares de escisión por enzimas de restricción presentes en el cDNA viral (FseI, AvrII, BsrGI) o añadidos a la secuencia de PRRSV en los extremos 5' y 3' por mutagénesis de inserción (SphI, PacI respectivamente). Un promotor de polimerasa T7 y dos residuos G sin matriz y un residuo T precedían a la secuencia viral. El vector pOK12 (24) se modificó para incluir un sitio PacI y una ribozima de la hepatitis delta aguas abajo de una cola de poli-adenosina de 50 nucleótidos.

Figura 3. Esquema de los cambios de nucleótidos de clones infecciosos o progenie de cerdos. Se presenta El diagrama de la organización del genoma de PRRSV bajo el cual se encuentran comparaciones del genoma completo. Se representan escisiones de proteínas no estructurales supuestas en la parte superior ORF1a y 1b, representadas por flechas descendentes. Los restos de firma se identifican bajo ORF1a y 1b, con flechas ascendentes que indican su situación en el genoma de PRRSV [cisteína-proteasa α y β semejante a papaína (PCPα, PCPβ); cisteínaproteasa (CP); serina/proteasa 3C (SP/3CP); polimerasa (POL); rico en cisteína/histidina (C/H); helicasa (Hel); endorribonucleasa específica de poli(U) homóloga de Xenopus laevis (XendoU); Ivanov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:12694-12699 (2004); Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)]. Las diferencias de nucleótidos se representan por barras verticales. 1. Cepa wt VR2332 (U87392) comparada con la vacuna derivada de VR-2332 (Ingelvac® MLV o RespPRRS, AF066183). 2. Cepa wt VR-2332 comparada con pVR-V6G7475A. 3. pVR-V5 comparado con V5-1-P3 sometido a pases in vivo (Sw612). 4. Cepa wt VR-2332 comparada con Sw612. Los cambios detallados de nucleótidos se enumeran en las Tablas 4 y 5.

Figura 4. Seroconversión de cerdos después de la infección con PRRSV. Se infectaron cerdos en crecimiento con la cepa wt nativa VR-2332 (□), Ingelvac® MLV (x), V5-1 P3 (○) o se dejaron sin infección (■). Los días indicados, se tomaron muestras de suero y se testaron por Elisa IDEXX para indicación de la seroconversión por anticuerpos anti-PRRSV para la proteína de la nucleocápsida.

Figura 5. A. Ensayos de calvas sobre la progenie P3 (primer linaje) de todos los clones infecciosos así como la cepa wt VR-2332 revelaron tamaños de calva diferentes. B. La progenie de V5-1 P3 después de crecimiento en cerdos (Sw612) producía calvas similares a la cepa wt VR-2332.

Figura 6. A. Los ensayos de calvas sobre la progenie P3 (segundo linaje) de todos los clones infecciosos así como de la cepa wt VR-2332 exhibían tamaños de calva que eran diferentes de las preparaciones de virus del primer linaje. B. Los títulos de virus P4 indican progenie de clones infecciosos que no se replicaban como la cepa wt VR2332 o el virus Sw612 a pesar de tener tamaño de calva similar.

Figura 7. A. Las progenies P3 de la cepa wt VR-2332 (♦), Sw612 (▲), pVR-HN (□), pVR-V5 (x), pVR-V5G7475A (*), pVR-V6 (●), pVr-V6G7475A (○) se examinaron simultáneamente respecto a cinética de crecimiento en un solo paso como se reseña en el Ejemplo 1. La cepa wt VR-2332 y los virus Sw612 se replicaban con títulos aproximadamente 10 veces mayores en todos los momentos. pVR-V6G7475A, sin cambio alguno de aminoácido respecto al virus nativo o la vacuna, producía virus que se replicaba a un título mayor en todos los momentos que todas las progenies restantes de clones infecciosos. El título final para cada preparación de virus se enumera en la tabla que se acompaña.

Figura 8. El análisis por transferencia Northern de diferentes pases de la progenie de pVR-V6G7475A así como Sw612 y el transcrito inicial in vitro revela que se producen heteróclitos tan pronto como P1 y, junto con RNA genómico, son más abundantes con los pases. Sin embargo, el RNA transcrito (Tx) no contiene especies heteróclitas fácilmente detectables.

Figura 9. A. Representación diagramática del genoma de PRRSV. Las escisiones de proteínas no estructurales supuestas se representan encima de ORF1a y 1b, representadas por flechas descendentes. Los restos de firma se identifican bajo ORF1a y 1b, indicando su situación en el genoma de PRRSV [cisteína-proteasa α y β semejantes a papaína (PL1); cisteína-proteasa (PL2); serina/3C-proteasa (3CL); polimerasa (RdRp); helicasa (Hel); endorribonucleasa (N) específica de poli(U) homóloga de Xenopus laevis; Ziebuhr et al., 2000; Ivanov et al., 2004; Gorvalenya et al., 2006]. B. Diagrama esquemático de la comparación de la proteína ORF1 (replicasa) de MN184A y MN184B y procesamiento supuesto. La degeneración observada en nsp2 se incluye en la comparación. C. Diagrama esquemático de la comparación de las proteínas ORF2-7 de MN184A y MN184B.

Figura 10. Alineación de la secuencia de aminoácidos ORF5 de PRRSV divergente. Los recuadros grises oscuros indican alta conservación de aminoácidos (> 80%; entre 16 y 19 residuos son idénticos); los recuadros grises medios (> 70%; entre 12 y 15 residuos son idénticos); los grises más claros (> 40%, entre 8 y 11 residuos son idénticos) y los recuadros sin sombreado (< 40%; menos de 8 residuos son idénticos) identifican residuos menos conservados. La región marcada con trazos indica la secuencia señal supuesta, las regiones encerradas en recuadros identifican las regiones transmembranales propuestas, se indican regiones hipervariables (HV-1 y HV-2), y se identifica la orientación propuesta de la proteína en el virión en negritas cursivas. El residuo cisteína conservado que se propone para interaccionar con la proteína M se identifica por la flecha descendente (↓). Los dos sitios de glicosilación en N supuestos conservados se identifican por asteriscos y la región hipervariable 1 contiene sitios de glicosilación en N específicos/de cepa/aislados (NxS/T). Se utilizaron para comparación las secuencias siguientes de longitud total de GenBank: VR-2332 (U87392), Ingelvac MLV (AF066183), 01NP1.2 (DQ056373), PL97-1 (AY58524), PA-8 (AF176348), SP (AF184212), BJ-4 (AF331831), HN1 (AY457635), 16244B (AF046869), HB-1 (AY150312), HB-2 (AY262352), CH-1a (AY032626), P129 (AF494042), JA142 (AY424271), SDPRRS-01-08 (AY375474), EuroPRRSV (AY366625), Lelystad (M96262), IAF-93-653 (U64931), IAF-Klop (AY184209), 98-3298 (DQ306877), 98-3403 (DQ306878), 99-3584 (DQ306879).

Figura 11. Alineación de la secuencia de aminoácidos nsp1β de PRRSV divergente. La derivación de la figura y el

esquema de colores se han descrito en la leyenda de la Figura 10. Los dos residuos catalíticos supuestos completamente conservados se identifican por asteriscos y los aminoácidos encuadrados identifican la conservación de la secuencia de MN184 con aislados de Tipo 1 y EAV. El sitio de escisión propuesto se identifica por la flecha descen

dente (↓).

Figura 12. Alineación de la secuencia de aminoácidos nsp2 de PRRSV divergente. Los residuos catalíticos de la cisteína-proteasa supuesta completamente conservada (Cys e His) se identifican por asteriscos y los aminoácidos incluidos en los recuadros significan la conservación de la secuencia de proteasas dentro de PRRSV y EAV. Los sitios de escisión propuestos se identifican por flechas compactas (↓); los sitios de escisión posibles adicionales se indican por una flecha cortada; el péptido señal, recuadro gris compacto; las regiones transmembranales (representadas en recuadros negros cortados; y los sitios potenciales de glicosilación en N, se indican por un asterisco (*). La derivación de la figura y el esquema de colores se describieron en la leyenda de la Figura 10.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

La presente invención incluye clones infecciosos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) VR-2332. Como se utiliza en esta memoria, el término "clon infeccioso" es un polinucleótido que tiene dos componentes; una secuencia de vector que se replica en una célula hospedadora procariota, y un segundo polinucleótido al que se hace referencia en esta memoria como un polinucleótido infeccioso. Cuando se transcribe in vitro para producir un polinucleótido de RNA y se introduce en una célula permisiva, el polinucleótido infeccioso se replica (como un RNA) y produce partículas infecciosas de virus . Así, un polinucleótido infeccioso puede estar presente en un vector como un DNA, como un RNA en una partícula de virus, o como un DNA o RNA aislado. El término "polinucleótido" se refiere a una forma polímera de nucleótidos de cualquier longitud, sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos, e incluye DNA y RNA tanto bi- como mono-catenarios. A no ser que se indique otra cosa, un polinucleótido incluye el complemento del mismo. La secuencia de nucleótidos del complemento de un polinucleótido puede ser determinada fácilmente por una persona con experiencia en la técnica. Un polinucleótido puede incluir secuencias de nucleótidos que tienen funciones diferentes, con inclusión por ejemplo de secuencias codificantes, y secuencias no codificantes tales como secuencias reguladoras y/o regiones no traducidas. Un polinucleótido puede obtenerse directamente a partir de una fuente natural, o se puede preparar con ayuda de técnicas recombinantes, enzimáticas,

o químicas. Un polinucleótido puede ser de topología lineal o circular. Un polinucleótido puede ser, por ejemplo, una porción de un vector, tal como un vector de expresión o clonación, o un fragmento.

Si se produce naturalmente, un polinucleótido se aísla preferiblemente, y más preferiblemente se purifica. Un compuesto "aislado", tal como un polinucleótido, polipéptido, o partícula de virus, es uno que está separado y apartado de su ambiente natural. Un compuesto "purificado" es uno que está exento al menos en un 60%, preferiblemente exento en un 75%, y muy preferiblemente exento en un 90% de otros componentes con los cuales se encuentra asociado naturalmente el mismo. Compuestos tales como polinucleótidos y polipéptidos que se producen fuera del organismo en el cual se encuentran naturalmente, v.g., por medios químicos o recombinantes, se considera que están aislados y purificados por definición, dado que los mismos no estaban nunca presentes en un ambiente natural.

Un ejemplo de un polinucleótido infeccioso de la presente invención incluye el polinucleótido infeccioso VR-V7 (Figura 1A). Se hace referencia a VR-V7 también en esta memoria como V6G7475A. Otros ejemplos de polinucleótidos infecciosos de la presente invención incluyen VR-V5 (Figura 1B), VR-V5G7475A (Figura 1C) y VR-V6 (Figura 1D). Debe indicarse que si bien las Figuras 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F y otras secuencias de nucleótidos virales se describen en esta memoria como una secuencia de DNA, la presente invención contempla la secuencia de RNA correspondiente, así como complementos de RNA y DNA de la misma.

Otros polinucleótidos infecciosos descritos en esta memoria tienen una secuencia de polinucleótidos que tiene semejanza estructural con un polinucleótido de referencia. Polinucleótidos de referencia incluyen la Figura 1A, la Figura 1B, la Figura 1C, la Figura 1D, la Figura 1E y la Figura 1F, la cepa prototipo Europea del virus PRRS, Lelystad (número de acceso a GenBank M96262.2; SEQ ID NO: 14), y la cepa prototipo Norteamericana del virus PRRS, VR2332 (número de acceso a GenBank U87392; SEQ ID NO: 15). Se hace referencia a la semejanza como un "identidad porcentual" y se determina por alineación de los residuos de los dos polinucleótidos (es decir, la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido candidato infeccioso y la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia) para optimizar el número de nucleótidos idénticos a lo largo de las longitudes de sus secuencias; se permiten lagunas en una cualquiera o ambas secuencias durante la alineación, a fin de optimizar el número de nucleótidos compartidos, aunque los nucleótidos en cada secuencia deben mantenerse sin embargo en su propio orden. En algunos aspectos, la laguna (a la que se hace referencia también como una deleción) está presente en la secuencia de polinucleótidos infecciosa candidato. Un polinucleótido infeccioso candidato es el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se compara con el polinucleótido de referencia. Un polinucleótido infeccioso candidato puede aislarse de un animal, tal como un cerdo infectado con PRRSV, aislarse de una línea de células de cultivo, o puede producirse utilizando técnicas recombinantes, o sintetizarse química o enzimáticamente. Dos secuencias de nucleótidos pueden compararse utilizando cualquiera de los algoritmos de ordenador disponibles comercialmente utilizados como herramienta de rutina para producir alineaciones de secuencias de nucleótidos. Preferiblemente, dos secuencias de nucleótidos se comparan utilizando el programa GAP del Paquete GCG Wisconsin (Accelrys, Inc.) versión

10.3 (2001). El programa GAP utiliza el algoritmo de Needleman et al., (J. Mol. Biol., 48: 443-453) 1970 a fin de encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de lagunas. Preferiblemente, se utilizan los valores por defecto para todos los parámetros de búsqueda GAP, con inclusión de la Matriz de Registro = NewsgapDNA.cmp, peso de laguna 50, peso de longitud = 3, coincidencia media = 10, falta de coincidencia = 0. En la comparación de dos secuencias de nucleótidos utilizando el algoritmo de búsqueda GAP, se hace referencia a la semejanza estructural como "identidad porcentual". Preferiblemente, un polinucleótido tiene semejanza estructural con un polinucleótido de referencia de al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad cuando la semejanza estructural se determina utilizando el programa GAP.

Si un polinucleótido es un polinucleótido infeccioso puede determinarse por inserción en un vector de un polinucleótido infeccioso candidato, transcripción del polinucleótido infeccioso candidato in vitro, transfección de una célula permisiva con las moléculas de RNA resultantes, y detección del RNA viral de la progenie, la proteína de la nucleocápsida viral de la progenie, detección de partículas infecciosas de virus , o una combinación de los mismos. El vector tiene preferiblemente las características de ser de número de copias bajo y se mantiene estable después de inserción de grandes insertos (v.g., de 15 kb). Un ejemplo de un vector adecuado es pOK y pOK12 (acceso a Gen-Bank AF223639; Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)), y otros vectores que tienen estas características son conocidos y están disponibles. En el vector, el polinucleótido infeccioso candidato se encuentra inmediatamente aguas abajo de un promotor. Promotores útiles son aquéllos que pueden ser inducidos para producir niveles altos de transcripción, tales como un promotor de RNA-polimerasa T7, por ejemplo TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO: 16), o los promotores de RNA-polimerasa SP6 y T3. La transcripción del polinucleótido infeccioso candidato incluye típicamente digestión con endonucleasas de restricción del vector para hacerlo lineal, y producción de transcritos de RNA por el uso de rutina y métodos de transcripción in vitro bien conocidos. Están disponibles comercialmente kits para transcripción in vitro (por ejemplo, mMessage y mMachine, disponibles de Ambion, Austin, TX).

