BRPI0611594A2 - vìrus da prrs, clones infecciosos, mutantes dos mesmos e métodos de uso - Google Patents

Abstract

VìRUS DA PRRS, CLONES INFECCIOSOS, MUTANTES DOS MESMOS E MéTODOS DE USO. A presente invenção refere-se a polinucleotídeos infecciosos isolados, tais como clones infecciosos, tendo uma seqúência de nucleotídeo com identidade aos vírus PRRS, tais como VR-2332, Lelystad ou outros, e opcionalmente ainda incluindo uma deleção em uma região da ORF1 que codifica o polipeptídeo nsp2.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLINU-CLEOTÍDEOS INFECCIOSOS ISOLADOS E CLONES INFECCIOSOS".

DADOS DE PEDIDO DE PATENTE DE CONTINUAÇÃO

O presente pedido de patente reivindica o benefício do Pedidode patente Provisório U.S. N9 de Série 60/694.02depositado em 24 de Ju-nho de 2005, o qual é incorporado aqui por referência.

ANTECEDENTES

A presente invenção refere-se ao vírus da síndrome respirató-ria e produtiva em suínos (PRRSV) que é o agente causador de uma do-ença caracterizada por distúrbios respiratórios em porcos jovens e insufi-ciência reprodutiva em porcas (Benfield e outros, J. Vet. Diagn. Invest., 4:127-133 (1992); Collins e outros, J. Vet. Diagn. Invest, 4: 117-126 (1992);Wensvoort e outros, Vet. Q., 13: 121-130 (1991)) e é endêmico na maioriados países. A síndrome foi primeiro reconhecida como uma "doença mis-teriosa em suínos" nos Estados Unidos em 1987 e foi descoberta na Eu-ropa em 1990. As duas cepas virais protótipas (Lelystad e VR-2332) dife-rem quanto à seqüência de nucleotídeo em aproximadamente 40% e re-presentam dois genotipos distintos, referidos como cepas Européia (EUou Tipo 1, Lelystad; Meulenberg e outros, Virology, 192: 62-72 (1993)) eNorte Americana (NA ou Tipo 2, VR-2332; Nelsen e outros, J. Virol, 73:270-80 (1999)), (Fang e outros, Virus Res., 100: 229-235 (2004); Mardas-si e outros, J. Gen. Virol, 75: 681-5 (1994); Meng e outros, Arch. Virol,140: 745-55 (1995); Ropp e outros, J. Virol, 78: 3684-3703 (2004)). A do-ença também tem sido referida como síndrome de Wabash, doença mis-teriosa de porco, síndrome respiratória e reprodutiva em suínos, pragasuína, síndrome respiratória e de aborto epidêmico em suínos, doença deaborto azul, doença de orelha azul, "abortus blau" e "seuchenhafter spa-tabort der schweine". A doença é caracterizada por insuficiência reprodu-tiva em porcas prenhes e problemas respiratórios em porcos de todas asidades. A doença tem um impacto negativo significativo sobre a indústriade suínos.

O PRRSV é um vírus de RNA senso-positivo, com envelope, dafamília Arteriviridae na ordem Nidoviraies (Cavanagh, Arch. Virol, 142:629:633 (1997)). O genoma do PRRSV varia de 15,1-15,5 kb de comprimen-to (Meulenberg e outros, Virology, 192: 62-72 (1993); Nelsen e outros, J. Vi-rol, 73: 270-80 (1999)). Os primeiros 75% do genoma codificam a poliproteí-na replicase essencial para replicação do vírus e são compreendidos de du-as grandes redes de leitura aberta (ORFs) (Ia e Ib) que são processadas co-traducionalmente em proteínas menores por proteases viralmente codifica-das (Snijder e outros, J Gen. Virol, 79: 961-79 (1998)). As proteínas estrutu-rais são codificadas por sete ORFs a jusante e são traduzidas a partir de umconjunto agrupado 3'-coterminal de mRNAs sub genômicos (sgmRNA) (Meu-lenberg e outros, Virology, 192: 62-72 (1993); Pattnaik e outros, Ce/l, 69:1011-1020 (1992)). Na cepa VR-2332, a região de codificação do genoma(15.411 bases) é flanqueada por regiões não traduzidas 5' e 3' de 189 e 151nucleotídeos, respectivamente.

A cepa VR-2332 de PRRSV foi bem caracterizada em termos desua seqüência genômica completa (Pattnaik e outros, Cell, 69: 1011-1020(1992)), a capacidade do PRRSB de produzir constitutivamente espécies deRNA subgenômicas defectivas denominada heteróclitos (latim: formas inco-muns) (Yuan e outros, Virology, 275: 158-169 (2000)); Yuan e outros, VirusResearch, 105: 75-87(2004)) e suas propriedades de crescimento in vitro,bem como in vivo (Murtaugh e outros, Vet. Immunol. Immunopathol., 102:105-349 (2004)). Além disso, um clone infeccioso desse genoma de PRRSVNA de 15,4 kb foi produzido e examinado com relação à sua capacidade decausar doença em suínos (pVR-HN; Nielsen e outros, J. Virol., 77: 3702-3711 (2003)).

O PRRSV continua a causar perdas econômicas significativasno mundo todo. Vacinas estão disponíveis, mas elas são baseadas em umacepa de PRRSV e há evidência de que as cepas de PRRSV variam a nívelantigênico e genético. Além disso, uma vez que o vírus foi identificado naEuropa e nos Estados Unidos, novos fenotipos da doença continuam a surgir.

SUMÁRIO DA INVENÇÃORelatos anteriores têm sugerido que deleções e/ou mutações dequalquer cepa de vírus da PRRS eram, muitas vezes, extremamente preju-diciais ao crescimento viral. Especificamente, laboratórios individuais tinhamfeito mutações na extremidade 3' do vírus e o vírus resultante era instável erevertia rapidamente à seqüência do tipo silvestre ou crescia muito pobre-mente ou de modo algum (Lee e outros, Virol., 331: 47-62 (2005); Choi eoutros, J. Virol., 80: 723-736 (2006); Lee e outros, Virolog., 346: 238-250(2005)). Assim, em comparação de seqüências de nucleotídeo das cepasEuropéia (genotipo do Tipo 1) e VR-2332 (genotipo do Tipo 2), não se sabiaonde fazer mutações no VR-2332 NSP2 que não fossem extremamente pre-judiciais. Contudo, alinhamento de seqüências de genoma completo de no--vos vírus de PRRS do Tipo 2 com VR-2332 começou a proporcionar um in-sight sobre onde mutantes viáveis poderiam ser feitos. Ainda, mutagênesepor deleção mostrou que a região entre os aminoácidos 324-813 de nsp2não era necessária para crescimento in vitro.

A presente invenção proporciona um polinucleotídeo infecciosoisolado tendo uma seqüência de nucleotídeo com pelo menos 88% de iden-tidade à SEQ ID NO: 1 e uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeos con-secutivos selecionados do nucleotídeo 2062 ao nucleotídeo 3864 de SEQ IDNO: 1. Também proporcionado é um polinucleotídeo infeccioso isolado tendouma seqüência de nucleotídeo com pelo menos 88% de identidade à SEQID NO: 14 e uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos sele-cionados do nucleotídeo 2061 ao nucleotídeo 3545 de SEQ ID NO: 14. Opolinucleotídeo isolado pode estar presente em um vetor, em uma partículaviral isolada, presente em uma célula ou uma combinação dos mesmos.Quando presente em um vetor, um promotor de RNA polimerase isolado po-de ser operavelmente ligado ao polinucleotídeo. O polinucleotídeo isoladopode ser um RNA. O polinucleotídeo isolado pode incluir 2 ou mais deleçõese cada deleção pode ser independentemente pelo menos 37 nucleotídeos30 consecutivos. O polinucleotídeo isolado pode ainda incluir um polinucleotí-deo exógeno presente na deleção e o polinucleotídeo exógeno pode codifi-car um polipeptídeo, tal como um marcador detectável.A presente invenção também proporciona um polinucleotídeoisolado tendo uma seqüência de nucleotídeo com pelo menos 88% de iden-tidade à SEQ ID NO: 1 e pelo menos uma deleção de pelo menos 39 nucleo-tídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo 2062 ao nucleotídeo 3864de SEQ ID NO: 1 e em que o polinucleotídeo se replica e produz partículasvirais infecciosas quando introduzido em uma célula. Também proporciona-do é um polinucleotídeo isolado tendo uma seqüência de nucleotídeo compelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 14 e pelo menos uma deleçãode pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo2061 ao nucleotídeo 3545 de SEQ ID NO: 14, em que o polinucleotídeo sereplica e produz partículas virais infecciosas quando introduzido em umacélula, O polinucleotídeo isolado pode estar presente em um vetor, em umapartícula viral isolada, presente em uma célula ou uma combinação dosmesmos. Quando presente em um vetor, um promotor de RNA polimerasepode ser operavelmente ligado ao polinucleotídeo. O polinucleotídeo isoladopode ser um RNA. O polinucleotídeo isolado pode incluir 2 ou mais deleçõese cada deleção pode ser independentemente pelo menos 37 nucleotídeosconsecutivos. O polinucleotídeo isolado pode ainda incluir um polinucleotí-deo exógeno presente na deleção e o polinucleotídeo exógeno pode codifi-car um polipeptídeo, tal como um marcador detectável.

A presente invenção ainda proporciona um clone infeccioso ten-do um polinucleotídeo com uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos88% de identidade à SEQ ID NO: 1 e pelo menos uma deleção de pelo me-nos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo 2062 ao nu-cleotídeo 3864 de SEQ ID NO: 1. Também proporcionado é um clone infec-cioso tendo um polinucleotídeo com uma seqüência de nucleotídeo tendopelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 14 e pelo menos uma deleçãode pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo2061 ao nucleotídeo 3545 de SEQ ID NO: 14. O clone infeccioso pode estarpresente em uma célula. Um promotor de RNa polimerase pode estar opera-velmente ligado ao polinucleotídeo. O clone infeccioso pode incluir 2 ou maisdeleções e em que cada deleção é independentemente pelo menos 37 nu-cleotídeos consecutivos. O polinucleotídeo isolado pode ainda incluir um po-linucleotídeo exógeno presente na deleção e o polinucleotídeo exógeno po-de codificar um polipeptídeo, tal como um marcador detectável.

Também proporcionado pela presente invenção é um polinucleo-tídeo infeccioso isolado compreendendo uma seqüência de nucleotídeo SEQID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 e um polipeptídeo nsp2codificado por um polinucleotídeo infeccioso compreendendo uma seqüênciade nucleotídeo SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13.

O termo "compreende" e variações do mesmo não têm um signi-ficado Iimitativo onde esses termos aparecem na descrição e reivindicações.A menos que de outro modo indicado, "um", "uma, "o", "a" e "pelo menosum(a)" são usados permutavelmente e significam um(a) ou mais de um(a).

BREVE DESCRIÇÃO DAS figuraS

Figura 1. A. Seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) do poli-nucleotídeo infeccioso VR-V7 (também referido aqui como V6G7475A). B.Seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 2) do polinucleotídeo infeccioso VR-V5. C. Seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 3) do polinucleotídeo infec-cioso VR-V5G7475A. D. Seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 4) do poli-nucleotídeo infeccioso VR-V6. E. Seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 5)do polinucleotídeo infeccioso MN184A. F. Seqüência de nucleotídeo (SEQID NO: 6) do polinucleotídeo infeccioso MN184B. G. Seqüência de nucleotí-deo (SEQ ID NO: 7) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ324-434. H. Se-qüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 8) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2Δ324-523. I. Seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 9) do polinucleotídeoinfeccioso Nsp2 Δ543-632. J. Seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 10) dopolinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ633-726. L. Seqüência de nucleotídeo(SEQ ID NO: 11) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ543-726. L. Seqüênciade nucleotídeo (SEQ ID NO: 12) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ727-813. M. Seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 13) do polinucleotídeo infec-cioso Nsp2 Δ324-726.

Figura 2. Montagem de clones de comprimento total da cepaVR-2332 de PRRSV. O genoma 15.4 foi amplificado em quatro seções (I -IV) que incorporavam sítios de clivagem de enzima de restrição únicos pre-sentes em cDNA viral (Fsel, Avrll, BsrGI) ou adicionados à seqüência doPRRSV nas extremidades 5' e 3' através de mutagênese por inserção (Sphl,Pacl, respectivamente). Um promotor de polimerase A T7 e 2 resíduos de Gsem padrão e um resíduo de T precediam a seqüência viral. O vetor pOK12(24) foi modificado para incluir um sítio pacl e uma delta ribozima de hepatitea jusante de uma cauda de poliadensina de 50 nucleotídeos.

Figura 3. Esquema de alterações de nucleotídeo de clones in-fecciosos ou prole de suíno—Diagrama de organização do genoma de PR-RSV é apresentado, sob o qual estão comparações de genoma completo.Clivagens de proteína não-estrutural putativa são representadas acima dasORFIa e Ib, representadas pelas setas descendentes. Motivos de assinaturasão identificados abaixo das ORFIa e Ib, com as setas ascendentes indican-do sua colocação no genoma do PRRSV [protease de cisteína α e β seme-lhantes à papaína (PCPa, ΡΟΡβ); protease de cisteína (CP); protease deserina/3 C (SP/3CP); polimerase (POL); rico em cisteína/histidina (C/H); heli-case (Hei); endoribonuclease poli(U)-específica homóloga a Xenopus Iaevis(XendoU); Ivanov e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 10:12694-12699(2004); Ziebuhr e outros, J. Gen. Virol, 81: 853-879 (2000)]. Diferenças denucleotídeo são representadas pelas barras verticais. 1. Cepa do tipo silves-tre VR-2332 (U87392) comparada com vacina derivada de VR-2332 (Ingel-vac® MLV ou RespPRRS, AF066183). 2. Cepa do tipo silvestre VR-2332comparada com pVR-V6G7475A. 3. pVR-V5 comparado com V5-1-P3 pas-sado in vivo (Sw612). 4. Cepa do tipo silvestre VR-2332 comparado comSw612. Alterações de nucleotídeo detalhadas são listadas nas Tabelas 4 e 5.

Figura 4. Soro-conversão de suíno após infecção com PRRSV.Suínos em crescimento foram infectados com a cepa do tipo silvestre nativaVR-2332 (D), Ingelvac® MLV ( X ), V5-1P3 (O) ou permaneceram não infec-tados (■). Nos dias indicados, amostras de soro foram tomadas e testadasatravés de do Elisa IDEXX com relação à indicação de soro-conversão poranticorpos anti-PRRSV à proteína de nucleocapsídeo.

Figura 5. A. Ensaios de placa sobre a prole P3 (primeira Iinha-gem) de todos os clones, bem como da cepa do tipo silvestre VR-2332 reve-laram diferentes tamanhos de placa. B. Prole de V5-1P3 após crescimentoem suínos (Sw612) produziu placas similares à cepa do tipo silvestre VR-2332.

Figura 6. A. Ensaios de placa sobre a prole P3 (segunda Iinha-gem) de todos os clones infecciosos, bem como da cepa do tipo silvestreVR-2332 mostraram tamanhos de placa que eram diferentes dos preparadosvirais de primeira linhagem^B. Titulações-de vírus P4 indicam que a prole declone infeccioso não estavam se replicando como a cepa do tipo silvestreVR-2332 ou o vírus Sw612, a despeito de terem um tamanho de placa similar.

Figura 7. A. Prole P3 da cepa do tipo silvestre VR-2332 (♦),Sw612 (A), pVR-HN ( ), pVR-V5 (X), pVR-V5G7475A (*), pVR-V6 (·), pVR-V6G7475A (O) foram simultaneamente examinadas com relação à cinéticade crescimento em uma etapa, conforme esboçado no Exemplo 1. A cepa dotipo silvestre VR-2332 e vírus Sw612 se replicaram em titulações de até a-proximadamente 10 vezes maiores em todos os pontos de tempo. pVR-V6G7475A, sem nenhuma alteração de aminoácido com relação ao vírusnativo ou vacina, produziu vírus que se replicava em uma titulação maior emtodos os pontos de tempo do que todas as outras proles de clone infeccioso.A titulação final para cada preparado viral é listada na tabela de comparação.

Figura 8. Análise por Northern blot de diferentes passagens daprole de pVR-V6G7475A, bem como Sw612 e do transcrito inicial in vitrorevela que heteróclitos são produzidos tão precocemente quanto P1 e, juntocom RNA genômico, são mais abundantes com a passagem. Contudo, RNAde transcrito (Tx) não contém espécies de heteróclito prontamente detectáveis.Figura 9. A. Representação diagramática do genoma do PR-RSV. Clivagens de proteína não estrutural putativa são representadas acimadas ORFIa e Ib1 representadas por setas descendentes. Motivos de assina-tura são identificados abaixo das ORFIa e Ib1 indicando sua colocação nogenoma do PRRSV [proteases de cisteína α e β semelhantes à papaína(PL1); protease de cisteína (PL2); protease de serina/3C (3CL); polimerase(RdRp); helicase (Hei); endoribonuclease polí(U)-específica homóloga a Xe-nopus laevis (N); Ziebuhr e outros, 2000; Ivanov e outros, 2004; Gorbalenyae outros, 2006]. B. Diagrama esquemático da comparação de proteína deORF1 (replicase) de MN184A e MN184B e processamento putativo. A dege-nerância observada em nsp2 é incluída na comparação. C. Diagrama es-quemático da comparação de proteínas de ORF2-7 de MN184A e MN184B.

