MX2007009060A - Mutantes de la proteina n del virus del sindrome reproductor y respiratorio de los porcinos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un virus PRRS modificado geneticamente y polinucleotidos que lo codifican; se proporcionan tambien vacunas que comprenden el virus modificado geneticamente y los polinucleotidos.

Description

MUTANTES DE LA PROTEINA N DEL VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTOR Y RESPIRATORIO DE LOS PORCINOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un virus PRRS modificado genéticamente y polinucleótidos que lo codifican. Se proporcionan también vacunas que comprenden el virus modificado genéticamente y los polinucleótidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El síndrome reproductor y respiratorio de los porcinos (PRRS) se caracteriza por abortos, partos con producto muerto, y otros problemas reproductores en las cerdas multíparas y jóvenes, así como enfermedad respiratoria en los cerdos jóvenes. El agente causal es el virus PRRS, un miembro de la familia Arteriviridae y el orden Nidovirales. Dos genotipos distintos del virus emergieron casi simultáneamente en América del Norte y en Europa a finales de los años 1980. El virus PRRS es hoy en día endémico en casi todos los países productores de puercos, y está considerado como una de las enfermedades más importantes económicamente que afectan a la industria porcina mundial. Actualmente, las vacunas comerciales contra el PRRS incluyen vacunas vivas modificadas y vacunas muertas (desactivadas). Las vacunas muertas han sido criticadas por fallo en la inducción de una inmunidad fuerte contra las cepas heterólogas del virus PRRS. Las vacunas vivas modificadas están atenuadas por pasos en serie en cultivo de células hasta que se pierde la virulencia. Las vacunas vivas modificadas provocan una protección más amplia que las vacunas muertas, pero pueden presentar numerosos problemas de seguridad que incluyen virulencia residual, propagación a los cerdos no vacunados, y reversión genética a la virulencia. Debido a cambios antígénicos que tienen lugar durante el proceso de atenuación, tales vacunas pueden perder también algo de su capacidad para proteger contra las cepas de campo virulentas del virus PRRS. Por tanto, existe una necesidad acuciante de vacunas vivas modificadas nuevas y mejoradas para proteger contra el PRRS.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un virus PRRS modificado genéticamente que se ha modificado dentro de la región NLS-2, la región NoLS, y/o la región NES de la proteína de la nucleocápsida (N) de tal modo que el virus PRRS resultante está atenuado. La presente invención proporciona adicionalmente una molécula infecciosa de RNA que codifica el virus modificado genéticamente y una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica la molécula infecciosa de RNA arriba citada. La invención proporciona también un cultivo biológicamente activo de los virus citados (es decir esencialmente exento de otros virus) y describe un vector vírico que comprende una secuencia de DNA codificante de una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus PRRS modificado genéticamente como se ha citado arriba. La presente invención proporciona adicionalmente una célula hospedadora transfectada que comprende cualquiera de los virus que anteceden, moléculas infecciosas de RNA, polinucleótidos aislados o vectores víricos arriba citados. La presente invención proporciona adicíonalmente una vacuna para proteger un animal porcino contra la infección por un virus PRRS, vacuna que comprende un virus PRRS modificado genéticamente como se ha citado arriba; una molécula infecciosa de RNA como se ha citado arriba que codifica el virus PRRS modificado genéticamente; una molécula de polinucleótido aislada citada arriba (opcionalmente en forma de un plásmido), que codifica el virus PRRS modificado genéticamente; o el vector vírico arriba citado que codifica el virus PRRS modificado genéticamente; en una cantidad eficaz para producir inmunoprotección contra la infección por un virus PRRS; y un vehículo aceptable para uso veterinario. La invención proporciona adicionalmente mutaciones de NLS-2 resistentes a la reversión. Modalidades preferidas de la invención, especialmente para propósitos de vacuna, contendrán sustituciones y/o deleciones adicionales de nucleótidos, diseñadas para minimizar la probabilidad de reversión, y para minimizar la probabilidad de que otros residuos flanqueantes muten a residuos básicos tales como lisina y arginína y restablezcan con ello un motivo NLS funcional en la región. La presente invención proporciona adicionalmente un método para proteger un animal porcino contra la infección por un virus PRRS, que comprende vacunar el animal con una cantidad de la vacuna arriba citada que es eficaz para producir inmunoprotección contra la infección por un virus PRRS. La invención proporciona un método para producir un virus PRRS modificado genéticamente, método que comprende mutar la secuencia de DNA codificante de una molécula infecciosa de RNA que codifica el virus PRRS como se ha descrito arriba, y expresar el virus PRRS modificado genéticamente utilizando un sistema de expresión adecuado. Un virus PRRS, sea de tipo salvaje o modificado genéticamente, puede expresarse a partir de una molécula polinucleotídica aislada, utilizando sistemas de expresión adecuados conocidos generalmente en la técnica, ejemplos de los cuales se describen en esta solicitud. Por ejemplo, la molécula polinucleótido aislada puede encontrarse en la forma de un plásmido capaz de expresar el virus codificado en una célula hospedadora adecuada in vitro, como se describe con mayor detalle más adelante. Otras características de la invención serán evidentes después de la revisión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1A. Dibujo que muestra la posición y secuencia de la mutación NLS dentro de la proteína P129 de la nucleocápsida. Figura 1 B. Fotomicrografías de células MARK-145 infectadas falsamente, infectadas con P129, e infectadas con P129-GG. La fila superior muestra placas típicas utilizando microscopía de contraste de fases, mientras que la fila inferior muestra la tinción con anticuerpo fluorescente de los focos infectados utilizando el anticuerpo monoclonal SDOW17 conjugado con FITC. Obsérvese la ausencia de tinción de la nucleocápsida en los núcleos y nucléolos de las células infectadas con P129-GG. Figura 2A. Número de cerdos virémicos los días 0 a 28 después de la infección por grupos de tratamiento (7 cerdos por grupo).

Figura 2B. Título medio de virus en los sueros de los cerdos los días 0 a 28 después de la infección, por grupo de tratamiento. Figura 2 C. Niveles medios de anticuerpo ELISA (relaciones S/P) en los sueros de los cerdos los días 0 a 28 después de la infección, por grupo de tratamiento. Figura 2D. Una retitulación de los sueros representados en la Figura 2C; todas las muestras se diluyeron en relación 1 :5 antes del ensayo a fin de apreciar mejor las diferencias en las muestras con títulos altos. Figura 2E. Títulos medios de neutralización del suero en los cerdos infectados durante el estudio de cuatro semanas. Breve Descripción de las Secuencias SEQ ID NO: 1 Residuos 41-47 de la proteína N del aislado VR2332 de PRRSV norteamericano SEQ ID NO: 2 Secuencia de la región NoLS de VR2332 SEQ ID NO: 3 Secuencia de la región NoLS de Lelystad SEQ ID NO: 4 La región NES del aislado VR2332 SEQ ID NO: 5 La región NES del aislado Lelystad SEQ ID NO: 6 Secuencia de aminoácidos de la proteína N del aislado P129 SEQ ID NO: 7 Secuencia de nucleótidos de ORF7 (codifica la proteína N) del aislado P129 SEQ ID NO: 8 Iniciador P-SHUTTLE-FWD SEQ ID NO: 9 Iniciador P-SHUTTLE-REV SEQ ID NO: 10 Iniciador mutágeno KK43/44GG-Fwd SEQ ID NO: 11 Iniciador mutágeno KK43/44GG-REV SEQ ID NO: 12 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de aminoácidos de la región NLS2 de P129 ts: SEQ ID NO: 13 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencias de nucleótidos de la región NLS2 de P129 ts: SEQ ID NO: 14 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de aminoácidos de la región NLS2 de P129-GG: SEQ ID NO: 15 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de nucleótidos de la región NLS2 de P129-GG: SEQ ID NO: 16 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de aminoácidos de la región NLS2 de P129-d43/44: SEQ ID NO: 17 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de nucleótidos de la región NLS2 de P129-d43/44: SEQ ID NO: 18 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de aminoácidos de la región NLS2 de P129-d43/44/46: SEQ ID NO: 19 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de nucleótidos de la región NLS2 de P129-d43/44/46: SEQ ID NO: 20 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de aminoácidos de la región NLS2 de P129-d44/46/47: SEQ ID NO: 21 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de nucleótidos de la región NLS2 de P129-d44/46/47: SEQ ID NO: 22 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de aminoácidos de la región NLS2 de P129-d46/47/48: SEQ ID NO: 23 Mutantes de deleción de la Tabla 8. Secuencia de nucleótidos de la región NLS2 de P129-d46/47/48: SEQ ID NO: 24 P129-d43/44F SEQ ID NO: 25 P129-d43/44/46F SEQ ID NO: 26 P129-d44/46/47F SEQ ID NO: 27 P129-d46/47/48F SEQ ID NO: 28 P129-d43/44R SEQ ID NO: 29 P129-d43/44/46R SEQ ID NO: 30 P129-d44/46/47R SEQ ID NO: 31 P129-d46/47/48R Referencias Citadas Doan, D.N.P., y Dokland T. (2003). Estructura de la proteína de la nucleocápsida del virus del síndrome reproductor y respiratorio de los porcinos. Structure 11(11), 1445-1451. Lee, C, Calvert, G.J., Welch, S.