KR100996105B1 - 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ｎ 단백질돌연변이체 - Google Patents

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ｎ 단백질돌연변이체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한 상기 유전적으로 변형된 바이러스 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신이 제공된다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스, N 단백질 돌연변이체

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 Ｎ 단백질 돌연변이체 {N Protein Mutants of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus}
본 발명은 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한 상기 유전적으로 변형된 바이러스 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신이 제공된다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)은 성숙한 암퇘지 (sow)와 새끼를 낳은 일이 없는 암퇘지 (gilt)에 있어서의 유산, 사산 및 기타 생식 문제 뿐만 아니라 새끼 돼지에 있어서의 호흡기 질환을 특징으로 한다. 병원체는 PRRS 바이러스인데, 이는 아르테리비리대 (Arteriviridae)과 및 니도비랄레스 (Nidovirales) 목의 구성원이다. 이 바이러스의 2가지 별개의 유전자형이 1980년대 말 북아메리카와 유럽에서 거의 동시에 출현하였다. PRRS 바이러스는 현재 거의 모든 양돈국에서 풍토병이며, 이는 전세계 양돈업에 영향을 미치는 경제적으로 가장 중요한 질환 중의 하나로 간주되고 있다.
현재 PRRS에 대항하여 상업적으로 시판되고 있는 백신에는 변형된 생 백신과 사멸 (불활성화) 백신이 포함된다. 사멸 백신은 이종 PRRS 바이러스 균주에 대항하여 강력한 면역을 유도시키지 못하는 것으로 비난받아 왔다. 변형된 생 백신은 독력이 상실될 때까지 세포 배양액 중에서 연속 계대함으로써 약독화된다. 변형된 생 백신은 사멸 백신보다는 더 광범위한 보호를 유발시키지만, 잔류 독성, 백신 접종하지 않은 돼지로의 확산, 및 독성 상태로의 유전적 복귀를 포함한 수 많은 안전상의 우려를 야기시킬 수 있다. 약독화 과정 동안에 일어나는 항원성 변화로 인해, 상기 백신은 PRRS 바이러스의 독성 야외 균주 (field strain)에 대해 보호할 수 있는 능력을 일부 상실할 수도 있다. 따라서, PRRS에 대해 보호해 줄 수 있는 신규하고도 개선된 변형된 생 백신이 강력히 요망된다.
도 1. (A) P129 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 단백질 내에서의 NLS 돌연변이의 위치와 서열을 도시한 도면. (B) 모의 감염된, P129 감염된, 및 P129-GG 감염된 MARK-145 세포의 현미경 사진. 상부 열은 위상 대비 현미경을 이용한 특유의 플라크를 나타내는 반면, 하부 열은 FITC-접합된 모노클로날 항체 SDOWl7을 사용한 감염된 병소의 형광성 항체 염색을 나타낸다. P129-GG로 감염된 세포의 핵과 핵소체에는 뉴클레오캡시드 염색이 없다는 것에 유의해야 한다.
도 2. (A) 처리군 (군당 7마리 돼지)을 감염시킨 후 0일째부터 28일째까지 바이러스혈증을 나타내는 돼지의 수. (B) 처리군을 감염시킨 후 0일째부터 28일째까지 돼지 혈청 내의 평균 바이러스성 역가. (C) 처리군을 감염시킨 후 0일째부터 28일째까지 돼지 혈청 중의 평균 ELISA 항체 수준 (S/P 비). (D) 도 2C에 도시된 혈청의 재-적정. 고 역가를 나타내는 샘플 간의 차이를 보다 잘 구별하기 위해 검정에 앞서 모든 샘플을 1:5로 희석시켰다. (E) 4주 간의 연구 동안 감염된 돼지 중에서의 평균 혈청 중화 역가.
서열의 간단한 설명
서열 1: 북아메리카 PRRSV 분리주 VR2332의 N 단백질 잔기 41-47.
서열 2: VR2332 NoLS 영역 서열.
서열 3: 렐리스태드 (Lelystad) NoLS 영역 서열.
서열 4: VR2332 분리주의 NES 영역.
서열 5: 렐리스태드 분리주의 NES 영역.
서열 6: P129 분리주로부터의 N 단백질의 아미노산 서열.
서열 7: P129 분리주로부터의 ORF7 (N 단백질을 암호화한다)의 뉴클레오티드 서열.
서열 8: 프라이머 P SHUTTLE FWD.
서열 9: 프라이머 P-SHUTTLE-REV
서열 10: 돌연변이 유발성 프라이머 KK43/44GG-Fwd.
서열 11: 돌연변이 유발성 프라이머 KK43/44GG-REV.
서열 12: 표 8 결실 돌연변이체. wt P129의 NLS2 영역의 아미노산 서열.
서열 13: 표 8 결실 돌연변이체. wt P129의 NLS2 영역의 뉴클레오티드 서열.
서열 14: 표 8 결실 돌연변이체. P129-GG의 NLS2 영역의 아미노산 서열.
서열 15: 표 8 결실 돌연변이체. P129-GG의 NLS2 영역의 뉴클레오티드 서열.
서열 16: 표 8 결실 돌연변이체. P129-d43/44의 NLS2 영역의 아미노산 서열.
서열 17: 표 8 결실 돌연변이체. P129-d43/44의 NLS2 영역의 뉴클레오티드 서열.
서열 18: 표 8 결실 돌연변이체. P129-d43/44/46의 NLS2 영역의 아미노산 서열.
서열 19: 표 8 결실 돌연변이체. P129-d43/44/46의 NLS2 영역의 뉴클레오티드 서열.
서열 20: 표 8 결실 돌연변이체. P129-d44/46/47의 NLS2 영역의 아미노산 서열.
서열 21: 표 8 결실 돌연변이체. P129-d44/46/47의 NLS2 영역의 뉴클레오티드 서열.
서열 22: 표 8 결실 돌연변이체. P129-d46/47/48의 NLS2 영역의 아미노산 서열.
서열 23: 표 8 결실 돌연변이체. P129-d46/47/48의 NLS2 영역의 뉴클레오티드 서열.
서열 24: P129-d43/44F
서열 25: P129-d43/44/46F
서열 26: P129-d44/46/47F
서열 27: P129-d46/47/48F
서열 28: P129-d43/44R
서열 29: P129-d43/44/46R
서열 30: P129-d44/46/47R
서열 31: P129-d46/47/48R
참고 문헌
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발명의 요약
본 발명은 뉴클레오캡시드 (N) 단백질의 NLS-2 영역, NoLS 영역, 및/또는 NES 영역 내에 변형이 가해진 결과 약독화된 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 제공한다. 본 발명은 추가로, 이와 같이 유전적으로 변형된 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자, 및 이러한 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 언급된 바이러스의 생물학적으로 순수한 배양액 (즉, 실질적으로 기타 바이러스가 없는), 및 상기 언급된 바와 같은 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바이러스, 감염성 RNA 분자, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터 중의 어느 것을 포함하는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바와 같은 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스; 이러한 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 암호화하는, 상기 언급된 바와 같은 감염성 RNA 분자; 상기 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 암호화하는, 상기 언급된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 (임의로는 플라스미드의 형태임); 또는 상기 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 암호화하는, 상기 언급된 바이러스 벡터를, PRRS 바이러스에 의한 감염에 대항하여 면역보호를 야기시키는데 유효한 양으로 포함하고 수의용으로 허용 가능한 담체를 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로 부터 돼지 동물을 보호하기 위한 백신을 제공한다.
본 발명은 추가로, NLS-2의 복귀-저항성 돌연변이물을 제공한다. 특히 백신 목적상 바람직한 본 발명의 양태는 복귀 가능성을 최소화하고, 기타 플랭킹 잔기가 염기성 잔기 (예: 리신 및 아르기닌)로 돌연변이됨으로써 해당 영역 내에 기능적 NLS 모티프가 복원될 가능성을 최소화하도록 고안된 추가의 뉴클레오티드 치환 및/또는 결실을 함유할 것이다.
본 발명은 추가로, 돼지 동물에게 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대항하여 면역보호를 유발시키는 데 유효한 양의 상기 언급된 백신을 접종하는 것을 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 언급된 바와 같은 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이시키고; 이와 같이 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 적합한 발현 시스템을 이용하여 발현시키는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
야생형 또는 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스는 당해 분야에 일반적으로 공지된 적합한 발현 시스템 (그의 예들이 본원에 기재되어 있다)을 사용하여 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 발현할 수 있다. 예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 다음에 추가로 상세히 기재되는 바와 같이, 암호화된 바이러스를 시험관내 적합한 숙주 세포에서 발현할 수 있는 플라스미드의 형태일 수 있다.
본 발명의 기타 특징들은 본 명세서를 고려하여 명백할 것이다.
본 발명자들은 독성 PRRS 바이러스의 뉴클레오캡시드 또는 N 단백질 (ORF7에 의해 암호화됨) 내의 NLS-2 영역, NoLS 영역, 또는 NES 영역을 돌연변이 또는 결실시킴으로써 독성 PRRS 바이러스를 약독화시키는 방법; 이러한 약독화 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물; 및 상기 면역원성 조성물로 백신 접종함으로써 돼지를 PRRS로부터 보호하는 방법을 본원에 기재하였다. 이러한 방법에 의해 약독화된 PRRS 바이러스는 독성 야외 균주의 항원 특징을 보유하고 그에 따라 세포 배양 약독화 바이러스에 기초한 백신보다 더 강력한 보호를 제공할 것이다.
