JP6997574B2 - ブタ生殖および呼吸症候群(prrs)ウイルスに対する離乳前の効果的なワクチン接種 - Google Patents
ブタ生殖および呼吸症候群(prrs)ウイルスに対する離乳前の効果的なワクチン接種 Download PDFInfo
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Description
生減弱形態を用いたワクチン接種は不運にも非中和抗体の豊富な生成を誘導するのみである。この時間間隔の間、例えば、限られた量のインターフェロン(IFN)-γ(分泌細胞のみが生成される。したがって、PRRSVは本質的に、常に豊富な体液性(抗体に基づく)免疫、および、多様で限定的だが潜在的に防御的なTヘルパー(Th)1様のIFN-γ反応によって区別される、不均衡免疫反応を刺激すると考えられる。適応免疫の不均衡進行に最も関与していると思われるPRRSV感染の1つの特徴は、十分な自然免疫反応の欠如である。大抵、ウイルス感染細胞はI型インターフェロン「IFN」(IF
N-αおよびIFN-βを含む)を分泌し、隣接する細胞を感染から保護する。さらに、放出されたI型IFNは未感作T細胞のサブセットと相互作用し、ウイルス特有II型IFN(IFN-γ)分泌細胞への転換を促進する。対照的に、PRRSV露出に対するブタのIFN-α反応はほぼ実在しない。そのようなIFN-α生成の病原体による非効果的な刺激は、IFN-αがIFN-γ遺伝子発現を増加させるため、宿主の適応免疫反応の本質において大きな影響を有すると期待されるだろう。したがって、元のサイトカインは優性経路を制御し,適応免疫の発達、すなわちT細胞媒介IFN-γ反応および最大抗ウイルス免疫防御を促進する。
いて重要な役割を果たす樹状細胞の特別型によって生じるということが明らかになっている。具体的には、希少だが優れた樹状細胞の型であり自然IFN-α/β生成細胞としても知られる形質細胞様樹状細胞(PDC)は、未感作T細胞をIFN-γ分泌細胞に分化させる能力により、抗ウイルス免疫において重要な役割を果たす。希少ではあるが、PDCは非常に強力なIFN-α生成細胞であり、それぞれの細胞がウイルスへの反応において3~10pgのIFN-αを生成することが可能である。対照的に、単球は細胞単位で5から10倍少ないIFN-αを生成する。ブタPDCの表現型およびいくつかの生物学的特性が記載されている(Summerfield et al.,2003,Immunology110:440)。近年の研究は、PRRSVはブタPDCのIFN-α分泌を刺激しないとする(Calzada et al.,2010,Veterinary Immunology and Immunopathology135:20)ことが明らかにされている。
供給する。ある態様において、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、もしくは配列番号6、またはそれに少なくとも70%の同一性、好適にはそれに80%の同一性、さらに好適にはそれに85%,90%,95%,96%,97%,98%もしくは99%の同一性を有する配列を含む、本明細書に記載されているDNA配列を供給する。
EIV(配列番号42参照)、FNP(配列番号45参照)、およびPIL(配列番号48参照)、これらの同定した配列のあらゆる組み合わせ(2、3、4、から最大で17)を含む。
(a)以下の特定の配列における特定のアミノ酸のいずれか
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、
アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)および
アミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号48を参照)、これらの同定配列のあらゆる組み合わせ(2、3、4、最大で17)を含み、または、
(b)前記他の特定3残基アミノ酸配列が1つまたは2つの追加的なアミノ配列変更を示し得るがそれでも上記特定配列と一致すると見なされることを考慮し、上記の3残基配列に一致するあらゆる他の北米または中国PRRSウイルスの特定3残基ORF1aペプチド配列における前記特定下線単一アミノ酸を含む。発明の本実施形態の目的には、「一致」は関連配列が、Henikoff et al.Proc Natl.Acad.Sci.,USA,89,pp.10915-10919,1992に記載されるように、BLOSUMアルゴリズムを用いて最適に並べられ得ることを意味する。
変化(a)、
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、または変化(a)のあらゆるサブセット、
変化(b)、
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、または変化(b)のあらゆるサブセット、
変化(c)、
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、または変化(c)のあらゆるサブセット、ならびに
変化(d)、
アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)、
およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号20を参照)、またはそれらの変化(d)のあらゆるサブセット。
(1)アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
(2)アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
(3)アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
(4)アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)、
およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号48を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット
を含むアミノ酸配列を有する。
(a)配列番号6、
(b)少なくとも(a)のDNA配列と85%の同一性を有する配列であって、そこにおいてそのORF1aにコードされたタンパク質が以下、
群(b)(1)から
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
群(b)(2)から
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
群(b)(3)から
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに/または
群(b)(4)から
アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)、
およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号20を参照)、もしくはそれらのあらゆるサブセット、を含むアミノ酸配列を含む配列、ならびに
(c)0.5MのNaHPo4、7%のSDS、1mMのEDTAの溶液における65℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションおよび0.1SSC/0/1%SDSにおける68℃での洗浄を含む高い緊縮条件下で(a)または(b)のDNA配列の相補体にハイブリタイズするDNA配列。
(a)配列番号6のDNA配列、
(b)DNA配列で、(a)のDNA配列と少なくとも85%の同一性を有し、そのORF1aにコードされたタンパク質が以下のいずれか、および以下のいずれかの組み合わせを含むアミノ酸配列を有するDNA配列
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、
(アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)、
およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号20を参照)、または
(c)0.5MのNaHPo4、7%のSDS、1mMのEDTAの溶液における65℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションおよび0.1SSC/0/1%SDSにおける68℃での洗浄を含む高い緊縮条件下で(a)もしくは(b)のDNA配列の相補体にハイブリタイズするDNA配列。
表1は、感染性cDNAクローン、およびPK-9細胞への核酸導入によって誘導されたそれに対応するウイルスを示す。
表2は、野生型PRRSウイルスおよび細胞培養における成長に適応した誘導体のインターフェロン-α抑制効果を示す。
表3は、野生型PRRSウイルスP129およびCD163発現PK-9細胞における成長に適応した遺伝子操作されたその誘導体のインターフェロン-α抑制効果を示す。
表4は、野生型P129ウイルスおよびPRRSのIngelvacワクチンに比べ、低下したP129-PK-FLおよびP129-PK-d43/44ウイルスのインターフェロン-α抑制効果を示す。
表5は、ワクチンウイルスの安全性および有効性を評価するための試験の構想を示す。
表6は、遺伝子位置による、0継代P129と17継代P129-PK-FLとの間の全てのヌクレオチド差異および結果として得られるアミノ酸の差異を示す。
表7は、ウイルスタンパク質による、0継代P129と17継代P129-PK-FLとの間のヌクレオチドおよびアミノ酸の差異の集計を示す。
表8は、遺伝子位置による、感染性cDNAクローンpCMV-S-P129およびpCMV-S-P129-PK17-FLにおいて見つかったPRRSV遺伝子間の全てのヌクレオチドの差異および結果として得られるアミノ酸の差異を示す。
表9および10は、52代継代ウイルスの表現型(配列番号6)に貢献するアミノ酸変化を示す。
表11は、1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種後の臨床症状を有するブタの数を示す。