Después de transcripción in vitro, el RNA se purifica utilizando métodos de rutina y se utiliza luego para transfectar una célula permisiva. Ejemplos de células permisivas incluyen, por ejemplo, BHK-21 (que permite una tanda de población de partículas de virus), CL-2621, MA-104 (ATCC CRL-2378), MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477483 (1993)), líneas de células clonadas a partir de estas líneas de células, o macrófagos alveolares primarios de porcino. Métodos para transfección eficiente de células incluyen el uso de bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3dimetilhidroxi-etil-amonio y colesterol (DMRIE-C) y otros productos disponibles comercialmente, con preferencia, DMRIE-C. Métodos para transfección eficiente de macrófagos alveolares primarios de porcino se conocen en la técnica (Groot Bramel-Verheige et al., Virol., 278:380-389 (2000)). Generalmente, pueden utilizarse para transfección 2 a 3 microgramos de RNA, pero pueden utilizarse cantidades menores y mayores. Después de un periodo de tiempo adecuado, la presencia de RNA viral de la progenie puede detectarse por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Análogamente, la proteína de la nucleocápsida viral de la progenie puede ser detectada, por ejemplo, por un anticuerpo específico de la nucleocápsida. Adicionalmente, puede detectarse si las partículas de virus producidas por células transfectadas con un nucleótido candidato infeccioso llegarán a infectar otra célula por exposición de células permisivas no infectadas al sobrenadante de las células infectadas. Opcionalmente, puede observarse efecto citopático (CPE). Un polinucleótido infeccioso candidato se considera que es un polinucleótido infeccioso cuando el mismo produce RNA viral de la progenie, proteínas virales de la progenie (nucleocápsida, membrana, GP5, y otras), e infecta otras células permisivas.

En algunos aspectos descritos en esta memoria, un polinucleótido infeccioso puede incluir una deleción de nucleótidos que codifican proteína 2 no estructural (nsp2), uno de varios polipéptidos (12 predichos) presentes en la poliproteína codificada por ORF1. En un virus PRRS, y polinucleótidos infecciosos del mismo, los nucleótidos que codifican el primer aminoácido de snp2 pueden determinarse por identificación del sitio de escisión de la proteasa 1 beta semejante a papaína, que se predice está situada después del aminoácido glicina ORF1 en la posición 383 de VR2332.

Con respecto a la identificación de los nucleótidos que codifican el último aminoácido de nsp2, no se ha determinado empíricamente el sitio de escisión C-terminal exacto de nsp2 de la poliproteína codificada por ORF1a, por lo que los nucleótidos que corresponden al extremo 3' de la región codificante se desconocen. Sin embargo, se han propuesto dos predicciones de sitios de restricción C-terminal, una Gly|Gly (donde la línea vertical entre los dos residuos glicina indica la localización de la escisión) en el aminoácido 980 en VR-2332, y la otra en el aminoácido 1197 en VR-2332. En la alineación de todas las secuencias PRRSV disponibles, existen varios dobletes Gly|Gly totalmente conservados dentro de esta porción, que pueden ser también el sitio de escisión en el terminal C de nsp2 de la poliproteína (aminoácidos 646, 980, 1116, 1196, 1197, en VR-2332). Las localizaciones de los dobletes Gly|Gly en los otros virus y polinucleótidos infecciosos pueden identificarse por comparación de las secuencias de nsp2 y los dobletes Gly|Gly descritos en la Figura 12. Los estudios actuales sugieren que pueden existir al menos tres sitios de escisión en nsp2, correspondientes a los aminoácidos 280, 1116, 1196 o 1197.

El polipéptido nsp2 incluye un dominio de cisteína-proteasa semejante a quimotripsina altamente conservado (identificado como CP en la Figura 3 y PL2 en la Figura 9) presente en el término N, y 3-4 dominios transmembranales predichos cerca del término C de nsp2 (donde el número de dominios transmembranales varía dependiendo de la localización del sitio de restricción C-terminal). Típicamente, la deleción de los nucleótidos que codifican los aminoácidos del dominio PL2 o la totalidad de los dominios transmembranales predichos da como resultado un polinucleótido que puede replicarse en células permisivas pero no producirá partículas infecciosas de virus . Así, un clon infeccioso de la presente invención no incluye típicamente la deleción del dominio PL2 entero o la totalidad de los dominios transmembranales predichos.

Los nucleótidos que codifican el dominio de cisteína- proteasa semejante a quimotripsina son los nucleótidos 1474 a 1776 de VR-V7 (Figura 1A), los nucleótidos 1474 a 1776 de VR-2332 (número de acceso a GenBank U87392), y los nucleótidos 1482 a 1784 de Lelystad (número de acceso a GenBank M96262.2). La localización de un dominio de cisteína-proteasa semejante a quimotripsina en la secuencia de nucleótidos de otros virus PRRS puede identificarse por alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido nsp2 codificado por un virus PRRS con la alineación de la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 12, y determinación de cuáles son los nucleótidos que codifican dichos aminoácidos que se alinean con el dominio de cisteína-proteasa semejante a quimotripsina. Alternativamente, las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos nsp2 de otros virus PRRS pueden identificarse por alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido nsp2 codificado por un virus PRRS con la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos nsp2 producidos por otros arterivirus, tales como el virus de la arteritis de los equinos (EAV) y el virus aumentador de la lactato-deshidrogenasa (LDV).

Los nucleótidos que codifican los dominios transmembranales predichos de VR-V7 (Figura 1A), VR-2332 (número de acceso a GenBank U87392) y Lelystad (número de acceso a GenBank M96262.2) se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Nucleótidos nsp2 que codifican dominios transmembranales predichos

VR-V7

VR-2332 Lelystad

Dominio transmembranal I

881 a 901 881 a 901 761 a 781

Dominio transmembranal II

913 a 934 913 a 934 793 a 814

Dominio transmembranal III

963 a 980 963 a 980 843 a 860

Dominio transmembranal IV

985 a 1003 985 a 1003 865 a 883

La localización de los dominios transmembranales en la secuencia de nucleótidos de otros virus PRRS puede identificarse por alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido nsp2 codificado por un virus PRRS con la alineación de la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 12, y determinación de qué nucleótidos codifican

10 aquellos aminoácidos que están alineados con los dominios transmembranales. Alternativamente, la localización de los dominios transmembranales puede identificarse con un algoritmo de computadora, tal como el algoritmo Predict-Protein como ha sido descrito por Rost et al. (Nucleic Acids Res., 32 (publicación del servidor de la Web): W321-326 (2004), o el algoritmo TMHMM descrito por Krogh et al. (J. Mol. Biol., 305:567-580 (2001)) y disponible en internet.

La deleción presente en los polinucleótidos infecciosos de la presente invención puede hallarse típicamente entre los

15 nucleótidos que codifican el dominio de cisteína-proteasa semejante a quimotripsina y los nucleótidos que codifican los dominios transmembranales, y no da como resultado un cambio de marco en el marco de lectura de ORF1. Como se ha expuesto anteriormente, la deleción no incluye típicamente todos los nucleótidos que codifican el dominio de cisteína-proteasa semejante a quimotripsina, todos los nucleótidos que codifican los dominios transmembranales,

o la combinación de los mismos. En algunos aspectos, por ejemplo cuando el polinucleótido infeccioso tiene seme

20 janza estructural con la secuencia de la Figura 1A, el límite 5' de una deleción se encuentra en el nucleótido 2305, el nucleótido 2205, el nucleótido 2105, o el nucleótido 2062, y el límite 3' de una deleción se encuentra en el nucleótido 3774, el nucleótido 3804, el nucleótido 3834, o el nucleótido 3864. En otros aspectos, por ejemplo cuando el polinucleótido infeccioso tiene semejanza estructural con la secuencia del nº. de acceso a GenBank M96262.2, el límite 5' de una deleción se encuentra en el nucleótido 2304, el nucleótido 2204, el nucleótido 2104, o el nucleótido 2061, y el

25 límite 3' de una deleción se encuentra en el nucleótido 3455, el nucleótido 3495, el nucleótido 3525, o el nucleótido 3545. La deleción puede ser de al menos 39 nucleótidos, 48 nucleótidos, o 57 nucleótidos. En algunos aspectos, la deleción puede ser al menos 267 nucleótidos, al menos 276 nucleótidos, o al menos 285 nucleótidos. En algunos aspectos, la deleción no es > 489 nucleótidos, no > 459, no > 429, o no > 402 nucleótidos. Un polinucleótido infeccioso puede tener más de una deleción en la región nsp2.

30 Ejemplos de polinucleótidos infecciosos derivados de VR-V7 y que contienen una deleción se describen en la Tabla

2.

Tabla 2. Polinucleótidos infecciosos derivados de VR-V7 (Figura 1A).

Polinucleótido*

Nucleótidos delecionados de la Figura 1A Aminoácidos delecionados de ORF1 Títulos virales (PFU/ml) Sumario de fenotipo**

nsp2 Δ0180-323

1876-2304 563-705 - no viable

nsp2 Δ242-323

2056-2304 623-705 - no viable

nsp2 Δ324-434

2305-2637 706-816 + (~105) tamaño de calva pequeño

nsp2 Δ324-523

2305-2904 706-905 + (~105-106) intermedio

nsp2 Δ543-632

2962-3231 925-1014 + (~105) tamaño de calva pequeño

nsp2 Δ633-726

3232-3513 1015-1108 + (~105) tamaño de calva pequeño

nsp2 Δ543-726

2962-3513 925-1108 + (~105) tamaño de calva pequeño

nsp2 Δ727-813

3514-3774 1109-1195 + (~105) tamaño de calva pequeño

nsp2 Δ324-726

2305-3513 706 -1108 + (~101-2) ND

nsp2 Δ324-813

2305-3774 706-1195 - no viable

nsp2 Δ727-845

3514-3870 1109-1227 - no viable

nsp2 Δ324-845

2305-3870 706-1227 - no viable

* La deleción se refiere a los aminoácidos de nsp2 que se delecionan, v.g., en el virus nsp2 Δ 180-323, se han dele5 cionado los aminoácidos 180-323 de nsp2.

** El tamaño de la calva se refiere a las calvas producidas por VR-2332 de tipo salvaje.

Un polinucleótido infeccioso que contiene una deleción puede incluir un polinucleótido exógeno insertado en el lugar de la deleción. Un polipéptido "exógeno" hace referencia a una secuencia nucleotídica extraña, es decir, una secuencia de nucleótido que no está presente normalmente en un virus PRRS o un clon infeccioso del mismo. El poli10 nucleótido exógeno puede incluir, y preferiblemente incluye de hecho un polipéptido. Polinucleótidos exógenos adecuados incluyen aquéllos que codifican un marcador detectable, v.g., una molécula que es detectada fácilmente por diversos métodos. Ejemplos incluyen polipéptidos fluorescentes (v.g., proteínas fluorescentes verdes, amarillas, azules, o rojas), luciferasa, cloranfenicol-acetil-transferasa, y otras moléculas (tales como c-myc, flag, 6xhis, el péptido HisGln (HQ) de fijación de metales, y el epítope V5) detectables por su fluorescencia, actividad enzimática o 15 propiedades inmunológicas, y son típicamente útiles cuando se detectan en una célula, por ejemplo, una célula cultivada, o una muestra de tejido que se ha extraído de un animal. Otros polinucleótidos exógenos que pueden utilizarse son aquéllos que codifican polipéptidos expresados por otras entidades, tales como células y patógenos. La expresión de un polinucleótido exógeno da como resultado un polinucleótido infeccioso que expresa antígenos extraños. Ejemplos de secuencias de nucleótidos exógenos incluyen aquéllas que codifican proteínas expresadas por 20 patógenos, preferiblemente patógenos de porcino, tales como el circovirus Tipo 2 porcino, Mycoplasma hyopneumoniae (v.g., las proteínas P46 y P65 de M. hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis (v.g. las proteínas de la membrana exterior de L. intracellularis), el ORF5 de diferentes cepas de PRRSV, y Streptococcus suis (v.g., la proteína de 38 kDa de S. suis). El polipéptido nsp2 tiene epítopes de células B y se espera sea inmunógeno. La inclusión de epítopes extraños en un polipéptido nsp2 se espera que dé como resultado una respuesta inmune a los epítopes

extraños. Ejemplos adicionales de polinucleótidos exógenos incluyen aquéllos que codifican modificadores de la respuesta biológica, tales como, por ejemplo, IFN-α, IFN-γ, IL-12, IL-2, TNF-α, e IL-6.

El polinucleótido exógeno se inserta en la región de deleción de tal modo que el mismo se encuentra en marco con el marco de lectura abierto que codifica nsp1α y insp2β, y puede insertarse en tándem más de un polinucleótido exógeno, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias de nucleótidos que codifican tres epítopes c-myc. El tamaño total del polinucleótido infeccioso que contiene un polinucleótido exógeno insertado en el sitio de la deleción es típicamente no > 16.000 bases, no > 15.800 bases, no > 15.600 bases, no > 15.400 bases, o no > 15.200 bases (con inclusión de la cola poliA). Puede estar presente una inserción en un polinucleótido infeccioso que tiene la deleción nsp2 Δ324-434, nsp2 Δ324-523, nsp2 Δ543-632, nsp2 Δ633-726, nsp2 Δ543-726, nsp2 Δ727-813, o nsp2 Δ324-726, preferiblemente la deleción nsp2 Δ324-434, nsp2 Δ543-632, nsp2 Δ633-726, nsp2 Δ543-726, nsp2 Δ727813, o nsp2 Δ324-726. Ejemplos preferidos de clones infecciosos que contienen un polinucleótido exógeno en la localización de una deleción incluyen un polinucleótido infeccioso que tiene la deleción nsp2 Δ324-434 que contiene una región codificante que codifica una proteína fluorescente verde de 238 aminoácidos, un polinucleótido infeccioso que tiene la deleción nsp2 Δ543-632 que contiene una región codificante que codifica una proteína fluorescente verde de 238 aminoácidos, un polinucleótido infeccioso que tiene la deleción nsp2 Δ324-434 que contiene una región codificante que codifica un epítope c-myc de 10 aminoácidos (EQKLISEEDL, SEQ ID NO: 17), un polinucleótido infeccioso que tiene la deleción nsp2 Δ324-434 que contiene una región codificante que codifica un epítope c-myc de 10 aminoácidos, y un polinucleótido infeccioso que tiene las deleciones nsp2 Δ324-726 o nsp2 Δ543-726, cada una de las cuales contiene una región codificante que codifica la repetición en tándem del epítope c-myc de 10 aminoácidos.