ORF7에 의해 암호화되는, PRRSV의 뉴클레오캡시드 단백질 (N)은 인산화되는 작은 염기성 단백질이고 [참고: Wootton, Rowland, and Yoo, 2002], 이는 동종-이량체를 형성한다 [참고: Wootton and Yoo, 2003]. 최근에 결정 구조가 결정되었다 [참고: Doan and Dokland, 2003]. N 단백질은 감염된 세포에서 여러 가지 기능을 지니는 것으로 여겨진다. 세포질 내에서 일어나는 과정인 게놈 RNA가 패키징되는 구형 캡시드 구조를 형성하는 것 이외에도, N 단백질의 일부가 핵, 구체적으로는 감염된 세포의 핵소체 내로 수송된다. N 단백질의 아미노산 서열은 핵 및 핵소체 내로의 수송과 핵으로부터의 외수송을 각각 촉진시켜 주는, 2개의 핵 국재화 신호 (NLS), 핵소체 국재화 신호 (NoLS) 및 핵 외수성 신호 (NES)를 함유하고 있다 [참고: Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; Rowland and Yoo, 2003]. 핵소체 내에 있는 동안에는 N 단백질이 작은 핵소체 RNA-관련 단백질 피브릴라린 (fibrillarin)과 상호 작용하고, 감염된 세포에서 rRNA 프로세싱과 리보솜 생물발생을 조절하여 바이러스 복제가 용이하도록 할 수 있다 [참고: Yoo et al., 2003]. 본 발명에서 본 발명자들은 N 단백질의 NLS, NoLS, 및 NES 모티프 내에 돌연변이 및 결실을 유발하면 비정상적인 핵 트래픽킹 (trafficking)을 수반하는 생육 가능한 바이러스가 생성될 수 있고, 이러한 돌연변이를 함유하는 바이러스가 PRRS에 대항하는 백신으로서 유용하다는 사실을 밝혀내었다.
이러한 유형의 바이러스 돌연변이는 단독으로도 또는 기타 약독화 돌연변이와 병용해서, 신규한 PRRS 백신을 고안하는데 매우 유용하다.
정의
본 발명의 목적상 "유효한 면역보호성 반응", "면역보호" 등의 용어는 백신 접종한 동물에게서 특정 병원체에 의한 감염에 대해 보호하기 위해 이러한 병원체의 하나 이상의 항원성 에피토프에 대항하는 면역 반응을 의미한다. 본 발명의 목적상, 특정 병원체에 의한 감염에 대한 보호에는 감염을 절대적으로 예방하는 것 뿐만 아니라, 백신 접종하지 않은 감염된 동물과 비교해서 백신 접종한 동물에게서 해당 병원체에 의한 감염 정도 또는 감염 비율을 탐지 가능한 수준으로 감소시켰거나 해당 병원체에 의한 감염으로부터 비롯되는 질환 또는 모든 증상의 중증도를 탐지 가능한 수준으로 저하시키는 것이 포함된다. 유효한 면역보호성 반응은 기존에 병원체에 의해 감염된 적이 없었고/없었거나 백신 접종 시점에 병원체에 의해 감염되지 않은 동물에게서 유도될 수 있다. 유효한 면역보호성 반응은 백신 접종 시점에 병원체에 의해 이미 감염된 동물에게서 유도될 수도 있다.
유전적으로 변형된 PRRS 바이러스는 이것이 그의 변형되지 않은 모 균주보다 덜 독성인 경우에 "약독화"된 것이다. 특정 균주가 질병 중증도를 결정하는 한 가지 이상의 파라미터에 있어 통계상 유의적 감소를 나타내는 경우에 이러한 균주는 "덜 독성"이다. 이러한 파라미터에는 바이러스혈증 수준, 발열, 호흡 곤란 중증도, 생식기 증상 중증도, 또는 폐 병변 수 또는 중증도 등이 포함될 수 있다.
"유럽 PRRS 바이러스"는 1991년경 유럽에서 최초로 단리된 PRRS 바이러스와 연관된 유전적 특징을 지닌 PRRS 바이러스의 모든 균주를 지칭한다 [참고: 예를 들어, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130]. "유럽 PRRS 바이러스"는 또한, 당해 분야에서 "렐리스태드 (Lelystad) 바이러스"로서 종종 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같은 "유전적으로 변형된"이란 달리 표기되지 않는 한, 인간의 개입에 의해 유전적으로 돌연변이된 것을 의미하고, "돌연변이된"이란 특정 아미노산이 또 다른 아미노산으로 대체되거나, 또는 암호화 뉴클레오티드가 또 다른 뉴클레오티드로 대체된 것을 의미하는데 (예를 들어, T를 C로 대체시킴), 즉 바람직하게는 암호화되는 아미노산을 변화시키는 방식으로 소위 "치환"시키거나 또는 기타 돌연변이, 예를 들어 "결실" 또는 "삽입"을 의미한다. 돌연변이는 항상 암호화 뉴클레오티드 서열에서 수행된다.
"PRRS 바이러스 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포"는 본 발명의 바이러스로 감염시킨 경우에 감염성 PRRS를 생성시킬 수 있는 세포주를 의미한다. 이러한 세포에는 돼지 폐포성 대식세포 및 돼지 폐포성 대식세포의 유도체, MA-104 세포 및 MA-104 세포의 유도체, MARC-145 세포 및 MARC-145 세포의 유도체, 및 PRRS 바이러스에 대한 수용체로 형질감염시킨 세포가 포함된다. 본 발명의 작은 플라크 표현형을 입증하는데 특히 바람직한 것은 MARC-145 세포이다. 용어 "PRRS 바이러스 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포"에는 또한, 살아 있는 돼지 내의 세포가 포함될 수 있다.
본 발명의 목적상 "면역 반응"은 특정한 항원성 에피토프(들)에 대항하여 유도되거나 또는 이러한 특정한 항원성 에피토프(들)를 분해 또는 억제시키는데 도움을 주는 항체 및/또는 세포 (예: T 림프구)의 생성을 의미한다.
"북아메리카 PRRS 바이러스"는 1990년대 초에 미국에서 최초로 단리된 PRRS 바이러스 [참고: 예를 들어, Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126]; 북아메리카 PRRS 바이러스 분리주 MN-1b [참고: Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Jnvest. 6:293-296]; PRRS의 퀘벡 (Quebec) IAF-exp91 균주 [참고: Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140: 1405-1418]; 및 북아메리카 PRRS 바이러스 분리주 VR 2385 [참고: Meng, X. -J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1795-1801] 등의 북아메리카 PRRS 바이러스 분리주와 연관된 유전적 특징을 지닌 모든 PRRS 바이러스를 의미한다. 유전적 특징은 북아메리카 PRRS 바이러스 균주들 간에 공유되는 게놈 뉴클레오티드 서열 유사성 및 아미노산 서열 유사성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "개방 판독 프레임" 또는 "ORF"는 중지 코돈이 개입하지 않고 특정한 PRRS 바이러스 단백질을 암호화하는데 요구되는 최소한의 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"돼지 (porcine 또는 swine)"는 수이대 (Suidae)과의 특정 구성원인 모든 동물, 예를 들어 돼지 (pig)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "PRRS 바이러스"는 달리 표기되지 않는 한, 북아메리카 또는 유럽 PRRS 바이러스의 모든 균주를 의미한다.
"PRRS"는 PRRS 바이러스 감염에 의해 야기된 돼지의 질병 증상을 포괄한다. 이러한 증상의 예에는 발열, 임신한 암컷의 유산, 호흡 곤란, 폐 병변, 식욕 상실, 및 새끼 돼지의 사망률이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은, "PRRS를 유발할 수 없는" PRRS 바이러스는 돼지를 감염시킬 수는 있지만, 이러한 돼지에게서 PRRS 감염과 통상 연관된 질병 증상을 유발하지 않는 바이러스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 PRRSV "N 단백질" 또는 "ORF7"은 PRRS 바이러스의 유럽 및 북아메리카 유전자형 둘 다의 ORF7에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서 정의된다. 현재 공지되어 있는 N 단백질의 특이적 이소형의 예는 유전자은행에 승인 번호 PRU87392로써 보고된 북아메리카 PRRS 원형 (prototype) 분리주 VR2322의 123개 아미노산 폴리펩티드, 및 Genbank 승인 번호 A26843으로써 보고된 유럽 원형 PRRS 분리주 렐리스태드의 128개 잔기 N 단백질이다.
"PRRSV N 단백질 NLS-1 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NLS-1 영역"은 성숙한 N 단백질의 대략 처음 15개 N-말단 잔기 내에 위치한, 4개의 연속되는 염기성 아미노산 (리신 또는 아르기닌) 또는 3개의 염기성 잔기와 1개의 히스티딘 또는 프롤린을 함유하는 "pat4" 또는 "nuc1" 핵 국재화 신호 [참고: Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003]를 지칭한다. 예를 들어, VR2332 NLS-1 영역 서열은 KRKK이고, 이는 잔기 9-12에 위치하는 반면, 렐리스태드 분리주 서열은 KKKK이며, 이는 N 단백질의 잔기 10-13에 위치한다.
"PRRSV N 단백질 NLS-2 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NLS-2 영역"은 2가지 형태 중의 하나를 취할 수 있는 N 단백질 내의 제2 핵 국재화 신호를 지칭한다. 북아메리카 PRRS 바이러스에서는 NLS-2가 본 발명자들에 의해 "pat8" 모티프로 명명된 패턴을 지니고 있는데, 이는 3개의 잔기 내에서 프롤린으로 시작하고 그 다음에 5개 잔기 서열 [5개 잔기 중에서 적어도 3개가 염기성 잔기 (K 또는 R)이다]이 위치하고 있다 [이는 문헌 (참고: Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003)에 기재된 "pat7" 또는 "nuc2" 모티프를 약간 변형시킨 것이다]. 예를 들어, 이러한 서열은 북아메리카 PRRSV 분리주 VR2332의 N 단백질 잔기 41-47에 위치하고 있고, 서열 PGKKNKKK (서열 1)로써 나타낸다. 유럽 PRRS 바이러스에서는 NLS-2가 "pat4" 또는 "nuc1" 모티프를 갖고 있는데, 이는 4개의 염기성 아미노산의 연속 연장물이거나 히스티딘 또는 프롤린과 연합된 3개 염기성 잔기의 연속 연장물이다 [참고: Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003]. 유럽 PRRSV 분리주 렐리스태드의 NLS-2는 잔기 47-50에 위치하고, 이는 서열 KKKK로써 나타낸다.
