JP2015517526A - ブタ生殖および呼吸症候群(prrs)ウイルスに対する離乳前の効果的なワクチン接種 - Google Patents
ブタ生殖および呼吸症候群(prrs)ウイルスに対する離乳前の効果的なワクチン接種 Download PDFInfo
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Abstract
Description
、新型RNAウイルスおよびその修飾生形態、およびワクチンの構築、特にそのようなc
DNAクローンを用いたブタワクチンを対象とする。より具体的には、本発明は、生後間
もなく(すなわち1日齢以下)から2週齢を含む、離乳前の子ブタへの安全で早期なワク
チン接種もまた供給し、常に選択的に、多価混合ブタワクチン、例えば2価PRRSV/
マイコプラズマヒオニューモニエ(M.hyo)ワクチン、2価PRRSV/ブタサーコ
ウイルス2型(PCV2)ワクチン、および3価PRRSV/M.hyo/PCV2ワク
チンとの組み合わせ、または単に1価PRRSVワクチンとして接種される。そのような
状況下でのPRRSに対する早期ワクチン接種は、防御免疫の早期発現を供給し、防御免
疫はワクチン接種後約14日以内、すなわち1日齢でのワクチン接種後15日目、7日齢
でのワクチン接種後21日目、14日齢でのワクチン接種後約28日以内に生じる。本明
細書は北米PRRSウイルスの「P129株」の多数の構築物を供給し(第PCT/IB
2011/055003号および米国第6,500,662号参照)、ワクチンとして非
常に効果的で上記の早期で安全な使用を含むが、そのような防御免疫の早期発現(すなわ
ち生後1日齢で早くも与えられた免疫ワクチン接種後約2週間)は他の北米および欧州P
RRS株、例えば米国第5,476,778号、米国第5,846,805号、米国第6
,380,376号、米国第6,982,160号および米国第6,197,310号に
も適用可能であるとされる。
タにおける生殖に関する問題、ならびに若いブタにおける呼吸器疾患を特徴とする。病原
体はPRRSウイルス(PRRSV)であり、アルテリウイルス科およびニドウイルス目
の仲間である。ニドウイルス目はエンベロープウイルスであり、陽性極性RNAの単一ス
トランドから成るゲノムを有する。陽性ストランドRNAウイルスのゲノムRNAは保存
および遺伝情報の発現の両方における二元的役割を果たす。ニドウイルスにおける複製ま
たは転写にはDNAは含まれない。非構造タンパク質はニドウイルスのゲノムRNAから
大型ポリタンパク質として直接変換され、次にウイルスプロテアーゼによって切断され謙
虚で機能的なタンパク質となる。サブゲノムRNA(sgRNA)の3’共末端入れ子化
セット集合はゲノムから合成され、メッセンジャーRNAとして構造タンパク質の変換に
用いられる。ニドウイルスゲノムRNAの再生はこのようにゲノム複製およびsgRNA
合成の複合過程である。
でほぼ同時に表れた。PRRSウイルスは現在ほぼ全てのブタ生産国における風土病であ
り、世界規模のブタ産業に影響を与える経済的に重大な疾患の1つであるとされる。さら
に、毒性の高い遺伝子型が中国および隣接国で取り出され、そのような遺伝子型は概して
北米遺伝子型に関連するものである。
ままである。野外の動物へのワクチン接種は概して効果的ではないと証明されている。P
RRSは一般的にワクチン接種を受けた群れにおいて再発現し、ほとんどの農場でのPR
RSVワクチン接種キャンペーンは疾患を最終的には抑制できない。
生減弱形態を用いたワクチン接種は不運にも非中和抗体の豊富な生成を誘導するのみであ
る。この時間間隔の間、例えば、限られた量のインターフェロン(IFN)−γ(分泌細
胞のみが生成される。したがって、PRRSVは本質的に、常に豊富な体液性(抗体に基
づく)免疫、および、多様で限定的だが潜在的に防御的なTヘルパー(Th)1様のIF
N−γ反応によって区別される、不均衡免疫反応を刺激すると考えられる。適応免疫の不
均衡進行に最も関与していると思われるPRRSV感染の1つの特徴は、十分な自然免疫
反応の欠如である。大抵、ウイルス感染細胞はI型インターフェロン「IFN」(IF
N−αおよびIFN−βを含む)を分泌し、隣接する細胞を感染から保護する。さらに、放出されたI型IFNは未感作T細胞のサブセットと相互作用し、ウイルス特有II型IFN(IFN−γ)分泌細胞への転換を促進する。対照的に、PRRSV露出に対するブタのIFN−α反応はほぼ実在しない。そのようなIFN−α生成の病原体による非効果的な刺激は、IFN−αがIFN−γ遺伝子発現を増加させるため、宿主の適応免疫反応の本質において大きな影響を有すると期待されるだろう。したがって、元のサイトカインは優性経路を制御し,適応免疫の発達、すなわちT細胞媒介IFN−γ反応および最大抗ウイルス免疫防御を促進する。
は、大量のI型インターフェロンを生成することができるT−細胞機能の極性形成にお
いて重要な役割を果たす樹状細胞の特別型によって生じるということが明らかになっている。具体的には、希少だが優れた樹状細胞の型であり自然IFN−α/β生成細胞としても知られる形質細胞様樹状細胞(PDC)は、未感作T細胞をIFN−γ分泌細胞に分化させる能力により、抗ウイルス免疫において重要な役割を果たす。希少ではあるが、PDCは非常に強力なIFN−α生成細胞であり、それぞれの細胞がウイルスへの反応において3〜10pgのIFN−αを生成することが可能である。対照的に、単球は細胞単位で5から10倍少ないIFN−αを生成する。ブタPDCの表現型およびいくつかの生物学的特性が記載されている(Summerfield et al.,2003,Immunology110:440)。近年の研究は、PRRSVはブタPDCのIFN−α分泌を刺激しないとする(Calzada et al.,2010,Veterinary Immunology and Immunopathology135:20)ことが明らかにされている。
N−γ反応の強度を改善するという観察(W.A.Meier et al.,Vet.
Immunol.Immunopath.102,pp299−314,2004)と組
み合わせることで、IFN−αがブタのこのウイルスの感染間に果たす重要な役割を強調
する。防御免疫の発達におけるIFN−αの明らかに重要な役割を考えると、異なるPR
RSウイルスストックがIFN−α生成を刺激および/または抑制する能力を決定づける
ことが重要である。したがって、PRRSから保護するための新しい、改良された修飾生
ワクチンが緊急に必要である。下記の通り新型感染性cDNAクローン、pCMV−S−
P129−PK、および他から生成されたウイルスは、野生型P129ウイルスまたは2
種類の商用の修飾生PRRSワクチンとは異なる表現型を有するということは明らかであ
る。理論に限られず、本発明は、細胞に基づくウイルスへの免疫反応を促進するワクチン
およびPRRSワクチンの新しく効果的な生成を供給する。
おけるPRRSウイルスに対する効果的な免疫保護反応を誘導する、PRRSウイルスを
コードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含む分離ポリヌクレオチド分子を
供給する。ある態様において、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番
号4、もしくは配列番号6、またはそれに少なくとも70%の同一性、好適にはそれに8
0%の同一性、さらに好適にはそれに85%,90%,95%,96%,97%,98%
もしくは99%の同一性を有する配列を含む、本明細書に記載されているDNA配列を供
給する。
および適切な宿主細胞においてポリヌクレオチド分子を転写することが可能なプロモータ
ー遺伝子を含むプラスミドを供給する。別の実施形態においては、本明細書に記載された
プラスミドの北米または中国PRRSコード配列はさらに1つ以上の検出可能な異種抗原
性エピトープをコードする。本発明は本明細書に記載されたプラスミドを有する核酸導入
された宿主細胞を供給する。
る。本ワクチンは、感染性RNA分子によってコードされる北米または中国PRRSウイ
ルスを含み得、この感染性RNA分子、またはプラスミドはそれぞれ、本明細書に記載さ
れた分離ポリヌクレオチド分子によってコードされる。さらに他の態様では、ワクチンは
、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む。本明細書に記
載されたワクチンセットは、家畜への使用に容認可能なワクチンキャリアを選択的に含み
得る。ある重要な態様では、ワクチンは野生型P129PRRSウイルスに比べて少ない
インターフェロン−α抑制効果を有する(ATCC203488、203489、米国特
許第6,500,662号を参照)。
と本明細書に記載された修飾生ワクチンセットでワクチン接種を受けたブタを区別する(
いわゆるDIVA検査)ポリヌクレオチド分子を含む診断キットを供給する。
的に保護的な量のワクチンの動物への投与を含む、PRRSウイルス株の感染からブタを
守る方法を供給する。
PRRS)、またはそのためのポリヌクレオチド配列コードを含み、ORF1aにコード
されたタンパク質があらゆる次のアミノ酸配列を有するものから成る群から選択され、下
線の残基は新型であると思われる。AMANVYD(配列番号9)、IGHNAVM(配
列番号12)、TVPDGNC(配列番号15)、CWWYLFD(配列番号18)、H
GVHGKY(配列番号21)、AAKVDQY(配列番号24)、PSATDTS(配
列番号27)、LNSLLSK(配列番号30)、APMCQDE(配列番号33)、C
APTGMD(配列番号36)、PKVAKVS(配列番号39)、AGEIVGV(配
列番号42)、ADFNPEK(配列番号45)、およびQTPILGR(配列番号48
)。本発明のさらに好適な実施形態においては、本発明は、ORF1aからコードされた
タンパク質内に上記に同定した配列を有し、これらの同定した配列のあらゆる組み合わせ
(2、3、4、から最大で17)を含む、北米または中国PRRS分離を供給する。
(a)以下の特定の配列における特定のアミノ酸のいずれか
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、
アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)および
アミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号48を参照)、これらの同定配列のあらゆる組み合わせ(2、3、4、最大で17)を含み、または、
