KR101728202B1 - 북아메리카 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(prrs) 바이러스 및 이의 용도 - Google Patents

북아메리카 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(prrs) 바이러스 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전적으로 변경된 북아메리카 PRRS 바이러스를 코딩하는 감염성 RNA 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 및 이 분자 및 관련된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 다양한 성분들을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 유전적으로 변경된 바이러스 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신, 및 천연적으로 감염된 동물과 백신접종된 동물을 구별하는 진단 키트도 제공된다.

Description

북아메리카 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 및 이의 용도{NORTH AMERICAN PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME (PRRS) VIRUS AND USES THEREOF}
본 발명은 동물 건강의 분야에 속하고 양성 극성 RNA 바이러스, 신규 RNA 바이러스 및 이들의 변경된 생바이러스 형태의 감염성 cDNA 클론, 및 이러한 cDNA 클론을 사용하는 백신, 특히 돼지 백신의 구축에 관한 것이다.
돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)은 경산돈(sow) 및 미경산돈(gilt)에서의 유산, 사산 및 다른 생식기 문제뿐만 아니라 새끼 돼지에서의 호흡기 질환을 특징으로 한다. 병인 물질은 아테리비리대(Arteriviridae) 과 및 니도비랄레스(Nidovirales) 목의 구성원인 PRRS 바이러스(PRRSV)이다. 니도바이러스는 양성 극성 RNA의 단일 가닥으로 구성된 게놈을 갖는 외피보유 바이러스이다. 양성 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA는 유전정보의 저장 및 발현 둘다에서 이중 역할을 충족시킨다. 니도바이러스에서 어떠한 DNA도 복제 또는 전사에 관여하지 않는다. 비-구조 단백질은 니도바이러스의 게놈 RNA로부터 큰 폴리단백질로서 직접적으로 번역된 후 바이러스 프로테아제(protease)에 의해 분리된 기능성 단백질로 절단된다. 하위게놈 RNA들(sgRNA들)의 3'-공말단(coterminal) 네스티드 세트(nested set)는 상기 게놈으로부터 합성되고 구조 단백질의 번역을 위한 메신저 RNA로서 사용된다. 따라서, 니도바이러스 게놈 RNA의 재생성은 게놈 복제와 sgRNA 합성의 조합된 과정이다.
1980년대 후반, 상기 바이러스의 2종의 상이한 유전형들이 거의 동시에 출현하였다(북아메리카에서 1종 및 유럽에서 또 다른 1종). PRRS 바이러스는 현재 거의 모든 돼지 생산 국가에서 유행하고 있고 전세계적 돼지고기 산업에 영향을 미치는 가장 경제적으로 중요한 질환들 중 하나로서 간주된다. 또한, 고도 독성 유전형이 중국 및 주변 국가에서 단리되었고, 이러한 유전형은 일반적으로 북아메리카 유전형과 관련되어 있다.
PRRSV의 생물학을 이해하는 데 있어서 상당한 진보가 있음에도 불구하고, 상기 바이러스의 제어는 어려운 과제로 남아있다. 현지(field)에서 동물의 백신접종은 거의 비효과적인 것으로 입증되었다. PRRS는 통상적으로 면역화된 무리에서 재출현하고, 대부분의 농장 PRRSV 백신접종 캠페인은 궁극적으로 상기 질환을 제어하지 못한다.
이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 돼지를 야생형 PRRSV로 감염시키거나 돼지를 이 병원체의 약독화된 생바이러스 형태로 백신접종하는 것은 불운하게도 비-중화 항체의 풍부한 생성만을 이끌어낸다. 이 시간 간격 동안, 예를 들면, 단지 한정된 양의 인터페론(IFN)-γ 분비 세포가 발생된다. 따라서, PRRSV는 일관되게 풍부한 체액성(항체-기초) 면역, 및 변동가능하고 한정되지만 잠재적으로 보호성을 나타내는 T 헬퍼(Th) 1-유사 IFN-γ 반응에 의해 구별되는 불균형한 면역 반응을 본질적으로 자극하는 것으로 보인다. 후천성 면역의 불균형한 발달에 기여할 가능성이 가장 높은 PRRSV 감염의 한 특징은 적절한 선천성 면역 반응의 결여이다. 통상적으로, 바이러스에 의해 감염된 세포는 감염으로부터 인접 세포를 보호하는 I형 인터페론 "IFN"(IFN-α 및 IFN-β를 포함함)을 분비한다. 또한, 방출된 I형 IFN은 천연 T 세포의 부분집합과 상호작용하여 상기 세포가 바이러스 특이적 II형 IFN(IFN-γ) 분비 세포로 전환되는 것을 촉진한다. 대조적으로, PRRSV 노출에 대한 돼지의 IFN-α 반응은 거의 존재하지 않는다. 병원체에 의한 IFN-α 생성의 이러한 비효율적인 자극은 IFN-α가 IFN-γ 유전자 발현을 상향조절하기 때문에 숙주의 후천성 면역 반응의 성질에 유의한 영향을 미칠 것으로 예측된다. 따라서, 전자 사이토카인은 후천성 면역, 즉 T 세포에 의해 매개된 IFN-γ 반응 및 피크 항-바이러스 면역 방어의 발달을 촉진하는 주요 경로를 제어한다.
이와 관련하여, 바이러스 감염에서 선천성 면역과 후천성 면역 사이의 가능한 연결이 다량의 I형 인터페론을 생성하는 능력을 갖고 T 세포 기능의 분극화에 있어서 핵심적인 역할을 수행하는 특별한 유형의 수지상세포를 통해 일어난다는 것은 명백해졌다. 구체적으로, 드물지만 현저한 유형의 수지상세포인 플라스마사이토이드(plasmacytoid) 수지상세포(PDC)(천연 IFN-α/β 생성 세포로서도 공지되어 있음)는 천연 T 세포가 IFN-γ 분비 세포로 분화하는 것을 야기하는 그들의 능력을 통해 항-바이러스 면역에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다. PDC는 드물지만 IFN-α의 엄청나게 강력한 생성자이고, 이때 각각의 세포는 바이러스에 반응하여 3 pg 내지 10 pg의 IFN-α를 생성할 수 있다. 대조적으로, 단핵세포는 세포 당 기준으로 5배 내지 10배 더 적은 IFN-α를 생성한다. 돼지 PDC의 표현형 및 몇몇 생물학적 성질은 기재되었다(문헌[Summerfield et al., 2003, Immunology 110:440]). 최근 연구는 PRRSV가 IFN-α를 분비하도록 돼지 PDC를 자극하지 않는다는 것을 확인시켜 주었다(문헌[Calzada et al., 2010, Veterinary Immunology and Immunopathology 135:20]).
이 사실은, 백신접종시 외인적으로 첨가된 IFN-α가 PRRSV 특이적 IFN-γ 반응의 강도를 개선한다는 것이 발견되었다는 관찰결과와 함께(문헌[W.A. Meier et al., Vet. Immunol. Immunopath. 102, pp 299-314, 2004]), IFN-α가 이 바이러스에 의한 돼지의 감염 동안 수행하는 핵심적인 역할을 강조한다. 보호 면역의 발달에 대한 IFN-α의 명백한 핵심적인 역할이 주어진 한, IFN-α의 생성을 자극하고/하거나 억제하는 상이한 PRRS 바이러스 스톡(stock)의 능력을 측정하는 것은 중요하다. 따라서, PRRS로부터 보호하는 새로운 개선된 변경된 생백신에 대한 긴급한 필요성이 존재한다. 하기 기재된 바와 같이, 신규 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129-PK 등으로부터 유도된 바이러스가 야생형 P129 바이러스 또는 2종의 상업적으로 입수가능한 변경된 PRRS 생백신과 상이한 표현형을 갖는다는 것은 분명하다. 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 본 발명은 상기 바이러스에 대한 세포-기초 면역 반응을 용이하게 하는 백신을 제공하고 PRRS 백신의 새로운 효과적인 발생을 정의한다.
제1 실시양태에서, 본 발명은 백신으로서 돼지 동물에서 PRRS 바이러스에 대한 효과적인 면역보호 반응을 이끌어내도록 유전적으로 변경된 PRRS 바이러스를 코딩하는 감염성 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6을 포함하는 본원에 기재된 DNA 서열, 또는 이 서열에 대한 70% 이상의 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 및 적합한 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 전사할 수 있는 프로모터를 포함하는 플라스미드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원의 플라스미드의 북아메리카 또는 중국 PRRS 코딩 서열은 하나 이상의 검출가능한 이종 항원성 에피토프를 추가로 코딩한다. 본 발명은 본원에 기재된 플라스미드를 포함하는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하는 백신을 제공한다. 상기 백신은 감염성 RNA 분자에 의해 코딩된 북아메리카 또는 중국 PRRS 바이러스, 상기 감염성 RNA 분자 또는 플라스미드(이들 각각은 본원에 기재된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 코딩됨)를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 백신은 본원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 본원에 기재된 백신은 선택적으로 수의학적 사용을 위해 허용될 수 있는 백신 담체를 포함할 수 있다. 한 중요한 양태에서, 상기 백신은 야생형 P129 PRRS 바이러스(ATCC 203488 및 203489, 미국 특허 제6,500,662호 참조)에 비해 감소된 인터페론-α 억제 효과를 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PRRS 바이러스의 현지 균주에 의해 천연적으로 감염된 돼지 동물과 본원에 기재된 변경된 생백신으로 백신접종된 돼지 동물을 구별하는(소위 DIVA 시험) 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 특허청구범위의 백신을 동물에게 면역원적 보호량으로 투여하는 단계를 포함하는, PRRS 바이러스의 균주에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 실시양태 및 바람직한 실시양태는 단리된 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이때 ORF1a에 의해 코딩된 단백질은 하기 아미노산 서열들 중 임의의 아미노산 서열을 함유하는 단백질들로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 밑줄 표시된 잔기는 신규 잔기인 것으로 생각된다: AMANVYD(서열번호 9); IGHNAVM(서열번호 12); TVPDGNC(서열번호 15); CWWYLFD(서열번호 18); HGVHGKY(서열번호 21); AAKVDQY(서열번호 24); PSATDTS(서열번호 27); LNSLLSK(서열번호 30); APMCQDE(서열번호 33); CAPTGMD(서열번호 36); PKVAKVS(서열번호 39); AGEIVGV(서열번호 42); ADFNPEK(서열번호 45); 및 QTPILGR(서열번호 48). 본 발명의 추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 ORF1a로부터 코딩된 단백질 내에 상기 확인된 서열들 중 임의의 서열(이들 확인된 서열들의 임의의 조합물(2, 3, 4... 최대 17)을 포함함)을 함유하는 단리된 북아메리카 또는 중국 PRRS를 제공한다.
추가로, 본 발명은 단리된 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스를 제공하고, 이때 ORF1a에 의해 코딩된 이의 단백질은 하기 서열 중 어느 하나의 서열(이들 확인된 서열들의 임의의 조합물(2, 3, 4... 최대 17)을 포함함)을 함유하는 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된다: ANV(서열번호 9 참조); HNA(서열번호 12 참조); PDG(서열번호 15 참조); WYL(서열번호 18 참조); VHG(서열번호 21 참조); KVD(서열번호 24 참조); ATD(서열번호 27 참조); SLL(서열번호 30 참조); MCQ(서열번호 33 참조); PTG(서열번호 36 참조); VAK(서열번호 39 참조); EIV(서열번호 42 참조); FNP(서열번호 45 참조); 및 PIL(서열번호 48 참조).