"PRRSV N 단백질 NoLS 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NoLS 영역"은 총 길이가 약 32개 아미노산이고 그의 아미노 말단 근처에 NLS-2 영역을 혼입시킨 핵소체 국재화 신호를 지칭한다. 예를 들어, VR2332 NoLS 영역 서열은 잔기 41-72에 위치하고, 이는 서열 PGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSER (서열 2) [참고: Rowland & Yoo, 2003]로써 나타내며, 상응하는 렐리스태드 분리주 서열은 잔기 42-73에 위치하고, 이는 서열 PRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTER (서열 3)으로써 나타낸다.
"PRRSV N 단백질 NES 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NES 영역"은 N 단백질의 카복시 말단 근처에 위치한 LXL 모티프를 함유하는 핵 외수송 신호를 지칭한다. NES 모티프는 X-R(2-5)-X-R2-X-R-Y인데, 여기서 X는 루이신, 이소루이신 또는 발린이고, Y는 루이신, 이소루이신, 발린 또는 알라닌이며 R은 모든 아미노산이다. 다음에 제시되는 바와 같이 원형 북아메리카 및 유럽 분리주는 상기 도식에 따르는데, 둘 다 5개 잔기 스페이서를 갖고 있다.
"형질감염된 숙주 세포"는 미국 특허 제5,600,662호에 기재된 바와 같이, PRRS 바이러스 RNA로 형질감염시킨 경우에 PRRS 비리온 (virion)의 제1 회전을 야기시킬 수 있는 실제적으로 모든 숙주 세포를 의미한다. 추가의 증식 감염이 요망되는 경우에는, 다음에 정의되는 바와 같은 "PRRS 바이러스 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포"를 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 분자는 당업자에게 공지된 재조합 기술을 사용하여 유전적으로 돌연변이시킬 수 있는데, 이러한 재조합 기술에는 부위-지시된 돌연변이 유발, 또는 무작위 돌연변이 유발, 예를 들어 당해 분야에 공지된 바와 같이 화학적 돌연변이 유발원 또는 자외선에 대한 노출이 포함된다. 이러한 돌연변이는 당해 분야에 공지된 표준 방법, 예를 들어 문헌 [참고: Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol, 1998, 440:199-206]에 기재된 바와 같은 감염성 카피 (copy)의 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 수행할 수 있다 [참고: 예를 들어, Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.].
따라서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이시키고; 이와 같이 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 적합한 발현 시스템을 이용하여 발현시키는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 북아메리카 PRRS 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스는 당해 분야에 일반적으로 공지된 적합한 발현 시스템 (그의 예들이 본원에 기재되어 있다)을 사용하여 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 발현할 수 있다. 예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 다음에 추가로 상세히 기재되는 바와 같이, 암호화된 바이러스를 시험관내 적합한 숙주 세포에서 발현할 수 있는 플라스미드의 형태일 수 있다.
북아메리카 PRRSV N 단백질 서열은 고도로 보존적이고, 보고된 서열들은 서로 약 93 내지 100% 동일률을 지니고 있다. 북아메리카 및 유럽 PRRSV N 단백질은 약 57 내지 59% 동일하고 공통의 구조적 모티프를 공유하고 있다.
예를 들어, VR2332 NES 영역 서열은 잔기 106-117에 위치하고, 서열 LPTHHTVRLIRV (서열 4) [참고: Rowland & Yoo, 2003]로써 나타내며, 렐리스태드 분리주 서열은 잔기 107-118에 위치하고, 서열 LPVAHTVRLIRV (서열 5)로써 나타낸다.
Genbank 내의 북아메리카 PRRSV 서열 내의 모든 서열을 포함하는 다음 컨센서스에서, (*)가 표시된 위치는 완전히 보존된 것이다. 대체 아미노산이 각 위치 아래에 제시된다.
LPTHHTVRLIRV (서열 4)
**VAQ******A
Q
V
G
상기 인용된 아미노산의 번호매김은 언급된 데이터베이스 등록 서열들에 따른 것이다. 상이하게 번호매길 수도 있는 기타 모든 PRRS 분리주에서는, 관심있는 PRRS 균주 내에 보존된 특징적 아미노산을 확인하고, 이를 기준 균주와 정렬시킴으로써 적절한 영역을 용이하게 확인 (동정)한다. 본 발명의 목적은 PRRS 바이러스 또는 그의 암호화 핵산을 변형시켜 하나 이상의 보존 영역이 치환, 결실 또는 삽입에 의해 제거되도록 하여 약독화 표현형이 얻어지도록 하는 것이다.
보존된 NLS-2 모티프, NoLS 영역 또는 NES 모티프를 제거하는 결실, 삽입 또는 치환은 본 발명의 암호화 바이러스 내의 폴리뉴클레오티드를 변형시킴으로써 도입한다. 바람직한 양태에서는, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산을 포함하는 결실 또는 삽입으로 인해, 보존된 모티프가 제거되고, 그로 인해 약독화 바이러스가 생성된다.
아미노산은 물리적 특성과 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여도에 따라서 분류할 수 있다. 당해 분야에서 보존적 치환은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 지닌 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것으로서 간주된다. 예시되는 보존적 치환은 바로 다음의 표 1 [참고: 1997년 3월 13일자로 공개된 WO 97/09433, page 10 (1996년 9월 6일자로 출원된 PCT/GB96/02197)]에 제시되어 있다:
보존적 치환 I
측쇄 특징 아미노산
지방족
비극성
 G A P
I L V
극성 - 전하를 띠지 않음
 C S T M
N Q
극성 - 전하를 띰
 D E
K R
방향족 H F W Y
기타 N Q D E
또 다른 한편, 보존적 아미노산은 바로 다음 표 2에 제시된 바와 같이, 문헌 [참고: L(1975), pp.71-77]에 기재된 바와 같이 분류할 수 있다:
보존적 치환 II
측쇄 특징 아미노산
비극성 (소수성)
A. 지방족: A L I V P
B. 방향족: F W
C. 황-함유: M
D. 경계선: G
전하를 띠지 않음 - 극성
A. 히드록실: S T Y
B. 아미드: N Q
C. 설프히드릴: C
D. 경계선: G
양전하를 띰 (염기성): K R H
음전하를 띰 (산성): D E
또 다른 대안으로서, 예시적인 보존적 치환이 바로 다음의 표 3에 제시된다:
보존적 치환 III
본래의 잔기 예시되는 치환물
Ala (A) Val, Leu, Ile
Arg (R) Lys, Gln, Asn
Asn (N) Gln, His, Lys, Arg
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, Gln, Asn
Met (M) Leu, Phe, Ile
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P) Gly
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala
유전적으로 변형된 PRRS 바이러스의 제조
재조합 DNA 기술은 핵산을 DNA 수준으로 변형시키는 것을 목표로 하는 극도로 다양하고 강력한 분자 생물학 기술을 포함하고, 이러한 기술을 사용함으로써 게놈을 분자상 수준으로 분석 및 변형시킬 수 있다. 이와 관련하여, PRRS 바이러스와 같은 바이러스는 그의 게놈 크기가 작기 때문에 이러한 조작에 특히 적합하다. 그러나, 재조합 DNA 기술은 비-레트로바이러스성 RNA 바이러스에 대해서는 바로 적용 가능하지 않는데, 이는 이들 바이러스가 그들의 복제시 DNA 중간 단계를 포함하고 있지 않기 때문이다. 이러한 바이러스를 위해, 재조합 DNA 기술을 그들의 게놈에 적용하여 변형된 바이러스를 생성시키기 전에 감염성 cDNA 클론을 발생시켜야 한다. 감염성 클론은 연구 중인 바이러스의 완전한 길이 (게놈 길이) cDNA (본원에서는 광범위한 의미에서 RNA의 DNA 카피 뿐만 아니라 엄격한 의미에서 mRNA의 DNA 카피를 사용한다)를 구축함으로써 유도시킬 수 있는데, 그 후에는 상기 완전한 길이의 cDNA로 형질감염시킨 세포에서 감염성 전사체를 생체내 합성하지만, 감염성 전사체는 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 시험관내 연결된 부분-길이의 cDNA 단편으로부터 시험관내 전사시킴으로써 수득할 수도 있다. 모든 경우에 있어, 상기와 같이 전사된 RNA는 상기 cDNA 내로 도입시킨 변형을 모두 수반하고 있으며, 이를 사용하여 이로써 변형된 바이러스를 추가로 계대접종할 수 있다.
유럽 PRRS 바이러스 분리주 또는 렐리스태드 바이러스의 감염성 클론의 제조는 미국 특허 제6,268,199호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. P129로 명명된 북아메리카 PRRS 바이러스 분리주 [참고: Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004]의 감염성 cDNA 클론의 제조는 미국 특허 제6,500,662호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. P129 cDNA의 서열은 Genbank 승인 번호 AF494042 및 미국 특허 제6,500,662호에 기재되어 있다. 다음 본 발명자들의 작업으로, 플라스미드 맥락에서 CMV 즉발형 (조기 발현) 프로모터에 의해 발현되고 pCMV-S-P129로 명명된 감염성 클론을 사용하였으며, 이는 또한 미국 특허 제6,500,662호에 기재되어 있다. 미국 특허 제6,500,662호에 기재된 바와 같이, 본원에서 사용하기 적합한 기타 플라스미드와 프로모터가 있다.