-K.W., y Yoo, D. (2005). Un sistema genético inverso lanzado por DNA para el virus del síndrome reproductor y respiratorio de los porcinos revela que la homodimerización de la proteína de la nucleocápsida es esencial para la infectívidad del virus. Virology 331 , 47-62. Rowland, R.R., Kervin, R., Kuckleburg, C, Sperlich, A., y Benfield, D.A. (1999). 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DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describe en esta memoria método de atenuación de un virus PRRS virulento por mutación o delecíón de la región NLS-2, la región NoLS, o la región NES en la proteína de la nucleocápsida o proteína N (codificada por ORF7) del virus, una composición inmunógena que comprende dicho virus atenuado, y un método de protección de los puercos contra el PRRS por vacunación con dichas composiciones inmunógenas. Los virus PRRS que han sido atenuados por este método deberían retener las características antigénicas de la cepa de campo virulenta y proporcionar por tanto protección más potente que las vacunas basadas en virus atenuados por cultivo de células. La proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV, que es codificada por ORF7, es una proteína básica pequeña que está fosforilada (Wootton, Rowland, y Yoo, 2002) y forma omodímeros (Wootton y Yoo, 2003). La estructura cristalina ha sido determinada recientemente (Doan y Dokland, 2003). La proteína N parece tener funciones múltiples en la célula infectada. Además de formar una estructura de cápsida esférica en la cual está empaquetado el RNA genómico, un proceso que tiene lugar en el citoplasma, una porción de proteína N es transportada al núcleo y específicamente al nucléolo de la célula infectada. La secuencia de aminoácidos de la proteína N contiene dos señales de localizacíón nuclear (NLS), una señal de locallzación nucleolar (NoLS), y una señal de exportación nuclear (NES) que facilitan el transporte al núcleo y al nucléolo, y la exportación del núcleo, respectivamente (Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; Rowland y Yoo, 2003). Mientras se encuentra en el nucléolo, la proteína N interacciona con la pequeña proteína fibrillarina asociada al RNA nucleolar y puede regular el procesamiento del rRNA y la biogénesis del ribosoma en la célula infectada a fin de favorecer la replicación del virus (Yoo et al., 2003). En la presente invención, se demuestra que las mutaciones y delecíones dentro de los motivos NLS, NoLS, y NES de la proteína N pueden dar como resultado virus viables con tráfico nuclear aberrante, y que los virus que contienen tales mutaciones son útiles como vacunas contra el PRRS. Las mutaciones víricas de este tipo son valiosas, sea solas o en combinación con otras mutaciones atenuantes, para diseñar nuevas vacunas contra el PRRS. DEFINICIONES "Una respuesta inmunoprotectora eficaz", "Inmunoprotección". y términos análogos, para los propósitos de la presente invención, significan una respuesta inmunológica que está dirigida contra uno o más epítopes antígénicos de un patógeno a fin de proteger contra la infección por el patógeno en un animal vacunado. Para los propósitos de la presente invención, protección contra la infección por un patógeno incluye no sólo la prevención absoluta de la infección, sino también cualquier reducción detectable en el grado o tasa de infección por un patógeno, o cualquier reducción detectable en la gravedad de la enfermedad o cualquier síntoma o condición resultante de la infección por el patógeno en el animal vacunado en comparación con un animal no vacunado infectado. Una respuesta inmunoprotectora eficaz puede inducirse en animales que no han estado infectados previamente con el patógeno y/o no están infectados con el patógeno en el momento de la vacunación. Una respuesta ¡nmunoprotectora eficaz puede inducirse también en un animal ya infectado por el patógeno en el momento de la vacunación. Un virus PRRS modificado genéticamente está "atenuado" sí es menos virulento que su cepa parental sin modificar. Una cepa es "menos virulenta" si exhibe una disminución estadísticamente significativa en uno o más parámetros determinantes de la gravedad de la enfermedad. Tales parámetros pueden incluir nivel de viremia, fiebre, gravedad de la dificultad respiratoria, gravedad de los síntomas reproductores, o número o gravedad de las lesiones pulmonares, etc. "Virus PRRS europeo" se refiere a cualquier cepa de virus PRRS que tenga las características genéticas asociadas con el virus PRRS que fue aislado por primera vez en Europa alrededor de 1991 (véase, v.g., Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q., 13:121-130). Se hace referencia a veces también en la técnica al "virus PRRS europeo" como "virus Lelystad". "Modificado genéticamente", tal como se utiliza en esta memoria y a no ser que se indique otra cosa, significa mutado genéticamente por intervención humana, donde "mutado" significa el reemplazamiento de un aminoácido por otro o el reemplazamiento del nucleótido codificante por otro (v.g. C en lugar de T), es decir, una denominada "sustitución", preferiblemente de una manera que el aminoácido codificado se cambia, o cualquier otra mutación tal como "deleción" o "inserción". La mutación se lleva a cabo siempre en la secuencia del nucleótido codificante. "Célula hospedadora capaz de soportar la replicación del virus PRRS" significa una línea de células que es capaz de generar PRRS infeccioso cuando está infectada con un virus de la invención. Tales células incluyen células macrófagos alveolares de porcino y derivados de células macrófagos alveolares de porcino, células MA-104 y derivados de células MA-104, células MARC-145 y derivados de células MARC-145, y células transfectadas con un receptor para el virus PRRS. Para la demostración del Fenotipo de placa pequeña de la invención se prefieren especialmente las células MARC-145. La expresión "célula hospedadora capaz de soportar la replicación del virus PRRS" puede incluir también células que se encuentran en un cerdo vivo. "Respuesta inmunolóqica", para los propósitos de esta invención, significa la producción de anticuerpos y/o células (tales como línfocítos T) que están dirigidas contra, o favorecen la descomposición o inhibición de, un epítope antígénico particular o epítopes antigénicos particulares. "Virus PRRS norteamericano" significa cualquier virus PRRS que tenga las características genéticas asociadas con un aislado del virus PRRS norte-americano, tales como, pero sin carácter limitante, las del virus PRRS que fue aislado por primera vez en los Estados Unidos alrededor de principios de los años 1990 (véase, v.g., Collins, J.E, et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); el aislado MN-1b del virus PRRS norteamericano (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293-296); la cepa de PRRS Quebec IAF-exp91 (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418); y el aislado VR2385 del virus PRRS norteamericano (Meng, X -J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801 ). Las características genéticas se refieren a la semejanza de secuencia de nucleótidos genómica y semejanza de secuencia de aminoácidos compartidas por las cepas de virus PRRS norteamericano. "Marco de lectura abierto", o "ORF", como se utiliza en esta memoria, significa la secuencia de nucleótidos mínima requerida para codificar una proteína del virus PRRS particular sin un codón de parada intermedio. "Porcino" y "puerco" se utilizan intercambiablemente en esta memoria y hacen referencia a cualquier animal que es un miembro de la familia Suidae tal como, por ejemplo, un cerdo. El término "virus PRRS", como se utiliza en esta memoria, a no ser que se indique otra cosa, significa cualquier cepa de los virus PRRS norteamericano o europeo. "PRRS" abarca los síntomas de enfermedad en los puercos causados por una infección con el virus PRRS. Ejemplos de tales síntomas incluyen, pero sin carácter limitante, fiebre, aborto en las hembras preñadas, dificultad respiratoria, lesiones pulmonares, pérdida de apetito y mortalidad en los cerdos jóvenes. Como se utiliza en esta memoria, un virus PRRS que es "incapaz de producir PRRS" hace referencia a un virus que puede infectar un cerdo, pero que no produce ninguno de los síntomas de enfermedad asociados normalmente con una infección por PRRS en el cerdo. "Proteína N" o "ORF7" del PRRSV. tal como se utiliza en esta memoria, se define como un polipéptido que es codificado por el ORF7 de ambos genotipos europeo y norteamericano del virus PRRS. Ejemplos de isotipos específicos de la proteína N que se conocen actualmente son el polipéptido de 123 aminoácidos del aislado VR2322 del prototipo de PRRS norteamericano consignado en Genbank por el número de acceso PRU87392, y la proteína N de 128 residuos deL aislado Lelystad del PRRS prototipo europeo consignado en Genbank con el número de acceso A26843. "Reqión NLS-1 de la proteína N de PRRSV" o "región NLS-1 del ORF7 de PRSV" hace referencia a una señal de localización nuclear "pat4" o "nucí" (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003) que contiene cuatro aminoácidos básicos continuos (lisina o arginína), o tres residuos básicos y una histidina o prolina, localizados dentro de aproximadamente los 15 primeros residuos N-terminales de la proteína N madura. A modo de ejemplo, la secuencia de la región NLS-1 de VL2332 es KRKK y está localizada en los residuos 9-12, mientras que la secuencia del aislado Lelystad es KKKK y está localizada en los residuos 10-13 de la proteína N.