추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 북아메리카 또는 중국 PRRS 바이러스를 제공하고, 이때 상기 바이러스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이로부터 코딩된 단백질 내의 임의의 점에서 임의의 다른 특정 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 위치의 동일성과 관계없이, ORF1a 바이러스 단백질은
(a) 하기 특정된 서열(이들 확인된 서열들의 임의의 조합물(2, 3, 4... 최대 17)을 포함함) 내의 특정 아미노산들 중 임의의 아미노산을 함유하거나:
아미노산 서열 ANV(서열번호 9 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 HNA(서열번호 12 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 PDG(서열번호 15 참조) 내의 아미노산 D,
아미노산 서열 WYL(서열번호 18 참조) 내의 아미노산 Y,
아미노산 서열 VHG(서열번호 21 참조) 내의 아미노산 H,
아미노산 서열 KVD(서열번호 24 참조) 내의 아미노산 V,
아미노산 서열 ATD(서열번호 27 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 SLL(서열번호 30 참조) 내의 아미노산 L,
아미노산 서열 MCQ(서열번호 33 참조) 내의 아미노산 C,
아미노산 서열 PTG(서열번호 36 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 VAK(서열번호 39 참조) 내의 아미노산 A,
아미노산 서열 EIV(서열번호 42 참조) 내의 아미노산 I,
아미노산 서열 FNP(서열번호 45 참조) 내의 아미노산 N, 및
아미노산 서열 PIL(서열번호 48 참조) 내의 아미노산 I; 또는
(b) 상기 특정된 3-잔기 서열들에 상응하는 임의의 다른 북아메리카 또는 중국 PRRS 바이러스의 특정된 3-잔기 ORF1a 펩티드 서열 내에 상기 특정 밑줄 표시된 단일 아미노산을 함유한다(상기 다른 특정 3-잔기 아미노산 서열이 1개 또는 2개의 추가 아미노산 서열 변화를 보일 수 있으나 여전히 상기 특정된 서열에 상응하는 것으로서 인정될 수 있다는 것을 고려함). 본 발명의 이 실시양태의 목적을 위해, "상응하는"은 상대적 서열들을 문헌[Henikoff et al. Proc Natl. Acad. Sci., USA, 89, pp. 10915-10919, 1992]에 기재된 BLOSUM 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 추가 바람직한 실시양태에서, 단리된 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스가 제공되고, 이때 ORF1a에 의해 코딩된 이의 단백질은 하기 변이 (a), (b), (c) 및 (d) 중 하나 이상을 함유하는 아미노산 서열을 갖고, 이때 각각의 상기 변이는 다음과 같이 정의된다:
변이 (a)
아미노산 서열 ANV(서열번호 9 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 HNA(서열번호 12 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 PDG(서열번호 15 참조) 내의 아미노산 D,
아미노산 서열 WYL(서열번호 18 참조) 내의 아미노산 Y,
아미노산 서열 VHG(서열번호 21 참조) 내의 아미노산 H, 또는
변이 (a)의 임의의 부분집합;
변이 (b)
아미노산 서열 KVD(서열번호 24 참조) 내의 아미노산 V,
아미노산 서열 ATD(서열번호 27 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 SLL(서열번호 30 참조) 내의 아미노산 L,
아미노산 서열 MCQ(서열번호 33 참조) 내의 아미노산 C, 또는
변이 (b)의 임의의 부분집합;
변이 (c)
아미노산 서열 PTG(서열번호 36 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 VAK(서열번호 39 참조) 내의 아미노산 A, 또는
변이 (c)의 임의의 부분집합; 및
변이 (d)
아미노산 서열 EIV(서열번호 42 참조) 내의 아미노산 I,
아미노산 서열 FNP(서열번호 45 참조) 내의 아미노산 N, 및
아미노산 서열 PIL(서열번호 20 참조) 내의 아미노산 I, 또는
변이 (d)의 임의의 부분집합.
이러한 PRRS 바이러스는 변이 (a)에서 확인된 5개의 아미노산 서열들 중 2개 이상의 아미노산 서열들, 및/또는 변이 (b)에서 확인된 4개의 아미노산 서열들 중 2개 이상의 아미노산 서열들, 및/또는 변이 (c)에서 확인된 2개의 아미노산 서열들, 및/또는 변이 (d)에서 확인된 3개의 아미노산 서열들 중 2개 이상의 아미노산 서열들을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 적합한 숙주 세포를 직접적으로 형질감염시킬 수 있고 이로써 형질감염된 적합한 숙주 세포로부터 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스를 발현할 수 있는 플라스미드로서, (a) PRRS 바이러스를 코딩하는 감염성 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열, 및 (b) 상기 감염성 RNA 분자를 전사할 수 있는 프로모터를 포함하는 플라스미드를 제공하고, 이때 상기 바이러스의 ORF1a에 의해 코딩된 단백질은
(1) 아미노산 서열 ANV(서열번호 9 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 HNA(서열번호 12 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 PDG(서열번호 15 참조) 내의 아미노산 D,
아미노산 서열 WYL(서열번호 18 참조) 내의 아미노산 Y,
아미노산 서열 VHG(서열번호 21 참조) 내의 아미노산 H, 또는
이들의 임의의 부분집합;
(2) 아미노산 서열 KVD(서열번호 24 참조) 내의 아미노산 V,
아미노산 서열 ATD(서열번호 27 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 SLL(서열번호 30 참조) 내의 아미노산 L,
아미노산 서열 MCQ(서열번호 33 참조) 내의 아미노산 C, 또는
이들의 임의의 부분집합;
(3) 아미노산 서열 PTG(서열번호 36 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 VAK(서열번호 39 참조) 내의 아미노산 A, 또는
이들의 임의의 부분집합; 및/또는
(4) 아미노산 서열 EIV(서열번호 42 참조) 내의 아미노산 I,
아미노산 서열 FNP(서열번호 45 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 PIL(서열번호 48 참조) 내의 아미노산 I, 또는
이들의 임의의 부분집합
을 함유하는 아미노산 서열을 갖는다.
ORF1a는 프로테아제 기능을 포함하는 폴리단백질을 코딩하고 ORF1b는 레플리카제(replicase)(RNA 중합효소) 및 헬리카제(helicase) 기능을 포함하는 폴리단백질을 코딩한다는 것이 인식될 것이다. PRRS의 다양한 ORF들(개방 판독 프레임)로부터 코딩된 단백질들에 대한 기능에 관한 추가 정보는 예를 들면, 미국 특허 제7,132,106호에서 발견될 수 있다. 또한, ORF7 및 다른 개방 판독 프레임의 기능에 관해서는 미국 특허 제7,544,362호를 참조한다. 당분야에서 인식될 바와 같이, ORF1에 의해 코딩된 단백질들은 공지된 추가 기능 및 비공지된 추가 기능을 가질 것으로 예측되고, 본 발명의 실시에 있어서 유용한 신규 아미노산 변화는 ORF1에 의해 코딩된 단백질들의 어느 한 특정 기능에 대한 그들의 효과를 통해 한정되지 않는다.
추가 바람직한 실시양태에서, 상기 플라스미드는 표적화된 진핵 세포에서 DNA 론치(launch)를 허용할 수 있는 진핵 프로모터, 또는 상기 플라스미드의 시험관내 전사를 유도할 수 있는 원핵 또는 파지 프로모터인 프로모터를 함유한다. 유사하게, 본 발명은 적합한 숙주 세포를 적절한 플라스미드로 형질감염시키는 단계 및 형질감염된 세포에 의해 발생된 PRRS 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는, PRRS 바이러스를 발생시키는 방법을 제공한다.
따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 북아메리카 PRRS 바이러스를 코딩하는 감염성 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하고, 이때 상기 DNA 서열은 하기 (a) 내지 (c)로 구성된 군으로부터 선택된다:
(a) 서열번호 6;
(b) 상기 (a)의 DNA 서열에 대한 85% 이상의 동일성을 갖는 서열로서, 이의 ORF1a에 의해 코딩된 단백질이 하기 군 (b)(1), 군 (b)(2), 군 (b)(3) 및/또는 군 (b)(4)의 서열을 함유하는 아미노산 서열을 갖는, 서열:
군 (b)(1) 아미노산 서열 ANV(서열번호 9 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 HNA(서열번호 12 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 PDG(서열번호 15 참조) 내의 아미노산 D,
아미노산 서열 WYL(서열번호 18 참조) 내의 아미노산 Y,
아미노산 서열 VHG(서열번호 21 참조) 내의 아미노산 H, 또는
이들의 임의의 부분집합;
군 (b)(2) 아미노산 서열 KVD(서열번호 24 참조) 내의 아미노산 V,
아미노산 서열 ATD(서열번호 27 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 SLL(서열번호 30 참조) 내의 아미노산 L,
아미노산 서열 MCQ(서열번호 33 참조) 내의 아미노산 C, 또는
이들의 임의의 부분집합;
군 (b)(3) 아미노산 서열 PTG(서열번호 36 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 VAK(서열번호 39 참조) 내의 아미노산 A, 또는
이들의 임의의 부분집합; 및/또는
군 (b)(4) 아미노산 서열 EIV(서열번호 42 참조) 내의 아미노산 I,
아미노산 서열 FNP(서열번호 45 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 PIL(서열번호 48 참조) 내의 아미노산 I, 또는
이들의 임의의 부분집합; 및
(c) 65℃에서 0.5 M NaHPO4, 7% SDS 및 1 mM EDTA에서 필터 결합된 DNA와 혼성화하고 68℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS에서 세척하는 것을 포함하는 매우 엄격한 조건 하에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA 서열의 상보체와 혼성화하는 DNA 서열.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 분자로 형질감염된 숙주 세포를 제공하고, (a) 이러한 상기 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 코딩된 유전적으로 변경된 북아메리카 PRRS 바이러스, (b) 상기 감염성 분자, (c) 플라스미드 형태의 상기 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 (d) 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 바이러스 벡터, 및 수의학적 사용에 적합한 담체를 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하는 백신을 제공하고, 이때 상기 PRRS 바이러스는 감염에 대한 면역보호를 생성하기에 효과적인 양으로 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대한 효과적인 면역보호 반응을 이끌어낼 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 (a), (b) 또는 (c)에 상응하는 RNA 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다:
(a) 서열번호 6의 DNA 서열;
(b) 상기 (a)의 DNA 서열에 대한 85% 이상의 동일성을 갖는 DNA 서열로서, 이의 ORF1a에 의해 코딩된 단백질이 하기 서열 중 어느 하나의 서열, 또는 하기 서열 중 어느 하나의 서열의 임의의 조합물을 함유하는 아미노산 서열을 갖는, DNA 서열:
아미노산 서열 ANV(서열번호 9 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 HNA(서열번호 12 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 PDG(서열번호 15 참조) 내의 아미노산 D,
아미노산 서열 WYL(서열번호 18 참조) 내의 아미노산 Y,
아미노산 서열 VHG(서열번호 21 참조) 내의 아미노산 H,
아미노산 서열 KVD(서열번호 24 참조) 내의 아미노산 V,
아미노산 서열 ATD(서열번호 27 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 SLL(서열번호 30 참조) 내의 아미노산 L,
아미노산 서열 MCQ(서열번호 33 참조) 내의 아미노산 C,
아미노산 서열 PTG(서열번호 36 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 VAK(서열번호 39 참조) 내의 아미노산 A,
아미노산 서열 EIV(서열번호 42 참조) 내의 아미노산 I,
아미노산 서열 FNP(서열번호 45 참조) 내의 아미노산 N, 및
아미노산 서열 PIL(서열번호 20 참조) 내의 아미노산 I; 또는
(c) 65℃에서 0.5 M NaHPO4, 7% SDS 및 1 mM EDTA에서 필터 결합된 DNA와 혼성화하고 68℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS에서 세척하는 것을 포함하는 매우 엄격한 조건 하에 상기 (a) 또는 (b)의 DNA 서열의 상보체와 혼성화하는 DNA 서열.