Un polinucleótido infeccioso está presente típicamente en un vector, y se hace referencia a la combinación de polinucleótido infeccioso y vector con un clon infeccioso, que se produce por genética inversa. Un vector es un polinucleótido replicante, tal como un plásmido, fago, o cósmido, al cual puede estar unido otro polinucleótido a fin de producir la replicación del polinucleótido unido. La construcción de vectores que contienen un polinucleótido de la invención emplea métodos estándar de DNA recombinante conocidos en la técnica (véase, v.g., Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)). Un vector puede proporcionar clonación adicional (amplificación del polinucleótido), es decir, un vector de clonación, o expresión del polipéptido codificado por la región codificante, es decir, un vector de expresión, o la combinación de los mismos. El término vector incluye, pero sin carácter limitante, vectores de plásmidos, vectores virales, vectores de cósmidos, o vectores de cromosomas artificiales. Típicamente, un vector es capaz de replicación en un hospedador bacteriano, por ejemplo E. coli. Preferiblemente, el vector es un plásmido.

La selección de un vector depende de una diversidad de características deseadas en el constructo resultante, tales como un marcador de selección, una tasa de replicación del vector, y análogos. Preferiblemente, un vector adecuado para uso como parte de un clon infeccioso es a la vez un vector de clonación y un vector de expresión. Los vectores útiles tienen un número de copias bajo en una célula hospedadora. Células hospedadoras adecuadas para clonación o expresión de los vectores de esta invención son células procariotas o eucariotas. Preferiblemente, la célula hospedadora secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Procariotas adecuados incluyen eubacterias, tales como organismos gram-negativos, por ejemplo, E. coli o S. typhimurium. Células hospedadoras ilustrativas útiles para producir, manipular, y mantener un clon infeccioso son DH5α, DH-1 (ATCC 33849), y AG-1, preferiblemente, DH-1 o AG-1.

Un vector incluye secuencias reguladoras enlazadas operativamente al polinucleótido infeccioso. El término "enlazado operativamente" hace referencia a una yuxtaposición de componentes tal que los mismos se encuentran en una relación que les permite funcionar de su manera deseada. Una secuencia reguladora está "enlazada operativamente" a un polinucleótido infeccioso de la presente invención cuando aquélla está unida de tal modo que la expresión de la región codificante se realiza en condiciones compatibles con la secuencia reguladora. Típicamente, un promotor es uno que proporciona fijación de especificidad alta de una RNA-polimerasa, y promotores de este tipo incluyen T7, SP6, y T3. Típicamente, el promotor está situado inmediatamente aguas arriba del primer nucleótido del polinucleótido infeccioso. Preferiblemente, está insertado un GGT entre el promotor y el primer nucleótido del polinucleótido infeccioso. Opcional y preferiblemente, el vector contiene también una ribozima del virus de la hepatitis delta aguas debajo de la región poliA.

Opcional y preferiblemente, el vector incluye una o más secuencias marcadoras de selección, que codifican típicamente una molécula que desactiva o detecta o es detectada de algún otro modo por un compuesto en el medio de crecimiento. Por ejemplo, la inclusión de una secuencia marcadora de selección puede hacer la célula transformada resistente a un antibiótico, o puede conferir metabolismo específico del compuesto a la célula transformada. Ejemplos de una secuencia marcadora de selección son secuencias que confieren resistencia a kanamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, y neomicina.

Cuando se produce una deleción de nucleótidos que codifican un polipéptido nsp2 en un clon infeccioso, pueden utilizarse métodos estándar de DNA recombinante conocidos en la técnica (véase, v.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Como reconocerán las personas expertas, es una práctica estándar durante la construcción de un clon infeccioso (y cuando se realizan deleciones de construcción en un clon infeccioso) verificar por análisis de la secuencia de nucleótidos la presencia de secuencias de nucleótidos esperadas, tales como deleciones u otras alteraciones y la ausencia de otras mutaciones. Análogamente, cuando se testa un polinucleótido infeccioso candidato para determinar si el mismo es infeccioso, es práctica estándar verificar por análisis de la secuencia de nucleótidos la ausencia de virus contaminante de tipo salvaje.

Se describen también en esta memoria polinucleótidos infecciosos descritos en la Figura 1E y la Figura 1F así como polinucleótidos infecciosos que tienen semejanza estructural con la secuencia de la Figura 1E o la secuencia de la Figura 1F. Métodos para determinación de la semejanza estructural se describen en esta memoria. Preferiblemente, un polinucleótido infeccioso de este aspecto tiene semejanza estructural con la secuencia de la Figura 1E o la secuencia de la Figura 1F de al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%. Se considera que un polipéptido que tiene semejanza estructural con la secuencia de la Figura 1E o la secuencia de la Figura 1F es un polinucleótido infeccioso si, cuando está presente en una partícula viral y se expone a células permisivas, el polinucleótido se replica en la células permisivas y produce partículas infecciosas de virus .

Se describen también en esta memoria partículas de virus. Como se utiliza en esta memoria, los términos "partícula de virus" y "partícula viral" se utilizan intercambiablemente y hacen referencia a un polinucleótido de la presente invención rodeado por una envoltura. Una partícula de virus descrita en esta memoria puede, cuando se añade a una célula permisiva cultivada, replicarse para dar como resultado la producción de más partículas virales.

Una partícula de virus puede hacerse crecer por pases in vivo o en cultivo de células. El sometimiento a pases in vivo incluye inocular un cerdo (Faaberg et al., Patente U.S. 7.041.443). El sometimiento a pases en cultivo de células incluye exponer células cultivadas a la partícula de virus e incubar las células en condiciones adecuadas para que el virus se reproduzca y produzca más partículas virales. Preferiblemente, las células cultivadas no son una línea de células inmortalizada o transformada (es decir, las células no son capaces de dividirse indefinidamente). Preferiblemente, se utilizan macrófagos alveolares primarios de porcino para el sometimiento a pases en cultivo de células (Faaberg et al., Patente U.S. 7.041.443).

Un virus descrito en esta memoria puede estar desactivado, es decir, puede estar incapacitado para reproducirse in vivo y/o en cultivo de células. Métodos de desactivación se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, tratamiento de una partícula de virus de la invención con un agente químico desactivador estándar tal como un reactivo aldehídico que incluye formalina, acetaldehído y análogos; alcoholes reactivos ácidos que incluyen cresol, fenol y análogos; ácidos tales como ácido benzoico, ácido benceno-sulfónico y análogos; lactonas tales como betapropiolactona y caprolactona; y lactamas, carbodiimidas y compuestos carbonil-diheteroaromáticos activados(as) tales como carbonil-diimidazol. Puede utilizarse también irradiación tal como por ejemplo irradiación ultravioleta y gamma para desactivar el virus.

Se describen también en esta memoria partículas de virus atenuadas (es decir, virus que tienen una capacidad reducida para causar los síntomas de la enfermedad misteriosa porcina en los cerdos), y métodos de producción de una partícula de virus atenuada. Métodos de producción de un virus atenuado se conocen en la técnica. Típicamente, un virus descrito en esta memoria se somete a pases, es decir se utiliza para infectar una célula en cultivo, se deja reproducir, y se cosecha finalmente. Este proceso se repite hasta que la virulencia del virus en los cerdos se reduce. Por ejemplo, el virus puede someterse a pases diez veces en cultivo de células, después de lo cual se mide la virulencia del virus. Si la virulencia no ha disminuido, el virus que no se inyectó en el animal se somete a pases diez veces más en cultivo de células. Este proceso se repite hasta que se reduce la virulencia. En general, la virulencia se mide por inoculación de cerdos con virus, y evaluación de la presencia de síntomas clínicos y/o DL50 (véase, por ejemplo, Halbur et al., J. Vet. Diagn. Invest., 8:11-20 (1996), Halbur et al., Vet. Pathol., 32:200-204 (1995), y Park et al., Am. J. Vet. Res., 57:320-323 (1996)). Preferiblemente, la virulencia se reduce hasta que el virus atenuado no causa la muerte de los animales, y preferiblemente no causa síntomas clínicos de la enfermedad.

Típicamente, un cultivo de células útil para producir un virus atenuado descrito en esta memoria incluye células de origen mamífero no porcino. Ejemplos de cultivos de células de mamífero no porcinas incluyen, por ejemplo, la línea de células MA-104 (ATCC CRL-2378), la línea de células MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477-483 (1993)), y la línea de células CL-2621 (Baustita et al., J Vet. Diagn. Invest., 5:163-165 (1993)). Preferiblemente, se utiliza un cultivo de células mixto para producir una partícula de virus atenuada descrita en esta memoria. En un cultivo de células mixto existen al menos dos tipos de células presentes. Preferiblemente, un cultivo de células mixto incluye una línea de células inmortalizada o transformada y un cultivo de células primario. Un cultivo de células mixto es particularmente útil cuando un virus se reproduce lentamente, o no se reproduce en absoluto, en una línea de células inmortalizada o transformada. Ejemplos preferidos de una línea de células inmortalizada o transformada para uso en un cultivo de células mixto incluyen, por ejemplo, la línea de células MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477483 (1993)), y la línea de células MA-104 (ATCC CRL-2378). Preferiblemente, los cultivos de células primarias para uso en un cultivo de células mixto son de origen porcino. Un ejemplo preferido de un cultivo de células primario para uso en un cultivo de células mixto son macrófagos primarios alveolares de porcino.

Se describen adicionalmente en esta memoria los polipéptidos codificados por regiones codificantes de nsp2 presentes en los polinucleótidos descritos en la Tabla 2, con inclusión de aquéllos que son viables. Se describen también en esta memoria anticuerpos, con inclusión de anticuerpos monoclonales y policlonales, que se fijan específicamente a un polipéptido codificado por las regiones codificantes de nsp2 presentes en los polinucleótidos descritos en la Tabla 2. El término "anticuerpo", a no ser que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos enteros que retienen su actividad de fijación para un antígeno diana. Tales fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2, así como anticuerpos monocatenarios (scFv). Como se utiliza en esta memoria, un anticuerpo que puede "fijarse específicamente" a un polipéptido es un anticuerpo que interacciona únicamente con el epítope del antígeno que indujo la síntesis del anticuerpo, o interacciona con un epítope estructuralmente afín. Un anticuerpo que "se fija específicamente" a un epítope interaccionará, en las condiciones apropiadas, con el epítope incluso en presencia de una diversidad de dianas de fijación posibles. Como se utiliza en esta memoria, el término "complejo polipéptido:anticuerpo" hace referencia al complejo que resulta cuando un anticuerpo se fija específicamente a un polipéptido, o una subunidad o análogo del mismo. En algunos aspectos, un anticuerpo descrito en esta memoria incluye aquéllos que no se fijan específicamente a un polipéptido nsp2 de longitud total codificado por VR-2332 (v.g., número de acceso a GenBank U87392, aminoácidos 384-1363 del ORF1 (véase también Allende et al. J. Gen. Virol., 80:307-315 (1999) o aminoácidos 384-1580 del ORF1 (véase también Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)). Tales anticuerpos pueden identificarse utilizando métodos de rutina conocidos en la técnica.

Los anticuerpos descritos en esta memoria se pueden preparar utilizando el polipéptido intacto. Opcionalmente, un polipéptido nsp2 descrito en esta memoria puede estar unido o conjugado covalentemente a un polipéptido portador para mejorar las propiedades inmunológicas del polipéptido. Polipéptidos portadores útiles se conocen en la técnica.

La preparación de anticuerpos policlonales es bien conocida. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse por inmunización con un inmunógeno de una diversidad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones, hámster, cobayos y ratas así como animales transgénicos tales como ovejas, vacas, cabras o cerdos transgénicos. Los anticuerpos resultantes pueden aislarse de otras proteínas utilizando una columna de afinidad que tenga un resto de fijación Fc, tal como proteína A, o análogos.

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse por diversos métodos familiares para los expertos en la técnica. Resumidamente, células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, comúnmente por fusión con una célula de mieloma, (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)). Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse a partir de cultivos de hibridoma por métodos bien conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, el anticuerpo puede producirse recombinantemente, por ejemplo, por presentación de fago

o por métodos combinatorios. La presentación de fago y los métodos combinatorios pueden utilizarse para aislar anticuerpos recombinantes que se fijan a un polipéptido descrito en esta memoria, o una subunidad biológicamente activa o análogo de la misma (véase, por ejemplo, Ladner et al., Patente EE.UU. nº. 5.223.409). Tales métodos pueden utilizarse para generar anticuerpos monoclonales humanos.

Se describen también en esta memoria composiciones que incluyen un polinucleótido infeccioso, polinucleótido PRRS, partícula de virus, o anticuerpo descrito en esta memoria. Tales composiciones incluyen típicamente un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en esta memoria, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solución salina, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y análogos, compatibles con administración farmacéutica. Compuestos activos adicionales pueden incorporarse también en las composiciones.

Una composición se puede preparar por métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. En general, una composición puede formularse de modo que sea compatible con su ruta de administración proyectada. Ejemplos de rutas de administración incluyen perfusión y ruta parenteral, v.g. intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (v.g. inhalación), transdérmica (tópica), y transmucosal. Las soluciones o suspensiones pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para administración, solución salina, aceites fijos, polietilen-glicoles, glicerina, propilen-glicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenes; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilenodiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos; electrólitos, tales como ion sodio, ion cloruro, ion potasio, ion calcio, e ion magnesio, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Una composición puede confinarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones pueden incluir soluciones acuosas estériles (en el caso de ser solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles. Para administración intravenosa, portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Una composición es típicamente estéril y, cuando es adecuada para uso inyectable, debe ser fluida en tal grado que exista susceptibilidad fácil de administración con jeringuilla. La composición debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y estar conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y análogos), y mixturas adecuadas de los mismos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y análogos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse por inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones estériles por incorporación del compuesto activo (es decir, un polinucleótido infeccioso o virus PRRS de la presente invención) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, en caso requerido, seguido por esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan por incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los arriba enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío y liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo o de los mismos previamente esterilizada por filtración.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en la forma de tabletas, trociscos, o cápsulas, v.g., cápsulas de gelatina. Estas composiciones pueden estar también conformadas en un polvo o suspendidas en una solución acuosa de tal modo que estos polvos y/o soluciones puedan añadirse al pienso animal o al agua de bebida de los animales. Estas composiciones pueden estar convenientemente edulcoradas o saborizadas por diversos agentes conocidos para promover la absorción de la vacuna oralmente por el cerdo.