관심있는 개방 판독 프레임의 완전한 서열과 관심있는 아미노산 잔기의 위치가 제공된다면, 당업자는 목적하는 특정한 위치에서의 변화를 고안하기 위해 단지 코돈 표만을 찾아보면 된다. 아미노산 및 그의 대표적 약어, 부호 및 코돈에 관한 표가 다음 표 4에 제시된다.
아미노산 약어 부호 코돈(들)
알라닌 Ala A GCA GCC GCG GCU
시스테인 Cys C UGC UGU
아스파르트산 Asp D GAC GAU
글루탐산 Glu E GAA GAG
페닐알라닌 Phe F UUC UUU
글리신 Gly G GGA GGC GGG GGU
히스티딘 His H CAC CAU
이소루이신 Ile I AUA AUC AUU
리신 Lys K AAA AAG
루이신 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌 Met M AUG
아스파라긴 Asn N AAC AAU
프롤린 Pro P CCA CCC CCG CCU
글루타민 Gln Q CAA CAG
아르기닌 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌 Thr T ACA ACC ACG ACU
발린 Val V GUA GUC GUG GUU
트립토판 Trp W UGG
티로신 Tyr Y UAC UAU
코돈은 mRNA 내의 뉴클레오티드 및 그들의 상응하는 cDNA 분자의 삼중자 서열로 이루어진다. 코돈은 mRNA 분자에 존재하는 경우에는 염기 우라실 (U)을 특징으로 하지만, DNA에 존재하는 경우에는 염기 티미딘 (T)을 특징으로 한다. 특정 폴리뉴클레오티드 내의 동일한 아미노산 잔기에 대한 코돈 상의 단순한 변화는 암호화된 폴리펩티드의 서열이나 구조를 변화시키지 않을 것이다. 특정한 3개 뉴클레오티드 서열이 특정한 어떠한 아미노산을 "암호화한다"는 것을 명확히 제시하는 경우, 당업자는 상기 표가 논쟁 중인 특정한 뉴클레오티드를 확인하기 위한 수단을 제공한다는 것을 명백히 인식할 것이다. 에를 들어, 특정한 3개 뉴클레오티드 서열이 리신을 암호화하는 경우, 상기 표에는 2가지 가능한 삼중사 서열이 AAA 및 AAG라고 기술되어 있다. 글리신은 GGA, GGC, GGT (RNA에 존재하는 경우에는 GGU) 및 GGG에 의해 암호화된다. 암호화된 단백질 내에서 리신을 글리신 잔기로 변화시키기 위해서는, AAA 또는 AAG 삼중자를 암호화 핵산 중의 GGA 및 GGC, GGT 또는 GGG로 대체시킬 수도 있다. P129 분리주로부터의 N 또는 ORF7 단백질의 암호화 서열이 다음에 예시된다.
Figure 112007061685816-pct00001
NLS-2 영역에서 변형된 돌연변이체 단백질 N 폴리뉴클레오티드 서열의 구축은 실시예 2의 예시 실시예를 통하여 입증된다.
NLS-1, NoLS 또는 NES 영역 내에서의 돌연변이들도 유사한 기술과 유사한 결과를 이용하여 달성할 수 있다는 것을 인지해야 한다.
유전적으로 변형된 PRRS 바이러스가 약독화된다는 것을 입증함
유전적으로 변형된 특정한 균주가 약독화된다는 것을 입증하기 위해, 다음에 기재된 바와 같은 실험을 사용할 수도 있다.
새끼를 낳은 일이 없는 암퇘지를 무리당 10마리 이상 각 시험에 포함시켰는데, 이들은 PRRSV가 없는 농장으로부터 가져온 것이다. 동물들을 대상으로 하여 PRRS 바이러스 특이적 혈청 항체가 없는지를 시험하였는데, PRRSV에 대해 음성이었다. 각 시험에 포함된 모든 동물은 동일한 공급처로부터 가져온 것이고 사육되었다. 동물을 무작위로 여러 군으로 나누었다.
콧구멍당 105 TCID50을 수반한 1 ml PRRSV를 비내 투여하면서 임신 90일 째에 시험감염 (challenge)을 수행한다. 각 시험 구성당 적어도 3개 군이 존재하는데, 1개 군은 P129 시험감염용이고; 1개 시험군은 가능하게 약독화시킨 바이러스로의 시험감염용이며; 다른 1개 군은 대조군이다.
대조군이 연구 기간 전반에 걸쳐 PRRSV-음성인 채로 있고 대조군과 비교해서 P129 시험감염된 군에서는 건강하게 살아있는 새끼 돼지가 25% 이상 적게 태어나는 경우에 본 연구는 근거가 확실한 (유효한) 것으로 간주된다.
약독화, 달리 말하면 독력이 덜한 것은 생식기 성능이나 기타 징후학을 결정하는 한 가지 이상의 파라미터가 통계상 유의적으로 변하는 것으로 정의된다:
변형시키지 않은 모 균주 감염군과 비교해서 시험군 (가능하게는 약독화 바이러스)에 대한 다음 파라미터들 중의 한 가지 이상이 상당히 저하되면, 이는 약독화의 지표이다:
a) 사산 빈도
b) 임신 112일 이전 유산
c) 미이라된 새끼 돼지의 수
d) 생기가 없고 약한 새끼 돼지의 수
e) 이유전 사망률 (preweaning mortality).
더우기, 변형시키지 않은 모 균주 감염군과 비교해서 시험군에 대한 다음 파라미터들 중의 한 가지가 상당히 증가하는 것이 바람직하다:
f) 성숙한 암퇘지당 이유를 시작한 새끼 돼지의 수
g) 성숙한 암퇘지에게서 태어나는 건강한 새끼 돼지의 수.
또 다른 방식에서는, 호흡기 증상과 PRRSV 감염의 기타 증상을 조사하여 다음 실시예 3에 기재된 바와 같이 약독화를 정립할 수 있었다.
백신
약독화 균주는 백신을 제제화하는데 매우 유용하다. 본 발명의 백신은 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대하여 돼지를 보호하는 경우에 유효하다. 백신을 병에 걸리지 않은 1마리 이상의 돼지에게 투여한 후, 생물학적으로 순수한 바이러스 분리주 (예: VR 2385, VR 2386, P129 등)로 후속 시험감염시키면, 보호시키지 않은 유사한 돼지 (즉, 적당한 대조군)에게서 상기 분리주에 의해 전형적으로 유발되는 총체적 또는 조직병리학적 변화 (예: 폐 병변) 또는 질병 증상과 비교해서 이러한 총체적 또는 조직병리학적 변화 또는 질병 증상의 중증도가 저하되는 경우에, 해당 백신은 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대항하여 돼지를 보호시켜 준다. 보다 특히, 본 발명의 백신은 이를 필요로 하는 1마리 이상의 적합한 돼지에게 투여한 후, 적당한 시간 (예: 3주) 후에 다량의 생물학적으로 순수한 PRRS 분리주 샘플 [10(3-7) TCID(50)]로 시험감염시킴으로써 유효한 것으로 밝혀질 수 있다. 이어서, 대략 1주 후에 상기 시험감염시킨 돼지로부터 혈액 샘플을 취한 다음, 이러한 혈액 샘플로부터 PRRS 바이러스를 분리하기 위한 시도를 수행한다 (예를 들어, 다음 실험 VIII에 예시된 바이러스 분리 과정 참고). 다량의 바이러스가 분리되는 것은 본 발명의 백신이 유효하지 않을 수 있다는 지표인 반면, 소량의 바이러스가 분리되거나 바이러스가 전혀 분리되지 않는 것은 당해 백신이 유효할 수 있다는 지표이다.
따라서, 본 발명의 백신의 유효성은 정량적으로 (즉, 적당한 대조군과 비교해서 경화 폐 조직 비율의 감소) 또는 정성적으로 (예를 들어, 혈액으로부터 PRRSV의 분리, 면역검정에 의해 폐, 편도선 또는 림프절 조직 샘플 중에서 PRRSV 항원의 탐지) 평가할 수 있다. 돼지 생식기 및 호흡기 질환 증상은 정량적으로 (예: 온도/열), 반-정량적으로 [예: 호흡 곤란 중증도 (다음에 상세히 설명된다)], 또는 정성적으로 (예: 한 가지 이상 증상의 존재 또는 부재, 또는 한 가지 이상 증상, 예를 들어 청색증, 폐렴, 폐 병변 등의 중증도 저하) 평가할 수 있다.
병에 걸리지 않은 돼지는 돼지 생식기 및 호흡기 질환 감염원에 노출된 적이 전혀 없었거나 또는 돼지 생식기 및 호흡기 질환 감염원에 노출되긴 하였지만 지금은 질환 증상을 나타내지 않는 돼지이다. 병에 걸린 돼지는 PRRS 증상을 나타내거나 그로부터 PRRSV를 분리할 수 있는 돼지이다.
본 발명의 백신은 인간 (적용 가능한 경우)을 포함한 동물에게 허용 가능한 담체, 예를 들어 표준 완충제, 안정화제, 희석제, 방부제, 및/또는 가용화제를 포함하도록 승인된 규정에 따라서 제형화할 수 있고, 지속 방출을 촉진하도록 제형화할 수 있다. 희석제에는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함된다. 등장성을 위한 첨가제에는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스가 포함된다. 안정화제에는 특히 알부민이 포함된다. 변형된 생 백신을 제형화하는데 특히 유용한 것을 포함한, 기타 적합한 백신 비히클 및 첨가제는 당해 분야에 공지되어 있거나 당업자에게 명백할 것이다 [참고: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed, 1990, Mack Publishing; 이는 본원에 참고로 도입된다].