表12は、1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種後の血清平均力価を示す。
表13は、以前1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種を受けた7週齢のブタの抗原投与後の肺病変の割合を示す。
表14は、以前1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種を受けた18週齢のブタの抗原投与後の肺病変の割合を示す。
表15は、以前1日齢での修飾生PRRSVワクチンの接種を受けた26週齢のブタの抗原投与後の肺病変の割合を示す。
表16は、以前修飾生PRRSVワクチンの接種を受けた5週齢の子ブタの抗原投与後の肺病変の割合を示す。
配列番号1はP129-PK-FL継代17の完全ゲノムを供給する。
分子生物学および遺伝子組み換え技術の当業者が備えている技能の範囲内の慣習的な方法を用い、その多数が例示の目的で以下に記述される。そのような技術は文献において完全に説明される。例えばSambrook,et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatis et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);Animal
Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)を参照されたい。
Quebec LAF-exp91strain of PRRS(Mardassi,H.et al.,1995,Arch.Virol.140:1405-1418);およびNorth American PRRS virus isolate VR
2385(Meng,X.-J et al.,1994,J.Gen.Virol.75:1795-1801を参照)を意味するがこれに限られない。遺伝的特徴は、北米PRRSウイルス株と共有するゲノムヌクレオチド配列の類似性およびアミノ酸配列の類似性を意味する。中国RPPSウイルス株は一般的に北米株と約80~93%のヌクレオチド配列の類似性を表す。
重症度、生殖症状の重症度、または肺病変の数もしくは重症度等を含み得る。
くはプロリンに関連する3つの塩基性残基の連続的広がりである(Nakai&Kanehisa,1992;Rowland&Yoo,2003)。欧州PRRSV分離株LelystadのNLS-2は残基47~50に位置し、配列K..Kによって表される。
る65℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、ならびに0.2×SSC/0.1%SDSにおける42oCでの洗浄(Ausubel et al edit
ors,Protocols in Molecular Biology,Wiley
and Sons,1994,pp.6.0.3~6.4.10を参照)、または別の方法で下記に定義されるPRRSウイルスをコードする配列のハイブリダイゼーションをもたらす条件下で配列番号1の相補体にハイブリダイズする場合、第2のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は配列番号1(または他のあらゆる特定ポリヌクレオチド配列)と同族である。ハイブリダイゼーション条件の修正は、経験的に決定され得、またはプローブのグアノシン/シトシン(GC)塩基対合の長さおよび割合に基づき正確に計算され得る。ハイブリダイゼーション条件はSambrook,et al.,(Eds.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York(1989),pp.9.47~9.51に記載のように計算することができる。
る65oCでのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションおよび、0.1×SS
C/0.1%SDSにおける68oCでの洗浄、でハイブリダイズする場合、第2のヌク
レオチド配列は配列番号1(または本発明のあらゆる他の配列)と同族である(Ausebel et al.Current Protocols in Molecular
Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York,1989。
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照)による。
っても得られ得、または生体外で全てのウイルスゲノムを含む結紮した部分長cDNA断片を用いることによっても得られ得る。全ての場合において、転写RNAはcDNAに導入された全ての修飾を保有し、このように修飾されたウイルスの更なる継代に用いられ得る。