(b)前記他の特定3残基アミノ酸配列が1つまたは2つの追加的なアミノ配列変更を示し得るがそれでも上記特定配列と一致すると見なされることを考慮し、上記の3残基配列に一致するあらゆる他の北米または中国PRRSウイルスの特定3残基ORF1aペプチド配列における前記特定下線単一アミノ酸を含む。発明の本実施形態の目的には、「一致」は関連配列が、Henikoff et al.Proc Natl.Acad.Sci.,USA,89,pp.10915−10919,1992に記載されるように、BLOSUMアルゴリズムを用いて最適に並べられ得ることを意味する。
変化(a)、
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、または変化(a)のあらゆるサブセット、
変化(b)、
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、または変化(b)のあらゆるサブセット、
変化(c)、
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、または変化(c)のあらゆるサブセット、ならびに
変化(d)、
アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)、
およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号20を参照)、またはそれらの変化(d)のあらゆるサブセット。
(1)アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
(2)アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
(3)アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
(4)アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)、
およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号48を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット
を含むアミノ酸配列を有する。
(a)配列番号6、
(b)少なくとも(a)のDNA配列と85%の同一性を有する配列であって、そこにおいてそのORF1aにコードされたタンパク質が以下、
群(b)(1)から
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
群(b)(2)から
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
群(b)(3)から
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
群(b)(4)から
アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)、
およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号20を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、を含むアミノ酸配列を含む配列、ならびに
(c)0.5MのNaHPo4、7%のSDS、1mMのEDTAの溶液における65℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションおよび0.1SSC/0/1%SDSにおける68℃での洗浄を含む高い緊縮条件下で(a)または(b)のDNA配列の相補体にハイブリタイズするDNA配列。
(a)配列番号6のDNA配列、
(b)DNA配列で、(a)のDNA配列と少なくとも85%の同一性を有し、そのORF1aにコードされたタンパク質が以下のいずれか、および以下のいずれかの組み合わせを含むアミノ酸配列を有するDNA配列
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、
(アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)、
およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号20を参照)、または
(c)0.5MのNaHPo4、7%のSDS、1mMのEDTAの溶液における65℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションおよび0.1SSC/0/1%SDSにおける68℃での洗浄を含む高い緊縮条件下で(a)もしくは(b)のDNA配列の相補体にハイブリタイズするDNA配列。
表1は、感染性cDNAクローン、およびPK−9細胞への核酸導入によって誘導され
たそれに対応するウイルスを示す。
表2は、野生型PRRSウイルスおよび細胞培養における成長に適応した誘導体のイン
ターフェロン−α抑制効果を示す。
表3は、野生型PRRSウイルスP129およびCD163発現PK−9細胞における
成長に適応した遺伝子操作されたその誘導体のインターフェロン−α抑制効果を示す。
表4は、野生型P129ウイルスおよびPRRSのIngelvacワクチンに比べ、
低下したP129−PK−FLおよびP129−PK−d43/44ウイルスのインター
フェロン−α抑制効果を示す。
表5は、ワクチンウイルスの安全性および有効性を評価するための試験の構想を示す。
表6は、遺伝子位置による、0継代P129と17継代P129−PK−FLとの間の
全てのヌクレオチド差異および結果として得られるアミノ酸の差異を示す。
表7は、ウイルスタンパク質による、0継代P129と17継代P129−PK−FL
との間のヌクレオチドおよびアミノ酸の差異の集計を示す。
表8は、遺伝子位置による、感染性cDNAクローンpCMV−S−P129およびp
CMV−S−P129−PK17−FLにおいて見つかったPRRSV遺伝子間の全ての
ヌクレオチドの差異および結果として得られるアミノ酸の差異を示す。
表9および10は、52代継代ウイルスの表現型(配列番号6)に貢献するアミノ酸変
化を示す。
表11は、1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種後の臨床症状を有するブタの数
を示す。
表12は、1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種後の血清平均力価を示す。
表13は、以前1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種を受けた7週齢のブタの抗
原投与後の肺病変の割合を示す。
表14は、以前1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種を受けた18週齢のブタの
抗原投与後の肺病変の割合を示す。
表15は、以前1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種を受けた26週齢のブタの
抗原投与後の肺病変の割合を示す。
表16は、以前修飾生PRRSVワクチンの接種を受けた5週齢の子ブタの抗原投与後
の肺病変の割合を示す。
配列番号1はP129−PK−FL継代17の完全ゲノムを供給する。
、文脈が明らかに別の意味を示さない限り、複数形への言及を含む。したがって、例えば
、「本方法」への言及は1つ以上の本明細書に記載された方法および/または段階を含み
、本開示その他を読むにあたり当業者には明らかなものとなるだろう。
本発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載さ
れるものと同様または同等のあらゆる方法および物質が発明の実施または検査において使
用され得るが、好適な方法および物質がこれから記述される。
分子生物学および遺伝子組み換え技術の当業者が備えている技能の範囲内の慣習的な方法
を用い、その多数が例示の目的で以下に記述される。そのような技術は文献において完全
に説明される。例えばSambrook,et al.Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)
;Maniatis et al.Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual(1982);DNA Cloning:A Practi
cal Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.);Olig
onucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984);N
ucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higg
ins,eds.,1985);Transcription and Transla
tion(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);Animal
Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986);Perba
l,A Practical Guide to Molecular Cloning
(1984)を参照されたい。
するあらゆるPRRSウイルス、例えば1990年代初頭頃に米国で最初に分離されたP
RRSウイルス(例えば、Collins,J.E.,et al.,1992,J.V
et.Diagn.Invest.4:117−126);North America
n PRRS virus isolate MN−1b(Kwang,J.et al
.,1994,J.Vet.Diagn.Invest.6:293−296);the
Quebec LAF−exp91strain of PRRS(Mardassi
,H.et al.,1995,Arch.Virol.140:1405−1418)
;およびNorth American PRRS virus isolate VR
2385(Meng,X.−J et al.,1994,J.Gen.Virol.
75:1795−1801を参照)を意味するがこれに限られない。遺伝的特徴は、北米
PRRSウイルス株と共有するゲノムヌクレオチド配列の類似性およびアミノ酸配列の類
似性を意味する。中国RPPSウイルス株は一般的に北米株と約80〜93%のヌクレオ
チド配列の類似性を表す。
に関連する遺伝的特徴を有するあらゆる株のPRRSウイルスを意味する(例えばWen
svoort,G.,et al.,1991,Vet.Q.13:121−130を参