따라서, 본 발명은 PRRS 바이러스의 현지 균주에 의해 천연적으로 감염된 돼지 동물과 본 발명의 백신으로 백신접종된 돼지 동물을 구별하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 진단 키트도 제공하고, 이때 상기 백신(바이러스)은 바람직하게는 야생형 P129 PRRS 바이러스(서열번호 5)에 비해 감소된 인터페론-α 억제 효과를 나타낸다.
도 1은 백신접종 후 직장 온도를 보여준다.
도 2는 독성 PRRSV NADC20에 의한 챌린지(challenge) 후 직장 온도를 보여준다.
도 3은 백신접종 후 및 챌린지 후 체중을 보여준다.
도 4는 PRRS 병소를 갖는 폐의 백분율에 대한 챌린지 후 데이터를 보여준다.
도 5는 관찰된 병소의 중증도에 대한 챌린지 후 폐 평가 점수(LAS)를 보여준다.
도 6은 백신접종 후 및 챌린지 후 혈청 중의 항-PRRSV 항체 수준(ELISA S/P 비)을 보여주는 막대그래프이다.
도 7은 혈청 중의 챌린지 후 바이러스 존재량(load)(PAM 세포에 대한 log TCID50/ml)을 그래프로 표시한 것이다.
도 8은 본원에 개시된 바와 같이 서열번호 1 내지 서열번호 6을 포함하는 백신을 수득하기 위해 이용된 방법을 그림으로 표시한 것이다.
표의 간단한 설명
표 1은 감염성 cDNA 클론, 및 PK-9 세포 내로의 형질감염에 의해 유도된 상응하는 바이러스를 보여준다.
표 2는 야생형 PRRS 바이러스 및 세포 배양물에서 증식하도록 적응된 유도체의 인터페론-α 억제 효과를 보여준다.
표 3은 야생형 PRRS 바이러스 P129, 및 CD163 발현 PK-9 세포에서 증식하도록 적응된 이의 유전적으로 조작된 유도체의 인터페론-α 억제 효과를 보여준다.
표 4는 야생형 P129 바이러스 및 PRRS 인겔백 백신에 비해 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스의 감소된 인터페론-α 억제 효과를 보여준다.
표 5는 백신 바이러스의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 수행된 연구의 디자인을 보여준다.
표 6은 P129 계대감염 0과 P129-PK-FL 계대감염 17 사이의 모든 뉴클레오티드 차이 및 발생된 아미노산 차이를 게놈 위치별로 보여준다.
표 7은 P129 계대감염 0과 P129-PK-FL 계대감염 17 사이의 뉴클레오티드 및 아미노산 차이의 요약을 바이러스 단백질별로 보여준다.
표 8은 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129에서 발견된 PRRSV 게놈과 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL에서 발견된 PRRSV 게놈 사이의 모든 뉴클레오티드 차이 및 발생된 아미노산 차이를 게놈 위치별로 보여준다.
표 9 및 10은 계대감염 52 바이러스(서열번호 6)의 표현형에 기여하는 아미노산 변화를 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 P129-PK-FL 계대감염 17 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 2는 P129-PK-d43/44 계대감염 17 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 3은 P129-PK-FL 계대감염 24 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 4는 P129-PK-d43/44 계대감염 34 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 5는 P129 계대감염 0 완전 게놈을 제공한다.
서열번호 6은 P129 계대감염 52 완전 게놈을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형은 복수형 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "방법"에 대한 언급은 본 개시내용 등을 읽었을 때 당분야에서 숙련된 자에게 자명해질, 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 지금부터 기재된다.
구체적으로 상반되게 기재되어 있지 않은 한, 본 발명의 실시는 바이러스학, 면역학, 미생물학 및 분자생물학의 통상적인 방법들 및 당분야의 기술 내의 재조합 DNA 기법을 이용할 것이고, 이들 중 대다수는 예시 목적으로 후술되어 있다. 이러한 기법들은 문헌에서 전체적으로 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]을 참조한다.
"북아메리카 PRRS 바이러스"는 북아메리카 PRRS 바이러스 단리물, 예컨대, 약 1990년대 초반 미국에서 최초로 단리된 PRRS 바이러스(예를 들면, 문헌[Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126] 참조); 북아메리카 PRRS 바이러스 단리물 MN-1b(문헌[Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293-296]); PRRS의 퀘벡 LAF-exp91 균주(문헌[Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418]); 및 북아메리카 PRRS 바이러스 단리물 VR 2385(문헌[Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801])(그러나, 이들로 한정되지 않음)와 관련된 유전적 특징을 갖는 임의의 PRRS 바이러스를 의미한다. 유전적 특징은 북아메리카 PRRS 바이러스 균주에 의해 공유된 게놈 뉴클레오티드 서열 유사성 및 아미노산 서열 유사성을 의미한다. 중국 PRRS 바이러스 균주는 일반적으로 북아메리카 균주에 대해 약 80% 내지 93%의 뉴클레오티드 서열 유사성을 나타낸다.
"유럽 PRRS 바이러스"는 약 1991년에 유럽에서 최초로 단리된 PRRS 바이러스(예를 들면, 문헌[Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130] 참조)와 관련된 유전적 특징을 갖는 PRRS 바이러스의 임의의 균주를 의미한다. "유럽 PRRS 바이러스"는 당분야에서 종종 "렐리스타트(Lelystad) 바이러스"로서도 지칭된다.
본 발명의 목적을 위해, "효과적인 면역보호 반응", "면역보호" 등은 백신접종된 동물에서 병원체에 의한 감염으로부터 보호하기 위해 상기 병원체의 하나 이상의 항원성 에피토프에 대해 유도된 면역 반응을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 병원체에 의한 감염으로부터의 보호는 감염의 절대적 예방뿐만 아니라, 백신접종되지 않은 감염된 동물에 비해 백신접종된 동물에서 병원체에 의한 감염의 정도 또는 속도의 임의의 검출가능한 감소, 또는 상기 병원체에 의한 감염으로부터 발생된 질환 또는 임의의 증상 또는 병태의 중증도의 임의의 검출가능한 감소도 포함한다. 효과적인 면역보호 반응은 병원체에 의해 이전에 감염되지 않았고/않았거나 백신접종시 병원체에 의해 감염되지 않은 동물에서 유도될 수 있다. 효과적인 면역보호 반응은 백신접종시 병원체에 의해 이미 감염된 동물에서도 유도될 수 있다.
유전적으로 변경된 PRRS 바이러스는 그의 비-변경된 모 균주보다 낮은 독성을 나타내는 경우 "약독화"되어 있다. 균주는 질환 중증도를 결정하는 하나 이상의 파라미터의 통계학적으로 유의한 감소를 보이는 경우 "낮은 독성"을 나타낸다. 이러한 파라미터는 바이러스혈증, 발열, 호흡 곤란의 중증도, 생식기 증상의 중증도, 또는 폐 병소의 수 또는 중증도 등의 수준을 포함할 수 있다.
"PRRS 바이러스 복제를 뒷받침할 수 있는 숙주 세포"는 본 발명의 바이러스에 의해 감염되었을 때 감염성 PRRS를 발생시킬 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 세포는 단핵세포/대식세포 계통의 돼지 세포, 예컨대, 돼지 폐포 대식세포 및 유도체, MA-104 원숭이 신장 세포 및 유도체, 예컨대, MARC-145 세포, 및 PRRS 바이러스에 대한 수용체로 형질감염된 세포를 포함한다. 용어 "PRRS 바이러스 복제를 뒷받침할 수 있는 숙주 세포"는 살아있는 돼지 내의 세포도 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "개방 판독 프레임" 또는 "ORF"는 특정 PRRS 바이러스 단백질을 코딩하는 데에 필요한, 개재 정지 코돈을 갖지 않는 최소 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"돼지" 및 "돈(豚)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 수이대(Suidae) 과의 구성원인 임의의 동물, 예컨대, 어린 돼지를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되어 있지 않은 한, 용어 "PRRS 바이러스"는 북아메리카 또는 유럽 PRRS 바이러스의 임의의 균주를 의미한다.
"PRRS"는 PRRS 바이러스 감염에 의해 야기된 돼지의 질환 증상을 포괄한다. 이러한 증상의 예에는 발열, 임신한 암컷의 유산, 호흡 곤란, 폐 병소, 식욕 상실, 및 어린 돼지의 사망이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "PRRS를 생성할 수 없는" PRRS 바이러스는 돼지를 감염시킬 수 있으나 돼지에서 PRRS 감염과 정상적으로 관련된 임의의 질환 증상을 발생시키지 않는 바이러스를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, PRRSV "N 단백질" 또는 "ORF7"은 PRRS 바이러스의 유럽 유전형 및 북아메리카 유전형 둘다의 ORF7에 의해 코딩된 폴리펩티드로서 정의된다. 현재 공지되어 있는 N 단백질의 구체적인 동종형(isotype)의 예는 수탁번호 PRU87392로 진뱅크(Genbank)에 보고된 북아메리카 PRRS 원형 단리물 VR2322의 123개 아미노산 폴리펩티드, 및 수탁번호 A26843으로 진뱅크에 보고된 유럽 원형 PRRS 단리물 렐리스타트의 128개 잔기 N 단백질이다.
"PRRSV N 단백질 NLS-1 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NLS-1 영역"은 성숙 N 단백질의 약 처음 15개 N-말단 잔기들 내에 위치하는, 4개의 연속 염기성 아미노산(라이신 또는 아르기닌), 또는 3개의 염기성 잔기 및 히스티딘 또는 프롤린을 함유하는 "pat4" 또는 "nuc1" 핵 국소화 신호(문헌[Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003])를 의미한다. 예를 들면, VR2332 NLS-1 영역 서열은 KRKK이고 잔기 9 내지 12에 위치하지만, 렐리스타트 단리물 서열은 KKKK이고 N 단백질의 잔기 10 내지 13에 위치한다.
"PRRSV N 단백질 NLS-2 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NLS-2 영역"은 2종의 형태들 중 한 형태를 취할 수 있는, N 단백질 내의 제2 핵 국소화 신호를 의미한다. 북아메리카 PRRS 바이러스에서 NLS-2는 3개의 잔기 내의 프롤린으로 시작하고 이어서 5개의 잔기들 중 3개 이상의 염기성 잔기(K 또는 R)를 함유하는 5개 잔기 서열을 갖는, 본 발명자들에 의해 "pat8" 모티프로서 명명된 패턴을 갖는다(문헌[Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003]에 기재된 "pat7" 또는 "nuc2" 모티프의 약간의 변경). 예를 들면, 이러한 서열은 북아메리카 PRRSV 단리물 VR2332의 N 단백질 잔기 41 내지 47에 위치하고 서열 P...K로 표시된다. 유럽 PRRS 바이러스에서, NLS-2는 히스티딘 또는 프롤린과 관련된 4개의 염기성 아미노산 또는 3개의 염기성 잔기로 구성된 연속 스트레치(stretch)인 "pat4" 또는 "nuc1" 모티프를 갖는다(문헌[Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003]). 유럽 PRRSV 단리물 렐리스타트의 NLS-2는 잔기 47 내지 50에 위치하고 서열 K..K로 표시된다.