Figura 10. Alinhamento da seqüência de aminoácido de ORF5de PRRSV divergente. As caixas verde escuro indicam alta conservação deaminoácido (>80%; entre 16 e 19 resíduos são idênticos), cinza médio(>60%; entre 12 e 15 resíduos são idênticos), cinza mais claro (>40%; entre8 e 11 resíduos são idênticos) e as caixas não sombreadas (<40%; menosde 8 resíduos são idênticos) identificam resíduos menos conservados. A re-gião tracejada indica a seqüência de sinal putativa, as regiões entre caixasidentificam as regiões transmembrana propostas, as regiões hipervariáveissão indicadas (HV-1 e HV-2) e a orientação proposta da proteína no vírion éidentificada em itálico em negrito. O resíduo de cisteína conservado que éproposto para interagir com a proteína M é identificado por u ma seta des-cendente (4-). Os dois sítios de N-glicosilação putativos conservados são i-dentificados por estrelas e a região hipervariável 1 contém sítios de N-glicosilação específicos de cepa/isolado (NxS/T). As seguintes seqüênciasde comprimento total do GenBank foram usadas para comparação: VR-2332(U87392), Ingelvac MLV (AF066183), 01NP1.2 (DQ056373), PL97-1(AY58524), PA -8 (AF176348), SP (AF184212), BJ-4 (AF331831), HN1(,AY457635), 16244B (AF046869), HB-1 {AY! 50312), HB-2 (AY262352), CH-1a (AY032626), P129 (AF494042), JA142 (AY424271), SDPRRS-01- 08(AY375474), EuroPRRSV (AY366525), Lelystad (M96262), IAF-93-653(U64931), IAF-KIop (.ΑΥ184209), 98-3298 (DQ30687?), 98-3403 (DQ306878),99-3584 (DQ306879).

Figura 11. Alinhamento de seqüência de aminoácido de Νβρίβde PRRSV divergente. O desvio na figura e esquema de cor foram descritosna legenda da figura 10. Os dois resíduos catalíticos putativos completamen-te conservados são identificados por estrelas e os aminoácidos dentro decaixas identificam a conservação de seqüência de MN184 com isolados doTipo 1 e EAV. O sítio de clivagem proposto é identificado pela seta descen-dente (Ψ).

Figura 12. Alinhamento de seqüência de aminoácido de Nsp2de PRRSV divergente. Os resíduos catalíticos de protease de cisteína puta-4ivos-compJetamente-conservados-(-Cys e His) são identificados por estrelase os aminoácidos entre caixas significam conservação de seqüência de pro-tease dentro do PRRSV e EAV. Os sítios de clivagem propostos são identifi-cados por setas cheias (Ψ); possíveis sítios de clivagem adicionais são indi-cados por uma seta hachurada; peptídeo sinalizador, caixa cinza sólida; re-giões transmembrana, mostradas em caixas pretas hachuradas; sítios de N-glicosilação potenciais, indicados por um asterisco (*). O desvio na figura eesquema de cor foram descritos na legenda da figura 10.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS

A presente invenção inclui clones infecciosos do vírus da sín-drome reprodutiva e respiratória de Suínos (PRRSV)1 VR-2332. Conformeusado aqui, o termo "clone infeccioso" é um polinucleotídeo tendo dois com-ponentes; uma seqüência de vetor que se replica em uma célula hospedeiraprocariota e um segundo polinucleotídeo referido aqui como um polinucleotí-deo infeccioso. Quando transcrito in vitro para proporcionar um polinucleotí-deo de RNA e introduzido em uma célula permissiva, o polinucleotídeo in-feccioso se replica (como um RNA) e produz partículas virais infecciosas.Assim, um polinucleotídeo infeccioso pode estar presente em um vetor comoum DNA, como um RNa em uma partícula viral ou como um DNA ou RNAisolado. O termo "polinucleotídeo" se refere a uma forma polimérica de nu-cleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxinucleo-tídeos, e inclui DNA e RNA fita duplo e simples. A menos que de outro modoobservado, um polinucleotídeo inclui o complemento do mesmo. A seqüên-cia de nucleotídeo do complemento de um polinucleotídeo pode ser facil-mente determinada por aqueles versados na técnica. Um polinucleotídeopode incluir seqüências de nucleotídeo tendo diferentes funções incluindo,por exemplo, seqüências de codificação e seqüências de não codificação,tais como seqüências regulatórias e/ou regiões não traduzidas. Um polinu-cleotídeo pode ser obtido diretamente a partir de uma fonte natural ou podeser preparado com o auxílio de técnicas recombinantes, enzimáticas ouquímicas. Um polinucleotídeo pode ser de topologia linear ou circular. Umpolinucleotídeo pode ser, por exemplo, uma porção de um vetor, tal comoum vetor de expressão ou clonagem ou um fragmento.

Se ocorrendo naturalmente, um polinucleotídeo é, de preferên-cia, isolado, mas preferivelmente purificado. Um composto "isolado", tal co-mo um polinucleotídeo, polipeptídeo ou partícula viral, é um que é separadoe distinto de seu ambiente natural. Um composto "purificado" é um que épelo menos 60% isento, de preferência 75% isento e, mais preferivelmente,90% isento de outros componentes com os quais ele está naturalmente as-sociado. Compostos tais como polinucleotídeos e polipeptídeos que sãoproduzidos fora do organismo no qual eles ocorrem naturalmente, por exem-plo, através de meios químicos ou recombinantes, são considerados comosendo isolados e purificados por definição, uma vez que eles nunca estive-ram presentes em um ambiente natural.

Um exemplo de um polinucleotídeo infeccioso da presente in-venção inclui o polinucleotídeo infeccioso VR-V7 (SEQ ID NO: 1). VR-V7também é referido aqui como V6G7475A. Outros exemplos de polinucleotí-deos infecciosos da presente invenção incluem VR- V5 (SEQ ID NO: 2), VR-V5G7475A (SEQ ID NO: 3) e VR-V6 (SEQ ID NO: 4). Deverá ser notado queembora SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e outras seqüências de nucleotídeo vi-rais sejam descritas aqui como uma seqüência de DNA, a presente invençãoconsidera a seqüência de RNA correspondente e complementos de RNA eDNA das mesmas, também.Outros polinucleotídeos infecciosos da presente invenção têmuma seqüência de polinucleotídeo tendo similaridade estrutural a um polinu-cleotídeo de referência. Polinucleotídeos de referência incluem SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, a cepa protótipo do vírus de PRRS Europeu, Lelystad (número de acessoao Genbank M96262; SEQ ID NO: 14) e a cepa protótipo do vírus de PRRSNorte Americano, VR-2332 (número de acesso ao Genbank U87392; SEQID NO: 15). A similaridade é referida como "identidade percentual" e é de-terminada através de alinhamento dos resíduos dos dois polinucleotídeos(isto é, a seqüência de nucleotídeo de um polinucleotídeo infeccioso candi-dato e a seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo de referência) paraotimizaro-n úmero de-nueleotídeos idênticos ao-longo dos-eomprimentos desuas seqüências; gaps em uma ou ambas as seqüências são permitidas aofazer o alinhamento de forma a otimizar o número de nucleotídeos comparti-lhados, embora os nucleotídeos em cada seqüência devam, todavia, perma-necer em sua ordem apropriada. Em alguns aspectos da presente invenção,a gap (também referida como uma deleção) está presente na seqüência dopolinucleotídeo infeccioso candidato. Um polinucleotídeo infeccioso candida-to é um polinucleotídeo que tem a seqüência de nucleotídeo sendo compa-rada com o polinucleotídeo de referência. Um polinucleotídeo infecciosocandidato pode ser isolado de um animal, tal como um porco infectado comPRRSV, isolado de uma linhagem de célula cultivada ou pode ser produzidousando técnicas recombinantes ou química ou enzimaticarriente sintetizado.Duas seqüências de nucleotídeo podem ser comparadas usando qualquerum dos algoritmos de computador comercialmente disponíveis rotineiramen-te usados para produzir alinhamentos de seqüências de nucleotídeo. De pre-ferência, duas seqüências de nucleotídeo são comparadas usando o pro-grama GAP do GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc.) versão 10.3 (2001).O programa GAP usa o algoritmo de Needleman e outros (J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970)) para encontrar o alinhamento de duas seqüências comple-tas que máxima o número de combinações e minimiza o número de gaps.De preferência, os valores de default para todos os parâmetros de busca noGAP são usados, incluindo matriz de escore = NewsgapDNA.cmp, peso porgap = 50, peso por extensão = 3, combinação média = 10, combinação errô-nea média = 0. Na comparação de duas seqüências de nucleotídeo usandoo algoritmo de busca do GAP, similaridade estrutural é referida como "identi-dade percentual". De preferência, um polinucleotídeo tem similaridade estru-tural com um polinucleotídeo de referência de pelo menos 88%, pelo menos89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92 %, pelo menos93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade quando a similari-dade estrutural é determinada usando o programa GAP.

Se um polinucleotídeo é um polinucleotídeo infeccioso pode serdeter-minado-através de inserção, em um vetor, de um polinucleotídeo infec-cioso candidato, transcrição do polinucleotídeo infeccioso candidato in vitro,transfecção de uma célula permissiva com as moléculas de RNA resultantese detecção de RNA viral da prole, proteína de nucleocapsídeo viral da prole,detecção de partículas virais infecciosas ou uma combinação dos mesmos, ovetor tem, de preferência, as características de ser de baixo número de có-pia e permanecer estável após inserção de grandes insertos (por exemplo,15 kb). Um exemplo de um vetor adequado é pOK e pOK12 (Acesso aoGenBank AF223639, Vieira e outros, Gene, 100: 189-194 (1991)) e outrosvetores tendo essas características são conhecidos e estão disponíveis. Novetor, o polinucleotídeo infeccioso candidato está imediatamente a jusantede um promotor. Promotores úteis são aqueles que podem ser incluídos pa-ra proporcionar altos níveis de transcrição, tal como um promotor de RNApolimerase T7, por exemplo, TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO: 16) ouos promotores de RNA polimerase SP6 e T3. Transcrição do polinucleotídeoinfeccioso candidato inclui, tipicamente, digestão com endonuclease de res-trição do vetor para torna-lo linear e produção de transcritos de RNA atravésde uso de métodos de transcrição in vitro de rotina e bem-conhecidos. Kitspara transcrição in vitro estão comercialmente disponíveis (por exemplo,mMessage mMachine, disponível da Ambion, Austin, TX).

Após transcrição in vitro, o RNA é purificado usando métodos derotina e, então, usado para transfeetar uma célula permissiva. Exemplos decélulas permissivas incluem, por exemplo, BHK-21 (a qual permite um ciclode produção de partícula viral), CL-2621, MA-104 (ATCC CRL-2378),MARC-145 (Kim e outros, Arch. Virol, 133: 477-483 (1993)), linhagens decélula clonadas dessas linhagens de células ou macrófagos alveolares pri-mários de suíno. Métodos para transfeetar eficazmente células incluem ouso de brometo de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidróxi etil amônio e coles-terol (DMRIE-C) e outros produtos comercialmente disponíveis, de preferên-cia DMRIΕ-C. Métodos para transfeetar eficazmente macrófagos alveolaresprimários de suíno são conhecidos na técnica (Groot Bramel Verheige e ou-tros, Virol., 278: 380-389 (2000)). Geralmente, 2 a 3 microgramas de RNApodem ser usados para transfecção, mas quantidades maiores e menorespodem ser usadas. Após um período de tempo adequado, a presença deRNA viral da prole pode ser detectada, por exemplo, através de reação emcadeia de polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR). Da mesma forma,proteína de nucleocapsídeo viral da prole pode ser detectada, por exemplo,através de um anticorpo nucleocapsídeo-específico. Ainda, se as partículasvirais produzidas por células transfectadas com um polinucleotídeo infeccio-so candidato infectarão outra célula pode ser detectado através de exposi-ção de células permissivas não infectadas ao sobrenadante de células infec-tadas. opcionalmente, o efeito citopático (CPE) pode ser observado. Um po-linucleotídeo infeccioso candidato é considerado como sendo um polinucleo-tídeo infeccioso quando ele produz RNA viral da prole, proteínas virais deprole (nucleocapsídeo, membrana, GP5 e outras) e infecta outras células permissivas.

Em alguns aspectos da presente invenção, um polinucleotídeoinfeccioso inclui uma deleção de nucleotídeos que codificam a proteína 2não estrutural (nsp2), um de vários (12 previstos) polipeptídeos presentes napoliproteína codificada pela ORF1. Em um vírus de PRRS e polinucleotídeosinfecciosos do mesmo, os nucleotídeos que codificam o primeiro aminoácidode nsp2 podem ser determinados através de identificação do sítio de cliva-gem de protease 1 beta semelhante à papaína, prevista como estando apóso aminoácido glicina na ORF1 na posição 383 no VR-2332.

Com relação à identificação de nucleotídeos que codificam oúltimo aminoácido de nsp2, o sítio de clivagem C-terminal exato da nsp2 dapoliproteína codificada pela ORF 1a não foi empiricamente determinado, as-sim, os nucleotídeos correspondendo à extremidade 3' da região de codifi-cação são desconhecidos. Contudo, duas previsões do sítio de clivagem C-terminal foram propostas, um em Gly|Gly (onde a linha vertical entre os doisresíduos de glicina indicam a localização de clivagem) no aminoácido 980 doVR-2332 e a outro no aminoácido 1197 no VR-2332. Em alinhamento detodas as seqüências de PRRSV disponíveis, existem várias duplas GIyJGIycompletamente conservadas dentro dessa proteína que também podem sero sítio de clivagem C-terminal da nsp2 da poliproteína (aminoácidos 646,980, 1116, 1196, 1197 em VR-2332). As localizações das duplas Gly|Gly nosoutros vírus e polinucleotídeos infecciosos podem ser identificadas atravésde comparação das seqüências de nsp2 e das duplas Gly|Gly descritas nafigura 12. Estudos atuais sugerem que existem pelo menos 3 sítios de cliva-gem na nsp2, correspondendo aos aminoácidos 980, 1116, 1196 ou 1197.

O polipeptídeo de nsp2 inclui um domínio de protease de cisteí-na semelhante à quimotripsina altamente conservado (identificado como CPna figura 3 e PL2 na figura 9) presente no N-término e 3-4 domínios trans-membrana previstos próximo ao C-término da nsp2 (onde o número de do-mínios transmembrana varia dependendo da localização do sítio de clivagemC-terminal). Tipicamente, deleção dos nucleotídeos que codificam os amino-ácidos do domínio PL2 ou todos os domínios transmembrana previstos re-sulta em um polinucleotídeo que pode se replicar em células permissivas,mas não produz partículas virais infecciosas. Assim, um clone infeccioso dapresente invenção, tipicamente, não inclui deleção do domínio PL2 todo outodos os domínios transmembrana previstos.

Os nucleotídeos que codificam o domínio de protease de cisteí-na semelhante à quimotripsina são os nucleotídeos 1474 a 1776 do VR-V7(SEQ ID NO: 1), nucleotídeos 1474 a 1776 do VR-2332 (número de acessoao Genbank U87392), e nucleotídeos 1482 a 1784 do Lelystad (número deacesso ao Genbank M96262). A localização de um domínio de protease decisteína semelhante à quimotripsina na seqüência de nucleotídeo de outrosvírus de PRRS pode ser identificada através de alinhamento da seqüênciade aminoácido do polipeptídeo de nsp2 codificado por um vírus de PRRScom o alinhamento de seqüência de aminoácido descrito na figura 12 e de-terminação de quais nucleotídeos codificam aqueles aminoácidos que sealinham com o domínio de protease de cisteína semelhante à quimotripsina.Alternativamente, as seqüências de aminoácido de polipeptídeos de nsp2 deoutros vírus de PRRS podem ser identificadas através de alinhamento daseqüência de aminoácido do polipeptídeo de nsp2 codificado por um vírusde PRRS com a seqüência de aminoácido de polipeptídeos de nsp2 produ-zidos por outros arterivírus, tal como o νírus da a arterite de eqüino (EAV) e ovírus de elevação de dehidrogenase de Iactato (LDV).

Os nucleotídeos que codificam os domínios transmembrana pre-vistos do VR-V7 (SEQ ID NO: 1), VR-2332 (número de acesso ao GenbankU87392) e Lelystad (número de acesso ao Genbank M96262) são mostra-dos na Tabela 1.

Tabela 1. Nucleotídeos de nsp2 que codificam domínios transmembranaprevistos.

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A localização dos domínios transmembrana na seqüência denucleotídeo de outros vírus de PRRS pode ser identificada através de ali-nhamento da seqüência de aminoácido do polipeptídeo de nsp2 codificadopor um vírus de PRRS com o alinhamento de seqüência de aminoácido des-crito na figura 12 e determinação de quais nucleotídeos codificam aquelesaminoácidos que se alinham com os domínios transmembrana. Alternativa-mente, a localização dos domínios transmembrana pode ser identificadacom um algoritmo de computador, tal como o algoritmo PredictProtein, con-forme descrito por Rost e outros (Nucleic Acids Res., 32 (edição para Servi-dor da Web): W321-326 (2004) ou o algoritmo TMHMM, conforme descritopor Krogh e outros (J. Moi Biol., 305: 567-580 (2001)) e disponível atravésda World Wide Web.