照)。「欧州PRRSウイルス」は当業者において「Leystadウイルス」を意味す
ることもある。
は、ワクチン接種を受けた動物における病原体による感染から保護するための、1つ以上
の病原体の抗原エピトープに向けられる免疫反応を意味する。本発明の目的においては、
病原体による感染からの保護は、感染からの完全な保護だけでなく、病原体による感染の
程度もしくは比率のあらゆる検出可能な減衰、またはワクチン接種を受けていない感染し
た動物と比較した、ワクチン接種を受けた動物における病原体による感染がもたらす疾患
もしくはあらゆる症状もしくは状態の重症度のあらゆる検出可能な減衰も含む。効果的な
免疫保護反応は、以前病原体に感染していないおよび/またはワクチン接種の時点で病原
体に感染していない動物において誘導され得る。効果的な免疫保護反応はワクチン接種の
時点で既に病原体に感染している動物においても誘導され得る。
。疾患の重症度を決定する1つ以上のパラメータにおいて統計的に有意な減衰を示すとき
、株は「毒性が低い」。そのようなパラメータはウイルス血症のレベル、熱、呼吸困難の
重症度、生殖症状の重症度、または肺病変の数もしくは重症度等を含み得る。
感染したとき感染性PRRSを作り出すことが可能な細胞を意味する。そのような細胞は
単球/マクロファージ系統のブタ細胞、例えばブタ肺胞マクロファージ細胞および誘導体
、MA−104サル腎細胞および誘導体、例えばMARC−145細胞、ならびにPRR
Sウイルスの受容体と核酸導入した細胞を含む。用語「PRRSウイルス複製の支援をす
ることが可能な宿主細胞」は生きたブタの細胞もまた含み得る。
のPRRSウイルスタンパク質をコードすることを求められる最小ヌクレオチド配列を意
味する。
能的に用いられ、イノシシ科の仲間であるあらゆる動物、例えば、ブタを意味する。本明
細書で用いられる用語「PRRSウイルス」は、別の方法が指定されない限り、北米また
は欧州PRRSウイルスのどちらかのいずれかの株を意味する。
む。そのような症状の例は、発熱、妊娠している雌における流産、呼吸困難、肺病変、食
欲不振、および若いブタの死亡率を含むがこれらに限られない。本明細書で用いられる、
「PRRSを生成できない」PRRSウイルスは、ブタに感染できるが、ブタにおけるP
RRS感染に一般的に関連づけられる疾患症状を生成しないウイルスを意味する。
イルスの欧州および北米遺伝子型の両者のORF7によってコードされるポリペプチドと
して定義される。現在知られているNタンパク質の具体的なアイソタイプの例は、受託番
号PRU87392によってGenbankにおいて報告された北米PRRS123アミ
ノ酸ポリペプチド原型分離株VR2322、およびGenbank受託番号A26843
において報告された欧州原型PRRS分離株Lelystadの128残基Nタンパク質
である。
−1領域」は「pat4」または「nuc1」核局在化シグナルを意味し(Nakai&
Kanehisa、1992;Rowl&Yoo、2003)、4つの連続的塩基性アミ
ノ酸(リジンまたはアルギニン)または3つの塩基性残基およびヒスチジンまたはプロリ
ンを含み、成熟Nタンパク質のおよそ第1の15N末端残基内に位置する。例として、L
elystad分離株配列はKKKKであり、Nタンパク質の残基10〜13に位置する
一方で、VR2332NLS−1領域配列はKRKKであり、残基9〜12に位置する。
−2領域」は、Nタンパク質内の第2の核局在化シグナルを意味し、2つの形態のうち1
つの形態を取ることができる。北米PRRSウイルスにおいて、NLS−2は、「pat
8」モチーフと指定したパターンを有し、5つの残基配列による3つの残基内において追
随されるプロリンから始まり、5つのうち少なくとも3つの塩基性残基(KまたはR)を
含む(「pat7」または「nuc2」モチーフのわずかな修飾がNakai&Kane
hisa、1992、Rowland&Yoo、2003により記載される)。例として
、そのような配列は北米PRRSV分離株VR2332のNタンパク質残基41〜47に
位置し、配列P...Kで表される。欧州PRRSウイルスにおいてNLS−2は「pa
t4」または「nuc1」モチーフを有し、4つの塩基性アミノ酸またはヒスチジンもし
くはプロリンに関連する3つの塩基性残基の連続的広がりである(Nakai&Kane
hisa,1992;Rowland&Yoo,2003)。欧州PRRSV分離株Le
lystadのNLS−2は残基47〜50に位置し、配列K..Kによって表される。
領域」は全長約32アミノ酸を有し、そのアミノ末端付近のNLS−2領域を包含する核
小体局在シグナルを意味する。例として、VR2332NoLS領域配列は残基41〜7
2に位置し、配列P...Rによって表され(Rowl&Yoo、2003)、それに対
応するLelystad分離株配列は、残基42〜73に位置し、配列P..Rによって
表される。
らゆる宿主細胞を意味し、PRRSウイルスに核酸導入されたとき、RNAはPRRSウ
イルス粒子の少なくとも第1のラウンドを生成することができる。本発明における「感染
性DNA分子」は複製、転写および適切な宿主細胞から機能的なウイルス粒子への転換を
支援するために不可欠な要素をコードする。同様に、「分離ポリヌクレオチド分子」は、
自然発生状態から、もしあれば検出可能なあらゆる程度で精製された、本発明のポリヌク
レオチド分子を含む物質の組成物を意味する。
加を含むことができ、第1のヌクレオチド配列にコードされたポリアミノ酸に少なくとも
約70%同一であるかまたは本発明の実施に有益である限り、コードされたポリアミノ酸
におけるアミノ酸の差異をもたらす。この点において、概して全体のタンパク質機能を不
活性化しないと認識される特定の保守的アミノ酸置換、例えば、正電荷を持つものとして
、アミノ酸(逆もまた同様)、リジン、アリジニンおよびヒスチジン;負電荷を持つもの
として、アミノ酸(逆もまた同様)、アスパラギン酸およびグルタミン酸;ならびに中性
電荷を持つアミノ酸の群として(全ての場合において逆もまた同様)、(1)アラニンお
よびセリン、(2)アスパラギン、グルタミン、およびヒスチジン、(3)システインお
よびセリン、(4)グリシンおよびプロリン、(5)イソロイシン、ロイシンおよびバリ
ン(6)メチオニン、ロイシンおよびイソロイシン、(7)フェニルアラニン、メチオニ
ン、ロイシン、およびチロシン、(8)セリンおよびトレオニン、(9)トリプトファン
およびチロシン、(10)ならびに例えばチロシン、トリプトファンおよびフェニルアラ
ニンがなされ得る。アミノ酸は物理的特性ならびに2次および3次タンパク質構造への貢
献によって分類され得る。保守的な置換は当業者に、あるアミノ酸の類似する特性を持つ
別のアミノ酸への置換として認識される。例示的保守的置換は1997年3月13日に公
開された国際公開第WO97/09433号、頁10、(1996年9月6日に出願され
た国際出願第PCT/GB96/02197号において見られる。または、保守的アミノ
酸はLehninger(Biochemistry,Second Edition;
Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975),pp.71−7
7)において記載されるように分類され得る。さらなる適切な保守的変化およびその適用
は以下で記載される。
、部位特異的変異誘発法、またはランダム変異導入法、例えば当業者に周知のように化学
突然変異原または放射線への露出を含む。」変異は当業者に周知の標準方法で実行され得
、例えば記載のような感染性コピー(例えばMeulenberg et al.,Ad
v.Exp.Med.Biol.,1998,440:199−206)の部位特異的変
異誘発法(例えばSambrook et al.(1989)Molecular C
loning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spri
ng Harbor,N.Y.を参照)による。
本方法は、上記のようにPRRSウイルスをコードする感染性RNA分子をコードするD
NA配列に変異を起こさせること、および適切な発現体系を用いて遺伝子組換えPRRS
ウイルスを発現することを含む。遺伝子組換えPRRSウイルスは、当業者に周知の適切
な発現体系を用いて分離ポリヌクレオチド分子から発現され得、その例は本出願に記載さ
れる。例えば、分離ポリヌクレオチド分子は、以下でより詳細に記載されるように、適切
な体外宿主細胞におけるコードされたウイルスを発現することが可能なプラスミド形態で
あり得る。
%の互いとの同一性を有する。北米および欧州PRRSV Nタンパク質は約57〜59
%同一であり、共通の構造モチーフを共有する。一般的に、特定のヌクレオチドまたはコ
ードされたアミノ酸に異なって番号を付けられる可能性があるPRRSコード配列および
分離株を比較するとき、適切な領域の同定は、対象のPRRS株における保存された特徴
的アミノ酸を同定することおよびそれを参考株と整列させることより、速やかに達成され
る。
力な分子生物学手法を含み、分子レベルでゲノムを分析および修飾することを可能にする
。この点において、PRRSウイルスのようなウイルスは、そのゲノムの適度なサイズゆ
えに、上記の操作に特に従順である。しかしながら、これらのウイルスは複製においてD
NA中間段階を含まないため、組換えDNA技術は非レトロウイルスRNAウイルスに直
ちに適用できるわけではない。そのようなウイルスには、修飾ウイルスを生成するために
それらのゲノムに組換えDNA技術が適応され得る前に、感染性cDNAクローンが開発
されなければならない。感染性クローンは試験下のウイルスの全長(ゲノムの長さ)cD
NA(ここではRNAのDNAコピーの広い意味で用いられ、mRNAのDNAコピーの
厳密な意味のみではない)の構造から誘導され得、その後、感染性転写が全長cDNAで
核酸導入された生体内の細胞において合成され、しかし感染性転写は転写混合物の存在に
伴う原核プロモーターを有するプラスミドにおける全長cDNAからの生体外の転写によ
っても得られ得、または生体外で全てのウイルスゲノムを含む結紮した部分長cDNA断
片を用いることによっても得られ得る。全ての場合において、転写RNAはcDNAに導
入された全ての修飾を保有し、このように修飾されたウイルスの更なる継代に用いられ得
る。
は米国特許第6,268,199号に記載され、参照することによって全面的に本明細書
に組み込まれる。P129に指定された北米PRRSウイルス分離株の感染性cDNAク
ローンの調製(Lee et al.,2005;Yoo et al.,2004)は
米国特許第6,500,662号に記載され、参照することによって全面的に本明細書に
組み込まれる。P129cDNAの配列はGenbank受託番号AF494042およ
