JP2008531006A - ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスのnタンパク質変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号1 北米型PRRSV単離株VR2332のNタンパク質残基41〜47
配列番号2 VR2332 NoLS領域の配列
配列番号3 レリスタットNoLS領域の配列
配列番号4 VR2332単離株のNES領域
配列番号5 レリスタット単離株のNES領域
配列番号6 P129単離株からのNタンパク質のアミノ酸配列
配列番号7 P129単離株からのORF7(Nタンパク質をコードする)のヌクレオチド配列
配列番号8 プライマーP−SHUTTLE−FWD
配列番号9 プライマーP−SHUTTLE−REV
配列番号10 変異原性プライマーKK43/44GG−Fwd
配列番号11 変異原性プライマーKK43/44GG−REV
配列番号12 表8の欠失変異体。野生型P129のNLS2領域のアミノ酸配列:
配列番号13 表8の欠失変異体。野生型P129のNLS2領域のヌクレオチド配列:
配列番号14 表8の欠失変異体。P129−GGのNLS2領域のアミノ酸配列:
配列番号15 表8の欠失変異体。P129−GGのNLS2領域のヌクレオチド配列:
配列番号16 表8の欠失変異体。P129−d43/44のNLS2領域のアミノ酸配列:
配列番号17 表8の欠失変異体。P129−d43/44のNLS2領域のヌクレオチド配列:
配列番号18 表8の欠失変異体。P129−d43/44/46のNLS2領域のアミノ酸配列:
配列番号19 表8の欠失変異体。P129−d43/44/46のNLS2領域のヌクレオチド配列:
配列番号20 表8の欠失変異体。P129−d44/46/47のNLS2領域のアミノ酸配列:
配列番号21 表8の欠失変異体。P129−d44/46/47のNLS2領域のヌクレオチド配列:
配列番号22 表8の欠失変異体。P129−d46/47/48のNLS2領域のアミノ酸配列:
配列番号23 表8の欠失変異体。P129−d46/47/48のNLS2領域のヌクレオチド配列:
配列番号24 P129−d43/44F
配列番号25 P129−d43/44/46F
配列番号26 P129−d44/46/47F
配列番号27 P129−d46/47/48F
配列番号28 P129−d43/44R
配列番号29 P129−d43/44/46R
配列番号30 P129−d44/46/47R
配列番号31 P129−d46/47/48R
Doan,D.N.P.およびDokland,T.(2003年)、「Structure of the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus」、Structure 11(11),1445−1451。
Lee,C.、Calvert,J.G.、Welch,S.−K.W.およびYoo,D.(2005年)、「A DNA−launched reverse genetics system for porcine reproductive and respiratory syndrome virus reveals that homodimerization of the nucleocapsid protein is essential for virus infectivity」、Virology 331,47−62。
Rowland,R.R.、Kervin,R.、Kuckleburg,C.、Sperlich,A.およびBenfield,D.A.(1999年)、「The localization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus of infected cells and identification of a potential nucleolar localization signal sequence」、Virus Research 64(1),1−12。
Rowland,R.R.R.、Schneider,P.、Fang,Y.、Wootton,S.、Yoo,D.およびBenfield,D.A.(2003年)、「Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus」、Virology 316(1),135−145。
Rowland,R.R.R.およびYoo,D.(2003年)、「Nucleolar−cytoplasmic shuttling of PRRSV nucleocapsid protein:a simple case of molecular mimicry or the complex regulation by nuclear import,nucleolar localization and nuclear export signal sequences」、Virus Research 95(1−2),23−33。