"PRRSV N 단백질 NoLS 영역" 또는 "PRRSV ORF7 NoLS 영역"은 약 32개 아미노산의 총 길이를 갖고 그의 아미노 말단 근처에서 NLS-2 영역을 포함하는 핵소체 국소화 신호를 의미한다. 예를 들면, VR2332 NoLS 영역 서열은 잔기 41 내지 72에 위치하고 서열 P...R(문헌[Rowland & Yoo, 2003])로 표시되고, 상응하는 렐리스타트 단리물 서열은 잔기 42 내지 73에 위치하고 서열 P..R로 표시된다.
"형질감염된 숙주 세포"는 미국 특허 제5,600,662호에 기재된 바와 같이 PRRS 바이러스 RNA로 형질감염되었을 때 적어도 제1 라운드의 PRRS 비리온을 생성할 수 있는 사실상 임의의 숙주 세포를 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, "감염성 DNA 분자"는 적합한 숙주 세포로부터 기능성 비리온으로의 복제, 전사 및 번역을 뒷받침하는 데에 필요한 요소를 코딩하는 DNA 분자이다.
마찬가지로, "단리된 폴리뉴클레오티드 분자"는 존재하는 경우 그의 천연 발생 상태로부터 임의의 검출가능한 정도까지 정제된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 물질 조성물을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 제2 폴리뉴클레오티드 분자(RNA 또는 DNA)의 뉴클레오티드 서열은 제1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열에 대한 "상동성"을 갖거나 상기 제1 폴리뉴클레오티드 분자에 대한 "동일성"을 갖고, 이때 상기 제2 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열은 유전 코드의 축퇴성에 기초할 때 상기 제1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열과 동일한 폴리아미노산을 코딩하거나, 본 발명의 실시에 있어서 유용하도록 상기 제1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리아미노산과 충분히 유사한 폴리아미노산을 코딩한다. 또한, 상동성 폴리뉴클레오티드 서열은 센스 및 안티센스 가닥, 및 모든 경우에서 임의의 이러한 가닥의 상보체를 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명의 실시에 있어서 유용하므로 상동성 또는 동일성을 갖고, 이때 상기 분자는 감염된 돼지의 체액 또는 조직 샘플 중의 PRRS 바이러스 또는 바이러스 폴리뉴클레오티드의 존재를 예를 들면, 표준 혼성화 또는 증폭 기법으로 검출하기 위한 진단 프로브로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 제2 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열은 BLASTN 알고리즘(NCBI로서도 공지된, 미국 국립보건원의 국립 생물공학정보센터(미국 매릴랜드주 베테스다 소재))에 기초할 때 제1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열에 대한 약 70% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 경우 상기 제1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열에 대한 상동성을 갖는다. 본 발명의 실시에 따른 계산을 위한 구체적인 예에서, BLASTP 2.2.6이 언급된다(문헌[Tatusova TA and TL Madden, "BLAST 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences." (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250]). 요약하건대, 10의 갭 개방 벌점, 0.1의 갭 연장 벌점, 및 헤니코프(Henikoff) 및 헤니코프의 "blosum62" 점수화 매트릭스를 이용하여 정렬 점수를 최적화하기 위해 2개의 아미노산 서열들을 정렬한다(문헌[Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992]). 그 다음, % 동일성을 다음과 같이 계산한다: 동일한 매치(match)의 총수 x 100/보다 긴 서열의 길이 + 2개의 서열들을 정렬하기 위해 상기 보다 긴 서열 내로 도입된 갭의 수.
바람직하게는, 상동성 뉴클레오티드 서열은 약 75% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 유전 코드가 축퇴되어 있기 때문에, 상동성 뉴클레오티드 서열은 임의의 수의 "침묵" 염기 변화, 즉 동일한 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
상동성 뉴클레오티드 서열은, 이 서열이 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리아미노산과 약 70% 이상 동일한 상태로 남아 있거나 본 발명의 실시에 있어서 유용한 한, 비-침묵 돌연변이, 즉 코딩된 폴리아미노산에서 아미노산 차이를 발생시키는 염기 치환, 결실 또는 추가를 더 함유할 수 있다. 이와 관련하여, 일반적으로 전체 단백질 기능을 불활성화시키지 않는다고 인정되는 일부 보존적 아미노산 치환이 만들어질 수 있다: 예컨대, 양으로 하전된 아미노산의 경우(역 또한 마찬가지임) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 음으로 하전된 아미노산의 경우(역 또한 마찬가지임), 아스파르트산 및 글루탐산; 및 중성으로 하전된 아미노산의 일부 기들의 경우(모든 경우에서 역 또한 마찬가지임), (1) 알라닌 및 세린, (2) 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘, (3) 시스테인 및 세린, (4) 글리신 및 프롤린, (5) 이소류신, 류신 및 발린, (6) 메티오닌, 류신 및 이소류신, (7) 페닐알라닌, 메티오닌, 류신 및 티로신, (8) 세린 및 쓰레오닌, (9) 트립토판 및 티로신, 및 (10) 예를 들면, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌. 아미노산은 물리적 성질, 및 이차 및 삼차 단백질 구조에의 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 한 아미노산을 유사한 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것으로서 당분야에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 1997년 3월 13일자로 공개된 국제 특허출원 공보 제WO 97/09433호의 제10면(1996년 9월 6일자로 출원된 제PCT/GB96/02197호)에서 발견될 수 있다. 대안적으로, 보존적 아미노산은 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp. 71-77]에 기재된 바와 같이 분류될 수 있다. 추가 적합한 보존적 변화 및 이의 적용은 후술되어 있다.
상동성 뉴클레오티드 서열은 예를 들면, 상기 BLASTN을 이용하여 뉴클레오티드 서열들을 비교함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 상동성 뉴클레오티드 서열은 선택된 조건 하에서의 혼성화에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 제2 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열은 중간의 엄격한 조건, 예를 들면, 65℃에서 0.5 M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 및 1 mM EDTA에서 필터 결합된 DNA와 혼성화하고 42℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS에서 세척하는 조건(문헌[Ausubel et al editors, Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1994, pp. 6.0.3 to 6.4.10] 참조), 또는 이하에 정의된 바와 같이 PRRS 바이러스를 코딩하는 서열들의 혼성화를 다른 방식으로 야기할 조건 하에 서열번호 1의 상보체와 혼성화하는 경우 서열번호 1(또는 임의의 다른 특정 폴리뉴클레오티드 서열)에 대한 상동성을 갖는다. 혼성화 조건의 변경은 실험적으로 결정될 수 있거나 프로브의 구아노신/사이토신(GC) 염기 쌍형성의 길이 및 백분율에 기초하여 정확히 계산될 수 있다. 혼성화 조건은 문헌[Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51]에 기재된 바와 같이 계산될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 매우 엄격한 조건, 예를 들면, 65℃에서 0.5 M NaHPO4, 7% SDS 및 1 mM EDTA에서 필터 결합된 DNA와 혼성화하고 68℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS에서 세척하는 조건 하에 서열번호 1의 상보체와 혼성화하는 경우 서열번호 1(또는 본 발명의 임의의 다른 서열)에 대한 상동성을 갖는다(문헌[Ausebel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1989]).
나아가, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 단리된 RNA 분자는 합성 분자, 및 재조합 기법, 예컨대, 시험관내 클로닝 및 전사를 통해 수득된 분자 둘다를 포함한다는 것이 이해되어야 한다.
폴리뉴클레오티드 분자는 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 부위-지정된 돌연변이유발 또는 무작위 돌연변이유발, 예컨대, 화학적 돌연변이유발제 또는 방사선에의 노출을 포함하는, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 재조합 기법을 이용함으로써 유전적으로 돌연변이될 수 있다. 돌연변이는 당분야에서 공지되어 있는 표준 방법, 예를 들면, 기재된 바와 같은(예를 들면, 문헌[Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol., 1998, 440:199-206]) 감염성 카피의 부위-지정된 돌연변이유발(예를 들면, 문헌[Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 전술된 바와 같이 PRRS 바이러스를 코딩하는 감염성 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열을 돌연변이시키는 단계, 및 적합한 발현 시스템을 이용하여 유전적으로 변경된 PRRS 바이러스를 발현시키는 단계를 포함하는, 유전적으로 변경된 북아메리카 PRRS 바이러스를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 유전적으로 변경된 PRRS 바이러스는 당분야에서 일반적으로 공지되어 있는 적합한 발현 시스템(이의 예는 본원에 기재되어 있음)을 이용함으로써 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 발현될 수 있다. 예를 들면, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 더 상세히 후술되어 있는 바와 같이 시험관내 적합한 숙주 세포에서 코딩된 바이러스를 발현할 수 있는 플라스미드의 형태로 존재할 수 있다.
북아메리카 PRRSV N 단백질 서열은 고도로 보존되어 있고, 보고된 서열들은 서로 약 93% 내지 100%의 동일성을 갖는다. 북아메리카 PRRSV N 단백질과 유럽 PRRSV N 단백질은 약 57% 내지 59% 동일하고 공통된 구조 모티프를 공유한다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드 또는 코딩된 아미노산에 대해 상이하게 넘버링될 수 있는 PRRS 코딩 서열과 단리물을 비교할 때, 적절한 영역의 확인은 관심 있는 PRRS 균주에서 보존된 특징적인 아미노산을 확인하고 이를 기준 균주와 정렬시킴으로써 용이하게 달성된다.
재조합 DNA 기술은 DNA 수준에서 핵산을 변경시키는 것을 목적으로 하는 매우 다양하고 강력한 분자생물학 기법을 포함하고 분자 수준에서 게놈을 분석하고 변경하는 것을 가능하게 한다. 이와 관련하여, 바이러스, 예컨대, PRRS 바이러스는 그의 게놈의 적당한 크기 때문에 특히 이러한 조작으로 처리되기 쉽다. 그러나, 재조합 DNA 기술은 비-레트로바이러스성 RNA 바이러스들에 즉시 적용될 수 없는데, 이는 이들 바이러스들이 그들의 복제에 있어서 DNA 중간 단계를 포함하지 않기 때문이다. 이러한 바이러스들의 경우, 재조합 DNA 기술이 그들의 게놈에 적용되어 변경된 바이러스를 발생시키기 전에 감염성 cDNA 클론이 개발되어야 한다. 감염성 클론은 연구되고 있는 바이러스의 전장(게놈 길이) cDNA(본원에서 RNA의 DNA 카피의 넓은 의미로 사용될 뿐만 아니라, mRNA의 DNA 카피의 좁은 의미로도 사용됨)를 구축한 후, 상기 전장 cDNA로 형질감염된 생체내 세포에서 감염성 전사체를 합성함으로써 유도될 수 있으나, 감염성 전사체는 전사 칵테일의 존재 하에 원핵 프로모터를 갖는 플라스미드 내의 전장 cDNA로부터 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있거나 전체 바이러스 게놈을 포함하는 라이게이션된 부분 길이 cDNA 단편들의 사용을 통해 시험관 내에서 수득될 수도 있다. 모든 경우에서, 전사된 RNA는 cDNA에 도입된 모든 변경을 보유하고 이로써 변경된 바이러스를 추가로 계대감염시키는 데에 사용될 수 있다.
