BRPI0611594B1

BRPI0611594B1 - Polinucleotídeos infecciosos isolados e clones infecciosos

Info

Publication number: BRPI0611594B1
Application number: BRPI0611594-2A
Authority: BR
Inventors: Kay Faaberg; Jun Han; Gongping Liu; Yue Wang
Original assignee: Regents Of The University Of Minnesota
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2021-11-30
Also published as: MX2007015849A; US10294459B2; EP2369001A3; RU2427646C2; EP2369001A2; US9080143B2; US20120149096A1; CN101258247B; CN101258247A; ES2386973T3; JP5139280B2; US20100267929A1; EP1904631B1; JP2008543342A; CA2611820C; EP2369001B1; DK2369001T3; DK1904631T3; CA2611820A1; US20170130207A1

Abstract

vírus da prrs, clones infecciosos, mutantes dos mesmos e métodos de uso. a presente invenção refere-se a polinucleotídeos infecciosos isolados, tais como clones infecciosos, tendo uma seqúência de nucleotídeo com identidade aos vírus prrs, tais como vr-2332, lelystad ou outros, e opcionalmente ainda incluindo uma deleção em uma região da orf1 que codifica o polipeptídeo nsp2.

Description

DADOS DE PEDIDO DE PATENTE DE CONTINUAÇÃO

[0001] O presente pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de patente Provisório U.S. N° de Série 60/694.021, depositado em 24 de Junho de 2005, o qual é incorporado aqui por referência.

ANTECEDENTES

[0002] A presente invenção refere-se ao vírus da síndrome respiratória e produtiva em suínos (PRRSV) que é o agente causador de uma doença caracterizada por distúrbios respiratórios em porcos jovens e insuficiência reprodutiva em porcas (Benfield e outros, J. Vet. Diagn. Invest., 4: 127-133 (1992); Collins e outros, J. Vet. Diagn. Invest, 4: 117-126 (1992); Wensvoort e outros, Vet. Q., 13: 121-130 (1991)) e é endêmico na maioria dos países. A síndrome foi primeiro reconhecida como uma "doença misteriosa em suínos" nos Estados Unidos em 1987 e foi descoberta na Europa em 1990. As duas cepas virais protótipas (Lelystad e VR-2332) diferem quanto à sequência de nucleotídeo em aproximadamente 40% e representam dois genotipos distintos, referidos como cepas Européia (EU ou Tipo 1, Lelystad; Meulenberg e outros, Virology, 192: 62-72 (1993)) e Norte Americana (NA ou Tipo 2, VR-2332; Nelsen e outros, J. Virol, 73: 270-80 (1999)), (Fang e outros, Virus Res., 100: 229-235 (2004); Mardassi e outros, J. Gen. Virol, 75: 681-5 (1994); Meng e outros, Arch. Virol, 140: 745-55 (1995); Ropp e outros, J. Virol, 78: 3684-3703 (2004)). A doença também tem sido referida como síndrome de Wabash, doença misteriosa de porco, síndrome respiratória e reprodutiva em suínos, praga suína, síndrome respiratória e de aborto epidêmico em suínos, doença de aborto azul, doença de orelha azul, "abortus blau" e "seuchenhafter spatabort der schweine". A doença é caracterizada por insuficiência reprodutiva em porcas prenhes e problemas respiratórios em porcos de todas as idades. A doença tem um impacto negativo significativo sobre a indústria de suínos.

[0003] O PRRSV é um vírus de RNA senso-positivo, com envelope, da família Arteriviridae na ordem Nidovirales (Cavanagh, Arch. Virol, 142: 629:633 (1997)). O genoma do PRRSV varia de 15,115,5 kb de comprimento (Meulenberg e outros, Virology, 192: 62-72 (1993); Nelsen e outros, J. Virol, 73: 270-80 (1999)). Os primeiros 75% do genoma codificam a poliproteína replicase essencial para replicação do vírus e são compreendidos de duas grandes redes de leitura aberta (ORFs) (Ia e Ib) que são processadas co- traducionalmente em proteínas menores por proteases viralmente codificadas (Snijder e outros, J Gen. Virol, 79: 961-79 (1998)). As proteínas estruturais são codificadas por sete ORFs a jusante e são traduzidas a partir de um conjunto agrupado 3'-coterminal de mRNAs sub genômicos (sgmRNA) (Meulenberg e outros, Virology, 192: 62-72 (1993); Pattnaik e outros, Cell, 69: 1011-1020 (1992)). Na cepa VR- 2332, a região de codificação do genoma (15.411 bases) é flanqueada por regiões não traduzidas 5' e 3' de 189 e 151 nucleotídeos, respectivamente.

[0004] A cepa VR-2332 de PRRSV foi bem caracterizada em termos de sua sequência genômica completa (Pattnaik e outros, Cell, 69: 1011-1020 (1992)), a capacidade do PRRSB de produzir constitutivamente espécies de RNA subgenômicas defectivas denominada heteróclitos (latim: formas incomuns) (Yuan e outros, Virology, 275: 158-169 (2000)); Yuan e outros, Virus Research, 105: 75-87(2004)) e suas propriedades de crescimento in vitro, bem como in vivo (Murtaugh e outros, Vet. Immunol. Immunopathol., 102: 105349 (2004)). Além disso, um clone infeccioso desse genoma de PRRSV NA de 15,4 kb foi produzido e examinado com relação à sua capacidade de causar doença em suínos (pVR-HN; Nielsen e outros, J. Virol., 77: 3702- 3711 (2003)).

[0005] O PRRSV continua a causar perdas econômicas significativas no mundo todo. Vacinas estão disponíveis, mas elas são baseadas em uma cepa de PRRSV e há evidência de que as cepas de PRRSV variam a nível antigênico e genético. Além disso, uma vez que o vírus foi identificado na Europa e nos Estados Unidos, novos fenotipos da doença continuam a surgir.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Relatos anteriores têm sugerido que deleções e/ou mutações de qualquer cepa de vírus da PRRS eram, muitas vezes, extremamente prejudiciais ao crescimento viral. Especificamente, laboratórios individuais tinham feito mutações na extremidade 3' do vírus e o vírus resultante era instável e revertia rapidamente à sequência do tipo silvestre ou crescia muito pobremente ou de modo algum (Lee e outros, Virol., 331: 47-62 (2005); Choi e outros, J. Virol., 80: 723-736 (2006); Lee e outros, Virolog., 346: 238-250 (2005)). Assim, em comparação de sequências de nucleotídeo das cepas Européia (genotipo do Tipo 1) e VR-2332 (genotipo do Tipo 2), não se sabia onde fazer mutações no VR-2332 NSP2 que não fossem extremamente prejudiciais. Contudo, alinhamento de sequências de genoma completo de novos vírus de PRRS do Tipo 2 com VR-2332 começou a proporcionar um insight sobre onde mutantes viáveis poderiam ser feitos. Ainda, mutagênese por deleção mostrou que a região entre os aminoácidos 324-813 de nsp2 não era necessária para crescimento in vitro.

[0007] A presente invenção proporciona um polinucleotídeo infeccioso isolado tendo uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 1 e uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo 2062 ao nucleotídeo 3864 de SEQ ID NO: 1. Também proporcionado é um polinucleotídeo infeccioso isolado tendo uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 14 e uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo 2061 ao nucleotídeo 3545 de SEQ ID NO: 14. O polinucleotídeo isolado pode estar presente em um vetor, em uma partícula viral isolada, presente em uma célula ou uma combinação dos mesmos. Quando presente em um vetor, um promotor de RNA polimerase isolado pode ser operavelmente ligado ao polinucleotídeo. O polinucleotídeo isolado pode ser um RNA. O polinucleotídeo isolado pode incluir 2 ou mais deleções e cada deleção pode ser independentemente pelo menos 37 nucleotídeos consecutivos. O polinucleotídeo isolado pode ainda incluir um polinucleotídeo exógeno presente na deleção e o polinucleotídeo exógeno pode codificar um polipeptídeo, tal como um marcador detectável.

[0008] A presente invenção também proporciona um polinucleotídeo isolado tendo uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 1 e pelo menos uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo 2062 ao nucleotídeo 3864 de SEQ ID NO: 1 e em que o polinucleotídeo se replica e produz partículas virais infecciosas quando introduzido em uma célula. Também proporcionado é um polinucleotídeo isolado tendo uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 14 e pelo menos uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo 2061 ao nucleotídeo 3545 de SEQ ID NO: 14, em que o polinucleotídeo se replica e produz partículas virais infecciosas quando introduzido em uma célula. O polinucleotídeo isolado pode estar presente em um vetor, em uma partícula viral isolada, presente em uma célula ou uma combinação dos mesmos. Quando presente em um vetor, um promotor de RNA polimerase pode ser operavelmente ligado ao polinucleotídeo. O polinucleotídeo isolado pode ser um RNA. O polinucleotídeo isolado pode incluir 2 ou mais deleções e cada deleção pode ser independentemente pelo menos 37 nucleotídeos consecutivos. O polinucleotídeo isolado pode ainda incluir um polinucleotídeo exógeno presente na deleção e o polinucleotídeo exógeno pode codificar um polipeptídeo, tal como um marcador detectável.

[0009] A presente invenção ainda proporciona um clone infeccioso tendo um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 1 e pelo menos uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo 2062 ao nucleotídeo 3864 de SEQ ID NO: 1. Também proporcionado é um clone infeccioso tendo um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 88% de identidade à SEQ ID NO: 14 e pelo menos uma deleção de pelo menos 39 nucleotídeos consecutivos selecionados do nucleotídeo 2061 ao nucleotídeo 3545 de SEQ ID NO: 14. O clone infeccioso pode estar presente em uma célula. Um promotor de RNa polimerase pode estar operavelmente ligado ao polinucleotídeo. O clone infeccioso pode incluir 2 ou mais deleções e em que cada deleção é independentemente pelo menos 37 nucleotídeos consecutivos. O polinucleotídeo isolado pode ainda incluir um polinucleotídeo exógeno presente na deleção e o polinucleotídeo exógeno pode codificar um polipeptídeo, tal como um marcador detectável.

[00010] Também proporcionado pela presente invenção é um polinucleotídeo infeccioso isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13 e um polipeptídeo nsp2 codificado por um polinucleotídeo infeccioso compreendendo uma sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13.

[00011] O termo "compreende" e variações do mesmo não têm um significado limitativo onde esses termos aparecem na descrição e reivindicações. A menos que de outro modo indicado, "um", "uma, "o", "a" e "pelo menos um(a)" são usados permutavelmente e significam um(a) ou mais de um(a).

BREVE DESCRIÇÃO DAS figuraS

[00012] Figura 1. A. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) do polinucleotídeo infeccioso VR-V7 (também referido aqui como V6G7475A). B. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 2) do polinucleotídeo infeccioso VR-V5. C. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 3) do polinucleotídeo infeccioso VR-V5G7475A. D. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 4) do polinucleotídeo infeccioso VR-V6. E. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 5) do polinucleotídeo infeccioso MN184A. F. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 6) do polinucleotídeo infeccioso MN184B. G. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 7) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ324-434. H. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 8) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ324-523. I. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 9) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ543-632. J. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 10) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ633- 726. L. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 11) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ543-726. L. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 12) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ727-813. M. Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 13) do polinucleotídeo infeccioso Nsp2 Δ324- 726.

[00013] Figura 2. Montagem de clones de comprimento total da cepa VR-2332 de PRRSV. O genoma 15.4 foi amplificado em quatro seções (I - IV) que incorporavam sítios de clivagem de enzima de restrição únicos presentes em cDNA viral (FseI, AvrII, BsrGI) ou adicionados à sequência do PRRSV nas extremidades 5' e 3' através de mutagênese por inserção (SphI, PacI, respectivamente). Um promotor de polimerase A T7 e 2 resíduos de G sem padrão e um resíduo de T precediam a sequência viral. O vetor pOK12 (24) foi modificado para incluir um sítio pacI e uma delta ribozima de hepatite a jusante de uma cauda de poliadensina de 50 nucleotídeos.

[00014] Figura 3. Esquema de alterações de nucleotídeo de clones infecciosos ou prole de suíno. Diagrama de organização do genoma de PRRSV é apresentado, sob o qual estão comparações de genoma completo. Clivagens de proteína não-estrutural putativa são representadas acima das ORFIa e Ib, representadas pelas setas descendentes. Motivos de assinatura são identificados abaixo das ORFIa e Ib, com as setas ascendentes indicando sua colocação no genoma do PRRSV [protease de cisteína α e β semelhantes à papaína (PCPα, PCPβ); protease de cisteína (CP); protease de serina/3 C (SP/3CP); polimerase (POL); rico em cisteína/histidina (C/H); helicase (Hel); endoribonuclease poli(U)-específica homóloga a Xenopus laevis (XendoU); Ivanov e outros, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 10: 12694 12699 (2004); Ziebuhr e outros, J. Gen. Virol, 81: 853-879 (2000)]. Diferenças de nucleotídeo são representadas pelas barras verticais. 1. Cepa do tipo silvestre VR-2332 (U87392) comparada com vacina derivada de VR-2332 (Ingelvac® MLV ou RespPRRS, AF066183). 2. Cepa do tipo silvestre VR-2332 comparada com pVR-V6G7475A. 3. pVR-V5 comparado com V5-1-P3 passado in vivo (Sw612). 4. Cepa do tipo silvestre VR-2332 comparado com Sw612. Alterações de nucleotídeo detalhadas são listadas nas Tabelas 4 e 5.

[00015] Figura 4. Soro-conversão de suíno após infecção com PRRSV. Suínos em crescimento foram infectados com a cepa do tipo silvestre nativa VR-2332 (D), Ingelvac® MLV ( X ), V5-1P3 (O) ou permaneceram não infectados (■). Nos dias indicados, amostras de soro foram tomadas e testadas através de do Elisa IDEXX com relação à indicação de soro-conversão por anticorpos anti-PRRSV à proteína de nucleocapsídeo.

[00016] Figura 5. A. Ensaios de placa sobre a prole P3 (primeira linhagem) de todos os clones, bem como da cepa do tipo silvestre VR- 2332 revelaram diferentes tamanhos de placa. B. Prole de V5-1P3 após crescimento em suínos (Sw612) produziu placas similares à cepa do tipo silvestre VR-2332.

[00017] Figura 6. A. Ensaios de placa sobre a prole P3 (segunda linhagem) de todos os clones infecciosos, bem como da cepa do tipo silvestre VR-2332 mostraram tamanhos de placa que eram diferentes dos preparados virais de primeira linhagem. B. Titulações de vírus P4 indicam que a prole de clone infeccioso não estavam se replicando como a cepa do tipo silvestre VR-2332 ou o vírus Sw612, a despeito de terem um tamanho de placa similar.

[00018] Figura 7. A. Prole P3 da cepa do tipo silvestre VR-2332 (♦), Sw612 (A), pVR-HN (□), pVR-V5 (X), pVR-V5G7475A (*), pVR-V6 (•), pVR-V6G7475A (O) foram simultaneamente examinadas com relação à cinética de crescimento em uma etapa, conforme esboçado no Exemplo 1. A cepa do tipo silvestre VR-2332 e vírus Sw612 se replicaram em titulações de até aproximadamente 10 vezes maiores em todos os pontos de tempo. pVR-V6G7475A, sem nenhuma alteração de aminoácido com relação ao vírus nativo ou vacina, produziu vírus que se replicava em uma titulação maior em todos os pontos de tempo do que todas as outras proles de clone infeccioso. A titulação final para cada preparado viral é listada na tabela de comparação.

[00019] Figura 8. Análise por Northern blot de diferentes passagens da prole de pVR-V6G7475A, bem como Sw612 e do transcrito inicial in vitro revela que heteróclitos são produzidos tão precocemente quanto P1 e, junto com RNA genômico, são mais abundantes com a passagem. Contudo, RNA de transcrito (Tx) não contém espécies de heteróclito prontamente detectáveis.

[00020] Figura 9. A. Representação diagramática do genoma do PRRSV. Clivagens de proteína não estrutural putativa são representadas acima das ORFIa e Ib, representadas por setas descendentes. Motivos de assinatura são identificados abaixo das ORFIa e Ib, indicando sua colocação no genoma do PRRSV [proteases de cisteína α e β semelhantes à papaína (PL1); protease de cisteína (PL2); protease de serina/3C (3CL); polimerase (RdRp); helicase (Hel); endoribonuclease poli(U)-específica homóloga a Xenopus laevis (N); Ziebuhr e outros, 2000; Ivanov e outros, 2004; Gorbalenya e outros, 2006]. B. Diagrama esquemático da comparação de proteína de ORF1 (replicase) de MN184A e MN184B e processamento putativo. A degenerância observada em nsp2 é incluída na comparação. C. Diagrama esquemático da comparação de proteínas de ORF2-7 de MN184A e MN184B.