본 발명의 백신은 하나 이상의 추가의 면역조정 성분, 예를 들어 아주반트 (adjuvant) 또는 사이토킨을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 백신에 사용할 수 있는 아주반트의 비-제한적 예에는 RIBI 아주반트 시스템 (공급처: Ribi Inc., Hamilton, Mont.), 명반, 미네랄 젤, 예를 들어 수산화알루미늄 젤, 수중유 에멀션, 유중수 에멀션, 예를 들어 프로인트 (Freund) 완전 및 불완전 아주반트, 블록 공중합체 (공급처: CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (공급처: Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (공급처: Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN® 아주반트, 사포닌, 퀼 (Quil) A 또는 기타 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 및 아브리딘 (Avridine) 지질-아민 아주반트가 포함된다. 본 발명의 백신에 유용한 수중유 에멀션의 비-제한적 예에는 변형된 SEAM62 및 SEAM 1/2 제형이 포함된다. 변형된 SEAM62는 5% (v/v) 스쿠알렌 (공급처: Sigma), 1% (v/v) SPAN® 85 세정제 (공급처; ICI Surfactants), 0.7% (v/v) TWEEN® 80 세정제 (공급처: ICI Surfactants), 2.5% (v/v) 에탄올, 200 pg/ml 퀼 A, 및 100 ㎍/ml 콜레스테롤, 및 0.5% (v/v) 레시틴을 함유하는 수중유 에멀션이다. 변형된 SEAM 1/2는 5% (v/v) 스쿠알렌, 1% (v/v) SPAN® 85 세정제, 0.7% (v/v) Tween 80 세정제, 2.5% (v/v) 에탄올, 100 ㎍/ml 퀼 A, 및 50 ㎍/ml 콜레스테롤을 함유하는 수중유 에멀션이다. 본 발명의 백신에 포함될 수 있는 기타 면역조정제에는, 예를 들어 하나 이상의 인터루킨, 인터페론, 또는 기타 공지된 사이토킨이 포함된다.
본 발명의 백신은 임의로, 본 발명의 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 지속 방출시키기 위해 제형화할 수 있다. 이러한 지속 방출 제형의 예에는 생체 적합성 중합체, 예를 들어 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 메틸셀룰로스, 히알루론산, 콜라겐 등의 복합체와 조합한 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 포함된다. 약물 전달 비히클 중의 분해 가능한 중합체의 구조, 선별 및 사용은 문헌 [참고: A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292; 본원에 참고로 도입된다]을 포함한 여러 공개 문헌에 고찰되었다. 제약 제형에 사용하기 위한 중합체를 선별하고, 이러한 중합체를 사용하는 것에 관한 추가의 지침이 당해 분야에 공지된 문헌 [참고: 예를 들어, M. Chasin and R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, N. Y.; 본원에 참고로 도입된다]에 보고되었다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 본 발명의 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 미소피막화하여 투여와 효능을 개선시킬 수 있다. 항원을 미소피막화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 미국 특허 제3,137,631호; 미국 특허 제3,959,457호; 미국 특허 제4,205,060호; 미국 특허 제4,606,940호; 미국 특허 제4,744,933호; 미국 특허 제5,132,117호; 및 국제공개공보 WO 95/28227 (이들 모두가 본원에 참고로 도입된다)에 기재된 기술이 포함된다.
리포솜을 사용하여 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 지속 방출을 제공할 수도 있다. 리포솜성 제형을 제조하고 사용하는 방법에 관한 상세 내역은 특히 미국 특허 제4,016,100호; 미국 특허 제4,452,747호; 미국 특허 제4,921,706호; 미국 특허 제4,927,637호; 미국 특허 제4,944,948호; 미국 특허 제5,008,050호; 및 미국 특허 제5,009,956호 (이들 모두가 본원에 참고로 도입된다)를 참고할 수 있다.
상기 언급된 백신의 유효량은 저용량의 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터로부터 시작한 다음, 효과를 모니터링하면서 그 투여량을 증가시키는 통상적인 수단에 의해 결정할 수 있다. 유효량은 백신을 단일 투여한 후 또는 백신을 여러 차례 투여한 후에 수득할 수 있다. 각 동물에 대한 최적의 용량을 결정하고자 하는 경우에는 공지된 요인들을 고려할 수 있다. 이러한 요인에는 동물의 종, 크기, 연령 및 일반적인 상태, 해당 동물에게 기타 약물이 존재하는지의 여부 등이 포함된다. 실제 투여량은 기타 동물 연구로부터의 결과를 고려한 후에 선택하는 것이 바람직하다.
적절한 면역 반응이 달성되었는지를 탐지하는 한 가지 방법은 백신 접종한 후 해당 동물에게서 혈청전환 및 항체 역가를 결정하는 것이다. 백신 접종 타이밍과 부스터 (존재하는 경우) 횟수는 관련된 모든 요인들 (이들 중의 몇몇이 상기 언급되었다)을 분석한 것에 근거하여 의사 또는 수의사가 결정하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있는 요인들, 예를 들어 백신 접종하고자 하는 동물의 체중을 고려하여 공지된 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 본 발명의 백신 중의 본 발명의 바이러스의 용량은 바람직하게 약 101 내지 109 pfu (플라크 형성 단위), 보다 바람직하게 약 102 내지 108 pfu, 가장 바람직하게 약 103 내지 107 pfu의 범위이다. 본 발명의 백신 중의 본 발명의 플라스미드의 용량은 바람직하게 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg, 보다 바람직하게 약 1 ㎍ 내지 약 10 mg, 보더 더 바람직하게 약 10 ㎍ 내지 약 1 mg의 범위이다. 본 발명의 백신 중의 본 발명의 감염성 RNA 분자의 용량은 바람직하게 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg, 보다 바람직하게 약 1 ㎍ 내지 약 10 mg, 보더 더 바람직하게 약 10 ㎍ 내지 약 1 mg의 범위이다. 본 발명의 백신 중의 본 발명의 바이러스 벡터의 용량은 바람직하게 약 101 내지 109 pfu, 보다 바람직하게 약 102 내지 108 pfu, 보다 더 바람직하게 약 103 내지 107 pfu의 범위이다. 적합한 투여량 크기는 약 0.5 ml 내지 약 10 ml, 보다 바람직하게는 약 1 ml 내지 약 5 ml의 범위이다.
예를 들어, 백신은 경구, 비경구, 피내, 피하, 근육내, 비내 또는 정맥내 전달할 수 있다. 경구 전달은, 예를 들어 해당 조성물을 동물의 사료 또는 음료에 부가하는 것을 포괄할 수 있다. 백신 투여량과 관련된 요인에는, 예를 들어 돼지의 체중 및 연령이 포함된다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 PRRS 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 중의 어느 하나의 유효량을, 제약용 또는 수의용으로 허용 가능한 담체와 합하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 PRRS 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 생 약독화 백신을 미국 특허 제6,500,662호에 기재된 바와 같이 변형시켜, 공지된 재조합 기술을 사용하여 PRRS 바이러스 게놈 내로 삽입되는 이종 항원성 에피토프를 암호화할 수 있다. 본 발명에 대한 이종 항원성 에피토프로서 유용한 항원성 에피토프에는 PRRS 바이러스 이외의 돼지 병원체로부터의 항원성 에피토프, 예를 들어 돼지 파보바이러스 (parvovirus), 돼지 시르코바이러스 (circovirus), 돼지 로타바이러스 (rotavirus), 돼지 인플루엔자, 슈도라비스 바이러스 (pseudorabies virus), 전파 가능한 위장염 바이러스, 돼지 호흡기 코로나바이러스, 전통적인 돼지열 바이러스, 아프리카산 돼지열 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 돼지 파라믹소바이러스 (paramyxovirus), 악티노바실루스 플레우로뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실루스 수이스 (Actinobacillus suis), 바실루스 안트라시 (Bacillus anthraci), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 클로스트리듐 해모리티쿰 (Clostridium haemolyticum), 클로스트리듐 페르프링겐스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 에리시펠로트딕스 루시오파티애 (Erysipelothdix rhusiopathiae), 해모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis), 렙토스피라 종 (Leptospira spp.), 미코플라스마 히오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae), 미코플라스마 히오리니스 (Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 히오시노비아 (Mycoplasma hyosynovia), 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 살모넬라 콜레래수이스 (Salmonella choleraesuis), 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 스트렙토코쿠스 에퀴스밀리스 (Streptococcus equismilis), 및 스트렙토코쿠스 수이스 (Streptococcus suis)로 이루어진 군에서 선택된 돼지 병원체로부터의 항원성 에피토프가 포함된다. 전술된 돼지 병원체로부터의 항원성 에피토프를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지되어 있고, NCBI가 제공하는 Genbank와 같은 공개 유전자 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html)로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 부가의 특징 및 변동들은 발명의 상세한 설명을 포함한 본원 전문으로부터 당업자에게는 명백할 것이며, 이러한 특징 모두는 본 발명의 국면으로서 간주된다. 마찬가지로, 본원에 언급된 본 발명의 특징은 부가의 양태들로 재조합되어, 이러한 특징 조합이 본 발명의 국면 또는 양태로서 구체적으로 언급되었는지에 상관없이 본 발명의 국면으로서 간주된다. 또한, 본 발명에 중요한 것으로 본원에 기재되는 상기 제한 사항은 그 자체로 고찰되어야 하고; 본 발명에 중요한 것으로 본원에 기재되지 않은 제한 사항이 결여된 본 발명의 변동 역시 본 발명의 국면으로서 간주된다. 본 발명이 전술된 설명과 실시예에 특정하게 기재된 것과는 달리 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다.