유럽 PRRS 바이러스 단리물 또는 렐리스타트 바이러스의 감염성 클론의 제제는 본원에 참고로 전체적으로 도입되는 미국 특허 제6,268,199호에 기재되어 있다. P129로 명명된 북아메리카 PRRS 바이러스 단리물의 감염성 cDNA 클론의 제제(Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004)가 본원에 참고로 전체적으로 도입되는 미국 특허 제6,500,662호에 기재되어 있다. P129 cDNA의 서열은 진뱅크 수탁번호 AF494042 및 미국 특허 제6,500,662호에 개시되어 있다. 하기 본 발명자들의 연구는 플라스미드의 내용 면에서 CMV 즉시 초기 프로모터에 의해 발현되고 pCMV-S-P129로 명명되어 있고 미국 특허 제6,500,662호에도 개시되어 있는 이러한 감염성 클론을 사용한다. 미국 특허 제6,500,662호에 기재된 바와 같이, 본원에서 사용되기에 적합한 다른 플라스미드 및 프로모터가 존재한다.
관심 있는 임의의 개방 판독 프레임의 완전한 서열 및 관심 있는 아미노산 잔기의 위치가 주어지면, 통상의 기술을 가진 자는 원하는 특정 위치에서 변화를 디자인하기 위해 코돈 표만을 참조할 필요가 있다.
코돈은 mRNA 및 이의 상응하는 cDNA 분자에서 뉴클레오티드의 삼염기 서열을 구성한다. 코돈은 mRNA 분자에 존재할 때 염기 우라실(U)을 특징으로 하지만 DNA에 존재할 때 염기 티미딘(T)을 특징으로 한다. 폴리뉴클레오티드 내에서 동일한 아미노산 잔기에 대한 코돈의 단순한 변화는 코딩된 폴리펩티드의 서열 또는 구조를 변화시키지 않을 것이다. 특정 3 뉴클레오티드 서열이 임의의 특정 아미노산을 "코딩한다"고 기술하는 어구가 존재할 때, 통상의 기술을 가진 자는 상기 표가 해당 특정 뉴클레오티드를 확인하는 수단을 제공한다는 것을 인식할 것임이 자명하다. 예를 들면, 특정 3 뉴클레오티드 서열이 라이신을 코딩하는 경우, 상기 표는 2개의 가능한 삼염기 서열들이 AAA 및 AAG라고 개시한다. 글라이신은 GGA, GGC, GGT(RNA의 경우 GGU) 및 GGG에 의해 코딩된다. 코딩된 단백질에서 라이신을 글라이신 잔기로 변경시키기 위해, 코딩 핵산에서 AAA 또는 AAG 삼염기를 GGA 및 GGC 중 어느 하나, GGT 또는 GGG로 교체할 것이다.
전술된 바와 같이, 본 발명은 PRRS의 백신 균주의 제공에 관한 것이고, 이때 다른 반응들 중에서 인터페론 경로에 의해 매개되는 상기 바이러스에 대한 숙주 반응은 하향조절되지 않는다. 상세히 후술되어 있는 바와 같이, 이와 관련하여 효과적인 바이러스 게놈에 대한 다양한 변경들, 특히 본원에 개시된 바와 같이 ORF1a에서 발견된 변경들 및 이들의 조합이 존재한다. 본원에도 개시된 바와 같이, 유사한 변경 점은 PRRS 게놈의 추가 개방 판독 프레임에서 발견될 수 있다는 것을 인식해야 한다(표 9 참조).
PRRS 폴리뉴클레오티드를 변경시키는 일부 다른 종래 방법들이 PRRS 바이러스를 약독화시키는 데에 있어서 성공적이었으므로 백신 사용에 대한 적합성을 제공할 수 있지만, 발생된 약독화의 정확한 원인이 일반적으로 공지되어 있지 않다는 것은 주목할 만하다. 예를 들면, 독성 PRRS 바이러스의 뉴클레오캡시드 또는 N 단백질(ORF7에 의해 코딩됨)에서 NLS-2 영역, NoLS 영역 또는 NES 영역을 돌연변이시키거나 결실시켜 개방 판독 프레임 7(ORF7) 내에 결실을 포함시킴으로써 독성 PRRS 바이러스를 약독화시키는 것이 개시되어 있다. 또 다른 양태에서, ORF7 결실은 캡시드 단백질의 핵 국소화 신호(NLS)를 코딩하는 서열 내에 존재한다. NLS를 코딩하는 서열 내의 ORF7 결실은 위치 43 내지 48에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 위치 43 및 44 중 하나 또는 둘다에서의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 예를 들면, 참고로 도입되는 미국 특허 제7,544,362호의 전체 개시내용을 참조한다. ORF7에 의해 코딩되는 PRRSV의 뉴클레오캡시드 단백질(N)은 인산화되고(문헌[Wootton, Rowland, and Yoo, 2002]) 동종이량체를 형성하는(문헌[Wootton and Yoo, 2003]) 작은 염기성 단백질이다. 결정 구조는 최근에 확인되었다(문헌[Doan and Dokland, 2003]). N 단백질은 감염된 세포에서 다수의 기능을 갖는 것으로 보인다. 게놈 RNA가 팩키징되어 구형 캡시드 구조를 형성하는 것(세포질에서 일어나는 과정) 이외에, N 단백질의 일부는 감염된 세포의 핵, 특히 핵소체 내로 수송된다. N 단백질의 아미노산 서열은 2개의 핵 국소화 신호(NLS), 즉 핵 및 핵소체 내로의 수송을 용이하게 하는 핵소체 국소화 신호(NoLS), 및 핵으로부터의 이출을 용이하게 하는 핵 이출 신호(NES)를 함유한다(문헌[Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; Rowland and Yoo, 2003]). 핵소체에 존재하는 동안 N 단백질은 작은 핵소체 RNA 관련 단백질 피브릴라린과 상호작용하고 바이러스 복제에 유리하도록 감염된 세포에서 rRNA 프로세싱 및 리보좀 생합성을 조절할 수 있다(문헌[Yoo et al., 2003]). 이러한 유형의 바이러스 돌연변이는 단독으로 또는 다른 약독화된 돌연변이와 함께 신규 PRRS 백신을 디자인하는 데 있어서 중요하다. 약독화된 PRRS 바이러스의 또 다른 예에서, ORF1a에 대한 변경이 이용되었다. ORF1a의 비-구조 단백질 2 코딩 영역 내의 초가변 영역에서 아미노산 616 내지 752에 존재하는 항원성 에피토프를 코딩하는 DNA 서열의 결실이 이용되었다(참고로 전체적으로 도입되는 미국 특허 제7,618,797호 참조).
PRRS 바이러스의 면역생물학에 대한 연구는 PRRS 바이러스와 PDC의 상호작용이 조사할 가치가 있다는 것을 암시한다. 이 유형의 세포는 인간, 마우스, 래트, 돼지 및 원숭이에서 말초혈 단핵세포의 0.2% 내지 0.8%를 차지한다. 이 세포는 그의 희귀성에도 불구하고 선천성 면역 시스템의 중요한 성분이고 바이러스 자극 후 엄청난 양의 IFN-α를 분비할 수 있다. PDC는 천연 살해 세포, B 세포 및 T 세포의 기능을 촉진하기 때문에 항-바이러스 선천성 면역 및 후천성 면역을 조절하는 데 있어서 IFN-α의 분비를 통해 주요 역할을 수행한다. 더욱이, 돼지 단핵세포로부터 유도된 수지상세포(MoDC)의 성숙은 항원을 제시하고 T 세포를 활성화시키는 MoDC의 능력을 향상시키는 PDC에 의해 분비된 IFN-α에 의해 보조된다. 바이러스 감염의 후기에서, PDC는 T 세포의 기능을 직접적으로 조절하는 독특한 유형의 성숙 수지상세포로 분화되고 PRRS 바이러스를 포함하는 바이러스들에 대한 항-바이러스 면역의 주요 매개자인 IFN-γ를 분비할 수 있는 세포로의 T 세포의 분화를 유도한다. IFN-α를 분비하는 PDC의 능력을 억제하는 것으로 공지되어 있는 인간 바이러스, 예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스 및 홍역 바이러스가 존재한다는 것은 놀라운 사실이 아니다. 이 억제 효과는 체액성 면역 반응의 우세 및 이들 바이러스들에 의한 감염의 결과로서 관찰된 관련 면역병리에 있어서 일정할 역할을 수행할 뿐만 아니라, 이차 세균 및 바이러스 감염에 대한 숙주의 증가된 민감성에 있어서도 일정한 역할을 수행하는 것으로 생각된다.
대조적으로, 야생형 PRRSV 단리물뿐만 아니라 인겔백(Ingelvac) PRRS 백신 균주들 둘다(실시예 5 및 하기 참조)가 IFN-α를 생성하는 돼지 PDC의 정제된 집단의 능력을 억제한 반면, 신규 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스 스톡들(하기 참조)은 이 PDC 기능에 대한 억제 효과를 최소한으로 나타내었거나 전혀 나타내지 않았다. 이들 관찰결과의 의의는 부분적으로 바이러스에 대한 후천성 면역 반응의 발달을 조절하는 데 있어서 IFN-α의 중요성에 있다. 따라서, 최소한으로 IFN-α를 억제하는 바이러스로부터 유도된 약독화된 바이러스 백신이 강한 항-바이러스 보호 면역 반응을 이끌어낼 가능성이 매우 높다. 인겔백 PRRS MLV 백신에 대한 IFN-α의 항원보강제 효과가 바이러스 특이적 T 세포-매개된 IFN-γ 반응을 유도하였고, 상기 백신에 의해 이끌어내진 바이러스 특이적 T 세포-매개된 IFN-γ 반응의 강도가 현지 및 실험실 조건 하에 상기 바이러스에 대한 보호 면역과 양의 상관관계를 갖는다는 것은 이미 입증되었다. 따라서, 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 비-IFN-α-억제 PRRSV에 의해 이끌어내진 세포-매개된 면역 반응 및 보호 면역의 수준은 야생형(IFN-α 억제) 표현형을 나타내는 PRRSV 단리물에 의해 이끌어내진 세포-매개된 면역 반응 및 보호 면역의 수준보다 유의하게 더 높을 것이라는 것을 예측하는 것이 타당할 것이다.
본 발명을 언급할 때, P129-PK-FL 바이러스뿐만 아니라, pCMV-S-P129-PK 감염성 cDNA 클론으로부터 유도된 모든 5종의 결실 돌연변이체도 IFN-α 생성을 억제하는 능력을 상실한다는 것은 주목할 만하다. 그러므로, 이 비정상적 표현형은 단지 결실로 인한 것일 수 없지만, 적어도 부분적으로 상기 감염성 클론의 구축 동안 고정된 유전적 변화에 기인해야 한다. 흥미롭게도, PK-9 세포 상에서 연속적으로 63회 계대감염된 비-클로닝된 P129 바이러스는 IFN 유도를 억제하는 능력을 보유하였다(표 1). 감염성 클론으로부터 유도된 모든 바이러스들에서 관찰된 공통된 IFN 표현형에 대한 가장 그럴듯한 설명은 감염성 클론의 발생 동안 하나 이상의 돌연변이의 도입이다. 이들 돌연변이는 감염성 클론을 구축하는 데에 사용된 바이러스 RNA에서 가능한 낮은 수준으로 존재할 것이다. 궁극적으로, 상기 돌연변이는 돼지에서 원래의(계대감염 0) 바이러스에 존재하였을 수 있거나, 16회 계대감염 동안 PK-9 세포 상에서 증식하도록 상기 바이러스를 적응시키는 과정 동안 발생되어 풍부해졌을 수 있다. 상기 돌연변이가 PCR에 의해 유도된 오류의 결과 또는 클로닝 인공물일 가능성도 배제될 수 없다. IFN-α 억제 기능 상실의 원인이 되는 돌연변이는 감염성 클론 구축 동안 임의의 속도로 "고정"되었고 이 특정 감염성 클론으로부터 유도된 모든 바이러스들에 존재할 것으로 예측된다.