Wootton,S.K.、Rowland,R.R.R.およびYoo,D.(2002年)、「Phosphorylation of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein」、Journal of Virology 76(20),10569−10576。
Wootton,S.K.およびYoo,D.(2003年)、「Homo−oligomerization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and the role of disulfide linkages」、Journal of Virology 77(8),4546−4557。
Yoo,D.、Wootton,S.K.、Li,G.、Song,C.およびRowland,R.R.(2003年)、「Colocalization and interaction of the porcine arterivirus nucleocapsid protein with the small nucleolar RNA associated protein fibrillarin」、Journal of Virology 77(22),12173−12183。
Yoo,D.、Welch,S.−K.W.、Lee,C.およびCalvert,J.G.(2004年)、「Infectious clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and their potential as vaccine vectors」、Veterinary Immunology and Immunopathology 102,143−154。
「効果的免疫防御反応」および「免疫防御」などの用語は、本発明の目的では、ワクチン接種された動物で病原体による感染に対して防御する、病原体の1つまたは複数の抗原エピトープに対する免疫応答を意味する。本発明の目的では、病原体による感染に対する防御には、感染の絶対的予防のみでなく、ワクチン接種されなかった感染動物と比較した際の、ワクチン接種された動物での病原体による感染の程度または率におけるいかなる検出可能な低減も、あるいは病原体による感染から生じた疾患またはなんらかの症状もしくは状態の重症度におけるいかなる検出可能な低減も含まれる。効果的免疫防御反応は、以前に病原体に感染していない、かつ/またはワクチン接種時に病原体に感染していない動物で誘導できる。効果的免疫防御反応は、ワクチン接種時に既に病原体に感染していた動物でも誘導できる。
LPTHHTVRLIRV(配列番号4)
**VAQ******A
Q
V
G
組換えDNA技術は、核酸をDNAレベルで改変することを目的とした極めて多様かつ強力な分子生物学技法を含み、分子レベルでのゲノムの分析および改変を可能にする。この点に関して、PRRSウイルスなどのウイルスは、そのゲノムのサイズが小さいため、そのような操作がとりわけ容易である。しかし、レトロウイルスではないRNAウイルスは、それらの複製においてDNA中間体の段階を包含しないため、組換えDNA技術をそれらに直ちに適用することができない。そのようなウイルスに関しては、改変ウイルスを生成させるために、それらのゲノムに組換えDNA技術を適用できるようになる前に、感染性のcDNAクローンを発生させなければならない。感染性クローンは、研究しているウイルスの完全長(ゲノム長)cDNA(ここでは、RNAのDNAコピーに関する広い意味で用いられおり、厳密な意味でのmRNAのDNAコピーのみではない)を構築し、その後、その完全長cDNAで形質移入された細胞において、in vivoで感染性転写産物を合成させることを介して得ることができるが、感染性転写産物は、完全なウイルスゲノムを含む、in vitro連結された部分長cDNA断片からのin vitro転写によっても得ることができる。すべての場合において、転写されたRNAは、上記cDNAに導入されたすべての改変を保有し、そのように改変されたウイルスのさらなる継代に使用することができる。
特定の遺伝的に改変された株が弱毒化されていることを実証するために、以下に記載する実験を用いることができよう。
a)死産の頻度、
b)妊娠112日目の以前における妊娠中絶、
c)ミイラ変性した子ブタの数、
d)不活発で弱い子ブタの数、
e)離乳前の死亡率
のうちの1つにおける有意な低減が弱毒化の指標となろう。さらに、無改変親株に感染した群との比較で、試験群に関する以下のパラメータ、すなわち、
f)メスブタ1匹あたりの離乳した子ブタの数、
g)メスブタ1匹あたりに産まれた生きていて健康な子ブタの数
のうちの1つにおける有意な増大が好ましい。別法では、下記実施例3に記載の通り、弱毒化を確定するために、PRRSV感染の呼吸器症状および他の症状を検査することができよう。
弱毒化株はワクチンの製剤に有用である。
シャトルプラスミドpTB−shuttle−PRRSV−3997の構築