"La región NLS-2 la proteina N de PRRSV" o "reqión NLS-2 de ORF7 de PRRSV" hace referencia a una segunda señal de localización nuclear dentro de la proteína N que puede adoptar una de dos formas. En los virus PRRS norteamericanos, NLS-2 tiene un patrón que ha sido designado por los autores de la presente invención como el motivo "patd", que comienza con una prolina seguida dentro de tres residuos por una secuencia de cinco residuos que contiene al menos tres residuos básicos (K o R) de un total de cinco (una ligera modificación del motivo "pat7" o "nuc3" descrito por Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). A modo de ejemplo, una secuencia de este tipo está localizada en los residuos 41-47 de la proteína N del aislado VR2332 de PRRSV norteamericano, y se representa por la secuencia PGKKNKKK (SEQ ID NO: 1). En los virus PRRS europeo, NLS-2 tiene un motivo "pat4" o "nucí", que es un tramo continuo de cuatro aminoácidos básicos o tres residuos básicos asociados con histidina o prolina (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). La NLS-2 del aislado Lelystad de PRRSV europeo está localizada en los residuos 47-50 y se representa por la secuencia KKKK. "Reqión NoLS de la proteína N de PRRSV" o "reqión NoLS de ORF7 de PRRSV" hace referencia a una señal de localizacíón nucleolar que tiene una longitud total de aproximadamente 32 aminoácidos y que incorpora la región NLS-2 cerca de su término amino. A modo de ejemplo, la secuencia de la región NoLS de VR2332 está localizada en los residuos 41-72 y se representa por la secuencia PGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSER (SEQ ID NO: 2) (Rowland & Yoo, 2003) y la secuencia del aislado Lelystad correspondiente está localizada en los residuos 42-73 y se representa por la secuencia PRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTER (SEQ ID NO: 3). "Reqión NES de la proteina N de PRRSV" o "reqión NES de ORF7 de PRRSV" hace referencia a una señal de exportación nuclear que contiene un motivo LXL localizado cerca del terminal del extremo del terminal carboxi de la proteína N. El motivo NES es X-R (2-5)-X-R2-X-R-Y donde X es leucina, ¡soleucina o valina, Y es leucina, isoleucina, valina o alanina y R es cualquier aminoácido. Como se muestra más adelante, los aislados de los prototipos norteamericano y Europa están de acuerdo con este esquema, teniendo ambos un espaciador de 5 residuos.

"Célula hospedadora transfectada" significa prácticamente cualquier célula hospedadora que, como se describe en la patente US 5.600.662, cuando se transfecta con RNA del virus PRRS, puede producir una primera tanda de viriones de PRRS. Si se desea infección productiva adicional, podría utilizarse una "célula hospedadora capaz de soportar la replicación del virus PRRS" como se define más adelante. Las moléculas de polinucleótidos pueden mutarse genéticamente utilizando métodos recombinantes conocidos por quienes poseen una experiencia ordinaria en la técnica, con inclusión de mutagénesis orientada, o por mutagénesis aleatoria, por ejemplo por exposición a mutágenos químicos o a radiación, como es conocido en la técnica. Dichas mutaciones pueden llevarse a cabo por métodos estándar conocidos en la técnica, v.g., mutagénesis orientada (véase, v.g., Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) de una copia infecciosa como se ha descrito (v.g. Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol, 1998, 440:199-206). De acuerdo con ello, la presente invención proporciona adicionalmente un método para producir un virus PRRS norteamericano modificado genéticamente, método que comprende dar la secuencia de DNA codificante de una molécula de RNA infecciosa que codifica el virus PRRS como se ha descrito arriba, y expresar el virus PRRS modificado genéticamente utilizando un sistema de expresión adecuado. Un virus PRRS modificado genéticamente puede ser expresado por una molécula de polinucleótido aislada utilizando sistemas de expresión adecuados conocidos en la técnica, ejemplos de los cuales se describen en esta solicitud. Por ejemplo, la molécula de polinucleótido aislada puede encontrarse en la forma de un plásmido capaz de expresar el virus codificado en una célula hospedadora adecuada in vitro, como se describe más adelante con mayor detalle. Las secuencias de la proteína N de PRRSV norteamericano están altamente conservadas y las secuencias consignadas tienen aproximadamente 93-100% de identidad unas con otras. Las proteínas N de PRRSV norteamericano y Europa son idénticas aproximadamente en un 57-59% y comparten motivos estructurales comunes. A modo de ejemplo, la secuencia de la región NES de VR2332 está localizada en los residuos 106-117 y se representa por la secuencia LPTHHTVRLIRV (SEQ ID NO: 4) (Rowland & Yoo, 2003) y la secuencia del aislado Lelystad está localizada en los residuos 107-118 y se representa por la secuencia LPVAHTVRLIRV (SEQ ID NO: 5). En el consenso que sigue, que incluye todas las secuencias contenidas en las secuencias PRRSV norteamericano incluidas en Genbank, las posiciones con un (*) están completamente conservadas. Bajo cada posición se muestran aminoácidos alternativos. LPTHHTVRLIRV(SEQ ID NO: 4) * *VAQ* * * * * *A Q V G La numeración de los aminoácidos referenciados arriba está de acuerdo con las entradas en la base de datos mencionadas. En todos los restantes aislados de PRRS, que podrían numerarse de modo diferente, la identificación de las regiones apropiadas se consigue fácilmente por identificación de los aminoácidos característicos conservados en una cepa PRRS de interés y alineación de la misma con una cepa de referencia. Es un objeto de la presente invención modificar un PRRS o sus ácidos nucleicos codificantes de tal modo que una o más regiones conservadas se eliminan por sustituciór,, deleción o inserción, dando como resultado un fenotipo atenuado. Deleciones, inserciones, o sustituciones que eliminan el motivo NLS2 conservado, la región NoLS, o el motivo NES se introducen por modificación de nucleótidos en los virus codificantes de la invención. En una modalidad preferida, una deleción o inserción que comprende 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos da como resultado la eliminación de un motivo conservado y conduce a un virus atenuado. Los aminoácidos pueden clasificarse de acuerdo con sus propiedades físicas v su contribución a la estructura secundaria v terciaria de las proteínas. Una sustitución conservadora se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Sustituciones conservadoras ilustrativas se presentan inmediatamente a continuación en la Tabla 1 (tomada del documento WO 97/09433, página 10. publicado el 13 de marzo de 1997 (PCT/GB96/02197. presentado en fecha 9/6/96)). Tabla 1 Sustituciones conservadoras I CARACTERÍSTICA DE LA CADENA LATERAL AMINOÁCIDO Alifática No-polar GAP ILV Polar - sin carga CSTM NQ Polar: cargada DE KR Aromática HFWY Otras NQDE Alternativamente, aminoácidos conservadores pueden agruparse como se describe en Lehninger [Biochemistry, 2a Edición; Worth Publishers, Inc. Nueva York:Nueva York (1975), pp.71-77] como se expone inmediatamente a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2 Sustituciones Conservadoras II CADENA LATERAL CARACTERÍSTICA AMINOÁCIDO No polar (hidrófoba) A. Alifática: ALI VP B. Aromática: FW C. Sulfurada M D. Límite: G Sin carga-polar A. Hídroxilo: STY B. Amida: NQ C. Sulfhidrilo: C D. Límite: G Cargada positivamente (básica): KRH Cargada negativamente (acida): DE Como otra alternativa adicional, sustituciones conservadoras ilustrativas se exponen inmediatamente a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3 Sustituciones Conservadoras lll Residuo Original Sustitución Ilustrativa Ala (A) Val, Leu, lie Arg (R) Lys, Gln, Asn Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) Asp His (H) Asn, Gln, Lys, Arg He (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe Leu (L) lie, Val, Met, Ala, Phe Lys (K) Arg, Gln, Asn Met (M) Leu, Phe, lie Phe (F) Leu, Val, lie, Ala Pro (P) Gly Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Val (V) lie, Leu, Met, Phe, Ala Preparación de Virus PRRS Modificado Genéticamente La tecnología del DNA recombinante comprende técnicas de biología molecular extremadamente variadas y poderosas encaminadas a la modificación de ácidos nucleicos al nivel del DNA y hace posible analizar y modificar genomas al nivel molecular. A este respecto, los virus tales como el virus PRRS, debido al pequeño tamaño de su genoma, son particularmente adecuados para tales manipulaciones. Sin embargo, la tecnología del DNA recombínante no es inmediatamente aplicable a virus de RNA no retrovírícos, dado que estos virus no incluyen un paso intermedio de DNA en su replicación. Para tales virus, tienen que desarrollarse clones de cDNA infecciosos antes de poder aplicar la tecnología del DNA recombínante a su genoma para generar virus modificados. Los clones infecciosos pueden derivarse por la construcción de cDNA de longitud total (longitud genómíca) (utilizado en este caso en el sentido amplio de una copia de DNA de RNA y no sólo en el sentido estricto de una copia de DNA de mRNA) del virus objeto de estudio, después de lo cual se sintetiza in vivo un transcrito infeccioso en las células transfectadas con el cDNA de longitud total, pero pueden obtenerse también transcritos infecciosos por transcripción in vitro a partir de fragmentos de cDNA de longitud parcial ligados in vitro que comprenden el genoma completo del virus. En todos los casos, el RNA transcrito lleva todas las modificaciones que se han introducido en el cDNA y puede utilizarse para sometimiento ulterior a pasos del virus así modificado. La preparación de un clon infeccioso de un aislado del virus PRRS europeo o virus Lelystad se describe en la patente U.S. No. 6.268.199 que se incorpora en esta memoria completamente por referencia. La preparación de un clon de cDNA infeccioso de un aislado del virus PRRS norteamericano designado P129 (Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004) se describe en la patente US 6.500.662 que se incorpora por la presente totalmente por referencia. La secuencia de cDNA de P129 se describe en el Número de Acceso a Genbank AF494042 y en la patente US 6.500.662. El trabajo de los autores de la presente invención que sigue hace uso de un clon infeccioso de este tipo que, en el contexto de un plásmido, se expresa por el promotor temprano inmediato CMV y ha sido designado pCMV-S-P129 y se describe también en la patente US 6.500.662. Como se describe en la patente US 6.500.662, existen otros plásmidos y promotores adecuados para uso en esta invención. Dada la secuencia completa de cualquier marco de lectura abierto de interés y la localización de un residuo de aminoácido de interés, una persona con experiencia ordinaria necesita simplemente consultar una tabla de codones para diseñar cambios en la posición particular deseada. Una tabla de aminoácidos y sus abreviaturas, símbolos y codones representativos se expone a continuación en la Tabla 4 siguiente.

