JP7129978B2 - 豚繁殖・呼吸障害症候群(prrs)ウイルスの欧州株に対抗する離乳前の効果的なワクチン接種 - Google Patents
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Description
(a)(1)欧州型PRRSウイルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列であって、当該コードDNA配列は配列番号5であるか、または配列番号5と少なくとも85%同一であるコードDNA配列、及び(2)当該好適な宿主細胞において当該感染性RNA分子をコードする当該DNA配列の転写を誘導することができるプロモーターを含む、プラスミド;ならびに
(b)感染性PRRS RNA分子であって、欧州型PRRSウイルスをコードする当該感染性PRRS RNA分子をコードするDNA配列を含むプラスミドのin vitro転写により産生され、プラスミドの当該コードDNA配列は配列番号5であるか、または配列番号5と少なくとも85%同一であるコードDNA配列である、感染性PRRS RNA分子からなる群から選択され、
(a)及び(b)の場合に、配列番号5と少なくとも85%同一であり、参照配列と比較して1つ以上の特有の変異を含んでいるコード配列が使用される組成物を好適な真核宿主細胞にトランスフェクトすることを含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象物を包含する。したがって、例えば、「方法」への言及は、本開示などを読めば当業者には明らかであろう本明細書に記載の種類の1つ以上の方法及び/または工程を含む。
特定の遺伝子改変株が弱毒化されていることを実証するには、以下に記載される実験を用いることができる。
a)死産の頻度
b)妊娠112日目またはそれ以前の流産
c)ミイラ化した子ブタの数
d)あまり元気がなく、弱った子ブタの数
e)離乳前の死。
f)雌ブタ1頭あたりの離乳子ブタ数
g)雌ブタ1頭あたりに出生した健康な子ブタの生存数。
これらの試験で使用されたBHK21-C12-26細胞株の親であるBHK21-C12細胞株の作製は、US9,102,912に以前に記載された。この特許では、BHK21-C12細胞株を実施例14及び図6においてBHK/CMV/v1#12と呼んでいる。簡潔には、一般的に使用されているベビーハムスター腎臓細胞株BHK-21にプラスミドpCMV-susCD163v1をトランスフェクトした。このプラスミドは、CMVプロモーターの制御下にある、ブタ(sus)CD163 PRRSV受容体遺伝子の短縮型変異体(v1)を含んでいる。このプラスミドはまた、それぞれE.coli及び哺乳動物細胞の選抜に用いる、原核生物/真核生物の二重プロモーターの制御下にあるカナマイシン/ネオマイシン耐性遺伝子を含む。トランスフェクション後、96ウェルプレート中でG418(Geneticin、ネオマイシン類似体)を用いた同時選抜及び単一細胞クローニングを細胞に施した。得られたクローンから、先で使用する1つ(#12、すなわち「C12」)を選択し、BHK21-C12と命名した。
PK-9細胞は、ブタCD163遺伝子の欠失型及びネオマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドをPK0809ブタ腎臓細胞株に安定的にトランスフェクトすることによって誘導されるトランスジェニック細胞株である。PK-9細胞株の構築及び特性決定の詳細は以前に記載されている(米国特許第9,102,912号を参照)。
本試験の目的は、1日齢で筋肉内経路(IM、群T02)または鼻腔内経路(IN、群T03)によりワクチン接種を受け、続いてワクチン接種後26週で別の欧州型のPRRSV分離株により呼吸器に攻撃接種されたブタにおいて、欧州型PRRS改変生ワクチン(配列番号5によりコードされるウイルス)の免疫持続期間(DOI)を評価することであった。有効性を決定する際の主要変数は、T01ブタと比較した処置群T02及びT03の血清中のウイルス量(ウイルス血症)であった。副次変数として肺病変、直腸温、排菌、臨床徴候、及び体重を比較した。
出生直後、子ブタを無作為化し、可能な限り均等にすべての雌ブタにまたがるように子ブタを交叉哺育した。離乳時に雌ブタを離し、子ブタを供給元農場の畜舎に収容した(1つの処置につき1畜舎)。
動物に関する特定のパラメーターは以下の通りである。
0日目に、目標力価(2.5log10CCID50/2mL)になるように、IVPをワクチン希釈液(ロットT22019)で希釈した。1アリコートのIVPを採集してBHK-21-C12-26細胞に滴定し、投与量を確定した。追加のIVP試料は凍結し(-80±10℃)、保持試料として保存した。現地の標準手順に従って、BHK-21-C12-26細胞に滴定を実施した。再構成され希釈されたワクチンの力価は101.9CCID50/mlであり、これは102.2CCID50/2mL(2.2log10CCID50/2ml)に相当する。0日目に、目標力価(2.5log10CCID50/2mL)になるように、IVPをワクチン希釈液(ロットT22019)で希釈した。1アリコートのIVPを採集してBHK-21-C12-26細胞に滴定し、投与量を確定した。追加のIVP試料は凍結し(-80±10℃)、保持試料として保存した。現地の標準手順に従って、BHK-21-C12-26細胞に滴定を実施した。再構成され希釈されたワクチンの力価は101.9CCID50/mlであり、これは102.2CCID50/2mL(2.2log10CCID50/2ml)に相当する。対照品(CP)をワクチン希釈液(生理食塩水溶液)で希釈し、4.0mL(2.0mL IM+2.0mL IN)にして投与した。