A deleção presente em polinucleotídeos infecciosos da presenteinvenção está, tipicamente, entre os nucleotídeos que codificam o domíniode protease de cisteína semelhante à quimotripsina e os nucleotídeos quecodificam os domínios transmembrana e não resulta em um desvio de redena rede de leitura da ORF1. Conforme discutido acima, a deleção, tipica-mente, não inclui todos os nucleotídeos que codificam o domínio de proteasede cisteína semelhante à quimotripsina, todos os nucleotídeos que codificamos domínios transmembrana ou a combinação dos mesmos. Em alguns as-pectos, por exemplo, quando o- polinucleotídeo infeccioso tem similaridadeestrutural com SEQ ID NO: 1,· o limite 5' de uma deleção está no nucleotídeo2305, nucleotídeo 2205, nucleotídeo 2105 ou nucleotídeo 2062 e o limite 3"de uma deleção está no nucleotídeo 3774, nucleotídeo 3804, nucleotídeo3834 ou nucleotídeo 3864. Em outros aspectos, por exemplo, quando o poli-nucleotídeo infeccioso tem similaridade estrutural com SEQ ID NO: 14, olimite 5' de uma deleção está no nucleotídeo 2304, nucleotídeo 2204, nucle-otídeo 2104 ou nucleotídeo 2061 e o limite 3' de uma deleção está no nucle-otídeo 3455, nucleotídeo 3495, nucleotídeo 3525 ou nucleotídeo 3545. Adeleção pode ser pelo menos 39 nucleotídeos, 48 nucleotídeos ou 57 nucle-otídeos. Em alguns aspectos, a deleção pode ser pelo menos 267 nucleotí-deos, pelo menos 276 nucleotídeos ou pelo menos 285 nucleotídeos. Emalguns aspectos, a deleção é não mais do que 489 nucleotídeos, não maisdo que 459, não mais do que 429 ou não mais do que 402 nucleotídeos. Umpolinucleotídeo infeccioso pode ter mais de uma deleção na região de nsp2.

Exemplos de polinucleotídeos infecciosos derivados de VR-V7 econtendo uma deleção são descritos na Tabela 2.Tabela 2. Polinucleotídeos infecciosos derivados de VR-V7 (SEQ ID NO: 1).

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*A deleção se refere aos aminoácidos de nsp2 que são deletados, por e-xemplo, no vírus Nsp2 Δ180-323, os aminoácidos 180-323 da nsp2 são deletados.

**0 tamanho de placa é com relação às placas produzidas pelo VR-2332 dotipo silvestre.

Um polinucleotídeo infeccioso contendo uma deleção pode inclu-ir um polinucleotídeo exógeno inserido em lugar da deleção. Um polinucleo-tídeo "exógeno" se refere a uma seqüência de nucleotídeo estranho, isto é,uma seqüência de nucleotídeo que não está normalmente presente em umvírus de PRRS ou um clone infeccioso do mesmo. O polinucleotídeo exóge-no pode e, de preferência, não codifica um polipeptídeo. Polinucleotídeosexógenos adequados incluem aqueles que codificam um marcador detectá-vel, por exemplo, uma molécula que é facilmente detectada através de vá-rios métodos. Exemplos incluem polipeptídeos fluorescentes (por exemplo,proteínas fluorescentes verde, amarela, azul é vermelha), luciferase, acetiltransferase de cloranfenicol e outras moléculas (tais como c-myc, flag, 6xhis,peptídeo de ligação a metal HisGIn (HQ) e epítopo V5) detectáveis por suafluorescência, atividade enzimática ou propriedades imunológicas e são, tipi-camente, úteis quando detectadas em uma célula, por exemplo, uma célulacultivada ou uma amostra tecidual que tenha sido removida de um animal.Outros polinucleotídeos exógenos que podem ser usados são aqueles quecodificam polipeptídeos expressos por outras entidades, tais como células epatógenos. Expressão de um polinucleotídeo exógeno resulta em um polinu-cleotídeo infeccioso que expressa antígenos estranhos. Exemplos de se-qüências de nucleotídeo exógenas incluem aquelas que codificam proteínasexpressas por patógenos, de preferência patógenos de suíno, tais como ocircovírus suíno do tipo 2, Mycoplasma hyopneumoniae (por exemplo, asproteínas P46 e P65 de M hyopneumoniae), Lawsonia intracellularis (porexemplo, as proteínas da membrana externa de L. intracellularis), a ORF5de diferentes cepas de PRRSV e Streptococcus suis (por exemplo, a proteí-na de 38-kDa de S. suis). O polipeptídeo de nsp2 tem epítopos de células Be espera-se que seja imunogênico. Espera-se que a inclusão de epítoposestranhos em um polipeptídeo de nsp2 resulte em uma resposta imune aosepítopos estranhos. Exemplos adicionais de polinucleotídeos exógenos in-cluem aqueles que codificam modificadores de resposta biológica, por e-xemplo, IFN-α, IFN-γ, IL- 127IL-2, TNF-α e ÍL-6.

O polinucleotídeo exógeno é inserido na região de deleção demodo que ele esteja em rede com a rede de leitura aberta que codificansploc e ηsρίβ e mais de um polinucleotídeo exógeno pode ser inserido ale-atoriamente, por exemplo, seqüências de nucleotídeo que codificam três epí-topos de c-myc podem estar presentes. O tamanho total do polinucleotídeoinfeccioso contendo um polinucleotídeo exógeno inserido em lugar da dele-ção é, tipicamente, não maior do que 16.000 bases, não maior do que15.800 bases, não maior do que 15.600 bases, não maior do que 15.400bases ou não maior do que 15.200 bases (incluindo a cauda de poli A), umainserção pode estar presente em um polinucleotídeo infeccioso tendo a de-leção Nsp2 Δ324-434, Nsp2 Δ324-523, Nsp2 Δ543-632, Nsp2 Δ633-726,Nsp2 Δ543-726, Nsp2 Δ727-813 ou Nsp2 Δ324-726, de preferência a dele-ção Nsp2 Δ324-434, Nsp2 Δ543-632, Nsp2 Δ633-726, Nsp2 Δ543-726, Nsp2Δ727-813 ou Nsp2 Δ324-726. Exemplos preferidos de clones infecciososcontendo um polinucleotídeo exógeno em lugar de uma deleção incluem umpolinucleotídeo infeccioso tendo a deleção Nsp2 Δ324-434 contendo umaregião de codificação que codifica uma proteína fluorescente verde de 238aminoácidos, um polinucleotídeo infeccioso tendo a deleção Nsp2 Δ543-632contendo uma região de codificação que codifica uma proteína fluorescenteverde de 238 aminoácidos, um polinucleotídeo infeccioso tendo a deleçãoNsp2 Δ324-434 contendo uma região de codificação que codifica um epítopode c-myc de 10 aminoácidos (EQKLISEED L, SEQ ID NO: 17), um polinu-cleotídeo infeccioso tendo a deleção Nsp2 Δ324-434 contendo uma regiãode codificação que codifica um epítopo de c-myc de 10 aminoácidos e umpolinucleotídeo infeccioso tendo as deleções Nsp2 Δ324-726 ou Nsp2 Δ543-726, cada uma contendo uma região de codificação que codifica uma repeti-ção aleatória do epítopo de c-myc de 10 aminoácidos.

Um polinucleotídeo infeccioso está, tipicamente, presente em umvetor e a combinação do polinucleotídeo infeccioso e vetor é referida comoum clone infeccioso, o qual é feito através de genética invertida. Um vetor éum polinucleotídeo de replicação, tal como um plasmídeo, fago ou cosmí-deo, ao qual outro polinucleotídeo pode ser preso de modo a levar à replica-ção do polinucleotídeo preso. Construção de vetores contendo um polinucle-otídeo da invenção emprega métodos padrões de DNA recõmbinante co-nhecidos na técnica (veja, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).Um vetor pode proporcionar clonagem adicional (amplificação do polinucleo-tídeo), isto é, um vetor de clonagem ou para a expressão do polipeptídeocodificado pela região de codificação, isto é, um vetor de expressão ou acombinação dos mesmos. O termo vetor inclui, mas não está limitado a, ve-tores de plasmídeo, vetores virais, vetores de cosmídeo ou vetores de cro-mossoma artificial. Tipicamente, um vetor é capaz de replicação em um hos-pedeiro bacteriano, por exemplo, E. coli. De preferência, o vetor é um plasmídeo.

Seleção de um vetor depende de uma variedade de característi-cas desejadas na estrutura resultante, tal como um marcador de seleção,taxa de replicação do vetor e similares. De preferência, um vetor adequadopara uso como parte de um clone infeccioso é um vetor de clonagem e umvetor de expressão. Vetores úteis têm um baixo número de cópia em umacélula hospedeira. Células hospedeiras adequadas para clonagem ou ex-pressão dos vetores aqui são células procariotas ou eucariotas. De prefe-rência, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteo-líticas. Procariotas adequados incluem eubactérias, tais como organismosgram-negativos, por exemplo, E. coli ou S. typhimurium. Células hospedeirasexemplificativas úteis para fabricação, manipulação e manutenção de umclone infeccioso são DH-5oc, DH-1 (ATCC 33849) e AG-1, de preferênciaDH-1 ou AG-1.

— Um-vetor-inclui seqüências regulatórias operavelmente ligadasao polinucleotídeo infeccioso. O termo "operavelmente ligado" se refere auma justaposição de componentes, de modo que eles estejam em uma rela-ção que permite que os mesmos funcionem de sua maneira pretendida. Umaseqüência regulatória é "operavelmente ligada" a um polinucleotídeo infec-cioso da presente invenção quando ela está unida de uma forma tal que ex-pressão da região de codificação é obtida sob condições compatíveis com aseqüência regulatória. Tipicamente, um promotor é um que proporciona liga-ção em alta especificidade de uma RNA polimerase e tais promotores inclu-em T7, SP6, e T3. Tipicamente, o promotor está localizado imediatamente amontante do primeiro nucleotídeo do polinucleotídeo infeccioso. De prefe-rência, um GGT está inserido entre o promotor e o primeiro nucleotídeo dopolinucleotídeo infeccioso. Opcionalmente e de preferência, o vetor tambémcontém uma ribozima do vírus delta de hepatite a jusante da região poli A.

O vetor, opcionalmente e de preferência, inclui uma ou mais se-qüências marcadoras de seleção as quais codificam, tipicamente, uma mo-lécula que inativa ou de outro modo detecta ou é detectada por um compos-to no meio de crescimento. Por exemplo, a inclusão de uma seqüência mar-cadora de seleção pode tornar a célula transformada resistente a um antibió-tico ou pode conferir à mesma um metabolismo composto-específico sobre acélula transformada. Exemplos de uma seqüência marcadora de seleção sãoseqüências que conferem resistência à canamicina, ampicilina, cloranfenicol,tetraciclina e neomicina.

Quando de produção de uma deleção de nucleotídeos que codi-ficam um polipeptídeo de nsp2 em um clone infeccioso, métodos de DNArecombinante padrões conhecidas na técnica podem ser usados (veja, porexemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)). Conforme aqueles versados na téc-nica reconhecerão, é prática padrão durante construção de um clone infec-cioso (e quando de construção de deleções em um clone infeccioso) verifi-car, através de análise de seqüência de nucleotídeo, a presença de seqüên-cias de nucleotídeo esperadas, tais como deleções ou outras alterações e aausência de outras mutações-Da mesma forma,-quando-um-polinucleotídeoinfeccioso candidato é testado para determinar se ele é infeccioso, é práticapadrão verificar, através de análise da seqüência de nucleotídeo, a ausênciade vírus contaminante do tipo silvestre.

A presente invenção também inclui polinucleotídeos infecciososisolados descritos em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e polinucleotídeos in-fecciosos tendo similaridade estrutural à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.Métodos para determinação de similaridade estrutural são descritos aqui. Depreferência, um polinucleotídeo infeccioso desse aspecto da presente inven-ção tem similaridade estrutural à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 de pelomenos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me-nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Um polinucle-otídeo tendo similaridade estrutural à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 é con-siderado com sendo um polinucleotídeo infeccioso se, quando presente emuma partícula viral e exposto à células permissíveis, o polinucleotídeo sereplica nas células permissivas e produz partículas virais infecciosas.

A presente invenção partículas virais isoladas. Conforme usadoaqui, os termos "partícula viral" e "partícula de vírus" são usados permuta-velmente e se referem a um polinucleotídeo da presente invenção circunda-do por um envelope. Uma partícula viral da presente invenção podem, quan-do adicionada a uma célula cultivada permissiva, pode se replicar na produ-ção de mais partículas virais.

Uma partícula viral pode ser crescida através de passagem invivo ou em cultura de célula. Passagem in vivo inclui inoculação de um porco(Faaberg e outros, Patente U.S 7.041.443). Passagem em cultura de célulainclui exposição de células cultivadas à partícula viral e incubação das célu-las sob condições adequadas para que o vírus se reproduza e produza maispartículas virais. De preferência, as células cultivadas não são uma linhagemde célula imortalizada ou transformada (isto é, as células não são capazesde se dividir indefinidamente). De preferência, macrófagos aíveolares primá-rios de suíno são usados para passagem em cultura de células (Faaberg eoutros, Patente U.S 7.041.443).

Um vírus da presente invenção pode ser inativado, isto é, torna-do incapaz de reprodução in vivo e/ou em cultura de células. Métodos deinativação são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, tratamento deuma partícula viral da invenção com um agente de inativação químico pa-drão, tal como um reagente de aldeído, incluindo formalina, acetaldeído esimilares; álcoois ácidos reativos, incluindo cresol, fenol e similares; ácidos,tais com ácido benzóico, ácido benzeno sulfônico e similares; lactonas, taiscomo beta propiolactona e caprolactona; e Iactames ativados, carbodiimidase compostos de carbonila diheteroaromáticos, tal como carbonil diimidazol.Irradiação, tal como com irradiação ultravioleta e gama, também pode serusada para inativar o vírus.

Também incluídas na presente invenção são partículas viraisatenuadas (por exemplo, vírus tendo capacidade reduzida de causar os sin-tomas de doença misteriosa de suínos em porcos) e métodos de fabricaçãode uma partícula viral atenuada. Métodos de produção de um vírus atenuadosão conhecidos na técnica. Tipicamente, um vírus da presente invenção épassado, isto é, usado para infectar uma célula em cultura, deixado reprodu-zir e, então, coletado. Esse processo é repetido até que a virulência do vírusem porcos seja diminuída. Por exemplo, o vírus pode ser passado 10 vezesem cultura de célula e, então, a virulência do vírus medida. Se a virulêncianão diminuiu, o vírus que não foi injetado no animal é passado mais 10 ve-zes em cultura de célula. Esse processo é repetido até que a virulência sejadiminuída. Em geral, a virulência é medida através de inoculação de porcoscom vírus e avaliação da presença de sintomas clínicos e/ou da LD5O (veja,por exemplo, Halbur e outros, J. Vet. Diagn. invest, 8: 11-20 (1996), Halbur eoutros, Vet. Pathol, 32: 200-204 (1995) e Park e outros, Am. J. Vet. Res., 57:320-323 (1996)). De preferência, a virulência é diminuída de modo que ovírus atenuado não causa a morte dos animais e, de preferência, não causasintomas clínicos da doença.

Tipicamente, uma cultura de célula útil para produção de um ví-rus atenuado da presente invenção inclui células de origem mamífero de-não-suíno; Exemplos-de-eulturas de células de mamífero de não-suíno inclu-em, por exemplo, a linhagem de células MA- 104 (ATCC CRL-2378), a li-nhagem de célula MARC-145 (Kim e outros, Arch. Virol, 133: 477-483(1993)) e a linhagem de célula CL-2621 (Baustita e outros, J. Vet. Diagn.Invest., 5: 163-165 (1993)). De preferência, uma cultura de célula misturadaé usada para produção de uma partícula viral atenuada da presente inven-ção. Em uma cultura de célula misturada, existem pelo menos dois tipos decélulas presentes. De preferência, uma cultura de célula misturada incluiuma linhagem de célula imortalizada ou transformada e uma cultura de célu-la primária. Uma cultura de célula misturada é particularmente útil quandoum vírus se produz lentamente ou nem isso, em uma linhagem de célula i-mortalizada ou transformada. Exemplos preferidos de uma linhagem de célu-la transformada ou imortalizada para uso em uma cultura de célula mistura-da incluem, por exemplo, a linhagem de célula MARC-145 (Kim e outros,Arch. Virol, 133: 477-483 (1993)) e a linhagem de célula MA-104 (ATCCCRL-2378). De preferência, culturas de célula primária para uso em umacultura de célula misturada são originárias de suíno. Um exemplo preferidode uma cultura de célula primária para uso em uma cultura de célula mistu-rada é macrófagos alveolares primários de suíno.