Tabla 4 Los codones constituyen secuencias de tripletes de nucleótidos en mRNA y sus moléculas de cDNA correspondientes. Los codones se caracterizan por la base uracilo (U) cuando están presentes en una molécula de mRNA, pero se caracterizan por la base timidína (T) cuando están presentes en DNA. Un cambio simple en un codón para el mismo residuo de aminoácido dentro de un nucleótido no cambiará la secuencia o estructura del polípéptido codificado. Es evidente que cuando una frase indica que una secuencia particular de 3 nucleótidos "codifica" cualquier aminoácido particular, el profesional con experiencia ordinaria podría reconocer que la tabla anterior proporciona un medio para identificar los nucleótidos particulares en cuestión. A modo de ejemplo, sí una secuencia particular de tres nucleótidos codifica lisina, la tabla anterior índica que las dos secuencias de tripletes posibles son AAA y AAG. La glicina es codificada por GGA, GGC, GGT (GGU si se trata de RNA) y GGG. Para cambiar un residuo lisina a glicina en una proteína codificada, podría reemplazarse un triplete AAA o AAG con cualquiera de GGA y GGG, GGT o GGG en al ácido nucleico codificante. La secuencia codificante de la proteína N o ORF del aislado P129 se ilustra a continuación.

La construcción de una secuencia de polinucleótidos mutante de la proteína N modificada en las regiones NLS-2 se demuestra a modo de ejemplo ilustrativo en el Ejemplo 2. Se apreciará que mutaciones en las regiones NLS-1, NoLS o NES pueden realizarse con técnicas similares y resultados similares. Demostración de oue un Virus PRRS Modificado Genéticamente está Atenuado Para demostrar que una cepa particular modificada genéticamente está atenuada podría utilizarse un experimento como el que se describe a continuación. Se incluyen en cada prueba al menos 10 cerdas jóvenes por grupo, procedentes de una granja exenta de PRRSV. Se comprueba que los animales están exentos de anticuerpos específicos del virus PRRS y son negativos para PRRSV. Todos los animales incluidos en la prueba son de la misma procedencia y raza. La asignación de los animales a los grupos es aleatoria. Se realiza el enfrentamiento el día 90 de la preñez con aplicación intranasal de 1 ml de PRRSV con 105 TCID50 en cada orificio nasal. Hay al menos tres grupos por cada disposición de ensayo. Un grupo para enfrentamiento a P129; un grupo de ensayo para enfrentamiento con el virus posiblemente atenuado; y un grupo de control estricto. El estudio se considera válido cuando los controles estrictos se mantienen negativos a PRRSV durante todo el desarrollo del estudio y nacen como mínimo 25% menos de lechones vivos sanos en el grupo enfrentado a P129 en comparación con los controles estrictos. La atenuación, o dicho de otro modo menor virulencia, se define como el cambio estadísticamente significativo de uno o más parámetros que determinan la eficiencia reproductora u otra sintomatología: Reducción significativa en al menos uno de los parámetros siguientes para el grupo de ensayo (virus posiblemente atenuado) en comparación con el grupo infectado con la cepa parental sin modificar sería una indicación de atenuación: a) frecuencia de nacidos muertos b) aborto en o antes del día 112 de la preñez c) número de lechones momificados d) número de lechones menos vivaces y débiles e) mortalidad antes del destete Adicionalmente, se prefiere un aumento significativo en uno de los parámetros siguientes para el grupo de ensayo comparado con el grupo infectado con la cepa parental sin modificar: f) número de lechones destetados por cerda g) número de lechones sanos vivos nacidos por cerda Como alternativa, podrían examinarse los síntomas respiratorios y otros síntomas de la infección por PRRSV para establecer la atenuación como se describe en el Ejemplo 3 más adelante. Vacunas Una cepa atenuada es valiosa para formulación de vacunas. La vacuna presente es eficaz si la misma protege un cerdo contra la infección por un virus PRRS. Una vacuna protege un cerdo contra la infección por un virus PRRS si, después de la administración de la vacuna a uno o más cerdos no afectados, un enfrentamiento subsiguiente con un aislado biológicamente puro del virus (v.g., VR2385, VR2326, P129, etc.) da como resultado una menor gravedad de cualesquiera cambios evidentes o histopatológicos (v.g., lesiones en el pulmón) y/o de síntomas de la enfermedad, en comparación con los cambios o síntomas causados típicamente por el aislado en cerdos similares que no están protegidos (es decir, con relación a un control apropiado). Más particularmente, puede demostrarse que la presente vacuna es eficaz por administración de la vacuna a uno o más cerdos adecuados que se encuentran en necesidad de ello, y luego, después de un período de tiempo apropiado (v.g., 3 semanas), enfrentamiento con una muestra grande (10<3_7) TCID(50)) de un aislado de PRRSV biológicamente puro. Se extrae luego una muestra de sangre del cerdo sometido al enfrentamiento al cabo de aproximadamente una semana, y se realiza después un intento de aislar el virus de la muestra de sangre (v.g., véase el procedimiento de aislamiento de virus ilustrado en el Experimento Vlll más adelante). El aislamiento de una gran cantidad del virus es una indicación de que la vacuna puede no ser eficaz, mientras que el aislamiento de cantidades reducidas del virus (o la ausencia de virus) es una indicación de que la vacuna puede ser eficaz. Así pues, la eficacia de la presente vacuna puede evaluarse cuantitativamente (es decir, una disminución en el porcentaje de tejido pulmonar consolidado en comparación con un grupo de control apropiado) o cualitativamente (v.g., aislamiento de PRRSV de la sangre, detección de antígeno de PRRSV en una muestra de tejido de pulmón, amígdala o ganglio linfático por un inmunoensayo). Los síntomas de la enfermedad reproductora y respiratoria de los porcinos pueden evaluarse cuantitativamente (v.g., temperatura/fiebre), semí-cuantitativamente (v.g., gravedad de la dificultad respiratoria [explicada en detalle más adelante], o cualitativamente (v.g., la presencia o ausencia de uno o más síntomas o una reducción en la gravedad de uno o más síntomas, tales como cianosis, neumonía, lesiones pulmonares, etc.). Un cerdo no afectado es un cerdo que o bien no ha estado expuesto a un agente infeccioso de la enfermedad reproductora y respiratoria de los porcinos, o que ha estado expuesto a un agente infeccioso de la enfermedad reproductora y respiratoria de los porcinos pero no presenta síntomas de la enfermedad. Un cerdo afectado es uno que exhibe síntomas de PRRS o del cual puede aislarse PRRSV. Las vacunas de la presente invención pueden formularse siguiendo el convenio aceptado para incluir vehículos aceptables para animales, con inclusión de humanos (en su caso), tales como tampones, estabilizadores, diluyentes, conservantes y/o solubílizadores estándar, y puede formularse también para facilitar liberación prolongada. Los diluyentes incluyen agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, y análogos. Los aditivos para isotonicidad incluyen cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol, y lactosa, entre otros. Los estabilizadores incluyen albúmina, entre otros. Otros vehículos y aditivos de vacunas adecuados, con inclusión de aquéllos que son particularmente útiles en la formulación de vacunas vivas modificadas, son conocidos o serán evidentes para los expertos en la técnica, véase, v.g., Remington's Pharmaceutícal Science, Edición 18a, 1990, Mack Publishíng, que se incorpora en esta memoria por referencia. Las vacunas de la presente invención pueden comprender además uno o más componentes inmunomoduladores adicionales tales como, v.g., un adyuvante o citoquína, entre otros. Ejemplos no limitantes de adyuvantes que pueden utilizarse en la vacuna de la presente invención incluyen el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), alumbre, geles minerales tales como gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite-en-agua, emulsiones de agua-enaceite tales como, v.g., los adyuvantes completo e incompleto de Freund, copolímero Block (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge, Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville, Calif.), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, el monofosforil-lípído A, y el adyuvante lípido-amina, Avridina. Ejemplos no limitantes de emulsiones de aceite-en-agua útiles en la vacuna de la invención incluyen las formulaciones modificadas SEAM 62 y SEAM 1/2. SEAM 62 modificada es una emulsión de aceite-en-agua que contiene 5% (v/v) de escualeno (Sigma), 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85 (ICI Surfactants), 0,7% (v/v) de detergente Tween® 80 (ICI Surfactants), 2,5% (v/v) de etanol, 200 pg/ml de Quil A, 100 µg/ml de colesterol, y 0,5% (v/v) de lecitina. SEAM 1/2 modificada es una emulsión de aceite-en-agua que comprende 5% (v/v) de escualeno, 1% (v/v) de detergente SPAN® 85, 0,7% (v/v) de detergente Tween 80, 2,5% (v/v) de