力価105.7CCID50/2mLのOlot/91ウイルスを含む攻撃接種物質を両鼻孔に1.0mLずつ注入することにより、全ブタに総攻撃量2.0mLで鼻腔内(IN)攻撃接種した。
ワクチン接種前(D0)及び攻撃前(D181)、全ブタの血清はRT-qPCRでPRRSV陰性であった。攻撃接種後、T01群のブタの100%が185日目にウイルス血症になり(攻撃接種後3日、DC+3)、試験終了時まで陽性のままであった。ワクチン接種群では、ブタの100%(T02群)及び88%(T03)が同じくDC+3で陽性であった。しかしながら、両方のワクチン接種群における陽性ブタの比率は時間とともに減少し、DC+8及び剖検日(DN)には対照群T01と比較して有意に低くなった。
攻撃接種前(D181)に、全ブタの鼻腔スワブはRT-qPCRでPRRSV陰性であった。攻撃接種後、T01のブタはすべて鼻腔排菌者になっていた。ワクチン接種群では、鼻腔経路でこれまで排菌したブタの比率は94%(T02群)及び88%(T03群)であった。T01群との比較では、T03群に185、188、及び191/192日目(DC+3、DC+6、及びDN)で、T02群に191/192日目(DN)で鼻腔排菌者の比率に有意な減少が観察された。ワクチン接種群間で鼻腔排菌者の比率に有意差は検出されなかった。鼻腔経路によって排菌されたウイルス量は、DC+6及びDNのT02群と比較して、及びDC+3、DC+6、及びDNのT03群と比較して、T01群で有意に多かった。ワクチン接種群間の比較から、DC+3で、T03と比較してT02群に有意に高いウイルス力価が認められた。攻撃接種後10日間の鼻腔排菌の結果を表2にまとめている。
攻撃接種前(D181)に、全ブタの口腔スワブはRT-qPCRでPRRSV陰性であった。攻撃後、口腔経路でこれまで排菌したブタの比率は、T01群、T02群、及びT03群でそれぞれ9/20(45%)、8/18(44%)、及び7/17(41%)であった。試験終了時までに、T02群の全ブタと、T03群の1頭を除くすべてのブタが口腔スワブで陰性であった。対照群T01では、その時点で5/20がまだ陽性であった。T01とT02との間の口腔排菌者の比率には、試験終了時(DN)に統計的有意差があった。口腔経路によって排菌されたウイルス量は、剖検日(攻撃接種後9/10日に相当)でT03群と比較してT01群において有意に高かった。185日目(DC+3)のウイルス量はまた、T01及びT03の両方と比較してT02群で有意に高かった。攻撃接種後10日間の口腔排菌の結果を表3にまとめている。
攻撃接種後の全期間で、いずれのブタも異常な全身状態、抑うつ状態、呼吸困難、咳、またはくしゃみを示さなかった。
攻撃接種後の期間の直腸温の結果を表4にまとめている。T01群では、5/20のブタ(25%)が攻撃接種後の期間に少なくとも1回は発熱(RT≧40.5)した。ワクチン接種群T02及びT03において、攻撃後に発熱したブタの比率はそれぞれ8/18(44%)及び12/17(71%)であった。185日目(DC+3)には、ワクチン接種群T02及びT03の両方でT01群と比較して直腸温が有意に高かった。
処置群ごとの病変のある肺の比率を表5に示す。肺の視覚的スコアを表6に示す。剖検時、対照群T01のうち18/20のブタ(90%)は、PRRSV攻撃が肺病変の誘発に成功したことを示す、陽性の肺の視覚的スコアを有した。T02群及びT03群では、12/17(71%)及び7/16(44%)のブタが同様に陽性と採点された。T03群のうち1頭のブタ(#300)は、右肺葉の10~70%、左肺葉の2~30%、及び副葉の70%に、それによって何らかの潜在的なPRRSV関連病変の存在をマスクするカタル性化膿性胸膜肺炎の罹患を示していた。このブタからのデータは分析から区別した(MSFの目印のある報告を参照)。剖検時に病変が観察される肺の比率は、ワクチン接種群T02及びT03と比較して対照群T01において有意に高かった。ワクチン接種群間に差は検出されなかった。
血清検査結果の概要を表7に示す。ワクチン接種段階の期間に月1回の間隔で採取した試料から得られたELISAの結果の概要のみ、記述統計量(幾何平均及び標準偏差)で示す。実験単位の反復はなかった(処置を混合しなかった)ため、群間の差は評価できなかった。群間の差は、攻撃接種段階で動物を混合した後の181日目の試験日にのみ試験した。ワクチン接種前、全ブタはELISA陰性であった(IDEXX S/P比<0.4)。対照群T01のブタは、攻撃接種まで陰性のままであった。ワクチン接種の1か月後(28日目)、T02群及びT03群のブタはすべて、既にPRRSVに対する抗体が発生しており、それらのすべてが攻撃接種時(ワクチン接種の6.5か月後)に引き続き陽性であった。181日目(DC-1)の群間比較から、T02群と比較してT03群に有意に高い最小二乗平均抗体価が認められた。