PRRSV가 바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의한 오류의 결과로서 무작위 유전적 다양성을 용이하게 발생시키는 것으로 공지되어 있는 한, 변경된 IFN-α 억제 표현형의 원인이 되는 돌연변이가 cDNA 클론의 구축에 사용된 바이러스 RNA에 이미 존재하였을 가능성이 높다. 바이러스 유사 종은 생체내 바이러스 복제 동안 천연적으로 나타나는 밀접하게 관련된 유전적 변이체들의 불균질한 혼합물로 구성된다. 감염성 cDNA 클론으로부터 유도된 PRRSV의 다회 시험관내 계대감염 후 바이러스 유사 종의 관찰이 훨씬 더 적절하다. 이것은 이전에 수행된 연구에서 바이러스 게놈의 출발 집단이 유전적으로 균질한 집단으로 구성되어 있었고, 세포 배양물에서의 계대감염 동안 서열 다양성이 신속히 발생되었기 때문에 주목할 만하다. 현재 연구에서, 감염성 클론의 구축을 유발하는 16회 PK-9 계대감염 전에 원래의 P129 바이러스가 (생물학적으로 또는 분자적으로) 클로닝되어 있지 않았기 때문에 게놈 불균질성의 수준은 보다 더 높았을 것이다. 따라서, 유사 종들로부터 IFN-α 억제 기능 상실의 원인이 되는 PRRSV RNA 변이체를 우연히 선택하고 pCMV-S-P129-PK17-FL 감염성 cDNA 클론 내로 도입하는 것이 가능할 것으로 보인다. 모든 유도체 바이러스들이 효과적인 차세대 PRRS 백신의 개발에 중요한 것으로 입증될 수 있는 이 뚜렷한 생물학적 표현형을 공유하는 한, 감염성 클론 내로의 이들 돌연변이들의 도입은 일부 환경 하에 행운으로서 간주될 것이다.
이 바이러스의 다른 균주들처럼 야생형 PRRS 바이러스 균주 P19는 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 플라스마사이토이드 수지상세포(PDC)가 인터페론(IFN)-α를 생성하는 능력에 대한 강한 억제 효과를 나타내었다. 다른 한편으로, P129(pCMV-S-P129-PK17-FL)의 감염성 cDNA 클론으로부터 유도된 바이러스는 IFN-α 억제 표현형의 상당한 감소를 나타내었다. 이 감염성 클론은 16회의 연속 계대감염의 과정에 걸쳐 CD163 발현 돼지 신장 세포주 PK-9 상에서 증식하도록 이전에 적응된 바이러스로부터 구축되었다(참고로 전체적으로 도입되는 미국 특허 제7,754,464호 참조). P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44의 IFN-α 억제 표현형은 낮은 수준 내지 무시할만한 수준이었고 높은 억제 효과를 나타내는 2종의 인겔백 PRRS 변경된 생바이러스 백신 균주들 중 어느 하나에 의해 나타나는 IFN-α 억제 표현형과 현저히 대조되었다. 이들 결과는 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스가 모 저(low)-계대감염 P129 단리물, 다른 야생형 PRRS 바이러스 및 상기 2종의 인겔백 PRRS 백신과 생물학적으로 구별된다는 것을 보여준다. 감소된 IFN-α 억제 표현형의 잠재적 영향뿐만 아니라 표현형적 변화에 대한 가능한 원인도 논의되어 있다.
본 발명의 아미노산 변경
본 발명의 실시에 따라, 북아메리카 유전형이든 아니면 중국 유전형이든 관계없이 ORF1로부터 코딩된 단백질 내의 특정 위치에서 특정 아미노산을 함유하고 바람직한 표현형을 이들 바이러스들에 부여하는 PRRS의 신규 단리물이 현지에서 확인될 수 있다. 대안으로, 전술된 바와 같이, 표준 유전적 절차를 이용하여 코딩된 ORF1 단백질의 유전 서열(및 이로써 아미노산 서열)을 변경시켜 변경된 북아메리카 및 중국 PRRS 바이러스들 및 감염성 클론, 및 이들로부터 유도된 백신(이들 모두 이러한 표현형을 제공함)을 생성할 수 있다. 바람직한 예에서, 상기 표현형은 야생형 PRRS 바이러스에 비해 감소된 인터페론-α 억제 효과, 및 선택적으로 강력한 면역 반응을 유발하되 검출가능한 병리학적 증상을 거의 나타내지 않으면서 숙주 동물(돼지)에서 재생산되거나 지속되는 능력을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 실시에서, 유용한 출발점으로서 작용할 수 있는 북아메리카 PRRS 균주 또는 단리물은 예를 들면, 미국 특허 제6,500,662호, 제7,618,797호, 제7,691,389호, 제7,132,106호, 제6,773,908호, 제7,264,957호, 제5,695,766호, 제5,476,778호, 제5,846,805호, 제6,042,830호, 제6,982,160호, 제6,241,990호 및 제6,110,468호에 개시된 PRRS 균주 또는 단리물을 포함한다. 유용한 출발점으로서 작용할 수 있는 중국 PRRS 균주 및 단리물에 대해서는 예를 들면, TJM-92 바이러스에 관한 중국 특허출원 제CN201633909호로부터의 공개된 중국 특허출원 제CN200910091233.6호를 참조한다.
하기 논의와 관련하여, 국제적으로 인정된 단일 문자 및 3문자 표기가 DNA에 의해 코딩된 대다수의 일반 아미노산들에 대해 사용된다: 알라닌(Ala, A); 아르기닌(Arg, R); 아스파라긴(Asn, N); 아스파르트산(Asp, D); 시스테인(Cys, C); 글루탐산(Glu, E); 글루타민(Gln, Q); 글라이신(Gly, G); 히스티딘(His, H); 이소류신(Ile, I); 류신(Leu, L); 라이신(Lys, K); 메티오닌(Met, M); 페닐알라닌(Phe, F); 프롤린(Pro, P); 세린(Ser, S); 쓰레오닌(Thr, T); 트립토판(Trp, W); 티로신(Tyr, Y) 및 발린(Val, V).
표 9 및 10은 인터페론 알파 활성의 감소된 억제와 상호관련되어 있음으로써 백신에 대한 안전하고 강력한 면역 반응을 허용하는 북아메리카(및 중국) PRRS의 독성 약화에 대한 원인이 되는 관찰된 아미노산 변화를 확인시켜 준다. 표 10은 이와 관련된 매우 바람직한 ORF1a 내의 아미노산 변경을 확인시켜 주고 이들 돌연변이들이 다른 P129 배양물로부터의 계대감염과 관련하여 어떻게 발생되는지를 보여준다(또한, 이 기록의 조사는 필요에 따라 본 발명의 아미노산 변화들 중 임의의 아미노산 변화를 갖는 코딩 DNA를 (재)구축하는 돌연변이유발 전략의 디자인도 용이하게 한다는 것을 인식해야 함). 이와 관련하여, (P129 계대감염 52에 의해 입증된 바와 같이) ORF1a에 대한 가장 바람직한 아미노산 개선은 다수의 글리코실화 기회를 잠재적으로 부가하고 단백질 기능을 추가로 변경시킬 수 있는 182의 아스파라긴, 189의 아스파라긴, 273의 티로신, 302의 히스티딘, 665의 쓰레오닌, 943의 시스테인, 1429의 쓰레오닌, 1505의 알라닌 및 2410의 아스파라긴을 포함한다.
따라서, 본 발명은 단리된 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스를 제공하고, 이때 ORF1a에 의해 코딩된 이의 단백질은 하기 서열 중 어느 하나의 서열을 함유하는 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된다:
아미노산 서열 AMANVYD(서열번호 9) 내의 아미노산 N;
아미노산 서열 IGHNAVM(서열번호 12) 내의 아미노산 N;
아미노산 서열 TVPDGNC(서열번호 15) 내의 아미노산 D;
아미노산 서열 CWWYLFD(서열번호 18) 내의 아미노산 Y;
아미노산 서열 HGVHGKY(서열번호 21) 내의 아미노산 H;
아미노산 서열 AAKVDQY(서열번호 24) 내의 아미노산 V;
아미노산 서열 PSATDTS(서열번호 27) 내의 아미노산 T;
아미노산 서열 LNSLLSK(서열번호 30) 내의 아미노산 L;
아미노산 서열 APMCQDE(서열번호 33) 내의 아미노산 C;
아미노산 서열 CAPTGMD(서열번호 36) 내의 아미노산 T;
아미노산 서열 PKVAKVS(서열번호 39) 내의 아미노산 A;
아미노산 서열 AGEIVGV(서열번호 42) 내의 아미노산 I;
아미노산 서열 ADFNPEK(서열번호 45) 내의 아미노산 N; 및
아미노산 서열 QTPILGR(서열번호 48) 내의 아미노산 I.
보다 구체적으로, 본 발명은 단리된 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스를 제공하고, 이때 ORF1a에 의해 코딩된 이의 단백질은 하기 서열 중 어느 하나의 서열을 함유하는 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된다:
아미노산 서열 ANV(서열번호 9 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 HNA(서열번호 12 참조) 내의 아미노산 N,
아미노산 서열 PDG(서열번호 15 참조) 내의 아미노산 D,
아미노산 서열 WYL(서열번호 18 참조) 내의 아미노산 Y,
아미노산 서열 VHG(서열번호 21 참조) 내의 아미노산 H,
아미노산 서열 KVD(서열번호 24 참조) 내의 아미노산 V,
아미노산 서열 ATD(서열번호 27 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 SLL(서열번호 30 참조) 내의 아미노산 L,
아미노산 서열 MCQ(서열번호 33 참조) 내의 아미노산 C,
아미노산 서열 PTG(서열번호 36 참조) 내의 아미노산 T,
아미노산 서열 VAK(서열번호 39 참조) 내의 아미노산 A,
아미노산 서열 EIV(서열번호 42 참조) 내의 아미노산 I,
아미노산 서열 FNP(서열번호 45 참조) 내의 아미노산 N, 및
아미노산 서열 PIL(서열번호 48 참조) 내의 아미노산 I.
전술된 바와 같이, 북아메리카 및 중국 PRRS의 많은 공지된 균주들 및 단리물들이 존재하고, 신규 균주가 계속 진화하거나 단리되고 있다. 고도의 아미노산 서열 상동성이 모든 이들 균주들 사이에 존재하지만, 당분야에서 숙련된 자는 약간의 변경이 존재하고 실제로 이들 차이 및 유사성을 이용하여 모든 백신 균주들의 표현형적 성질을 추가로 개선할 수 있다는 것을 즉시 인식할 것이다.