F7の欠失は位置43~48での1つ以上のアミノ酸の欠失を含み得るか、または位置43および44の一方もしくは両方でのアミノ酸の欠失を含み得る。例えば参照によって組み込まれる米国特許第7,544,362号の全開示を参照されたい。ORF7にコードされたPRRSVのヌクレオカプシドタンパク質は小さい塩基性タンパク質であり、リン酸化しており(Wootton,Rowland,and Yoo,2002)ホモ2量体を形成する(Wootton and Yoo,2003)。結晶構造が近年特定された(Doan and Dokland,2003)。Nタンパク質は感染細胞において複数の機能を有するように思われる。細胞質で起こる過程である、内部にゲノムRNAがパッケージされる球状のカプシド構造を形成する過程に加え、Nタンパク質の一部が核および特異的に感染細胞の核に輸送される。Nタンパク質のアミノ酸配列は2つの核局在化シグナル(NLS)、核小体局在化シグナル(NoLS)、および核輸出シグナル(NES)を含み、核および核小体への輸送ならびに核からの輸出をそれぞれ容易にする(Rowland et al.,1999;Rowland et al.,2003;Rowland and Yoo,2003)。核小体にある間、Nタンパク質は小型核小体RNA関連タンパク質フィブラリンと相互作用し、感染細胞におけるrRNA処理およびリボソーム生合成を制御しウイルス複製に助力し得る(Yoo et al.,2003)。この型のウイルス変異は、新型PRRSワクチンの考案に、単独または他の減弱変異との組み合わせのどちらにおいても価値あるものである。減弱されたPRRSウイルスの別の例においては、ORF1aへの修飾が用いられた。ORF1aの領域をコードする非構造タンパク質2超可変領域におけるアミノ酸616から752の間の抗原エピトープをコードするDNA配列の欠失が用いられた。参照することによって全面的に組み込まれる米国特許第7,618,797号を参照されたい。
下のウイルスに対する防御免疫と正相関を有することが以前に実証された。したがって、理論に限られないが、細胞媒介の免疫反応および非IFN-α抑制PRRSVによって誘発される防御免疫のレベルは野生型(IFN-α抑制)表現型を示すPRRSV分離株のそれよりも著しく高いと期待することは妥当である。
3/44ウイルスが生物学的に親低継代P129分離株、他の野生型PRRSウイルス、およびIngelvac PRRSワクチンの両者とは異なるということを示す。減衰IFN-α抑制表現型の潜在的含意は、表現型の変化の考えられる理由と同様に記載される。
本発明のアミノ酸修飾
アミノ酸配列IGHNAVMにおけるアミノ酸N(配列番号12)、
アミノ酸配列TVPDGNCにおけるアミノ酸D(配列番号15)、
アミノ酸配列CWWYLFDにおけるアミノ酸Y(配列番号18)、
アミノ酸配列HGVHGKYにおけるアミノ酸H(配列番号21)、
アミノ酸配列AAKVDQYにおけるアミノ酸V(配列番号24)、
アミノ酸配列PSATDTSにおけるアミノ酸T(配列番号27)
アミノ酸配列LNSLLSKにおけるアミノ酸L(配列番号30)
アミノ酸配列APMCQDEにおけるアミノ酸C(配列番号33)、
アミノ酸配列CAPTGMDにおけるアミノ酸T(配列番号36)、
アミノ酸配列PKVAKVSにおけるアミノ酸A(配列番号39)、
アミノ酸配列AGEIVGVにおけるアミノ酸I(配列番号42)、
アミノ酸配列ADFNPEKにおけるアミノ酸N(配列番号45)および
アミノ酸配列QTPILGRにおけるアミノ酸I(配列番号48)。
アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照)、
アミノ酸配列HNAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照)、
アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照)、
アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照)、
アミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照)、
アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照)、
アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照)、
アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照)、
アミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照)、
アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)、
アミノ酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)、
アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照)、
アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照)および
アミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号48を参照)。