統計解析の前に、適切な対数変換を用いてRT-qPCRを変換した。変換されたデータを一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合(P≦0.05)、各時点で処置間のペアワイズ処置比較を行った。処置の最小二乗平均及び95%信頼区間を逆変換して表した。動物のウイルス血症/排菌者の比率も算出した。PRRSV RNAコピー/mLが50超(1.7log10 PRRSV RNAコピー/mL)の場合に、各試料を陽性であると判定した。これは、この技術の検出限界(100 PRRSV RNAコピー/mL)の半分に相当する。DC以前(攻撃接種前に相当)及びDC後(攻撃接種後)、これまでウイルス血症であったか、または排菌したかも測定した。時点ごとに、また攻撃接種前の期間及び攻撃接種後の期間に、動物がこれまでウイルス血症であったかどうかに応じて、ウイルス血症状態に関する頻度表を算出した。
直腸温は、一般線形反復測定の混合モデル分析を用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合(P≦0.05)、各時点で処置間のペアワイズ比較を行った。処置の最小二乗平均、95%信頼区間、最小値及び最大値を時点ごとに算出した。記述的統計、平均、標準偏差、及び範囲は、処置ごとに、及び攻撃接種前の試験日ごとに算出した。発熱(直腸温40.5℃超)を伴う動物の頻度分布を処置ごとに算出し、時点のデータを収集する。DC以前の期間及びDC後の期間に、動物がこれまで発熱したかどうかを判定した。動物がこれまで発熱したかどうかについての頻度表を、DC以前及びDC後の期間ごとに算出した。
統計解析の前に、必要な場合は、適切な対数変換を用いて血清値を変換した。変換された血清検査データを、一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合(P≦0.05)、各時点で処置間のペアワイズ比較を行った。処置の最小二乗平均及び95%信頼区間を逆変換して表した。さらに、陽性/陰性結果の頻度分布を各時点で処置ごとに算出した。また、試験期間の任意の時点で、各動物が抗体陽転(S/P比0.4以上)したかどうかを判定した。動物が抗体陽転したかどうかの頻度分布を処置ごとに算出した。記述的統計、平均、標準偏差、及び範囲は、処置ごとに、攻撃接種前に算出した。
攻撃接種前の臨床徴候及び攻撃接種後の臨床徴候の頻度分布を、処置ごとに個別に算出し、時点のデータを収集した。動物がこれまで臨床徴候があったかどうかについての頻度分布を、段階(DC以前及びDC後)で処置ごとに算出した。
体重は、一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。最小二乗平均、標準誤差、95%信頼区間、最小値及び最大値を各時点で処置ごとに算出した。処置効果及び/または処置と時点の交互作用が有意であった場合、各時点で処置同士の処置間ペアワイズ比較を行った。推定値の標準誤差及び95%信頼区間を算出した。記述的統計、平均、標準偏差、及び範囲は、処置ごとに、攻撃接種前に算出した。モデルからのパラメーター推定値を用いて、1日増加量の平均推定値及び比較を算出した。
肺全体の病変率を以下の式を用いて算出した:肺全体の病変率=(0.10×左上葉)+(0.10×左中葉)+(0.25×左下葉)+(0.10×右上葉)+(0.10)×右中葉)+(0.25×右下葉)+(0.10×副葉)。分析前に、逆正弦平方根変換を、肺全体の病変率に適用した。変換された肺病変を、一般線形混合モデルを用いて分析した。治療効果が有意であった場合、処置群間でペアワイズ比較を行った。肺全体の病変率の逆変換最小二乗平均、その標準誤差及び95%信頼区間を、最小値及び最大値とともに算出した。
肺病変の評価スコアの頻度分布を処置ごとに算出した。正常または正常でないスコアを、二項データの一般線形混合モデルを用いて分析した。一般線形混合モデルが収束しなかった場合、フィッシャーの正確検定を使用してデータを分析した。処置の主たる効果が有意であれば、処置間のペアワイズ比較を行った。
変換した肺全体の病変率を、固定効果である処置、ならびにランダム効果である畜舎及び畜舎内の区画による一般線形混合モデルで分析した。有意な(P≦0.05)処置効果について試験した後、パラメーター推定値の線形結合を事前比較に使用した。処置間で比較を行った。5%の有意水準(P≦0.05)を用いて統計的差異を評価した。最小二乗平均(逆変換)、標準誤差、平均の95%信頼区間、及び範囲を処置ごとに算出した。
このように、本試験の目的は、1日齢で筋肉内経路(IM、群T02)または鼻腔内経路(IN、群T03)によりワクチン接種を受け、ワクチン接種後26週で遺伝子型I型のPRRS分離株により呼吸器に攻撃接種されたブタにおいて、EU PRRS改変生ワクチン(配列番号5)の免疫持続期間(DOI)を評価することであった。有効性を決定する際の主要変数は、T01ブタと比較した処置群T02及びT03の血清中のウイルス量(ウイルス血症)であった。副次変数として肺病変、直腸温、排菌、臨床徴候、及び体重を比較した。