A presente invenção ainda inclui os polipeptídeos codificadospelas regiões de codificação de nsp2 presentes nos polinucleotídeos descri-tos na Tabela 2, incluindo aqueles que são viáveis. Também incluídos napresente invenção são anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e poli-clonais, que se ligam especificamente a um polipeptídeo codificado pelasregiões de codificação de nsp2 presentes nos polinucleotídeos descritos naTabela 2. O termo "anticorpo", a menos que especificado ao contrário, incluifragmentos de anticorpos inteiros os quais retêm sua atividade de ligaçãopor um antígeno alvo. Tais fragmentos incluem fragmentos Fv, F(ab') eF(ab')2, bem como anticorpos com uma única cadeia (scFv). Conforme usa-do aqui, um anticorpo que pode "se ligar especificamente" a um polipeptídeoé um anticorpo que interage apenas com o epítopo do antígeno que induziuà síntese do anticorpo ou interage com um epítopo estruturalmente relacio-nado. Urn-anticorpo que "se liga especificamente" a um epítopo interagirá,sob as condições apropriadas, com o epítopo mesmo na presença de umadiversidade de alvos de ligação potenciais. Conforme usado aqui, o termo"complexo de polipeptídeo:anticorpo" se refere ao complexo que resultaquando um anticorpo se liga especificamente a um polipeptídeo ou uma su-bunidade ou análogo do mesmo. Em alguns aspectos, um anticorpo da pre-sente invenção inclui aquele que não se liga especificamente a um polipeptí-deo de nsp2 de comprimento total codificado pelo VR-2332 (por exemplo,número de acesso ao Genbank U87392, aminoácidos 384-1363 da ORF1(veja também Allende e outros, J. Geri. Virol, 80: 307-315 (1999) ou aminoá-cidos 384-1580 da ORF1 (veja também Zebuhr e outros, J. Gen. Virol, 81:853-879 (2000)). Tais anticorpos podem ser identificados usando métodosde rotina conhecidos na técnica.

Anticorpos da presente invenção podem ser preparados usandoo polipeptídeo intacto. Opcionalmente, um polipeptídeo de nsp2 descrito aquipode ser covalentemente ligado ou conjugado a um polipeptídeo veículo pa-ra melhorar as propriedades imunológicas do polipeptídeo. Polipeptídeosveículo úteis são conhecidos na técnica.

O preparo de anticorpos policlonais é bem-conhecido. Anticor-pos policlonais podem ser obtidos através de imunização de uma variedadede animais de sangue quente, tais como cavalos, vacas, cabras, ovelha,cães, galinhas, coelhos, camundongos, hâmsters, porcos-da-índia e ratos,bem como animais transgênicos, tais como ovelha, vacas, cabras ou porcostransgênicos, com um imunogênio. Os anticorpos resultantes podem ser iso-lados de outras proteínas usando uma coluna de afinidade tendo uma por-ção de ligação a Fc, tal como proteína A ou semelhante.

Anticorpos monoclonais podem ser obtidos através de váriosmétodos familiares para aqueles versados na técnica. Resumidamente, célu-las de baço de um animal imunizado com um antígeno desejado são imorta-lizadas, comumente através de fusão com uma célula de mieloma (veja, porexemplo, Aníibodies: A Laboratory Manual, Harlow e outros, eds., Cold S-pring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Anti-corpos monoclonais podem ser isolados e purifieados de culturas de hibri-doma através de métodos bem-conhecidos na técnica.

Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser recombinante-mente produzido, por exemplo, através de phage display ou através de mé-todos combinatoriais. Métodos de phage display e combinatoriais podem serusados para isolar anticorpos recombinantes que se ligam a um polipeptídeodescrito aqui ou uma subunidade biologicamente ativa ou análogo do mes-mo (veja, por exemplo, Ladner e outros, Pat. U.S. No. 5.223.409). Tais mé-todos podem ser usados para gerar anticorpos monoclonais humanos. Apresente invenção também proporciona composições incluindo um polinu-cleotídeo infeccioso, polinucleotídeo de PRRS, partícula viral ou anticorpo dapresente invenção. Tais composições incluem, tipicamente, um veículo far-maceuticamente aceitável. Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamen-te aceitável" inclui solução salina, solventes, meios de dispersão, revesti-mentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e pararetardo de absorção e similares, compatíveis com administração farmacêuti-ca. Compostos ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições.

Uma composição pode ser preparada através de métodos bem-conhecidos na técnica de farmácia. Em geral, uma composição pode serformulada para ser compatível com sua via de administração pretendida.Exemplos de vias de administração incluem perfusão e parenteral, por e-xemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação),transdérmica (tópica) e transmucosal. Soluções ou suspensões podem inclu-ir os seguintes componentes: um diluente estéril, tal como água para admi-nistração, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como ál-cool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbicoou bissulfito de sódio; agentes de quelação, tal como ácido etileno diaminatetraacético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; eletrólitos,tais como íons de sódio, íons de cloreto, íons de potássio, íons de cálcio eíons de magnésio e agentes para o ajuste de tonicidade, tais como cloretode sódio ou dextrose. O pHpode-serajustadocomácidos-ou bases, taiscom ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Uma composição pode estar en-cerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos com doses múltiplasfeitos de vidro ou plástico.

Composições podem incluir soluções aquosas (onde solúveisem água) ou dispersões e pós estéreis para o preparo extemporâneo de so-luções ou dispersões estéreis. Para administração intravenosa, veículos a-dequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremo-phor EL® (BASF, Parsippany, NJ.) ou solução salina tamponada com fosfato(PBS). Uma composição é, tipicamente, estéril e, quando adequada parauso estéril, deverá ser fluida até o ponto em que exista facilidade de fluxo emuma seringa. Ela deverá ser estéril sob as condições de fabricação e arma-zenamento e preservada contra a ação contaminante de microorganismos,tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio dedispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol,propileno glicol e polietileno glicol líquido e similares) e misturas adequadasdos mesmos, prevenção da ação de microorganismos pode ser obtida atra-vés de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabe-nos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitoscasos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, po-lialcóois, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio, na composição. Absor-ção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida através de in-clusão, na composição, de um agente o qual retarda a absorção, por exem-plo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Soluções estéreis podem ser preparadas através de incorpora-ção do composto ativo (isto é, um polinucleotídeo infeccioso ou vírus dePRRS da presente invenção) na quantidade requerida em um solvente apro-priado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima,conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, disper-sões são preparadas através de incorporação do composto ativo em um veí-culo estéril, o qual contém um meio de dispersão dibásico e os outros ingre-dientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreispara o preparo de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos depreparo são secagem a vácuo e secagem por congelamento, o qual propor-ciona um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional deseja-do a partir de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

Composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou umveículo ingerível. Para a finalidade de administração terapêutica oral, o com-posto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de table-tes, trociscos, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. Essas composi-ções também podem ser formadas em um pó ou suspensas em uma soluçãoaquosa, de modo que esses pós e/ou soluções possam ser administrados àração para animal ou à água de beber do animal. Essas composições po-dem ser adequadamente adoçadas ou flavorizadas através de vários agen-tes conhecidos por promover a captação da vacina oralmente pelo porco.

Os compostos ativos também podem ser administrados atravésde qualqúer método adequado para administração de agentes de polinucleo-tídeo, por exemplo, usando pistolas de gene, bio injetores e emplastros paraa pele, bem com métodos sem agulha, tal como a tecnologia de vacina deDNA de micropartícula descrita por Johnston e outros (Pat. U.S. N5.6.194.389). Adicionalmente, distribuição intranasal é possível, conformedescrito, por exemplo, em , Hamajima e outros, Clin. Immunol. Immunopa-thol., 88: 205-210 (1998). Lipossomas e microencapsulação também podemser usados.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos queprotegerão o composto contra eliminação rápida do corpo, tal como umaformulação com liberação controlada, incluindo implantes. Polímeros biode-gradáveis biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de etilenovinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poli-láctico. Tais formulações podem ser preparadas usando técnicas padrão. Osmateriais também podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da AlzaCorporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossômicas tambémpodem ser usadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Essas po-dem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos por aqueles versa-dos-na técnica,

A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos ativos po-dem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrões emculturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determina-ção da LD5O (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose tera-peuticamente eficaz em 50% da população). A proporção de dose entre efei-tos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como aproporção de LD50ZED50. Compostos os quais exibem altos índices terapêuti-cos são preferidos.

Os dados obtidos de ensaios de cultura de célula e estudos comanimais podem ser usados na formulação de uma serie de dosagens parauso no campo. A dosagem de tais compostos oscila, de preferência, dentrode uma faixa de concentrações em circulação que incluem a ED50 com pou-ca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa de-pendendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada.

As composições podem ser administradas uma ou mais vezespor dia a uma ou mais vezes por semana, incluindo dia sim, dia não. Aque-les versados na técnica apreciarão que determinados fatores podem influen-ciar a dosagem e sincronização requeridos para tratar eficazmente um indi-víduo incluindo, mas não limitado a, gravidade da doença ou distúrbio, tra-tamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do indivíduo e outras doençaspresentes. Além disso, tratamento de um indivíduo com uma quantidade efi-caz de um polipeptídeo pode incluir um único tratamento ou, de preferência,pode incluir uma série de tratamentos.

A presente invenção inclui métodos para uso das composiçõesdescritas aqui. Em um aspecto, a invenção inclui métodos para tratamentode um ou mais sintomas de doença misteriosa em suínos em um animal quepode ser causada por infecção com um vírus de PRRS. O método inclui ad-ministração de uma quantidade eficaz de uma composição da presente in-venção a um animal tendo ou em risco de ter doença misteriosa em suíno ousintomas de doença misteriosa em suíno.

Tratamento de doença misteriosa em suíno ou sintomas de do-ença misteriosa em suíno pode ser profilático ou, alternativamente, pode seriniciado após o desenvolvimento da doença ou sintomas da mesma. Con-forme usado aqui, o termo "sintoma" se refere à evidência objetiva, em umindivíduo, de doença misteriosa em suíno. Sintomas associados à doençamisteriosa em suíno e as avaliações de tais sintomas são rotina e conheci-dos na técnica. Exemplos de sintomas incluem aborto, anorexia, febre, letar-gia, pneumonia, descoloração vermelha/azul das orelhas, respiração difícil(dispnéia) e taxa respiratória aumentada (taquipnéia). Tratamento que é pro-filático, por exemplo, iniciado antes que um indivíduo manifeste sintomas deuma condição causada por um vírus de PRRS, é referido aqui como trata-mento de um indivíduo que está "em risco" de desenvolver a doença ou sin-tomas da mesma. Tipicamente, um animal "em risco" é um animal presenteem uma área onde animais tendo a doença ou sintomas da mesma foramdiagnosticados e/ou é provável que sejam expostos a um vírus de PRRS.Conseqüentemente, administração de uma composição pode ser realizadaantes, durante ou após a ocorrência das condições descritas aqui. Trata-mento iniciado após o desenvolvimento de uma condição pode resultar emdiminuição da gravidade dos sintomas de uma das condições ou remoçãocompleta dos sintomas.

Em alguns aspectos, os métodos incluem, tipicamente, adminis-tração, a um animal, de uma composição incluindo uma quantidade eficaz deuma partícula viral da presente invenção, uma "quantidade eficaz" é umaquantidade eficaz para prevenir a manifestação de sintomas de doença mis-teriosa em suíno, diminuição da gravidade dos sintomas da doença e/ou re-mover completamente os sintomas. Tipicamente, a quantidade eficaz é umaquantidade que resulta em uma resposta imune humoral e/ou celular queprotege o animal durante futura exposição a um vírus de PRRS. A partículaviral usada na composição pode conter um polinucleotídeo infeccioso quetem uma deleção, conforme descrito aqui. Opcionalmente, o polinucleotídeoinfeccioso também inclui um polinucleotídeo exógeno presente em lugar dadeleção. Uma vantagem de uso de uma partícula viral tendo uma deleção-(ou um polinucleotídeo exógeno presente em lugar da deleção) pode serfacilmente distinguida de outros vírus de PRRS, incluindo vírus de PRRS dotipo silvestre presente no campo. A partícula viral pode ser identificada atra-vés de isolamento do vírus de um animal seguido, por exemplo, através dedigestão com uma enzima de restrição ou amplificação PCR-baseada denucleotídeos específicos. Tal partícula viral "marcada" é, freqüentemente,referida na técnica como uma vacina de marcador.

Em outros aspectos da presente invenção, os clones infecciosose/ou polinucleotídeos infecciosos descritos aqui podem ser usados para in-vestigar inserções genéticas viáveis, para investigar RNA alternativo expres-so ou outras proteínas que não o vírus de comprimento total, para investigarrecombinação viral e investigar propriedades imunogênicas de nsp2 decomprimento total com relação à nsp2 truncada.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Clones de cDNA de comprimento total de vírus da síndrome res-piratória e reprodutiva em suínos (PRRSV), cepa protótipo VR-2332, foramdesenvolvidos, com cada versão progressiva possuindo menos alteraçõesde nucleotídeo que as versões anteriores quando comparado com a cepa dotipo silvestre VR-2332. Vírus de prole de cada clone infeccioso foi recupera-do e analisado para verificação da seqüência de nucleotídeo, taxa de cres-cimento in vitro e tamanho de placa. Prole de um clone infeccioso confirmoureplicação robusta in vivo, observada pelo aparecimento de anticorpos a-PRRSV na mesma taxa que o vírus do tipo silvestre. Análise de Northernblot da prole in vivo também revelou que espécies de RNA sub genômicasdefectivas, denominadas heteróclitos (formas incomuns), estavam presentesjunto com genomas de comprimento total. Análise de Northern blot concor-rente de uma série de passagens de culturas de células MA-104 infectadasrevelou que vírus revestimento obteve apenas gradualmente um perfil deRNA de heteróclito e de comprimento total similar às espécies de RNA ob-servadas em infecção in vivo.Materiais e Métodos

Células e cepas-virais.-Células MA-1-04 ou-suas-células des-cendentes MARC-145 (ATCC CRL-11171), uma linhagem de célula epitelialde rim de macaco verde Africano a qual suporta replicação de PRRSV(Meng e outros, J. Vet. Diagn. Invest, 8: 374-81 (1996)), foram mantidas emmeio mínimo essencial de Eagle (EMEM) (JRH Biosciences 56416), suple-mentado com 1 mg/ml de NaHCO3 e soro bovino fetal a 10% (FBS), a 37°Ccom 5% de CO2. As células cultivadas foram transfectadas com RNA ou in-fectadas com vírus quando o crescimento da monocamada tinha atingido 70-80% de confluência. Cepas protótipos de PRRSV Norte Americano VR-2332e Ingelvac® MLV foram descritos anteriormente (Yuan e outros, Virus Res.,79:189-200 (2001)). A cepa VR-2332 cresce em titulações equivalentes so-bre ambas as linhagens de célula.

Purificação de RNA viral. RNA viral (vRNA) foi purificado con-forme descrito (Chen e outros, J. Gen. Virol., 75: 925-930 (1994); Yuan eoutros, Virus Res., 79: 189-200 (2001)). Resumidamente, sobrenadante decélulas MARC-145 infectadas com VR-2332 foi coletado no dia 4 pós-infecção (p.i.). Após remoção dos resíduos celulares através de centrifuga-ção a 12.000 rpm, os sobrenadantes foram colocados em camadas sobre 2ml de uma almofada de sacarose a 0,5 M e centrifugados a 76.000 χ g du-rante 4 horas. Os vírions peletizados foram ressuspensos em 0,5 ml de LES(LiCI a 0,1 M/EDTA a 5 mM/SDS a 1,0%) e ainda digeridos através da adi-ção de 100 μg de proteinase K a 56°C para remover toda proteína. Após 10minutos de incubação, vRNA foi extraído varias vezes com fenol ácido e fe-nol/cl e, então, precipitado em etanol a 70% v/v. vRNA peletizado foi imedia-tamente ressuspenso em 50 μΙ de H2O ou tampão TE isento de RNase (Tris-HCI a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH de 8,0) e armazenado a -80°C.