먼저, 상기 (제38면 내지 제40면에서) 직접적으로 특정된 서열번호들에 의해 정의된 모든 아미노산 모티프들과 관련하여, (P129 계대감염 52로부터 제공된) 밑줄로 표시된 바람직한 아미노산들은 인접 아미노산들이 특정된 서열번호의 서열들로부터 달리 변화된 경우조차도 일반적으로 전체적으로 유리한 상태로 남아 있다. 따라서, 특정 대표적 예로서 AMANVYD(서열번호 9)와 관련하여, 이러한 다른 균주들에서 진화의 결과로서 치환 및/또는 결실 또는 추가를 야기하는 추가 변화가 발생한 경우조차도 임의의 북아메리카 또는 중국 PRRS로부터의 상응하는 ORF1-발현된 단백질 서열을 조사하여 상응하는 아미노산 모티프를 발견하는 것이 일반적으로 가능하다. 따라서, 당분야에서 숙련된 자에 의해 인식될 바와 같이, 계대감염 52의 특정된 아미노산에 대해 직접적으로 5' 또는 3'에 존재하는 전체 아미노산 서열 내의 다른 변화들에도 불구하고 P129 계대감염 52에 의해 입증된 바람직한 아미노산 변화도 작동가능한 상태로 남아 있을 것이다. 이것은 특히 비교 아미노산 변화들이 보존적 변화로서 간주되는 경우 그러할 것이다. 따라서, AMANVYD(서열번호 9) 및 이의 하위서열 ANV와 관련하여, 예를 들면, 이 서열 내의 발린이 이소류신 또는 류신, 또는 임의의 다른 잔기로 교체되어 있는 경우 또는 잔기가 단순히 결실되어 있거나 추가 잔기가 추가된 경우 또 다른 PRRS 균주에서 비교가능한 모티프를 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 정렬을 확인하여 폴리펩티드 서열 모티프가 상응하는지를 확인하기 위한 다수의 컴퓨터 프로그램들, 예를 들면, 소위 (주어진 % 동일성 수준에 기초한) Blosum 표가 존재한다(문헌[S. Henikoff et al. "Amino Acid Substitution matrices from protein blocks", Proc Natl Acad Sci, USA, 89(22), pp. 10915-10919, Nov 15, 1992] 및 문헌[A. L. Lehninger et al. Principles of Biochemistry, 2005, MacMillan and Company, 4th edition] 참조). 전체 5개 군으로의 카테고리화에 기초할 때 보존적 아미노산 변화도 인식된다: 설피드릴(Cys); 방향족(Phe, Tyr 및 Trp); 염기성(Lys, Arg, His); 지방족(Val, Ileu, Leu, Met); 및 친수성(Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser 및 Thr). 따라서, 지정된 위치에 인접한 하나 이상의 다른 아미노산이 추가되었거나, 결실되었거나 치환된 경우조차도 임의의 북아메리카 또는 중국 PRRS 코딩 뉴클레오티드 서열을 변경시켜 P129 계대감염 52에 대해 특정된 아미노산 변화들 중 임의의 아미노산 변화를 적절한 상응하는 위치에서 도입하는 것은 본 발명의 실시 내에 있다.
추가로, 유사한 원리에 기초할 때, 당분야에서 숙련된 자는 일단 바람직한 아미노산이 본 발명의 실시에 따라 ORF1a에 대해 확인된 특정 계대감염 52 변화로부터 확인되면, 의도된 계대감염 52 표현형을 실질적으로 보존하면서 임의의 이러한 계대감염 52 아미노산에 대한 보존적 치환도 P129 변이체에서 또는 임의의 다른 북아메리카 또는 중국 균주와 관련하여 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 대표적 예로서, (서열번호 30 내의) SLL과 관련하여, 지정된 류신 잔기는 이소류신, 발린 또는 메티오닌으로 더 치환될 수 있고; (서열번호 45 내의) FNP와 관련하여, 지정된 아스파라긴은 Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Ser 및 Thr 중 임의의 아미노산으로 치환될 수 있고; (서열번호 39 내의) VAK와 관련하여, 지정된 알라닌은 Asn, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Ser 및 Thr 중 임의의 아미노산으로 치환될 수 있지만, 특정된 위치에서의 임의의 이러한 아미노산 치환 작업 및 최초로 확인된 독특한 계대감염 52 아미노산 변화가 본 발명의 요건이 아니라는 것을 용이하게 인식할 것이다. 물론, 임의의 다른 인정된 모델에 따른 표준 보존적 아미노산 변화의 사용도 본 발명에서 실시된다. 예를 들면(모든 경우에서 역의 경우를 포함함), Glu 대신 Asp(역도 마찬가지임), Gln 대신에 Asn, Lys 대신에 Arg, Cys 또는 Thr 대신에 Ser, Tyr 대신에 Phe, Leu 또는 Ileu 대신에 Val, Gly 대신에 Ala 등을 사용할 수 있다.
추가로, 본 발명의 실시 내에서, (상기 ORF1a에 대해 확인된) 개별 계대감염 52 아미노산 변화들 중 임의의 아미노산 변화가 원하는 표현형적 효과를 나타내면서 임의의 북아메리카 또는 중국 PRRS 내에 유용하게 배치될 수 있지만, 전형적으로 코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 적절한 변경에 의해 공급되는 바와 같이 가능한 많은 표 9 또는 표 10 아미노산 선택을 최종 구축물 내에 포함시키는 것도 바람직하다. 따라서, 본 발명의 실시는 모든 확인된 전체 계대감염 52 아미노산 변화들의 임의의 특정 쌍, 삼중체 또는 다른 고차 조합물을 포함하기 위해 최종 바이러스 서열 내에서 약 17개의 확인된 계대감염 52 ORF1a 변화들(표 9) 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개 내지 최대 17개의 변화를 제공하는 중국 또는 북아메리카 PRRS 바이러스(및 상응하는 코딩 폴리뉴클레오티드)의 제공을 포함한다. 물론, 이러한 아미노산 변화는 부위-지정된 돌연변이유발, PCR 및 당분야에서 잘 공지되어 있는 다른 기법에 의해 상기 바이러스의 상응하는 코딩 뉴클레오티드 서열 내로 도입될 수 있다.
유전적으로 변경된 특정 균주가 약독화되어 있다는 것을 입증하기 위해, 후술된 실험이 이용될 수 있다.
PRRSV 부재 농장으로부터 유래된 군 당 10마리 이상의 미경산돈이 각각의 시험에 포함된다. PRRS 바이러스 특이적 혈청 항체를 갖지 않고 PRRSV에 대한 음성을 나타내는 동물들이 시험된다. 시험에 포함된 모든 동물들은 동일한 공급원으로부터 유래되고 사육된다. 동물들을 군에 무작위적으로 분배한다.
임신 90일째 날에 콧구멍 당 105 TCID50으로 1 ml PRRSV를 비강내로 적용함으로써 챌린지를 수행한다. 각각의 시험 셋업에 대해 3개 이상의 군이 존재한다: P129 챌린지에 대한 1개의 군; 가능하게는 약독화된 바이러스에 의한 챌린지에 대한 1개의 시험군; 및 1개의 엄격한 대조군.
연구는 엄격한 대조군이 연구 기간에 걸쳐 PRRSV 음성으로 남아있고 엄격한 대조군에 비해 P129 챌린지 군에서 25% 이상 더 적은 살아있는 건강한 자돈이 태어난 경우 유효한 것으로 간주된다.
약독화, 즉 보다 낮은 독성은 생식 성능 또는 다른 증상을 결정하는 하나 이상의 파라미터의 통계적으로 유의한 변화로서 정의된다.
비-변경된 모 균주에 의해 감염된 군에 비해 시험군(가능하게는 약독화된 바이러스)에 대한 하기 파라미터들 중 하나 이상의 파라미터의 유의한 감소는 약독화의 표시일 것이다:
a) 사산의 빈도
b) 임신 112일째 날 또는 임신 112일째 날 전의 유산
c) 미이라화된 자돈의 수
d) 덜 활동적이고 약한 자돈의 수
e) 이유 전 사망
나아가, 비-변경된 모 균주에 의해 감염된 군에 비해 시험군에 대한 하기 파라미터들 중 한 파라미터의 유의한 증가가 바람직하다:
f) 경산돈 당 이유된 자돈의 수
g) 경산돈 당 살아있는 건강한 자돈의 수
대안으로, PRRSV 감염의 호흡기 증상 및 다른 증상을 조사하여 약독화를 확립할 수 있다.
약독화된 균주는 백신의 형성에 있어서 귀중하다. 본 백신은 PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 경우 효과적이다. 백신은 이 백신이 1마리 이상의 영향 받지 않은 돼지에게 투여된 후 생물학적으로 순수한 바이러스 단리물(예를 들면, VR 2385, VR 2386, P129 등)을 사용한 후속 챌린지가 비-보호된 유사한 돼지에서 상기 단리물에 의해 전형적으로 야기되는 변화 또는 증상에 비해(즉, 적절한 대조군에 비해 상대적으로) 임의의 육안 또는 조직병리학적 변화(예를 들면, 폐의 병소) 및/또는 질환 증상의 중증도를 경감시킨 경우 PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지를 보호한다. 보다 구체적으로, 본 백신은 이 백신을 이를 필요로 하는 1마리 이상의 적합한 돼지에게 투여한 다음, 적절한 기간(예를 들면, 4주) 후에 생물학적으로 순수한 PRRSV 단리물의 큰 샘플(10(3-7) TCID(50))로 챌린지함으로써 효과적인 것으로 입증될 수 있다. 그 다음, 약 1주 후, 챌린지된 돼지로부터 혈액 샘플을 추출한 다음, 상기 혈액 샘플로부터 상기 바이러스를 단리하고자 하는 시도를 수행한다. 다량의 상기 바이러스의 단리는 상기 백신이 효과적이지 않을 수 있다는 것을 표시하는 반면, 감소된 양의 상기 바이러스의 단리(또는 바이러스의 부재)는 상기 백신이 효과적일 수 있다는 표시이다.
따라서, 본 백신의 효과는 정량적으로(즉, 적절한 대조군에 비해 경화된 폐 조직의 백분율의 감소) 또는 정성적으로(예를 들면, 혈액으로부터 PRRSV의 단리, 면역분석에 의한 폐, 편도선 또는 림프절 조직 샘플 중의 PRRSV 항원의 검출) 평가될 수 있다. 돼지 생식기 및 호흡기 질환의 증상은 정량적으로(예를 들면, 온도/발열) 또는 반-정량적으로(예를 들면, 하나 이상의 증상의 존재 또는 부재, 또는 하나 이상의 증상, 예컨대, 청색증, 폐렴, 폐 병소 등의 중증도의 감소) 평가될 수 있다.
영향 받지 않은 돼지는 돼지 생식기 및 호흡기 질환 감염제에 노출되지 않았거나 돼지 생식기 및 호흡기 질환 감염제에 노출되었지만 상기 질환의 증상을 보이지 않는 돼지이다. 영향 받은 돼지는 PRRS의 증상을 보이거나 PRRSV가 단리될 수 있는 돼지이다.
본 발명의 백신은 승인된 약정에 따라 (적용가능한 경우) 인간을 포함하는 동물용으로 허용가능한 담체, 예컨대, 표준 완충제, 안정화제, 희석제, 방부제 및/또는 가용화제를 포함하도록 제제화될 수 있고 지속 방출을 용이하게 하도록 제제화될 수도 있다. 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함한다. 등장성을 위한 첨가제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함한다. 안정화제는 특히 알부민을 포함한다. 다른 적합한 백신 비히클 및 첨가제(변경된 생백신의 제제화에 있어서 특히 유용한 백신 비히클 및 첨가제를 포함함)는 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있거나 자명할 것이다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing]을 참조한다.