追加を引き起こす進展の結果として、付加的な変化がそのような別の株に起きたとしても可能である。当業者に理解されるように、P129継代52で証明された好適なアミノ酸変化はしたがってまた、継代52の指定されたアミノ酸に対して直接5’または3’である総合的なアミノ酸配列における別の変化にもかかわらず、操作可能なままである。これは、比較アミノ酸変化が保守的であると考えられる場合において特にそうである。したがって、AMANVYD(配列番号9)およびその部分系列ANVに関して、例えば、その中のバリンをイソロイシン、もしくはロイシン、または任意の他の残基で置換されている場合、または残基が単に欠落している、もしくは追加残基が加えられた場合、別のPRRS株において、匹敵するモチーフを同定することは容易に可能なはずである。整列を同定し、ひいてはポリペプチド配列モチーフが、例えば、いわゆるBlosumテーブル(特定のレベルのパーセントの同一性に基づく)に対応するかどうか決定するための多数のコンピュータ・プログラムが存在する。S.Henikoff et al.“Amino
Acid Substitution matrices from protein
blocks”,Proc Natl Acad Sci,USA,89(22),pp.10915-10919,Nov 15, 1992を参照されたい。また、A.L.Lehninger et al.Principles of Biochemistry,2005,MacMillan and Company,4th editionも参照されたい。また、保守的なアミノ酸変化は5つの総合的な群への分類、スルフィドリル基(Cys)、芳香族(Phe、Tyr、およびTrp)、塩基性(Lys、Arg、His)、脂肪性(Val、Ileu、Leu、Met)、ならびに、親水性(Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、SerおよびThr)に基づいて認識される。したがって、指定された位置に隣接する1つ以上の他のアミノ酸が追加、削除または置換されているとしても、P129継代52に特定されたアミノ酸変化のいずれかを、適切および対応する位置にて組み込むために、ヌクレオチド配列をコードするあらゆる北米または中国PRRSを修飾することは、本発明の実施の範疇にある。
、中国または北米PRRSウイルス(および対応するコードするポリヌクレオチド)を含み、(表9)最終的なウイルス配列の中の全て、全ての総合的に同定された継代52アミノ酸変化のあらゆる特定の組、3つの組または別のより高い組み合わせをも含む。そのようなアミノ酸変化は、もちろん、当技術分野でよく知られている、部位特異的変異誘発、PCR、および他の技術でウイルスの対応するコードヌクレオチド配列を導入し得る。
内投与によって実行される。それぞれの検査構成あたり少なくとも3つの群があり、1つはP129抗原投与の群、1つは減弱している可能性があるウイルスでの抗原投与の検査群、および1つは厳密な対照群である。
非修飾親株感染群と比較した検査群(減弱した可能性のあるウイルス)の次のパラメータの少なくとも1つの著しい減少は、減弱の徴候である。
a)死産の頻度
b)妊娠112日またはそれより前での流産
c)ミイラ化した子ブタの数
d)元気がなく弱い子ブタの数
e)離乳前死亡率
さらに非修飾親株感染群と比較した検査群の次のパラメータの少なくとも1つの顕著な増加が好適である。
f)雌ブタ1頭につき離乳される子ブタの数
g)雌ブタ1頭につき生まれる、生きている健康な子ブタの数
代替では、呼吸器症状およびPRRSV感染症の他の症状は、減弱を確立するために調べられることができた。
であることが示され得る。それから、血液サンプルは約1週後に抗原投与を受けたブタか
ら引き出され、次いでウイルスを血液サンプルから分離する試みが実行される。減衰した量のウイルス(またはウイルスなし)の分離が、ワクチンが効果的であり得るという徴候である一方、大量のウイルスの分離は、ワクチンが効果的であり得ないという徴候である。
harmaceutical Science,18th ed.,1990,MackPublishingを参照されたい。
Sciences,Vol.45,M.Dekker,N.Yの“Biodegrad
able Polymers as Drug Delivery Systems”があり、参照することによって本明細書に組み込まれる。あるいは、または加えて、投与および有効性を向上させるためにウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターをマイクロカプセル化できる。抗原をマイクロカプセル化する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第3,137,631号、米国特許第3,959,457号、米国特許第4,205,060号、米国特許第4,606,940号、米国特許第4,744,933号、米国特許第5,132,117号および国際特許公開第WO95/28227号に記述された技術を含み、それらの全ては、参照することによって本明細書に組み込まれる。