etanol, 100 µg/ml de Quil A, y 50 µg/ml de colesterol. Otros agentes inmunomoduladores que pueden incluirse en la vacuna incluyen, v.g., una o más interleuquinas, interferones, u otras citoquinas conocidas. Las vacunas de la presente invención pueden formularse opcionalmente para liberación prolongada del virus, la molécula infecciosa de RNA, el plásmido o el vector vírico de la presente invención. Ejemplos de tales formulaciones de liberación prolongada incluyen virus, molécula infecciosa de RNA, plásmido, o vector vírico en combinación con composiciones de polímeros bíocompatibles, tales como, v.g., polí(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólíco), metilcelulosa, ácido hialuróníco, colágeno y análogos. La estructura, selección y uso de polímeros degradables en vehículos de suministro de fármacos han sido revisados en varias publicaciones, que incluyen A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292, que se incorpora en esta memoria por referencia. Orientación adicional en la selección y utilización de polímeros en formulaciones farmacéuticas pueden encontrarse en textos conocidos en la técnica, por ejemplo M. Chasin y R. Langer (compiladores), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" en: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, N.Y., que se incorpora también en esta memoria por referencia. Como alternativa, o adicionalmente, el virus, plásmido, o vector vírico puede estar microencapsulado para mejorar la administración y eficacia. Métodos para microencapsulación de antígenos son bien conocidos en la técnica, e incluyen métodos descritos, v.g., en los documentos U.S. Pat. No. 3.137.631 ; U.S. Pat. No. 3.959.457; U.S. Pat. No. 4.205.060; U.S. Pat. No. 4.606.940; U.S. Pat. No. 4.744.933; U.S. Pat. No. 5.132.117; y la Publicación de Patente Internacional WO 95/28227, todos los cuales se incorporan en esta memoria por referencia. También pueden utilizarse liposomas para proporcionar la liberación prolongada de virus, plásmido, o vector vírico. Detalles concernientes al modo de producir y utilizar formulaciones de líposomas pueden encontrarse, entre otros lugares, en los documentos U.S. Pat. No. 4.016.100; U.S. Pat. No. 4.452.747; U.S. Pat. No. 4.921.706; U.S. Pat. No. 4.927.637; U.S. Pat. No. 4.944.948; U.S. Pat. No. 5.008.050; y U.S. Pat. No. 5.009.956, todos los cuales se incorporan en esta memoria por referencia. Una cantidad eficaz de cualquiera de las vacunas arriba descritas puede determinarse por medios convencionales, comenzando con una dosis baja de virus, plásmido o vector vírico, y aumentando luego la dosificación al tiempo que se observan los efectos. Una cantidad eficaz puede obtenerse después de una sola administración de una vacuna o después de administraciones múltiples de una vacuna. Factores conocidos pueden tomarse en consideración cuando se determina una dosis óptima por animal. Éstos incluyen la especie, el tamaño, la edad y el estado general del animal, la presencia de otros fármacos en el animal, y análogos. La dosificación real se selecciona preferiblemente después de la consideración de los resultados a partir de otros estudios con animales. Un método para detectar si se ha conseguido una respuesta inmune adecuada consiste en determinar la seroconversión y el título de anticuerpos en el animal después de la vacunación. El momento oportuno de la vacunación y el número de refuerzos, en su caso, serán determinados preferiblemente por un médico o veterinario basándose en el análisis de todos los factores relevantes, algunos de los cuales se han descrito arriba. La cantidad de dosis eficaz de virus, molécula infecciosa de RNA, plásmido, o vector vírico, de la presente invención puede determinarse utilizando técnicas conocidas, tomando en consideración factores que pueden ser determinados por una persona con experiencia ordinaria en la técnica tales como el peso del animal a vacunar. La cantidad de dosis de virus de la presente invención en una vacuna de la presente invención es con preferencia desde aproximadamente 101 a aproximadamente 109 pfu (unidades formadoras de placas), de modo más preferible desde aproximadamente 102 a aproximadamente 108 pfu, y de modo muy preferible desde aproximadamente 103 a aproximadamente 107 pfu. La cantidad de dosis de un plásmido de la presente invención en una vacuna de la presente invención es con preferencia desde aproximadamente 0,1 µg a aproximadamente 100 mg, de modo más preferible desde aproximadamente 1 µg a aproximadamente 10 mg, y de modo todavía más preferible desde aproximadamente 10 µg a aproximadamente 1 mg. La cantidad de dosis de una molécula infecciosa de RNA de la presente invención en una vacuna de la presente invención es con preferencia desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg, de modo más preferible desde aproximadamente 1 µg a aproximadamente 10 mg, y de modo todavía más preferible desde aproximadamente 10 µg a aproximadamente 1 mg. La cantidad de dosis de un vector vírico de la presente invención en una vacuna de la presente invención es con preferencia desde aproximadamente 101 pfu a aproximadamente 109 pfu, de modo más preferible desde aproximadamente 102 pfu a aproximadamente 108 pfu, y de modo todavía más preferible desde aproximadamente 103 a aproximadamente 107 pfu. Un tamaño de dosificación adecuado es desde aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 10 ml, y de modo más preferible desde aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml. A modo de ejemplo, las vacunas pueden administrarse por vía oral, parenteral, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intranasal o intravenosa. El suministro oral puede comprender, por ejemplo, añadir las composiciones a la comida o la bebida de los animales. Factores que influyen en la dosificación de la vacuna incluyen, por ejemplo, el peso y la edad del cerdo. La presente invención proporciona adicionalmente un método de preparación de una vacuna que comprende un virus PRRS, molécula infecciosa de RNA, plásmido, o vector vírico descrito en esta memoria, método que comprende combinar una cantidad eficaz de uno del virus PRRS, la molécula infecciosa de RNA, el plásmido, o el vector vírico de la presente invención, con un vehículo aceptable para uso farmacéutico o veterinario. Adicionalmente, la vacuna viva atenuada de la presente invención puede modificarse como se describe en la patente US 6.500.662 para codificar un epítope heterólogo antigénico que se inserta en el genoma vírico del PRRS utilizando técnicas recombinantes conocidas. Epítopes antigénícos útiles como epítopes antigénicos heterólogos para la presente invención incluyen epítopes antigénicos de un patógeno del puerco distinto del virus PRRS que incluyen, pero sin carácter limitante, un epítope antígénico de un patógeno del puerco seleccionado del grupo constituido por parvovirus porcino, círcovirus porcino, un rotavírus porcino, gripe del puerco, virus de la pseudorrabia, virus de la gastroenteritis transmisible, coronavirus respiratorio porcino, virus de la fiebre clásica del puerco, virus de la fiebre africana del puerco, virus de la encefalomiocarditis, paramixovirus de los porcinos, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Bacillus anthraci, Bordetella bronchiseptica, Clostridium haemoliticum, Clostridium períringens, Clostridium tetani, Escherichia coli, Erysipelothdix rhusiopathiae, Haemophilus parasuis, Leptospira spp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia, Pasteurella multocida, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Streptococcus equismilis, y Streptococcus suis. Secuencias de nucleótidos que codifican epítopes antigénicos de los patógenos del puerco mencionados anteriormente se conocen en la técnica y pueden obtenerse de bases de datos públicas de genes tales como GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html) proporcionada por NCBI. Características y variaciones adicionales de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la totalidad de esta solicitud, con inclusión de la descripción detallada, y la totalidad de dichas características deben considerarse como aspectos de la invención. Análogamente, características de la invención descritas en esta memoria pueden recombinarse en modalidades adicionales que deben considerarse también como aspectos de la invención, con indiferencia de si la combinación de características se ha mencionado específicamente arriba como un aspecto o modalidad de la invención. Asimismo, únicamente aquellas limitaciones que se describen en esta memoria como críticas para la invención deben considerarse como tales; las variaciones de la invención que carezcan de limitaciones que no hayan sido descritas en esta memoria como críticas deben considerarse como aspectos de la invención. Estará claro que la invención puede practicarse de modo distinto al que se ha descrito particularmente en la descripción que antecede y los ejemplos. Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la vista de la doctrina anterior y, por consiguiente, están dentro del alcance de la invención. La presente invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos siguientes, pero sin limitarse a los mismos. Ejemplo 1 : Construcción del plásmido lanzadera pTB-shuttle-PRRSV-3997 Se construyó un plásmido lanzadera a fin de facilitar la introducción de modificaciones específicas en un clon de cDNA genómico del virus PRRS de longitud total. Un fragmento de 3.997 pb, que representaba el final del extremo 3' del genoma vírico (posiciones de nucleótidos 11.504 a 15.416, con inclusión de una cola de poliadenosina de 21 residuos) y 84 pb de secuencias vectoras de aguas abajo, se amplificó por PCR. La reacción PCR incluía 5 ng del DNA plasmídíco pCMV-S-P129 (documento US 6.500.662 B1), 300 ng del iniciador directo P-shuttle-Fwd (5?CTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3') (SEQ ID NO: 8): posiciones 11.504 a 11.530), 300 ng del iniciador inverso P-shuttle-Rev (5'-ATCTTATCATGTCTGGATCCCCGCGGC-3') (SEQ ID NO: 9): posiciones 15.500 a 15.475), 1 mM de cada uno de dCTP, dGTP, dATP, y dTTP, 1 x tampón PCR [KCl 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,8), MgS04 2 mM, 0,1% de Tritón X-100], y 2,5 U de DNA-polimerasa de Pfu (Stratagene), utilizando el sistema PCR GeneAmp 2400 (Perkin Elmer). La mezcla de reacción se calentó durante 5 mín a 95°C y se sometió a 35 ciclos de amplificación en las condiciones siguientes: desnaturalización a 95°C durante 30 s, reasociación de iniciadores a 55°C durante 1 min, y extensión a 72°C durante 3 min. El producto PCR se clonó en el vector pTrueBlue utilizando el kit de clonación PCR TrueBlue MicroCartrídge™ XL (Genomics One; Buffalo, Nueva York) para crear pTB-shuttle-PRRSV-3997. Ejemplo 2: Modificación de la secuencia NLS-2 para generar el virus P129-GG Se utilizó mutagénesis orientada basada en PCR para modificar el motivo de la señal de localización nuclear 2 (NLS-2) localizado en las posiciones de aminoácidos 41 a 47 de la proteína de la nucleocápsida (N). Entre los virus PRRS del genotipo norteamericano, este motivo NLS es generalmente PGKKNKK (como en el aislado prototipo VR-2332 o el aislado de Canadá PA-8), o un derivado del mismo, tal como PGKKSKK (encontrado en los aislados P129 y 93-47324). Se cree que la presencia de residuos múltiples cargados positivamente lisina (K) o arginina (R) es importante para una señal NLS totalmente funcional. Los residuos lisína en las posiciones 43 y 44 de N (posiciones de nucleótidos 14.999-15.004 del genoma de P129) se reemplazaron por residuos glicina utilizando el plásmido lanzadera y el par de iniciadores mutágenos KK43-44GG-Fwd (5'- GGCAAGGGACCGGGAGGGGGAAATAAGAAGAAAAAC-3') (SEQ ID NO: 10)-: posiciones del genoma 14.984 a 15.019) y KK43-44 GG-Rev (5'- GTTTTTCTTCTTATTTCCCCCTCCCGGTCCCTTGCC-3') (SEQ ID NO:11)-: posiciones del genoma 14.984 a 15.019), donde los subrayados indican cambios de codón para sustituciones de aminoácidos de KKS a GGN. Se llevaron a cabo amplificaciones PCR utilizando 5 ng del DNA plasmídico de pTB-shuttle-PRRSV-3997, 300 ng de cada uno de los iniciadores directo e inverso; concentraciones 1 mM de cada uno de dCTP, dGTP, dATP, y dTTP, 1 x tampón PCR [KCl 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,8), MgS04 2 mM, 0,1% de Tritón X-100]; y 2,5 U de DNA-polimerasa de Pfu (Stratagene). Las muestras se sometieron a 16 ciclos de amplificación en las condiciones siguientes: desnaturalización a 94°C durante 30 s, reasociación de iniciadores a 55°C durante 1 min, y extensión de iniciadores a 68°C durante 12 min 30 s. Después de sometimiento a los ciclos PCR, el producto PCR se digirió con 10 U de Dpn I para eliminar el molde de DNA plasmídico metilado. Se transformaron células XL1-Blue de E. coli por choque térmico con 4 µl de la mezcla de reacción PCR digerida con Dpn I que contenía los plásmidos mutados y se extendieron sobre una placa de agar LB que contenía ampicilina. Se seleccionaron aleatoriamente colonias y se cultivaron durante una noche. Se preparó DNA plasmídico utilizando un kit Spín Miniprep QIAprep (Qiagen). Se comprobó la presencia de la mutación deseada (PGGGNKK) por secuencíación de nucleótidos, y el plásmido resultante se designó pTB-shuttle-N-GG. El plásmido lanzadera que llevaba la mutación GG (pTB-shuttle-N-GG) y el clon genómico de tipo salvaje de longitud total (pCMV-S-P129) contienen cada uno sitios singulares BsrG I y Spe I (en las posiciones 1.192 y 3.963, y las posiciones 12.692 y 15.463, respectivamente). Después de digestión con estas dos enzimas, el fragmento BsrG l-Soe I de 2.772 pb se purificó en gel de pTB-shuttle-N-GG, y el fragmento BsrG\-Spe I de 16.120 pb se purificó en gel de pCMV-S-P129. Estos dos fragmentos se ligaron utilizando DNA-ligasa T4 (Invitrogen) para construir un clon de cDNA genómico de longitud total modificado con GGN. Se transformó la cepa DH5-a de E. coli con 10 µl de la mezcla de reacción de ligación. Se seleccionaron colonias bacterianas de placas LB que contenían ampicilina y se prepararon DNAs plasmídicos. Basándose en los patrones de digestión con Xma I, se seleccionaron clones de longitud total. Los clones seleccionados se secuencíaron para confirmar la presencia de la modificación GGN en el clon de cDNA genómico de longitud total. Uno de los plásmidos resultantes se designó pCMV-S-P129-GG. Se cultivaron células MARC-145 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 8% de suero de bovino fetal (FBS; Gibco BRL), penicilina (100 U/ml), y estreptomicina (50 µg/ml) a 37°C con 5% de C02. Se sembraron las células en cápsulas de 35 mm de diámetro y se cultivaron hasta 70% de confluencia. Las células se transfectaron durante 24 h con 2 µg de DNA plasmídico pCMV-S-P129-GG utilizando Lipofectína (Invitrogen). Las células transfectadas se incubaron a 37°C en DMEM complementado con 8% de FBS durante 5 días. Se observó el efecto citopático (CPE) específico de PRRSV durante 3 días después de la transfección y se observó la propagación ulterior a las células vecinas durante 5 días después de la transfección. La especificidad del CPS se confirmó por tinción de inmunofluorescencia de las células utilizando un antisuero de conejo para las proteínas no estructurales nsp2 y nsp3, y el MAb SDOW17 específico de N (véase la Figura 1). Los sobrenadantes de cultivo de las células transfectadas se cosecharon 5 días después de la transfección y se designaron 'P129-GG paso 1' (P1). El virus del paso-1 se utilizó para inocular células Marc-145 nuevas y la cosecha de 5 días se designó 'paso-2' (P2). Se preparó el virus 'paso-3' (P3) del mismo modo que P2. Cada paso del virus se guardó en partes alícuotas de 1 ml a -80°C hasta su utilización. Cada paso del virus P129-GG se tituló por ensayo de placas, y se determinó que los títulos eran 1 x 102, 5 x 102, y 5 x 103 pfu/ml para los pasos 1, 2, y 3, respectivamente. Se generó el virus P129 de tipo salvaje a partir de pCMV-S-P129 y se tituló en paralelo, obteniéndose títulos de 1 x 103, 1 x 104 y 5 x 105 pfu/ml para los pasos 1 , 2, y 3 respectivamente. Ejemplo 3: Infección de los cerdos con el virus P129-GG y el virus parental P129 (Demostración de que el virus P129-GG está Atenuado) Veintiún cerdos sanos cruzados sin historia de enfermedad causada por o vacunación contra PRRSV y Mycoplasma hyopneumoniae se asignaron aleatoriamente a 3 grupos de tratamiento de 7 cerdos cada uno. Aproximadamente a las 6 semanas de edad, los cerdos T01 recibieron un placebo, mientras que los cerdos T02 y T03 se sometieron a un enfrentamiento intranasal con 2,0 ml de stock de virus diluido a 2,5 x 104 pfu/ml (5,0 x 104 pfu/dosis) del virus P129-GG modificado genéticamente (generado a partir del plásmido pCMV-S-P129-GG) o el virus PRRS parental P129 (generado a partir del plásmido pCMV-S-P129), respectivamente. Se observaron todos los cerdos diariamente respecto a signos clínicos que incluían estado general, depresión, pérdida del apetito, estornudos, tos, y dificultad respiratoria. Se registraron las temperaturas rectales y los pesos corporales. Se tomaron muestras de sangre los días 0, 4, 7, 10, 14, 21 , y 28 para aislamiento de PRRSV y serología. Se realizaron necropsias los días 14 (2 cerdos/grupo) y 28 (5 cerdos/grupo) y se recogieron muestras de tejido (pulmón y amígdalas). Se realizaron estimaciones de gravedad de las lesiones pulmonares y porcentaje de consolidación de cada lóbulo pulmonar. Los cerdos de los grupos T02 y T03 desarrollaban signos de una infección moderada con el virus PRRS; difundían virus en el suero, y experimentaban seroconversión. Los cerdos de control no infectados (T01) permanecían negativos en cuanto a viremia del suero y negativos en cuanto a anticuerpos para el virus PRRS. Comparados con los cerdos infectados por el virus parental P129 (T03), los cerdos infectados con el virus P129-GG (T02) difundían menos virus en su suero (Figuras 2A y 2B) y producían niveles mayores de anticuerpo ELISA antí-PRRS (Figuras 2C y 2D), y anticuerpos neutralizantes (Figura 2E).