[00021] Figura 10. Alinhamento da sequência de aminoácido de ORF5 de PRRSV divergente. As caixas verde escuro indicam alta conservação de aminoácido (>80%; entre 16 e 19 resíduos são idênticos), cinza médio (>60%; entre 12 e 15 resíduos são idênticos), cinza mais claro (>40%; entre 8 e 11 resíduos são idênticos) e as caixas não sombreadas (<40%; menos de 8 resíduos são idênticos) identificam resíduos menos conservados. A região tracejada indica a sequência de sinal putativa, as regiões entre caixas identificam as regiões transmembrana propostas, as regiões hipervariáveis são indicadas (HV-1 e HV-2) e a orientação proposta da proteína no vírion é identificada em itálico em negrito. O resíduo de cisteína conservado que é proposto para interagir com a proteína M é identificado por u ma seta descendente (Φ). Os dois sítios de N-glicosilação putativos conservados são identificados por estrelas e a região hipervariável 1 contém sítios de N-glicosilação específicos de cepa/isolado (NxS/T). As seguintes sequências de comprimento total do GenBank foram usadas para comparação: VR-2332 (U87392), Ingelvac MLV (AF066183), 01NP1.2 (DQ056373), PL97-1 (AY58524), PA -8 (AF176348), SP (AF184212), BJ-4 (AF331831), HN1 (AY457635), 16244B (AF046869), HB-1 (AYl 50312), HB-2 (AY262352), CH-1a (AY032626), P129 (AF494042), JA142 (AY424271), SDPRRS-01- 08 (AY375474), EuroPRRSV (AY366525), Lelystad (M96262), IAF-93-653 (U64931), IAF-Klop (AY184209), 98-3298 (DQ306877), 98-3403 (DQ306878), 99-3584 (DQ306879).

[00022] Figura 11. Alinhamento de sequência de aminoácido de Nsp1β de PRRSV divergente. O desvio na figura e esquema de cor foram descritos na legenda da figura 10. Os dois resíduos catalíticos putativos completamente conservados são identificados por estrelas e os aminoácidos dentro de caixas identificam a conservação de sequência de MN184 com isolados do Tipo 1 e EAV. O sítio de clivagem proposto é identificado pela seta descendente (Φ).

[00023] Figura 12. Alinhamento de sequência de aminoácido de Nsp2 de PRRSV divergente. Os resíduos catalíticos de protease de cisteína putativos completamente conservados (Cys e His) são identificados por estrelas e os aminoácidos entre caixas significam conservação de sequência de protease dentro do PRRSV e EAV. Os sítios de clivagem propostos são identificados por setas cheias (ê); possíveis sítios de clivagem adicionais são indicados por uma seta hachurada; peptídeo sinalizador, caixa cinza sólida; regiões transmembrana, mostradas em caixas pretas hachuradas; sítios de Nglicosilação potenciais, indicados por um asterisco (*). O desvio na figura e esquema de cor foram descritos na legenda da figura 10.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[00024] A presente invenção inclui clones infecciosos do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de Suínos (PRRSV), VR-2332. Conforme usado aqui, o termo "clone infeccioso" é um polinucleotídeo tendo dois componentes; uma sequência de vetor que se replica em uma célula hospedeira procariota e um segundo polinucleotídeo referido aqui como um polinucleotídeo infeccioso. Quando transcrito in vitro para proporcionar um polinucleotídeo de RNA e introduzido em uma célula permissiva, o polinucleotídeo infeccioso se replica (como um RNA) e produz partículas virais infecciosas. Assim, um polinucleotídeo infeccioso pode estar presente em um vetor como um DNA, como um RNa em uma partícula viral ou como um DNA ou RNA isolado. O termo "polinucleotídeo" se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos, e inclui DNA e RNA fita duplo e simples. A menos que de outro modo observado, um polinucleotídeo inclui o complemento do mesmo. A sequência de nucleotídeo do complemento de um polinucleotídeo pode ser facilmente determinada por aqueles versados na técnica. Um polinucleotídeo pode incluir sequências de nucleotídeo tendo diferentes funções incluindo, por exemplo, sequências de codificação e sequências de não codificação, tais como sequências regulatórias e/ou regiões não traduzidas. Um polinucleotídeo pode ser obtido diretamente a partir de uma fonte natural ou pode ser preparado com o auxílio de técnicas recombinantes, enzimáticas ou químicas. Um polinucleotídeo pode ser de topologia linear ou circular. Um polinucleotídeo pode ser, por exemplo, uma porção de um vetor, tal como um vetor de expressão ou clonagem ou um fragmento.

[00025] Se ocorrendo naturalmente, um polinucleotídeo é, de preferência, isolado, mas preferivelmente purificado. Um composto "isolado", tal como um polinucleotídeo, polipeptídeo ou partícula viral, é um que é separado e distinto de seu ambiente natural. Um composto "purificado" é um que é pelo menos 60% isento, de preferência 75% isento e, mais preferivelmente, 90% isento de outros componentes com os quais ele está naturalmente associado. Compostos tais como polinucleotídeos e polipeptídeos que são produzidos fora do organismo no qual eles ocorrem naturalmente, por exemplo, através de meios químicos ou recombinantes, são considerados como sendo isolados e purificados por definição, uma vez que eles nunca estiveram presentes em um ambiente natural.

[00026] Um exemplo de um polinucleotídeo infeccioso da presente invenção inclui o polinucleotídeo infeccioso VR-V7 (SEQ ID NO: 1). VR-V7 também é referido aqui como V6G7475A. Outros exemplos de polinucleotídeos infecciosos da presente invenção incluem VR- V5 (SEQ ID NO: 2), VR-V5G7475A (SEQ ID NO: 3) e VR-V6 (SEQ ID NO: 4). Deverá ser notado que embora SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e outras sequências de nucleotídeo virais sejam descritas aqui como uma sequência de DNA, a presente invenção considera a sequência de RNA correspondente e complementos de RNA e DNA das mesmas, também.

[00027] Outros polinucleotídeos infecciosos da presente invenção têm uma sequência de polinucleotídeo tendo similaridade estrutural a um polinucleotídeo de referência. Polinucleotídeos de referência incluem SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, a cepa protótipo do vírus de PRRS Europeu, Lelystad (número de acesso ao Genbank M96262; SEQ ID NO: 14) e a cepa protótipo do vírus de PRRS Norte Americano, VR- 2332 (número de acesso ao Genbank U87392; SEQ ID NO: 15). A similaridade é referida como "identidade percentual" e é determinada através de alinhamento dos resíduos dos dois polinucleotídeos (isto é, a sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo infeccioso candidato e a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo de referência) para otimizar o número de nucleotídeos idênticos ao longo dos comprimentos de suas sequências; gaps em uma ou ambas as sequências são permitidas ao fazer o alinhamento de forma a otimizar o número de nucleotídeos compartilhados, embora os nucleotídeos em cada sequência devam, todavia, permanecer em sua ordem apropriada. Em alguns aspectos da presente invenção, a gap (também referida como uma deleção) está presente na sequência do polinucleotídeo infeccioso candidato. Um polinucleotídeo infeccioso candidato é um polinucleotídeo que tem a sequência de nucleotídeo sendo comparada com o polinucleotídeo de referência. Um polinucleotídeo infeccioso candidato pode ser isolado de um animal, tal como um porco infectado com PRRSV, isolado de uma linhagem de célula cultivada ou pode ser produzido usando técnicas recombinantes ou química ou enzimaticamente sintetizado. Duas sequências de nucleotídeo podem ser comparadas usando qualquer um dos algoritmos de computador comercialmente disponíveis rotineiramente usados para produzir alinhamentos de sequências de nucleotídeo. De preferência, duas sequências de nucleotídeo são comparadas usando o programa GAP do GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc.) versão 10.3 (2001). O programa GAP usa o algoritmo de Needleman e outros (J. Mol. Biol, 48: 443-453 (1970)) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que máxima o número de combinações e minimiza o número de gaps. De preferência, os valores de default para todos os parâmetros de busca no GAP são usados, incluindo matriz de escore = NewsgapDNA.cmp, peso por gap = 50, peso por extensão = 3, combinação média = 10, combinação errônea média = 0. Na comparação de duas sequências de nucleotídeo usando o algoritmo de busca do GAP, similaridade estrutural é referida como "identidade percentual". De preferência, um polinucleotídeo tem similaridade estrutural com um polinucleotídeo de referência de pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92 %, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade quando a similaridade estrutural é determinada usando o programa GAP.

[00028] Se um polinucleotídeo é um polinucleotídeo infeccioso pode ser determinado através de inserção, em um vetor, de um polinucleotídeo infeccioso candidato, transcrição do polinucleotídeo infeccioso candidato in vitro, transfecção de uma célula permissiva com as moléculas de RNA resultantes e detecção de RNA viral da prole, proteína de nucleocapsídeo viral da prole, detecção de partículas virais infecciosas ou uma combinação dos mesmos. o vetor tem, de preferência, as características de ser de baixo número de cópia e permanecer estável após inserção de grandes insertos (por exemplo, 15 kb). Um exemplo de um vetor adequado é pOK e pOK12 (Acesso ao GenBank AF223639, Vieira e outros, Gene, 100: 189-194 (1991)) e outros vetores tendo essas características são conhecidos e estão disponíveis. No vetor, o polinucleotídeo infeccioso candidato está imediatamente a jusante de um promotor. Promotores úteis são aqueles que podem ser incluídos para proporcionar altos níveis de transcrição, tal como um promotor de RNA polimerase T7, por exemplo, TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO: 16) ou os promotores de RNA polimerase SP6 e T3. Transcrição do polinucleotídeo infeccioso candidato inclui, tipicamente, digestão com endonuclease de restrição do vetor para torna-lo linear e produção de transcritos de RNA através de uso de métodos de transcrição in vitro de rotina e bem-conhecidos. Kits para transcrição in vitro estão comercialmente disponíveis (por exemplo, mMessage mMachine, disponível da Ambion, Austin, TX).

[00029] Após transcrição in vitro, o RNA é purificado usando métodos de rotina e, então, usado para transfectar uma célula permissiva. Exemplos de células permissivas incluem, por exemplo, BHK-21 (a qual permite um ciclo de produção de partícula viral), CL- 2621, MA-104 (ATCC CRL-2378), MARC-145 (Kim e outros, Arch. Virol, 133: 477-483 (1993)), linhagens de célula clonadas dessas linhagens de células ou macrófagos alveolares primários de suíno. Métodos para transfectar eficazmente células incluem o uso de brometo de 1,2- dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidróxi etil amônio e colesterol (DMRIE-C) e outros produtos comercialmente disponíveis, de preferência DMRIE-C. Métodos para transfectar eficazmente macrófagos alveolares primários de suíno são conhecidos na técnica (Groot Bramel-Verheige e outros, Virol., 278: 380-389 (2000)). Geralmente, 2 a 3 microgramas de RNA podem ser usados para transfecção, mas quantidades maiores e menores podem ser usadas. Após um período de tempo adequado, a presença de RNA viral da prole pode ser detectada, por exemplo, através de reação em cadeia de polimerase-transcriptase reversa (RT- PCR). Da mesma forma, proteína de nucleocapsídeo viral da prole pode ser detectada, por exemplo, através de um anticorpo nucleocapsídeo- específico. Ainda, se as partículas virais produzidas por células transfectadas com um polinucleotídeo infeccioso candidato infectarão outra célula pode ser detectado através de exposição de células permissivas não infectadas ao sobrenadante de células infectadas. opcionalmente, o efeito citopático (CPE) pode ser observado. Um polinucleotídeo infeccioso candidato é considerado como sendo um polinucleotídeo infeccioso quando ele produz RNA viral da prole, proteínas virais de prole (nucleocapsídeo, membrana, GP5 e outras) e infecta outras células permissivas.

[00030] Em alguns aspectos da presente invenção, um polinucleotídeo infeccioso inclui uma deleção de nucleotídeos que codificam a proteína 2 não estrutural (nsp2), um de vários (12 previstos) polipeptídeos presentes na poliproteína codificada pela ORF1. Em um vírus de PRRS e polinucleotídeos infecciosos do mesmo, os nucleotídeos que codificam o primeiro aminoácido de nsp2 podem ser determinados através de identificação do sítio de clivagem de protease 1 beta semelhante à papaína, prevista como estando após o aminoácido glicina na ORF1 na posição 383 no VR-2332.

[00031] Com relação à identificação de nucleotídeos que codificam o último aminoácido de nsp2, o sítio de clivagem C-terminal exato da nsp2 da poliproteína codificada pela ORF 1a não foi empiricamente determinado, assim, os nucleotídeos correspondendo à extremidade 3' da região de codificação são desconhecidos. Contudo, duas previsões do sítio de clivagem C-terminal foram propostas, um em Gly|Gly (onde a linha vertical entre os dois resíduos de glicina indicam a localização de clivagem) no aminoácido 980 do VR-2332 e a outro no aminoácido 1197 no VR-2332. Em alinhamento de todas as sequências de PRRSV disponíveis, existem várias duplas Gly|Gly completamente conservadas dentro dessa proteína que também podem ser o sítio de clivagem C-terminal da nsp2 da poliproteína (aminoácidos 646, 980, 1116, 1196, 1197 em VR-2332). As localizações das duplas Gly|Gly nos outros vírus e polinucleotídeos infecciosos podem ser identificadas através de comparação das sequências de nsp2 e das duplas Gly|Gly descritas na figura 12. Estudos atuais sugerem que existem pelo menos 3 sítios de clivagem na nsp2, correspondendo aos aminoácidos 980, 1116, 1196 ou 1197.

[00032] O polipeptídeo de nsp2 inclui um domínio de protease de cisteína semelhante à quimotripsina altamente conservado (identificado como CP na figura 3 e PL2 na figura 9) presente no N- término e 3-4 domínios transmembrana previstos próximo ao C- término da nsp2 (onde o número de domínios transmembrana varia dependendo da localização do sítio de clivagem C-terminal). Tipicamente, deleção dos nucleotídeos que codificam os aminoácidos do domínio PL2 ou todos os domínios transmembrana previstos resulta em um polinucleotídeo que pode se replicar em células permissivas, mas não produz partículas virais infecciosas. Assim, um clone infeccioso da presente invenção, tipicamente, não inclui deleção do domínio PL2 todo ou todos os domínios transmembrana previstos.

[00033] Os nucleotídeos que codificam o domínio de protease de cisteína semelhante à quimotripsina são os nucleotídeos 1474 a 1776 do VR-V7 (SEQ ID NO: 1), nucleotídeos 1474 a 1776 do VR-2332 (número de acesso ao Genbank U87392), e nucleotídeos 1482 a 1784 do Lelystad (número de acesso ao Genbank M96262). A localização de um domínio de protease de cisteína semelhante à quimotripsina na sequência de nucleotídeo de outros vírus de PRRS pode ser identificada através de alinhamento da sequência de aminoácido do polipeptídeo de nsp2 codificado por um vírus de PRRS com o alinhamento de sequência de aminoácido descrito na figura 12 e determinação de quais nucleotídeos codificam aqueles aminoácidos que se alinham com o domínio de protease de cisteína semelhante à quimotripsina. Alternativamente, as sequências de aminoácido de polipeptídeos de nsp2 de outros vírus de PRRS podem ser identificadas através de alinhamento da sequência de aminoácido do polipeptídeo de nsp2 codificado por um vírus de PRRS com a sequência de aminoácido de polipeptídeos de nsp2 produzidos por outros arterivírus, tal como o vírus da arterite de eqüino (EAV) e o vírus de elevação de dehidrogenase de lactato (LDV).

[00034] Os nucleotídeos que codificam os domínios transmembrana previstos do VR-V7 (SEQ ID NO: 1), VR-2332 (número de acesso ao Genbank U87392) e Lelystad (número de acesso ao Genbank M96262) são mostrados na Tabela 1. Tabela 1. Nucleotídeos de nsp2 que codificam domínios transmembrana previstos.