상기 교시 측면에서 보면 본 발명의 수 많은 변형 및 변동이 가능하므로, 이들 역시 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이로써 제한되지 않는다.
실시예 1: 셔틀 플라스미드 pTB-셔틀-PRRSV-3997의 구축
특정 변형을 완전한 길이의 PRRS 바이러스 게놈 cDNA 클론 내로 도입하는 것을 촉진시키기 위해 셔틀 플라스미드를 구축하였다. 바이러스 게놈의 맨 끝 3' 말단을 나타내는 3,997 bp 단편 (21개 잔기 폴리아데노신 꼬리를 포함한, 뉴클레오티드 위치 11,504 내지 15,416) 및 하단 벡터 서열의 84 bp를 PCR-증폭시켰다. PCR 반응은 GeneAmp PCR 시스템 2400 (공급처: Perkin Elmer)를 사용하여, 5 ng의 pCMV-S-P129 플라스미드 DNA (참고: US 6,500,662 Bl), 300 ng의 정배향 프라이머 P-셔틀-Fwd (5'-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3') (서열 8): 위치 11,504 내지 11,530), 300 ng의 역배향 프라이머 P-셔틀-Rev 프라이머 (5'- ATCTTATCATGTCTGGATCCCCGCGGC-3') (서열 9): 위치 15,500 내지 15,475), 1 mM의 각각의 dCTP, dGTP, dATP, 및 dTTP, 1 x PCR 완충액 [10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM 트리스 (Tris)-HCl (pH 8.8), 2 mM MgSO4, 0.1% 트리톤 (Triton) X-100], 및 2.5 U의 Pfu DNA 폴리머라제 (공급처: Stratagene)를 포함하였다. 반응물을 95℃에서 5분 동안 가열하고, 다음 조건 하에 증폭 35주기를 수행하였다: 95℃에서 30초 동안 변성시키고, 55℃에서 1분 동안 프라이머 어닐링시키며, 72℃에서 3분 동안 연장시킴. 이러한 PCR 생성물을, TrueBlue 마이크로카트릿지™ PCR 클로닝 키트 XL (공급처: Genomics One; Buffalo, New York)를 사용하여 pTrueBlue 벡터 내로 클로닝하여 pTB-셔틀-PRRSV-3997을 창출시켰다.
실시예 2: NLS-2 서열을 변형시켜 P129-GG 바이러스를 생성시킴
PCR에 의거한 부위-지시된 돌연변이 유발을 사용하여, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질의 아미노산 위치 41 내지 47에 위치한 핵 국재화 신호 2 (NLS-2) 모티프를 변형시켰다. 북아메리카 유전자형 PRRS 바이러스 중에서 이러한 NLS 모티프는 일반적으로 PGKKNKK (원형 분리주 VR-2332 또는 캐나다 분리주 PA-8에서와 같음), 또는 그의 유도체, 예를 들어 PGKKSKK (분리주 P129 및 93-47324에서 발견됨)이다. 여러 개의 양전하를 띤 리신 (K) 또는 아르기닌 (R) 잔기가 존재하는 것은 완전한 기능적 NLS 신호에 있어 중요한 것으로 여겨진다. N 단백질의 위치 43 및 44에 위치한 리신 잔기 (P129 게놈의 뉴클레오티드 위치 14,999-15,004)를, 상기 셔틀 플라스미드와 돌연변이 유발성 프라이머 쌍 KK43/44GG-Fwd (5'- GGCAAGGGACCGGGAGGGGGAAATAAGAAGAAAAAC-3') (서열 10)-: 게놈 위치 14,984 내지 15,019) 및 KK43/44GG-Rev (5'-GTTTTTCTTCTTATTTCCCCCTCCCGGTCCCTTGCC-3') (서열 11)-: 게놈 위치 14,984 내지 15,019) [밑줄친 것은 KKS로부터 GGN으로의 아미노산 치환에 대한 코돈 변화를 나타낸다]을 사용하여 글리신 잔기로 대체시켰다. 5 ng의 pTB-셔틀-PRRSV-3997 플라스미드 DNA, 300 ng의 각각의 정배향 및 역배향 프라이머; 1 mM 농도의 각각의 dCTP, dGTP, dATP, 및 dTTP, 1 x PCR 완충액 [10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM 트리스-HCl (pH 8.8), 2 mM MgSO4, 0.1% 트리톤 X-100], 및 2.5 U의 Pfu DNA 폴리머라제 (공급처: Stratagene)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 샘플을 대상으로 하여 다음 조건 하에 증폭 16주기를 수행하였다: 94℃에서 30초 동안 변성시키고, 55℃에서 1분 동안 프라이머 어닐링시키며, 68℃에서 12분 30초 동안 프라이머 연장시킴. PCR 주기 후, PCR-생성물을 10 U의 DpnI로 분해시켜 메틸화 플라스미드 DNA 주형을 제거하였다. 이. 콜라이 (E. coli) XLl-Blue 세포를, 돌연변이된 플라스미드를 함유하는 4 ㎕의 PCR-DpnI 분해시킨 반응물과 함께 열 쇽함으로써 형질전환시키고, 이를 앰피실린을 함유하는 LB 한천 판 위에 놓아두었다. 집락을 무작위로 골라내고 밤새 배양하였다. 퀴아프렙 (QIAprep) 스핀 미니프렙 키트 (공급처: Qiagen)를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 뉴클레오티드 서열 분석함으로써 목적하는 돌연변이 (PGGGNKK)의 존재를 확증하였고, 이로써 생성된 플라스미드를 pTB-셔틀-N-GG로 명명하였다.
GG 돌연변이를 수반하는 셔틀 플라스미드 (pTB-셔틀-N-GG)와 야생형의 완전 한 길이의 게놈 클론 (pCMV-S-P129)은 각각 독특한 BsrGI 및 SpeI 부위 (각각 위치 1,192 및 3,963, 및 위치 12,692 및 15,463)를 함유하고 있다. 이들 2개 효소로 분해시킨 후, 2,772 bp BsrGI-SpeI 단편을 pTB-셔틀-N-GG로부터 겔 정제하였고, 16,120 bp BsrGI-SpeI 단편을 pCMV-S-P129로부터 겔 정제하였다. 이들 두 단편을 T4 DNA 리가제 (공급처: Invitrogen)를 사용하여 연결시켜 GGN-변형된 완전한 길이의 게놈 cDNA 클론을 구축하였다. 이. 콜라이 균주 DH5-α를 상기 연결 반응물 10 ㎕로 형질전환시켰다. 앰피실린을 함유하는 LB 판으로부터 세균성 집락을 선별하고, 플라스미드 DNAs를 제조하였다. XmaI 분해 패턴에 기초하여, 완전한 길이의 클론을 선별하였다. 이와 같이 선별된 클론을 서열 분석하여 상기 완전한 길이의 게놈 cDNA 클론에 GGN 변형이 존재한다는 것을 확인하였다. 이로써 생성된 플라스미드 중의 하나가 pCMV-S-P129-GG로 명명되었다.
MARC-145 세포를 37℃ 및 5% CO2 하에, 8% 태아 소 혈청 (FBS; 공급처: Gibco BRL), 페니실린 (100 U/ml), 및 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml)을 보충시킨 둘벡코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 성장시켰다. 세포를 35 mm-직경 디쉬에 시딩하고, 70% 밀집도가 되도록 성장시켰다. 리포펙틴 (Lipofectin; 공급처: Invitrogen)을 사용하여 상기 세포를 2 ㎍의 pCMV-S-P129-GG 플라스미드 DNA로 24시간 동안 형질감염시켰다. 이와 같이 형질감염시킨 세포를, 8% FBS를 보충시킨 DMEM에서 37℃ 하에 5일 동안 항온 배양하였다. 형질감염시킨지 3일 후에 PRRSV-특이적 세포변성 효과 (CPE)를 관찰하였고, 형질감염시킨지 5일 후에는 이러한 세포변성 효과가 이 웃 세포로 추가로 확산되는 것이 관찰되었다. CPE의 특이성은 비-구조 단백질 nsp2 및 nsp3, 및 N-특이적 MAb SDOW17에 대한 토끼 항혈청을 사용하여 면역형광 세포 염색시킴으로써 확증되었다 (도 1 참고). 형질감염시킨지 5일 후에, 형질감염된 세포로부터 배양 상등액을 수거하고, 이를 'Pl29-GG 계대 1' (Pl)로 명명하였다. 이러한 계대-1 바이러스를 사용하여 신선한 Marc-145 세포를 접종하고, 5일 후 수거물을 '계대-2' (P2)로 명명하였다. '계대-3' (P3) 바이러스를 P2와 동일한 방식으로 제조하였다. 각 바이러스성 계대를 사용할 때까지 -80℃ 하에 1 ml 분취액에 저장하였다. P129-GG 바이러스의 각 계대를 플라크 검정에 의해 적정한 결과, 역가는 계대 1, 2 및 3에 대해 각각 lx102, 5x102, 및 5x103 pfu/ml인 것으로 결정되었다. 야생형 P129 바이러스를 pCMV-S-P129로부터 생성시키고, 이를 병행해서 적정한 결과, 계대 1, 2 및 3에 대해 각각 lx103, 1x104, 및 5x105 pfu/ml의 역가를 산출하였다.