び米国特許第6,500,662号において開示される。下記の試験はプラスミドとの関
連でCMV最初期プロモーターによって発現され、pCMV−S−P129に指定される
そのような感染性クローンを利用し、米国特許第6,500,662号においても開示さ
れる。米国特許第6,500,662号に記載のように、本発明における使用に適切な他
のプラスミドおよびプロモーターがある。
業者は望まれる具体的位置における変化を考案するにはコドン表を調べるだけでよい。
DNA分子を構成する。コドンはmRNA分子内に存在するときはウラシル塩基(U)に
よって特徴づけられるが、DNA内に存在するときはチミジン塩基(T)によって特徴づ
けられる。コドンにおけるポリヌクレオチド内の同じアミノ酸残基への単純な変化はコー
ドされたポリペプチドの配列または構造を変化させない。特定の3ヌクレオチド配列がい
ずれかの特定のアミノ酸を「コードする」と述べるとき、当業者が上記の表が対象の特定
のヌクレオチドを同定する手法を供給するということを認識し得るということは明らかで
ある。例として、特定の3ヌクレオチド配列がリジンをコードする場合、上記表は2つの
可能性のあるトリプレット配列がAAAおよびAAGであるということを開示する。グリ
シンはGGA,GGC,GGT(RNAにおける場合はGGU)およびGGGによってコ
ードされる。コードされたタンパク質においてリジンをグリシン残基に変化させるために
は、コードする核酸内においてAAAまたはAAGのトリプレットをGGAおよびGGC
,GGTまたはGGGのいずれかに置き換える可能性がある。
路によって媒介されるウイルスに対する宿主反応は、他の反応がある中で下方制御されな
い。下に詳細に記載されるように、この点において効果的なウイルスゲノムに対する多様
な修飾があり、特に本明細書で開示されるようにORF1aにおいて発見されるものおよ
びその組み合わせがある。注目されるべきは、類似する修飾点がPRRSゲノムの追加的
翻訳領域において、本明細書でも開示されるように(表9参照)発見され得るということ
である。
RSウイルスを減弱させることに成功しており、結果としての減弱の正確な要因は一般的
に知られていないものの、ワクチン使用への適合性を供給し得るということである。例え
ば、ウイルスのヌクレオカプシドまたはNタンパク質(ORF7にコードされた)におけ
るNLS−2領域、NoLS領域、もしくはNES領域を変異させるまたは欠失させるこ
とにより毒性PRRSウイルスを減弱させること、翻訳領域7(ORF7)における欠失
を含むことが開示される。別の態様では、ORF7の欠失はカプシドタンパク質の核局在
化シグナル(NLS)をコードする配列内における。NLSをコードする配列内でのOR
F7の欠失は位置43〜48での1つ以上のアミノ酸の欠失を含み得るか、または位置4
3および44の一方もしくは両方でのアミノ酸の欠失を含み得る。例えば参照によって組
み込まれる米国特許第7,544,362号の全開示を参照されたい。ORF7にコード
されたPRRSVのヌクレオカプシドタンパク質は小さい塩基性タンパク質であり、リン
酸化しており(Wootton,Rowland,and Yoo,2002)ホモ2量
体を形成する(Wootton and Yoo,2003)。結晶構造が近年特定され
た(Doan and Dokland,2003)。Nタンパク質は感染細胞において
複数の機能を有するように思われる。細胞質で起こる過程である、内部にゲノムRNAが
パッケージされる球状のカプシド構造を形成する過程に加え、Nタンパク質の一部が核お
よび特異的に感染細胞の核に輸送される。Nタンパク質のアミノ酸配列は2つの核局在化
シグナル(NLS)、核小体局在化シグナル(NoLS)、および核輸出シグナル(NE
S)を含み、核および核小体への輸送ならびに核からの輸出をそれぞれ容易にする(Ro
wland et al.,1999;Rowland et al.,2003;Ro
wland and Yoo,2003)。核小体にある間、Nタンパク質は小型核小体
RNA関連タンパク質フィブラリンと相互作用し、感染細胞におけるrRNA処理および
リボソーム生合成を制御しウイルス複製に助力し得る(Yoo et al.,2003
)。この型のウイルス変異は、新型PRRSワクチンの考案に、単独または他の減弱変異
との組み合わせのどちらにおいても価値あるものである。減弱されたPRRSウイルスの
別の例においては、ORF1aへの修飾が用いられた。ORF1aの領域をコードする非
構造タンパク質2超可変領域におけるアミノ酸616から752の間の抗原エピトープを
コードするDNA配列の欠失が用いられた。参照することによって全面的に組み込まれる
米国特許第7,618,797号を参照されたい。
検査に値するということを示唆する。この細胞型はヒト、マウス、ラット、ブタおよびサ
ルの末梢血単核球の0.2%〜0.8%を表す。稀であるにもかかわらず、この細胞は自
然免疫系の重要な構成要素であり、ウイルス刺激の後で多量のIFN−αを分泌すること
が可能である。PDCが抗ウイルス性の自然および適応免疫を制御するにあたり主要な役
割を果たすのは、それらがナチュラルキラー細胞、B細胞、およびT細胞の機能を促進す
るためであり、IFN−αの分泌を介する。さらに、ブタ単球誘導樹状細胞の成熟化(M
oDC)はPDCによって分泌されるIFN−αにより促進され、MoDCが抗原および
活性T細胞を提示する能力の向上をもたらす。ウイルス感染の後期段階で、PDCは成熟
樹状細胞の固有の型に分化し、T細胞の機能を直接的に制御しT細胞の分化を、PRRS
ウイルスを含むウイルスに対する抗ウイルス免疫の主要な媒介物であるIFN−γ分泌が
可能な細胞へ向かわせる。当然のことながら、PDCがIFN−αを分泌する能力を抑制
するとして知られる呼吸系発疹ウイルスおよび麻疹ウイルスのような、ヒトウイルスがあ
る。この抑制効果は、体液性免疫反応およびこれらのウイルスへの感染の結果として観察
される関連する免疫病理学の優性において、ならびに、第2の細菌およびウイルス感染へ
の宿主の易感性において、役割を果たすと思われる。
トック(下記参照)がこのPDC機能に対して最小から無の抑制効果を示した一方で、野
生型PRRSV分離株もIngelvac PRRSワクチン株の両者と同様に(例5お
よび下記を参照)純化されたブタPDCの集団がIFN−αを生成する能力を抑制した。
これらの観察の重要性は、部分的に、ウイルスへの適応免疫反応の発展を抑制することに
おけるIFN−αの重要性に帰する。したがって、IFN−αを最小に抑制するウイルス
から誘導された減弱したウイルスワクチンは強い抗ウイルス保護免疫反応を誘発する可能
性が高い。Ingelvac PRRS MLVワクチンに対するIFN−αのアジュバ
ント効果はウイルス特有T細胞媒介IFN−γ反応を誘発すること、および、ワクチンに
よって誘発されたウイルス特有T細胞媒介IFN−γ反応の強度は野外および実験室条件
下のウイルスに対する防御免疫と正相関を有することが以前に実証された。したがって、
理論に限られないが、細胞媒介の免疫反応および非IFN−α抑制PRRSVによって誘
発される防御免疫のレベルは野生型(IFN−α抑制)表現型を示すPRRSV分離株の
それよりも著しく高いと期待することは妥当である。
P129−PK感染性cDNAクローンから誘導された5つの欠失変異体の全てと同様に
、IFN−α生成を抑制する能力を失ったことである。したがって、この異常な表現型は
欠失のみによる結果ではなく、少なくとも部分的に、感染性クローンの構築の間に固定さ
れた遺伝子変化による結果でもある。興味深いことに、連続的にPK−9細胞上で63回
継代されたクローンされていないP129ウイルスはIFN誘発を抑制する能力を維持し
た(表1)。全ての感染性クローン誘導ウイルスにおいて見られる共通のIFN表現型に
対する最も有望な説明は、感染性クローンの生成の間の1つ以上の変異の取り込みである
。これらの変異は、感染性クローンを構築するために用いられるウイルス性RNA内に、
恐らく低いレベルで存在し得た。究極的に、変異は、ブタにおける元の(継代0)ウイル
ス内に存在し得たか、またはウイルスをPK−9細胞上での16継代にわたる生育に適応
させる過程の間に生成および濃縮され得た。変異が結果PCR誘発エラーまたはクローン
人工物であるという可能性は除外され得ない。少なくとも、変異はIFN−α抑制機能の
欠損が感染性クローン構築の間に「固定」されたことの原因であり、この特定の感染性ク
ローンから誘導された全てのウイルス内に存在することが求められる。
ルス性RNAに前から存在していた可能性は、PRRSVがウイルス性RNA依存RNA
ポリメラーゼによるエラーの結果として容易にランダムな遺伝的多様性を生成するとして
知られていることを考慮すると、もっともらしい。ウイルス疑似種は、生体内でのウイル
ス複製の間自然に現れる、密接に関わる遺伝子変異体の異種性混合物で構成される。より
関連があるのは、感染性cDNAクローンから誘導されたPRRSVの生体外の複数の継
代後のウイルス疑似種の観察である。以前行われた試験におけるウイルスゲノムの開始個
体群は遺伝的に同種な個体群から成り、配列の多様性は細胞培養における継代の間急速に
生成されたため、これは注目すべきである。現在の試験においては、元のP129ウイル
スが16PK−9継代の前にクローンされておらず(生物学的にまたは分子的に)、感染
性クローンの構築に通じるため、ゲノム異質性のレベルはより高くあり得る。したがって
IFN−α抑制機能の欠損の原因である疑似種の中でPRRSV RNA変異体、および
pCMV−S−P129−PK17−FL感染性cDNAクローンへの取り込みの可能性
選択はもっともらしい。これらの変異の感染性クローンへの取り込みは、全ての誘導ウイ
ルスが、効果的な次世代PRRSワクチンの発達に重要であると証明され得る、この独特
な生物学的表現型を共有していることを考慮すると、いくつかの条件下においては、偶発
的であり得る。
(PBMC)および形質細胞様樹状細胞(PDC)がインターフェロン(IFN)−αを
生成する能力に対し強い抑制効果を示した。一方で、P129(pCMV−S−P129
−PK17−FL)の感染性cDNAクローンから誘導されたウイルスはIFN−α抑制
表現型における有意な減衰を示した。この感染性クローンは、以前CD163発現ブタ腎
細胞株PK―9における16の連続的継代にわたる培養に適応したウイルスから構築され
た(参照することによって全面的に組み込まれる米国特許第7,754,464号を参照
)。P129−PK−FLおよびP129−PK−d43/44のIFN−α抑制表現型
は低いものから無視できるものまでの範囲を持ち、どちらも高い抑制性を持つ2つのIn