Los compuestos activos se pueden administrar también por cualquier método adecuado para administración de agentes polinucleótidos, v.g., utilizando cañones de genes, bioinyectores, y parches dérmicos así como métodos sin aguja tales como la tecnología de vacunas de DNA de micropartículas descrita por Johnston et al (Patente EE.UU. nº. 6.194.389). Adicionalmente, es posible el suministro intranasal, como se describe, por ejemplo, en Hamajima et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 88:205-210 (1998). Pueden utilizarse también liposomas y microencapsulación.

Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, con inclusión de implantes. Pueden utilizarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Tales formulaciones se pueden preparar utilizando técnicas estándar. Los materiales pueden obtenerse también comercialmente de, por ejemplo, Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Pueden utilizarse también suspensiones de liposomas como portadores farmacéuticamente aceptables.Éstas se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica.

La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos activos pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales, v.g., para determinación de la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La ratio de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico, y puede expresarse como la ratio DL50/DE50. Se prefieren compuestos que exhiban índices terapéuticos altos.

Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo de células y estudios en animales pueden utilizarse en la formulación de una gama de dosificaciones para uso en el campo. La dosificación de tales compuestos está basada preferiblemente en una gama de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con toxicidad escasa o nula. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada.

Las composiciones se pueden administrar una o dos veces al día hasta una o más veces por semana, con inclusión de una sola vez en días alternos. El profesional experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación y la temporización requeridas para tratar eficazmente a un individuo, incluyendo, pero sin carácter limitante, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, el estado general de salud y/o la edad del individuo, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un individuo con una cantidad eficaz de un polipéptido puede incluir un solo tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos.

Se describen también en esta memoria métodos para utilización de las composiciones aquí descritas. En un aspecto, la invención incluye métodos que describen el tratamiento de uno o más síntomas de la enfermedad misteriosa del cerdo en un animal que puede estar causada por infección por un virus PRRS. El método incluye administrar una cantidad eficaz de una composición descrita en esta memoria a un animal que padece o se encuentra en riesgo de padecer la enfermedad misteriosa del cerdo, o síntomas de la enfermedad misteriosa del cerdo.

El tratamiento de la enfermedad misteriosa del cerdo, o los síntomas de la enfermedad misteriosa del cerdo, puede ser profiláctico o, alternativamente, puede iniciarse después de la aparición de la enfermedad o los síntomas de la misma. Como se utiliza en esta memoria, el término "síntoma" se refiere a la evidencia objetiva en un individuo de la enfermedad misteriosa del cerdo. Los síntomas asociados con la enfermedad misteriosa del cerdo y las evaluaciones de tales síntomas son rutinarios y se conocen en la técnica. Ejemplos de síntomas incluyen aborto, anorexia, fiebre, estado letárgico, neumonía, coloración roja/azul de las orejas, respiración laboriosa (disnea), y ritmo respiratorio incrementado (taquipnea). Se hace referencia en esta memoria a un tratamiento que es profiláctico, por ejemplo, iniciado antes que un individuo manifieste síntomas de una afección causada por un virus PRRS, como tratamiento de un individuo que se encuentra "en riesgo" de desarrollar la enfermedad o síntomas de la misma. Típicamente, un animal "en riesgo" es un animal que se encuentra en un área en la que se han diagnosticado animales que presentan la enfermedad o síntomas de la misma y/o es probable que se vea expuesto a un virus PRRS. De acuerdo con ello, la administración de una composición puede realizarse antes, durante, o después de la aparición de las condiciones descritas en esta memoria. El tratamiento iniciado después de la aparición de una condición puede dar como resultado disminución de la gravedad de los síntomas de una de las condiciones, o la eliminación completa de los síntomas.

En algunos aspectos, los métodos incluyen típicamente administrar a un animal una composición que incluye una cantidad eficaz de una partícula de virus descrita en esta memoria. Una "cantidad eficaz" es una cantidad efectiva para prevenir la manifestación de síntomas de la enfermedad misteriosa del cerdo, reducir la gravedad de los síntomas de la enfermedad, y/o eliminar por completo los síntomas. Típicamente, la cantidad eficaz es una cantidad que da como resultado una respuesta inmune humoral y/o celular que protege al animal durante la exposición futura a un virus PRRS. La partícula de virus utilizada en la composición puede contener un polinucleótido infeccioso que tiene una deleción como se describe en esta memoria. Opcionalmente, el polinucleótido infeccioso incluye también un polinucleótido exógeno presente en la localización de la deleción. Una ventaja de la utilización de una partícula de virus que tiene una deleción (o un polinucleótido exógeno presente en la localización de la deleción) es que la misma puede distinguirse fácilmente de otros virus PRRS, con inclusión del virus PRRS de tipo salvaje presentes en el campo. La partícula de virus puede identificarse por aislamiento del virus de un animal seguido, por ejemplo, por secuenciación, digestión con enzimas de restricción, o amplificación de nucleótidos específicos basada en PCR. A una partícula de virus "marcada" de este tipo se hace referencia a menudo en la técnica como vacuna marcadora.

En otros aspectos descritos en esta memoria, los clones infecciosos y/o polinucleótidos infecciosos descritos en esta memoria pueden utilizarse para investigar inserciones de genes viables, investigar RNA o proteínas alternativos expresados distintos del virus de longitud total, investigar recombinación viral, e investigar propiedades inmunógenas de nsp2 de longitud total con relación a nsp2 truncado.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se desarrollaron clones de cDNA de longitud total del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino de Norteamérica (PRRSV), cepa prototipo VR-2332, poseyendo cada versión progresiva menos cambios de nucleótidos que las versiones previas cuando se comparaban con la cepa wt VR-2332. Se recuperó el virus de la progenie de cada clon infeccioso y se analizó para verificación de la secuencia de nucleótidos, la tasa de crecimiento in vitro y el tamaño de las calvas. La progenie de un clon infeccioso confirmó una replicación robusta in vivo, observada por la aparición de anticuerpos alfa-PRRSV a la misma tasa que el virus wt. El análisis por transferencia Northern in vivo de la progenie reveló también que especies de RNA subgenómicas defectuosas, denominadas heteróclitos (formas no comunes), estaban presentes junto con genomas de longitud total. El análisis concurrente por transferencia Northern de una serie de pases de cultivos de células MA-104 infectadas reveló que el virus recombinante adquiría sólo gradualmente un perfil simultáneo de RNA de longitud total y heteróclito similares a la especie de RNA observada en la infección in vivo.

Materiales y métodos

Células y cepas virales. Células MA-104 o sus células descendientes MARC-145 (ATCC CRL-11171), una línea de células epiteliales de riñón del mono verde africano que soporta replicación de PRRSV (Meng et al., J. Vet. Diagn. Invest., 8:374-81 (1996)), se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (JRH Biosciences 56416), complementado con 1 mg/ml de NaHCO3 y 10% de suero bovino fetal (FBS), a 37ºC con 5% de CO2. Las células cultivadas se transfectaron con RNA o se infectaron con virus cuando el crecimiento monocapa había alcanzado 7080% de confluencia. Las cepas prototipo PRRSV de Norteamérica VR-2332 e Ingelvac® MLV han sido descritas previamente (Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001). La cepa VR-2332 crece hasta títulos equivalentes en ambas líneas de células.

Purificación del RNA viral. Se purificó RNA viral (vRNA) como se describe. (Chen et al., J Gen. Virol., 75:925-930 (1994); Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001)). Resumidamente, el sobrenadante de células MARC-145 infectadas con VR-2332 se cosechó el día 4 después de la infección (p.i.). Después de eliminación de los residuos celulares por centrifugación a 12.000 rpm, los sobrenadantes se estratificaron sobre una capa amortiguadora de 2 ml de sacarosa 0,5 M y se centrifugaron a 76.000 x g durante 4 horas. Los viriones reducidos a un sedimento se resuspendieron en 0,5 ml de LES (LiCl 0,1 M/EDTA 5 mM/1,0% SDS) y se digirieron ulteriormente por adición de 100 μg de proteinasa K a 56ºC para eliminar totalmente la proteína. Después de 10 minutos de incubación, se extrajo el vRNA varias veces con fenol ácido y fenol/cloroformo y se precipitó luego en etanol de 70% v/v. El vRNA reducido a un sedimento se resuspendió inmediatamente en 50 μl de agua o tampón TE exento de RNasa (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se guardó a -80ºC.

Construcción de cDNA viral de longitud total. La síntesis del cDNA se realizó con el Kit RT-PCR Enhanced Avian HS (Sigma, HSRT-100). Se utilizaron ocho cebadores PCR (Tabla 3) para amplificar cuatro fragmentos de cDNA solapantes que cubrían el genoma completo de VR-2332 (Figura 2). Las condiciones de los ciclos eran 94ºC durante 2

minutos, seguido por 35 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 68ºC durante 4-5 segundos, seguidos por 68ºC durante 5 minutos. Cada fragmento PCR se purificó con el Kit Gel Extraction QIAEX II (Qiagen) y se clonó en el vector pCR® 2.1-TOPO® con el Kit de Clonación TOPO TA® (Invitrogen K450001). Los plásmidos que representaban cada fragmento se sometieron a análisis de la secuencia de nucleótidos. Los fragmentos con las mutaciones de nucleóti5 dos mínimas comparadas con la secuencia parental VR-2332 (número de sumisión a GenBank U87392) se utilizaron para ensamblar el cDNA de longitud total, como se muestra en la Figura 2. En cada región solapante, se utilizó un solo sitio de enzima de restricción para unir los fragmentos flanqueantes. Cuatro fragmentos digeridos, que representaban la secuencia genómica de longitud total, se ensamblaron con precisión escalonadamente en un vector de plásmido modificado de bajo número de copias (pOK12HDV-PacI). El vector se modificó para incluir la ribozima HDV 10 por inserción de un fragmento de 244 pb SmaI a SacII que contenía la ribozima antigenoma de HDV y una secuencia terminadora de RNA-polimerasa T7 del vector de transcripción 2.0 (Johnson et al., J. Virol., 71:3323-3327 (1997); Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)) en los sitios correspondientes en pOK12 (Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)). El sitio de la enzima de restricción NcoI en este fragmento de 244 pb se reemplazó con un sitio singular PacI por mutación de oligonucleótidos con juegos de cebadores 5' pOK12HDV-2157/3' pOK12HDV-257 y 5' 15 pOK12HDV-257/poliA-modificado (Tabla 3), seguido por fusión PCR. En los clones cDNA de longitud total, la secuencia genómica viral estaba precedida por el promotor de RNA-polimerasa T7, 1 ó 2 residuos G y un residuo T, y seguida por una cola de ácido poliadenílico de 50 nucleótidos. Los clones ensamblados se propagaron en la cepa DH5α de Escherichia coli y se presentaron luego para la confirmación de la secuencia nucleotídica del genoma total.

Modificación y análisis de la secuencia de los clones de cDNA de longitud total. Se utilizó el Kit de Mutagénesis Dirigida Multisite QuikChange® (Stratagene) para modificar todos los clones de cDNA desde pVR-V4 a pVR-V6G7475A. Las inserciones completas de plásmidos de cDNA genómico se presentaron luego al Centro de Análisis Genético Avanzado de la Universidad de Minnesota (AGAC) para análisis de la secuencia de nucleótidos con cebadores de secuenciación apropiados (Tabla 3). Las diferencias de secuencia entre pVR-V4 hasta pVR-V6G7475A, así como las de VR-2332 parental, su cepa de vacuna atenuada correspondiente, Ingelvac MLV, y pVR-HN, el primer clon infeccioso de VR-2332, se enumeran en la Tabla 4. (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999); Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001); Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)).

Tabla 4. Diferencias de nucleótidos entre las cepas de PRRSV y los clones infecciosos VR-2332. Únicamente se muestran las posiciones en las cuales se observaron diferencias de nucleótidos. Los nucleótidos que se representan en la cepa VR-2332 se muestran en recuadros sin sombrear. Los recuadros con sombreado claro representan diferencias de nucleótidos que son exclusivas para el clon infeccioso, los recuadros

con sombreado medio hacen resaltar aquellos nucleótidos que se observan también en Ingelvac® MLV, y los recuadros con sombreado

negro indican nucleótidos exclusivos de porcino. Las regiones que no se secuenciaron se indican por una barra oblicua

Las bases negativas hacen referencia a aquellos nucleótidos presentes en el RNA después de transcripción y derivados del promotor de RNA * polimerasa inmediatamente aguas arriba del polinucleótido infeccioso. Estos nucleótidos derivados del promotor ya no están presentes típicamente en un polinucleótido infeccioso después que el mismo se ha sometido a pases 9 veces.

Transcripción in vitro. El clon de cDNA de longitud total se linealizó por escisión con PacI, que corta aguas abajo de la cola poliA. Se produjeron transcritos de RNA protegidos terminalmente [análogo de la caperuza m7G(5')ppp(5')G]

utilizando el Kit mMESSAGE MACHINE™ (Ambion) y una ratio optimizada 2:1 de análogo metilado de la caperuza a GTP. Se generaron aproximadamente 50 a 60 μg de RNA a partir de 2 μg de matriz de DNA en 20 μl de mixtura de

reacción. El aumento de la ratio de análogo de la caperuza a GTP reducía sustancialmente el rendimiento de RNA. Se purificó subsiguientemente el RNA con fenol ácido-cloroformo seguido por precipitación con isopropanol y se resuspendió en tampón TE exento de nucleasas (pH 8,0). El RNA se evaluó respecto a calidad por comparación de tamaños con RNA viral de VR-2332 de tipo salvaje en un gel de agarosa desnaturalizante con 1% de glioxal, y se cuantificó por espectrofotometría a DO260.

Transfección de las células MARC-145. Se generó un procedimiento de transfección modificado basado en el método descrito por Nielsen et al., (J. Virol., 77:3702-3711 (2003)). Para la transfección, se sembraron las células MARC145 en placas de 6 pocillos (2-3 x 105 células/pocillo) en 3 ml de medio completo [EMEM complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS)] y se incubaron luego a 37ºC, 5% CO2 durante 20-24 horas hasta aproximadamente 80% de confluencia (Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126 (1992)). Se combinaron 4 μg de RNA transcrito in vitro diluido en 500 μl de Medio de Suero Reducido Opti-MEM® I (Invitrogen) y 2 μl de bromuro de 1,2dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxi-etil-amonio y colesterol (DMRIE-C; Invitrogen) diluidos en 1 ml de medio Opti-MEM®, y se agitaron con brevedad enérgicamente. Las células MARC-145 se lavaron una sola vez con 2 ml de medio Opti-MEM® y se cubrieron inmediatamente después con la solución del complejo lípido:RNA. Se utilizó DMRIE-C sin RNA (2 μl) como control negativo y se empleó como control positivo DMRIE-C con 10-100 ng de RNA viral purificado de la cepa (tipo salvaje) wt VR-2332. Después de 4 horas de exposición a los complejos lípido:RNA, se lavaron las monocapas y se añadió medio completo nuevo (EMEM con 10% FBS). Los sobrenadantes de las células transfectadas se monitorizaron diariamente respecto a la aparición de efecto citopático (CPE) y se sometieron a pases sobre MARC-145 nuevas 72-96 horas después de la transfección.