RT qPCRに関しては、ワクチン接種前(D-1)、攻撃接種前(D62)、及び攻撃接種後3、5、7、及び10日目(D66、D68、D70、及びD73)に採取した血清試料に対して現地のSOPに従って実施した逆転写(RT)qPCRによって、ウイルス血症(血清中のPRRSV量)及び排菌(スワブ材料中のPRRSV量)を測定した。簡潔には、精製したウイルスRNAを鋳型として使用し、50℃で30分間逆転写し、95℃で5分間変性させた。PCRの反応プログラムは、95℃で20秒間の変性と53℃で40秒間のアニーリングの40サイクルで構成される。qRT-PCRは7500 Real-Time PCR Systemサーマルサイクラーで実施した。以下の通り、レリスタッドウイルスに適したプライマー及びプローブを選択した:
フォワードプライマー(レリスタッドF):5’-GCACCACCTCACCCAGAC-3’(配列番号6、最終濃度0.5マイクロモル)。
リバースプライマー(レリスタッドR):5’-CAGTTCCTGCGCCTTGAT-3’(配列番号7、最終濃度0.5マイクロモル)。
プローブ(レリスタッドS):5’-6-FAM-CCTCTGCTTGCAATCGATCCAGAC-TAMRA-3’(配列番号8、最終濃度0.6マイクロモル)。
ワクチン接種前(D0)、攻撃接種前(D67)、及び剖検時(D77)に採取した血清を、IDEXX PRRS X3 ELISAを使用して製造業者の指示に従い、PRRSVに対する抗体について試験した。簡潔には、組換えPRRSV抗原でコーティングした96ウェルプレート中で、血清試料を1:40に希釈し、18~26℃で30分間インキュベートした。洗浄後、抗ブタ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加し、プレートを18~26℃でさらに30分間インキュベートした。未結合コンジュゲートを洗い流し、TMB基質をウェルに加えた。650nmでの顕色を測定した。試料ごとにS/P値を記録した。S/P比が0.4以上であれば、試料をPRRS抗体に対して陽性に分類した。S/P比が0.4未満であれば、試料を陰性に分類した。ELISAの説明書は試験ファイルに含まれている。
本試験の目的は、ワクチン接種の4週間後にPRRSVにより誘発される呼吸器疾患を予防するために2週齢のブタに投与される実験用EU PRRSV MLVワクチン(配列番号5ウイルス)の免疫開始(OOI)を評価することであった。疾患の予防を判断する際の主要変数は、T01(対照品をワクチン接種)と比較した処置群T02(試験品目をワクチン接種)の血清中ウイルス量であった。これは、肺病変、口腔及び鼻腔の排菌、臨床所見、直腸温、ならびに体重によって裏付けられた。
**に指定された日に、直腸温及び臨床所見を記録した。臨床所見には、全身状態、抑うつ状態、くしゃみ、咳、及び呼吸困難が含まれていた。直腸温は現地の標準手順に従って測定した。完全な臨床検査が実施されなかった日(ワクチン接種/攻撃接種の前日及び翌日)には、標準的なSOPに従って、ブタの全身健康状態を観察し、動物ケア日報(DRAC)のフォームに記録した。
剖検時に、以下の方法を用いて肺病変を採点した:1)各葉(左上葉、左中葉、左下葉、右上葉、右中葉、右下葉、及び副葉)の硬化の比率を、病変が観察された葉の比率、及び2)視覚的数値スコア(0、1、2、3)で採点し、記録する。
標準手順に従って実施した逆転写(RT)qPCRによって、ウイルス血症(血清中のPRRSV量)及び排菌(鼻腔及び口腔スワブ中のPRRSV量)を測定した。簡潔には、精製したウイルスRNAを鋳型として使用し、50℃で30分間逆転写し、95℃で5分間変性させた。PCRの反応プログラムは、95℃で20秒間の変性と53℃で40秒間のアニーリングの40サイクルで構成される。qRT-PCRは7500 Real-Time PCR Systemサーマルサイクラーで実施した。結果をRNAコピー/mlとして表した。
ワクチン接種前、攻撃接種前、及び剖検時に採取した血清を、IDEXX PRRS X3 ELISAを使用して製造業者の指示に従い、PRRSVに対する抗体について試験した。簡潔には、組換えPRRSV抗原でコーティングした96ウェルプレート中で血清試料を1:40に希釈し、18~26℃で30分間インキュベートした。洗浄後、抗ブタ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加し、プレートを18~26℃でさらに30分間インキュベートした。未結合コンジュゲートを洗い流し、TMB基質をウェルに加えた。650nmでの顕色を測定した。試料ごとにS/P値を記録した。S/P比が0.4以上であれば、試料をPRRS抗体に対して陽性に分類した。S/P比が0.4未満であれば、試料を陰性に分類した。ELISAの説明書は試験ファイルに含まれている。試験は37日目に終了した(安楽死)。