gelvac PRRS修飾生ウイルスワクチン株のいずれかによって示されたものと著
しい対照を成した。これらの結果は、P129−PK−FLおよびP129−PK−d4
3/44ウイルスが生物学的に親低継代P129分離株、他の野生型PRRSウイルス、
およびIngelvac PRRSワクチンの両者とは異なるということを示す。減衰I
FN−α抑制表現型の潜在的含意は、表現型の変化の考えられる理由と同様に記載される
。
本発明のアミノ酸修飾
かで、ORF1からコードされたタンパク質に特定の位置にアミノ酸を含み、それが所望
の表現型をこれらのウイルスに与える分野で同定され得る。別の例では、上述のように、
コードされたORF1タンパク質の遺伝子配列(および、したがってアミノ酸配列)を修
飾し、再び、その全てがそのような表現型を有する、修飾北米および中国PRRSウイル
ス、ならびに感染性クローン、ならびにそのワクチンを生成するために、標準遺伝子手順
が用いられ得る。好適な実施例では、表現型は、野生型PRRSウイルスと比較して減衰
したインターフェロン−α抑制効果、および、選択的に、ほとんど検出不可能な病態であ
るが強い免疫反応を誘発する一方で宿主動物(ブタ)内で繁殖または持続する能力を含む
がこれに限られない。
、例えば開示されている米国特許第6,500,662号、同第7,618,797号、
同第7,691,389号、同第7,132,106号、同第6,773,908号、同
第7,264,957号、同第5,695,766号、同第5,476,778号、同第
5,846,805号、同第6,042,830号、同第6,982,160号、同第6
,241,990号、および同第6,110,468号を含む。出発点として役に立ち得
る中国PRRS株および分離株については例えば、TJM−92ウイルスに係る公開され
た中国出願CN201633909から中国出願CN200910091233.6を参
照されたい。
コードされる最も一般的なアミノ酸である、アラニン、(Ala,A)、アルギニン(A
rg,R)、アスパラギン(Asn,N)、アスパラギン酸(Asp,D)、システイン
(Cys,C)、グルタミン酸(Glu,E)、グルタミン(Gln,Q)、グリシン(
Gly,G)、ヒスチジン、(His,H)、イソロイシン(Ile,I)、ロイシン(
Leu,L)、リジン(Lys,K)、メチオニン(Met,M)、フェニルアラニン(
Phe,F)、プロリン(Pro,P)、セリン(ser,S)、トレオニン(Thr,
T)、トリプトファン(Trp,W)、チロシン(Tyr,Y)およびバリン(Val,
V)に使用される。
国)PRRSにおける、毒性の減弱の原因となる観察されたアミノ酸変化を同定する。そ
の結果、ワクチンへの安全で強い免疫反応を可能にする。表10は、ORF1a内におけ
るこの点で非常に好適なアミノ酸修正を同定し、他のP129培養菌から継代することに
関してこれらの変異がどのように起こったかを示す(またこの経歴の検査は、本発明のア
ミノ酸変化のいずれかを有するコード化DNAを(再)構築するための変異誘発方策の考
案を必要に応じて容易にするということを特筆すべきである。)。この点に関して、OR
F1aへの最も好適なアミノ酸改善は(P129継代52で明示されているように、18
2のアスパラギン、189のアスパラギン、273のチロシン、302のヒスチジン、6
65のトレオニン、943のシステイン、1429のトレオニン、1505のアラニン、
2410のアスパラギンを含み、潜在的に多数のグリコシル化の機会を加えて、そのよう
にしてタンパク質機能をさらに変更し得る。
供給し、そこにおいて、ORF1aによってコードされたそのタンパク質が以下のいずれ
かを含むアミノ酸配列を含む群から選択される。
アミノ酸配列IGHNAVMにおけるアミノ酸N(配列番号12)、
アミノ酸配列TVPDGNCにおけるアミノ酸D(配列番号15)、
アミノ酸配列CWWYLFDにおけるアミノ酸Y(配列番号18)、
アミノ酸配列HGVHGKYにおけるアミノ酸H(配列番号21)、
アミノ酸配列AAKVDQYにおけるアミノ酸V(配列番号24)、
アミノ酸配列PSATDTSにおけるアミノ酸T(配列番号27)
アミノ酸配列LNSLLSKにおけるアミノ酸L(配列番号30)
アミノ酸配列APMCQDEにおけるアミノ酸C(配列番号33)、
アミノ酸配列CAPTGMDにおけるアミノ酸T(配列番号36)、
アミノ酸配列PKVAKVSにおけるアミノ酸A(配列番号39)、
アミノ酸配列AGEIVGVにおけるアミノ酸I(配列番号42)、
アミノ酸配列ADFNPEKにおけるアミノ酸N(配列番号45)および
アミノ酸配列QTPILGRにおけるアミノ酸I(配列番号48)。
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、
アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)および
アミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号48を参照)。
。
ブタが含まれている。動物はPRRSウイルス特異的血清抗体がないことおよびPRRS
V陰性であることを検査される。試験に含まれる全ての動物は同じ源および種類である。
群への動物の配分は無作為抽出される。
内投与によって実行される。それぞれの検査構成あたり少なくとも3つの群があり、1つ
はP129抗原投与の群、1つは減弱している可能性があるウイルスでの抗原投与の検査
群、および1つは厳密な対照群である。
有効であると考えられ、P129を抗原投与された群で生まれる、生きている健康な子ブ
タは、厳密な対照群と比べ少なくとも25%少ない。
上のパラメータの統計的な著しい変化と定義される。
非修飾親株感染群と比較した検査群(減弱した可能性のあるウイルス)の次のパラメータ
の少なくとも1つの著しい減少は、減弱の徴候である。
a)死産の頻度
b)妊娠112日またはそれより前での流産
c)ミイラ化した子ブタの数
d)元気がなく弱い子ブタの数
e)離乳前死亡率
さらに非修飾親株感染群と比較した検査群の次のパラメータの少なくとも1つの顕著な増
加が好適である。
f)雌ブタ1頭につき離乳される子ブタの数
g)雌ブタ1頭につき生まれる、生きている健康な子ブタの数
代替では、呼吸器症状およびPRRSV感染症の他の症状は、減弱を確立するために調べ
られることができた。
から保護するならば、現在のワクチンは効果的である。1頭以上の非罹患ブタへのワクチ
ンの投与後に、生物学的に純粋なウイルス分離株(例えば、VR2385、VR2386
、P129その他)によるその後の抗原投与が、一般的に、無防備である類似したブタで
分離株に起因するそれらの変化または症状と比較して(すなわち、適切な対照に関連して
)、あらゆる肉眼的もしくは組織病理変化(例えば、肺病変)および/または疾患の症状
の重症度の減衰をもたらす場合、ワクチンはPRRSウイルスによる感染からブタを保護
する。より具体的には、現在のワクチンは必要に応じて1頭以上の適当なブタにワクチン
を投与し、その後適切な長さの時間(例えば、4週間)の後、生物学的に純粋なPRRS
V分離株の大きなサンプル(10(3-7)TCID(50))で抗原投与することにより効果的
であることが示され得る。それから、血液サンプルは約1週後に抗原投与を受けたブタか
ら引き出され、次いでウイルスを血液サンプルから分離する試みが実行される。減衰した
量のウイルス(またはウイルスなし)の分離が、ワクチンが効果的であり得るという徴候
である一方、大量のウイルスの分離は、ワクチンが効果的であり得ないという徴候である
。
変した肺組織のパーセンテージの減少)、または質的に(例えば、血液からのPRRSV
の分離、肺、扁桃腺またはリンパ節組織サンプルにおける免疫測定によるPRRSV抗原
の検出)評価され得る。ブタ生殖および呼吸器疾患の症状は、量的に(例えば、体温/熱
)または半定量的に(例えば、1つ以上の症状の有無または1つ以上の症状、例えばチア
ノーゼ、肺炎、肺障害その他の重症度の減衰)評価され得る。
なかったか、または、ブタ生殖および呼吸症のおよび呼吸器疾患感染性病原体に曝露され
ていたが、疾患の症状を示していないブタである。罹患したブタは、PRRSの症状を示
す、または、PRRSを分離できるものである。
ために、次の許容可能な慣用に従って処方することができる。例えば、標準的なバッファ
、安定剤、希釈剤、防腐剤、および/または、可溶化剤である。そして、持続放出を促進
するためにも処方することができる。希釈剤は、水、生理的食塩水、ブドウ糖、エタノー
ル、グリセロール、およびそれらと同様のものを含む。等張性のための添加物は、とりわ
け塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトールおよびラクトース、を含む。
安定剤はとりわけアルブミンを含む。修飾生ワクチンを処方する際特に有益なものを含む
、他の適当なワクチン媒体および添加物は、当業者にとって周知であるか、または明らか
である。参照することによって本明細書に組み込まれる、Remington’s P
harmaceutical Science,18th ed.,1990,Mack
Publishingを参照されたい。
つ以上の追加免疫調節成分を含むことができる。本発明のワクチンで使用できるアジュバ
ントの非限定的な例は、例えばRIBI補助剤系(Ribi Inc.,Hamilto
n,Mont.)、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルのような鉱物ゲル類、水中油型
乳剤、例えばフロイント完全および不完全アジュバントなどの油中水型乳剤、ブロック共
重合体(CytRx,Atlanta,Ga.)、QS−21(Cambridge B
iotech Inc.,Cambridge Mass.)、SAF−M(Chiro
n、Emeryville Calif.)、AMPHIGEN.RTMアジュバント、
サポニン、Quil Aまたは他のサポニン断片、モノホスホリルリピドA、ならびにア
ブリジン脂質−アミンアジュバントを含む。本発明のワクチンで有益な水中油型乳剤の非
限定的な例は、修飾されたSEAM62およびSEAM1/2の製剤を含む。修飾された
SEAM62は、5%(v/v)のスクアレン(Sigma)、1%(v/v)のSPA
N.RTM85.洗剤(ICI界面活性剤)、0.7%(v/v)のTWEEN.RTM
.80洗剤(ICI界面活性剤)、2.5%(v/v)のエタノール、200pg/ml
のQuil A、100[mgr]g/mlコレステロール、および0.5%(v/v)
のレシチンを含む水中油型乳剤である。修飾されたSEAM1/2は、5%(v/v)の
スクアレン、1%(v/v)のSPAN.RTM85.洗剤(ICI界面活性剤)、0.