Detección del RNA viral de la progenie. Para testar el RNA viral de la progenie, se cosecharon sobrenadantes de cultivo celular de células MARC-145 transfectadas e infectadas. Se aisló el RNA con el Kit de RNA viral QiaAmp (Qiagen). Se realizó la RT-PCR con pares de cebadores seleccionados, específicos para los nucleótidos de la cepa VR-2332 que eran indicativos de residuos mutados de clones infecciosos (Tabla 3). La confirmación de la progenie de clones infecciosos se obtuvo por verificación de la secuencia nucleotídica de nucleótidos específicos de clones presentes en los productos RT-PCR.

Detección de la proteína de la nucleocápsida viral de la progenie. Se utilizaron ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA) para detectar la expresión de proteínas virales en células MARC-145 transfectadas con RNA transcrito in vitro, o infectadas con el virus de la progenie, dispuestas en cubreobjetos. Las células infectadas se fijaron en paraformaldehído al 3,7% con solución salina tamponada con fosfato (PBS), de pH 7,5, a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Las células fijadas se lavaron con PBS, se incubaron a 37ºC durante 45 minutos en el anticuerpo monoclonal SDOW17 específico de la proteína de la nucleocápsida del PRRSV (Magar et al., Can. J. Vet. Res., 59:232-234 (1995)) y se incubaron posteriormente con inmunoglobulina G (IgG) anti-ratón de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína a 37ºC durante 45 minutos más (dilución 1:100) (Sigma). Se lavaron los cubreobjetos con PBS, se montaron en portaobjetos utilizando aceite de soporte de gel, y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia.

Ensayo de calvas virales. Monocapas de células MARC-145 en placas de 6 pocillos se infectaron con sobrenadante de células (en diluciones al décuplo) procedente de células MARC-145 transfectadas o infectadas por incubación a la temperatura ambiente durante 1 hora. Las monocapas infectadas se lavaron subsiguientemente una sola vez con EMEM nuevo/10% FBS, se cubrieron inmediatamente con Agarosa SeaPlaque estéril al 1% (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, Maine) en 1X MEM (Sigma M4144)/10% FBS/2% (p/v) NaHCO3/1X glutamina/1X aminoácidos no esenciales/10 mM HEPES/2% (v/v) gentamicina, y se incubaron a 37ºC/5% CO2, invertidas, durante 5 días. Después de eliminación cuidadosa de la agarosa, las células se tiñeron con 5% de violeta cristal en etanol al 20% durante 10-30 minutos para visualización del tamaño de las calvas.

Curva de crecimiento viral. Monocapas MARC-145 en matraces T-75 se inocularon con PRRSV parental o recombinante diluido en EMEM exento de suero a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001. Después de 1 hora de fijación a la temperatura ambiente con mezcladura cuidadosa, se eliminaron los inóculos y se lavaron 3 veces las monocapas con EMEM exento de suero. Después del lavado, se añadieron 4 ml de medio completo y los matraces se incubaron subsiguientemente durante hasta 5 días a 37ºC, 5% CO2. Se cosecharon inmediatamente partes alícuotas (0,5 ml) después de la adición de medio (momento puntual de 0 horas) y al cabo de 24, 48, 72, 96 y 120 horas, y se guardaron a -80ºC. Se utilizaron diluciones seriadas de las muestras para infectar células MARC-145 nuevas y las células se procesaron luego como se ha descrito arriba. Después de eliminar la agarosa, se visualizaron y contaron las calvas. Los resultados de la curva de crecimiento se expresaron como PFU/ml.

Inoculación in vivo del virus de la progenie. Diez cerdos de 4 semanas de edad de raza y sexo mixtos procedentes de una piara PRRSV-seronegativa se dividieron en 3 grupos, constituidos cada uno por dos animales. El primer grupo recibió 103,5 dosis infecciosas de cultivo de tejido al 50% (TCID50) de virus clonado (pVL-V5, tercer pase en células MARC-145) por ml, el segundo grupo recibió 105,4 TCID50 por ml de la cepa del virus parental VR-2332 (cuarto pase en células MARC-145), y el tercer grupo se inoculó falsamente con EMEM. Todos los animales recibieron 2 ml de inoculo por inyección intramuscular. Los animales se mantuvieron en salas separadas a lo largo del experimento y se observaron diariamente respecto a síntomas clínicos. Todos los cerdos se sacrificaron por eutanasia el día 28 después de la infección. Para recuperar el virus, las muestras individuales de suero se diluyeron 5 veces con EMEM incompleto y se pusieron sobre monocapas nuevas de MARC-145 durante 1 a 2 horas a la temperatura ambiente con agitación cuidadosa. Se retiraron luego los inóculos y se añadió EMEM completo. Las células infectadas se incubaron a 37ºC, 5% de CO2 y se observaron diariamente. Una vez que fue evidente el CPE, los sobrenadantes de células infectados se congelaron a -80ºC hasta su caracterización posterior.

Análisis por Transferencia Northern. Transcritos de pVR-V6G7475A se transfectaron en células MA104 y se sometieron luego a pases sobre células nuevas durante varios pases. Para el análisis por transferencia Northern subsiguiente, los sobrenadantes del pase 1 (P1), P3, P6, P8 y P10 se diluyeron en una ratio 1:50 y se utilizaron luego para infectar células (1 ml/matraz T75) el mismo día. Al mismo tiempo, se diluyó al décuplo suero de porcino infectado y se utilizó luego (1 ml) para infectar un matraz T75 separado. El efecto citopático se observó el día 3 p.i. para todos los matraces. El RNA intracelular se extrajo utilizando un Kit RNeasy Midi (Qiagen) y se sometió a electroforesis (15 μg/muestra) en un gel desnaturalizante de glioxal como se ha descrito previamente (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)). Como control se corrió RNA transcrito de pVR-V6G7475A (100 ng). Después de transferencia del RNA a Membrana de Transferencia de Nailon Magnagraph de 0,45 micrómetros (Osmonics), se sondó la membrana con oligonucleótido marcado/1a-p222, marcado en un extremo con γ-32P-ATP (Amersham) utilizando polinucleótido-quinasa (Promega) como se ha descrito previamente (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)).

Análisis de la secuencia de ácido nucleico del virus de la progenie. Se realizó una amplificación rápida de 5' y 3' de

los extremos del cDNA (RACE) con el Kit de Amplificación de cDNA SMART™ RACE (BD Bioscience) o el Juego 5'

ó 3'- Full Race Core (TaKaRa Bio Inc.) en RNA viral aislado con el Mini Kit de RNA Viral QIAmp® (Qiagen). La secuencia de nucleótidos remanente se determinó a partir de los productos RT-PCR de pares de cebadores desarrollados para cubrir el genoma entero de la cepa VR-2332 (Tabla 3), como se ha descrito previamente (Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001)). Los productos se presentaron para determinación de la secuencia de ácido nucleico en el Centro de Análisis Genético Avanzado en la Universidad de Minnesota. La secuencia viral completa con al menos recubrimiento triple se ensambló inicialmente con el paquete SeqMan del software de análisis de secuencias Lasergene® (DNASTAR, Inc.), y se analizó ulteriormente utilizando el software GCG Wisconsin Package versión

10.3 ((Accelrys Inc.). Se utilizaron la cepa VR-2332 (Acceso a GenBank U87392), la cepa Ingelvac® MLV (Acceso a GenBank AF066183) y el clon de cDNA pVR-HN (Acceso a GenBank AY150564; Nielsen et al., J. Virol., 77:37023711 (2003)) en todas las comparaciones de nucleótidos para cepas de virus recombinantes.

Resultados

Modificación del vector pOK12. pOK12 (Acceso a GenBank AF223639; Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)), un vector de clonación de bajo número de copias, se modificó por digestión con SmaI (sitio de enzima en el par de bases 263 en pOK12) y SalI (sitio en pb 307) e inserción del fragmento de 244 pb SmaI-SalI del vector 2.0 (7) que contenía la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV). El vector (pOK12HDV) se modificó ulteriormente por mutagénesis de un sitio KpnI existente (sitio pOK12 HDV en el pn 273) para insertar un sitio de enzima de restricción PacI mediante el uso del par de cebadores 5'-pOK12 HDV-257SphIPacI/3'-pOK12HDV-257SphIPacI. La ribozima de HDV Se añadió para proporcionar una escisión eficaz exactamente en el extremo 3' del tramo poliA. Los estudios realizados revelaron que la modificación no era necesaria para obtener virus de progenie infeccioso.

Construcción de clones de cDNA de longitud total. La estrategia de clonación se representa en la Figura 2. Cuatro fragmentos de genoma solapantes se amplificaron a partir de RNA viral purificado de VR-2332 por RT-PCR utilizando los pares de cebadores indicados (Figura 2, Tabla 3). Cada fragmento se clonó individualmente en el vector pCR® 2.1-TOPO® para generar el clon intermedio pCR-SphI-FseI (segmento I), pCR-FseI-AvrII (segmento II), pCR-AvrII-BsrGI (segmento III), y pCR-BsrGI-PacI (segmento IV). Los clones de cDNA se digirieron luego con dos enzimas de restricción singulares como se indica por el nombre del clon. Los cuatro fragmentos se purificaron en gel y se ligaron escalonadamente al vector pOK12HDV-PacI para generar un clon de cDNA de longitud total de PRRSV (pVR-V4). En el clon de cDNA de longitud total, la secuencia genómica viral estaba dirigida por el promotor de RNApolimerasa T7 y seguida por una cola de ácido poliadenílico de 50 nucleótidos. Los transcritos de RNA del clon pVR-V4 no exhibían la infectividad típica del PRRSV cuando se transfectaron en células permisivas, aunque pudo detectarse RNA viral a lo largo de varios pases. Cuando se comparó con la cepa VR-2332, se detectaron un total de 45 mutaciones de nucleótidos (Tabla 4) que conducían a 21 cambios de aminoácidos (Tabla 5), aunque varias mutaciones eran iguales que las identificadas previamente en Ingelvac® MLV (Yuan et al., Virus Res., 61:87-98 (1999)).

Dado que muchas mutaciones en pVR-V4 ocurrían en la región crítica que codifica helicasa, polimerasa y otros restos de Nidovirus supuestos (Figura 3, Tabla 4), se generaron clones adicionales del segmento genómico III (pCR-AvrII-BsrGI) y se secuenciaron en su totalidad. Después de reemplazamiento del segmento III de pVR-V4 con el fragmento más exacto de la secuencia obtenido, se determinó de nuevo la secuencia de nucleótidos del clon de longitud total entero del genoma (pVR-V5). Excepto en la región reemplazada y en cuatro mutaciones espontáneas (nucleótidos 1595, 13860, 14336, y 14404), estos dos clones genómicos eran idénticos (Tabla 4). El análisis de la secuencia de pVR-V5 demostró que este clon albergaba un total de 23 mutaciones comparado con la cepa VR2332. De estos 23 cambios, únicamente 8 mutaciones de nucleótidos codificaban un cambio en aminoácido y 5 de las mutaciones de residuos de aminoácido eran idénticas a Ingelvac® MLV y por tanto no se predijo que afectarían desfavorablemente a la replicación in vitro (Tabla 4).

El clon pVR-V6 se derivó de mutagénesis orientada del segmento genómico IV para reparar los nucleótidos 13860 y 14979 utilizando los cebadores 13860C2T/ y 14979A2G/, respectivamente. La mutación de estos dos nucleótidos

corregiría el residuo de aminoácido 25 de GP5 (L→F) y el residuo 31 de la proteína de la nucleocápsida (T→A). El

análisis de la secuencia del clon pVR-V6 confirmó que los nucleótidos se habían corregido de nuevo a nucleótidos de tipo salvaje (wt) VR-2332 y no habían dado como resultado ningún otro cambio de nucleótido en ninguna otra parte del genoma cuando se compararon con pVR-V5 (Tablas 4 y 5). Finalmente, la mutagénesis orientada en el segmento III del genoma utilizando el oligómero 7475 G2A se completó tanto en pVR-V5 como en pVR-V6 a fin de corregir una alteración de wt VR-2332 en el nucleótido 7475. El cambio de G→A en el nucleótido 7475 dio como resultado una glicina (G) en el aminoácido 2429 de ORF1 en los dos clones recombinantes al ácido glutámico (E) observado en la cepa viral VR-2332 parental. Los dos clones finales, pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A se secuenciaron de nuevo en su totalidad y se encontró que tenían sólo (nucleótido 7475) alterado respecto a los plásmidos recombinantes originales pVR-V5 y pVR-V6, respectivamente (Tabla 5). pVR-V6G7475A contiene así 11 cambios de nucleótidos y ningún cambio de aminoácido con respecto a la cepa VR-2332, además de los observados también en Ingelvac® MLV.

Como puede verse esquemáticamente en la Figura 3 para el constructo final (pVR-V6G7475A), y se detalla en las Tablas 4 y 5, todos los clones de longitud total poseen todavía cambios de nucleótidos dispersos en todo el genoma, fundamentalmente en las regiones de ORF1 definidas deficientemente. Sin embargo, el gran grupo de cambios de nucleótidos en ORF1b que evitaban supuestamente que pVR-V4 completase la replicación viral se repararon en versiones posteriores de los clones del genoma de longitud total. Sólo quedaba una mutación de nucleótido (nt 11329 que codificaba la mutación G3739A) en ORF1b de pVR-V5 y clones posteriores, y esta mutación no evita que Ingelvac® MLV infecte y se replique eficientemente en células cultivadas. Las Tablas 4 y 5 muestran también la información de residuos para el clon infeccioso previamente publicado, pVR-HN (Nielsen et al., J. Virol., 77:37023711 (2003)), que se ha demostrado se replica en animales. Existe un aumento sustancial en el número de residuos en pVR-HN (15 nucleótidos) que exhiben directamente la secuencia de Ingelvac® MLV en el constructo final, pVR-V6G7475A (7 nucleótidos).

Caracterización del virus recombinante. Se produjeron transcritos de RNA de longitud total de cada clon de cDNA. La transfección de células MARC-145 con los transcritos de cDNA o RNA viral de wt VR-2332 (vRNA) dio como resultado CPE, caracterizado por aglomeración de células seguida por lisis, a las 48 a 72 horas después de la transfección. Los CPE causados por los transcritos recombinantes estaban retardados y eran algo distintos comparados con el inducido por el vRNA de VR-2332 wt, en el cual el CPE se presenta como agregación enérgica, desprendimiento, y disgregación. A las 96 horas de la transfección, la mayoría de las células transfectadas con vRNA de VR2332 habían sufrido lisis y se habían desprendido de la placa, mientras que se apreciaba un CPE menos severo en las células transfectadas con los transcritos de RNA clonado derivados in vitro.