[00035] A localização dos domínios transmembrana na sequência de nucleotídeo de outros vírus de PRRS pode ser identificada através de alinhamento da sequência de aminoácido do polipeptídeo de nsp2 codificado por um vírus de PRRS com o alinhamento de sequência de aminoácido descrito na figura 12 e determinação de quais nucleotídeos codificam aqueles aminoácidos que se alinham com os domínios transmembrana. Alternativamente, a localização dos domínios transmembrana pode ser identificada com um algoritmo de computador, tal como o algoritmo PredictProtein, conforme descrito por Rost e outros (Nucleic Acids Res., 32 (edição para Servidor da Web): W321-326 (2004) ou o algoritmo TMHMM, conforme descrito por Krogh e outros (J. Mol. Biol., 305: 567-580 (2001)) e disponível através da World Wide Web.

[00036] A deleção presente em polinucleotídeos infecciosos da presente invenção está, tipicamente, entre os nucleotídeos que codificam o domínio de protease de cisteína semelhante à quimotripsina e os nucleotídeos que codificam os domínios transmembrana e não resulta em um desvio de rede na rede de leitura da ORF1. Conforme discutido acima, a deleção, tipicamente, não inclui todos os nucleotídeos que codificam o domínio de protease de cisteína semelhante à quimotripsina, todos os nucleotídeos que codificam os domínios transmembrana ou a combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, por exemplo, quando o polinucleotídeo infeccioso tem similaridade estrutural com SEQ ID NO: 1, o limite 5' de uma deleção está no nucleotídeo 2305, nucleotídeo 2205, nucleotídeo 2105 ou nucleotídeo 2062 e o limite 3' de uma deleção está no nucleotídeo 3774, nucleotídeo 3804, nucleotídeo 3834 ou nucleotídeo 3864. Em outros aspectos, por exemplo, quando o polinucleotídeo infeccioso tem similaridade estrutural com SEQ ID NO: 14, o limite 5' de uma deleção está no nucleotídeo 2304, nucleotídeo 2204, nucleotídeo 2104 ou nucleotídeo 2061 e o limite 3' de uma deleção está no nucleotídeo 3455, nucleotídeo 3495, nucleotídeo 3525 ou nucleotídeo 3545. A deleção pode ser pelo menos 39 nucleotídeos, 48 nucleotídeos ou 57 nucleotídeos. Em alguns aspectos, a deleção pode ser pelo menos 267 nucleotídeos, pelo menos 276 nucleotídeos ou pelo menos 285 nucleotídeos. Em alguns aspectos, a deleção é não mais do que 489 nucleotídeos, não mais do que 459, não mais do que 429 ou não mais do que 402 nucleotídeos. Um polinucleotídeo infeccioso pode ter mais de uma deleção na região de nsp2.

[00037] Exemplos de polinucleotídeos infecciosos derivados de VR- V7 e contendo uma deleção são descritos na Tabela 2. Tabela 2. Polinucleotídeos infecciosos derivados de VR-V7 (SEQ ID NO: 1).

*A deleção se refere aos aminoácidos de nsp2 que são deletados, por exemplo, no vírus Nsp2 Δ180-323, os aminoácidos 180-323 da nsp2 são deletados. **O tamanho de placa é com relação às placas produzidas pelo VR- 2332 do tipo silvestre.

[00038] Um polinucleotídeo infeccioso contendo uma deleção pode incluir um polinucleotídeo exógeno inserido em lugar da deleção. Um polinucleotídeo "exógeno" se refere a uma sequência de nucleotídeo estranho, isto é, uma sequência de nucleotídeo que não está normalmente presente em um vírus de PRRS ou um clone infeccioso do mesmo. O polinucleotídeo exógeno pode e, de preferência, não codifica um polipeptídeo. Polinucleotídeos exógenos adequados incluem aqueles que codificam um marcador detectável, por exemplo, uma molécula que é facilmente detectada através de vários métodos. Exemplos incluem polipeptídeos fluorescentes (por exemplo, proteínas fluorescentes verde, amarela, azul e vermelha), luciferase, acetil transferase de cloranfenicol e outras moléculas (tais como c-myc, flag, 6xhis, peptídeo de ligação a metal HisGln (HQ) e epítopo V5) detectáveis por sua fluorescência, atividade enzimática ou propriedades imunológicas e são, tipicamente, úteis quando detectadas em uma célula, por exemplo, uma célula cultivada ou uma amostra tecidual que tenha sido removida de um animal. Outros polinucleotídeos exógenos que podem ser usados são aqueles que codificam polipeptídeos expressos por outras entidades, tais como células e patógenos. Expressão de um polinucleotídeo exógeno resulta em um polinucleotídeo infeccioso que expressa antígenos estranhos. Exemplos de sequências de nucleotídeo exógenas incluem aquelas que codificam proteínas expressas por patógenos, de preferência patógenos de suíno, tais como o circovírus suíno do tipo 2, Mycoplasma hyopneumoniae (por exemplo, as proteínas P46 e P65 de M. hyopneumoniae), Lawsonia intracellularis (por exemplo, as proteínas da membrana externa de L. intracellularis), a ORF5 de diferentes cepas de PRRSV e Streptococcus suis (por exemplo, a proteína de 38-kDa de S. suis). O polipeptídeo de nsp2 tem epítopos de células B e espera-se que seja imunogênico. Espera-se que a inclusão de epítopos estranhos em um polipeptídeo de nsp2 resulte em uma resposta imune aos epítopos estranhos. Exemplos adicionais de polinucleotídeos exógenos incluem aqueles que codificam modificadores de resposta biológica, por exemplo, IFN-a, IFN- y, IL- 12, IL-2, TNF-a e IL-6.

[00039] O polinucleotídeo exógeno é inserido na região de deleção de modo que ele esteja em rede com a rede de leitura aberta que codifica nsp1a e nsp1β e mais de um polinucleotídeo exógeno pode ser inserido aleatoriamente, por exemplo, sequências de nucleotídeo que codificam três epítopos de c-myc podem estar presentes. O tamanho total do polinucleotídeo infeccioso contendo um polinucleotídeo exógeno inserido em lugar da deleção é, tipicamente, não maior do que 16.000 bases, não maior do que 15.800 bases, não maior do que 15.600 bases, não maior do que 15.400 bases ou não maior do que 15.200 bases (incluindo a cauda de poli A). uma inserção pode estar presente em um polinucleotídeo infeccioso tendo a deleção Nsp2 Δ324-434, Nsp2 Δ324-523, Nsp2 Δ543-632, Nsp2 Δ633-726, Nsp2 Δ543-726, Nsp2 Δ727-813 ou Nsp2 Δ324-726, de preferência a deleção Nsp2 Δ324-434, Nsp2 Δ543-632, Nsp2 Δ633-726, Nsp2 Δ543- 726, Nsp2 Δ727-813 ou Nsp2 Δ324-726. Exemplos preferidos de clones infecciosos contendo um polinucleotídeo exógeno em lugar de uma deleção incluem um polinucleotídeo infeccioso tendo a deleção Nsp2 Δ324-434 contendo uma região de codificação que codifica uma proteína fluorescente verde de 238 aminoácidos, um polinucleotídeo infeccioso tendo a deleção Nsp2 Δ543-632 contendo uma região de codificação que codifica uma proteína fluorescente verde de 238 aminoácidos, um polinucleotídeo infeccioso tendo a deleção Nsp2 Δ324-434 contendo uma região de codificação que codifica um epítopo de c-myc de 10 aminoácidos (EQKLISEED L, SEQ ID NO: 17), um polinucleotídeo infeccioso tendo a deleção Nsp2 Δ324-434 contendo uma região de codificação que codifica um epítopo de c-myc de 10 aminoácidos e um polinucleotídeo infeccioso tendo as deleções Nsp2 Δ324-726 ou Nsp2 Δ543-726, cada uma contendo uma região de codificação que codifica uma repetição aleatória do epítopo de c-myc de 10 aminoácidos.

[00040] Um polinucleotídeo infeccioso está, tipicamente, presente em um vetor e a combinação do polinucleotídeo infeccioso e vetor é referida como um clone infeccioso, o qual é feito através de genética invertida. Um vetor é um polinucleotídeo de replicação, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outro polinucleotídeo pode ser preso de modo a levar à replicação do polinucleotídeo preso. Construção de vetores contendo um polinucleotídeo da invenção emprega métodos padrões de DNA recombinante conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Um vetor pode proporcionar clonagem adicional (amplificação do polinucleotídeo), isto é, um vetor de clonagem ou para a expressão do polipeptídeo codificado pela região de codificação, isto é, um vetor de expressão ou a combinação dos mesmos. O termo vetor inclui, mas não está limitado a, vetores de plasmídeo, vetores virais, vetores de cosmídeo ou vetores de cromossoma artificial. Tipicamente, um vetor é capaz de replicação em um hospedeiro bacteriano, por exemplo, E. coli. De preferência, o vetor é um plasmídeo.

[00041] Seleção de um vetor depende de uma variedade de características desejadas na estrutura resultante, tal como um marcador de seleção, taxa de replicação do vetor e similares. De preferência, um vetor adequado para uso como parte de um clone infeccioso é um vetor de clonagem e um vetor de expressão. Vetores úteis têm um baixo número de cópia em uma célula hospedeira. Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão dos vetores aqui são células procariotas ou eucariotas. De preferência, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Procariotas adequados incluem eubactérias, tais como organismos gram-negativos, por exemplo, E. coli ou S. typhimurium. Células hospedeiras exemplificativas úteis para fabricação, manipulação e manutenção de um clone infeccioso são DH-5α, DH-1 (ATCC 33849) e AG-1, de preferência DH-1 ou AG-1.

[00042] Um vetor inclui sequências regulatórias operavelmente ligadas ao polinucleotídeo infeccioso. O termo "operavelmente ligado" se refere a uma justaposição de componentes, de modo que eles estejam em uma relação que permite que os mesmos funcionem de sua maneira pretendida. Uma sequência regulatória é "operavelmente ligada" a um polinucleotídeo infeccioso da presente invenção quando ela está unida de uma forma tal que expressão da região de codificação é obtida sob condições compatíveis com a sequência regulatória. Tipicamente, um promotor é um que proporciona ligação em alta especificidade de uma RNA polimerase e tais promotores incluem T7, SP6, e T3. Tipicamente, o promotor está localizado imediatamente a montante do primeiro nucleotídeo do polinucleotídeo infeccioso. De preferência, um GGT está inserido entre o promotor e o primeiro nucleotídeo do polinucleotídeo infeccioso. Opcionalmente e de preferência, o vetor também contém uma ribozima do vírus delta de hepatite a jusante da região poli A.

[00043] O vetor, opcionalmente e de preferência, inclui uma ou mais sequências marcadoras de seleção as quais codificam, tipicamente, uma molécula que inativa ou de outro modo detecta ou é detectada por um composto no meio de crescimento. Por exemplo, a inclusão de uma sequência marcadora de seleção pode tornar a célula transformada resistente a um antibiótico ou pode conferir à mesma um metabolismo composto-específico sobre a célula transformada. Exemplos de uma sequência marcadora de seleção são sequências que conferem resistência à canamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina e neomicina.

[00044] Quando de produção de uma deleção de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo de nsp2 em um clone infeccioso, métodos de DNA recombinante padrões conhecidas na técnica podem ser usados (veja, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Conforme aqueles versados na técnica reconhecerão, é prática padrão durante construção de um clone infeccioso (e quando de construção de deleções em um clone infeccioso) verificar, através de análise de sequência de nucleotídeo, a presença de sequências de nucleotídeo esperadas, tais como deleções ou outras alterações e a ausência de outras mutações. Da mesma forma, quando um polinucleotídeo infeccioso candidato é testado para determinar se ele é infeccioso, é prática padrão verificar, através de análise da sequência de nucleotídeo, a ausência de vírus contaminante do tipo silvestre.

[00045] A presente invenção também inclui polinucleotídeos infecciosos isolados descritos em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 e polinucleotídeos infecciosos tendo similaridade estrutural à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Métodos para determinação de similaridade estrutural são descritos aqui. De preferência, um polinucleotídeo infeccioso desse aspecto da presente invenção tem similaridade estrutural à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 de pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Um polinucleotídeo tendo similaridade estrutural à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 é considerado com sendo um polinucleotídeo infeccioso se, quando presente em uma partícula viral e exposto à células permissíveis, o polinucleotídeo se replica nas células permissivas e produz partículas virais infecciosas.

[00046] A presente invenção partículas virais isoladas. Conforme usado aqui, os termos "partícula viral" e "partícula de vírus" são usados permutavelmente e se referem a um polinucleotídeo da presente invenção circundado por um envelope. Uma partícula viral da presente invenção podem, quando adicionada a uma célula cultivada permissiva, pode se replicar na produção de mais partículas virais.

[00047] Uma partícula viral pode ser crescida através de passagem in vivo ou em cultura de célula. Passagem in vivo inclui inoculação de um porco (Faaberg e outros, Patente U.S 7.041.443). Passagem em cultura de célula inclui exposição de células cultivadas à partícula viral e incubação das células sob condições adequadas para que o vírus se reproduza e produza mais partículas virais. De preferência, as células cultivadas não são uma linhagem de célula imortalizada ou transformada (isto é, as células não são capazes de se dividir indefinidamente). De preferência, macrófagos alveolares primários de suíno são usados para passagem em cultura de células (Faaberg e outros, Patente U.S 7.041.443).

[00048] Um vírus da presente invenção pode ser inativado, isto é, tornado incapaz de reprodução in vivo e/ou em cultura de células. Métodos de inativação são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, tratamento de uma partícula viral da invenção com um agente de inativação químico padrão, tal como um reagente de aldeído, incluindo formalina, acetaldeído e similares; álcoois ácidos reativos, incluindo cresol, fenol e similares; ácidos, tais com ácido benzóico, ácido benzeno sulfônico e similares; lactonas, tais como beta propiolactona e caprolactona; e lactames ativados, carbodiimidas e compostos de carbonila diheteroaromáticos, tal como carbonil diimidazol. Irradiação, tal como com irradiação ultravioleta e gama, também pode ser usada para inativar o vírus.

[00049] Também incluídas na presente invenção são partículas virais atenuadas (por exemplo, vírus tendo capacidade reduzida de causar os sintomas de doença misteriosa de suínos em porcos) e métodos de fabricação de uma partícula viral atenuada. Métodos de produção de um vírus atenuado são conhecidos na técnica. Tipicamente, um vírus da presente invenção é passado, isto é, usado para infectar uma célula em cultura, deixado reproduzir e, então, coletado. Esse processo é repetido até que a virulência do vírus em porcos seja diminuída. Por exemplo, o vírus pode ser passado 10 vezes em cultura de célula e, então, a virulência do vírus medida. Se a virulência não diminuiu, o vírus que não foi injetado no animal é passado mais 10 vezes em cultura de célula. Esse processo é repetido até que a virulência seja diminuída. Em geral, a virulência é medida através de inoculação de porcos com vírus e avaliação da presença de sintomas clínicos e/ou da LD5O (veja, por exemplo, Halbur e outros, J. Vet. Diagn. Invest, 8: 11-20 (1996), Halbur e outros, Vet. Pathol, 32: 200-204 (1995) e Park e outros, Am. J. Vet. Res., 57: 320-323 (1996)). De preferência, a virulência é diminuída de modo que o vírus atenuado não causa a morte dos animais e, de preferência, não causa sintomas clínicos da doença.

[00050] Tipicamente, uma cultura de célula útil para produção de um vírus atenuado da presente invenção inclui células de origem mamífero de não-suíno. Exemplos de culturas de células de mamífero de não-suíno incluem, por exemplo, a linhagem de células MA- 104 (ATCC CRL-2378), a linhagem de célula MARC-145 (Kim e outros, Arch. Virol, 133: 477-483 (1993)) e a linhagem de célula CL-2621 (Baustita e outros, J. Vet. Diagn. Invest., 5: 163-165 (1993)). De preferência, uma cultura de célula misturada é usada para produção de uma partícula viral atenuada da presente invenção. Em uma cultura de célula misturada, existem pelo menos dois tipos de células presentes. De preferência, uma cultura de célula misturada inclui uma linhagem de célula imortalizada ou transformada e uma cultura de célula primária. Uma cultura de célula misturada é particularmente útil quando um vírus se produz lentamente ou nem isso, em uma linhagem de célula imortalizada ou transformada. Exemplos preferidos de uma linhagem de célula transformada ou imortalizada para uso em uma cultura de célula misturada incluem, por exemplo, a linhagem de célula MARC-145 (Kim e outros, Arch. Virol, 133: 477-483 (1993)) e a linhagem de célula MA-104 (ATCC CRL-2378). De preferência, culturas de célula primária para uso em uma cultura de célula misturada são originárias de suíno. Um exemplo preferido de uma cultura de célula primária para uso em uma cultura de célula misturada é macrófagos alveolares primários de suíno.