Construção de cDNA de comprimento total. Síntese de cDNAfoi realizada com o Kit de RT-PCR Enhanced Avian HS (Sigma, HSRT-100).Oito iniciadores de PCR (Tabela 3) foram usados para amplificar quatrofragmentos de cDNA de sobreposição cobrindo todo o genoma de VR-2332(figura 2). As condições de ciclização foram 94°C durante 2 minutos, então,35 ciclos de 94°C durante 15 segundos, 68°C durante 4-5 segundos, segui-do por 68-G dürante-5 minutos^ Cada-fragmento de-PGR foi-purifiçado com oKit QIAEX Il Gel Extraction (Qiagen) e clonado no vetor pCR®2.1 -TOPO®com o Kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen K450001). Plasmídeos represen-tando cada fragmento foram submetidos para análise de seqüência de nu-cleotídeo. Os fragmentos com as mutações mínimas de nucleotídeo compa-rados com a seqüência do VR-2332 precursor (número de submissão aoGenBank U87392) foram usados para montar cDNA de comprimento total,conforme mostrado na figura 2. Em cada região de sobreposição, um sítio deenzima de restrição único foi utilizado para unir fragmentos de flanqueamen-to. Quatro fragmentos digeridos, representando a seqüência genômica decomprimento total, foram precisamente montados gradualmente em um vetorde plasmídeo de baixo número de cópia modificado (pOK12HDV-Pacl). Ovetor foi modificado para incluir a ribozima HDV através de inserção de umfragmento SmaI a Sacll de 244 bp contendo a ribozima antigenoma HDV euma seqüência terminadora de RNA polimerase T7 do vetor de Transcrição2.0 (Johnson e outros, J. Virol, 71: 3323-3327 (1997); Pattnaik e outros, Cell,69: 1011-1020 (1992)) nos sítios correspondentes no pOK12 (Vieira e ou-tros, Gene, 100: 189-194 (1991)). O sítio de enzima de restrição Nco\ nessefragmento de 244 bp foi substituído por um sitio Pac\ único através de muta-ção de oligonucleotídeo com os conjuntos de iniciador 5'pOK12HDV-2157/3'pOK12HDV-257 e 5'pOK12HDV-257/poliA-modificado (Tabela 3),seguido por PCR de fusão. Em clones de cDNA de comprimento total, a se-qüência genômica viral era precedida pelo promotor de RNA polimerase 17,1 ou 2 resíduos de G e um resíduo de T e seguido por uma cauda de ácidopoliadenílico de 50 nucleotídeos. Os clones montados foram propagados nacepa DH5a de Escherichia coli e, então, submetidos à confirmação da se-qüência de nucleotídeo de comprimento total.<table>table see original document page 35</column></row><table>Modificação e análise de seqüência de clones de cDNA decomprimento total. O kit QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis (S-tratagene) foi usado para modificar todos os clones de cDNA de pVR-V4 pa-ra pVR-V6G7475A. Os insertos de plasmídeo de cDNA genômico completosforam, então, submetidos ao University of Minnesota Advanced Genetic A-nalysis Center (AGAC) para análise da seqüência de nucleotídeo com inicia-dores de seqüenciamento apropriados (Tabela 3). Diferenças na seqüênciaentre pVR-V4 a pVR-V6G7475A, bem como aquelas do VR-2332 precursor,sua cepa de vacina atenuada correspondente, Inglevac MLV, e pVR-HN, oprimeiro clone infeccioso de VR-2332, são listados na Tabela 4 (Nelsen eoutros, J. Virol., 73: 270-80 (1999); Yuan e outros, Virus Res., 79: 189-200(2001); Nielsen e outros, J. Virol., 77: 3702-3711 (2003)).<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>Transcrição in vitro. O clone de cDNA foi Iinearizado atravésde clivagem com Pac\, a qual corta a jusante da cauda de poli(A). Transcri-tos de RNA [análogo de m7G(5')ppp(5')G revestimento] revestidos foramproduzidos usando o Kit mMESSAGE MACHINE® (Ambion) e uma propor-ção otimizada de 2:1 de análogo de revestimento metilado para GTP. apro-ximadamente 50 a 60 μg de RNA foram gerados a partir de 2 μg de padrãode DNA em 20 μΙ de mistura de reação. Aumento da proporção de análogode revestimento para GTP reduziu substancialmente o rendimento de RNA.O RNA foi subseqüentemente purificado através de fenol ácido-clorofórmio,seguido por precipitação com isopropanol e ressuspenso em tampão TE i-sento de nuclease (pH de 8,0). RNA foi avaliado com relação à qualidadeatravés de comparação de tamanho com o RNA viral de VR-2332 do tiposilvestre sobre um gel de agarose de desnaturação com glioxal a 1% e quan-tificado através de espectrofotometria a OD26o-

Transfecção de células MARC-145. Um procedimento modifi-cado foi gerado baseado na abordagem descrita por Nielsen (Nielsen e ou-tros, (J. Virol, 77: 3702-3711 (2003)). Para transfecção, células MARC-145foram cultivadas sobre lâminas com seis cavidades (2-3 χ 105 células/ cavi-dade) em 3 ml de meio completo [EMEM suplementado com soro bovinofetal a 10% (FBS)] e, então, incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 20-24horas, até aproximadamente 80% confluentes (Collins e outros, J, Vet. Di-agn. Invest., 4: 117-126 (1992)). 4 μg de RNA transcrito in vitro diluído em500 μΙ de Opti-MEM® I Reduced Serum Médium (Invitrogen) e 2 μΙ de brome-to de 1,2-dimiristilóxipropil-3-dimetil-hidróxi etil amônio e colesterol (DMRIE-C; Invitrogen) diluído em 1 ml de meio Opti-MEM® foram combinados e sub-metidos a turbilhonamento rapidamente. As células MARC-145 foram lava-das uma vez com 2 ml de meio Opti-MEM® e, então, imediatamente coloca-das em sobre-camadas com a solução de complexo de lipídio:RNA. DMRIE-C sem RNA (2 μΙ) foi usado como um controle negativo e DMRIE-C com 10 -100 ng de RNA viral de cepa do ts (tipo silvestre) VR-2332 purificado foi u-sado como um controle positivo. Após 4 horas de exposição aos complexosde lipídio.RNA, as monocamadas foram lavadas e meio completo fresco (E-MEM com FBS a 10%) foi adicionado. Os sobrenadantes de células trans-fectadas foram monitorados diariamente com relação ao aparecimento deefeito citopático (CPE) e passados sobre MARC-145 fresca a 72-96 horaspós-transfecção.

Detecção de RNA viral de prole. Para detectar RNA viral deprole, sobrenadante de cultura de célula de células MARC-145 transfectadase infectadas foi coletado. RNA foi isolado com o Kit QiaAmp viral RNA (Qia-gen). RT-PCR foi realizada com pares de iniciador selecionados, específicospara os nucleotídeos da cepa VR-2332 que eram indicativos de resíduos declone infeccioso com mutação (Tabela 3). Confirmação da prole de cloneinfeccioso foi obtida através de verificação da seqüência de nucleotídeo denucleotídeos clone-específicos presentes nos produtos de RT-PCR.

Detecção de proteína de nucleocapsídeo viral de prole. En-saios de imunofluorescência indiretos (IFA) foram usados para detectar ex-pressão de proteína viral em RNA transcrito in vitro transfectado ou célulasMARC-145 virus de prole-infectadas preparadas sobre lamínulas. As célulasinfectadas foram fixadas em paraformaldeído a 3,7% com solução salinatamponada com fosfato (PBS), pH de 7,5, em temperatura ambiente durante10 minutos. As células fixadas foram lavadas com PBS, incubadas a 37°Cdurante 45 minutos em anticorpo monoclonal proteínai de nucleocapsídeo dePRRSV-específico SDOW17 (Magar e outros, Can. J. VetRes., 59: 232-234(1995)) e ainda incubadas com imunoglobulina G anti-camundongo de cabra(IgG) conjugada com isotiocianato de fluoresceína a 37°C durante mais 45minutos (diluição a 1:100) (Sigma). As lamínulas foram lavadas com PBS,montadas sobre uma lâmina usando óleo de montagem de gel e observadassob um microscópio de fluorescência.

Ensaio de placa viral. Monocamadas de células MARC-145sobre lâminas com seis cavidades foram infectadas com o sobrenadante decélula (em diluições de 10-vezes) de células MARC-145 transfectadas ouinfectadas através de incubação em temperatura ambiente durante 1 hora.Monocamadas infectadas foram subseqüentemente lavadas uma vez comEMEM fresco/FBS a 10%, colocadas imediatamente com SeaPIaque Agaro-se a 1% estéril (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, Maine) em1X MEM (Sigma M4144)/FBS a 10%/NaHC03 a 2% (peso/v)/4X glutami-na/1X aminoácidos não essenciais/HEPES a 10 mM/gentamicina a 2% (v/v)e incubadas a 37°C/5% de CO2, invertida, durante 5 dias. Após remoçãocuidadosa da agarose, as células foram coradas com violeta cristal a 5% emetanol a 20% durante 10-30 minutos para visualização de tamanho de placa.

Curva de crescimento viral. Monocamadas de MARC-145 emfrascos T-75 foram inoculadas com PRRSV precursor ou recombinante diluí-do em EMEM isento de soro em uma multiplicidade de infecção (MOI) de0,001. Após 1 hora de fixação em temperatura ambiente com ligeira mistura,os inóculos foram removidos e as monocamadas lavadas três vezes comEME isento de soro. Após lavagem, 4 ml de meio completo foram adiciona-dos e os frascos foram subseqüentemente incubados durante até 5 dias a37°C, 5% de CO2. Alíquotas (0,5 ml) foram coletadas imediatamente após aadição de meio (ponto de tempo 0 hora) e a 24, 48, 72, 96 e 120 horas earmazenadas a -80°C. Diluições seriais das amostras foram usadas parainfectar células MARC-145 frescas e as células, então, processadas confor-me descrito acima. Após remoção de agarose, as placas foram visualizadase contadas. Resultados da curva de crescimento foram expressos comoPFU/ml.

Inoculação de vírus de prole in vivo. Dez porcos de 4 sema-nas de idade de cruzamentos e sexo misturados de um rebanho PRRSV-soro-negativo foram divididos em três grupos, cada um consistindo de doisanimais. O primeiro grupo recebeu uma dose infecciosa de cultura tecidual a50% de 103,5 (TCID50) de vírus clonado (pVR-V5, terceira passagem sobrecélulas MARC-145) por ml, o segundo grupo recebeu uma TCID5O de 105,4por ml de cepa de vírus precursora VR-2332 (quarta passagem sobre célulasMARC-145) e o terceiro grupo foi inoculado simuladamente com EMEM. To-dos os animais receberam 2 ml de inóculo através de injeção intramuscular.Os animais foram mantidos em ambientes separados no decorrer do expe-rimento e observados diariamente com relação aos sinais clínicos. Todos osporcos foram sacrificados no dia 28 pós-infeccção. Para recuperar vírus,amostras de soro individuais foram diluídas 5 vezes em EMEM incompleto ecolocadas sobre monocamadas de MARC-145 fresca durante 1 a 2 horasem temperatura ambiente com ligeira agitação. Os inóculos foram, então,removidos e EMEM completo foi adicionado. Células infectadas foram incu-badas a 37°C, 5% de CO2 e observadas diariamente. Uma vez que CPE eraevidente, sobrenadantes de células infectadas foram congelados a -80°C atéoutra caracterização.

Análise de Northern Blot. Transcritos de pVR-V6G7475A foramtransfectados em células MA104 e, então, passados sobre células frescasdurante várias passagens. Para subseqüente análise de Northern blot, so-brenadantes da passagem 1 (P1), P3, P6, P8 e P10 foram diluídos a 1:50 e,então, usados para infectar células (1 ml/frasco T75) no mesmo dia. Aomesmo tempo, soro de suíno infectado foi diluído 10 vezes e, então, usado(1 ml) para infectar um frasco T75 distinto. Efeito citopático foi observado nodia 3 p.i. para todos os frascos. RNA intracelular foi extraído usando um kitRNeasy Midi (Qiagen) e submetido à eletroforese (15 μg/amostra) sobre umgel de desnaturação de glioxal conforme descrito anteriormente (Nelsen eoutros, J. Virol, 73: 270-80 (1999)). RNA de transcrito de pVR-V6G7475A(100 ng) foi passado como um controle. Após transferência de RNA parauma Membrana de Transferência de Náilon de 0,45 mícron MagnaGraph(Osmonics), a membrana foi hibridizada com oligonucleotídeo rotulado/1 a-p222, a extremidade rotulada com γ32-Ρ-ΑΤΡ (Amersham) usando quínasede polinucleotídeo (Promega) conforme descrito anteriormente (Nelsen eoutros, J. Virol, 73: 270-80 (1999)).

Análise de seqüência de ácido nucléico de vírus de prole.Amplificação rápida de 5'- e 3'- de extremidades de cDNA (RACE) foi reali-zada com o kit SMART® RACE cDNA Amplification (BD Bioscience) ou 5' ou3'-Full Race Core Set (TaKaRa Bio Inc) sobre RNA viral isolado com o kitQIAmp®Viral RNA Mini (Qiagen). A seqüência de nucleotídeo restante foideterminada a partir dos produtos de RT-PCR de pares de iniciador desen-volvidos para cobrir o genoma todo da cepa VR-2332 (Tabela 3), conformedescrito anteriormente (Yuan e outros, Virus Res., 79: 189-200 (2001)). Osprodutos foram submetidos à determinação da seqüência de ácido nucleicono Advanced Genetic Analysis Center na University of Minnesota. A seqüên-cia viral completa com uma cobertura de pelo menos três vezes foi inicial-mente montada com o pacote SeqMan do software de análise de seqüênciaLasergene® (DNASTAR, Inc.) e ainda analisada usando o software GCGWisconsin Package Versão 10.3 (Accelrys Inc.). A cepa VR-2332 (Acesso aoGenBank U87392), cepa Ingelvac® MLV (Acesso ao GenBank AF066183) eclone de cDNA pVR-HN (Acesso ao GenBank AY150564; Nielsen e outros,J. Virol., 77: 3702-3711 (2003)) foram usados em todas as comparações denucleotídeo com as cepas de vírus recombinante.

Resultados

Modificação do vetor pOK12. pOK12 (Acesso ao GenBankAF223639; Vieira e outros, Gene, 100: 189-194 (1991)), um vetor de clona-gem de baixo número de cópia, foi modificado através de digestão com Smal(sítio enzimático a 273 bp no pOK12) e Sall (sítio a 307 bp) e inserção dofragmento de Smal-Sall de 244 bp do Vetor 2.0 (7) contendo a ribozima dodelta vírus de hepatite (HDV). O vetor (pOK12HDV) foi, então, ainda modifi-cado através de mutagênese de um sítio Kpnl existente (sítio no pOK12HDVa 273 bp) para inserir um sítio de enzima de restrição Pacl através do uso dopar de iniciador 5'-pOK12HDV-257SphlPacl/3 '-pOK12HDV-257SphlPacl. Aribozima HDV foi adicionada para proporcionar clivagem eficaz precisamentena extremidade 3' do trato de poliA. Estudos revelaram que a modificaçãonão era necessária para obtenção de vírus de prole infeccioso.

Construção de clones de cDNA de comprimento total. A es-tratégia de clonagem é representada na figura 2. Quatro fragmentos de ge-noma de sobreposição foram amplificados a partir de RNA viral de VR-2332purificado através de RT-PCR usando os pares de iniciador indicados (Figu-ra 2, Tabela 3). Cada fragmento foi individualmente clonado no vetor p-CR®2.1-TOPO® para gerar o clone intermediário pCR-Sphl-Fsel (segmentoI), pCR-Fsel-AvrlI (segmento II), pCR-AvrlI-BsrGI (segmento III) e pCR-BsrGI-PacI (segmento IV). Os clones de cDNA foram, então, digeridos comduas enzimas de restrição únicas, conforme indicado pelo nome do clone.Quatro fragmentos foram purificados em gel e ligados gradualmente ao vetorpOK12HDV-Pacl para gerar um clone de cDNA de comprimento total dePRRSV (pVR-V4). No clone de cDNA de comprimento total, a seqüênciagenômica viral foi acionada através do promotor de RNA polimerase 17 eseguido por uma cauda de ácido poliadenílico de 50 nucleotídeos. Transcri-tos de RNA do clone pVR-V4 não mostram infectividade típica por PRRSVquando transfectados em células permissivas, embora RNA viral pudesseser detectado após várias passagens. Quando de comparação com a cepaVR-2332, um total de 45 mutações de nucleotídeo (Tabela 4), levando a 21alterações de aminoácido, foram detectadas (Tabela 5), embora várias fos-sem as mesmas conforme anteriormente identificado em Ingelvac® MLV(Yuan e outros, Virus Res., 61: 87-98 (1999)).

Tabela 5. Diferenças de aminoácido entre as cepas de PRRSV eclones infecciosos de VR-2332. Apenas posições onde diferenças de nucleo-tídeo não foram observadas são mostradas com a posição de aminoácidocorrespondente dentro da região genômica identificada. Aminoácidos quesão representados na cepa VR-2332 são mostrados em caixas não sombre-adas e identidades de aminoácido do clone infeccioso com VR-2332 sãorepresentadas em caixas em branco. O texto em cada caixa individual repre-senta alterações silenciosas ou de aminoácido em virtude de diferenças denucleotídeo mostradas na Tabela 2. Caixas de tonalidade clara representamdiferenças de nucleotídeo que são únicas ao clone infeccioso, caixas de to-nalidade média ressaltam aqueles nucleotídeos que são também observa-dos em Ingelvac® MLV e caixas que são de tonalidade mais escura indicamnucleotídeos únicos de suínos. Aminoácidos separados por barras inclinadasindicam números de aminoácido da ORF2a/ORF2b. Regiões que não foramseqüenciadas são indicadas por uma barra inclinada.<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table>Em virtude do fato de muitas mutações no pVR-V4 ocorrerem naregião crítica que codifica a helicase putativa, polimerase e outros motivosde Nidovírus (Figura 3, Tabela 4), clones adicionais de segmento genômicoIII (pCR-Avrll-BsrGI) foram gerados e seqüenciados em sua totalidade. Apóssubstituição do segmento Ill do pVR-V4 pelo fragmento de seqüência maispreciso obtido, nós novamente determinados a seqüência de nucleotídeo doclone de comprimento total genômico inteiro (pVR-V5). Exceto quanto à re-gião substituída e quatro mutações espontâneas (nucieotídeos 1595, 13860,14336 e 14404), esses dois clones genômicos eram idênticos (Tabela 4).Análise de seqüência de pVR-V5 mostrou que esse clone abrigava um totalde 23 mutações comparado com a cepa VR-2332. Dessas 23 alterações,apenas 8 mutações de nucleotídeo codificavam uma alteração no aminoáci-do e cinco das mutações de resíduo de aminoácidò eram idênticas ao Ingel-vac® MLV e, assim, não previstas como afetando adversamente a replicaçãoin vitro (Tabela 4).