7%(v/v)のTWEEN80洗剤、2.5%(v/v)のエタノール、100.mu
.g/mlのQuil A、50.mu.g/mlコレステロールを含む水中油型乳剤で
ある。他の免疫調節薬は、例えば1つ以上のインターロイキン、インターフェロン、また
は他の周知のサイトカインを含むワクチンに含むことができる。
発明のウイルスベクターのために任意に処方できる。そのような持続放出製剤の例は、例
えば、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラ
ーゲン、および同様のもののなどのウイルス、感染性RNA分子、プラスミドまたは生体
適合ポリマーの複合体と組み合わされたウイルスベクター含む。薬物送達媒体における分
解性ポリマーの構造、選択、および使用は、参照することによって本明細書に組み込まれ
る、A.Domb et. al.,Polymers for Advanced T
echnologies3:279−292を含む、いくつかの刊行物で概説されている
。医薬製剤に重合体を選択および使用することにおける追加指針は、当技術分野で知られ
ていた文章で見ることができる。例えば、M.Chasin and R.Langer
(eds),1990,Drugs and the Pharmaceutical
Sciences,Vol.45,M.Dekker,N.Yの“Biodegrad
able Polymers as Drug Delivery Systems”が
あり、参照することによって本明細書に組み込まれる。あるいは、または加えて、投与および有効性を向上させるためにウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターをマイクロカプセル化できる。抗原をマイクロカプセル化する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第3,137,631号、米国特許第3,959,457号、米国特許第4,205,060号、米国特許第4,606,940号、米国特許第4,744,933号、米国特許第5,132,117号および国際特許公開第WO95/28227号に記述された技術を含み、それらの全ては、参照することによって本明細書に組み込まれる。
するために使用できる。リポソーム型製剤を製作し使用する方法に関する詳細は、とりわ
け米国特許第4,016,100号、米国特許第4,452,747号、米国特許第4,
921,706号、米国特許第4,927,637号、米国特許第4,944,948号
、米国特許第5,008,050号、および米国特許第5,009,956号で発見でき
、それらの全ては、参照することによって本明細書に組み込まれる。
ス、プラスミドまたはウイルスベクターから開始し、次に、効果を監視している間、投与
量を増加させることができる。有効な量はワクチンの1回の投与の後、またはワクチンの
複数回の投与の後に得られ得る。1頭の動物あたり1つの至適投与量を決定するとき、周
知の要素を考慮に入れることができる。これらは動物の種類、大きさ、年齢および全身状
態、動物の他の薬の存在および同様のものを含む。実際の投与量は、好適には他の動物実
験の結果を考慮した後に選択される。
で血清変換および抗体価を決定することである。ワクチン接種のタイミングおよび追加免
疫の数は、もしあれば、上述のいくつかが示すように、全ての関連要素の分析に基づく医
師または獣医によって決定されることが好適である。
は、ワクチン接種を受ける動物の体重など当業者により決定され得る要素を考慮に入れな
がら、周知の技術を使用して決定できる。例として、ワクチンは経口、非経口、皮内、皮
下、筋肉内、鼻腔内または静脈内で送達し得る。経口での送達は、例えば動物の飼料また
は飲物に組成を加えることを含み得る。ワクチン投与量に関係する要素は、例えばブタの
体重と年齢を含む。
またはウイルスベクターを含むワクチンを調製する方法、医薬的または獣医科的使用に許
容し得る担体で、本発明のPRRSウイルス、感染性RNA分子、プラスミド、またはウ
イルスベクターのうち1つの有効な量の合成を含む方法を提供する。
ることでPRRSウイルスゲノムに挿入される異種抗原性エピトープをコードするために
本発明の生減弱ワクチンを修飾できる。参照することによって全面的に組み込まれる米国
特許第7,132,106号もまた参照されたい。本発明のための異種抗原性エピトープ
として有益な抗原性エピトープは、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス、ブタロタ
ウイルス、ブタインフルエンザ、仮性狂犬病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸
器コロナウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、脳心筋炎ウイル
ス、ブタパラミクソウイルス、トルクテノウイルス、アクチノバチルス・プルロニューモ
ニア、アクチノバチルス・スイス、炭疽菌、気管支敗血症菌、クロストリジウム・ヘモリ
ティクム、ウェルシュ菌、破傷風菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、パラインフルエンザ菌、レプ
トスピラ属細菌、マイコプラズマヒオニューモニエ、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイ
コプラズマ・ヒオシノビエ、パスツレラ・マルトシダ、ブタコレラ菌、ネズミチフス菌、
ストレプトコッカス・エクイスミリスおよびブタ連鎖球菌から成る群から選択されるブタ
病原体からの抗原性エピトープを含むがこれに限られないPRRSウイルス以外のブタ病
原体からの抗原性エピトープを含む。前述のブタの病原体から抗原性エピトープをコード
するヌクレオチド系列は、当技術分野で周知であり、ワールド・ワイド・ウェブ上で(米
国)国立生物工学情報センターからのGenbankなどで、公共の遺伝子データベース
から取得できる。
らかになり、そのような全ての特徴が本発明の態様として意図される。同様に、本明細書
に記載された発明の特徴はまた、特徴の組み合わせが本発明の態様または実施例として明
確に上記言及されるかどうかにかかわらず、本発明の態様として意図する追加実施例と再
結合できる。また、本発明に重要である本明細書に記載されるそのような制限だけが、そ
のように見られるべきである。重要であることが本明細書で記述されていない制限の欠如
している本発明の変化は、本発明の態様として意図される。本発明が前述の説明および実
施例で具体的に記載されている方法とは別の方法で実施され得ることは明確である。
発明の範疇にある。
PRRSVの適応と減弱はP129をPK−9セルに分離する。
gnostic Laboratory of Purdue Universityで
、インディアナ州の病気のブタから分離された。このブタからの血清試料は、血清および
肺ホモジネートストックを膨張させる高い健康状態のブタで1回継代された。ウイルス性
RNAは、血清および肺ホモジネートから抽出され、P129継代0ウイルスの記載の完
全ゲノムコンセンサス配列を決定するために使用された。RNAは、最初に無作為の6量
体で刺激され、cDNAを統合するために使用された。ゲノムは、高忠実度(校正)PC
Rを使用することで3つの重なっている断片に増幅された。3回の別々のPCR反応(1
ゲノム分節あたりの)からのPCR生成物は、T/Aクローンであり、DNAの配列に全
長のゲノムコンセンサス配列を生成させる(配列番号1を参照)ために使用された。
初にブタの肺胞マクロファージ(PAM)細胞を感染させることにおいて使用された。P
AM感染(継代1)からの子孫ウイルスは、0.1マイクロメータのスポイトフィルタを
通してフィルターにかけられ、PK−9細胞を感染させることに使用された。
イシン耐性遺伝子の削除されたバージョンをコードするプラスミドで安定して核酸導入さ
せることによって引き出されたトランスジェニック細胞株である。構築の詳細およびPK
−9細胞株の特殊化は以前に記載した。
数の平行な系統を有するいくつかの試みを必要とした。感染は、複製ウェルの免疫蛍光に
よって、ウイルス性のヌクレオカプシドタンパク質(Rural Technologi
es Inc,Brookings South Dakota)に対して特定の、FI
TC抱合型モノクローナル抗体SDOW17を使用することで監視された。早期の継代は
、いくつかの小さい増殖巣をもたらしたが、新しい単分子層の感染を起こすことができる
のに十分な無細胞のウイルス粒子を生成しなかった。これらの継代は、Accutase
(トリプシン代用品)と共に感染した単分子層を扱い、新鮮培地とともに複数のウェルに
ある細胞を再び蒔くことによって、非感染PK−9細胞の添加のあるなしにかかわらず、
実現された。そのようないくつかの継代の後、いくつかの系統は、蛍光増殖巣の頻度と大
きさの明確な増加を示した。これらのいくつかは無細胞のウイルス流体を使用して継代さ
れる能力を取得した。継代17(PAM細胞上の1、PK−9上の16)によって、以前
の継代から無細胞流体の希釈を使用することで1つの系統が確実に維持され、数日以内で
全体の単分子層の感染をもたらした。ウイルスはいかなる継代レベルでもPK−9細胞へ
の細胞変性効果を引き起こさなかった。RNAは、感染したPK−9細胞からウイルス継
代17で抽出され、感染性cDNAクローンを構成するために使用された。
P129−PK継代17の感染性cDNAクローンの構築
ンプラスミドを使用して構築された。ウイルスのゲノムは、重複領域の独特な制限エンド
ヌクレアーゼ部位が自然に発生していた状態で、3つの重なる分節で逆転写およびPCR
によって増幅された。3回の別々のPCR反応からの生成物は、各ゲノム分節のためにコ
ンセンサス配列を発生させるようにクローンを作られ、配列され、並べられた。所与のセ
グメントの3個のクローン化された生成物のいずれもその分節に関する予測されたコンセ
ンサスのアミノ酸配列に一致しなかった場合、予測されたコンセンサスのアミノ酸配列が
一致するまで、クローンの1つはサブクローニングおよび/または、部位特異的変異誘発
によって変更された。3つのゲノム分節およびプラスミドバックボーンは、標準のクロー
ン技術および制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することで接合された。PK−9セルの
中に核酸導入されると、pCMV−S−P129−PK17−FLに指定された、結果と
して生じる全長クローンは、感染した。この感染性cDNAクローンの配列は、配列番号
2において与えられる。ゲノムは本質的には標準の終端で構築されている継代17ウイル
スと同一であり、継代17のコンセンサス配列に関連するいかなる挿入または欠失も欠落
している。この感染性cDNAクローンのウイルスゲノムの中には設計された制限部位ま
たは他の目標とされた変化は存在しない。
129−PK17−FLのゲノム配列の間のヌクレオチドおよびアミノ酸差異は表6に個
別に記載されている。表6はゲノム位置による全てのヌクレオチド差異および結果として
起こるアミノ酸差異を含む。これら変異のサブセットはIFN抑制(継代0)からIFN
非抑制(継代17感染性cDNAクローンから得られた全てのウイルス)への表現型にお
ける変化の原因である。表7では、PRRSV翻訳領域(ORF)または非構造タンパク
質(nsp)によるヌクレオチド、アミノ酸、および非保存アミノ酸差異をまとめる。表
7の目的のために、アミノ酸の以下の群は保存されていると考えられていたそれらの中に
あり、[K,R]、[D,E]、[L,I,V,A]、および[S,T]である。
P129−PK継代17における欠失変異体
感染性cDNAクローンpCMV−S−P129−PK17−FLに設計された。
F7によってコードされる)のアミノ酸位置41〜47に位置する核局在配列(NLS)
であった。2種類の欠失が作成された。別のPRRSV感染性クローンの文脈の中でこれ
らの削除について前述された。アミノ酸残基41〜49の野生型配列は、PG...KN
である。また、「PG...KS」として知られている、変異体「d43/44」では、
リジン残基43および44は欠失され、アスパラギン残基49はセリンに変わる。また、
「PG−−S−KS」として知られている、変異体「d43/44/46」では、リジン
残基43、44および46は欠失され、アスパラギン残基49はセリンに変わる。これら
の欠失を取り入れる、pCMV−S−P129−PK17−FLから得られた感染性クロ
ーンは、それぞれpCMV−S−P129−PK17−d43/44およびpCMV−S
−P129−PK17−d43/44/46である。米国特許第7,544,362号を
参照。
した。別のPRRSV感染性クローンの文脈の中で131のアミノ酸(393のヌクレオ
チド)の欠失について前述された。この欠失を取り入れる、pCMV−S−P129−P
K17−FLから得られた感染性クローンは、pCMV−S−P129−PK17−ns
p2である。
−PK17−FLバックボーンの中で生成され、そしてこれらはpCMV−S−P129
−PK17−nsp2−d43/44およびpCMV−S−P129−PK17−nsp
2−d43/44/46に指定された。
PK−9細胞におけるウイルスの世代および成長
イルスを生成するためにPK−9細胞の中に核酸導入された。ウイルスは、リポフェクタ
ミン2000を使用して、これらの感染性クローンからPK−9細胞の中に環状プラスミ
ドの直接核酸導入により生成された。核酸導入に続いて、回復したウイルスはさらに力価
を増加し、毒性を減弱するために再度連続的にPK−9細胞で継代された。ストックは生
体外検査および生体内評価のためにワクチン候補として作成された。非変更のpCMV−
S−P129−PK17−FL感染性クローンから得られたP129−PK17−FLウ
イルスの症例では、ウイルスはブタからの合計52の継代に達するまで培養された。この
ウイルスの完全ゲノムは継代24(配列番号3)および52(配列番号6)で配列された
。
P129−PK継代17感染性CDNAクローンから得られたウイルスは、IFN−アルファ誘導を抑制する能力を減衰させる
S)および抗生物質(50μg/mlのゲンタマイシン、100UIペニシリンおよび1
00のμg/mlのストレプトマイシン)で補われた改変イーグル培地(MEM)で生育
された。ブタ肺胞マクロファージZMAC−1細胞は、10%のFBSで補われたRPM
I−1640で育てられた。TGEウイルス株Purdueは、改変イーグル培地の0.