[00051] A presente invenção ainda inclui os polipeptídeos codificados pelas regiões de codificação de nsp2 presentes nos polinucleotídeos descritos na Tabela 2, incluindo aqueles que são viáveis. Também incluídos na presente invenção são anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais, que se ligam especificamente a um polipeptídeo codificado pelas regiões de codificação de nsp2 presentes nos polinucleotídeos descritos na Tabela 2. O termo "anticorpo", a menos que especificado ao contrário, inclui fragmentos de anticorpos inteiros os quais retêm sua atividade de ligação por um antígeno alvo. Tais fragmentos incluem fragmentos Fv, F(ab') e F(ab')2, bem como anticorpos com uma única cadeia (scFv). Conforme usado aqui, um anticorpo que pode "se ligar especificamente" a um polipeptídeo é um anticorpo que interage apenas com o epítopo do antígeno que induziu à síntese do anticorpo ou interage com um epítopo estruturalmente relacionado. Um anticorpo que "se liga especificamente" a um epítopo interagirá, sob as condições apropriadas, com o epítopo mesmo na presença de uma diversidade de alvos de ligação potenciais. Conforme usado aqui, o termo "complexo de polipeptídeo:anticorpo" se refere ao complexo que resulta quando um anticorpo se liga especificamente a um polipeptídeo ou uma subunidade ou análogo do mesmo. Em alguns aspectos, um anticorpo da presente invenção inclui aquele que não se liga especificamente a um polipeptídeo de nsp2 de comprimento total codificado pelo VR-2332 (por exemplo, número de acesso ao Genbank U87392, aminoácidos 384-1363 da ORF1 (veja também Allende e outros, J. Gen. Virol, 80: 307-315 (1999) ou aminoácidos 384-1580 da ORF1 (veja também Zebuhr e outros, J. Gen. Virol, 81: 853-879 (2000)). Tais anticorpos podem ser identificados usando métodos de rotina conhecidos na técnica.

[00052] Anticorpos da presente invenção podem ser preparados usando o polipeptídeo intacto. Opcionalmente, um polipeptídeo de nsp2 descrito aqui pode ser covalentemente ligado ou conjugado a um polipeptídeo veículo para melhorar as propriedades imunológicas do polipeptídeo. Polipeptídeos veículo úteis são conhecidos na técnica.

[00053] O preparo de anticorpos policlonais é bem-conhecido. Anticorpos policlonais podem ser obtidos através de imunização de uma variedade de animais de sangue quente, tais como cavalos, vacas, cabras, ovelha, cães, galinhas, coelhos, camundongos, hâmsters, porcos-da-índia e ratos, bem como animais transgênicos, tais como ovelha, vacas, cabras ou porcos transgênicos, com um imunogênio. Os anticorpos resultantes podem ser isolados de outras proteínas usando uma coluna de afinidade tendo uma porção de ligação a Fc, tal como proteína A ou semelhante.

[00054] Anticorpos monoclonais podem ser obtidos através de vários métodos familiares para aqueles versados na técnica. Resumidamente, células de baço de um animal imunizado com um antígeno desejado são imortalizadas, comumente através de fusão com uma célula de mieloma (veja, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e outros, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados de culturas de hibridoma através de métodos bem-conhecidos na técnica.

[00055] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser recombinantemente produzido, por exemplo, através de phage display ou através de métodos combinatoriais. Métodos de phage display e combinatoriais podem ser usados para isolar anticorpos recombinantes que se ligam a um polipeptídeo descrito aqui ou uma subunidade biologicamente ativa ou análogo do mesmo (veja, por exemplo, Ladner e outros, Pat. U.S. No. 5.223.409). Tais métodos podem ser usados para gerar anticorpos monoclonais humanos. A presente invenção também proporciona composições incluindo um polinucleotídeo infeccioso, polinucleotídeo de PRRS, partícula viral ou anticorpo da presente invenção. Tais composições incluem, tipicamente, um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui solução salina, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e para retardo de absorção e similares, compatíveis com administração farmacêutica. Compostos ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições.

[00056] Uma composição pode ser preparada através de métodos bem-conhecidos na técnica de farmácia. Em geral, uma composição pode ser formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem perfusão e parenteral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (tópica) e transmucosal. Soluções ou suspensões podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, tal como água para administração, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes de quelação, tal como ácido etileno diamina tetraacético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; eletrólitos, tais como íons de sódio, íons de cloreto, íons de potássio, íons de cálcio e íons de magnésio e agentes para o ajuste de tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Uma composição pode estar encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos com doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.

[00057] Composições podem incluir soluções aquosas (onde solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para o preparo extemporâneo de soluções ou dispersões estéreis. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ.) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Uma composição é, tipicamente, estéril e, quando adequada para uso estéril, deverá ser fluida até o ponto em que exista facilidade de fluxo em uma seringa. Ela deverá ser estéril sob as condições de fabricação e armazenamento e preservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similares) e misturas adequadas dos mesmos. prevenção da ação de microorganismos pode ser obtida através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcóois, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio, na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida através de inclusão, na composição, de um agente o qual retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00058] Soluções estéreis podem ser preparadas através de incorporação do composto ativo (isto é, um polinucleotídeo infeccioso ou vírus de PRRS da presente invenção) na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas através de incorporação do composto ativo em um veículo estéril, o qual contém um meio de dispersão dibásico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para o preparo de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparo são secagem a vácuo e secagem por congelamento, o qual proporciona um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

[00059] Composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou um veículo ingerível. Para a finalidade de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de tabletes, trociscos, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. Essas composições também podem ser formadas em um pó ou suspensas em uma solução aquosa, de modo que esses pós e/ou soluções possam ser administrados à ração para animal ou à água de beber do animal. Essas composições podem ser adequadamente adoçadas ou flavorizadas através de vários agentes conhecidos por promover a captação da vacina oralmente pelo porco.

[00060] Os compostos ativos também podem ser administrados através de qualquer método adequado para administração de agentes de polinucleotídeo, por exemplo, usando pistolas de gene, bio injetores e emplastros para a pele, bem com métodos sem agulha, tal como a tecnologia de vacina de DNA de micropartícula descrita por Johnston e outros (Pat. U.S. N°. 6.194.389). Adicionalmente, distribuição intranasal é possível, conforme descrito, por exemplo, em , Hamajima e outros, Clin. Immunol. Immunopathol., 88: 205-210 (1998). Lipossomas e microencapsulação também podem ser usados.

[00061] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação com liberação controlada, incluindo implantes. Polímeros biodegradáveis biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Tais formulações podem ser preparadas usando técnicas padrão. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossômicas também podem ser usadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Essas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00062] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos ativos podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A proporção de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a proporção de LD50/ED50. Compostos os quais exibem altos índices terapêuticos são preferidos.

[00063] Os dados obtidos de ensaios de cultura de célula e estudos com animais podem ser usados na formulação de uma serie de dosagens para uso no campo. A dosagem de tais compostos oscila, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações em circulação que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada.

[00064] As composições podem ser administradas uma ou mais vezes por dia a uma ou mais vezes por semana, incluindo dia sim, dia não. Aqueles versados na técnica apreciarão que determinados fatores podem influenciar a dosagem e sincronização requeridos para tratar eficazmente um indivíduo incluindo, mas não limitado a, gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, tratamento de um indivíduo com uma quantidade eficaz de um polipeptídeo pode incluir um único tratamento ou, de preferência, pode incluir uma série de tratamentos.

[00065] A presente invenção inclui métodos para uso das composições descritas aqui. Em um aspecto, a invenção inclui métodos para tratamento de um ou mais sintomas de doença misteriosa em suínos em um animal que pode ser causada por infecção com um vírus de PRRS. O método inclui administração de uma quantidade eficaz de uma composição da presente invenção a um animal tendo ou em risco de ter doença misteriosa em suíno ou sintomas de doença misteriosa em suíno.

[00066] Tratamento de doença misteriosa em suíno ou sintomas de doença misteriosa em suíno pode ser profilático ou, alternativamente, pode ser iniciado após o desenvolvimento da doença ou sintomas da mesma. Conforme usado aqui, o termo "sintoma" se refere à evidência objetiva, em um indivíduo, de doença misteriosa em suíno. Sintomas associados à doença misteriosa em suíno e as avaliações de tais sintomas são rotina e conhecidos na técnica. Exemplos de sintomas incluem aborto, anorexia, febre, letargia, pneumonia, descoloração vermelha/azul das orelhas, respiração difícil (dispnéia) e taxa respiratória aumentada (taquipnéia). Tratamento que é profilático, por exemplo, iniciado antes que um indivíduo manifeste sintomas de uma condição causada por um vírus de PRRS, é referido aqui como tratamento de um indivíduo que está "em risco" de desenvolver a doença ou sintomas da mesma. Tipicamente, um animal "em risco" é um animal presente em uma área onde animais tendo a doença ou sintomas da mesma foram diagnosticados e/ou é provável que sejam expostos a um vírus de PRRS. Conseqüentemente, administração de uma composição pode ser realizada antes, durante ou após a ocorrência das condições descritas aqui. Tratamento iniciado após o desenvolvimento de uma condição pode resultar em diminuição da gravidade dos sintomas de uma das condições ou remoção completa dos sintomas.

[00067] Em alguns aspectos, os métodos incluem, tipicamente, administração, a um animal, de uma composição incluindo uma quantidade eficaz de uma partícula viral da presente invenção. uma "quantidade eficaz" é uma quantidade eficaz para prevenir a manifestação de sintomas de doença misteriosa em suíno, diminuição da gravidade dos sintomas da doença e/ou remover completamente os sintomas. Tipicamente, a quantidade eficaz é uma quantidade que resulta em uma resposta imune humoral e/ou celular que protege o animal durante futura exposição a um vírus de PRRS. A partícula viral usada na composição pode conter um polinucleotídeo infeccioso que tem uma deleção, conforme descrito aqui. Opcionalmente, o polinucleotídeo infeccioso também inclui um polinucleotídeo exógeno presente em lugar da deleção. Uma vantagem de uso de uma partícula viral tendo uma deleção (ou um polinucleotídeo exógeno presente em lugar da deleção) pode ser facilmente distinguida de outros vírus de PRRS, incluindo vírus de PRRS do tipo silvestre presente no campo. A partícula viral pode ser identificada através de isolamento do vírus de um animal seguido, por exemplo, através de digestão com uma enzima de restrição ou amplificação PCR-baseada de nucleotídeos específicos. Tal partícula viral "marcada" é, freqüentemente, referida na técnica como uma vacina de marcador.

[00068] Em outros aspectos da presente invenção, os clones infecciosos e/ou polinucleotídeos infecciosos descritos aqui podem ser usados para investigar inserções genéticas viáveis, para investigar RNA alternativo expresso ou outras proteínas que não o vírus de comprimento total, para investigar recombinação viral e investigar propriedades imunogênicas de nsp2 de comprimento total com relação à nsp2 truncada. EXEMPLOS Exemplo 1

[00069] Clones de cDNA de comprimento total de vírus da síndrome respiratória e reprodutiva em suínos (PRRSV), cepa protótipo VR- 2332, foram desenvolvidos, com cada versão progressiva possuindo menos alterações de nucleotídeo que as versões anteriores quando comparado com a cepa do tipo silvestre VR-2332. Vírus de prole de cada clone infeccioso foi recuperado e analisado para verificação da sequência de nucleotídeo, taxa de crescimento in vitro e tamanho de placa. Prole de um clone infeccioso confirmou replicação robusta in vivo, observada pelo aparecimento de anticorpos a-PRRSV na mesma taxa que o vírus do tipo silvestre. Análise de Northern blot da prole in vivo também revelou que espécies de RNA sub genômicas defectivas, denominadas heteróclitos (formas incomuns), estavam presentes junto com genomas de comprimento total. Análise de Northern blot concorrente de uma série de passagens de culturas de células MA-104 infectadas revelou que vírus revestimento obteve apenas gradualmente um perfil de RNA de heteróclito e de comprimento total similar às espécies de RNA observadas em infecção in vivo. Materiais e Métodos

[00070] Células e cepas virais. Células MA-104 ou suas células descendentes MARC-145 (ATCC CRL-11171), uma linhagem de célula epitelial de rim de macaco verde Africano a qual suporta replicação de PRRSV (Meng e outros, J. Vet. Diagn. Invest, 8: 374-81 (1996)), foram mantidas em meio mínimo essencial de Eagle (EMEM) (JRH Biosciences 56416), suplementado com 1 mg/ml de NaHCO3 e soro bovino fetal a 10% (FBS), a 37°C com 5% de CO2. As células cultivadas foram transfectadas com RNA ou infectadas com vírus quando o crescimento da monocamada tinha atingido 70-80% de confluência. Cepas protótipos de PRRSV Norte Americano VR-2332 e Ingelvac® MLV foram descritos anteriormente (Yuan e outros, Virus Res., 79:189-200 (2001)). A cepa VR-2332 cresce em titulações equivalentes sobre ambas as linhagens de célula.

[00071] Purificação de RNA viral. RNA viral (vRNA) foi purificado conforme descrito (Chen e outros, J. Gen. Virol., 75: 925-930 (1994); Yuan e outros, Virus Res., 79: 189-200 (2001)). Resumidamente, sobrenadante de células MARC-145 infectadas com VR-2332 foi coletado no dia 4 pós-infecção (p.i.). Após remoção dos resíduos celulares através de centrifugação a 12.000 rpm, os sobrenadantes foram colocados em camadas sobre 2 ml de uma almofada de sacarose a 0,5 M e centrifugados a 76.000 x g durante 4 horas. Os vírions peletizados foram ressuspensos em 0,5 ml de LES (LiCl a 0,1 M/EDTA a 5 mM/SDS a 1,0%) e ainda digeridos através da adição de 100 μg de proteinase K a 56°C para remover toda proteína. Após 10 minutos de incubação, vRNA foi extraído varias vezes com fenol ácido e fenol/cl e, então, precipitado em etanol a 70% v/v. vRNA peletizado foi imediatamente ressuspenso em 50 μl de H2O ou tampão TE isento de RNase (Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH de 8,0) e armazenado a -80°C.

[00072] Construção de cDNA de comprimento total. Síntese de cDNA foi realizada com o Kit de RT-PCR Enhanced Avian HS (Sigma, HSRT-100). Oito iniciadores de PCR (Tabela 3) foram usados para amplificar quatro fragmentos de cDNA de sobreposição cobrindo todo o genoma de VR-2332 (figura 2). As condições de ciclização foram 94°C durante 2 minutos, então, 35 ciclos de 94°C durante 15 segundos, 68°C durante 4-5 segundos, seguido por 68°C durante 5 minutos. Cada fragmento de PCR foi purificado com o Kit QIAEX II Gel Extraction (Qiagen) e clonado no vetor pCR®2.1 -TOPO® com o Kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen K450001). Plasmídeos representando cada fragmento foram submetidos para análise de sequência de nucleotídeo. Os fragmentos com as mutações mínimas de nucleotídeo comparados com a sequência do VR-2332 precursor (número de submissão ao GenBank U87392) foram usados para montar cDNA de comprimento total, conforme mostrado na figura 2. Em cada região de sobreposição, um sítio de enzima de restrição único foi utilizado para unir fragmentos de flanqueamento. Quatro fragmentos digeridos, representando a sequência genômica de comprimento total, foram precisamente montados gradualmente em um vetor de plasmídeo de baixo número de cópia modificado (pOK12HDV-PacI). O vetor foi modificado para incluir a ribozima HDV através de inserção de um fragmento SmaI a SacII de 244 bp contendo a ribozima antigenoma HDV e uma sequência terminadora de RNA polimerase T7 do vetor de Transcrição 2.0 (Johnson e outros, J. Virol, 71: 3323-3327 (1997); Pattnaik e outros, Cell, 69: 1011-1020 (1992)) nos sítios correspondentes no pOK12 (Vieira e outros, Gene, 100: 189-194 (1991)). O sítio de enzima de restrição NcoI nesse fragmento de 244 bp foi substituído por um sitio PacI único através de mutação de oligonucleotídeo com os conjuntos de iniciador 5'pOK12HDV- 2157/3'pOK12HDV-257 e 5'pOK12HDV-257/poliA-modificado (Tabela 3), seguido por PCR de fusão. Em clones de cDNA de comprimento total, a sequência genômica viral era precedida pelo promotor de RNA polimerase T7, 1 ou 2 resíduos de G e um resíduo de T e seguido por uma cauda de ácido poliadenílico de 50 nucleotídeos. Os clones montados foram propagados na cepa DH5α de Escherichia coli e, então, submetidos à confirmação da sequência de nucleotídeo de comprimento total. Tabela 3. Iniciadores de oligonucleotídeo usados nesse estudo. Iniciadores dianteiros são indicados com uma barra inclinada (/) após o designador, iniciadores reversos são precedidos por uma barra inclinada. Sítios de enzima de restrição inseridos são mostrados em itálico sublinhado.