El virus (P0) se cosechó de las células transfectadas y se utilizó una parte alícuota (10 μl diluidos hasta 1 ml en

medio de cultivo) para infectar células MARC-145 para amplificación del virus de la progenie. Después de la detección del CPE, el virus (P1) se cosechó de nuevo y se utilizó una parte alícuota para reinfección de células MARC

145. El virus recombinante en el sobrenadante de las células (P2) se utilizó para purificación del RNA viral, que se empleó luego para obtener fragmentos RT-PCR con los pares de cebadores 5'-6800/3'-ORF1b (nt 6796-7614) y P51/05P4 (nt 13757-14341). Los fragmentos PCR obtenidos se presentaron para análisis de la secuencia de nucleótidos a fin de confirmar que la infectividad observada era debida a transcritos de RNA de longitud total transfectados del constructo infeccioso y no un resultado de contaminación debida al virus wt. Se observaron mutaciones de nucleótidos en los residuos 7329, 7475, 7554, y diferencias en el nucleótido 13860 en el virus de la progenie de pVR-V5, y 7329, 7554, y 13860 se detectaron en el virus de pVR-V5G7475A. Análogamente, se detectaron mutaciones en los residuos 7329, 7475 y 7554 en la progenie pVR-V6 y se detectaron mutaciones en 7329 y 7554 en el virus resultante de pVR-V6G7475A (Tabla 4 y 5). No se observaron mutaciones correspondientes en el virus P2 procedente de las transfecciones de vRNA wt.

Análisis de inmunofluorescencia de los virus recombinantes. Se utilizaron ensayos de inmunofluorescencia directa para detectar la expresión de la proteína de la nucleocápsida de PRRSV en células MARC-145 infectadas. Todas las células infectadas por transcritos de virus recombinante (P2 y siguientes) así como vRNA eran positivas por este método. Era claramente evidente una acumulación nucleolar masiva de la proteína de la nucleocápsida, como había sido consignado previamente por Rowland et al. (Virus Res., 64:1-12 (1999)).

Infección in vivo con virus recombinante derivado de pVR-V5. Los virus recombinantes recuperados de P3 de células MARC-145 transfectadas con transcritos de RNA del clon de cDNA pVR-V5 se inocularon en cerdos jóvenes en paralelo con VR-2332 wt, virus de la vacuna Ingelvac® MLV y solución salina (control negativo). Se recogieron muestras de sangre los días 0, 3, 5, 7, 14, 21 y 28 p.i. y se analizaron respecto a seroconversión por HerdChek PRRS 2XR ELISA (IDEXX) y respecto a recuperación de virus. El día 28, todos los animales infectados habían experimentado seroconversión con aproximadamente la misma cinética, revelando que los virus recombinantes pVR-V5 se replicaban satisfactoriamente in vivo (Figura 4). Los síntomas clínicos estaban ausentes de todos los animales durante el curso del experimento, pero esto no era una sorpresa, dado que la cepa VR-2332 wt no produce en muchos casos enfermedad manifiesta en los cerdos jóvenes y da como resultado ganglios linfáticos engrosados sólo transitoriamente, típicamente hacia el día 14 p.i.

Se utilizó una muestra de suero de un animal infectado con progenie de pVR-V5 (Sw612), tomada a los 14 días p.i., para infectar monocapas recientes de MARC-145 para recuperación de virus recombinante sometido a pases in vivo. Como se ha descrito anteriormente, el virus derivado de transfección in vitro de transcritos de RNA del clon pVR-V5 causaba sólo CPE mínimo (evidenciado por agregación de células infectadas) mientras que el virus recuperado del suero del día 14 del animal de test causaba CPE típico (agregación de células, desprendimiento, y disgregación) a las 96 horas de la infección. Esto sugería que se había producido un cambio en el genotipo o fenotipo viral mientras pVR-V5 se replicaba in vivo.

Con objeto de dilucidar la razón del cambio aparente de fenotipo, se completó el análisis de la secuencia genómica total en virus recombinado de un cerdo (Sw612) y se sometió luego a pases una sola vez en células MARC-145 para amplificar la progenie de Sw612 (Figura 3, Tablas 4 y 5). Cuando se comparó con el virus utilizado para infectar cerdos, pVR-V5, se retenían en Sw612 17 cambios de nucleótidos específicos del clon de cDNA infeccioso, algunos de los cuales se observan también en Ingelvac® MLV (7/17 nucleótidos). Los dos residuos G no virales seguidos por un residuo T presente en el extremo 5' del transcrito del clon pVR-V5 original no se apreciaban en el virus derivado de la infección in vivo. Se observaba degeneración en las posiciones de los nucleótidos 9958 (R), 14336 (Y) y 15411 (Y). El nucleótido semejante a VR-2332 wt (G) en la posición 9958 exhibía degeneración con un nucleótido semejante a Ingelvac® MLV (A). Este cambio da como resultado una mutación de un residuo glicina a un residuo ácido glutámico, respectivamente (Tabla 2). En la posición 14336, se detectó degeneración como una base específica de clon infeccioso (C) y una base específica de VR-2332 wt (T), lo que reflejaba una mutación silenciosa.

Había otra mutación (nt 7475) en la cual un residuo G había cambiado al residuo A wt. Sin embargo, había otras cinco diferencias de nucleótidos (nt 102, 827, 1379, 14686 y 15411) no apreciadas en ninguno de los otros virus de este estudio. El nucleótido 102 está localizado en la secuencia conductora, que se cree no se traduce. No obstante, si se tradujera la secuencia conductora, el ORF codificado (nucleótidos 1-100 de VR-2332) se extendería en un solo residuo de aminoácido (W). Las mutaciones en los residuos 827 y 1379 conducían a mutaciones en OFR1a, dando como resultado en ambos casos un cambio de aminoácido de la alanina codificada por VR-2332 wt por una valina Sw612. El residuo guanina en el nt 7475 de pVR-V5 había mutado a adenina wt. Esto daba como resultado una mutación de un aminoácido no conservadora G3294A, que está basada en producto de escisión nsp7 de proteasa predicho de ORF1a, y esta región genómica no tiene función alguna definida hasta la fecha. El nucleótido 14686, localizado en ORF6, exhibía un cambio desde una guanina VR-2332 wt a una alanina en Sw612, que codifica todavía el aminoácido glicina. El otro cambio de nucleótido singular ocurría exactamente en el extremo 3' de la secuencia viral (nt 15411), antes del comienzo de la cola poliA. En este caso, un residuo timina previamente conservado revelaba degeneración con un residuo citosina. Estos cambios genéticos, aunque informativos, no revelaban inmediatamente la o las causas del cambio en el fenotipo de crecimiento observado. Sin embargo, ello revelaba de hecho la naturaleza errante de la replicación de PRRSV in vivo y sugiere que una secuencia genómica viral moderadamente diferente de VR-2332 wt era capaz de replicarse eficazmente (Figura 3).

Comparación del tamaño de la calva viral. Se completaron determinaciones del tamaño de las calvas de los virus recombinantes así como de VR-2332 wt en paralelo en células MARC-145 a las 120 horas p.i. (Fig. 5A). La cepa VR-2332 formaba calvas que tenían un tamaño medio de 3 mm, mientras que la progenie del pase 3 del clon de cDNA de pVR-HN formaba calvas ligeramente menores (2,5 mm como promedio). En contraste, se obtuvieron únicamente calvas minúsculas de los virus recombinantes derivados de pVR-V5 y pVR-V6, y éstas eran sólo fácilmente apreciables por examen al microscopio (Fig. 5A). Los virus recombinantes recuperados de los clones pVR-V5G7475A y pVR-V6-G7475A formaban, por término medio, calvas de 1,5 mm y 2 mm respectivamente. Sin embargo, en otro ensayo, las calvas producidas por la progenie viral (Sw612) recuperadas de la infección in vivo de virus recombinante derivado de VR-FLV5 eran mucho mayores, aproximadamente iguales en tamaño y en número a las derivadas de VR-2332 wt (Fig. 5B).

Quedaban sólo volúmenes mínimos de los sobrenadantes de células que contenían cada virus recombinante. Por tanto, a fin de examinar detalladamente el papel del cambio de nucleótido en la determinación del tamaño de las calvas, se transfectaron transcritos nuevos de RNA producidos a partir de pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A en células MARC-145 (denominado segundo linaje). Los virus de la progenie del pase 3 de cada clon infeccioso a los 5 días post-infección se analizaron de nuevo respecto a tamaño de las calvas en comparación con VR-2332 wt, VR-HN y los virus Sw612. En contraste con el ensayo de calvas previo, los tamaños de todas las calvas aparecían similares, yendo únicamente los virus recombinantes obtenidos de pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A ligeramente menores que los virus wt VR-2332, Sw612 y pVR-V6G7475A obtenidos in vivo (Fig. 6A). Sin embargo, los virus recombinantes no mimetizaban todavía directamente la infección viral auténtica, como se muestra por los títulos aproximadamente 10 veces más bajos cuando se comparaban con wt VR-2332 o con virus pVR-V5 recombinante que se había sometido a pases en cerdos (Sw612) (Fig. 6B).

Análisis de la Secuencia de Nucleótidos de las Preparaciones de Virus del Primer y Segundo linajes. El análisis limitado de la secuencia de nucleótidos (debido a limitación del stock de virus) de virus del pase 3 derivado de pVR-V5 inoculados en cerdos (V5-1-P3) y el análisis completo de la secuencia de nucleótidos del virus derivado del pase 3 de pVR-V5 (V5-2-P3) se completaron a fin de revelar la razón genética de las discrepancias en el tamaño de las calvas. Tales análisis revelaron que los dos virus V5 preparados independientemente diferían en secuencia en el extremo 5' (Tabla 4). El virus que había producido calvas minúsculas (V5-1-P3) no tenía nucleótido extraño alguno en el extremo 5', como se muestra en la secuencia de nucleótidos de la cepa wt VR-2332, mientras que el que producía calvas de mayor tamaño (V5-2-P3) poseía 4 residuos timidina sin matriz en el término 5' (Tabla 4). La secuencia de nucleótidos viral V5-1-P3 restante que pudieron obtener los autores de la invención coincidía exactamente con la del virus V5-2-P3, así como la del clon parental. No obstante, el análisis de la secuencia completa del virus V5-2-P3 revelaba que el virus exhibía degeneración de nucleótidos en varios sitios genómicos. Se obtuvieron resultados similares cuando se analizaron regiones limitadas de los virus del segundo linaje VR-FLV5G7475A-P3 y VRFLV6G7475A-P3. Estas dos últimas infecciones de la progenie de clones exhibían términos 5' diferentes al mismo tiempo que exhibían degeneración en su secuencia.

Curvas de Crecimiento Viral. Se completaron simultáneamente determinaciones de la curva de crecimiento viral en un solo paso utilizando células MARC-145 y virus del pase 3 (segundo linaje) (Fig. 7). Los virus recombinantes recuperados de pVR-V5, pVR-V5G7475A, pVR-V6, pVR-V6G7475A y pVR-HN exhibían tasas de crecimiento viral en un solo paso similares, pero sus picos de replicación eran todos ellos significativamente más bajos que la cepa wt VR2332 y Sw612, la progenie in vivo de pVR-V5. Asimismo, las tasas de replicación de las preparaciones de virus recombinantes derivadas de pVR-V5, pVR-V6 y pVR-HN se reducían un tanto en comparación con el virus derivado de pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A. Los dos últimos clones infecciosos codifican diferencias tan pequeñas como de 13 y 11 nucleótidos, respectivamente, dando como resultado 2 y 0 cambios de aminoácido con respecto a la secuencia de wt VR-2332 además de los cambios observados en Ingelvac® MLV. Estos datos revelan por tanto que los virus con un cambio tan pequeño como de 11 nucleótidos respecto a wt VR-2332 y su progenie atenuada Ingelvac® MLV están algo deteriorados en replicación. Correspondientemente, los títulos resultantes de los virus wt VR2332 y SW612 eran aproximadamente 6-15 veces mayores que el de los virus recombinantes que no se habían sometido a pases en cerdos (Fig. 7).

Análisis Northern de vRNA. Se ha demostrado que las especies sgRNA deficientes de PRRSV, identificadas previamente como RNAs subgenómicos heteróclitos (latín: formas no comunes), son un constituyente de la infección de PRRSV y no pueden separarse de los genomas virales de longitud total por métodos estándar tales como pase de células cultivadas a multiplicidades de infección bajas o centrifugación en gradiente de sacarosa (Yuan et al., Virology, 275:158-169; 30 (2000); Yuan et al., Virus Res., 105:75-87 (2004)). Para explorar si se producen o no heteróclitos de PRRSV durante la transcripción in vitro de los clones del genoma de cDNA de longitud total o aparecen después de transformación/infección subsiguiente, se completó el análisis por transferencia Northern. El transcrito de RNA de longitud total y los pases 1, 3, 6, 8 y 10 del virus producido a partir de las células MA-104 transfectadas se utilizaron para inocular matraces T-75 nuevos de células M-104 con 100 μl de sobrenadante diluido 1:100, así como suero Sw612 diluido 1:10 (2 ml total/matraz). Después de 4 días, se cosechó RNA intracelular de PRRSV y se separaron 15 μg de cada preparación por electroforesis a través de un gel de agarosa desnaturalizante, y se transfirieron a una membrana de nailon. Después de reticulación del RNA, la membrana se hibridó con una sonda radiomarcada con 32P complementaria al extremo 5' de ORF1a que selecciona genomas de VR-2332 de longitud total así como heteróclitos (/1a-222; 29). Como se muestra en la Figura 8, el transcrito de RNA es en su mayor parte una sola banda, que migra como vRNA de longitud total, mientras que las especies de RNA de PRRSV del pase 1 y posteriores migran a la vez como especies de longitud total y especies de tamaño subgenómico identificadas previamente como heteróclitos. Adicionalmente, la fuerza de hibridación aumenta a lo largo de los pases. Dado que el virus se cosechó de un volumen igual de sobrenadante de células infectadas en el mismo momento, esta solución sugiere que el vRNA se hace más eficiente con las replicaciones a lo largo del tiempo. Por último, cuando se compara el virus generado por Sw612 con el virus generado por cultivo de células, el patrón de bandas de RNA es indistinguible, lo que sugiere fuertemente que las especies de RNA defectivas se forman fácilmente y se replican tanto in vitro como in vivo y son por tanto una parte natural de la infección de PRRSV.