O clone pVR-V6 foi derivado a partir de mutagênese sítio-dirigidado segmento de genoma IV para reparar os nucieotídeos 13860 e 14979usando os iniciadores 13860C2T/ e 14979A2G/, respectivamente. Mutaçãodesses dois nucieotídeos corrigiria o resíduo de aminoácido 25 de GP5(L-T) e o resíduo 31 da proteína de nucleocapsídeo (T-4A). Análise de se-qüência do clone pVR-V6 confirmou que os nucieotídeos tinham sido corrigi-dos de volta para os nucieotídeos de VR-2332 do tipo silvestre (ts) e nãotinham resultado em quaisquer outras alterações de nucleotídeo em qual-quer parte no genoma quando comparado com pVR-V5 (Tabelas 4 e 5). Fi-nalmente, mutagênese sítio-dirigida sobre o segmento de genoma Ill usandoo oligômero 7475G2A foi completada em pVR-V5 e pVR-V6 de forma a cor-rigir uma alteração de VR-2332 do tipo silvestre no nt 7475. A alteração deG~*A no nt 7475 resultou em uma glicina (G) no aminoácido 2429 da ORF1nos dois clones recombinantes ao ácido glutâmico (E) observado na cepaviral VR-2332 precursora. Os dois clones finais, pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A, foram novamente seqüenciados em sua totalidade e descobriu-se que tinham sido alterados apenas (nt 7475) com relação aos plasmídeosrecombinantes originais pVR-V5 e pVR-V6, respectivamente (Tabela 5). OpVR-V6G7475A, assim, contém 11 alterações de nucleotídeo e nenhuma deaminoácido com relação à cepa VR-2332, além daquelas também já obser-vadas em Ingelvac® MLV.

Conforme pode ser observado esquematicamente na figura 3,para a estrutura final (pVR- V6G7475A) e detalhado nas Tabelas 4 e 5, to-dos os clones de comprimento total ainda possuem alterações de nucleotí-deo dispersas através do genoma, primariamente nas regiões pobrementedefinidas da 0RF1. Contudo, o grande agrupamento de alterações de nucle-otídeo na ORFIb que presumivelmente impedia o pVR-V4 de completar areplicação viral, foi reparado em versões posteriores de clones com genomade comprimento total. Apenas uma mutação de nucleotídeo (nt 11329 quecodifica a mutação G3739A) permaneceu na ORFIb do pVR-V5 e clonesposteriores e essa mutação não impede o Ingelvac MLV de infectar e se re-plicar eficazmente em células cultivadas. As Tabelas 4 e 5 também mostrama informação sobre resíduo para o clone infeccioso anteriormente publicado,pVR-HN (Nielsen e outros, J. Virol, 77: 3702-3711 (2003)), mostrado se re-plicando em animais. Há um aumento substancial no número de resíduos nopVR-HN (15 nucleotídeos) que mostram diretamente a seqüência do Ingel-vac® MLV com relação à estrutura final, pVR-V6G7475A (7 nucleotídeos).

Caracterização de vírus recombinante. Transcritos de RNA decomprimento total de cada clone de cDNA foram produzidos. Transfecção decélulas MARC-145 com os transcritos de cDNA ou RNA viral de VR-2332 dotipo silvestre (vRNA) resultou em CPE, caracterizado pelo agrupamento decélulas após lise, a 48 a 72 horas pós-transfecção. CPE causado pelostranscritos recombinantes era retardado e um pouco distinto comparado comaquele induzido pelo vRNA de VR-2332 do tipo silvestre, no qual CPE seapresenta como uma agregação vigorosa, desprendimento e ruptura. A 96horas pós-transfecção, a maioria das células transfectadas com vRNA deVR-2332 tinham sofrido Iise e se desprendido da placa, enquanto que CPEmenos severo era evidente em células transfectadas com os transcritos deRNA derivados in vitro clonados.Vírus (PO) foi coletado das células transfectadas e uma alíquota(10 μΙ diluída para 1 ml em meio de cultura) foi usada para infectar célulasMARC-145 para amplificação de vírus de prole. Após CPE ser detectado, ovírus (P1) foi novamente coletado e uma alíquota usada para re-infecção decélulas MARC-145. Vírus recombinante no sobrenadante de célula (P2) foiutilizado para purificação de RNA viral o qual foi, então, usado para obterfragmentos de RT-PCR com os pares de iniciador 5'-6800/3'-ORF1b (nt6796-7614) e P51/05P4 (nt 13757-14341). Os fragmentos de PCR obtidosforam submetidos à analise de seqüência de nucleotídeo para confirmar se ainfectividade observada era em virtude dos transcritos de RNA de compri-mento total transfectados da estrutura infecciosa e não um resultado de con-taminação em virtude do vírus do tipo silvestre. Mutações de nucleotídeo nosresíduos 7329, 7475, 7554 e 13860 e diferenças de nucleotídeo foram ob-servadas no vírus de prole com relação ao pVR-V5 e 7329, 7554 e 13860foram detectadas no vírus com relação ao pVR-V5G7475A. Similarmente,mutações nos resíduos 7329, 7475 e 7554 foram detectadas na prole pVR-V6 e mutações em 7329 e 7554 foram detectados em vírus resultantes depVR-V6G7475A (Tabelas 4 e 5). Mutações correspondentes não foram ob-servadas em vírus P2 com relação às transfecções de vRNA do tipo silvestre.

Análise por imunofluorescência de vírus recombinantes.

Ensaios de imunofluorescência direta foram usados para detectar a expres-são de proteína de nucleocapsídeo de PRRSV em células MARC-145 infec-tadas. Todas as células infectadas pelos transcritos de vírus recombinante(P2 e em diante), bem como vRNA eram positivos através desse método.Acúmulo nucleolar massivo da proteína de nucleocapsídeo era prontamenteevidente, conforme anteriormente reportado por Rowland e outros (VirusRes., 64: 1-12 (1999)).

Infecção in vivo com vírus recombinante derivado de pVR-V5. Vírus recombinantes recuperados de P3 de células MARC-145 transfec-tadas com transcritos de RNA do clone de cDNA pVR-V5 foram inoculadasem suínos jovens em paralelo com VR-2332 do tipo silvestre, vírus de vacinaIngelvac® MLV e solução salina (controle negativo). Amostras de sangueforam coletadas nos dias 0, 3, 5, 7, 14, 21 e 28 p.i. e analisadas com relaçãoà soro-conversão através do ELISA HerdChek PRRS 2XR (IDEXX) e comrelação à recuperação de vírus. No dia 28, todos os animais infectados ti-nham sido soro-convertidos com aproximadamente a mesma cinética, reve-lando que os vírus recombinantes pVR-V5 se replicaram bem in vivo (Figura4). Sinais clínicos estavam ausentes de todos os animais durante o curso doexperimento, mas isso não era inesperado, uma vez que a cepa VR-2332 dotipo silvestre freqüentemente não produz doença visível em suínos jovens eresulta em nódulos linfáticos inchados apenas transitoriamente, tipicamenteno dia 14 p.i.

Uma amostra de soro de um animal infectado com prole de pVR-V5 (Sw612), tomada a 14 dias p.i., foi usada para infectar monocamadas deMARC-145 fresca para recuperação de vírus recombinante passado in vivo.Conforme descrito anteriormente, o vírus derivado de transfecção in vitro detranscritos de RNA de clone pVR-V5 causou apenas CPE mínimo (evidenci-ado através de agregação de células infectadas), enquanto que o vírus re-cuperado de soro a partir do dia 14 do animal de teste causou CPE típico(agregação celular, desprendimento e ruptura) a 96 horas pós-infecção. Issosugeriu que um desvio no genotipo ou fenotipo viral tinha ocorrido enquantoo pVR-V5 se replicada in vivo.

De forma a elucidar a razão para a evidente alteração no fenotipo, análise deseqüência de genoma total foi realizada sobre vírus recuperado de um porco(Sw612) e, então, passado uma vez em células MARC-145 para amplificar aprole Sw612 (Figura 3, Tabelas 4 e 5). Quando comparado ao vírus usadopara infectar suínos, pVR-V5, 17 alterações de nucleotídeo de cDNA de clo-ne infeccioso-específicas foram retidas no Sw612, algumas das quais tam-bém foram observadas em Ingelvac® MLV (7/17 nucleotídeos). Os dois resí-duos de G não virais seguido por um resíduo de T presente na extremidade5' do transcrito de clone pVR-V5 original não foram observados no vírus de-rivado de infecção in vivo. Degenerância foi observada nas posições de nu-cleotídeo 9958 (R), 14336 (Y) e 15411 (Υ). O nucleotídeo (G) semelhante aVR-2332 do tipo silvestre na posição 9958 mostrou degenerância com umnucleotídeo (A) semelhante ao Ingelvac® MLV. Essa alteração resulta emuma mutação de um resíduo de glicina para um resíduo de ácido glutâmico,respectivamente (Tabela 2). Na posição 14336, degenerância foi detectadacomo uma base clone infeccioso-específica (C) e uma base VR-2332 do tiposilvestre-específica (Τ), o que refletia uma mutação silenciosa. Outra muta-ção (nt 7475) ocorreu, na qual um resíduo de G tinha sido convertido ao re-síduo de A do tipo silvestre. Contudo, haviam mais 5 diferenças de nucleotí-deo (nt 102, 827, 1379, 14686 e 15411) não observadas em qualquer umdos outros vírus nesse estudo. O nucleotídeo 102 está localizado na se-qüência líder, embora não seja traduzido. Contudo, se a seqüência líder foitraduzida, a ORF codificada (nucleotídeos 1 -100 do VR-2332) não seria es-tendida em um resíduo de aminoácido (W). As mutações nos resíduos 827 e1379 levaram à mutações na ORF1a, em ambos os casos resultando emuma alteração de aminoácido da alanina codificada no VR-2332 do tipo sil-vestre por uma valina no Sw612. O resíduo de guanina no nt 7475 do pVR-V5 tinha sofrido mutação para adenina do tipo silvestre. Isso resultou emuma mutação de aminoácido G3294A não-conservativa, a qual está situadana ORF1 em um produto de clivagem de protease previsto NSP7 e essa re-gião genômica não tem função definida até o momento. O nucleotídeo14686, localizado na ORF6, mostrou uma alteração de uma guanina no VR-2332 do tipo silvestre para uma alanina em Sw612, a qual ainda codifica oaminoácido glicina. A outra alteração de um único nucleotídeo ocorreu muitona extremidade 3' da seqüência viral (nt 15411), antes do início da cauda depoli A. Nesse caso, um resíduo de timina anteriormente conservado reveloudegenerância com um resíduo de citosina. Essas alterações genéticas, em-bora informativas, não revelam imediatamente a(s) causa(s) da alteração nofenotipo de crescimento observado. Contudo, elas revelam a natureza erran-te da replicação de PRRSV in vivo e sugerem que uma seqüência genômicaviral moderadamente diferente do VR-2332 do tipo silvestre era capaz de sereplicar eficazmente (figura 3).

Comparação de tamanho de placa viral. Determinações detamanho de placa dos vírus recombinantes, bem como VR-2332 do tipo sil-vestre foram realizadas em paralelo sobre células MARC-145 a 120 horasp.i. (figura 5A). A cepa VR-2332 formou placas com um tamanho médio de 3mm, enquanto que a prole da passagem 3 de clone de cDNA de pVR-HNformou placas ligeiramente menores (média de 2,5 mm). Em contraste, ape-nas placas minúsculas foram obtidas com vírus recombinantes derivados depVR-V5 e pVR-V6 e essas eram apenas prontamente evidentes através deexame com microscópio (figura 5A). Vírus recombinante recuperado dos clo-nes pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A formou, em média, placas de 1,5 mme 2 mm, respectivamente. Contudo, em outro ensaio, as placas produzidaspela prole viral (Sw612) recuperada de infecção in vivo de virus recombinan-te derivado de VR-FLV5 eram muito maiores, de tamanho e número aproxi-madamente iguais àquelas derivadas de VR-2332 do tipo silvestre (figu-ra5B).

Apenas volumes mínimos dos sobrenadantes de célula contendocada vírus recombinante restaram. Portanto, de forma a examinar totalmenteo papel da alteração de nucleotídeo na determinação do tamanho de placa,nós transfectamos transcritos de RNA frescos produzidos a partir de pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A em células MARC-145 (de-nominadas segunda linhagem). Vírus de prole da passagem 3 de cada cloneinfeccioso em 5 dias pós-infecção foram novamente analisados com relaçãoao tamanho de placa em comparação com VR-2332 do tipo silvestre, VR-HNe vírus Sw612. Em contraste ao ensaio de placa anterior, todos os tamanhosde placa pareciam similares, com os vírus recombinantes obtidos a partir depVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A apenas ligeiramente menores do que osvírus VR-2332 do tipo silvestre, Sw612 e pVR-V6G7475A derivados in vivo(figura 6A). Os vírus recombinantes, contudo, ainda não imitavam diretamen-te a infecção viral autêntica, conforme mostrado pelas titulações aproxima-damente 10 vezes menores quando comparado com o VR-2332 do tipo sil-vestre ou ao vírus recombinante pVR-V5 que tinha sido passado através desuíno (Sw612) (figura 6B).

Análise de seqüência de nucleotídeo das primeira e segun-da linhagens de preparados virais. Análise de seqüência de nucleotídeolimitada (em virtude de limitação quanto ao estoque de vírus) de vírus deri-vado de pVR-V5 da 3 passagem inoculado em suíno (V5-1-P3) e análisecompleta da seqüência de nucleotídeo de vírus derivado de pVR-V5 da 3passagem obtido acima (V5-2-P3) foram realizadas de forma a revelar a ra-zão genética para as discrepâncias no tamanho de placa. Tais análises reve-laram que os dois vírus V5 independentemente preparados diferiam quantoà seqüência na extremidade 5' (Tabela 4). O vírus que tinha produzido pla-cas minúsculas (V5-1-P3) não tinha nucleotídeos estranhos na extremidade5', conforme mostrado na seqüência de nucleotídeo da cepa VR-2332 do eoutros, enquanto que aquele que produziu placas maiores (V5-2-P3) possuía4 resíduos de timidina sem padrão no 5' término (Tabela 4). A seqüência denucleotídeo viral V5-1-P3 restante nós pudemos obter exatamente igual à-quela do vírus V5-2-P3, bem como aquela do clone precursor. Contudo, aná-lise completa de seqüência do vírus V5-2-P3 revelou que o vírus mostravadegenerância de nucleotídeo em vários sítios genômicos. Descobertas simi-lares foram obtidas quando de análise de regiões limitadas de vírus de se-gunda linhagem VR-FLV5G7475A-P3 e VR-FLV6G7475A-P3. Essas últimasduas proles de clone infeccioso mostravam diferentes 5 '-términos, bem co-mo exibiam degenerância na seqüência.

Curvas de crescimento viral. Determinações de curva de cres-cimento viral em uma etapa simultânea foram realizadas usando célulasMARC-145 e vírus da 3 passagem (segunda linhagem) (figura 7). Os vírusrecombinantes recuperados de pVR-V5, pVR-V5G7475A, pVR-V6 e pVR-V6G7475A e pVR-HN mostraram taxas de crescimento viral em uma etapasimilares, mas seus picos de replicaçao eram todos significativamente meno-res do que a cepa VR-2332 do tipo silvestre e Sw612, a prole in vivo depVR-V5. Também, as taxas de replicação dos preparados de vírus recombi-nante derivados de pVR-V5, pVR-V6 e pVR-HN eram um pouco diminuídasquando comparado com o vírus derivado de pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A. Os dois últimos clones infecciosos codificam tão pouco quanto13 e 11 diferenças de nucleotídeo, respectivamente, resultando em 2 e zeroalterações de aminoácido, a partir da seqüência do VR-2332 do tipo silves-tre, além das alterações observadas no Ingelvac MLV. Esses dados, então,revelaram que vírus com tão pouco quanto 11 alterações de nucleotídeocom relação ao VR-2332 do tipo silvestre e sua prole atenuada IngelvacMLV têm a replicação um pouco deficiente. Correspondentemente, as titula-ções resultantes de VR-2332 do tipo silvestre e vírus Sw612 eram aproxima-damente 6-15 vezes maiores do que aquelas dos vírus recombinantes quenão tinham sido passados em suínos (figura 7).