Posição no genoma é baseada na Submissão ao GenBank U87392

[00073] Modificação e análise de sequência de clones de cDNA de comprimento total. O kit QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) foi usado para modificar todos os clones de cDNA de pVR-V4 para pVR-V6G7475A. Os insertos de plasmídeo de cDNA genômico completos foram, então, submetidos ao University of Minnesota Advanced Genetic Analysis Center (AGAC) para análise da sequência de nucleotídeo com iniciadores de sequenciamento apropriados (Tabela 3). Diferenças na sequência entre pVR-V4 a pVR- V6G7475A, bem como aquelas do VR-2332 precursor, sua cepa de vacina atenuada correspondente, Inglevac MLV, e pVR-HN, o primeiro clone infeccioso de VR-2332, são listados na Tabela 4 (Nelsen e outros, J. Virol., 73: 270-80 (1999); Yuan e outros, Virus Res., 79: 189200 (2001); Nielsen e outros, J. Virol., 77: 3702-3711 (2003)). Tabela 4. Diferenças de nucleotídeo entre as cepas de PRRSV e clones infecciosos VR-2332. Apenas posições onde diferenças de nucleotídeo foram observadas são mostradas. Nucleotídeos que são representados na cepa VR-2332 são mostrados em caixas não sombreadas. Caixas em tonalidade clara representam diferenças de nucleotídeo que são únicas ao clone infeccioso, caixas de tonalidade média ressaltam aqueles nucleotídeos que são também observados em Ingervac® MLV e caixas que são de tonalidade mais escura indicam nucleotídeos únicos em suínos. Regiões que não foram sequenciadas são indicadas por uma barra inclinada.

*As bases negativas se referem àqueles nucleotídeos presentes no RNA após transcrição e derivados do promotor de RNA polimerase imediatamente a montante do polinucleotídeo infeccioso. Esses nucleotídeos promotor-derivados, tipicamente, não estão mais presentes em um polinucleotídeo infeccioso após ele ter sido passado 9 vezes.

[00074] Transcrição in vitro. O clone de cDNA foi linearizado através de clivagem com PacI, a qual corta a jusante da cauda de poli(A). Transcritos de RNA [análogo de m7G(5')ppp(5')G revestimento] revestidos foram produzidos usando o Kit mMESSAGE MACHINE® (Ambion) e uma proporção otimizada de 2:1 de análogo de revestimento metilado para GTP. aproximadamente 50 a 60 μg de RNA foram gerados a partir de 2 μg de padrão de DNA em 20 μl de mistura de reação. Aumento da proporção de análogo de revestimento para GTP reduziu substancialmente o rendimento de RNA. O RNA foi subseqüentemente purificado através de fenol ácido-clorofórmio, seguido por precipitação com isopropanol e ressuspenso em tampão TE isento de nuclease (pH de 8,0). RNA foi avaliado com relação à qualidade através de comparação de tamanho com o RNA viral de VR- 2332 do tipo silvestre sobre um gel de agarose de desnaturação com glioxal a 1% e quantificado através de espectrofotometria a OD26O.

[00075] Transfecção de células MARC-145. Um procedimento modificado foi gerado baseado na abordagem descrita por Nielsen (Nielsen e outros, (J. Virol, 77: 3702-3711 (2003)). Para transfecção, células MARC-145 foram cultivadas sobre lâminas com seis cavidades (2-3 x 105 células/ cavidade) em 3 ml de meio completo [EMEM suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS)] e, então, incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 20-24 horas, até aproximadamente 80% confluentes (Collins e outros, J. Vet. Diagn. Invest., 4: 117-126 (1992)). 4 μg de RNA transcrito in vitro diluído em 500 μl de Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Invitrogen) e 2 μl de brometo de 1,2- dimiristilóxipropil-3-dimetil-hidróxi etil amônio e colesterol (DMRIE-C; Invitrogen) diluído em 1 ml de meio Opti-MEM® foram combinados e submetidos a turbilhonamento rapidamente. As células MARC-145 foram lavadas uma vez com 2 ml de meio Opti-MEM® e, então, imediatamente colocadas em sobre-camadas com a solução de complexo de lipídio:RNA. DMRIE-C sem RNA (2 μl) foi usado como um controle negativo e DMRIE-C com 10 - 100 ng de RNA viral de cepa do ts (tipo silvestre) VR-2332 purificado foi usado como um controle positivo. Após 4 horas de exposição aos complexos de lipídio:RNA, as monocamadas foram lavadas e meio completo fresco (EMEM com FBS a 10%) foi adicionado. Os sobrenadantes de células transfectadas foram monitorados diariamente com relação ao aparecimento de efeito citopático (CPE) e passados sobre MARC-145 fresca a 72-96 horas pós-transfecção.

[00076] Detecção de RNA viral de prole. Para detectar RNA viral de prole, sobrenadante de cultura de célula de células MARC-145 transfectadas e infectadas foi coletado. RNA foi isolado com o Kit QiaAmp viral RNA (Qiagen). RT-PCR foi realizada com pares de iniciador selecionados, específicos para os nucleotídeos da cepa VR- 2332 que eram indicativos de resíduos de clone infeccioso com mutação (Tabela 3). Confirmação da prole de clone infeccioso foi obtida através de verificação da sequência de nucleotídeo de nucleotídeos clone-específicos presentes nos produtos de RT-PCR.

[00077] Detecção de proteína de nucleocapsídeo viral de prole. Ensaios de imunofluorescência indiretos (IFA) foram usados para detectar expressão de proteína viral em RNA transcrito in vitro transfectado ou células MARC-145 virus de prole-infectadas preparadas sobre lamínulas. As células infectadas foram fixadas em paraformaldeído a 3,7% com solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH de 7,5, em temperatura ambiente durante 10 minutos. As células fixadas foram lavadas com PBS, incubadas a 37°C durante 45 minutos em anticorpo monoclonal proteína de nucleocapsídeo de PRRSV-específico SDOW17 (Magar e outros, Can. J. Vet Res., 59: 232-234 (1995)) e ainda incubadas com imunoglobulina G anti- camundongo de cabra (IgG) conjugada com isotiocianato de fluoresceína a 37°C durante mais 45 minutos (diluição a 1:100) (Sigma). As lamínulas foram lavadas com PBS, montadas sobre uma lâmina usando óleo de montagem de gel e observadas sob um microscópio de fluorescência.

[00078] Ensaio de placa viral. Monocamadas de células MARC- 145 sobre lâminas com seis cavidades foram infectadas com o sobrenadante de célula (em diluições de 10-vezes) de células MARC- 145 transfectadas ou infectadas através de incubação em temperatura ambiente durante 1 hora. Monocamadas infectadas foram subseqüentemente lavadas uma vez com EMEM fresco/FBS a 10%, colocadas imediatamente com SeaPlaque Agarose a 1% estéril (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, Maine) em 1X MEM (Sigma M4144)/FBS a 10%/NaHCO3 a 2% (peso/v)/4X glutamina/1X aminoácidos não essenciais/HEPES a 10 mM/gentamicina a 2% (v/v) e incubadas a 37°C/5% de CO2, invertida, durante 5 dias. Após remoção cuidadosa da agarose, as células foram coradas com violeta cristal a 5% em etanol a 20% durante 10-30 minutos para visualização de tamanho de placa.

[00079] Curva de crescimento viral. Monocamadas de MARC-145 em frascos T-75 foram inoculadas com PRRSV precursor ou recombinante diluído em EMEM isento de soro em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,001. Após 1 hora de fixação em temperatura ambiente com ligeira mistura, os inóculos foram removidos e as monocamadas lavadas três vezes com EME isento de soro. Após lavagem, 4 ml de meio completo foram adicionados e os frascos foram subseqüentemente incubados durante até 5 dias a 37°C, 5% de CO2. Alíquotas (0,5 ml) foram coletadas imediatamente após a adição de meio (ponto de tempo 0 hora) e a 24, 48, 72, 96 e 120 horas e armazenadas a -800C. Diluições seriais das amostras foram usadas para infectar células MARC-145 frescas e as células, então, processadas conforme descrito acima. Após remoção de agarose, as placas foram visualizadas e contadas. Resultados da curva de crescimento foram expressos como PFU/ml.

[00080] Inoculação de vírus de prole in vivo. Dez porcos de 4 semanas de idade de cruzamentos e sexo misturados de um rebanho PRRSV-soro-negativo foram divididos em três grupos, cada um consistindo de dois animais. O primeiro grupo recebeu uma dose infecciosa de cultura tecidual a 50% de 103,5 (TCID50) de vírus clonado (pVR-V5, terceira passagem sobre células MARC-145) por ml, o segundo grupo recebeu uma TCID50 de 105,4 por ml de cepa de vírus precursora VR-2332 (quarta passagem sobre células MARC-145) e o terceiro grupo foi inoculado simuladamente com EMEM. Todos os animais receberam 2 ml de inóculo através de injeção intramuscular. Os animais foram mantidos em ambientes separados no decorrer do experimento e observados diariamente com relação aos sinais clínicos. Todos os porcos foram sacrificados no dia 28 pós-infeccção. Para recuperar vírus, amostras de soro individuais foram diluídas 5 vezes em EMEM incompleto e colocadas sobre monocamadas de MARC-145 fresca durante 1 a 2 horas em temperatura ambiente com ligeira agitação. Os inóculos foram, então, removidos e EMEM completo foi adicionado. Células infectadas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 e observadas diariamente. Uma vez que CPE era evidente, sobrenadantes de células infectadas foram congelados a -80°C até outra caracterização.

[00081] Análise de Northern Blot. Transcritos de pVR-V6G7475A foram transfectados em células MA104 e, então, passados sobre células frescas durante várias passagens. Para subseqüente análise de Northern blot, sobrenadantes da passagem 1 (P1), P3, P6, P8 e P10 foram diluídos a 1:50 e, então, usados para infectar células (1 ml/frasco T75) no mesmo dia. Ao mesmo tempo, soro de suíno infectado foi diluído 10 vezes e, então, usado (1 ml) para infectar um frasco T75 distinto. Efeito citopático foi observado no dia 3 p.i. para todos os frascos. RNA intracelular foi extraído usando um kit RNeasy Midi (Qiagen) e submetido à eletroforese (15 μg/amostra) sobre um gel de desnaturação de glioxal conforme descrito anteriormente (Nelsen e outros, J. Virol, 73: 270-80 (1999)). RNA de transcrito de pVR- V6G7475A (100 ng) foi passado como um controle. Após transferência de RNA para uma Membrana de Transferência de Náilon de 0,45 mícron MagnaGraph (Osmonics), a membrana foi hibridizada com oligonucleotídeo rotulado/1a-p222, a extremidade rotulada com y32-P- ATP (Amersham) usando quínase de polinucleotídeo (Promega) conforme descrito anteriormente (Nelsen e outros, J. Virol, 73: 270-80 (1999)).

[00082] Análise de sequência de ácido nucléico de vírus de prole. Amplificação rápida de 5'- e 3'- de extremidades de cDNA (RACE) foi realizada com o kit SMART® RACE cDNA Amplification (BD Bioscience) ou 5' ou 3'-FuIl Race Core Set (TaKaRa Bio Inc) sobre RNA viral isolado com o kit QIAmp®Viral RNA Mini (Qiagen). A sequência de nucleotídeo restante foi determinada a partir dos produtos de RT-PCR de pares de iniciador desenvolvidos para cobrir o genoma todo da cepa VR-2332 (Tabela 3), conforme descrito anteriormente (Yuan e outros, Virus Res., 79: 189-200 (2001)). Os produtos foram submetidos à determinação da sequência de ácido nucleico no Advanced Genetic Analysis Center na University of Minnesota. A sequência viral completa com uma cobertura de pelo menos três vezes foi inicialmente montada com o pacote SeqMan do software de análise de sequência Lasergene® (DNASTAR, Inc.) e ainda analisada usando o software GCG Wisconsin Package Versão 10.3 (Accelrys Inc.). A cepa VR-2332 (Acesso ao GenBank U87392), cepa Ingelvac® MLV (Acesso ao GenBank AF066183) e clone de cDNA pVR-HN (Acesso ao GenBank AY150564; Nielsen e outros, J. Virol., 77: 3702-3711 (2003)) foram usados em todas as comparações de nucleotídeo com as cepas de vírus recombinante. Resultados

[00083] Modificação do vetor pOK12. pOK12 (Acesso ao GenBank AF223639; Vieira e outros, Gene, 100: 189-194 (1991)), um vetor de clonagem de baixo número de cópia, foi modificado através de digestão com SmaI (sítio enzimático a 273 bp no pOK12) e SalI (sítio a 307 bp) e inserção do fragmento de SmaI-SalI de 244 bp do Vetor 2.0 (7) contendo a ribozima do delta vírus de hepatite (HDV). O vetor (pOK12HDV) foi, então, ainda modificado através de mutagênese de um sítio KpnI existente (sítio no pOK12HDV a 273 bp) para inserir um sítio de enzima de restrição PacI através do uso do par de iniciador 5'-pOK12HDV-257SphIPacI/3 '-pOK12HDV-257SphIPacI. A ribozima HDV foi adicionada para proporcionar clivagem eficaz precisamente na extremidade 3' do trato de poliA. Estudos revelaram que a modificação não era necessária para obtenção de vírus de prole infeccioso.

[00084] Construção de clones de cDNA de comprimento total. A estratégia de clonagem é representada na figura 2. Quatro fragmentos de genoma de sobreposição foram amplificados a partir de RNA viral de VR-2332 purificado através de RT-PCR usando os pares de iniciador indicados (Figura 2, Tabela 3). Cada fragmento foi individualmente clonado no vetor pCR®2.1-TOPO® para gerar o clone intermediário pCR-SphI-FseI (segmento I), pCR-FseI-AvrlI (segmento II), pCR-AvrlI-BsrGI (segmento III) e pCR-BsrGI-PacI (segmento IV). Os clones de cDNA foram, então, digeridos com duas enzimas de restrição únicas, conforme indicado pelo nome do clone. Quatro fragmentos foram purificados em gel e ligados gradualmente ao vetor pOK12HDV-PacI para gerar um clone de cDNA de comprimento total de PRRSV (pVR-V4). No clone de cDNA de comprimento total, a sequência genômica viral foi acionada através do promotor de RNA polimerase T7 e seguido por uma cauda de ácido poliadenílico de 50 nucleotídeos. Transcritos de RNA do clone pVR-V4 não mostram infectividade típica por PRRSV quando transfectados em células permissivas, embora RNA viral pudesse ser detectado após várias passagens. Quando de comparação com a cepa VR-2332, um total de 45 mutações de nucleotídeo (Tabela 4), levando a 21 alterações de aminoácido, foram detectadas (Tabela 5), embora várias fossem as mesmas conforme anteriormente identificado em Ingelvac® MLV (Yuan e outros, Virus Res., 61: 87-98 (1999)).

[00085] Tabela 5. Diferenças de aminoácido entre as cepas de PRRSV e clones infecciosos de VR-2332. Apenas posições onde diferenças de nucleotídeo não foram observadas são mostradas com a posição de aminoácido correspondente dentro da região genômica identificada. Aminoácidos que são representados na cepa VR-2332 são mostrados em caixas não sombreadas e identidades de aminoácido do clone infeccioso com VR-2332 são representadas em caixas em branco. O texto em cada caixa individual representa alterações silenciosas ou de aminoácido em virtude de diferenças de nucleotídeo mostradas na Tabela 2. Caixas de tonalidade clara representam diferenças de nucleotídeo que são únicas ao clone infeccioso, caixas de tonalidade média ressaltam aqueles nucleotídeos que são também observados em Ingelvac® MLV e caixas que são de tonalidade mais escura indicam nucleotídeos únicos de suínos. Aminoácidos separados por barras inclinadas indicam números de aminoácido da ORF2a/ORF2b. Regiões que não foram sequenciadas são indicadas por uma barra inclinada.