完全長PRRSウイルスゲノムcDNAクローンへの特定の改変の導入を容易にするために、シャトルプラスミドを構築した。ウイルスゲノムの最も3’末端側に相当する3997bp断片(21残基のポリアデノシンテールを含むヌクレオチド位置11504から15416まで)および下流のベクター配列84bpをPCR増幅させた。このPCR反応は、5ngのpCMV−S−P129プラスミドDNA(US6500662B1)、300ngの順方向プライマーP−shuttle−Fwd(5’−ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG−3’)(配列番号8):位置11504から11530)、300ngの逆方向プライマーP−shuttle−Revプライマー(5’−ATCTTATCATGTCTGGATCCCCGCGGC−3’)(配列番号9):位置15500から15475)、各1mMのdCTP、dGTP、dATP、およびdTTP、1×PCR緩衝液(10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris−HCl(pH8.8)、2mM MgSO4、0.1%TritonX−100)、および2.5UのPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene社)を含有し、GeneAmp PCRシステム2400(Perkin Elmer社)を用いて行った。反応物を95℃で5分間加熱し、下記の条件、すなわち、95℃で30秒の変性、55℃で1分間のプライマーアニーリング、および72℃で3分間の伸長で、35サイクルの増幅を行った。このPCR産物を、TrueBlue MicroCartridge(商標)PCRクローニングキットXL(Genomics One社;米国ニューヨーク州Buffalo所在)を用いて、pTrueBlueベクター中にクローニングして、pTB−shuttle−PRRSV−3997を作製した。
P129−GGウイルスを生成するためのNLS−2配列の改変
PCRベースの部位特異的変異導入を用いて、ヌクレオカプシド(N)タンパク質のアミノ酸位置41〜47に位置する核移行シグナル2(NLS−2)モチーフを改変した。北米遺伝子型PRRSウイルスの間では、このNLSモチーフは通常、PGKKNKK(原型単離株VR−2332またはカナダ単離株PA−8と同じく)、またはその誘導体、すなわちPGKKSKK(単離株P129および93−47324で見出されている)などである。完全に機能的なNLSシグナルには、正電荷を有するリジン(K)またはアルギニン(R)残基が複数存在することが重要であると考えられている。上記のシャトルプラスミドと、変異原性プライマー対であるKK43/44GG Fwd(5’−GGCAAGGGACCGGGAGGGGGAAATAAGAAGAAAAAC−3’)(配列番号10):ゲノム位置14984から15019)およびKK43/44GG Rev(5’−GTTTTTCTTCTTATTTCCCCCTCCCGGTCCCTTGCC−3’)(配列番号11):ゲノム位置14984から15019)とを用いて、Nの位置43および44(P129ゲノムのヌクレオチド位置14999〜15004)のリジン残基をグリシン残基で置換した。配列中、下線部は、KKSからGGNにアミノ酸置換させるコドン改変を示す。PCR増幅は、5ngのpTB−shuttle−PRRSV−3997プラスミドDNA、順方向プライマーおよび逆方向プライマーそれぞれ300ng;それぞれ1mM濃度のdCTP、dGTP、dATP、およびdTTP;1×PCR緩衝液(10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris−HCl(pH8.8)、2mM MgSO4、0.1%TritonX−100)ならびに2.5UのPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene社)を用いて行った。下記の条件、すなわち、94℃で30秒間の変性、55℃で1分間のプライマーアニーリング、および68℃で12分30秒間のプライマー伸長で、試料の増幅を16サイクル行った。PCRサイクルの後に、メチル化されているプラスミドDNA鋳型を除去するために、10UのDpn IでPCR産物を消化させた。変異導入されたプラスミドを含有するPCR−Dpn I消化反応物4μlを用い、熱ショックによって大腸菌(E.coli)XL1−Blue細胞を形質転換させ、アンピシリンを含有するLBアガープレート上に広げた。コロニーをランダムに選択し、終夜培養した。プラスミドDNAは、QIAprep spinミニプレップキット(Qiagen社)を用いて調製した。所望の変異(PGGGNKK)の存在を、ヌクレオチド配列の決定によって確認し、結果として得られたプラスミドをpTB−shuttle−N−GGと命名した。
P129−GGウイルスおよび親P129ウイルスへのブタの感染(P129−GGウイルスが弱毒化されていることの実証)