Se determinaron los títulos de neutralización del suero en ambos grupos T02 y T03 los días 7, 14, 21 y 28 después de la infección. Los títulos de neutralización se determinaron por TCID50 en placas de 96 pocilios por duplicado. En cada pocilio, se combinaron 200 pfu de virus P129 de tipo salvaje en un volumen de 100 µl con 100 µl de una dilución de 2 veces en serie de los sueros (desactivados previamente por calentamiento durante 30 mín a 56°C). Se incubó la mezcla durante 1 h a 37°C, seguido por infección de las células. Las células infectadas se incubaron durante 5 días y se determinaron los valores CPE. Los datos se presentan a continuación y muestran que los cerdos infectados con el virus mutante desarrollaban títulos de neutralización medios mayores que los infectados con el virus parental de tipo salvaje. Tabla 7-Títulos de Neutralización Durante las Cuatro Semanas de Infección (valores duplicados) P129-ts Día 7 Día 14 Día 21 Día 28 Cerdo 28 <2, <2 <2, <2 4, 4 3,5 Cerdo 30 <2, <2 2, 8 2, 2 4 Cerdo 35 <2, <2 4, 4 8, 4 7,5 Cerdo 40 <2, <2 4, 4 2, 8 8 Cerdo 43 <2, <2 <2, 4 <2, 8 3,5 Valor medio 2 - 2 4.2 5,3 P129-GG Cerdo 33 <2, <2 4, 8 8, 16 16 Cerdo 36 <2, <2 2, 2 16, 16 16 Cerdo 38 <2, <2 8, 4 8, 4 36 Cerdo 45 <2, <2 2, 2 4, 4 6 Cerdo 46 <2, <2 8, 8 16, 16 48 Valor medio <2 4 10.8 24,4 Uno de los sellos de la infección con PRRSV es la persistencia de virus en las amígdalas. Por esta razón, se recogieron las amígdalas de todos los cerdos infectados y dos cerdos de control infectados falsamente a la terminación del estudio (4 semanas después de la infección) y se examinaron respecto a persistencia vírica por RT-PCR. El gen N era detectable por RT-PCR en todos los cerdos infectados con el virus GG o el virus P129, mientras que las amígdalas de los cerdos infectados falsamente se mantenían negativas. Esto indica que todos los cerdos infectados difundían el virus a las 4 semanas después de la infección. Para desarrollar posibles mutaciones en la NLS del gen N, se secuenciaron los productos PCR de las amígdalas. En los cinco cerdos, se encontró que el virus GG persistente en las amígdalas estaba mutado en la secuencia NLS-2 por la introducción de una arginina en las posiciones 43 ó 44. El virus P129 de tipo salvaje de las amígdalas no mutaba y retenía la secuencia de tipo salvaje NLS-2. Ejemplo 4: Mutaciones de NLS-2 resistentes a la reversión Se creó la mutación P129-GG descrita en el Ejemplo 2 por cambio de seis nucleótidos. Como se ve en el Ejemplo 3, este virus es susceptible de reversión parcial o total y puede recuperar el fenotipo parental NLS-negativo con una frecuencia relativamente alta debido a mutación aleatoria y selección natural. Modalidades preferidas de la invención, especialmente para propósitos de vacuna, contendrían sustituciones y/o deleciones adicionales de nucleótidos, diseñadas para minimizar la probabilidad de reversión, y minimizar la probabilidad de que otros residuos flanqueantes muten a residuos básicos tales como lisina y arginina y restablezcan con ello un motivo funcional NLS en la región. Se prefieren codones que requieren dos o tres cambios separados de nucleótidos a fin de mutar a codones codificantes de un residuo básico respecto a aquéllos que requieren un solo cambio. Las mutaciones de deleción tienen muy poca probabilidad de reversión, dado que se ha eliminado una porción de la región. Pueden seleccionarse codones alternativos para aminoácidos flanqueantes, a fin de reducir las probabilidades de readquirir un motivo pat7, pat4, u otro motivo NLS por mutación. Ejemplos de tales mutaciones "resistentes a la reversión" se muestran en la Tabla 6. y deben considerarse como representativas más bien que limitantes. Dada esta información, otros ejemplos de mutaciones resistentes a la reversión pueden ser ideados por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. En la Tabla 8. el virus mutante P129-d43/44 es una delecíón de los aminoácidos 43 y 44. Adicionalmente, el codón serina en la posición 45 ha cambiado de AGT a TCT para reducir la probabilidad de que el mismo mute a un codón usina o arginina. Asimismo, el codón asparagina de la posición 49 (AAC) ha cambiado a un codón serina (TCC) por la misma razón. La serina se encuentra en la posición 49 en algunos aislados de campo existentes naturalmente, por lo que debería ser bien tolerada. Un motivo NLS pat 7 mínimo (PGSKKSS) persiste en este mutante, y puede tener actividad parcial de NLS. Se predice que los virus con actividad parcial de NLS tienen fenotipos que son intermedios entre el virus de tipo salvaje (parental) y los mutantes completos con NLS desactivados ("knockout"). Tales virus pueden ser especialmente útiles como vacunas.

Tabla 8 — Mutantes de deleción contemplados T X Q D H Q N M I N N E K G V R E R R N R R R s S D 38 39 «0 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 G K P G K E 5 K K K N P E K P wtPl29 (SEQ ID NO: 12 ) GGC AAG GGA pCG GCC AAG AAA AGT AAG AAG AAA AAG _E?St_SAG AAG CCC (SEQ ID NO: 13) 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 ß K G P O G G N K K N P E K P P129-GG SEQ XS NO: 14) GGC AAG GGA CCG GGA GGG GGA AAT AAG AAG AAA AAC eco OAG AAG CCC (SEQ ID NO: 15) 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 0 K G P - S K K K S P E K P P129-d43/44 (8EQ ID NO: 16) GGC AAG GGA CCß GGC TCT AAG AAG AAA TCC eco GAO AAG CCC (SEQ ID NO: 17 ) 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 0 K G P G - S - X B P E K P P129 -d43 /44 /46 (S8Q ID NO: 18 ) GGC AAG GGA CCG GGC AAG AAA TCC CCO GAO AAO CCC (SEQ ID NO:lS) 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 G K G P O K S - - K S P E K P P129-d44 /46/47 (SEQ XD NO: 30) GGC AAO GGA CCG GGC AAG TCT AAA TCC CCG GAO AAS CCC (3EQ ID NO! 21) 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 S3 G K O P O K K s - - S P E K P P129-d46/47/48 (SSQ XD NO: 22) GGC AAG GGA CCG GGC AAG AAA TCT TCC CCG GAG AAG CCC (SEQ ID NO: 23) . Las letras en negrita sn la parte superior que antecede son residuos alternativos que se encuentran al menos en un virus PRRS NA. • Los dos segmentos subrayados forman un tronco de 5 bases que puede ser importante para la síntesis de la cadena negativa. • Se contemplan también deleciones de 4 y 5 residuos.

Los otros tres mutantes que se muestran en la Tabla 8. (P129-d43/44/46, P129-d44/46/47, y P129-d46/47/48) son delecíones de tres aminoácidos, y tienen también los cambios de codón en las posiciones 45 y 49 arriba descritas. Estas mutaciones carecen de un motivo NLS y se predice que tienen una desactivación ("knockout") completa de la actividad de NLS. Se anticipa que estos virus están atenuados en los cerdos y son especialmente útiles como vacunas. Los iniciadores directo e inverso para las mutaciones descritas en la Tabla 8 son como sigue: Iniciadores Directos (5'-3') P129-d43/44 F (SEQ ID NO 24) GTCCAGAGGCAAGGGACCG K ATCTAAGAAGAAATCCCCGGAG P129-d44/46747F (SEQ ID NO: 16) GCAAGGGA( GGGAAAGTCTAAATCCC??¡ú\GAAG XX C P129-d46/47/48F (SEQ ID NO: 27) GCAAGGGACCXKKJAAAGAAATCTTCCCCGGAGAAGCCCC P129-d43/44 R (SEQ ID NO: 28) CTCCGGXJGATTTC?TCTTAGATCCCGGTCCCGGGCCTCGGGAC P129-d43/44/46R (SEQ ID NO: 29) ctccGc ?3AtttcrtAGAt cGGTcx:cp GccrctGGAC P129-d4446/47R (SEQ ID NO: 30) GGKjGCpCTCCGGGC^TTTAGACITTCCCGGTCCClTGC P129-d4ó747/48R (SEQ D> NO: 31) GGGGC GCTCCGGGGAAGATTTCTTTCXX GGTCCCTTGC Las descripciones y ejemplos anteriores demuestran que la región NLS-2 no se requiere para multiplicación del virus, pero es un factor importante de virulencia para PRRSV, como se demuestra por el hecho de que el único virus persistente en las amígdalas ha mutado. Se demuestra también que la NLS en la proteína N de PRRSV está correlacionada positivamente con mayor contenido de anticuerpos neutralizantes y títulos ELISA más altos. Así pues, se ha establecido que las mutaciones que eliminan el motivo de la secuencia NLS-2 dan como resultado una cepa de PRRSV atenuada.