Continuação

[00086] Em virtude do fato de muitas mutações no pVR-V4 ocorrerem na região crítica que codifica a helicase putativa, polimerase e outros motivos de Nidovírus (Figura 3, Tabela 4), clones adicionais de segmento genômico III (pCR-AvrlI-BsrGI) foram gerados e sequenciados em sua totalidade. Após substituição do segmento III do pVR-V4 pelo fragmento de sequência mais preciso obtido, nós novamente determinados a sequência de nucleotídeo do clone de comprimento total genômico inteiro (pVR-V5). Exceto quanto à região substituída e quatro mutações espontâneas (nucleotídeos 1595, 13860, 14336 e 14404), esses dois clones genômicos eram idênticos (Tabela 4). Análise de sequência de pVR-V5 mostrou que esse clone abrigava um total de 23 mutações comparado com a cepa VR-2332. Dessas 23 alterações, apenas 8 mutações de nucleotídeo codificavam uma alteração no aminoácido e cinco das mutações de resíduo de aminoácido eram idênticas ao Ingelvac® MLV e, assim, não previstas como afetando adversamente a replicação in vitro (Tabela 4).

[00087] O clone pVR-V6 foi derivado a partir de mutagênese sítio- dirigida do segmento de genoma IV para reparar os nucleotídeos 13860 e 14979 usando os iniciadores 13860C2T/ e 14979A2G/, respectivamente. Mutação desses dois nucleotídeos corrigiria o resíduo de aminoácido 25 de GP5 (L'F) e o resíduo 31 da proteína de nucleocapsídeo (T'A). Análise de sequência do clone pVR-V6 confirmou que os nucleotídeos tinham sido corrigidos de volta para os nucleotídeos de VR-2332 do tipo silvestre (ts) e não tinham resultado em quaisquer outras alterações de nucleotídeo em qualquer parte no genoma quando comparado com pVR-V5 (Tabelas 4 e 5). Finalmente, mutagênese sítio-dirigida sobre o segmento de genoma III usando o oligômero 7475G2A foi completada em pVR-V5 e pVR-V6 de forma a corrigir uma alteração de VR-2332 do tipo silvestre no nt 7475. A alteração de G 'A no nt 7475 resultou em uma glicina (G) no aminoácido 2429 da ORF1 nos dois clones recombinantes ao ácido glutâmico (E) observado na cepa viral VR-2332 precursora. Os dois clones finais, pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A, foram novamente sequenciados em sua totalidade e descobriu-se que tinham sido alterados apenas (nt 7475) com relação aos plasmídeos recombinantes originais pVR-V5 e pVR-V6, respectivamente (Tabela 5). O pVR-V6G7475A, assim, contém 11 alterações de nucleotídeo e nenhuma de aminoácido com relação à cepa VR-2332, além daquelas também já observadas em Ingelvac® MLV.

[00088] Conforme pode ser observado esquematicamente na figura 3, para a estrutura final (pVR- V6G7475A) e detalhado nas Tabelas 4 e 5, todos os clones de comprimento total ainda possuem alterações de nucleotídeo dispersas através do genoma, primariamente nas regiões pobremente definidas da ORF1. Contudo, o grande agrupamento de alterações de nucleotídeo na ORF1b que presumivelmente impedia o pVR-V4 de completar a replicação viral, foi reparado em versões posteriores de clones com genoma de comprimento total. Apenas uma mutação de nucleotídeo (nt 11329 que codifica a mutação G3739A) permaneceu na ORF1b do pVR-V5 e clones posteriores e essa mutação não impede o Ingelvac MLV de infectar e se replicar eficazmente em células cultivadas. As Tabelas 4 e 5 também mostram a informação sobre resíduo para o clone infeccioso anteriormente publicado, pVR-HN (Nielsen e outros, J. Virol, 77: 3702-3711 (2003)), mostrado se replicando em animais. Há um aumento substancial no número de resíduos no pVR-HN (15 nucleotídeos) que mostram diretamente a sequência do Ingelvac® MLV com relação à estrutura final, pVR-V6G7475A (7 nucleotídeos).

[00089] Caracterização de vírus recombinante. Transcritos de RNA de comprimento total de cada clone de cDNA foram produzidos. Transfecção de células MARC-145 com os transcritos de cDNA ou RNA viral de VR-2332 do tipo silvestre (vRNA) resultou em CPE, caracterizado pelo agrupamento de células após lise, a 48 a 72 horas pós-transfecção. CPE causado pelos transcritos recombinantes era retardado e um pouco distinto comparado com aquele induzido pelo vRNA de VR-2332 do tipo silvestre, no qual CPE se apresenta como uma agregação vigorosa, desprendimento e ruptura. A 96 horas pós- transfecção, a maioria das células transfectadas com vRNA de VR- 2332 tinham sofrido lise e se desprendido da placa, enquanto que CPE menos severo era evidente em células transfectadas com os transcritos de RNA derivados in vitro clonados.

[00090] Vírus (P0) foi coletado das células transfectadas e uma alíquota (10 μl diluída para 1 ml em meio de cultura) foi usada para infectar células MARC-145 para amplificação de vírus de prole. Após CPE ser detectado, o vírus (P1) foi novamente coletado e uma alíquota usada para re-infecção de células MARC-145. Vírus recombinante no sobrenadante de célula (P2) foi utilizado para purificação de RNA viral o qual foi, então, usado para obter fragmentos de RT-PCR com os pares de iniciador 5'-6800/3'-ORF1b (nt 67967614) e P51/05P4 (nt 13757-14341). Os fragmentos de PCR obtidos foram submetidos à analise de sequência de nucleotídeo para confirmar se a infectividade observada era em virtude dos transcritos de RNA de comprimento total transfectados da estrutura infecciosa e não um resultado de contaminação em virtude do vírus do tipo silvestre. Mutações de nucleotídeo nos resíduos 7329, 7475, 7554 e 13860 e diferenças de nucleotídeo foram observadas no vírus de prole com relação ao pVR-V5 e 7329, 7554 e 13860 foram detectadas no vírus com relação ao pVR-V5G7475A. Similarmente, mutações nos resíduos 7329, 7475 e 7554 foram detectadas na prole pVR-V6 e mutações em 7329 e 7554 foram detectados em vírus resultantes de pVR-V6G7475A (Tabelas 4 e 5). Mutações correspondentes não foram observadas em vírus P2 com relação às transfecções de vRNA do tipo silvestre.

[00091] Análise por imunofluorescência de vírus recombinantes. Ensaios de imunofluorescência direta foram usados para detectar a expressão de proteína de nucleocapsídeo de PRRSV em células MARC-145 infectadas. Todas as células infectadas pelos transcritos de vírus recombinante (P2 e em diante), bem como vRNA eram positivos através desse método. Acúmulo nucleolar massivo da proteína de nucleocapsídeo era prontamente evidente, conforme anteriormente reportado por Rowland e outros (Virus Res., 64: 1-12 (1999)).

[00092] Infecção in vivo com vírus recombinante derivado de pVR-V5. Vírus recombinantes recuperados de P3 de células MARC- 145 transfectadas com transcritos de RNA do clone de cDNA pVR-V5 foram inoculadas em suínos jovens em paralelo com VR-2332 do tipo silvestre, vírus de vacina Ingelvac® MLV e solução salina (controle negativo). Amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 3, 5, 7, 14, 21 e 28 p.i. e analisadas com relação à soro-conversão através do ELISA HerdChek PRRS 2XR (IDEXX) e com relação à recuperação de vírus. No dia 28, todos os animais infectados tinham sido soro- convertidos com aproximadamente a mesma cinética, revelando que os vírus recombinantes pVR-V5 se replicaram bem in vivo (Figura 4). Sinais clínicos estavam ausentes de todos os animais durante o curso do experimento, mas isso não era inesperado, uma vez que a cepa VR-2332 do tipo silvestre freqüentemente não produz doença visível em suínos jovens e resulta em nódulos linfáticos inchados apenas transitoriamente, tipicamente no dia 14 p.i.

[00093] Uma amostra de soro de um animal infectado com prole de pVR-V5 (Sw612), tomada a 14 dias p.i., foi usada para infectar monocamadas de MARC-145 fresca para recuperação de vírus recombinante passado in vivo. Conforme descrito anteriormente, o vírus derivado de transfecção in vitro de transcritos de RNA de clone pVR-V5 causou apenas CPE mínimo (evidenciado através de agregação de células infectadas), enquanto que o vírus recuperado de soro a partir do dia 14 do animal de teste causou CPE típico (agregação celular, desprendimento e ruptura) a 96 horas pós- infecção. Isso sugeriu que um desvio no genotipo ou fenotipo viral tinha ocorrido enquanto o pVR-V5 se replicada in vivo.

[00094] De forma a elucidar a razão para a evidente alteração no fenotipo, análise de sequência de genoma total foi realizada sobre vírus recuperado de um porco (Sw612) e, então, passado uma vez em células MARC-145 para amplificar a prole Sw612 (Figura 3, Tabelas 4 e 5). Quando comparado ao vírus usado para infectar suínos, pVR-V5, 17 alterações de nucleotídeo de cDNA de clone infeccioso-específicas foram retidas no Sw612, algumas das quais também foram observadas em Ingelvac® MLV (7/17 nucleotídeos). Os dois resíduos de G não virais seguido por um resíduo de T presente na extremidade 5' do transcrito de clone pVR-V5 original não foram observados no vírus derivado de infecção in vivo. Degenerância foi observada nas posições de nucleotídeo 9958 (R), 14336 (Y) e 15411 (Y). O nucleotídeo (G) semelhante a VR-2332 do tipo silvestre na posição 9958 mostrou degenerância com um nucleotídeo (A) semelhante ao Ingelvac® MLV. Essa alteração resulta em uma mutação de um resíduo de glicina para um resíduo de ácido glutâmico, respectivamente (Tabela 2). Na posição 14336, degenerância foi detectada como uma base clone infeccioso-específica (C) e uma base VR-2332 do tipo silvestre-específica (T), o que refletia uma mutação silenciosa. Outra mutação (nt 7475) ocorreu, na qual um resíduo de G tinha sido convertido ao resíduo de A do tipo silvestre. Contudo, haviam mais 5 diferenças de nucleotídeo (nt 102, 827, 1379, 14686 e 15411) não observadas em qualquer um dos outros vírus nesse estudo. O nucleotídeo 102 está localizado na sequência líder, embora não seja traduzido. Contudo, se a sequência líder foi traduzida, a ORF codificada (nucleotídeos 1-100 do VR-2332) não seria estendida em um resíduo de aminoácido (W). As mutações nos resíduos 827 e 1379 levaram à mutações na ORF1a, em ambos os casos resultando em uma alteração de aminoácido da alanina codificada no VR-2332 do tipo silvestre por uma valina no Sw612. O resíduo de guanina no nt 7475 do pVR-V5 tinha sofrido mutação para adenina do tipo silvestre. Isso resultou em uma mutação de aminoácido G3294A não- conservativa, a qual está situada na ORF1 em um produto de clivagem de protease previsto NSP7 e essa região genômica não tem função definida até o momento. O nucleotídeo 14686, localizado na ORF6, mostrou uma alteração de uma guanina no VR-2332 do tipo silvestre para uma alanina em Sw612, a qual ainda codifica o aminoácido glicina. A outra alteração de um único nucleotídeo ocorreu muito na extremidade 3' da sequência viral (nt 15411), antes do início da cauda de poli A. Nesse caso, um resíduo de timina anteriormente conservado revelou degenerância com um resíduo de citosina. Essas alterações genéticas, embora informativas, não revelam imediatamente a(s) causa(s) da alteração no fenotipo de crescimento observado. Contudo, elas revelam a natureza errante da replicação de PRRSV in vivo e sugerem que uma sequência genômica viral moderadamente diferente do VR-2332 do tipo silvestre era capaz de se replicar eficazmente (figura 3).

[00095] Comparação de tamanho de placa viral. Determinações de tamanho de placa dos vírus recombinantes, bem como VR-2332 do tipo silvestre foram realizadas em paralelo sobre células MARC-145 a 120 horas p.i. (figura 5A). A cepa VR-2332 formou placas com um tamanho médio de 3 mm, enquanto que a prole da passagem 3 de clone de cDNA de pVR-HN formou placas ligeiramente menores (média de 2,5 mm). Em contraste, apenas placas minúsculas foram obtidas com vírus recombinantes derivados de pVR-V5 e pVR-V6 e essas eram apenas prontamente evidentes através de exame com microscópio (figura 5A). Vírus recombinante recuperado dos clones pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A formou, em média, placas de 1,5 mm e 2 mm, respectivamente. Contudo, em outro ensaio, as placas produzidas pela prole viral (Sw612) recuperada de infecção in vivo de virus recombinante derivado de VR-FLV5 eram muito maiores, de tamanho e número aproximadamente iguais àquelas derivadas de VR- 2332 do tipo silvestre (figura5B).

[00096] Apenas volumes mínimos dos sobrenadantes de célula contendo cada vírus recombinante restaram. Portanto, de forma a examinar totalmente o papel da alteração de nucleotídeo na determinação do tamanho de placa, nós transfectamos transcritos de RNA frescos produzidos a partir de pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A em células MARC-145 (denominadas segunda linhagem). Vírus de prole da passagem 3 de cada clone infeccioso em 5 dias pós-infecção foram novamente analisados com relação ao tamanho de placa em comparação com VR-2332 do tipo silvestre, VR- HN e vírus Sw612. Em contraste ao ensaio de placa anterior, todos os tamanhos de placa pareciam similares, com os vírus recombinantes obtidos a partir de pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A apenas ligeiramente menores do que os vírus VR-2332 do tipo silvestre, Sw612 e pVR-V6G7475A derivados in vivo (figura 6A). Os vírus recombinantes, contudo, ainda não imitavam diretamente a infecção viral autêntica, conforme mostrado pelas titulações aproximadamente 10 vezes menores quando comparado com o VR-2332 do tipo silvestre ou ao vírus recombinante pVR-V5 que tinha sido passado através de suíno (Sw612) (figura 6B).

[00097] Análise de sequência de nucleotídeo das primeira e segunda linhagens de preparados virais. Análise de sequência de nucleotídeo limitada (em virtude de limitação quanto ao estoque de vírus) de vírus derivado de pVR-V5 da 3 passagem inoculado em suíno (V5-1-P3) e análise completa da sequência de nucleotídeo de vírus derivado de pVR-V5 da 3 passagem obtido acima (V5-2-P3) foram realizadas de forma a revelar a razão genética para as discrepâncias no tamanho de placa. Tais análises revelaram que os dois vírus V5 independentemente preparados diferiam quanto à sequência na extremidade 5' (Tabela 4). O vírus que tinha produzido placas minúsculas (V5-1-P3) não tinha nucleotídeos estranhos na extremidade 5', conforme mostrado na sequência de nucleotídeo da cepa VR-2332 do e outros, enquanto que aquele que produziu placas maiores (V5-2-P3) possuía 4 resíduos de timidina sem padrão no 5' término (Tabela 4). A sequência de nucleotídeo viral V5-1-P3 restante nós pudemos obter exatamente igual àquela do vírus V5-2-P3, bem como aquela do clone precursor. Contudo, análise completa de sequência do vírus V5-2-P3 revelou que o vírus mostrava degenerância de nucleotídeo em vários sítios genômicos. Descobertas similares foram obtidas quando de análise de regiões limitadas de vírus de segunda linhagem VR-FLV5G7475A-P3 e VR-FLV6G7475A- P3. Essas últimas duas proles de clone infeccioso mostravam diferentes 5 '-términos, bem como exibiam degenerância na sequência.

[00098] Curvas de crescimento viral. Determinações de curva de crescimento viral em uma etapa simultânea foram realizadas usando células MARC-145 e vírus da 3 passagem (segunda linhagem) (figura 7). Os vírus recombinantes recuperados de pVR-V5, pVR-V5G7475A, pVR-V6 e pVR-V6G7475A e pVR-HN mostraram taxas de crescimento viral em uma etapa similares, mas seus picos de replicação eram todos significativamente menores do que a cepa VR-2332 do tipo silvestre e Sw612, a prole in vivo de pVR-V5. Também, as taxas de replicação dos preparados de vírus recombinante derivados de pVR- V5, pVR-V6 e pVR-HN eram um pouco diminuídas quando comparado com o vírus derivado de pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A. Os dois últimos clones infecciosos codificam tão pouco quanto 13 e 11 diferenças de nucleotídeo, respectivamente, resultando em 2 e zero alterações de aminoácido, a partir da sequência do VR-2332 do tipo silvestre, além das alterações observadas no Ingelvac MLV. Esses dados, então, revelaram que vírus com tão pouco quanto 11 alterações de nucleotídeo com relação ao VR-2332 do tipo silvestre e sua prole atenuada Ingelvac MLV têm a replicação um pouco deficiente. Correspondentemente, as titulações resultantes de VR- 2332 do tipo silvestre e vírus Sw612 eram aproximadamente 6-15 vezes maiores do que aquelas dos vírus recombinantes que não tinham sido passados em suínos (figura 7).