01の多重度で、集密的なST細胞単分子層の感染によって調製された。ウイルス接種原
は1時間後に除去され、細胞は5%のCO2大気中37℃で2.5%のFBSで補われた
MEMで培養された。ウイルスは、80%の細胞変性効果が観察された後に、細胞単分子
層を冷凍し、解凍することによって、放出された。TGEウイルスストックは、15分間
、4℃で3,500rpmで遠心分離され、使用まで−80℃で貯蔵された。ウイルスス
トック(PK−9セルからの)は以下の通りであった。P129−PK−FLおよびP1
29−PK−dnsp2−d43/44/46は、継代8/25(感染性クローンから8
、ブタから25)に存在した。他の4つのウイルス(P129−PK−d43/44、P
129−PK−d43/44/46、P129−PK−dnsp2、およびP129−P
K−dnsp2−d43/44)は、継代21/38に存在した。様々なPRRSウイル
スの作用するストックは、商用ワクチンのIngelvac PRRS MLVおよびI
ngelvac PRRS ATPがメーカーの指示に応じて再編成されて、直接感染に
使用されたことを除いて、ZMAC−1細胞上で単一継代を作成することによって調製さ
れた。
フィコール・ハイパック1077(Sigma)勾配を通して密度遠心により隔離された
。ハンクス緩衝液で洗浄された後、細胞は、5%の牛胎児血清(Gibco)で補われる
L−グルタミン(Mediatech)、で中断した、100U/mlペニシリン、0.
1mg/mlのストレプトマイシン、1mMのピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ
酸(Mediatech)100U/mlのゲンタマイシンおよび250mMの2メルカ
プトエタノール(Sigma)を有するRPMI媒体で懸濁された。
zada−Nova、提出された)は実行され、これらの細胞(Summerfield
et al.,2003)によってCD4およびCD172の特徴的発現に基づいてい
た。簡潔に、新鮮なブタPBMCは0.5%のBSAを有するPBSで懸濁され、ブタC
D172(74−22−15、VMRD)を認識するmAbの最適量で標識化された。1
回の洗浄に続いて、次に、二次ヤギ反マウス抗体がPE(Southern Biote
ch)に抱合した状態、そして洗浄後FITCが反CD4(74−12−4、VMRD)
と標識化されている状態で培養された。PDCは反射セルソータ(iCyt)上で分類さ
れ、分類ゲートはCD4+/CD172low個体群に設定された。分類後、細胞の精製は再
解析によって確証された。全ての場合で、純度は>95%であった。
O2)、異なった刺激物質または偽刺激で刺激された。培養の後に、刺激細胞を覆う媒体
は、モノクローナル抗体が商業的に入手可能な状態で調製されたサンドイッチELISA
を使用し、(反ブタIFN−α mAb K9およびF17)IFN−αの存在のために
測定された。簡潔に、Immulon IIプレート(Dynatech Inc.)は
、4℃で一晩の培養、その後5%の牛胎児血清で補われるRPMI媒体でのブロッキング
によって、反ブタIFN−α mAb F17(PBL Laboratories)で
被覆された。1時間後、媒体が廃棄され、50マイクロリットルの脱離液が複製の測定ウ
ェルに加えられ、検査された。1時間の培養後に、測定ウェルは4回洗浄され、それから
ビオチン標識、反ブタIFN−α mAb K9(PBL Laboratories)
、HRP抱合型ストレプトアビジン(Zymed Laboratories)、および
TMB基質(KPL)で順番に培養された。光学密度はELISAプレートリーダーで決
定された。
アルファ誘導を抑制する能力を欠く。作用するウイルスストックはブタ肺胞マクロファー
ジ細胞株ZMAC−1を利用し、4つの異なったPRRS野生型ウイルス分離株(P34
12、P129、IND5、NADC20)の群から調製された。付加的なストックはま
た、PK−9、FK.D4またはマーク−145細胞の中で繰り返された継代によって細
胞培養で成長するように適合させられた最初の2つの野生型ウイルスの誘導体から調製さ
れた。4つの野生型分離株のうち3つ(P129、IND5、NADC20)はZMAC
−1細胞の中で容易にまた効率的に成長し、P3412野生型分離株は105TCID50
/mlだけの力価に達したのに対し、約107TCID50/mlの力価に達した。特に、
ZMAC−1細胞系で調製されたP129ウイルスのストックはウイルスが適合させられ
たPK−9またはMARC−145細胞で得られたものよりも10倍高い力価に達した。
これらのウイルスがPBMCによってIFN−α分泌を刺激する能力検査は、ただ1つを
例外として(P3412クローンCを隔離する)、IFN−αのわずか少量(<50pg
)が検査されたPRRSウイルスストックのいずれかに対するそれらの曝露に反応したこ
れらの細胞によって分泌されたことを明らかにした。ブタコロナウイルス、伝染性胃腸炎
ウイルス(TGEv)へのそれらの曝露の結果、同じ細胞によって生成されたIFN−α
(17,540pg)の豊富な分泌との比較によって無視できる。
活発にその生成を抑制する。PRRSVストックの抑制効果は、PRRSVの有無で、T
GEvへの曝露に反応してPBMCによって分泌されたIFN−αの量を測定することに
より、決定された。表2に示されているように、4つの野生型PRRSウイルス分離株全
てが検査され、細胞培養の全てが誘導体を適合させたのと同じように、TGEvへのPB
MCのIFN−α反応で強い抑制効果(>80%)を示した。全長P129−PK−FL
ウイルスおよびいくつかの遺伝子組み換えの欠失変異体を含む、感染性cDNAクローン
(pCMV−S−P129−PK17−FL)から誘導された、ウイルスストックの群の
分析が行われた。表3に示されているように、親の野生型分離株P129(継代1)の強
い抑制効果(95%)と比べると、P129−PK−FLウイルス、および全ての欠失変
異体は、PBMCでTGEvによるIFN−□誘導を抑制する著しく減衰した能力を示し
た。さらにこれらのウイルスのIFN−α表現型を評価するために、その後の実験はP1
29−PK−FLおよびP129−PK−d43/44ウイルス、親P129野生株、お
よび/またはBoehringer Ingelheim(Ingelvac PRRS
MLVおよびIngelvac PRRS ATP)によって生成された、2つの商業
的に入手可能に修飾生PRRSVワクチンの間の直接比較を実行することに焦点が向けら
れた。追加の低い継代参照分離株(NVSL−14)はまた検査された。表4に示されて
いるように、4つの独立した実験では、P129−PK−FLおよびP129−PK−d
43/44が親P129ウイルス、2つのIngelvac減弱株、または参考株よりか
なり少ないIFN−α抑制効果を示した。1つの例では、P129−PK−FLまたはP
129−PK−d43/44ウイルスへの共同感染はTGEvへのIFN−α反応の見か
けの増進をもたらした。
導体のインターフェロン−α抑制効果を示唆している。示されたPRRSウイルスストッ
クは、ZMAC−1細胞で生育され、これらの新たに生成したストックの力価がZMAC
−1細胞を使用することで決定した。TGEウイルスの有無で、示されたPRRSウイル
スストックに18時間曝露されたブタ末梢血単核細胞の培養上清における現在のIFN−
αの量は、ELISAによって決定された。*TGEvだけへの反応。
PK−9細胞で成長に適応したその遺伝子改変誘導体のインターフェロン−α抑制効果を
示している。TGEウイルスの有無で、示されたPRRSウイルスストック(PBMC)
に18時間曝露されたブタ末梢血単核細胞の培養上清における現在のIFN−αの量は、
ELISAによって決定された。na=該当なし:*TGEvだけへの反応。
P129−PK−FLおよびP129−PK−d43/44ウイルスの減衰するインター
フェロン−α抑制効果を示す。TGEウイルスの有無で、示されたPRRSウイルススト
ック(PBMC)に曝露されたブタ末梢血単核細胞の培養上清における現在のIFN−α
の量は、ELISAによって決定された。na=該当なし:*TGEvのみへの反応。
量は主としてPBMC個体群の0.3%未満を含む細胞のサブセットから誘導される。こ
の稀な、しかし、重要な細胞サブセットは形質細胞様樹状細胞(PDC)で構成され、樹
状細胞は特徴的な形質細胞様の形態学のためこの名前を受け入れた。さらにP129−P
K−FLおよびP129−PK−d43/44ウイルスのIFN−α表現型を調べるため
に、PBMCから>95%の純度で新たに分離しているPDCが利用されたことを除き、
一連の実験は上述したものと同様に行われた。図1に示されているように、この一連の実
験はP129−PK−FLおよびP129−PK−d43/44ウイルスがTGEVによ
るIFN−α誘導の無視できる抑制を引き起こすことを確証した。その上、1つの実験で
は、見かけの増強効果はP129−PK−FLおよびP129−PK−d43/44PR
RSウイルスに反応してPDCによってTGEV媒介IFN−α誘導で観察された。対照
的に、図1に示されているように、Ingelvac PRRS MLVウイルスはIF
N−α反応への強い抑制効果を示した。
3/44PRRSウイルス、ならびにpCMV−S−P129−PK17−FL感染性c
DNAクローンの他の誘導体が、感染したPBMCまたはPDC細胞の中でTGEVによ
るIFN−α誘導を抑制する大いに減衰した能力があることを明らかにする。これは、野
生型(低い継代)PRRSウイルスおよび2つの商業的に入手可能に修飾生ウイルスワク
チン(Ingelvac PRRS MLVおよびIngelvac PRRS ATP