統計解析の前に、適切な対数変換を用いてRT-qPCRデータを変換した。変換されたデータを一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合(P≦0.05)、各時点で処置間のペアワイズ比較を行った。処置の最小二乗平均及び95%信頼区間を逆変換して表した。ウイルス血症/排菌日数の比率も算出した。PRRSV RNAコピー/mLが250超の場合に、各試料を陽性であると判定した。これは、この技術の検出限界(試料の500 PRRSV RNAコピー/mL)の半分に相当する。27日以前(攻撃接種前に相当)及び27日より後(攻撃接種後)に、これまでウイルス血症であったか、またはこれまで排菌したかも測定した。
肺全体の病変率を以下の式を用いて算出した:肺全体の病変率=(0.10×左上葉)+(0.10×左中葉)+(0.25×左下葉)+(0.10×右上葉)+(0.10×右中葉)+(0.25×右下葉)+(0.10×副葉)。分析前に、逆正弦平方根変換を、肺全体の病変率に適用した。変換された肺病変を一般線形混合モデルによって分析した。治療効果が有意であった場合、処置群間でペアワイズ比較を行った。肺全体の病変率の逆変換最小二乗平均、その標準誤差及び95%信頼区間を、最小値及び最大値とともに算出した。肺病変の評価スコアの頻度分布を処置ごとに算出した。正常または正常でないスコアを、二項データの一般線形混合線形モデルを用いて分析した。一般線形混合モデルが収束しなかった場合、フィッシャーの正確検定を使用してデータを分析した。処置の主たる効果が有意であれば、処置間のペアワイズ比較を行った。
処置群ごとの病変のある肺の比率を表8に示す。肺の視覚的スコアを表9に示す。剖検時、対照群T01のうち17/18のブタ(94.4%)は、PRRSV攻撃が肺病変の誘発に成功したことを示す、陽性の肺の視覚的スコアを有した。T02群では、14/19(73.7%)のブタが同様に陽性と採点された。対照群T01は、T02群と比較して肺病変率のLS平均が有意に高かった。肺全体の視覚的スコアに関して、すべてのT02ブタの肺を、0(病変なし)または1(軽度の病変)のいずれかで採点した。T01対照群では、7/18(38.9%)のブタが視覚的スコア2(中程度の病変)と評価された。どの群の肺も視覚的スコア3(重度の病変)と評価されなかった。
全ブタが、0日目に血液のRT-qPCRでPRRSV陰性であることが見出された。攻撃接種時(27日目)に、TIをワクチン接種したブタ(T02群)の100%にPRRSV RNAを検出することができた。その時点まで、すべてのT01ブタは引き続きPRRSV陰性であった。対照ブタでは、ウイルス血症は29日目(攻撃接種後2日目)に最初に検出され、試験終了時までブタはPRRSV陽性のままであった。攻撃接種後のすべてのサンプリング日において、対照T01群に検出されたウイルス量は、T02群に検出されたものより有意に高かった。27日目(攻撃接種の日)から36日目までのウイルス血症の結果を表10にまとめている。最小二乗平均及び群間のLS平均の差の概要を表11に示す。
全ブタが、0日目に鼻腔及び口腔スワブのRT-qPCRでPRRSV陰性であることが見出された。攻撃接種時(27日目)に、TIをワクチン接種したブタ(T02群)の70%及び85%が、それぞれ鼻腔及び口腔スワブにPRRSV RNAが検出可能であった。その時点でT01群のブタはどれも排菌していなかった。攻撃接種後の期間、T01群の鼻腔排菌者の比率は85%(34日目)~100%(29日目)の範囲であった。T02群の鼻腔排菌者の比率は42%(36日目)~90%(29日目)の範囲であった。口腔排菌に関しては、陽性ブタの比率はT01群で95~100%、T02群で73.7~100%の範囲であった。LSMを群間で比較すると、鼻腔スワブについては34日目、口腔スワブについては31日目及び36日目を除く、すべての攻撃接種後の日でT01群に有意に高いウイルス量が認められた。
ワクチン接種前、全ブタが血清学的にPRRSV陰性であった(IDEXX S/P比<0.4)。攻撃接種時(ワクチン接種後4週間)、すべての対照ブタは引き続き血清陰性であったが、TIをワクチン接種したブタの90%はPRRSVに対して抗体陽転した(IDEXX S/P比>0.4)。36日目(攻撃接種後9日目)には、全ブタがPRRSVに対して血清陽性であった。群T02のブタは、対照群T01と比較して有意に高いLS平均抗体価を有した。ELISAによって得た血清学的結果を表16にまとめている。
本試験では、14~15日齢でワクチン接種したブタにおいて、ワクチン接種後4週間目に呼吸器への攻撃接種として病原性遺伝子型I型PRRSV分離株を接種したときの、PRRSV改変生ワクチンの免疫開始(OOI)を評価した。T01ブタはすべて、ワクチン接種期間を通してPRRSV血清陰性及びウイルス陰性のままであり、交絡疾患因子が検出されなかったため、この試験は有効であった。
本試験の目的は、筋肉内(IM、群T02)または鼻腔内(IN、群T03)経路により1日齢の子ブタに投与したときの、EU PRRS MLV(配列番号5から発現されるウイルス)の有効性に母体由来抗体(MDA)が与える影響を評価することであった。