PRRSVおよびマイコプラズマハイオニューモニエに起因する疾患またはそれらに対するワクチン接種の履歴がない21頭の健康な雑種ブタを、各7頭のブタからなる3つの治療群に無作為に割り当てた。週齢約6週間のときに、T01ブタにプラセボを与え、一方、T02およびT03のブタには、それぞれ、遺伝的に改変されたP129−GGウイルス(プラスミドpCMV−S−P129−GGから生成された)または親P129 PRRSウイルス(プラスミドpCMV−S−P129から生成された)の2.5×104pfu/ml(5.0×104pfu/用量)に希釈したウイルスストック2.0mlを鼻腔内投与した。すべてのブタに関して、毎日、全般的健康状態、抑うつ、食欲不振、くしゃみ、せき、および呼吸困難を含めた臨床徴候を観察した。直腸温および体重を記録した。PRRSVの単離および血清検査用に、0、4、7、10、14、21、および28日目に血液試料を採取した。14日目(ブタ2頭/群)および28日目(ブタ5頭/群)に、死体解剖を行い、組織試料(肺および扁桃腺)を採取した。肺病変重度および各肺葉の硬化のパーセントの推算を行った。群T02およびT03のブタは、軽度のPRRSウイルス感染の症状、すなわち血清中における排出ウイルスおよび血清転換を示した。未感染対照ブタ(T01)は、血清ウイルス血症陰性のままであり、そしてPRRSウイルスに対する抗体も陰性のままであった。
NLS−2の復帰抵抗性変異
実施例2に記載したP129−GG変異は、6ヌクレオチドを改変することによって生成された。実施例3で分かるように、このウイルスは部分的または完全に復帰変異でき、ランダム変異および自然淘汰のため、比較的に高い頻度で親株のNLS陰性表現型を回復しうる。本発明の好ましい実施形態、特にワクチンを目的としたものは、復帰の可能性が最小となり、かつ他の隣接残基がリジンおよびアルギニンなどの塩基性残基に変異して、それによってこの領域内で機能的なNLSモチーフが回復する可能性が最小となるように設計された、さらに別のヌクレオチド置換および/または欠失を含有しているであろう。塩基性残基をコードするコドンに変異するために、2もしくは3回の別々なヌクレオチド改変を必要とするコドンが、1回のみの改変を必要とするものよりも好ましい。欠失変異は、その領域の一部分が除かれているので、復帰する可能性が非常に低い。変異によってpat7、pat4、または他のNLSモチーフが再生する確率を小さくするために、隣接アミノ酸に代替のコドンを選択することもできる。そのような「復帰抵抗性」の変異の例を表6に示す。これらは、限定的なものではなく、代表的なものとして意図されている。この情報に基づいて、当業者ならば、復帰抵抗性変異の他の例を想起することができよう。
順方向プライマー(5’−3’)
P129−d43/44F(配列番号24)
GTCCAGAGGCAAGGGACCGGGATCTAAGAAGAAATCCCCGGAG
P129−d43/44/46F(配列番号25)
GTCCAGAGGCAAGGGACCGGGATCTAAGAAATCCCCGGAG
P129−d44/46/47F(配列番号26)
GCAAGGGACCGGGAAAGTCTAAATCCCCGGAGAAGCCCC
P129−d46/47/48F(配列番号27)
GCAAGGGACCGGGAAAGAAATCTTCCCCGGAGAAGCCCC
逆方向プライマー(5’−3’)
P129−d43/44R(配列番号28)
CTCCGGGGATTTCTTCTTAGATCCCGGTCCCTTGCCTCTGGAC
P129−d43/44/46R(配列番号29)
CTCCGGGGATTTCTTAGATCCCGGTCCCTTGCCTCTGGAC
P129−d44/46/47R(配列番号30)
GGGGCTTCTCCGGGGATTTAGACTTTCCCGGTCCCTTGC
P129−d46/47/48R(配列番号31)
GGGGCTTCTCCGGGGAAGATTTCTTTCCCGGTCCCTTGC
1.a)NLS−2領域、NoLS領域、およびNES領域からなる群より選択された少なくとも1つの保存領域内で改変され、それによって上記保存領域が失われているNタンパク質を含む、弱毒化されている遺伝的に改変されたPRRSウイルス、b)a)の遺伝的に改変されたPRRSウイルスをコードする感染性RNA分子、ならびにc)b)の感染性RNA分子をコードするDNA配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子からなる群より選択されたPRRS感染性因子を含む組成物。2.さらに改変されており、その結果、保存NLS−1領域が失われている請求項1に記載の組成物。3.上記保存領域が非保存的アミノ酸置換の導入によって失われている、請求項1に記載の組成物。4.上記保存領域が少なくとも部分的に欠失している、請求項1または2に記載の組成物。5.上記保存領域がNoLS領域である、請求項1に記載の組成物。6.上記保存領域がNLS−2領域である、請求項1に記載の組成物。7.上記保存領域がNES領域である、請求項1に記載の組成物。8.上記PRRSウイルスが北米型PRRSウイルスである、請求項1に記載の組成物。9.上記PRRSウイルスがヨーロッパ型PRRSウイルスである、請求項1に記載の組成物。10.上記保存領域がNLS−2領域である、請求項8に記載の組成物。11.Nタンパク質の残基42および43がグリシンである、請求項10に記載の組成物。12.Nタンパク質の残基42および43がグリシンであり、残基44がアスパラギンである、請求項10に記載の組成物。13.上記NLS−2領域が少なくとも部分的に欠失している、請求項10に記載の組成物。14.Nタンパク質の残基43から48までのうち少なくとも1残基が欠失している、請求項13に記載の組成物。15.Nタンパク質の残基43および44の両方が欠失している、請求項14に記載の組成物。17.Nタンパク質の残基43、44、および46が欠失している、請求項14に記載の組成物。Nタンパク質の残基44、46、および47が欠失している、請求項14に記載の組成物。19.Nタンパク質の残基46、47、および48が欠失している、請求項14に記載の組成物。20.復帰の可能性を最小にするように設計された、追加のヌクレオチド変異、置換、および/または欠失を含有している、請求項1から19に記載の組成物。