100mg、より好適には約1~約10mg、さらに好適には、約10~約1mgの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明の感染性DNA分子の投与量は、好適には約0.1mg~約100mg、より好適には約1~約10mg、さらに好適には、約10~約1mgの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明のウイルスベクターの投与量は、好適には約101~約109pfu、より好適には約102~約108pfu、さらに好適には、約103~約107pfuの範囲である。適切な投与量サイズは、約0.5ml~約10ml、より好適には約1ml~約5mlの範囲である。
ニア、アクチノバチルス・スイス、炭疽菌、気管支敗血症菌、クロストリジウム・ヘモリティクム、ウェルシュ菌、破傷風菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、パラインフルエンザ菌、レプトスピラ属細菌、マイコプラズマヒオニューモニエ、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・ヒオシノビエ、パスツレラ・マルトシダ、ブタコレラ菌、ネズミチフス菌、ストレプトコッカス・エクイスミリスおよびブタ連鎖球菌から成る群から選択されるブタ病原体からの抗原性エピトープを含むがこれに限られないPRRSウイルス以外のブタ病原体からの抗原性エピトープを含む。前述のブタの病原体から抗原性エピトープをコードするヌクレオチド系列は、当技術分野で周知であり、ワールド・ワイド・ウェブ上で(米国)国立生物工学情報センターからのGenbankなどで、公共の遺伝子データベースから取得できる。
PRRSV分離株P129のPK-9細胞への適応と減弱
P129-PK継代17の感染性cDNAクローンの構築
P129-PK継代17における欠失変異体
PK-9細胞におけるウイルスの世代および成長
P129-PK継代17感染性CDNAクローンから得られたウイルスは、IFN-アルファ誘導を抑制する能力を減衰させる
01の多重度で、集密的なST細胞単分子層の感染によって調製された。ウイルス接種原は1時間後に除去され、細胞は5%のCO2大気中37℃で2.5%のFBSで補われた
MEMで培養された。ウイルスは、80%の細胞変性効果が観察された後に、細胞単分子層を冷凍し、解凍することによって、放出された。TGEウイルスストックは、15分間、4℃で3,500rpmで遠心分離され、使用まで-80℃で貯蔵された。ウイルスストック(PK-9セルからの)は以下の通りであった。P129-PK-FLおよびP129-PK-dnsp2-d43/44/46は、継代8/25(感染性クローンから8、ブタから25)に存在した。他の4つのウイルス(P129-PK-d43/44、P129-PK-d43/44/46、P129-PK-dnsp2、およびP129-PK-dnsp2-d43/44)は、継代21/38に存在した。様々なPRRSウイルスの作用するストックは、商用ワクチンのIngelvac PRRS MLVおよびIngelvac PRRS ATPがメーカーの指示に応じて再編成されて、直接感染に使用されたことを除いて、ZMAC-1細胞上で単一継代を作成することによって調製された。
et al.,2003)によってCD4およびCD172の特徴的発現に基づいていた。簡潔に、新鮮なブタPBMCは0.5%のBSAを有するPBSで懸濁され、ブタCD172(74-22-15、VMRD)を認識するmAbの最適量で標識化された。1回の洗浄に続いて、次に、二次ヤギ反マウス抗体がPE(Southern Biotech)に抱合した状態、そして洗浄後FITCが反CD4(74-12-4、VMRD)と標識化されている状態で培養された。PDCは反射セルソータ(iCyt)上で分類され、分類ゲートはCD4+/CD172low個体群に設定された。分類後、細胞の精製は再解析によって確証された。全ての場合で、純度は>95%であった。
は、モノクローナル抗体が商業的に入手可能な状態で調製されたサンドイッチELISAを使用し、(反ブタIFN-α mAb K9およびF17)IFN-αの存在のために測定された。簡潔に、Immulon IIプレート(Dynatech Inc.)は、4℃で一晩の培養、その後5%の牛胎児血清で補われるRPMI媒体でのブロッキングによって、反ブタIFN-α mAb F17(PBL Laboratories)で被覆された。1時間後、媒体が廃棄され、50マイクロリットルの脱離液が複製の測定ウェルに加えられ、検査された。1時間の培養後に、測定ウェルは4回洗浄され、それからビオチン標識、反ブタIFN-α mAb K9(PBL Laboratories)、HRP抱合型ストレプトアビジン(Zymed Laboratories)、およびTMB基質(KPL)で順番に培養された。光学密度はELISAプレートリーダーで決定された。