ワクチン接種前(D0)、全ブタの血清はRT-qPCRでPRRSV陰性であり、さらにT01群のブタはすべて、攻撃接種されるまで陰性のままであった。対照的に、T02群(IMワクチン接種)のうち8/16(50%)の子ブタ及びT03群(INワクチン接種)のうち1/19(5.3%)の子ブタは、攻撃接種時(ワクチン接種後67日目)にRT-qPCRでPRRSV陽性であった。
攻撃接種後10日間のウイルス血症の結果を表17にまとめている。
統計解析の前に、適切な対数変換を用いてRT-qPCRデータを変換した。変換されたデータを一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合(P≦0.05)、各時点で処置間のペアワイズ比較を行った。処置の最小二乗平均及び95%信頼区間を逆変換して表した。ウイルス血症/排菌日数の比率も算出した。PRRSV RNAコピー/mLが50超の場合に、各試料を陽性であると判定した。これは、この技術の検出限界(100 PRRSV RNAコピー/mL)の半分に相当する。DC以前(攻撃接種前に相当)及びDC後(攻撃接種後)、これまでウイルス血症であったか、または排菌したかも測定した。
本試験の目的は、1日齢のブタにIM及びIN経路で投与されるPRRSV改変生ワクチン96V198クローン1の反復投与及び過剰投与の安全性、ならびに1回投与の伝播、拡散、及び安全性を評価することであった。本試験は、ワクチンのバッチに存在する、最小弱毒化継代レベルであるMSV+3(8ページを参照、MSV+5は標準継代49)を用いて実施した。
本試験は、実験条件下での1日齢のブタにおけるワクチンEU PRRS MLV(96V198クローン1)の安全性を、以下に記載するすべてのパラメーターについて、ワクチン希釈液を接種した対照群(陰性対照)と比較することにより実証するように計画した。ただし、体温は、ワクチン接種前の各子ブタの基礎体温を対照値とみなして分析した。原因がワクチンに起因する重度の局所反応または全身反応が観察されず、ワクチン接種群のすべてのブタの平均体温上昇が、ワクチン接種前の基礎平均気温と比較して1.5℃を超えず、かつ、実験群のどの子ブタもワクチン接種前の各子ブタの基礎温度と比較して2℃を超える体温上昇を示さなかった場合、ワクチンを安全とみなした。ワクチン株の拡散及び伝搬は、歩哨ブタでのワクチン株の存在を調べて評価した。ワクチン接種された動物での伝播は、血液、鼻、口、及び直腸の試料中及び組織中のウイルス量を調べて評価した。
体温に関しては、得られた結果が獣医学用途のワクチンに対する欧州薬局方の勧告を達成しているため、評価したプロトコールすべて(経路、力価、及び投与回数)において、このワクチンが安全であると結論付けることができる。
鼻腔内経路。局所反応は観察されなかった。
剖検時に、T12(IM経路による力価が最大)の2頭の子ブタだけが肉眼でわかる軽度の病変を有していた。顕微鏡では、T10群のうち4頭のブタにのみ病変が観察され、病変は、ごく軽度の限局性または多巣性の単核炎症性細胞浸潤物の存在を特徴とした。
鼻腔内経路:ワクチン接種に伴う全身反応及び臨床徴候がないことは、ワクチンが安全であることを示している。
ワクチン投与後の有害事象は、IM経路により得られる力価が最大であった群(最大排出力価の10倍)に属する8頭の子ブタのうち2頭にのみ観察された(T12群)。この事象は4時間以内には消失し、子ブタは完全に回復した。毎日の臨床評価に関しては、対照群の子ブタにも跛行が観察されており、跛行の症例がワクチン投与に伴う現象であるとみなすことはできなかった。試験期間に観察された唯一の死亡が生じた原因は、圧死によるものであるため、この死はワクチン投与とは無関係であったとみなすべきである。要約すると、IM経路によるワクチン株96V198クローン1は、最大力価(×10)について記載した有害事象を除いて完全に安全であるとみなされるべきである。
鼻腔内経路。
体重増加の平均を比較すると、0日目から14日目までで、T07は対応する対照(T02)よりも低い値を示した(p<0.05)。しかしながら、14日目から28日目までの体重増加を比較したところ、特に0日目から28日目までの全試験を考慮した場合、差は見られなくなった。したがって、鼻腔内経路でワクチン接種した子ブタの体重増加に影響はなく、受けた投与とは無関係であった。
同様に、0日目から14日目までで、T11は対応する対照(T04)よりも低い値を示した(p<0.05)。14日目から28日目までの期間を分析すると、差は見られなくなったが、0日目から28日目までの全試験をみると再び差が生じた。T11の3頭の子ブタの体重増加が、品目、力価、または投与経路に関係なく、28日目に剖検されたすべての子ブタ(T02、T04、T07、及びT11を意味する)を含め、最も低かったことから、この差は説明できた。0日目から28日目までの個々の体重増加はすべて、上述の3頭の子ブタ(それぞれ体重増加が4.08kg、2.89kg、及び3.05kgであった番号199、202、及び205の子ブタ)を除いて、5.5kg以上であった。注目すべきは、この3頭の子ブタが最も長期間、跛行を患っていたことである。結論として、T04とT11の体重増加に観察された差が、跛行事象またはワクチン接種によるものであるかどうかを区別することはできない。