DESCRIPCIÓN NUMERADA DE LA INVENCIÓN 1. Una composición que comprende un agente infeccioso de PRRS seleccionado del grupo constituido por: a.) un virus PRRS modificado genéticamente que comprende una proteína N que se ha modificado al menos en una región conservada seleccionada del grupo constituido por la región NLS-2, la región NoLS y la región NES de tal modo que la región conservada se ha eliminado, y en la cual el virus PRRS modificado genéticamente está atenuado; b.) una molécula infecciosa de RNA que codifica el virus PRRS modificado genéticamente de a.); y c.) una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica la molécula infecciosa de RNA de b.). 2. La composición de la reivindicación 1 que se ha modificado ulteriormente para dar como resultado la eliminación de la región NLS-1 conservada. 3. La composición de la reivindicación 1 , en la cual la región conservada se ha eliminado por la introducción de una sustitución de aminoácido no conservadora. 4. La composición de la reivindicación 1 ó 2 en la cual la región conservada se ha delecionado al menos parcialmente. 5. La composición de la reivindicación 1 , en la cual la región conservada es la región NoLS. 6. La composición de la reivindicación 1 , en la cual la región conservada es la región NLS-2. 7.

La composición de la reivindicación 1 , en la cual la región conservada es la región NES. 8. La composición de la reivindicación 1 , en la cual el virus PRRS es un virus PRRS norteamericano. 9. La composición de la reivindicación 1 , en la cual el virus PRRS es un virus PRRS europeo. 10. La composición de la reivindicación 8, en la cual la región conservada es la región NLS-2. 11. La composición de la reivindicación 10, en la cual los residuos 42 y 43 de la proteína N son glicinas. 12. La composición de la reivindicación 10, en la cual los residuos 42 y 43 de la proteína N son glicina y el residuo 44 es asparagina. 13. La composición de la reivindicación 10, en la cual la región NLS-2 se ha delecionado al menos parcialmente. 14. La composición de la reivindicación 13, en la cual al menos uno de los residuos 43 a 48 de la proteína N se ha delecionado. 15. La composición de la reivindicación 14, en la cual ambos residuos 43 y 44 de la proteína N se han delecionado. 17. La composición de la reivindicación 14, en la cual los residuos 43, 44, y 46 de la proteína N se han delecionado. 18. La composición de la reivindicación 14, en la cual los residuos 44, 46, y 47 de la proteína N se han delecionado. 19.

La composición de la reivindicación 14, en la cual los residuos 46, 47, y 48 de la proteína N se han delecionado. 20. La composición de las reivindicaciones 1-19 que contiene mutaciones, sustituciones y/o deleciones adicionales de nucleótidos, diseñadas para minimizar la probabilidad de reversión. 21. Una vacuna para proteger un animal porcino contra la infección por un virus PRRS, que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 en una cantidad eficaz para producir inmunoprotección contra la infección por un virus PRRS; y un vehículo aceptable para uso veterinario. 22. Un método para proteger un animal porcino contra la infección por un virus PRRS, que comprende vacunar el animal con una cantidad de la vacuna de la reivindicación 20 que es eficaz para producir inmunoprotección contra la infección por un virus PRRS. 23. Una célula hospedadora transfectada que comprende una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-20. 24. Un método para producir un virus PRRS modificado genéticamente y atenuado, método que comprende: a.) mutar una secuencia de DNA codificante de una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus PRRS, para producir un virus PRRS modificado genéticamente que comprende una proteína N que se ha modificado al menos en una región conservada seleccionada del grupo constituido por la región NLS-2, la región NoLS y la región NES de tal modo que la región conservada se ha eliminado; b.) introducir el virus PRRS modificado genéticamente en una célula hospedadora capaz de soportar la replicacíón del PRRS. 25. Un método de la reivindicación 24 en el cual el virus PRRS modificado genéticamente es un virus PRRS norteamericano. 26.

Un método de la reivindicación 24, en el cual el virus PRRS modificado genéticamente es un virus PRRS europeo. 27. El método de la reivindicación 24, en el cual la célula hospedadora capaz de soportar la replicación de PRRS es una célula MARC-145. 28. El método de la reivindicación 24, en el cual la célula hospedadora capaz de soportar la replicación del PRRS se encuentra en un animal porcino vivo. 29. Cualquiera de las invenciones descritas en esta memoria o cualquiera de las combinaciones de reivindicaciones descritas anteriormente.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. - Una composición que comprende un agente infeccioso del PRRS seleccionado del grupo constituido por: a.) un virus PRRS modificado genéticamente que comprende una proteína N que se ha modificado al menos en una región conservada seleccionada del grupo constituido por la región NLS-2, la región NoLS y la región NES de tal modo que la región conservada se ha eliminado, y en donde el virus PRRS modificado genéticamente está atenuado; b.) una molécula infecciosa de RNA que codifica el virus PRRS modificado genéticamente de a ); y c.) una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica la molécula infecciosa de RNA de b.). 2 - La composición de la reivindicación 1 , que se ha modificado ulteriormente para dar como resultado a) la eliminación de la región NLS-1 conservada, o la región conservada se ha eliminado por la introducción de una sustitución de aminoácido no conservadora, o la región conservada se ha delecionado al menos parcialmente 3. - La composición de la reivindicación 1, en la cual la región conservada se selecciona de cualquiera de o de una combinación de las siguientes: a) la región NoLS, la región NLS-2, y/o la región NES. 4. - La composición de las reivindicaciones 1-3, en la cual el virus PRRS se selecciona de cualquiera de o de una combinación de los siguientes: virus PRRS norteamericano o un virus PRRS europeo. 5. - La composición de la reivindicación 3, en la cual el virus PRRS es un virus PRRS norteamericano y en la cual la región conservada es la región NLS-2. 6. - La composición de la reivindicación 5 seleccionada del grupo constituido por estas composiciones: donde los residuos 43 y 44 de la proteína N son glicinas, donde los residuos 43 y 44 de la proteína N son glicina y el residuo 45 es asparagína, donde la región NLS-2 se ha delecionado al menos parcialmente, donde al menos uno de los residuos 43 a 48 de la proteína N se ha delecionado, donde ambos residuos 43 y 44 de la proteína N se han delecionado, donde los residuos 43, 44 y 46 de la proteína N se han delecionado, donde los residuos 44, 46 y 47 de la proteína N se han delecionado, y/o donde los residuos 46, 47 y 48 de la proteína N se han delecíonado. 7. - La composición de las reivindicaciones 1-6 que contiene mutaciones, sustituciones y/o deleciones adicionales de nucleótidos, diseñadas para minimizar la probabilidad de reversión. 8.- Una vacuna para proteger un animal porcino contra la infección por un virus PRRS, que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en una cantidad eficaz para producir inmunoprotección contra la infección por un virus PRRS; y un vehículo aceptable para uso veterinario. 9.- Un método para proteger un animal porcino contra la infección por un virus PRRS, que comprende vacunar el animal con una cantidad de la vacuna de la reivindicación 8 que es eficaz para producir inmunoprotección contra la infección por un virus PRRS. 10.- Una célula hospedadora transfectada que comprende una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9. 11.- Un método para producir un virus PRRS modificado genéticamente y atenuado, método que comprende: a.) mutar una secuencia de DNA codificante de una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus PRRS, para producir un virus PRRS modificado genéticamente que comprende una proteína N que se ha modificado al menos en una región conservada seleccionada del grupo constituido por la región NLS-2, la región NoLS y la región NES de tal modo que la región conservada se ha eliminado; b.) introducir el virus PRRS modificado genéticamente en una célula hospedadora capaz de soportar la replicación del PRRS. 12 - Un método de la reivindicación 11 , en el cual el virus PRRS modificado genéticamente se ha modificado ulteriormente con una o más mutaciones, sustituciones y/o deleciones adicionales de nucleótidos, que minimizan la posibilidad de reversión. 13. - Un método de la reivindicación 11 , en el cual el virus PRRS modificado genéticamente es un virus PRRS norteamericano o un virus PRRS europeo. 14. - El método de las reivindicaciones 11-13, en el cual la célula hospedadora capaz de soportar la replicación del PRRS es una célula MARC-145. 15 - El método de las reivindicaciones 11-13, en el cual la célula hospedadora capaz de soportar la replicación deL PRRS se encuentra en un animal porcino vivo.