실시예 3: 돼지를 P129-GG 바이러스 및 모 P129 바이러스로 감염시킴 (P129-GG 바이러스가 약독화된 것임을 입증함)
PRRSV 및 미코플라스마 히오뉴모니애로 인해 야기된 병력이 없거나 이러한 병원체에 대항하여 백신 접종한 적이 없는 건강한 교배종 돼지 21마리를 무작위로 3개 처리군 (각 처리군당 7마리)에 배정하였다. 대략 6주생의 TOl 돼지에게는 플라시보 (위약)을 투여하는 반면, T02 및 T03 돼지는 유전적으로 변형된 P129-GG 바이러스 (플라스미드 pCMV-S-P129-GG로부터 생성됨) 또는 모 P129 PRRS 바이러스 (플라스미드 pCMV-S-P129로부터 생성됨) 각각 2.5 x 104 pfu/ml (1회분당 5.0 x 104 pfu)로 희석시킨 바이러스 원액 2.0 ml로 비내 시험감염시켰다. 모든 돼지를 대상으로 하여 일반적 상태, 우울증, 식욕 상실, 재채기, 기침, 및 호흡 곤란을 포함한 임상 징후를 알아보기 위해 매일 관찰하였다. 직장 온도와 체중을 기록하였다. PRRSV 분리 및 혈청학을 알아보기 위해 혈액 샘플을 0, 4, 7, 10, 14, 21, 및 28일 째에 취하였다. 14일 (군당 2마리 돼지) 및 28일 (군당 5마리 돼지) 째에 부검을 수행하였고, 조직 샘플 (폐 및 편도선)을 수집하였다. 폐 병변 중증도 추정치와 각 폐엽의 경화율 (%)을 만들었다. T02 및 T03 처리군의 돼지들은 온순한 수준의 PRRS 바이러스 감염 징후를 나타내었고, 혈청에 바이러스를 유출시켰으며 혈청 전환되었다. 감염시키지 않은 대조군 돼지 (TOl)는 혈청 바이러스혈증에 대해 음성이었고, PRRS 바이러스에 대한 항체에 대해서도 음성이었다.
P129 모 바이러스로 감염된 돼지 (T03)와 비교해서, P129-GG 바이러스로 감염된 돼지 (T02)는 그들의 혈청 내에 바이러스를 덜 유출시켰고 (도 2a 및 2b), 보다 고 수준의 항-PRRS ELISA 항체 (도 2C 및 2D), 및 중화 항체 (도 2e)를 생성시켰다.
Figure 112007061685816-pct00002
감염 후 7일, 14일, 21일 및 28일 째에 T02 및 T03 처리군 둘 다에서 혈청 중화 역가를 결정하였다. 중화 역가는 96 웰 판에서 TCID50을 두 번 되풀이하여 측정함으로써 결정하였다. 각 웰에서는 100 ㎕ 용적의 야생형 P129 바이러스 200 pfu를 일련의 2배 혈청 희석액 (앞서 56℃ 하에 30분 동안 열 불활성화시킴) 100 ㎕와 합하였다. 이 혼합물을 37℃ 하에 1시간 동안 항온 배양한 다음, 세포를 감염시켰다. 이와 같이 감염시킨 세포를 5일 동안 항온 배양하고, CPEs를 결정하였다. 그 데이터가 다음에 제시되었는데, 이는 돌연변이체 바이러스로 감염된 돼지는 야생형 모 바이러스로 감염된 돼지보다 더 높은 평균 중화 역가를 나타냈다는 것을 보여준다.
Figure 112007061685816-pct00003
PRRSV 감염에 있어서의 특징들 중의 하나는 바이러스가 편도선에 존속한다는 것이다. 따라서, 연구가 종결될 무렵 (감염 후 4주째) 감염된 모든 돼지와 모의 감염된 2마리의 대조군 돼지로부터 편도선을 수집하고, RT-PCR에 의해 바이러스성 존속에 대해 조사하였다. GG 바이러스 또는 P129 바이러스로 감염된 모든 돼지에게서는 N 유전자가 RT-PCR에 의해 탐지 가능하였지만, 모의 감염된 돼지로부터의 편도선은 여전히 음성이었다. 이는 감염된 모든 돼지가 감염 후 4주 째에 바이러스를 유출하였다는 지표이다. N 유전자의 NLS에서의 가능한 돌연변이를 조사하기 위해, 편도선으로부터의 PCR 생성물을 서열 분석하였다.
5마리 모든 돼지에서, 편도선에 존속하는 GG 바이러스가 위치 43 또는 44에서의 아르기닌의 도입으로 인해 NLS-2 서열이 돌연변이된 것으로 밝혀졌다. 편도선으로부터의 야생형 P129 바이러스는 돌연변이되지 않았고 야생형 NLS-2 서열을 그대로 유지하였다.
실시예 4: NLS-2의 복귀-저항성 돌연변이
실시예 2에 기재된 Pl29-GG 돌연변이는 6개 뉴클레오티드를 변화시킴으로써 창출시켰다. 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 이러한 바이러스는 부분적 또는 완전히 복귀할 수 있고, 무작위 돌연변이와 천연 선별로 인해 비교적 고 빈도로 모 NLS-음성 표현형을 되찾을 수 있다. 특히 백신 목적상 바람직한 본 발명의 양태는 복귀 가능성을 최소화하고, 기타 플랭킹 잔기가 염기성 잔기 (예: 리신 및 아르기닌)로 돌연변이될 가능성을 최소화함으로써 해당 영역 내에 기능적 NLS 모티프가 복원될 가능성을 최소화하도록 고안된 추가의 뉴클레오티드 치환 및/또는 결실을 함유할 것이다. 염기성 잔기를 암호화하는 코돈으로 돌연변이시키기 위해 2개 또는 3개의 별개의 뉴클레오티드 변화를 요구하는 코돈이 단지 하나의 변화만을 요구하는 코돈에 비해 바람직하다. 결실 돌연변이물은 거의 복귀되지 않는데, 이는 해당 영역 일부가 제거되었기 때문이다. 돌연변이에 의해 pat7, pat4, 또는 기타 NLS 모티프가 재획득될 기회를 저하시키기 위해서는, 플랭킹 아미노산에 대한 대체 코돈을 선택할 수 있다. 이러한 "복귀 저항성" 돌연변이물의 예가 표 6에 제시되어 있고, 이는 제한적이라기보다는 대표적인 것으로 간주된다. 이러한 정보가 제공된다면, 당업자는 복귀 저항성 돌연변이물의 기타 예들을 고려할 수 있다.
표 8에서, 돌연변이체 바이러스 P129-d43/44는 아미노산 43 및 44가 결실된 것이다. 또한, 위치 45의 세린 코돈이 AGT에서 TCT로 변화되어 이것이 리신 또는 아르기닌 코돈으로 돌연변이될 가능성이 감소되었다. 또한, 위치 49의 아스파라긴 코돈 (AAC)이 동일한 이유로 인해 세린 코돈 (TCC)로 변하였다. 세린은 몇몇 천연 발생적 야외 분리주에서 위치 49에서 발견되었기 때문에, 잘 견뎌야만 한다. 최소 pat7 NLS 모티프 (PGSKKKS)는 상기 돌연변이체 내에 유지된 채로 있고, 부분 NLS 활성을 지닐 수도 있다. 부분 NLS 활성을 지닌 바이러스가 야생형 (모) 바이러스와 완전한 NLS 녹아웃 (knockout) 돌연변이체 사이의 중간 정도인 표현형을 지닌 것으로 추정되었다. 이러한 바이러스가 백신으로서 특히 유용할 수 있다.
Figure 112007061685816-pct00004
표 8에 제시된 기타 3가지 돌연변이체 (P129-d43/44/46, P129-d44/46/47, 및 P129-d46/47/48)는 3개의 아미노산이 결실된 것이고, 이는 상기 논의된 위치 45 및 49에서의 코돈 변화를 지니고 있다. 이들 돌연변이물에는 NLS 모티프가 결여되어 있고, NLS 활성의 완전한 녹아웃을 지니는 것으로 추정된다. 이들 바이러스는 돼지에서 약독화되는 것으로 예상되므로, 백신으로서 특히 유용하다.
표 8에 기재된 돌연변이물에 대한 정배향 및 역배향 프라이머는 다음과 같다:
정배향 프라이머 (5' - 3')
Figure 112007061685816-pct00005
역배향 프라이머 (5' - 3')
Figure 112007061685816-pct00006
상기 설명과 실시예는 NLS-2 영역이 바이러스 증식을 위해서는 요구되지 않지만, 편도선에 존속하는 바이러스만이 돌연변이되었다는 사실로써 입증된 바와 같이, PRRSV에 대한 중요한 독력 인자이라는 것을 입증해준다. 본 발명자들은 또한, PRRSV N 단백질 중의 NLS가 보다 높은 중화 항체 및 보다 높은 ELISA 역가와 전적으로 상관이 있다는 것을 입증하였다. 따라서 본 발명자들은 NLS-2 서열 모티프를 제거시키는 돌연변이로 인해, PRRSV의 약독화 균주가 산출된다는 사실을 확립하였다.