鼻腔内及び筋肉内経路。使用された経路とは無関係に、ワクチン接種動物において評価したほぼすべての組織にワクチン株が存在したことで、ウイルスの伝播が実証された。肺、扁桃腺、及び気管気管支リンパ節だけでなく、脾臓及び腸間膜リンパ節でも高いとみなすことができる力価で、96V198クローン1株が存在することは、ワクチン株の完全な生体伝搬を示唆する。
鼻腔内及び筋肉内経路。口腔液及び直腸スワブ中のワクチン株の検出は、ワクチン接種された子ブタからは不定であったが、鼻腔スワブ中では一定して高かった。ワクチン株検出の頻度分布は時間とともに減少した。すべての歩哨ブタからの血液試料中のワクチン株の検出と合わせ、これらの結果は、96V198クローン1がワクチン接種後早期に活性になり、かつ継続的に排菌されたことを実証している。また、歩哨子ブタからの組織及び血液試料中にワクチン株が存在したことは、ワクチン接種された子ブタから拡散したウイルスが活性であることを示していた。すなわち、この株は、歩哨動物を感染させることができ、体内で複製することができた。さらには、T09のうち1頭のIM歩哨ブタは、PRRSに適合する肺病変に加え、IHCに対する陽性結果も示していた。結論として、上記の結果は、96V198クローン1が、少なくともワクチン接種後の早期に、ワクチン接種された子ブタからワクチン接種していない子ブタへと、一貫して伝染し得ることを示している。
鼻腔内及び筋肉内経路。PRRSに適合する巨視的及び微視的病変(間質性肺炎)を有し、さらにPRRSV IHCに陽性の結果を示した9頭のブタはすべてIM群のものであった。したがって、IN経路は安全であるが、IM経路は少なくとも各群(T09~T12から)の1頭のブタにおいてPRRSVに適合する肺病変を誘発する可能性があると結論づけることができる。
本試験は、妊娠後期(妊娠87日目)である血清陽性の雌ブタに、単回用量のEU PRRS MLVを反復投与した場合の安全性を実証するように計画した。1回目または2回目の投与後にワクチン接種後の全身反応は観察されなかった。さらに、全観察期間を通して、いずれの雌ブタにも臨床所見は記録されなかった。
EU PRRSV改変生ワクチン(MLV)は、PRRS汚染環境での未経産ブタ及び雌ブタの能動的な予防接種により、PRRSウイルスの欧州株への感染を原因とするウイルス血症、経胎盤感染症、及び流産を減少させることを目的としている。現行法規によれば、販売承認を得るにはワクチンの安全性を証明することが義務付けられている。本試験は、欧州薬局方7.7:04/2013/50206-動物用ワクチン及び免疫血清の安全性評価、及びVICH GL44-動物用生ワクチン及び不活化ワクチンの対象動物安全性というガイドラインに従って計画された。本試験の目的は、妊娠後期である血清陽性の雌ブタにおいて、EU PRRS MLVの反復投与(1回+1回)の安全性を評価することである。試験した物質は、6.6log10CCD50/バイアルのEU PRRSV、96v198c1株、(MSV+3)であり、1回に5.2log10CCID50を2mLにして筋肉内投与した。RT qPCR
フォワードプライマー(レリスタッドF):5’-GCACCACCTCACCCAGAC-3’(最終濃度0.5μM)。
リバースプライマー(レリスタッドR):5’-CAGTTCCTGCGCCTTGAT-3’(最終濃度0.5μM)。
プローブ(レリスタッドS):5’-6-FAM-CCTCTGCTTGCAATCGATCCAGAC-TAMRA-3’(最終濃度0.6μM)。
ワクチン接種前に採取した雌ブタの血清を、製造業者の指示に従って、IDEXX PRRS X3 ELISAを使用してPRRSVに対する抗体について試験した。簡潔には、組換えPRRSV抗原でコーティングした96ウェルプレート中で血清試料を1:40に希釈し、18~26℃で30分間インキュベートした。洗浄後、抗ブタ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加し、プレートを18~26℃でさらに30分間インキュベートした。未結合コンジュゲートを洗い流し、TMB基質をウェルに加えた。650nmでの顕色を測定した。試料ごとにS/P値を記録した。S/P比が0.4以上であれば、試料をPRRS抗体に対して陽性に分類した。S/P比が0.4未満であれば、試料を陰性に分類した。ELISAの説明書は試験ファイルに含まれている。
ワクチン接種後の期間(D0~D28)に、どの雌ブタにも異常な臨床所見は記録されなかった。
ワクチン接種前及び以降の4日間に得た、各群の平均直腸温(RT)を**及び**に示す。直腸温の個別データは**に示されている。
a)群全体のワクチン接種後の平均直腸温が、ワクチン接種前の平均直腸温プラス1.5℃を超えてはならない。
1回目のワクチン接種:ワクチン接種後(D0+4時間、D1、D2、D3、またはD4のいずれか)の平均直腸温≦[ワクチン接種前の平均直腸温(D-1/D0の平均値)]+1.5℃