Análise de Northern de vRNA. Foi mostrado que espécies desgRNA de PRRSV defectivas, identificadas anteriormente como RNAs sub-genômicos de heteróclito (latim: formas íncomuns), são um constituinte deinfecção por PRRSV e não podem ser separadas de genomas virais decomprimento total através de métodos padrão, tal como passagem em célulacultivada em baixas multiplicidades de infecção ou centrifugação em gradi-ente de sacarose (Yuan e outros, Virology, 275: 158-169; 30 (2000); Yuan eoutros, Virus Res., 105: 75-87 (2004)). Para explorar se heteróclitos de PR-RSV são ou não produzidos durante transcrição in vitro de clones de geno-ma de cDNA de comprimento total ou aparecem após subseqüente transfec-ção/infecção, análise de Northern blot foi realizada. O transcrito de RNA decomprimento total e as passagens 1, 3, 6, 8 e 10 do vírus produzido a partirde células MA- 104 transfectadas foram usados para inocular frascos T-75frescos de células MA-104 com 10 μΙ de sobrenadante diluído a 1:100, bemcomo soro de Sw612 diluído a 1:10 (2 ml no total/frasco). Após 4 dias, RNAde PRRSV intracelular foi coletado e 15 μg de cada preparado foram sepa-rados por meio de eletroforese através de um gel de agarose de desnatura-ção e transfectados a uma membrana de náilon. Após ligação cruzada deRNA, a membrana foi hibridizada com uma sonda 32P -radiorrotulada com-plementar à extremidade 5 'da ORFIa que seleciona genomas de VR-2332de comprimento total, bem como heteróclitos (1a-222; 29). Conforme mos-trado na figura 8, o transcrito de RNA é principalmente uma única banda,migrando como vRNA de comprimento total, enquanto que espécies de RNAde PRRSV da passagem 1 e posterior migram como espécies de compri-mento total e tamanho subgenômico previamente identificadas como heteró-clitos. Além disso, a resistência de hibridização aumenta com a passagem.Uma vez que o vírus foi coletado de um volume igual de sobrenadante decélula no mesmo ponto de tempo, essa observação sugere que o vRNA setorna mais eficaz na replicação com o tempo. Por fim, quando de compara-ção do vírus gerado a partir de Sw612 com o vírus gerado em cultura de cé-lula, o padrão de formação de banda de RNA é indistinguível, sugerindo for-temente que as espécies de RNA defectivas são prontamente formadas ereplicadas in vitro, bem como in vivo e, assim, são uma parte natural de in-fecção por PRRSV.

Discussão

Em teoria, um clone de cDNA de um vírus seria idêntico à se-qüência precursora de forma a gerar um sistema genético reverso que imitaa infecção do tipo silvestre. Esforço considerável foi exercido para reproduziro genoma da cepa VR-2332 de PRRSV totalmente exata, ainda em virtudede mutações espontâneas imprevistas em vários sítios, nós não pudemosobter sucesso na derivação de um clone infeccioso que não tivesse diferen-ças com relação à cepa VR-2332 do tipo silvestre seqüenciada em nossolaboratório. DNA polimerases de alta fidelidade, usadas nesse estudo, estãodisponíveis para diminuir mutações artificiais, mas tal mutação não pode serevitada durante transcrição reversa (Malet e outros, J. Viroi Methods, 109:161-70 (2003)). Além disso, o fato de que o PRRSV exibe evolução viralsurpreendente e variação nas cepas (Chang e outros, J. Virol, 76: 4750-6(2002); Murtaugh e outros, Adv. Exp. Med. Biol, 440: 787-94 (1998); Yoon eoutros, Adv. Exp. Med. Biol, 494: 25-30 (2001)), ele se recombina pronta-mente em alta freqüência, para resultar em recombinantes intergênicos entreas cepas (Yuan e outros, Virus Res., 61: 87-98 (1999)), sofre recombinaçãointragênica para formar RNAs subgenômicos de PRRSV e heteróclitos (Nel-sen e outros, J. Virol, 73: 270-80 (1999); Yuan e outros, Virology, 275: 158-169 (2000); Yuan e outros, Virus Research, 105: 75- 87 (2004)) e freqüen-temente mostra degenerância de nucleotídeo em sítios de nucleotídeo im-previstos em isolados de campo serve para tornar esse objetivo inicial emalgo que consome tempo e de ganho negligenciável. Acredita-se que umaestrutura de DNA infecciosa possuindo tão pouco quanto 11 mutações denucleotídeo, quando comparado com a cepa VR-2332, fora dos domíniosconhecidos por estarem envolvidos em replicação viral (extremidades 5' e 3',ORF1b) era suficiente para produção de vírus do tipo silvestre e os objetivosa jusante do clone infeccioso usado para estudos de estrutura:função e dú-vidas sobre patogênese. O pVR-HN é mais similar ao Ingelvac® MLV na re-gião do vírus que codifica o motivo de helicase (NSP 10). Comparação pato-gênica adicional desses dois clones infecciosos poderia fornecer uma luzsobre as diferenças entre a cepa precursora, VR-2332, e sua prole de cepade vacina, lngelvac®MLV.

Informação valiosa pode ser derivada da construção e avaliaçãodos clones infecciosos para a cepa VR-2332 de PRRSV. Primeiro de tudo, acepa VR-2332 de PRRSV não pode tolerar todas as mutações para sobrevi-vência. Mutações de nucleotídeo ou aminoácido particulares podem ajudarou impedir a replicação viral e o desafio é determinar quais são letais para asobrevivência. No clone pVR-V4, o qual não produz vírionsinfecciosos, ha-via um total de quarenta e duas diferenças de nucleotídeo com relação àcepa precursora VR-2332 do tipo silvestre. Nessas quarenta e duas altera-ções de nucleotídeo, vários nucleotídeos resultam em mutações silenciosas(20 resíduos) ou existem em outras cepas de PRRSV conhecidas (9 muta-ções de resíduo de aminoácido imitam diretamente o Ingelvac® MLV), permi-tindo prever que essas alterações podem ser não-letais para a replicação dovírus. Onze alterações de nucleotídeo que levam a 12 alterações de amino-ácido e duas mutações em nucleotídeo 3' UTR, cada uma não observada noIngelvac® MLV, foram, assim, previstas como sendo letais para a cepa VR-2332 de PRRSV. Em pVR-V5 e estruturas posteriores, 19 alterações foramcorrigidas, incluindo diversas mutações silenciosas e 9 alterações de amino-ácido anormais não observadas no genoma do Ingelvac® MLV e 8 outrasalterações observadas na cepa de vacina. Isso levou à primeira evidência déque as estruturas são infecciosas, embora em pVR-V5 duas mutações deaminoácido ainda estivessem presentes, uma das quais foi alterada atravésde mutagênese sítio-dirigida para produzir o pVR-V6. A alteração de amino-ácido restante foi reparada no pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A, emboraesses clones ainda abrigassem mutações silenciosas que não eram encon-tradas na cepa VR-2332 e na cepa de vacina derivada.

Várias observações únicas foram obtidas a partir desse estudo.Primeiro de tudo, cada linhagem de vírus produzido pode resultar em umaseqüência 5' terminal única que não foi detectada na cepa VR-2332 do tiposilvestre. Não pode-se correlacionar ainda o tamanho de placa com a se-qüência de nucleotídeo. Em segundo, observou-se alterações únicas de nu-cleotídeo após replicação em suínos, o que pode refletir a natureza inerenteda polimerase de PRRSV. Todas as alterações de nucleotídeo eram de na-tureza transitória e não exibiam uma tendência (5 A/G e 4 C/T). Embora areversão G A no nucleotídeo 7475 fosse observada após passagem in vivo,não pode-se correlacionar esse sítio com o subseqüente tamanho de placaaumentado porque outras alterações sem padrão tinham ocorrido. Além dis-so, análise de seqüência de genoma completo da passagem 3 de um vírusV5-derivado que produziu placas maiores (V5-2-P3) revelou uma seqüência5' terminal diferentes do vírus V5 que produz placas minúsculas usado parainfectar suínos (V5-1-P3). Contudo, nós pudemos concluir que as mutaçõesnão eram letais para replicação do vírus porque esse vírus, após passagemem suínos, que produziu placas com tamanho do tipo silvestre sobre célulasMARC-145, cresceram quase que na mesma taxa que o vírus precursor(Figs. 5A, 6 e 7).

De interesse considerável é o fato de que análise de seqüênciada terceira passagem in vitro de V5, V5G7475A e V6G7475A parece sugerirque o complexo de replicase de PRRSV permite que transições freqüentes etransversão não freqüentes ocorram enquanto sofre replicação viral. Issopode refletir uma replicase viral que evoluiu de modo a gerar novas formasgenéticas de PRRSV e, então, avaliar sua competência com relação à outrasvariantes, resultando em um vírus otimamente "adaptado". Essas observa-ções também foram notadas durante passagem seqüencial de PRRSV invivo (Chang e outros, J. Virol., 76: 4750-63 (2002)). Os esforços atuais deseqüenciamento são para examinar os genomas de comprimento total dasúltimas passagens, quando uma replicação mais robusta é detectada. Fi-nalmente, está claro agora que a replicase da cepa VR-2332 de PRRSV sin-tetiza prontamente heteróclitos ao mesmo tempo em que está produzindovRNA de comprimento total. Essa cepa protótipo, isolada e caracterizada em1992, pode ser única na aquisição gradual de adaptação de replicação, umavez que outros investigadores que produziram clones infecciosos de cepasmais recentes não observaram o mesmo efeito (Truong e outros, Virology,325: 308-319 (2004)). O papel da formação de heteróclito e o concomitanteaparecimento de replicação viral vigorosa sugerem que há um papel vanta-joso para heteróclitos na evolução do PRRSV.

Exemplo 2

Muitos isolados virulentos de PRRSV aparentemente novo foramrecentemente identificados no Estado de Minnesota, EUA. Análise da se-qüência de nucleotídeo da ORF5 e comparação com o banco de dados dePRRSV do University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory (>5000isolados) revelou que os isolados eram de linhagem do Tipo 2, mas eramsignificativamente diferentes dos isolados anteriores. Além disso, eles erammais intimamente relacionados àqueles isolados previamente observados noCanadá no início da década de 1990 (Mardassi e outros, J. Gen. Virol, 75:681-685 (1994)) e no Estado de Minnesota em 1998. Análise de Polimorfis-mo de comprimento do fragmento de restrição (RFLP) da 0RF5 tambémdemonstrou que eles pertenciam ao mesmo grupo de vírus que aqueles doscasos anteriores, conhecidos como isolados 1-8-4 (Wesley e outros, J Vet.Diagn. Invest, 10: 140-144 (1998)) e, assim, foram denominados isoladosMN184. Em virtude da dissimilaridade evidente com todos, menos um isola-do de PRRSV MN anteriormente isolado, dois desses novos isolados foramamplificados apenas uma vez sobre macrófagos alveolares de suíno (PAM),a célula hospedeira, e análise de genoma de comprimento total foi realizadasobre os vírus, designados como MN184A e MN184B. Esses dois isoladosforam coletados em diferentes momentos em duas fazendas distintas.

Materiais e MétodosPara seqüenciar os isolados MN184, RNA viral (vRNA) foi extra-ído de sobrenadante de células infectadas com PRRSV com o kit QIAmp®Viral RNA Mini (Qiagen1 Valencia, CA)) e RT-PCR foi realizada (kit de RT-PCR Qiagen® OneStep). Iniciadores (disponíveis sob encomenda) foramprojetados baseado nas seqüências publicadas de diferentes cepas de PR-RSV depositadas no GenBank, bem como a seqüência de MN184 recente-mente gerada. A seqüência de nucleotídeo 5' dos dois isolados de PRRSVfoi derivada usando o kit 5'-Full RACE Core (TaKaRa Bio1 Madison1 Wl). 3'-RACE foi realizada com o kit de Amplificação de cDNA SMART^ RACE(Clontech1 Mountain View, CA). Os produtos de RT-PCR foram purificadosem gel (QIAquick®, Qiagen), clonados no vetor pGEM-T (Promega1 Madison,Wl) e 3 a 5 clones para cada produto de RT-PCR foram escolhidos para se-qüenciamento. A determinação de seqüência de nucleotídeo foi realizada emambas as direções com os iniciadores PCR-específicos ou o vetor codificadoSP6 e iniciador de promotor T7. Os produtos foram enviados ao AdvancedGenetic Analysis Center na University of Minnesota para determinação deseqüência com um analisador de fragmento de DNA automático ABI 377.Uma seqüência de qualidade representando uma cobertura de genoma depelo menos três vezes foi obtida. Dados de seqüência foram montados eanalisados usando os programas de análise de seqüência GeneTooI (BioTo-ols Inc., Edmonton1 Alberta CA) e Lasergene (DNASTAR, Madison, Wis.).

Múltiplos alinhamentos de seqüência foram gerados com CLUS-TALX (Thompson e outros, Nucleic Acids Res., 24: 4876-4882 (1997)) ouWisconsin Package Versão 10.3 (Accelrys Inc., San Diego1 CA). Seqüênciasde PRRSV de comprimento total foram alinhadas usando o CIustaIX (versão1.83.1; matriz de peso de DNA IUB, penalidade por gap de 15,00, penalida-de por extensão de gap de 6,66). O alinhamento resultante foi ainda analisa-do usando o Wisconsin Package Versão 10.3 Distances Program (métodode distância de Jukes-Cantor1 equivalências parciais em virtude de símbolosdegenerados consideradas). Para a figura 10, as seqüências foram alinha-das com o programa Pileup do Wisconsin Paekage (Matriz de Escore Blo-sum62, Peso por Gap = 8, Peso por Extensão = 2, Extremidades Sobrecar-regadas). O alinhamento foi classificado com relação à redundância e colori-do para identidade percentual usando Jalview (Clamp e outros, Bioinforma-tics, 12: 426-427 (2004)) e, então, transferido para o Adobe® Photoshop®CS, versão 8.0, para transformação em escala de cinza. Para a figura 11, asseqüências foram alinhadas com o programa Pileup do Wisconsin Package(Matriz de Escore Blosum62, Peso por Gap = 8, Peso por Extensão = 2, Ex-tremidades Sobrecarregadas). Para a figura 12, um peptídeo sinalizador foiprevisto usando o servidor SignaIP (Bendtsen e outros, J. Mol Biol., 340:783-795 (2004)). As regiões transmembrana foram derivadas através doPHDhtm (Rost e outros, Protein Sci., 5: 1704- 1718 (1996)) e sítios de N-glicosilação potenciais foram identificados através do PROSITE (Bairoch eoutros, Nucleic Acids Res., 25: 217-221 (1997)) usando o servidor Predict-Protein (Rost e outros, Nucleie Aeids Res., 32: W321-W326 (2003)). As se-qüências foram alinhadas com o programa Pileup do Wisconsin Package(Matriz de Escore Blosum62, Peso por Gap = 8, Peso por Extensão = 2, Ex-tremidades Sobrecarregadas).

Resultados

Alinhamento genômico demonstrou que esses dois PRRSV e-ram muito distintos (dissimilaridade de nucleotídeo >14,5%) com relação àoutros genomas seqüenciados de comprimento total do Tipo 2 Norte Ameri-cano, comparação adicional com seqüências de comprimento total do Tipo 1(Europeu) confirmaram que os isolados eram unicamente originários de ge-notipo do Tipo 2, uma vez que eles eram apenas aproximadamente 59%similares a nível de nucleotídeo às cepas de PRRSV Euro e Lelystad. Visi-velmente, esses isolados MN184 do Tipo 2 representavam os genomas dePRRSV mais curtos detectados até o momento (15019 nucleotídeos, nãoincluindo a cauda de poli A). Além disso, nenhuma área específica foi dis-cernida que sugeria que esses isolados eram derivados de recombinaçãoviral entre as cepas do Tipo 1 e do Tipo 2.

Análise de seqüência de comprimento total revelou que os doisisolados MN184 eram realmente distintos geneticamente. Eles compartilha-vam 98,0% de similaridade de nucleotídeo ou uma diferença de 2%. Essepercentual de dissimilaridade era inesperado em virtude de seu súbito apa-recimento simultâneo em Minnesota, sem nenhum isolado recente relacio-nado observado em nosso banco de dados de PRRSV nesse momento. ATabela 6 apresenta a comparação de nucleotídeo e aminoácido detalhadaentre os dois isolados e a figura 9 representa as diferenças de aminoácidoobservadas entre essas duas cepas. Ambos esses isolados possuíam dege-nerância de nucleotídeo em várias regiões do genoma, predominantementena região de nsp2 prevista da ORF1 (Tabela 6). O fato de que a degenerân-cia de nucleotídeo foi observada nesses isolados sugere que o PRRSV podeser composto de até várias espécies individuais, freqüentemente referidascomo um rebanho de seqüências virais relacionadas, mas distintas, dentrode animais infectados.<table>table see original document page 63</column></row><table>De forma a destacar mais precisamente as regiões individuaisdesses isolados MN184 que mostraram a maior dissimilaridade com relaçãoà outras cepas de PRRSV e atribuir a(s) região(ões) que contava(m) para adiferença no comprimento do genoma viral do Tipo 2, esses dois isoladosforam comparados com a seqüência da cepa VR-2332 do Tipo 2 protótipo.As diferenças entre os dois isolados puderam novamente ser discernidas,com o isolado MN184B possuindo similaridade ligeiramente aumentada àcepa VR-2332 do que o isolado MNI84A. As comparações de nucleotídeo eaminoácido com a VR-2332 mostraram que regiões individuais do isoladoMN184 variavam de 81,5-94,7% e 78,4-100%, respectivamente, mas as re-giões correspondendo à ORF5 (86,4-86,7% e 87,0-87,5%, respectivamente),ηερίβ prevista (83,8-84,0% e 84,8-85,4%, respectivamente) e nsp2 (81,5-85,5% e 78,4-79,5%, respectivamente) eram as mais variáveis. Mais interes-sante era que apenas a região genômica de nsp2 prevista mostrou uma dife-rença no comprimento de nucleotídeo e que ambos os isolados MN184 pos-suíam a mesma deleção na nsp2, detalhada abaixo. A comparação tambémrevelou que as 5' e 3' UTR1S eram as regiões mais conservadas do genoma(94,7% e 94,0%, respectivamente), indicando conservação de seqüência emregiões importantes para replicação e transcrição viral.