)で観察されたIFN抑制効果と著しい対照をなしている。P129−PK−FLおよび
P129−PK−d43/44ウイルスがPDCのこの重要な機能で最小限に抑制的であ
るという観察は、これらの細胞がウイルス感染に対して先天免疫を媒介する際に果たす主
要な役割を与えられ、潜在的に有意である。
せられた臨床上有効な商用ワクチンのウイルスを供給するが、そのようなウイルスおよび
ワクチンは歴史的な「サルの細胞」培養技術に、いかなる点でも依存、または開発されな
いことも注意するべきである。特に米国特許第7,754,464号を参照のこと。
ワクチンの候補の安全性および有効性
−S−P129−PK17−FL感染性cDNAクローン、P129−PK−FL(継代
7/24)、P129−PK−d43/44(継代17/34)、およびP129−PK
−d43/44/46(継代17/34)から誘導された3つのウイルスが、幼若ブタ呼
吸器疾患モデルで評価された。これらのウイルスの起源は図8に示されており、実験計画
(投与群)は表5に記載されている。低い継代の毒性PRRSV分離株NADC20は、
7週齢(ワクチン接種の4週間後)に異種抗原投与のために使用された。対照投与群は偽
ワクチンおよび商用PRRSワクチンIngelvac MLVを含む。
るセンチネルであった。それらは別々に収容され、PRRSV抗原投与の前に剖検された
。NT2ブタは、各T02からT05のための投与群あたり合計2つの、ワクチン接種を
受けたブタの2つの檻の間の檻に別々に収容された接触対照であった。NT3ブタは、投
与群(T01からT05)あたり合計2つの、ワクチン接種を受けたブタの檻につき1頭
の収容された接触対照であった。NT3ブタだけが、T01群に割り当てられた。
ン)投与群と比較された。結果は図1に示されている。発熱を引き起したワクチンはなか
った。全ての群はワクチン接種後の観察期間を通して平均104℃未満であった。
が施されていないT01ブタは104℃以上の熱が持続することを示した。対照的に、3
種類のワクチンは抗原投与後の熱を著しく下げた。P129−PK−FLは熱を下げるの
に最も有効であった。
重は、試験の−1日目(ワクチン接種前)、10、24、27(抗原投与の前)日目およ
び、37日目に記録された。ワクチン接種が施されていないブタでは、毒性NADC20
ウイルスを有する抗原投与は10日の観察の期間中、体重増加をほぼ完全に排除した。ワ
クチンはこの効果を様々な程度で否定した。
れの割合は、図4に示されている。T01の偽ワクチン群は平均25.1%の肺病変併発
であった。ワクチンは肺病変を様々な程度で減衰させた。P129−PK−FLは肺病変
併発を1.1%まで減衰させ、最も有効であった。
とで評価された。3種類のワクチンはLASを減衰させた。P129−PK−FLは平均
LASを偽ワクチン接種を受けた群で1.63から0.14まで減衰させた。
。IDEXX ELISA S/Pの割合は試験の27と37日目に測定された。結果は
図6に示される。P129−PK−FLでのワクチン接種は抗PRRS抗体の最高水準を
誘導した。
果(TCID50/mL)を示す。P129−PK−FLは抗原投与後のウイルス血症を減
衰させるのに最も効果的であった。
内容は、参照することによって組み込まれ、本発明の趣旨および範囲内でさまざまな修正
および変形を包含することが理解される。したがって、本発明は以下の請求項によっての
み制限される。
感染性CDNAクローンPCMV−S−P129からの感染性CDNA CLONE PCMV−S−P129−PK17−FLの誘導
感染性CDNAクローンPCMV−S−P129−PK17−FLのデノボ合成
P129−PKC12−FLウイルスから成るワクチンは1日齢のブタにおける使用に安全であり、少なくとも26週間にわたり有効である。
偽ワクチンを接種された雌ブタおよび子ブタはワクチン接種の期間を通じPRRSV陰性を示し続けた。交絡疾患因子は検出されなかった。1日齢でワクチン接種を受けた子ブタにおける安全性を実証するために用いられた主要変数はワクチン接種後の臨床観察である。全ての子ブタの成功的ワクチン接種を確認するために血清学が用いられた。
および記録された。対照生成物(T01)を投与された100頭のブタ(子ブタ)のうち
、および検査生成物(T02)を投与された91頭の子ブタのうち、それぞれ15頭およ
び14頭のブタが標準でないと観察された(表11,この具体例内で数字が付けられてい
る通りに表を参照)。標準でないと観察された子ブタは、さらに異常全身状態および/ま
たは鬱状態を有すると特筆された。
性であったこと(S/P比率<0.4)および全ての偽ワクチンの対照が本試験のワクチ
ン接種段階の間血清学的に陰性を示し続けたということを確認した。ワクチン接種後、P
129−PKC12−FLワクチン群内の全てのブタが21または22日目までに血清学
的に陽性(S/P比率>0.4)を示した。
0日)で点数化され、それぞれの葉(左頭部、左中、左尾部、右頭部、右中、右尾部、お
よび付属物)の硬変の割合が、病変を観察された葉のパーセントとして点数化および記録
された。
129−PKC12−FLウイルスワクチン接種を受けた子ブタに比べ、著しく高かった
(P≦0001)(表13)。
、P129−PKC12−FLウイルスワクチン接種を受けた子ブタに比べ、著しく高か
った(P≦0001)(表14)。
、P129−PKC12−FLウイルスワクチン接種を受けた子ブタに比べ著しく高かっ
た(P≦0001)(表15)。
P129−PKC12−FLウイルスから成るワクチンは防御免疫の早期発現を供給する。
ワクチン接種段階の間、18頭のブタ(3週齢)の投与群は、それぞれ6頭ずつの檻の中の4つの別室に収容された。ブタ(子ブタ)は、偽ワクチン(2mL)、減弱P129−PKC12−FL継代57ウイルスワクチン(2mL投与中に3.62log10TCID50)、Ingelvac PRRS MLVワクチン、またはIngelvac PRRS ATPワクチンの、単一の筋肉内注射を、およそ3週齢(0日目)で製造者の指示に従い投与された。
3頭の檻に再収容され、各投与群からの動物の複数の檻が4つの部屋のそれぞれに収容さ
れた。抗原投与されたのは、約5週齢に対する毒性異種PRRS分離株NADC20であ
る(14日目)。抗原投与量は2.07log10TCID50/mL(2.67log10T
CID50/4mLの投与量)での4.0mL(鼻孔につき1.0mLプラス2.0mLの
筋肉内注射)のNADC20保存溶液に同等であった。
変の割合であった。偽ワクチン接種群と比較した場合に、有意差が全てのワクチン接種群
(P129−PKC12−FL、P=0.0177;IngelvacPRRS ATP
、P=0.0255;Ingelvac PRRS MLV、P=0.0137)の間に
おいて見出された。ワクチン接種群を互いに比較した場合、有意差は見出されなかった(
表16)。
次の生物学的材料(米国特許第6,500,662号も参照)は、10801 University Blvd.,Manassas,Virginia,20110−2209,USAにあるアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)に1998年11月19日に寄託され、次の受託番号が与えられた。
プラスミドpCMV−S−P129、受託番号203489
次の米国特許の完全な原文および開示は参照することにより全てが記載されると同様に本明細書に組み込まれる:米国特許第6,500,662号および米国特許第7,618,797号。
Claims (6)
- ブタをPRRSウイルスによる感染から保護するワクチンであって、(a)配列番号6のポリヌクレオチド分子、または、前記ポリヌクレオチド分子に、0.5MのNaHPO4、7%のSDS、1mMのEDTAの溶液における65℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションおよび0.1×SSC/0.1%SDSにおける68℃での洗浄を含む高い緊縮条件下でハイブリダイズするあらゆるポリヌクレオチド、にコードされる北米PRRSウイルス、(b)前記コードポリヌクレオチド分子、(c)プラスミド形態の前記ポリヌクレオチド分子、あるいは(d)前記ポリヌクレオチド分子を含むウイルスベクターを含み、PRRSウイルスがPRRSウイルス感染に対する効果的免疫保護反応を誘導することが可能であり、感染に対する免疫保護および家畜への使用に適切なキャリアを生成するのに効果的な量であり、前記ワクチンが、子ブタが1日齢の時の早期および安全なワクチン接種を供給し、前記ワクチンが最大6ヶ月の免疫期間を供給するワクチン。
- ワクチン接種の2週間後から開始する、免疫の発現が供給される、請求項1に記載のワクチン。
- PRRSウイルスの感染に対してブタにワクチン接種をする方法であって、生後約12時間から2週齢の間における前記ワクチンを投与することを含み、前記ワクチンは
(a)北米PRRSウイルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含む分離ポリヌクレオチド分子、
(b)北米PRRSウイルスをコードする感染性RNA分子、
(c)プラスミド形態の前記ポリヌクレオチド分子(a)、または
(d)感染性配列を含むウイルスベクターを含む、方法。 - 防御免疫がワクチン接種の約14日以内に生じる、請求項3に記載の方法。
- 防御免疫が、1日齢でのワクチン接種後15日目、7日齢でのワクチン接種後21日目、14日齢でのワクチン接種後約28日以内に生じる、請求項4に記載の方法。
- 供給された防御免疫の期間が最大6ヶ月である、請求項3に記載の方法。
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