번호첨부한 발명의 설명
1. a) NLS-2 영역, NoLS 영역 및 NES 영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 보존 영역에서 변형되어 해당 보존 영역이 제거된 N 단백질을 포함하는 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스로서 약독화된 PRRS 바이러스; b) a)의 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자; 및 c) b)의 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로 이루어진 군에서 선택된 PRRS 감염원을 포함하는 조성물. 2. 제1항에 있어서, 보존된 NLS-1 영역이 제거되도록 추가로 변형된 조성물. 3. 제1항에 있어서, 상기 보존 영역이 비보존적 아미노산 치환의 도입에 의해 제거된 조성물. 4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보존 영역이 적어도 부분적으로 결실된 조성물. 5. 제1항에 있어서, 보존 영역이 NoLS 영역인 조성물. 6. 제1항에 있어서, 보존 영역이 NLS-2 영역인 조성물. 7. 제1항에 있어서, 보존 영역이 NES 영역인 조성물. 8. 제1항에 있어서, PRRS 바이러스가 북아메리카 PRRS 바이러스인 조성물. 9. 제1항에 있어서, PRRS 바이러스가 유럽 PRRS 바이러스인 조성물. 10. 제8항에 있어서, 보존 영역이 NLS-2 영역인 조성물. 11. 제10항에 있어서, N 단백질의 잔기 42 및 43이 글리신인 조성물. 12. 제10항에 있어서, N 단백질의 잔기 42 및 43이 글리신이고, 잔기 44가 아스파라긴인 조성물. 13. 제10항에 있어서, NLS-2 영역이 적어도 부분적으로 결실된 조성물. 14. 제13항에 있어서, N 단백질의 잔기 43 내지 48 중의 하나 이상이 결실된 조성물. 15. 제14항에 있어서, N 단백질의 잔기 43과 44 둘 다가 결실된 조성물. 17. 제14항에 있어서, N 단백질의 잔기 43, 44 및 46이 결실된 조성물. 18. 제14항에 있어서, N 단백질의 잔기 44, 46 및 47이 결실된 조성물. 19. 제14항에 있어서, N 단백질의 잔기 46, 47 및 48이 결실된 조성물. 20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 복귀 가능성을 최소화하도록 고안된 추가의 뉴클레오티드 돌연변이, 치환 및/또는 결실을 함유하는 조성물.
21 . PRRS 바이러스에 의한 감염에 대항하여 면역보호를 유발시키는 데 유효한 양의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물; 및 수의용으로 허용 가능한 담체를 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하기 위한 백신. 22. 돼지 동물에게 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대항하여 면역보호를 유발시키는 데 유효한 양의 제20항의 백신을 접종하는 것을 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하는 방법. 23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 형질감염시킨 숙주 세포.
24. a) PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이시켜 NLS-2 영역, NoLS 영역 및 NES 영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 보존 영역에서 변형되어 해당 보존 영역이 제거된 N 단백질을 포함하는 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를 생성시키는 단계; 및 b) 이러한 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스를, PRRS 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포 내로 도입시키는 단계를 포함하는, 유전적으로 변형되고 약독화된 PRRS 바이러스를 제조하는 방법. 25. 제24항에 있어서, 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스가 북아메리카 PRRS 바이러스인 방법. 26. 제24항에 있어서, 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스가 유럽 PRRS 바이러스인 방법. 27. 제24항에 있어서, PRRS 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포가 MARC-145 세포인 방법. 28. 제24항에 있어서, PRRS 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포가 살아있는 돼지 동물 내에 들어있는 것인 방법. 29. 본원에 기재된 본 발명 모두 또는 상기 언급된 모든 청구항 조합.
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. Yoo, Dongwan Lee, Changhee Calvert, Jay G. Welch, Siao-Kun W. <120> MUTANT PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS <130> PC32632A <160> 31 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 1 Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 1 5 <210> 2 <211> 32 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 2 Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro 1 5 10 15 Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 3 Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe 1 5 10 15 Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu 20 25 30 Arg <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 4 Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 5 Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val 1 5 10 <210> 6 <211> 123 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 6 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ser Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Gly Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 7 <211> 369 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 7 atgccaaata acaacggcaa gcagcaaaag aaaaagaagg ggaatggcca gccagtcaat 60 cagctgtgcc agatgctggg taaaatcatc gcccagcaaa accagtccag aggcaaggga 120 ccgggcaaga aaagtaagaa gaaaaacccg gagaagcccc attttcctct agcgaccgaa 180 gatgacgtca ggcatcactt cacccctggt gagcggcaat tgtgtctgtc gtcgatccag 240 actgccttta accagggcgc tggaacttgt accctgtcag attcagggag gataagttac 300 actgtggagt ttagtttgcc gacgcatcat actgtgcgcc tgatccgcgt cacagcatca 360 ccctcagca 369 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 8 actcagtcta agtgctggaa agttatg 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 9 atcttatcat gtctggatcc ccgcggc 27 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 10 ggcaagggac cgggaggggg aaataagaag aaaaac 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 11 gtttttcttc ttatttcccc ctcccggtcc cttgcc 36 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 12 Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ser Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro 1 5 10 15 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 13 ggcaagggac cgggcaagaa aagtaagaag aaaaacccgg agaagccc 48 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 14 Gly Lys Gly Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro 1 5 10 15 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 15 ggcaagggac cgggaggggg aaataagaag aaaaacccgg agaagccc 48 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 16 Gly Lys Gly Pro Gly Ser Lys Lys Lys Ser Pro Glu Lys Pro 1 5 10 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 17 ggcaagggac cgggctctaa gaagaaatcc ccggagaagc cc 42 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 18 Gly Lys Gly Pro Gly Ser Lys Lys Ser Pro Glu Lys Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 19 ggcaagggac cgggctctaa gaaatccccg gagaagccc 39 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 20 Gly Lys Gly Pro Gly Lys Ser Lys Ser Pro Glu Lys Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 21 ggcaagggac cgggcaagtc taaatccccg gagaagccc 39 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 22 Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ser Ser Pro Glu Lys Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 23 ggcaagggac cgggcaagaa atcttccccg gagaagccc 39 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 24 gtccagaggc aagggaccgg gatctaagaa gaaatccccg gag 43 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 25 gtccagaggc aagggaccgg gatctaagaa atccccggag 40 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 26 gcaagggacc gggaaagtct aaatccccgg agaagcccc 39 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 27 gcaagggacc gggaaagaaa tcttccccgg agaagcccc 39 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 28 ctccggggat ttcttcttag atcccggtcc cttgcctctg gac 43 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 29 ctccggggat ttcttagatc ccggtccctt gcctctggac 40 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 30 ggggcttctc cggggattta gactttcccg gtcccttgc 39 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 31 ggggcttctc cggggaagat ttctttcccg gtcccttgc 39

Claims (19)

  1. a) pat7 또는 pat8 모티프가 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 비보존적 아미노산 치환의 도입에 의해 중단되도록 NLS-2 영역이 변형된 N 단백질을 포함하는 유전적으로 변형되고 약독화된 북아메리카 PRRS 바이러스;
    b) a)의 유전적으로 변형된 북아메리카 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자; 및
    c) b)의 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택된 북아메리카 PRRS 감염원을 포함하며,
    여기서, 상기 N 단백질의 NLS-2 영역이 다음 중 하나 이상을 달성하도록 변형된 것인 제약 조성물:
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43 및 44에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 글리신임;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43 및 44에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 글리신이고, 서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 45에 상응하는 잔기가 아스파라긴임;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 잔기 41 내지 47에 상응하는 잔기들을 포함하는 NLS-2 영역이 적어도 부분적으로 결실됨;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43 내지 48에 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 잔기가 결실됨;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43 및 44에 상응하는 위치에 있는 두 잔기가 결실됨;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43, 44 및 46에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 결실됨;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 44, 46 및 47에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 결실됨; 및
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 46 내지 48에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 결실됨.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 바이러스의 N 단백질이 다음 중 하나 이상을 제외하고는 서열 6과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물:
    위치 43 및 44에 있는 잔기들이 글리신임;
    위치 43 및 44에 있는 잔기들이 결실됨;
    위치 43, 44 및 46에 있는 잔기들이 결실됨;
    위치 44, 46 및 47에 있는 잔기들이 결실됨; 및
    위치 46 내지 48에 있는 잔기들이 결실됨.
  8. PRRS 바이러스에 의한 감염에 대항하여 면역보호를 생성하는 데 유효한 양의 제1항 또는 제7항의 제약 조성물, 및 수의용으로 허용가능한 담체를 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하기 위한 백신.
  9. PRRS 바이러스에 의한 감염에 대항하여 면역보호를 생성하는 데 유효한 양의 제8항의 백신을 돼지 동물에게 접종하는 것을 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하는 방법.
  10. 제1항의 북아메리카 PRRS 감염원을 포함하는 형질감염된 숙주 세포.
  11. pat7 또는 pat8 모티프가 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 비보존적 아미노산 치환의 도입에 의해 중단되도록 NLS-2 영역이 변형된 N 단백질을 포함하는 유전적으로 변형되고 약독화된 북아메리카 PRRS 바이러스를, 북아메리카 PRRS 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포 내에 도입시키는 것을 포함하며,
    여기서, 상기 N 단백질의 NLS-2 영역이 다음 중 하나 이상을 달성하도록 변형된 것인, 유전적으로 변형되고 약독화된 북아메리카 PRRS 바이러스를 제조하는 방법:
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43 및 44에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 글리신임;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43 및 44에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 글리신이고, 서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 45에 상응하는 잔기가 아스파라긴임;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 잔기 41 내지 47에 상응하는 잔기들을 포함하는 NLS-2 영역이 적어도 부분적으로 결실됨;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43 내지 48에 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 잔기가 결실됨;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43 및 44에 상응하는 위치에 있는 두 잔기가 결실됨;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 43, 44 및 46에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 결실됨;
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 44, 46 및 47에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 결실됨; 및
    서열 6에 기재된 N 단백질의 위치 46 내지 48에 상응하는 위치에 있는 잔기들이 결실됨.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제11항에 있어서, 상기 바이러스의 N 단백질이 다음 중 하나 이상을 제외하고는 서열 6과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법:
    위치 43 및 44에 있는 잔기들이 글리신임;
    위치 43 및 44에 있는 잔기들이 결실됨;
    위치 43, 44 및 46에 있는 잔기들이 결실됨;
    위치 44, 46 및 47에 있는 잔기들이 결실됨; 및
    위치 46 내지 48에 있는 잔기들이 결실됨.
  18. 제11항 또는 제17항에 있어서, 북아메리카 PRRS 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포가 MARC-145 세포인 방법.
  19. 제11항 또는 제17항에 있어서, 북아메리카 PRRS 복제를 지원할 수 있는 숙주 세포가 살아있는 돼지 동물 내에 있는 세포인 방법.
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