ORF5 codifica uma proteína estrutural de PRRSV heterogênea(GP5) e é usada para identificação diagnostica de PRRSV (Kapur e outros,J. Geri. Virol, 77: 1271-1276 (1996)). A GP5 é uma proteína transmembranaprevista com um endodomínio e um ectodomínio. O ectodomínio de 30 ami-noácidos é composto de um domínio altamente conservado curto usualmen-te contendo pelo menos dois sítios de N-glicosílação ligados por duas regi-ões hipervariáveis. Foi mostrado que o domínio altamente conservado dessaregião de 30 aminoácidos codifica o epítopo de fixação viral em cepas doTipo 2 (Plagemann, Virology, 290: 11-20 (2001); Ostrowski e outros, J. Virol,76: 4241-4250 (2002); Plagemann e outros, Arch. Virol, 147: 2327-2347(2002)). GP5 do mesmo conjunto de genomas de comprimento total, bemcomo dos isolados RFLP 184 originais identificados no Canadá (IAF-93- 653,IAF-ΚΙορ) e em 1998-1999 em Minnesota (98-3298, 98-3403, 99-3584) foramalinhadas (figura 10). O alinhamento de GP5 de PRRSV revelou identidadesde aminoácido oscilando de 82,5% a 87,7% entre os novos isolados MN184e outras cepas do Tipo 2 de não-RFLP184. De modo interessante, as dife-renças de aminoácido entre os novos isolados MN184 e os isolados R-FLP184 mais antigos eram muito grandes (5,7% -12,2%) e, assim, nós nãodetectamos a origem clara do novo vírus RFLP184. O alinhamento limitadomostra que a maioria das diferenças de aminoácido observadas eram en-contradas nas regiões hipervariáveis (figura 10). Os dois sítios de N-glicosilação conservados foram mantidos nos isolados MN184, exceto quan-to à degenerância de nucleotídeo detectada que codifica o aminoácido 44 noisolado MN184B.

Nspip codifica uma protease de cisteína semelhante à papaína(den Boon e outros, J. Virol, 69: 4500-4505 (1995)). Um alinhamento de a-minoácido dos isolados MN184 com um conjunto não redundante de se-qüências de ηερίβ do Tipo 2 disponíveis, bem como cepas de PRRSV Euroe Lelystad do Tipo 1 foi realizado (figura 11). A proteína nspip possui umasérie de aminoácidos completamente conservados e os resíduos catalíticospropostos foram mantidos em todos os genomas seqüenciados (den Boon eoutros, J. Virol, 69: 4500-4505 (1995)). O alinhamento, ordenado através dasimilaridade de aminoácido, indica que os isolados MN184 são mais simila-res às cepas do Tipo 1 do que às outras seqüências do Tipo 2 de compri-mento total seqüenciadas. Contudo, os aminoácidos que eram conservadosnas outras seqüências do Tipo 2 não redundantes também eram principal-mente conservados nos isolados MN184, mas aminoácidos dispersos e asimilaridade de aminoácido (84,8-85,4%) revelaram uma proteína do Tipo 2divergente que tinha sido evidenciada até hoje. Assim, o alinhamento aindadefine resíduos mantidos da nspip que podem ser críticos para o ciclo dereplicação do PRRSV.

Um alinhamento de aminoácido de seqüências não redundantesde nsp2, ordenadas através da identidade de pares, é mostrado na figura 12.Um domínio de protease de cisteína (PL2) semelhante à quimotripsina estápresente no N-término, anteriormente previsto através de alinhamento com ansp2 do vírus da arterite de eqüino (EAV) (Snijder e outros, J. Geri. Virol, 79:961-979 (1998); Ziebuhr e outros, J Gen. Virol, 81: 853-879 (2000)). Existem3-4 domínios transmembrana previstos próximo do C término dessa proteína(McGuffin e outros, Bioiriformatics, 16: 404-405 (2000)), mas o sítio de cliva-gem C terminal exato não foi empiricamente determinado. Duas previsõesdo sítio de clivagem C terminal foram propostas, um G|G no aminoácido 980da nsp2 de VR-2332 (Allende e outros, J Gen. Virol, 80: 307-315 (1999)) e ooutro no aminoácido 1197 (Ziebuhr e outros, J. Gen. Virol, 81: 853-879(2000)), mas existem várias duplas G|G completamente conservadas dentrodessa proteína (aminoácidos 646, 980, 1116, 1196, 1197 da nsp2 de VR-2332; setas descendentes na figura 12). Trabalho anterior também tinhamostrado que a proteína nsp2 prevista é rica em prolina e contém múltiplosepítopos potenciais de células B (Oleksiewicz e outros, J. Virol, 75: 3277-3290 (2001); Fang e outros, Virus Res., 100: 229-235 (2004); Ropp e outros,J. Virol, 78: 3684-3703 (2004)). A grande região mediana da nsp2 de PR-RSV (aminoácidos 148-880 de nsp2 de VR-2332) não tem função atribuída,mas é altamente variável quanto ao comprimento. Além disso, a diferença nocomprimento entre as cepas de PRRSV do Tipo 1 e Tipo 2 foram mapeadasnessa região mediana variável da nsp2 (figura 12). Até agora, foi mostradoque genomas do Tipo 1 seqüenciados são 313-364 bases mais curtos doque o PRRSV do Tipo 2 (Meulenberg e outros, Virology, 192: 62-72 (1993);Fang e outros, Virus Res. ,100: 229-235 (2004), Ropp e outros, J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Contudo, o múltiplo alinhamento de seqüência estabele-ceu que o genoma do MN184 contém a nsp2 mais curta prevista até o mo-mento (2547 bp), 393 bp mais curta do que a cepa VR-2332 do Tipo 2 protó-tipo. Além disso, ele continha três deleções descontínuas na proteína tradu-zida com tamanhos de deleção consistindo de 111, 1 e 19 aminoácidos, res-pectivamente, correspondendo às posições de aminoácido na nsp2 da cepaVR-2332 de PRRSV de 324-434, 486 e 505-523, respectivamente (figura12). As três deleções resultaram na perda de vários resíduos de prolina eepítopos de células B previstos. Além dessas deleções, alterações significa-tivas na seqüência de aminoácido da nsp2 com relação à outras cepas doTipo 2 também foram observadas, algumas vezes correspondendo ao ami-noácido do Tipo 1 observado na mesma posição relativa (figura 12).Comparação da proteína prevista nsp2 dos dois genotipos de PRRSV de-monstrou que a identidade de aminoácido dentro de vírus do Tipo 2 oscilavade 66% a 99% e de 88-90% dentro de vírus do Tipo 1, mas diferiam gran-demente entre os genotipos (similaridade <45%). Em particular, os isoladosMN184 mostraram 66-80% de identidade de aminoácido a todas as proteí-nas previstas nsp2 do Tipo 2 e apenas 43-45% de identidade às cepas doTipo 1. Quando de inspeção do múltiplo alinhamento de seqüência na figura12, também notou-se que todos os casos de inserção ou deleção em ambosos genotipos ocorreram nessa região mediana hipervariável. Até esse ponto,Shen e outros (Arch. Virol., 145: 871-883 (2000)) primeiro reportaram que acepa SP do Tipo 2 Norte Americana de PRRSV tinha uma inserção única de36 aa com relação à posição entre o aa 813 e 814 da nsp2 de VR-2332 dePRRSV. Outro investigador descobriu uma deleção única de 12 aa na posi-ção 466-477 na nsp2 do isolado HB-2(sh)/2002 de PRRSV (Gao e outros,Arch. Virol., 149: 1341-1351 (2004)). Uma deleção de 17 aa ocorreu em iso-lados de PRRSV semelhantes ao Europeu recentemente identificados quan-do comparado com a cepa LV (Fang e outros, Virus Res., 100: 229-235(2004); Ropp e outros, J. Virol, 78: 3684-3703 (2004)). Os casos de mutaçãonão ocorriam consistentemente ao longo do mesmo trecho de aminoácidos,embora as deleções fossem observadas entre os isolados MN184 e outrosvírus do Tipo 2 abrangessem a maioria das maiores deleções detectadasentre PRRSV do Tipo 1 e outros do Tipo 2. Todos esses dados sugerem quea ORF de nsp2 contém um motivo de protease conservado e regiões abran-gendo a transmembrana previstas que podem ser necessárias para replica-ção de PRRSV, mas é altamente suscetível à mutação na grande seçãomediana.

O súbito aparecimento de isolados no campo de PRRSV emMinnesota refletindo o padrão 184 RFLP ainda é um mistério, mas as con-seqüências desse evento estão sendo agora obtidas. O Minnesota Veteri-nary Diagnostic Laboratory agora realiza seqüenciamento de rotina sobreisolados de 184 RFLP similares de aproximadamente um quarto do númerototal de requisitos de seqüência de ORF5. Além disso, o padrão 184 RFLPfoi agora detectado não apenas em Minnesota, mas em lowa, Wisconsin,Dakota do Sul, Kansas, Missouri, Illinois, Nebraska, Kentucky, Oklahoma eWyoming também. Escolheu-se derivar as seqüências de comprimento totalde dois isolados em virtude da necessidade de compreender se esses pode-riam ser mais do que um simples tipo de vírus e o fato de que o rebanho desuínos diagnosticado com o isolado MN184A apresentada um caso maisbrando de PRRS do que o rebanho infectado com isolado MN184B, confor-me reportado pelo patologista que fez o atendimento. As cepas não foraminoculadas em animais naive para verificar as apresentações do caso, mas éinteressante notar que o isolado MN184B tinha muito mais degenerância denucleotídeo detectada quando de análise do genoma e isso poderia refletir agravidade da doença reportada.

Essa análise de genoma aumentou a compreensão da imensavariação de seqüência de nucleotídeo e aminoácido que existe no campo.Fatores que acionam essa variação podem estar relacionados à forma pelaqual os suínos são criados, ao transporte interestadual e internacional desuínos e sêmen do varão, à intermistura de diferentes isolados de PRRSVdentro dos rebanhos e à natureza do vírus em si. Geração de seqüência degenoma completo também nos permite monitorar onde a variação de geno-ma é tolerada e quais regiões são mais conservadas. Como um resultadodesse estudo, bem como uma publicação anterior (Ropp e outros, J. Virol,78: 3684-3703 (2004)), um quadro está emergindo que indica que a nsp2,nsp1 β e 0RF5 são proteínas extraordinariamente versáteis.

Esse estudo também proporcionou evidência clara de que o ta-manho da nsp2 não pode mais ser usado para diferenciar entre os dois ge-notipos de PRRSV. A nova descoberta de que a nsp2 evoluiu para mostrarum genoma do Tipo 2 com três deleções descontínuas, levando ao genomamais curto até hoje (15.019 kb) sugere que o PRRSV pode estar evoluindopara eliminar regiões genômicas dispensáveis e tornar o genoma mais com-pacto. Finalmente, embora o significado de variações genéticas no PRRSVpossam ser apenas supostas no presente, a alteração evolucionária obser-vada na ORF5, nsplp e nsp2 estaria razoavelmente relacionada à adapta-ção biológica do PRRSV durante pressão de seleção.

A descrição completa de todas as patentes, pedidos de patentee publicações e material eletronicamente disponível (incluindo, por exemplo,submissões de seqüência de nucleotídeo, por exemplo, no GenBank e Ref-Seq, e submissões de seqüência de aminoácido, por exemplo, no SwissProt,PIR, PRF, PDB e traduções de regiões de codificação anotadas no GenBanke RefSeq) citados aqui são incorporados por referência. A descrição deta-lhada precedente e exemplos foram fornecidos para clareza de compreen-são apenas. Nenhuma limitação desnecessária deve ser depreendida dosmesmos. A invenção não está limitada aos detalhes exatos mostrados edescritos, uma vez que variações óbvias para aqueles versados na técnicaserão incluídas dentro da invenção definida pelas reivindicações.

A menos que de outro modo indicado, todos os números expres-sando quantidades de componentes, pesos moleculares e assim por dianteusados na especificação e reivindicações devem ser compreendidos comosendo modificados, em todos os casos, pelo termo "cerca de". Conseqüen-temente, a menos que de outro modo indicado ao contrário, os parâmetrosnuméricos apresentados no relatório descritivo e reivindicações são aproxi-mações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que sedeseja obter pela presente invenção. No máximo, e não como uma tentativade limitar a doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada pa-râmetro número deverá ser construído pelo menos à luz do número de dígi-tos significativos reportados e através de aplicação de técnicas comuns dearredondamento.

Não obstante o fato de que as faixas numéricas e parâmetrosapresentado o amplo escopo da invenção sejam aproximações, os valoresnuméricos apresentados nos exemplos específicos são reportados tão preci-samente quanto possível. Todos os valores numéricos, contudo, contêm ine-rentemente uma faixa necessariamente resultante do desvio padrão encon-trado em suas respectivas medições de testagem.Todos os cabeçalhos são para a conveniência do leitor e nãodeverão ser usados como limitando o significado do texto que segue ao ca-beçalho, a menos que assim especificado.

Claims (16)

1. Polinucleotídeo infeccioso isolado, caracterizado pelo fato deque compreende uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 98% deidentidade à SEQ ID NO: 1 e uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeosconsecutivos correspondendo ao nucleotídeo 2062 ao nucleotídeo 3864 deSEQ ID NO: 1.

2. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com-preende uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 88% de identida-de à SEQ ID NO: 1 e uma pelo menos uma deleção de pelo menos 39 nu-cleotídeos consecutivos correspondendo ao nucleotídeo 2062 ao nucleotí-- deo 3864 de SEQ ID NO: 1 e em que o polinucleotídeo se reproduz e produzpartículas virais infecciosas quando introduzido em uma célula.

3. Clone infeccioso, caracterizado pelo fato de que compreendeum polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 1 e pelo menos uma deleção de pelo me-nos 39 nucleotídeos consecutivos correspondendo ao nucleotídeo 2062 aonucleotídeo 3864 de SEQ ID NO: 1.

4. Polinucleotídeo infeccioso isolado, caracterizado pelo fato deque compreende uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 88% deidentidade à SEQ ID NO: 14 e uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeosconsecutivos correspondendo ao nucleotídeo 2061 ao nucleotídeo 3545 deSEQ ID NO: 14.

5. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com-preende uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 88% de identida-de à SEQ ID NO: 14 e pelo menos uma deleção de pelo menos 39 nucleotí-deos consecutivos correspondendo ao nucleotídeo 2061 ao nucleotídeo 3545 de SEQ ID NO: 14 e em que o polinucleotídeo se reproduz e produzpartículas virais infecciosas quando introduzido em uma célula.

6. Clone infeccioso, caracterizado pelo fato de que compreendeum polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 14 e pelo menos uma deleção de pelomenos 39 nucleotídeos consecutivos correspondendo ao nucleotídeo 2061ao nucleotídeo 3545 de SEQ ID NO: 14.

7. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1,2,4ou 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está presente em umvetor.

8. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, 2, 3ou 5, ou clone infeccioso de acordo com a reivindicação 3 ou 6, caracteriza-do pelo fato de que o polinucleotídeo compreende 2 ou mais deleções e emque cada deleção é independentemente pelo menos 37 nucleotídeos conse-cutivos.

9. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, 2, 4ou 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está presente em umapartícula viral infecciosa.

10. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, 2, 4ou 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é um polinucleotídeodeRNA.

11. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1,2,4ou 5, ou clone infeccioso de acordo com a reivindicação 3 ou 6, caracteriza-do pelo fato de que o polinucleotídeo está presente em uma célula.

12. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, 2, 4ou 5, ou clone infeccioso de acordo com a reivindicação 3 ou 6, caracteriza-do pelo fato de que um promotor de RNA polimerase é operavelmente ligadoao polinucleotídeo.

13. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, 2, 4ou 5, ou clone infeccioso de acordo com a reivindicação 3 ou 6, caracteriza-do pelo fato de que o polinucleotídeo ainda compreende um polinucleotídeoexógeno presente na deleção.

14. Polinucleotídeo isolado ou clone infeccioso de acordo com areivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codificaum marcador detectável.

15. Polinucleotídeo infeccioso isolado, caracterizado pelo fato deque compreende uma seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:- 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ IDNO: 12 ou SEQ ID NO: 13.

16. Polipeptídeo nsp2, caracterizado pelo fato de que é codifica-do por um polinucleotídeo infeccioso compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeo SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13.