Discusión

En teoría, un clon de cDNA infeccioso de un virus debería ser idéntico a la secuencia parental a fin de generar un sistema genético inverso que mimetice la infección del tipo salvaje. Se ejerció un esfuerzo considerable para reproducir un genoma de VR-2332 de la cepa PRRSV de fidelidad total, pero debido a mutaciones espontáneas impredecibles en varios sitios, no se ha tenido éxito todavía en la derivación de un clon infeccioso que no presente diferencia alguna respecto a la cepa VR-2332 wt secuenciada en el laboratorio de los inventores. Las DNA-polimerasas de alta fidelidad, utilizadas en este estudio, están disponibles para reducir las mutaciones artificiales, pero dicha mutación no puede evitarse durante la transcripción inversa (Malet et al., J. Virol. Methods, 109:161-70 (2003)). Adicionalmente, el hecho de que PRRSV exhibe evolución viral y variación de cepas asombrosa (Chang et al., J. Virol., 76:4750-6 (2002); Murtaugh et al., Adv. Exp. Med. Biol., 440:787-94 (1998); Yoon et al., Adv. Exp. Med. Biol., 494:25-30 (2001)), se recombina fácilmente a alta frecuencia dando como resultado recombinantes intergénicos entre cepas (Yuan et al., Virus Res., 61:87-98 (1999)), sufre recombinación intragénica para formar RNAs subgenómicos de PRRSV y heteróclitos (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-8025 (1999); Yuan et al., Virology, 275:158-169 (2000); Yuan et al., Virus Research, 105:75- 87 (2004)) y exhibe a menudo degeneración de nucleótidos en sitios nucleotídicos impredecibles en aislados de campo hacen que esta meta inicial consuma mucho tiempo y conduzca a una ganancia insignificante. Un constructo infeccioso de DNA que posee tan pocas como 11 mutaciones de nucleótidos, en comparación con la cepa VR-2332, fuera de los dominios que se sabe están implicados en la replicación viral (extremos 5' y 3', ORF1b) se consideró suficiente para la producción de virus wt y los objetivos aguas abajo del uso de clones infecciosos para interrogantes sobre patogénesis y estudios estructura:función. pVR-HN es más similar a Ingelvac® MLV en la región del virus que codifica el resto helicasa (nsp10). Adicionalmente, la comparación patogénica de estos dos clones infecciosos puede arrojar luz acerca de las diferencias entre la cepa parental, VR-2332, y su progenie de la cepa de vacuna, Ingelvac® MLV.

Puede deducirse información valiosa acerca de la construcción y evaluación de los clones infecciosos para la cepa VR-2332 de PRRSV. En primer lugar, la cepa VR-2332 de PRRSV no puede tolerar todas las mutaciones para supervivencia. Mutaciones particulares de nucleótidos o aminoácidos pueden favorecer o dificultar la replicación viral, y el reto consiste en averiguar cuáles son letales para la supervivencia. En el clon pVR-V4, que no producía viriones infecciosos, había un total de 42 diferencias de nucleótidos con respecto a la cepa parental wt VR-2332. En estos 42 cambios de nucleótidos, varios nucleótidos dan como resultado mutaciones silenciosas (20 residuos) o existen en otras cepas de PRRSV conocidas (9 mutaciones de residuos de aminoácidos mimetizan directamente Ingelvac® MLV), lo que conduce a la predicción de que estos cambios pueden ser no letales para la replicación del virus. Se predijo así que once cambios de nucleótidos que conducían a 12 cambios de aminoácidos y dos mutaciones de nucleótidos 3' UTR, no observadas cada una en Ingelvac® MLV, son letales para la cepa VR-2332 de PRRSV. En pVR-V5 y constructos posteriores, se corrigieron 19 cambios, que incluían varias mutaciones silenciosas y 9 cambios aberrantes de aminoácidos no observados en el genoma de Ingelvac® MLV y otros 8 cambios observados en la cepa de la vacuna. Esto condujo a la primera evidencia de que los constructos eran infecciosos, aunque en pVR-V5 estaban todavía presentes dos mutaciones de aminoácidos, una de las cuales se alteró por mutagénesis orientada para producir pVR-V6. El cambio de aminoácido restante se reparó en pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A, aunque estos clones albergan todavía mutaciones silenciosas que no se encuentran en la cepa VR-2332 y la cepa de vacuna derivada.

De este estudio se obtuvieron varias observaciones singulares. Ante todo, cada linaje de virus producido puede dar como resultado una secuencia terminal 5' singular que no se detectaba en la cepa wt VR-2332. Los autores de la invención tampoco pueden correlacionar todavía el tamaño de las calvas con la secuencia de nucleótidos. En segundo lugar, se observaron cambios de nucleótidos singulares después de replicación en cerdos, lo cual puede reflejar la naturaleza inherente de la polimerasa de PRRSV. Todos los cambios de nucleótidos eran de naturaleza transitoria y no exhibían sesgo (5 A/G y 4 C/T). Aunque la reversión G A en el nucleótido 7475 se observó después del pase in vivo, no se pudo correlacionar este sitio con el tamaño de calva incrementado subsiguiente debido a que habían ocurrido otros cambios sin matriz. Adicionalmente, los análisis de la secuencia del genoma total del pase 3 de un virus derivado de V5 que producía calvas de mayor tamaño (V5-2-P3) revelaron una secuencia diferente del terminal 5' del virus V5 portador de calvas minúsculas utilizado para infectar cerdos (V5-1-P3). Sin embargo, puede llegarse a la conclusión de que las mutaciones no eran letales para la replicación del virus, dado que este virus, después de pases en cerdos, producía calvas de tamaño wt en células MARC-145 y crecía prácticamente al mismo ritmo que el virus parental (Figs. 5A, 6 y 7).

Presenta un interés considerable el hecho de que el análisis de la secuencia de el tercer pase in vitro de V5, V5G7475A y V6G7475A parecía sugerir que el complejo de replicasa de PRRSV permite que ocurran transiciones frecuentes, y transversiones infrecuentes, al tiempo que sufre replicación viral. Esto puede reflejar una replicasa viral que ha evolucionado de tal modo que la misma puede generar nuevas formas genéticas de un genoma de PRRSV y evaluar luego su competencia entre otras variantes, dando como resultado un virus óptimamente "adaptado". Estas observaciones se han anotado también durante el sometimiento a pases secuenciales de PRRSV in vivo (Chang et al., J. Virol., 76:4750-63 (2002)). Se están haciendo actualmente esfuerzos de secuenciación para examinar los genomas de longitud total de pases ulteriores, cuando se detecta una replicación más robusta. Por último, está claro ahora que la replicasa de VR-2332 de la cepa PRRSV sintetiza fácilmente heteróclitos al mismo tiempo que está produciendo vRNA de longitud total. Esta cepa prototipo, aislada y caracterizada en 1992, puede ser exclusiva en la adquisición gradual de adaptación de la replicación, dado que otros investigadores que producen clones infecciosos de cepas más recientes no han observado el mismo efecto (Truong et al., Virology, 3325:308-319 (2004)). El papel de la formación de heteróclitos y la aparición concomitante de replicación viral vigorosa sugieren que existe un papel ventajoso de los heteróclitos en la evolución del PRRSV.

Ejemplo 2

Muchos aislados virulentos de un PRRSV aparentemente nuevo se identificaron recientemente en el estado de Minnesota, EE.UU. El análisis de la secuencia de nucleótidos de ORF5 y la comparación con la base de datos de PRRSV del Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad de Minnesota (> 5000 aislados) reveló que los aislados eran del linaje Tipo 2, pero eran significativamente diferentes de los aislados previos. Adicionalmente, los mismos estaban muy estrechamente relacionados con los aislados observados previamente en Canadá a principio de los años 1990 (Mardassi et al., J. Gen. Virol., 75:681-685 (1994)) y en el estado de Minnesota en 1998. El análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de ORF5 demostró también que los mismos pertenecían al mismo grupo de virus que estos casos anteriores, conocidos como aislados 1-8-4 (Wesley et al., J. Vet. Diagn. Invest., 10:140-144 (1998)) y se designaron por ello aislados MN184. Debido a la notable disimilitud con todos excepto uno de los aislados de PRRSV MN aislados previamente, dos de estos nuevos aislados se amplificaron una sola vez en macrófagos alveolares de porcino (PAM), la célula hospedadora, y el análisis del genoma de longitud total se completó en los virus, designados como MN184A y MN184B. Estos dos aislados se recogieron en momentos diferentes de dos explotaciones ganaderas separadas.

Materiales y Métodos

Para secuenciar los aislados MN184, se extrajo RNA viral (vRNA) del sobrenadante de células infectadas PRRSV con el Mini Kit de RNA Viral QIAmp® (Qiagen, Valencia, CA)) y se realizó una RT-PCR (kit RT-PCR Qiagen® OneStep). Los cebadores (disponibles a petición) se diseñaron basándose en las secuencias publicadas de diferentes cepas de PRRSV depositadas en GenBank así como la secuencia MN184 de nueva generación. La secuencia de nucleótidos 5' de los dos aislados PRRSV se derivó utilizando el Kit Core RACE 5'-Full (TaKaRa Bio, Madison, WI). La 3' RACE se realizó con el Kit de Amplificación de cDNA SMART™ RACE (Clontech, Mountain View, CA). Los productos de la RT-PCR se purificaron en gel (QIAquick® Qiagen), se clonaron en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI) y se seleccionaron de 3 a 5 clones para cada producto RT-PCR para secuenciación. La determinación de la secuencia de nucleótidos se completó en ambas direcciones con los cebadores PCR específicos o los cebadores de los promotores SP6 y P7 codificados por el vector. Los productos se sometieron al Centro de Análisis Genético Avanzado de la Universidad de Minnesota para determinación de la secuencia con un analizador automático de fragmentos de DNA ABI377. Se obtuvo una secuencia de calidad que representaba al menos un recubrimiento triple del genoma. Los datos se secuencia se ensamblaron y analizaron utilizando el programa de análisis de secuencias GeneTool (BioTools Inc., Edmonton, Alberta, CA) y Lasergene (DNASTAR, Madison, Wis.).

Se generaron alineaciones múltiples de secuencias con CLUSTALX (Thompson et al., Nucleic Acids Res., 24:48764882 (1997)) o el Paquete Wisconsin Version 10.3 (Accelrys Inc., San Diego, CA). Las secuencias de PRRSV de longitud total se alinearon utilizando ClustalX (Versión 1.83.1; matriz de pesos IUB DNA, penalidad por laguna 15.00, penalidad por longitud de laguna 6.66). La alineación resultante se analizó ulteriormente analizando el Programa de Distancias del Paquete Wisconsin Version 10.3 (método de distancias Jukes-Cantor, coincidencias parciales debidas a los símbolos degenerados considerados). Para la Figura 10, las secuencias se alinearon con el programa Pileup del paquete Wisconsin (Matriz de Registro Blosum62, Peso de Laguna = 8, Peso de Longitud = 2, Extremos Pesados). La alineación se registró para redundancia y se coloreó para identidad porcentual utilizando Jalview (Clamp et al., Bioinformatics, 12: 426-427 (2004)), y se transfirió luego a Adobe® Photoshop® CS, versión 8.0, para transformación en escala de grises. Para la Figura 11, las secuencias se alinearon con el programa Pileup del Paquete Wisconsin (Matriz de Registro Blosum 62, Peso de Laguna = 8, Peso de Longitud = 2, Extremos Pesados). Para la Figura 12, se predijo un péptido señal utilizando el servidor SignalP (Bendtsen et al., J. Mol. Biol., 340:783-795 (2004)). Las regiones transmembranales se derivaron por PHDhtm (Rost et al., Protein Sci., 5:1704-1718 (1996 y los sitios de N-glicosilación potencial se identificaron por PROSITE (Bairoch et al., Nucleic Acids Res., 25:217-221 1997)) utilizando el servidor PredictProtein (Rost et al., Nucleic Acids Res., 32:W321-W326 (2003)). Las secuencias se alinearon con el programa Pileup del Paquete Wisconsin (Matriz de Registro Blosum 62, Peso de Laguna = 8, Peso de Longitud = 2, Extremos Pesados).

Resultados

La alineación genómica demostró que estos dos PRRSV eran muy distintos (> 14,5% de disimilitud de nucleótidos de otros genomas secuenciados de longitud total de Norteamérica Tipo 2, pero la comparación con las secuencias de longitud total Tipo 1 (Europeas) confirmó que los aislados eran exclusivamente de origen de genotipo Tipo 2 dado que eran sólo aproximadamente 59% similares a nivel de nucleótidos a ambas cepas EuroPRRSV y Lelystad. Llamativamente, estos aislados de MN184 Tipo 2 representaban los genomas de PRRSV más cortos detectados hasta la fecha (15019 nucleótidos, sin incluir la cola poliA). Por otra parte, no se discernía área específica alguna que sugiriera que estos aislados se derivaban de recombinación viral entre las cepas Tipo 1 y Tipo 2.

El análisis de la secuencia de longitud total reveló que los dos aislados MN184 eran en realidad genéticamente distintos. Los mismos compartían 98,0% de semejanza de nucleótidos o 2% de diferencia. Este porcentaje de disimilitud era inesperado debido a su aparición simultánea brusca en Minnesota, sin ningún aislado reciente claramente afín observado en la base de datos de los inventores de PRRSV en dicho momento. La Tabla 6 presenta la comparación detallada de nucleótidos y aminoácidos entre los dos aislados, y la Figura 9 representa las diferencias de aminoácidos observadas entre estas dos cepas. Ambos aislados exhibían degeneración de nucleótidos en varias regiones del genoma, predominantemente en la región nsp2 predicha de ORF1 (Tabla 6). El hecho de que se observaba degeneración de nucleótidos en estos aislados sugería que PRRSV puede estar constituido por varias especies individuales, a las que se hace referencia a menudo como un enjambre de secuencias virales afines pero distintas en los animales infectados.

Con objeto de identificar más estrechamente las regiones individuales de estos aislados MN184 que exhibían la disimilitud máxima con respecto a otras cepas PRRSV y asignar la región o regiones que dieran cuenta de la diferencia en la longitud del genoma viral del Tipo 2, se compararon estos dos aislados con la secuencia de la cepa VR2332 prototipo de Tipo 2. Las diferencias entre los dos aislados pudieron discernirse de nuevo, exhibiendo el aislado MN184B una semejanza ligeramente mayor con la cepa VR-2332 que el aislado MN184A. Las comparaciones de nucleótidos y aminoácidos con VR-2332 demostraron que regiones individuales del aislado MN184 variaban desde 81,5-94,7% y 78,4-100%, respectivamente, pero las regiones correspondientes a ORF5 (86,4-86,7% y 87,0-87,5%, respectivamente) predecían nsp1β (83,8-84,0% y 84,8-85,4%, respectivamente), y nsp2 (81,5-85,5% y 78,4-79,5%, respectivamente) eran las más variables. Era sumamente interesante que únicamente la región genómica nsp2 predicha mostraba una diferencia en longitud de nucleótidos y que ambos aislados MN184 exhibían la misma deleción en nsp2, detallada más adelante. La comparación revelaba también que las UTR's 5' y 3' eran las regiones más conservadas del genoma (94,7% y 94,0%, respectivamente), indicando una conservación de secuencia en regiones importantes para la replicación y transcripción viral.