[00099] Análise de Northern de vRNA. Foi mostrado que espécies de sgRNA de PRRSV defectivas, identificadas anteriormente como RNAs subgenômicos de heteróclito (latim: formas incomuns), são um constituinte de infecção por PRRSV e não podem ser separadas de genomas virais de comprimento total através de métodos padrão, tal como passagem em célula cultivada em baixas multiplicidades de infecção ou centrifugação em gradiente de sacarose (Yuan e outros, Virology, 275: 158-169; 30 (2000); Yuan e outros, Virus Res., 105: 75-87 (2004)). Para explorar se heteróclitos de PRRSV são ou não produzidos durante transcrição in vitro de clones de genoma de cDNA de comprimento total ou aparecem após subseqüente transfecção/infecção, análise de Northern blot foi realizada. O transcrito de RNA de comprimento total e as passagens 1, 3, 6, 8 e 10 do vírus produzido a partir de células MA- 104 transfectadas foram usados para inocular frascos T-75 frescos de células MA-104 com 10 μl de sobrenadante diluído a 1:100, bem como soro de Sw612 diluído a 1:10 (2 ml no total/frasco). Após 4 dias, RNA de PRRSV intracelular foi coletado e 15 μg de cada preparado foram separados por meio de eletroforese através de um gel de agarose de desnaturação e transfectados a uma membrana de náilon. Após ligação cruzada de RNA, a membrana foi hibridizada com uma sonda 32P -radiorrotulada complementar à extremidade 5 'da ORF1a que seleciona genomas de VR-2332 de comprimento total, bem como heteróclitos (1a-222; 29). Conforme mostrado na figura 8, o transcrito de RNA é principalmente uma única banda, migrando como vRNA de comprimento total, enquanto que espécies de RNA de PRRSV da passagem 1 e posterior migram como espécies de comprimento total e tamanho subgenômico previamente identificadas como heteróclitos. Além disso, a resistência de hibridização aumenta com a passagem. Uma vez que o vírus foi coletado de um volume igual de sobrenadante de célula no mesmo ponto de tempo, essa observação sugere que o vRNA se torna mais eficaz na replicação com o tempo. Por fim, quando de comparação do vírus gerado a partir de Sw612 com o vírus gerado em cultura de célula, o padrão de formação de banda de RNA é indistinguível, sugerindo fortemente que as espécies de RNA defectivas são prontamente formadas e replicadas in vitro, bem como in vivo e, assim, são uma parte natural de infecção por PRRSV. Discussão

[000100] Em teoria, um clone de cDNA de um vírus seria idêntico à sequência precursora de forma a gerar um sistema genético reverso que imita a infecção do tipo silvestre. Esforço considerável foi exercido para reproduzir o genoma da cepa VR-2332 de PRRSV totalmente exata, ainda em virtude de mutações espontâneas imprevistas em vários sítios, nós não pudemos obter sucesso na derivação de um clone infeccioso que não tivesse diferenças com relação à cepa VR-2332 do tipo silvestre sequenciada em nosso laboratório. DNA polimerases de alta fidelidade, usadas nesse estudo, estão disponíveis para diminuir mutações artificiais, mas tal mutação não pode ser evitada durante transcrição reversa (Malet e outros, J. Virol. Methods, 109: 161-70 (2003)). Além disso, o fato de que o PRRSV exibe evolução viral surpreendente e variação nas cepas (Chang e outros, J. Virol, 76: 4750-6 (2002); Murtaugh e outros, Adv. Exp. Med. Biol, 440: 787-94 (1998); Yoon e outros, Adv. Exp. Med. Biol, 494: 25-30 (2001)), ele se recombina prontamente em alta freqüência, para resultar em recombinantes intergênicos entre as cepas (Yuan e outros, Virus Res., 61: 87-98 (1999)), sofre recombinação intragênica para formar RNAs subgenômicos de PRRSV e heteróclitos (Nelsen e outros, J. Virol, 73: 270-80 (1999); Yuan e outros, Virology, 275: 158-169 (2000); Yuan e outros, Virus Research, 105: 75- 87 (2004)) e freqüentemente mostra degenerância de nucleotídeo em sítios de nucleotídeo imprevistos em isolados de campo serve para tornar esse objetivo inicial em algo que consome tempo e de ganho negligenciável. Acredita-se que uma estrutura de DNA infecciosa possuindo tão pouco quanto 11 mutações de nucleotídeo, quando comparado com a cepa VR-2332, fora dos domínios conhecidos por estarem envolvidos em replicação viral (extremidades 5' e 3', ORF1b) era suficiente para produção de vírus do tipo silvestre e os objetivos a jusante do clone infeccioso usado para estudos de estrutura:função e dúvidas sobre patogênese. O pVR-HN é mais similar ao Ingelvac® MLV na região do vírus que codifica o motivo de helicase (NSP 10). Comparação patogênica adicional desses dois clones infecciosos poderia fornecer uma luz sobre as diferenças entre a cepa precursora, VR-2332, e sua prole de cepa de vacina, Ingelvac®MLV.

[000101] Informação valiosa pode ser derivada da construção e avaliação dos clones infecciosos para a cepa VR-2332 de PRRSV. Primeiro de tudo, a cepa VR-2332 de PRRSV não pode tolerar todas as mutações para sobrevivência. Mutações de nucleotídeo ou aminoácido particulares podem ajudar ou impedir a replicação viral e o desafio é determinar quais são letais para a sobrevivência. No clone pVR-V4, o qual não produz vírions infecciosos, havia um total de quarenta e duas diferenças de nucleotídeo com relação à cepa precursora VR-2332 do tipo silvestre. Nessas quarenta e duas alterações de nucleotídeo, vários nucleotídeos resultam em mutações silenciosas (20 resíduos) ou existem em outras cepas de PRRSV conhecidas (9 mutações de resíduo de aminoácido imitam diretamente o Ingelvac® MLV), permitindo prever que essas alterações podem ser não-letais para a replicação do vírus. Onze alterações de nucleotídeo que levam a 12 alterações de aminoácido e duas mutações em nucleotídeo 3' UTR, cada uma não observada no Ingelvac® MLV, foram, assim, previstas como sendo letais para a cepa VR-2332 de PRRSV. Em pVR-V5 e estruturas posteriores, 19 alterações foram corrigidas, incluindo diversas mutações silenciosas e 9 alterações de aminoácido anormais não observadas no genoma do Ingelvac® MLV e 8 outras alterações observadas na cepa de vacina. Isso levou à primeira evidência de que as estruturas são infecciosas, embora em pVR-V5 duas mutações de aminoácido ainda estivessem presentes, uma das quais foi alterada através de mutagênese sítio-dirigida para produzir o pVR-V6. A alteração de aminoácido restante foi reparada no pVR-V5G7475A e pVR-V6G7475A, embora esses clones ainda abrigassem mutações silenciosas que não eram encontradas na cepa VR-2332 e na cepa de vacina derivada.

[000102] Várias observações únicas foram obtidas a partir desse estudo. Primeiro de tudo, cada linhagem de vírus produzido pode resultar em uma sequência 5' terminal única que não foi detectada na cepa VR-2332 do tipo silvestre. Não pode-se correlacionar ainda o tamanho de placa com a sequência de nucleotídeo. Em segundo, observou-se alterações únicas de nucleotídeo após replicação em suínos, o que pode refletir a natureza inerente da polimerase de PRRSV. Todas as alterações de nucleotídeo eram de natureza transitória e não exibiam uma tendência (5 A/G e 4 C/T). Embora a reversão G A no nucleotídeo 7475 fosse observada após passagem in vivo, não pode-se correlacionar esse sítio com o subseqüente tamanho de placa aumentado porque outras alterações sem padrão tinham ocorrido. Além disso, análise de sequência de genoma completo da passagem 3 de um vírus V5-derivado que produziu placas maiores (V5-2-P3) revelou uma sequência 5' terminal diferentes do vírus V5 que produz placas minúsculas usado para infectar suínos (V5-1-P3). Contudo, nós pudemos concluir que as mutações não eram letais para replicação do vírus porque esse vírus, após passagem em suínos, que produziu placas com tamanho do tipo silvestre sobre células MARC-145, cresceram quase que na mesma taxa que o vírus precursor (Figs. 5A, 6 e 7).

[000103] De interesse considerável é o fato de que análise de sequência da terceira passagem in vitro de V5, V5G7475A e V6G7475A parece sugerir que o complexo de replicase de PRRSV permite que transições freqüentes e transversão não freqüentes ocorram enquanto sofre replicação viral. Isso pode refletir uma replicase viral que evoluiu de modo a gerar novas formas genéticas de PRRSV e, então, avaliar sua competência com relação à outras variantes, resultando em um vírus otimamente "adaptado". Essas observações também foram notadas durante passagem sequencial de PRRSV in vivo (Chang e outros, J. Virol., 76: 4750-63 (2002)). Os esforços atuais de sequenciamento são para examinar os genomas de comprimento total das últimas passagens, quando uma replicação mais robusta é detectada. Finalmente, está claro agora que a replicase da cepa VR-2332 de PRRSV sintetiza prontamente heteróclitos ao mesmo tempo em que está produzindo vRNA de comprimento total. Essa cepa protótipo, isolada e caracterizada em 1992, pode ser única na aquisição gradual de adaptação de replicação, uma vez que outros investigadores que produziram clones infecciosos de cepas mais recentes não observaram o mesmo efeito (Truong e outros, Virology, 325: 308-319 (2004)). O papel da formação de heteróclito e o concomitante aparecimento de replicação viral vigorosa sugerem que há um papel vantajoso para heteróclitos na evolução do PRRSV. Exemplo 2

[000104] Muitos isolados virulentos de PRRSV aparentemente novo foram recentemente identificados no Estado de Minnesota, EUA. Análise da sequência de nucleotídeo da ORF5 e comparação com o banco de dados de PRRSV do University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory (>5000 isolados) revelou que os isolados eram de linhagem do Tipo 2, mas eram significativamente diferentes dos isolados anteriores. Além disso, eles eram mais intimamente relacionados àqueles isolados previamente observados no Canadá no início da década de 1990 (Mardassi e outros, J. Gen. Virol, 75: 681685 (1994)) e no Estado de Minnesota em 1998. Análise de Polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição (RFLP) da ORF5 também demonstrou que eles pertenciam ao mesmo grupo de vírus que aqueles dos casos anteriores, conhecidos como isolados 18-4 (Wesley e outros, J Vet. Diagn. Invest, 10: 140-144 (1998)) e, assim, foram denominados isolados MN184. Em virtude da dissimilaridade evidente com todos, menos um isolado de PRRSV MN anteriormente isolado, dois desses novos isolados foram amplificados apenas uma vez sobre macrófagos alveolares de suíno (PAM), a célula hospedeira, e análise de genoma de comprimento total foi realizada sobre os vírus, designados como MN184A e MN184B. Esses dois isolados foram coletados em diferentes momentos em duas fazendas distintas. Materiais e Métodos

[000105] Para sequenciar os isolados MN184, RNA viral (vRNA) foi extraído de sobrenadante de células infectadas com PRRSV com o kit QIAmp® Viral RNA Mini (Qiagen, Valencia, CA)) e RT-PCR foi realizada (kit de RT-PCR Qiagen® OneStep). Iniciadores (disponíveis sob encomenda) foram projetados baseado nas sequências publicadas de diferentes cepas de PRRSV depositadas no GenBank, bem como a sequência de MN184 recentemente gerada. A sequência de nucleotídeo 5' dos dois isolados de PRRSV foi derivada usando o kit 5'-FuIl RACE Core (TaKaRa Bio, Madison, WI). 3'-RACE foi realizada com o kit de Amplificação de cDNA SMART® RACE (Clontech, Mountain View, CA). Os produtos de RT-PCR foram purificados em gel (QIAquick®, Qiagen), clonados no vetor pGEM-T (Promega, Madison, WI) e 3 a 5 clones para cada produto de RT-PCR foram escolhidos para sequenciamento. A determinação de sequência de nucleotídeo foi realizada em ambas as direções com os iniciadores PCR-específicos ou o vetor codificado SP6 e iniciador de promotor T7. Os produtos foram enviados ao Advanced Genetic Analysis Center na University of Minnesota para determinação de sequência com um analisador de fragmento de DNA automático ABI 377. Uma sequência de qualidade representando uma cobertura de genoma de pelo menos três vezes foi obtida. Dados de sequência foram montados e analisados usando os programas de análise de sequência GeneTool (BioTools Inc., Edmonton, Alberta CA) e Lasergene (DNASTAR, Madison, Wis.).

[000106] Múltiplos alinhamentos de sequência foram gerados com CLUSTALX (Thompson e outros, Nucleic Acids Res., 24: 4876-4882 (1997)) ou Wisconsin Package Versão 10.3 (Accelrys Inc., San Diego, CA). Sequências de PRRSV de comprimento total foram alinhadas usando o ClustalX (versão 1.83.1; matriz de peso de DNA IUB, penalidade por gap de 15,00, penalidade por extensão de gap de 6,66). O alinhamento resultante foi ainda analisado usando o Wisconsin Package Versão 10.3 Distances Program (método de distância de Jukes-Cantor, equivalências parciais em virtude de símbolos degenerados consideradas). Para a figura 10, as sequências foram alinhadas com o programa Pileup do Wisconsin Package (Matriz de Escore Blosum62, Peso por Gap = 8, Peso por Extensão = 2, Extremidades Sobrecarregadas). O alinhamento foi classificado com relação à redundância e colorido para identidade percentual usando Jalview (Clamp e outros, Bioinformatics, 12: 426-427 (2004)) e, então, transferido para o Adobe® Photoshop® CS, versão 8.0, para transformação em escala de cinza. Para a figura 11, as sequências foram alinhadas com o programa Pileup do Wisconsin Package (Matriz de Escore Blosum62, Peso por Gap = 8, Peso por Extensão = 2, Extremidades Sobrecarregadas). Para a figura 12, um peptídeo sinalizador foi previsto usando o servidor SignalP (Bendtsen e outros, J. Mol Biol., 340: 783-795 (2004)). As regiões transmembrana foram derivadas através do PHDhtm (Rost e outros, Protein Sci., 5: 17041718 (1996)) e sítios de N-glicosilação potenciais foram identificados através do PROSITE (Bairoch e outros, Nucleic Acids Res., 25: 217221 (1997)) usando o servidor PredictProtein (Rost e outros, Nucleic Acids Res., 32: W321-W326 (2003)). As sequências foram alinhadas com o programa Pileup do Wisconsin Package (Matriz de Escore Blosum62, Peso por Gap = 8, Peso por Extensão = 2, Extremidades Sobrecarregadas). Resultados

[000107] Alinhamento genômico demonstrou que esses dois PRRSV eram muito distintos (dissimilaridade de nucleotídeo > 14,5%) com relação a outros genomas sequenciados de comprimento total do Tipo 2 Norte Americano, comparação adicional com sequências de comprimento total do Tipo 1 (Europeu) confirmaram que os isolados eram unicamente originários de genotipo do Tipo 2, uma vez que eles eram apenas aproximadamente 59% similares a nível de nucleotídeo às cepas de PRRSV Euro e Lelystad. Visivelmente, esses isolados MN184 do Tipo 2 representavam os genomas de PRRSV mais curtos detectados até o momento (15019 nucleotídeos, não incluindo a cauda de poli A). Além disso, nenhuma área específica foi discernida que sugeria que esses isolados eram derivados de recombinação viral entre as cepas do Tipo 1 e do Tipo 2.

[000108] Análise de sequência de comprimento total revelou que os dois isolados MN184 eram realmente distintos geneticamente. Eles compartilhavam 98,0% de similaridade de nucleotídeo ou uma diferença de 2%. Esse percentual de dissimilaridade era inesperado em virtude de seu súbito aparecimento simultâneo em Minnesota, sem nenhum isolado recente relacionado observado em nosso banco de dados de PRRSV nesse momento. A Tabela 6 apresenta a comparação de nucleotídeo e aminoácido detalhada entre os dois isolados e a figura 9 representa as diferenças de aminoácido observadas entre essas duas cepas. Ambos esses isolados possuíam degenerância de nucleotídeo em várias regiões do genoma, predominantemente na região de nsp2 prevista da ORF1 (Tabela 6). O fato de que a degenerância de nucleotídeo foi observada nesses isolados sugere que o PRRSV pode ser composto de até várias espécies individuais, freqüentemente referidas como um rebanho de sequências virais relacionadas, mas distintas, dentro de animais infectados. Tabela 6. Análise detalhada de regiões genômicas de PRRSV e proteínas traduzidas e número de bases degeneradas detectadas em cada região. Degenerância é definida como mais de um nucleotídeo detectado para uma base em particular em arquivos de rastreamento distintos de três ou mais arquivos de rastreamento.