2回目のワクチン接種:ワクチン接種後(D14+4時間、D15、D16、D17、またはD18のいずれか)の平均直腸温≦[ワクチン接種前の平均直腸温(D13/D14の平均値)]+1.5℃
b)各雌ブタのワクチン接種後の個々の直腸温が、ワクチン接種前の直腸温(Pre-vac)プラス2℃を超えてはならない。
1回目のワクチン接種:ワクチン接種後(D0+4時間、D1、D2、D3、またはD4のいずれか)の個々の直腸温≦[ワクチン接種前の個々の直腸温(D-1/D0の個々の平均値)]+2.0℃
2回目のワクチン接種:ワクチン接種後(D14+4時間、D15、D16、D17、またはD18のいずれか)の個々の直腸温≦[ワクチン接種前の個々の直腸温(D13/D14の個々の平均値)]+2.0℃
T01群またはT02群のどの雌ブタにも、ワクチン接種後の全身反応は観察されなかった。
ワクチン接種前に、注射部位での局所反応の評価を妨げる可能性がある、以前の接種によって引き起こされた頸部領域の局所反応が存在しないか、すべての雌ブタを検査した。以前の接種により、3頭の雌ブタの右頸部に古い反応が見られ、うち2頭がT01群(1802及び2259)、1頭がT02(1663)であった。しかしながら、これらの反応はすべて下方に位置し、それぞれの接種箇所からは離れていた。2回目のワクチン接種の前に左頸部を検査したところ、4頭の雌ブタに古い反応が観察され、うち2頭がT01群(316及び1802)、2頭がT02群(2547及び2842)であった。右頸部での観察と同様、これらの反応は接種箇所より下に位置していた。いずれの場合(左右両方の頸部)にも、古い反応がワクチン接種後の局所反応の評価を妨げる可能性があるとは考えられなかった。CPを接種した雌ブタ(T01群)はいずれも、ワクチン接種後のどの時点でも注射部位に局所反応を示さなかった。ワクチン接種後にT02群に観察された局所反応を17にまとめる。
肉眼的検査では、両群の数頭の雌ブタが頸部筋肉に病変を有することが観察された。病変は主に、頸部領域全体に広がる乾酪性物質の多発性結節からなるものであった。この病変は注射時点では検出されなかったため、古い注射に起因するものであった。
どの処置群にも中絶または早産は記録されなかった。妊娠期間の長さは、T01群で114~117日、T02群で114~119日の範囲であった。出生した健康な子ブタを雌ブタごとに耳札で識別し、飼育した。
Claims (7)
- ブタ動物を豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)ウイルスによる感染から防御するためのワクチンであって、前記ワクチンは、(a)配列番号5のポリヌクレオチド分子、もしくは配列番号5に少なくとも90%同一である任意のポリヌクレオチドによってコードされる欧州型PRRSウイルス;(b)前記コードするポリヌクレオチド分子;(c)プラスミド形態である前記ポリヌクレオチド分子;または(d)前記ポリヌクレオチド分子を含むウイルスベクターを、感染に対して免疫防御を生じさせる有効量で含み、さらに獣医学的用途に適した担体を含んでおり、子ブタが生後1日齢以下であるという早期に、早期かつ安全なワクチン接種を提供し、最大6か月にわたる免疫持続期間をもたらす、前記ワクチン。
- 前記ワクチンが、約8~12時間齢の子ブタに投与された場合に感染からの防御をもたらす、請求項1に記載のワクチン。
- 免疫の開始がワクチン接種後2週間で始まる、請求項1に記載のワクチン。
- 免疫の開始がワクチン接種後24~28日で始まる、請求項1に記載のワクチン。
- ブタ動物に欧州型PRRSウイルスによる感染に対するワクチン接種をする方法であって、生後約12時間~3週齢の離乳前の前記動物に前記ワクチンを投与することを含み、前記ワクチンは、
(a)欧州型PRRSウイルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含む単離ポリヌクレオチド分子であって、該DNA配列は配列番号5もしくは配列番号5に少なくとも90%同一である任意のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド分子、
(b)欧州型PRRSウイルスをコードする感染性RNA分子であって、(a)に記載されたDNA配列によってコードされる、感染性RNA分子、
(c)プラスミド形態である前記ポリヌクレオチド分子(a)、
(d)感染性RNA分子(b)を含むウイルスベクター、または
(e)感染性RNA分子によってコードされる欧州型PRRSウイルスであって、該感染性RNA分子は(a)に記載された単離ポリヌクレオチド分子によってコードされる、欧州型PRRSウイルス
を含み、前記ワクチンウイルスが、前記ワクチンウイルスをブタ動物に投与する前に、ブタ細胞、またはブタCD163受容体を発現するブタ以外の哺乳動物細胞で増殖するように適合されている、前記方法。 - 防御免疫がワクチン接種後約28日以内に生じる、請求項5に記載の方法。
- 提供される防御免疫の持続期間が最大6か月である、請求項5に記載の方法。
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