ジ細胞株ZMAC-1を利用し、4つの異なったPRRS野生型ウイルス分離株(P3412、P129、IND5、NADC20)の群から調製された。付加的なストックはまた、PK-9、FK.D4またはマーク-145細胞の中で繰り返された継代によって細胞培養で成長するように適合させられた最初の2つの野生型ウイルスの誘導体から調製された。4つの野生型分離株のうち3つ(P129、IND5、NADC20)はZMAC-1細胞の中で容易にまた効率的に成長し、P3412野生型分離株は105TCID50
/mlだけの力価に達したのに対し、約107TCID50/mlの力価に達した。特に、
ZMAC-1細胞系で調製されたP129ウイルスのストックはウイルスが適合させられたPK-9またはMARC-145細胞で得られたものよりも10倍高い力価に達した。これらのウイルスがPBMCによってIFN-α分泌を刺激する能力検査は、ただ1つを例外として(P3412クローンCを隔離する)、IFN-αのわずか少量(<50pg)が検査されたPRRSウイルスストックのいずれかに対するそれらの曝露に反応したこれらの細胞によって分泌されたことを明らかにした。ブタコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEv)へのそれらの曝露の結果、同じ細胞によって生成されたIFN-α(17,540pg)の豊富な分泌との比較によって無視できる。
MLVおよびIngelvac PRRS ATP)によって生成された、2つの商業的に入手可能に修飾生PRRSVワクチンの間の直接比較を実行することに焦点が向けられた。追加の低い継代参照分離株(NVSL-14)はまた検査された。表4に示されているように、4つの独立した実験では、P129-PK-FLおよびP129-PK-d43/44が親P129ウイルス、2つのIngelvac減弱株、または参考株よりかなり少ないIFN-α抑制効果を示した。1つの例では、P129-PK-FLまたはP129-PK-d43/44ウイルスへの共同感染はTGEvへのIFN-α反応の見かけの増進をもたらした。
ELISAによって決定された。na=該当なし:*TGEvだけへの反応。
ワクチンの候補の安全性および有効性
感染性CDNAクローンPCMV-S-P129からの感染性CDNA CLONE PCMV-S-P129-PK17-FLの誘導
ンは、当業者の1人によって部位特異的変異誘発の技術を使用して、前に記述のPRRSV感染性cDNAクローンpCMV-S-P129から容易に誘導することができる。PRRSV感染性cDNAクローンpCMV-S-P129は米国特許第6,500,662号に記載されており、受託番号203489の下にATCCにて寄託されている。このクローンにおけるPRRSVゲノムのDNA配列はまた、受託番号AF494042としてGenbank(NCBI)データベースで入手可能である。部位特異的変異誘発キットは多くの供給者から商業的に入手可能であり、大きなプラスミドの複数の部位で多数の同時ヌクレオチド変化の作成が可能である。そのようなキットは、Change-IT(商標)Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit(Affymetrix/USB)、QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies-Stratagene Products)、およびAMAP Multi Site-directed Mutagenesis Kit(MBL International)を含むが、これらに限られない。
感染性CDNAクローンPCMV-S-P129-PK17-FLのデノボ合成
数の業者からの商用サービスとして入手可能であり、GenScript、DNA2.0、およびBio Basic Inc.を含むが、これに限られない。合成のウイルスゲノムは、ゲノムに隣接する5’のPacIおよび3’のSpeI制限酵素部位を使用し、感染性クローンpCMV-S-P129のウイルスゲノムを取り替えることによって、方向的にpCMV-Sベクターにクローン化される。合成ゲノムを切断するために、24ヌクレオチド拡張(5’-GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-genome-3’,下線PacI部位を含む)が合成ゲノムの5’末端に組み込まれ、83ヌクレオチド拡張(5’-genome-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3’,下線SpeI部位を含む)が合成ゲノムの3’末端に組み込まれる。PacIおよびSpeIでプラスミドおよび合成ゲノムを切断した後に、当業者によく知られた標準のクローン技術を使用することで、適切な断片を精製し、DNA連結酵素を使用して接合し、スクリーニングおよび繁殖のために大腸菌に形質転換する。
P129-PKC12-FLウイルスから成るワクチンは1日齢のブタにおける使用に安全であり、少なくとも26週間にわたり有効である。
偽ワクチンを接種された雌ブタおよび子ブタはワクチン接種の期間を通じPRRSV陰性を示し続けた。交絡疾患因子は検出されなかった。1日齢でワクチン接種を受けた子ブタにおける安全性を実証するために用いられた主要変数はワクチン接種後の臨床観察である。全ての子ブタの成功的ワクチン接種を確認するために血清学が用いられた。