Claims (15)
- a)NLS−2領域、NoLS領域、およびNES領域からなる群より選択された少なくとも1つの保存領域内で改変され、それによって前記保存領域が失われているNタンパク質を含む、弱毒化されている遺伝的に改変されたPRRSウイルス、
b)a)の遺伝的に改変されたPRRSウイルスをコードする感染性RNA分子、ならびに
c)b)の感染性RNA分子をコードするDNA配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子
からなる群より選択されたPRRS感染性因子を含む組成物。 - さらに改変されており、その結果、a)保存NLS−1領域が失われているか、または、非保存的アミノ酸置換の導入によって前記保存領域が失われているか、または前記保存領域が少なくとも部分的に欠失している、請求項1に記載の組成物。
- 前記保存領域が以下のもの、すなわち、a)NoLS領域、NLS−2領域、および/もしくはNES領域のいずれか、またはこれらの組合せから選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記PRRSウイルスが以下のもの、すなわち、北米型PRRSウイルスもしくはヨーロッパ型PRRSウイルスのいずれか、またはこれらの組合せから選択される、請求項1から3に記載の組成物。
- 前記PRRSウイルスが北米型PRRSウイルスであり、前記保存領域がNLS−2領域である、請求項3に記載の組成物。
- Nタンパク質の残基43および44がグリシンである組成物、
Nタンパク質の残基43および44がグリシンであり、かつ残基45がアスパラギンである組成物、
NLS−2領域が少なくとも部分的に欠失している組成物、
Nタンパク質の残基43から48までのうち少なくとも1残基が欠失している組成物、
Nタンパク質の残基43および44の両方が欠失している組成物、
Nタンパク質の残基43、44、および46が欠失している組成物、
Nタンパク質の残基44、46、および47が欠失している組成物、ならびに/または
Nタンパク質の残基46、47、および48が欠失している組成物
からなる群より選択された、請求項5に記載の組成物。 - 復帰の可能性を最小にするように設計された、追加のヌクレオチド変異、置換、および/または欠失を含有している、請求項1から6に記載の組成物。
- PRRSウイルスによる感染からブタ動物を防御するワクチンであって、PRRSウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項1から7のいずれかに記載の組成物と、獣医学的使用に許容できる担体とを含むワクチン。
- PRRSウイルスによる感染からブタ動物を防御する方法であって、PRRSウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項8に記載のワクチンで動物にワクチン接種するステップを含む方法。
- 請求項1から9のいずれかに記載の組成物を含む、形質移入された宿主細胞。
- 遺伝的に改変された弱毒化PRRSウイルスを作製する方法であって、
a)NLS−2領域、NoLS領域、およびNES領域からなる群より選択された少なくとも1つの保存領域内で改変され、それによって前記保存領域が失われているNタンパク質を含む遺伝的に改変されたPRRSウイルスを産生するように、PRRSウイルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列に変異導入するステップと、
b)PRRSの複製を支持できる宿主細胞に、前記遺伝的に改変されたPRRSウイルスを導入するステップと
を含む方法。 - 前記遺伝的に改変されたPRRSウイルスが、復帰の可能性を最小にする1つまたは複数の追加のヌクレオチド変異、置換および/または欠失でさらに改変されている、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝的に改変されたPRRSウイルスが北米型PRRSウイルスまたはヨーロッパ型PRRSウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記PRRSの複製を支持できる宿主細胞がMARC−145細胞である、請求項11から13に記載の方法。
- 前記PRRSの複製を支持できる宿主細胞が、生きているブタ動物の体内に含まれている、請求項11から13に記載の方法。
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