ORF5 codifica una proteína estructural de PRRSV heterogénea (GP5) y se utiliza a menudo para identificación diagnóstica de PRRSV (Kapur et al., J. Gen. Virol., 77:1271-1276 (1996)). GP5 es una proteína con tres dominios transmembranales predichos con un endodominio y un ectodominio. El ectodominio de 30 aminoácidos se compone de un dominio corto altamente conservado que contiene usualmente al menos dos sitios de glicosilación en N limitados por dos regiones hipervariables. Se ha demostrado que el dominio altamente conservado de esta región de 30 aminoácidos codifica el epítope de fijación viral en las cepas Tipo 2 (Plagemann, Virology, 290:11-20 (2001); Ostrowski et al., J. Virol., 76:4241-4250 (2002); Plagemann et al., Arch. Virol., 147:2327-2347 (2002)). GP5 del mismo conjunto de genomas de longitud total, así como los aislados originales RFLP184 identificados en Canadá (IAF-93653, IAF-Klop) y en 1998-1999 en Minnesota (98-3298, 98-3403, 99-3584) se alinearon (Fig. 10). La alineación de PRRSV GP5 reveló identidades de aminoácidos comprendidas entre 82,5% y 87,7% entre los nuevos aislados MN184 y otras cepas Tipo 2 distintas de RFLP184. Es interesante que las diferencias de aminoácidos entre los nuevos aislados MN184 y los aislados anteriores RFLP184 eran muy grandes (5,7%-12,2%) y por tanto no se detectó ningún origen claro del nuevo virus RFLP184. La alineación limitada demuestra que la mayor parte de las diferencias de aminoácidos observadas se encontraban en las regiones hipervariables (Fig. 10). Los dos sitios de glicosilación en N conservados se mantenían en los aislados MN184, excepto en lo que respecta a la degeneración de nucleótidos detectada que codificaba el aminoácido 44 en el aislado MN184B.

Nsp1β codifica una cisteína-proteasa semejante a papaína (den Boon et al., J. Virol., 69:4500-4505 (1995)). Se completó una alineación de aminoácidos de los aislados MN184 con un conjunto redundante de secuencias nsp1β Tipo 2 disponibles así como las cepas Tipo 1 EuroPRRSV y Lelystad (Fig. 11). La proteína nsp1β posee cierto

número de aminoácidos completamente conservados, y los residuos catalíticos propuestos se mantenían en todos los genomas secuenciados (den Boon et al., J. Virol., 69:4500-4505 (1995)). La alineación, ordenada por similitud de aminoácidos, indica que los aislados MN184 son más similares a las cepas Tipo 1 que las otras secuencias Tipo 2 de longitud total secuenciadas. En particular, 5 aminoácidos (encuadrados en Fig. 11) mimetizan directamente las cepas Tipo 1. Sin embargo, los aminoácidos que se conservaban en las otras secuencias Tipo 2 no redundantes estaban también mayoritariamente conservados en los aislados MN184, pero aminoácidos dispersos y la similitud de aminoácidos (84,8-85,4%) revelaban una proteína Tipo 2 más divergente que se había evidenciado hasta la fecha. Así, la alineación define adicionalmente residuos mantenidos de nsp1β que pueden críticos para el ciclo de replicación de PRRSV.

Una alineación de aminoácidos de secuencias no redundantes de nsp2, ordenada por identidad de parejas, se muestra en la Figura 12. Un dominio de cisteína-proteasa afín a quimotripsina altamente conservado (PL2) está presente en el término N, predicho previamente por alineación con el virus de la arteritis equina (EAV) nsp2 (Snijder et al., J. Gen . Virol., 79:961-979 (1998); Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)). Existen 3-4 dominios transmembranales predichos cerca del término C de esta proteína (McGuffin et al., Bioinformatics, 16:404-405 (2000)), pero el sitio de escisión exacto en el terminal C no ha sido determinado empíricamente. Se han propuesto dos predicciones del sitio de escisión C-terminal (una G|G en el aminoácido 980 de nsp2 VR-2332 (Allende et al., J. Gen. Virol., 80:307-315 (1999)) y la otra en el aminoácido 1197 (Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)), pero existen varios dobletes G|G completamente conservados en esta proteína (aminoácidos 646, 980, 1116, 1196, y 1197 de nsp2 de VR-2332; flechas descendentes en Fig. 12). Un trabajo anterior había indicado también que la proteína nsp2 predicha es rica en prolina y contiene epítopes múltiples de células B potenciales (Oleksiewicz et al.,

J. Virol., 75:3277-3290 (2001); Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Ropp et al., J.Virol., 78:3684-3703 (2004)). La región intermedia grande de PRRSV nsp2 (aminoácidos 148-880 de nsp2 de VR-2332) no tiene función asignada alguna, pero es de longitud muy variable. Adicionalmente, la diferencia de longitud entre las cepas Tipo 1 y Tipo 2 de PRRSV secuenciadas ha sido mapeada a esta región variable intermedia de nsp2 (Fig. 12). Hasta ahora, se ha demostrado que los genomas Tipo 1 secuenciados son 313-364 bases más cortos que la mayoría de los PRRSV Tipo 2 (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004), Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Sin embargo, la alineación de secuencias múltiples estableció que el genoma de MN184 contiene la nsp2 más corta predicha hasta la fecha (2547 pb), 393 pb más corta que la cepa de VR-2332 Tipo 2 prototipo. Adicionalmente, la misma contenía 3 deleciones discontinuas en la proteína traducida con tamaños de deleción consistentes en 111, 1 y 19 aminoácidos, respectivamente, correspondientes a las posiciones de los aminoácidos en la cepa VR-2332 de PRRSV nsp2 de 324-434, 486 y 505-523, respectivamente (Fig. 12). Las tres deleciones daban como resultado la pérdida de varios residuos prolina y predecían epítopes de células B. Además de estas deleciones, se observaban también alteraciones significativas en la secuencia de aminoácidos de nsp2 de otras cepas Tipo 2, correspondientes en algunos casos al aminoácido Tipo 1 observado en la misma posición relativa (Fig. 12). La comparación de la proteína predicha nsp2 de los dos genotipos PRRSV demostró que la identidad de aminoácidos dentro de los virus Tipo 2 variaba desde 66% a 99% y desde 88 a 90% en los virus Tipo 1, pero difería notablemente entre genotipos (semejanza < 45). En particular, los aislados de MN184 exhibían 66-80% de identidad de aminoácidos con todas las proteínas nsp2 Tipo 2 predichas y únicamente 43-45% de identidad con las cepas Tipo 1. Cuando se examinó la alineación de secuencias múltiples en Fig. 12, se observó también que todos los casos de inserción o deleción en ambos genotipos ocurrían en esta región hipervariable intermedia. Sobre este punto, Shen et al. (Arch. Virol., 145:871-883 (2000)) informaron por primera vez que la cepa SP Tipo 2 de PRRSV de Norteamérica tiene una inserción única de 36 aminoácidos con relación a la posición entre los aminoácidos 813 y 814 de PRRSV VR-2332 nsp2. Otro investigador encontró una deleción única de 12 aminoácidos en la posición 466477 en el aislado de PRRSV HB2(sh)/20002 nsp2 (Gao et al., Arch. Virol., 149:1341-1351 (2004)). Existía una deleción de 17 aminoácidos en aislados de PRRSV afines a los europeos de nueva identificación cuando se comparaban con la cepa LV (Fang et al., Virus Res., 100; 229-235 (2004); Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Los casos de mutación no ocurrían consistentemente a lo largo del mismo tramo de aminoácidos, aunque las deleciones observadas entre los aislados NM184 y otros virus Tipo 2 abarcan la mayor parte de la deleción más larga detectada entre el Tipo 1 y otros PRRSV Tipo 2. Todos estos datos sugerían que el ORF de nsp2 contiene un resto proteasa conservado y regiones predichas de alcance transmembranal que pueden ser necesarias para la replicación de PRRSV, pero esto es sumamente susceptible de mutación en la gran sección intermedia.

La aparición repentina de aislados de campo de PRRSV en Minnesota que reflejan el patrón 184 RFLP es todavía un misterio, pero las consecuencias de este evento están comprobándose todavía actualmente. El Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de Minnesota realiza actualmente la secuenciación rutinaria en aislados similares de 184 RFLP de aproximadamente una cuarta parte del número total de solicitudes de secuencia de ORF5. Adicionalmente, el patrón de 184 RFLP ha sido detectado ahora no sólo en Minnesota, sino también en Iowa, Wisconsin, Dakota del Sur, Kansas, Missouri, Illinois, Nebraska, Kentucky, Oklahoma y Wyoming. Los autores de la presente invención eligieron derivar las secuencias de longitud total de dos aislados debido a la necesidad de entender si esto podría ser más que un solo tipo de virus y al hecho de que la piara de cerdos diagnosticada con el aislado MN184A se presentaba con un caso más leve de PRRS que la piara infectada con el aislado ML184B, tal como fue comunicado por el patólogo encargado del caso. Las cepas no han sido inoculadas en animales naíf para comprobar las presentaciones de los casos, pero es interesante observar que el aislado ML184B tenía muchas más degeneraciones de nucleótidos detectadas cuando se analizó el genoma, y esto podría reflejar la gravedad de la enfermedad informada.

Este análisis del genoma aumentó la comprensión por los autores de la invención de la inmensa variación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos que existe en el campo. Factores que impulsan esta variación pueden estar relacionados con el modo en que se están tratando actualmente los cerdos, el transporte interestatal e internacional de los cerdos y el semen de los cerdos macho, la intermezcladura de aislados de PRRSV diferentes en las piaras y la naturaleza del propio virus. La generación de secuencias del genoma total permite también a los inventores monitorizar dónde se tolera la variación del genoma y qué regiones están más conservadas. Como resultado de este estudio, así como de una publicación previa (Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)), está emergiendo un cuadro que indica que nsp2, nsp1β y ORF5 son proteínas extraordinariamente versátiles.

Este estudio ha proporcionado también una evidencia clara de que el tamaño de nsp2 no puede utilizarse ya para diferenciar entre los dos genotipos de PRRSV. El nuevo descubrimiento de que nsp2 evolucionó para exhibir un genoma Tipo 2 con tres deleciones discontinuas, que conducen al genoma más corto hasta la fecha (15019 kb), sugiere que PRRSV puede estar evolucionando para eliminar regiones genómicas prescindibles y hacer más compacto el genoma. Finalmente, aunque la significación de variaciones genéticas en PRRSV puede sólo conjeturarse

actualmente, el cambio evolutivo observado en ORF5, nsp1β y nsp2 debería estar relacionado razonablemente con

la adaptación biológica de PRRSV durante la presión de selección.

La descripción y los ejemplos detalladas que anteceden se han dado únicamente para claridad de comprensión. No deben deducirse de ellos limitaciones innecesarias en ningún caso.

A no ser que se indique otra cosa, todos los números que expresan cantidades de componentes, pesos moleculares, etcétera, utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". De acuerdo con ello, a no ser que otra cosa indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que pretendan obtenerse por la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la doctrina de equivalencias dentro del alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debería interpretarse teniendo presente al menos el número de dígitos significativos consignados y aplicando técnicas ordinarias de redondeo.

A pesar de que los intervalos y parámetros numéricos que exponen el alcance general de la invención son aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se han expresado con la mayor precisión posible. Todos los valores numéricos, sin embargo, contienen inherentemente un intervalo resultante necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus medidas de test respectivas.

Todos los encabezamientos se incluyen para conveniencia del lector y no deberían utilizarse para limitar el significado del texto que sigue al encabezamiento, a no ser que se especifique en tal sentido.

Secuencia de GenBank N º de Acceso M96262.2:

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polinucleótido infeccioso que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad con la secuencia de la Figura 1A y una deleción de al menos 57 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2062 hasta el nucleótido 3864 de la secuencia de la Figura 1A.

2. 2.

   El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucleótido se replica y produce partículas infecciosas de virus cuando se introduce en una célula.

3. 3.

   El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una secuencia de vector que se replica en una célula hospedadora procariota.

4. 4.

   Un polinucleótido infeccioso que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad con la secuencia de GenBank nº. de acceso M96262.2 y una deleción de al menos 57 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2061 hasta el nucleótido 3545 de la secuencia de GenBank nº. de acceso M96262.2.

5. 5.

   El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el polinucleótido se replica y produce partículas infecciosas de virus cuando se introduce en una célula.

6. 6.

   El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende adicionalmente una secuencia de vector que se replica en una célula hospedadora procariota.

7. 7.

   Un vector que comprende el polinucleótido de las reivindicaciones 1, 2, 4 ó 5.

8. 8.

   El polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en donde el polinucleótido comprende dos o más deleciones, y en donde cada deleción es independientemente de al menos 57 nucleótidos consecutivos.

9. 9.

   Una partícula de virus que comprende el polinucleótido de las reivindicaciones 1, 2, 4 ó 5.

10. 10.

    El polinucleótido de las reivindicaciones 1, 2, 4, ó 5 en donde el polinucleótido es un polinucleótido de RNA.

11. 11.

    Una célula que comprende el polinucleótido de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, ó 6.

12. 12.

    El polinucleótido de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, ó 6, en donde un promotor de RNA-polimerasa está enlazado operativamente al polinucleótido.

13. 13.

    El polinucleótido de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, ó 6, en donde el polinucleótido comprende adicionalmente un polinucleótido exógeno presente en la deleción.

14. 14.

    El polinucleótido de la reivindicación 13 en donde el polinucleótido exógeno codifica un marcador detectable.

15. 15.

    Un polinucleótido infeccioso que comprende la secuencia de nucleótidos de Figura 1E, Figura 1F, Figura 1G, Figura 1H, Figura 1I, Figura 1J, Figura 1K, Figura 1L o Figura 1M.

16. 16.

    Un polipéptido nsp2 codificado por un polinucleótido infeccioso que comprende la secuencia de nucleótidos de Figura 1G, Figura 1H, Figura 1I, Figura 1J, Figura 1K, Figura 1L o Figura 1M.

    T7conductor/3' 4300 (4,6 kb)

    VR1509/3' FIN (4,3 KB)

    casquete 5'

    Falso

    RNA genómico

    Heteróclitos

    casquete 5'

    Figura 11

    Figura 12 Figura 12 continuación