. copiar dados da tabela

[000109] De forma a destacar mais precisamente as regiões individuais desses isolados MN184 que mostraram a maior dissimilaridade com relação à outras cepas de PRRSV e atribuir a(s) região(ões) que contava(m) para a diferença no comprimento do genoma viral do Tipo 2, esses dois isolados foram comparados com a sequência da cepa VR-2332 do Tipo 2 protótipo. As diferenças entre os dois isolados puderam novamente ser discernidas, com o isolado MN184B possuindo similaridade ligeiramente aumentada à cepa VR- 2332 do que o isolado MN184A. As comparações de nucleotídeo e aminoácido com a VR-2332 mostraram que regiões individuais do isolado MN184 variavam de 81,5-94,7% e 78,4-100%, respectivamente, mas as regiões correspondendo à ORF5 (86,486,7% e 87,0-87,5%, respectivamente), nsplβ prevista (83,8-84,0% e 84,8-85,4%, respectivamente) e nsp2 (81,5-85,5% e 78,4-79,5%, respectivamente) eram as mais variáveis. Mais interessante era que apenas a região genômica de nsp2 prevista mostrou uma diferença no comprimento de nucleotídeo e que ambos os isolados MN184 possuíam a mesma deleção na nsp2, detalhada abaixo. A comparação também revelou que as 5' e 3' UTR's eram as regiões mais conservadas do genoma (94,7% e 94,0%, respectivamente), indicando conservação de sequência em regiões importantes para replicação e transcrição viral.

[000110] ORF5 codifica uma proteína estrutural de PRRSV heterogênea (GP5) e é usada para identificação diagnóstica de PRRSV (Kapur e outros, J. Gen. Virol, 77: 1271-1276 (1996)). A GP5 é uma proteína transmembrana prevista com um endodomínio e um ectodomínio. O ectodomínio de 30 aminoácidos é composto de um domínio altamente conservado curto usualmente contendo pelo menos dois sítios de N-glicosilação ligados por duas regiões hipervariáveis. Foi mostrado que o domínio altamente conservado dessa região de 30 aminoácidos codifica o epítopo de fixação viral em cepas do Tipo 2 (Plagemann, Virology, 290: 11-20 (2001); Ostrowski e outros, J. Virol, 76: 4241-4250 (2002); Plagemann e outros, Arch. Virol, 147: 23272347 (2002)). GP5 do mesmo conjunto de genomas de comprimento total, bem como dos isolados RFLP 184 originais identificados no Canadá (IAF-93- 653, IAF-Klop) e em 1998-1999 em Minnesota (983298, 98-3403, 99-3584) foram alinhadas (figura 10). O alinhamento de GP5 de PRRSV revelou identidades de aminoácido oscilando de 82,5% a 87,7% entre os novos isolados MN184 e outras cepas do Tipo 2 de não-RFLP184. De modo interessante, as diferenças de aminoácido entre os novos isolados MN184 e os isolados RFLP184 mais antigos eram muito grandes (5,7% - 12,2%) e, assim, nós não detectamos a origem clara do novo vírus RFLP184. O alinhamento limitado mostra que a maioria das diferenças de aminoácido observadas eram encontradas nas regiões hipervariáveis (figura 10). Os dois sítios de N-glicosilação conservados foram mantidos nos isolados MN184, exceto quanto à degenerância de nucleotídeo detectada que codifica o aminoácido 44 no isolado MN184B.

[000111] Nsplβ codifica uma protease de cisteína semelhante à papaína (den Boon e outros, J. Virol, 69: 4500-4505 (1995)). Um alinhamento de aminoácido dos isolados MN184 com um conjunto não redundante de sequências de nsp1β do Tipo 2 disponíveis, bem como cepas de PRRSV Euro e Lelystad do Tipo 1 foi realizado (figura 11). A proteína nsp1β possui uma série de aminoácidos completamente conservados e os resíduos catalíticos propostos foram mantidos em todos os genomas sequenciados (den Boon e outros, J. Virol, 69: 4500-4505 (1995)). O alinhamento, ordenado através da similaridade de aminoácido, indica que os isolados MN184 são mais similares às cepas do Tipo 1 do que às outras sequências do Tipo 2 de comprimento total sequenciadas. Contudo, os aminoácidos que eram conservados nas outras sequências do Tipo 2 não redundantes também eram principalmente conservados nos isolados MN184, mas aminoácidos dispersos e a similaridade de aminoácido (84,8-85,4%) revelaram uma proteína do Tipo 2 divergente que tinha sido evidenciada até hoje. Assim, o alinhamento ainda define resíduos mantidos da nsplβ que podem ser críticos para o ciclo de replicação do PRRSV.

[000112] Um alinhamento de aminoácido de sequências não redundantes de nsp2, ordenadas através da identidade de pares, é mostrado na figura 12. Um domínio de protease de cisteína (PL2) semelhante à quimotripsina está presente no N-término, anteriormente previsto através de alinhamento com a nsp2 do vírus da arterite de eqüino (EAV) (Snijder e outros, J. Gen. Virol, 79: 961-979 (1998); Ziebuhr e outros, J Gen. Virol, 81: 853-879 (2000)). Existem 3-4 domínios transmembrana previstos próximo do C término dessa proteína (McGuffin e outros, Bioinformatics, 16: 404-405 (2000)), mas o sítio de clivagem C terminal exato não foi empiricamente determinado. Duas previsões do sítio de clivagem C terminal foram propostas, um G|G no aminoácido 980 da nsp2 de VR-2332 (Allende e outros, J Gen. Virol, 80: 307-315 (1999)) e o outro no aminoácido 1197 (Ziebuhr e outros, J. Gen. Virol, 81: 853-879 (2000)), mas existem várias duplas G|G completamente conservadas dentro dessa proteína (aminoácidos 646, 980, 1116, 1196, 1197 da nsp2 de VR-2332; setas descendentes na figura 12). Trabalho anterior também tinha mostrado que a proteína nsp2 prevista é rica em prolina e contém múltiplos epítopos potenciais de células B (Oleksiewicz e outros, J. Virol, 75: 3277-3290 (2001); Fang e outros, Virus Res., 100: 229-235 (2004); Ropp e outros, J. Virol, 78: 3684-3703 (2004)). A grande região mediana da nsp2 de PRRSV (aminoácidos 148-880 de nsp2 de VR- 2332) não tem função atribuída, mas é altamente variável quanto ao comprimento. Além disso, a diferença no comprimento entre as cepas de PRRSV do Tipo 1 e Tipo 2 foram mapeadas nessa região mediana variável da nsp2 (figura 12). Até agora, foi mostrado que genomas do Tipo 1 sequenciados são 313-364 bases mais curtos do que o PRRSV do Tipo 2 (Meulenberg e outros, Virology, 192: 62-72 (1993); Fang e outros, Virus Res. , 100: 229-235 (2004), Ropp e outros, J. Virol., 78: 3684-3703 (2004)). Contudo, o múltiplo alinhamento de sequência estabeleceu que o genoma do MN184 contém a nsp2 mais curta prevista até o momento (2547 bp), 393 bp mais curta do que a cepa VR-2332 do Tipo 2 protótipo. Além disso, ele continha três deleções descontínuas na proteína traduzida com tamanhos de deleção consistindo de 111, 1 e 19 aminoácidos, respectivamente, correspondendo às posições de aminoácido na nsp2 da cepa VR-2332 de PRRSV de 324-434, 486 e 505-523, respectivamente (figura 12). As três deleções resultaram na perda de vários resíduos de prolina e epítopos de células B previstos. Além dessas deleções, alterações significativas na sequência de aminoácido da nsp2 com relação à outras cepas do Tipo 2 também foram observadas, algumas vezes correspondendo ao aminoácido do Tipo 1 observado na mesma posição relativa (figura 12).

[000113] Comparação da proteína prevista nsp2 dos dois genotipos de PRRSV demonstrou que a identidade de aminoácido dentro de vírus do Tipo 2 oscilava de 66% a 99% e de 88-90% dentro de vírus do Tipo 1, mas diferiam grandemente entre os genotipos (similaridade <45%). Em particular, os isolados MN184 mostraram 66-80% de identidade de aminoácido a todas as proteínas previstas nsp2 do Tipo 2 e apenas 43-45% de identidade às cepas do Tipo 1. Quando de inspeção do múltiplo alinhamento de sequência na figura 12, também notou-se que todos os casos de inserção ou deleção em ambos os genotipos ocorreram nessa região mediana hipervariável. Até esse ponto, Shen e outros (Arch. Virol., 145: 871-883 (2000)) primeiro reportaram que a cepa SP do Tipo 2 Norte Americana de PRRSV tinha uma inserção única de 36 aa com relação à posição entre o aa 813 e 814 da nsp2 de VR-2332 de PRRSV. Outro investigador descobriu uma deleção única de 12 aa na posição 466-477 na nsp2 do isolado HB-2(sh)/2002 de PRRSV (Gao e outros, Arch. Virol., 149: 1341-1351 (2004)). Uma deleção de 17 aa ocorreu em isolados de PRRSV semelhantes ao Europeu recentemente identificados quando comparado com a cepa LV (Fang e outros, Virus Res., 100: 229-235 (2004); Ropp e outros, J. Virol, 78: 3684-3703 (2004)). Os casos de mutação não ocorriam consistentemente ao longo do mesmo trecho de aminoácidos, embora as deleções fossem observadas entre os isolados MN184 e outros vírus do Tipo 2 abrangessem a maioria das maiores deleções detectadas entre PRRSV do Tipo 1 e outros do Tipo 2. Todos esses dados sugerem que a ORF de nsp2 contém um motivo de protease conservado e regiões abrangendo a transmembrana previstas que podem ser necessárias para replicação de PRRSV, mas é altamente suscetível à mutação na grande seção mediana.

[000114] O súbito aparecimento de isolados no campo de PRRSV em Minnesota refletindo o padrão 184 RFLP ainda é um mistério, mas as consequências desse evento estão sendo agora obtidas. O Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory agora realiza sequenciamento de rotina sobre isolados de 184 RFLP similares de aproximadamente um quarto do número total de requisitos de sequência de ORF5. Além disso, o padrão 184 RFLP foi agora detectado não apenas em Minnesota, mas em Iowa, Wisconsin, Dakota do Sul, Kansas, Missouri, Illinois, Nebraska, Kentucky, Oklahoma e Wyoming também. Escolheu-se derivar as sequências de comprimento total de dois isolados em virtude da necessidade de compreender se esses poderiam ser mais do que um simples tipo de vírus e o fato de que o rebanho de suínos diagnosticado com o isolado MN184A apresentada um caso mais brando de PRRS do que o rebanho infectado com isolado MN184B, conforme reportado pelo patologista que fez o atendimento. As cepas não foram inoculadas em animais naive para verificar as apresentações do caso, mas é interessante notar que o isolado MN184B tinha muito mais degenerância de nucleotídeo detectada quando de análise do genoma e isso poderia refletir a gravidade da doença reportada.

[000115] Essa análise de genoma aumentou a compreensão da imensa variação de sequência de nucleotídeo e aminoácido que existe no campo. Fatores que acionam essa variação podem estar relacionados à forma pela qual os suínos são criados, ao transporte interestadual e internacional de suínos e sêmen do varão, à intermistura de diferentes isolados de PRRSV dentro dos rebanhos e à natureza do vírus em si. Geração de sequência de genoma completo também nos permite monitorar onde a variação de genoma é tolerada e quais regiões são mais conservadas. Como um resultado desse estudo, bem como uma publicação anterior (Ropp e outros, J. Virol, 78: 3684-3703 (2004)), um quadro está emergindo que indica que a nsp2, nsplβ e ORF5 são proteínas extraordinariamente versáteis.

[000116] Esse estudo também proporcionou evidência clara de que o tamanho da nsp2 não pode mais ser usado para diferenciar entre os dois genotipos de PRRSV. A nova descoberta de que a nsp2 evoluiu para mostrar um genoma do Tipo 2 com três deleções descontínuas, levando ao genoma mais curto até hoje (15.019 kb) sugere que o PRRSV pode estar evoluindo para eliminar regiões genômicas dispensáveis e tornar o genoma mais compacto. Finalmente, embora o significado de variações genéticas no PRRSV possam ser apenas supostas no presente, a alteração evolucionária observada na ORF5, nsp1β e nsp2 estaria razoavelmente relacionada à adaptação biológica do PRRSV durante pressão de seleção.

[000117] A descrição completa de todas as patentes, pedidos de patente e publicações e material eletronicamente disponível (incluindo, por exemplo, submissões de sequência de nucleotídeo, por exemplo, no GenBank e RefSeq, e submissões de sequência de aminoácido, por exemplo, no SwissProt, PIR, PRF, PDB e traduções de regiões de codificação anotadas no GenBank e RefSeq) citados aqui são incorporados por referência. A descrição detalhada precedente e exemplos foram fornecidos para clareza de compreensão apenas. Nenhuma limitação desnecessária deve ser depreendida dos mesmos. A invenção não está limitada aos detalhes exatos mostrados e descritos, uma vez que variações óbvias para aqueles versados na técnica serão incluídas dentro da invenção definida pelas reivindicações.

[000118] A menos que de outro modo indicado, todos os números expressando quantidades de componentes, pesos moleculares e assim por diante usados na especificação e reivindicações devem ser compreendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo "cerca de". Conseqüentemente, a menos que de outro modo indicado ao contrário, os parâmetros numéricos apresentados no relatório descritivo e reivindicações são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se deseja obter pela presente invenção. No máximo, e não como uma tentativa de limitar a doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro número deverá ser construído pelo menos à luz do número de dígitos significativos reportados e através de aplicação de técnicas comuns de arredondamento.

[000119] Não obstante o fato de que as faixas numéricas e parâmetros apresentado o amplo escopo da invenção sejam aproximações, os valores numéricos apresentados nos exemplos específicos são reportados tão precisamente quanto possível. Todos os valores numéricos, contudo, contêm inerentemente uma faixa necessariamente resultante do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de testagem.

[000120] Todos os cabeçalhos são para a conveniência do leitor e não deverão ser usados como limitando o significado do texto que segue ao cabeçalho, a menos que assim especificado.

Claims

1. Polinucleotídeo infeccioso isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 1 e uma deleção de pelo menos 57 nucleotídeos consecutivos correspondendo aos nucleotídeos 2305-2637 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 23052904 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 2962-3231 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 3232-3513 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 2962-3513 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 3514-3774 de SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 2305-3513 de SEQ ID NO: 1, em que o polinucleotídeo apresenta um polinucleotídeo exógeno inserido na região deletada.

2. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo apresentando a SEQ ID NO: 1 e uma pelo menos uma deleção de pelo menos 57 nucleotídeos consecutivos correspondendo aos nucleotídeos 2305-2637 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 2305-2904 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 29623231 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 3232-3513 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 2962-3513 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 3514-3774 de SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 2305-3513 de SEQ ID NO: 1, em que o polinucleotídeo apresenta um polinucleotídeo exógeno inserido na região deletada, e em que o polinucleotídeo se reproduz e produz partículas virais infecciosas quando introduzido em uma célula.

3. Clone infeccioso, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 1 e pelo menos uma deleção de pelo menos 57 nucleotídeos consecutivos correspondendo aos nucleotídeos 2305-2637 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 2305-2904 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 2962-3231 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 3232-3513 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 2962-3513 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 3514-3774 de SEQ ID NO: 1, ou nucleotídeos 2305-3513 de SEQ ID NO: 1, em que o polinucleotídeo apresenta um polinucleotídeo exógeno inserido na região deletada.

4. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está presente em um vetor.

5. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou clone infeccioso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende 2 ou mais deleções e em que cada deleção é independentemente pelo menos 37 nucleotídeos consecutivos.

6. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está presente em uma partícula viral infecciosa.

7. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é um polinucleotídeo de RNA.

8. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, 2, ou clone infeccioso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está presente em uma célula.

9. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou clone infeccioso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que um promotor de RNA polimerase é operacionalmente ligado ao polinucleotídeo.

10. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou clone infeccioso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um marcador detectável.