よび付属物)の硬変の割合が、病変を観察された葉のパーセントとして点数化および記録された。
るということを示す。1回の投与量は1日齢の子ブタを毒性異種PRRS抗原投与から少なくとも26週間にわたり保護する。
P129-PKC12-FLウイルスから成るワクチンは防御免疫の早期発現を供給する。
ワクチン接種段階の間、18頭のブタ(3週齢)の投与群は、それぞれ6頭ずつの檻の中の4つの別室に収容された。ブタ(子ブタ)は、偽ワクチン(2mL)、減弱P129-PKC12-FL継代57ウイルスワクチン(2mL投与中に3.62log10TCID50)、Ingelvac PRRS MLVワクチン、またはIngelvac PRRS ATPワクチンの、単一の筋肉内注射を、およそ3週齢(0日目)で製造者の指示に従い投与された。
次の生物学的材料(米国特許第6,500,662号も参照)は、10801 University Blvd.,Manassas,Virginia,20110-2209,USAにあるアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)に1998年11月19
日に寄託され、次の受託番号が与えられた。
プラスミドpCMV-S-P129、受託番号203489
次の米国特許の完全な原文および開示は参照することにより全てが記載されると同様に本明細書に組み込まれる:米国特許第6,500,662号および米国特許第7,618,797号。
Claims (6)
- 生後約12時間から2週齢の間におけるブタのワクチン接種に使用するための変異PRRSウイルスを製造する方法であって、ブタCD163受容体を発現する宿主細胞中でPRRSウイルスを培養すること、および該培養からウイルスを回収することを含み、
前記培養することは、ブタCD163受容体を組換え発現する哺乳類細胞株で毒性PRRSウイルスを複数回継代することで、PRRSウイルスを該細胞株上の生育に適応させ、毒性を減弱することを含む、方法。 - ワクチン接種時にブタが1日齢である、請求項1に記載の方法。
- ワクチン接種は、北米ブタ生殖および呼吸症候群(PRRS)ウイルスまたは中国ブタ生殖および呼吸症候群(PRRS)ウイルスの感染に対してブタにおける有効な免疫保護反応を誘発するためのものである、請求項1または2に記載の方法。
- 毒性PRRSウイルスが、PRRSウイルス分離株P129であり、宿主哺乳類細胞株が、ブタCD163受容体遺伝子で核酸導入されたブタ細胞である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 北米PRRSウイルスまたは中国PRRSウイルスの感染に対してブタにおける有効な免疫保護反応を誘発する方法であって、生後約12時間から2週齢の間に、変異した生のPRRSウイルスをブタの体内で発現させるワクチン組成物を用いて、ブタにワクチン接種することを含み、該PRRSウイルスはブタCD163受容体を発現する哺乳動物細胞中で弱毒化されたものであり、
前記ワクチン組成物は、感染に対して免疫防御を起こすのに有効な量の:
(a)配列番号6と85%~99%同一のポリヌクレオチド分子であって、そのORF1aにコードされたタンパク質が
(i)アミノ酸配列ANVにおけるアミノ酸N(配列番号9を参照);アミノ酸配列H
NAにおけるアミノ酸N(配列番号12を参照);アミノ酸配列PDGにおけるアミノ酸D(配列番号15を参照);アミノ酸配列WYLにおけるアミノ酸Y(配列番号18を参照);およびアミノ酸配列VHGにおけるアミノ酸H(配列番号21を参照);および
(ii)アミノ酸配列KVDにおけるアミノ酸V(配列番号24を参照);アミノ酸配列ATDにおけるアミノ酸T(配列番号27を参照);アミノ酸配列SLLにおけるアミノ酸L(配列番号30を参照);およびアミノ酸配列MCQにおけるアミノ酸C(配列番号33を参照);および
(iii)アミノ酸配列PTGにおけるアミノ酸T(配列番号36を参照)およびアミノ
酸配列VAKにおけるアミノ酸A(配列番号39を参照)の両方;および
(iv)アミノ酸配列EIVにおけるアミノ酸I(配列番号42を参照);アミノ酸配列FNPにおけるアミノ酸N(配列番号45を参照);およびアミノ酸配列PILにおけるアミノ酸I(配列番号48を参照)
を含むアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド分子;または
(b)前記のポリヌクレオチド分子(a)に対応するRNA配列;または
(c)前記のポリヌクレオチド分子(a)によってコードされる、変異した生のPRRSウイルス;または
(d)前記のポリヌクレオチド分子(a)を含むウイルスベクター;
および、家畜への使用に適切なキャリア
を含む、前記方法。 - ワクチン組成物が、2価PRRSV/マイコプラズマヒオニューモニエ(M.hyo)ワクチン、2価PRRSV/ブタサーコウイルス2型(PCV2)ワクチン、および3価PRRSV/M.hyo/PCV2ワクチンからなる群から選択される混合ワクチンである、請求項5に記載の方法。
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