본 발명의 백신은 하나 이상의 추가 면역조절 성분, 예컨대, 특히 항원보강제 또는 사이토카인을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 백신에서 사용될 수 있는 항원보강제의 비-한정적 예에는 RIBI 항원보강제 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.), 미국 몬타나주 해밀톤 소재), 명반, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄 겔, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 예컨대, 프로인트 완전 항원보강제 및 불완전 항원보강제, 블록 공중합체(CytRx, 미국 조지아주 아틀란타 소재), QS-21(캠브리지 바이오텍 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재), SAF-M(키론(Chiron), 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재), AMPHIGEN.RTM. 항원보강제, 사포닌, 퀼(Quil) A 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 및 아브리딘(Avridine) 지질-아민 항원보강제가 포함된다. 본 발명의 백신에서 유용한 수중유 에멀젼의 비-한정적 예에는 변경된 SEAM62 및 SEAM 1/2 제제가 포함된다. 변경된 SEAM62는 5%(부피/부피) 스쿠알렌(시그마), 1%(부피/부피) SPAN.RTM. 85 세제(아이씨아이 서팩턴츠(ICI Surfactants)), 0.7%(부피/부피) TWEEN.RTM. 80 세제(아이씨아이 서팩턴츠), 2.5%(부피/부피) 에탄올, 200 pg/ml 퀼 A, 100 [mgr]g/ml 콜레스테롤 및 0.5%(부피/부피) 레시틴을 함유하는 수중유 에멀젼이다. 변경된 SEAM 1/2는 5%(부피/부피) 스쿠알렌, 1%(부피/부피) SPAN.RTM. 85 세제, 0.7%(부피/부피) TWEEN 80 세제, 2.5%(부피/부피) 에탄올, 100 .mu.g/ml 퀼 A 및 50 .mu.g/ml 콜레스테롤을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 백신에 포함될 수 있는 다른 면역조절제는 예를 들면, 하나 이상의 인터류킨, 인터페론 또는 다른 공지된 사이토카인을 포함한다.
본 발명의 백신은 선택적으로 본 발명의 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 지속 방출하도록 제제화될 수 있다. 이러한 지속 방출 제제의 예에는 생체적합성 중합체, 예컨대, 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 메틸셀룰로스, 하이알루론산, 콜라겐 등의 합성물과 함께 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 약물 전달 비히클에서 분해가능한 중합체의 구조, 선택 및 사용은 본원에 참고로 도입되는 문헌[A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292]을 포함하는 여러 공개문헌에서 검토되어 있다. 약학 제제에서 중합체를 선택하고 사용하는 것에 대한 추가 지침은 당분야에서 공지되어 있는 교재, 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[M. Chasin and R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, N.Y.]에서 발견될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 투여 및 효능을 개선하도록 미세캡슐화될 수 있다. 항원을 미세캡슐화하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있고 예를 들면, 모두 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제3,137,631호, 미국 특허 제3,959,457호, 미국 특허 제4,205,060호, 미국 특허 제4,606,940호, 미국 특허 제4,744,933호, 미국 특허 제5,132,117호 및 국제 특허출원 공보 제WO 95/28227호에 기재된 기법을 포함한다.
리포좀을 사용하여 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 지속 방출을 제공할 수도 있다. 리포좀 제제를 제조하고 사용하는 방법에 관한 세부사항은 특히 모두 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,016,100호, 미국 특허 제4,452,747호, 미국 특허 제4,921,706호, 미국 특허 제4,927,637호, 미국 특허 제4,944,948호, 미국 특허 제5,008,050호 및 미국 특허 제5,009,956호에서 발견될 수 있다.
전술된 백신들 중 임의의 백신의 유효량은 낮은 투여량의 바이러스, 바이러스 단백질, 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 시작한 후 효과를 모니터링하면서 투여량을 증가시키는 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 유효량은 백신의 단회 투여 후에 또는 백신의 다회 투여 후에 수득될 수 있다. 동물 당 최적 투여량을 결정할 때 공지된 인자들이 고려될 수 있다. 이들은 동물의 종, 크기, 연령 및 일반적인 상태, 동물 내의 다른 약물의 존재 등을 포함한다. 실제 투여량은 바람직하게는 다른 동물 연구로부터의 결과를 고려한 후 선택된다(예를 들면, 하기 실시예 2 및 3 참조).
적절한 면역 반응이 달성되었는지를 검출하는 한 방법은 백신접종 후 동물에서 혈청전환 및 항체 역가를 측정하는 것이다. 백신접종의 시기 및 (존재하는 경우) 부스터(booster)의 횟수는 바람직하게는 모든 관련 인자들(이들 중 몇몇은 전술되어 있음)의 분석에 기초하여 의사 또는 수의사에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 바이러스, 단백질, 감염성 DNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 유효 투여량은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정될 수 있는 인자들, 예컨대, 백신접종될 동물의 체중을 고려하면서 공지된 기법을 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 백신에서 본 발명의 바이러스의 투여량은 바람직하게는 약 101 내지 약 109 pfu(플라크 형성 유닛), 보다 바람직하게는 약 102 내지 약 108 pfu, 가장 바람직하게는 약 103 내지 약 107 pfu이다. 본 발명의 백신에서 본 발명의 플라스미드의 투여량은 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100 mg, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mg, 훨씬 더 바람직하게는 약 10 내지 약 1 mg이다. 본 발명의 백신에서 본 발명의 감염성 DNA 분자의 투여량은 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100 mg, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mg, 훨씬 더 바람직하게는 약 10 내지 약 1 mg이다. 본 발명의 백신에서 본 발명의 바이러스 벡터의 투여량은 바람직하게는 약 101 내지 약 109 pfu, 보다 바람직하게는 약 102 내지 약 108 pfu, 훨씬 더 바람직하게는 약 103 내지 약 107 pfu이다. 적합한 투여량 크기 범위는 약 0.5 내지 약 10 ml, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 5 ml이다.
본 발명의 실시에 따른 바이러스 단백질 또는 펩티드 백신에 적합한 투여량은 일반적으로 투여 당 1 내지 50 ㎍이거나, 각각의 이러한 물질과 관련하여 인정된 방법에 의해 측정될 항원보강제의 양과 함께 표준 방법에 의해 측정될 수 있는 보다 높은 양이다. 돼지의 백신접종에 관한 본 발명의 바람직한 실시예에서, 동물에 대한 최적 표적 연령은 다른 예정된 백신접종, 예컨대, 마이코플라스마 하이요뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 PCV에 대한 백신접종과 상응할 수 있는 이유 전 약 1 내지 21일이다. 추가로, 사육중인 경산돈에 대한 백신접종의 바람직한 스케쥴은 해마다 수행되는 재백신접종 스케쥴과 유사한 투여량을 포함할 것이다.
전술된 백신들 중 임의의 백신의 유효량은 낮은 투여량의 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 시작한 후 효과를 모니터링하면서 투여량을 증가시키는 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 유효량은 백신의 단회 투여 후에 또는 백신의 다회 투여 후에 수득될 수 있다. 동물 당 최적 투여량을 결정할 때 공지된 인자들이 고려될 수 있다. 이들은 동물의 종, 크기, 연령 및 일반적인 상태, 동물 내의 다른 약물의 존재 등을 포함한다. 실제 투여량은 바람직하게는 다른 동물 연구로부터의 결과를 고려한 후 선택된다.
적절한 면역 반응이 달성되었는지를 검출하는 한 방법은 백신접종 후 동물에서 혈청전환 및 항체 역가를 측정하는 것이다. 백신접종의 시기 및 (존재하는 경우) 부스터의 횟수는 바람직하게는 모든 관련 인자들(이들 중 몇몇은 전술되어 있음)의 분석에 기초하여 의사 또는 수의사에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 유효 투여량은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정될 수 있는 인자들, 예컨대, 백신접종될 동물의 체중을 고려하면서 공지된 기법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 백신은 경구, 비경구, 진피내, 피하, 근육내, 비강내 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 경구 전달은 예를 들면, 조성물을 동물의 사료 또는 음료에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 백신 투여량 결정의 기초가 되는 인자는 예를 들면, 돼지의 체중 및 연령을 포함한다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 PRRS 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 및 바이러스 벡터 중 하나를 약학적 또는 수의학적 사용을 위해 허용될 수 있는 담체와 조합하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 PRRS 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 백신을 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
추가로, 본 발명의 약독화된 생백신을 미국 특허 제6,500,662호에 기재된 바와 같이 변경시켜 이종 항원성 에피토프를 코딩할 수 있고, 상기 이종 항원성 에피토프를 공지된 재조합 기법을 이용하여 PRRS 바이러스 게놈 내로 삽입한다. 참고로 전체적으로 도입되는 미국 특허 제7,132,106호도 참조한다. 본 발명을 위한 이종 항원성 에피토프로서 유용한 항원성 에피토프는 돼지 파보바이러스, 돼지 서코바이러스, 돼지 로타바이러스, 돼지 인플루엔자, 가광견병 바이러스, 전염가능한 위장염 바이러스, 돼지 호흡기 코로나바이러스, 고전적인 돼지 발열 바이러스, 아프리카 돼지 발열 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 돼지 파라믹소바이러스, 토크 테노(torque teno) 바이러스, 악티노바실러스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 바실러스 안쓰라시(Bacillus anthraci), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 클로스트리듐 해모라이티쿰(Clostridium haemolyticum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로쓰릭스 루시오패씨아(Erysipelothrix rhusiopathiae), 해모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 렙토스피라(Leptospira) 종, 마이코플라스마 하이요뉴모니아, 마이코플라스마 하이요리니스(Mycoplasma hyorhinis), 마이코플라스마 하이요시노비아(Mycoplasma hyosynovia), 파스테우렐라 뮬토시다(Pasteurella multocida), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 티피뮤륨(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 에퀴스밀리스(Streptococcus equismilis) 및 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)로 구성된 군으로부터 선택된 돼지 병원체로부터의 항원성 에피토프를 포함하나 이들로 한정되지 않는, PRRS 바이러스 이외의 돼지 병원체로부터의 항원성 에피토프를 포함한다. 전술된 돼지 병원체들로부터의 항원성 에피토프를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당분야에서 공지되어 있고 전세계 웹, 예컨대, (미국) 국립 생물공학정보센터로부터의 진뱅크 상의 공용 유전자 데이터베이스로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 추가 특징 및 변이는 상세한 설명을 포함하는 본원 전체로부터 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이고, 모든 이러한 특징들은 본 발명의 양태로서 간주된다. 마찬가지로, 본원에 기재된 본 발명의 특징들은 특징들의 조합이 본 발명의 양태 또는 실시양태로서 구체적으로 전술되어 있는지 여부와 관계없이 본 발명의 양태로서 간주되는 추가 실시양태와 재조합될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 핵심적인 것으로서 본원에 기재된 한계점만이 그 자체로서 고려되어야 하고, 본원에서 핵심적인 것으로서 기재되지 않은 한계점을 결여하는 본 발명의 변이는 본 발명의 양태로서 간주된다. 본 발명이 상기 설명 및 실시예에 구체적으로 기재된 것과 다른 방식으로 실시될 수 있다는 것은 명확할 것이다.
본 발명의 다수의 변경 및 변이는 상기 교시에 비추어 볼 때 가능하므로 본 발명의 범위 내에 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
PRRSV 단리물 P129의 PK-9 세포에의 적응 및 약독화
독성 PRRS 단리물 P129는 1995년 미국 인디애나주 퍼듀 대학(Purdue University)의 동물 질환 진단 실험실에서 병든 돼지로부터 단리되었다. 이 돼지로부터의 혈청 샘플을 매우 건강한 상태의 돼지에서 1회 계대감염하여 혈청 및 폐 균질화물 스톡을 증폭시켰다. 상기 혈청 및 폐 균질화물로부터 바이러스 RNA를 추출하고 P129 계대감염 0 바이러스의 완전 게놈 컨센서스 서열의 확인에 사용하였다. RNA를 먼저 랜덤 육량체로 프라이밍하고 cDNA의 합성에 사용하였다. 고도 정확성(high fidelity)(교정(proofreading)) PCR을 이용하여 상기 게놈을 3개의 중복 조각으로 증폭하였다. (게놈 분절 당) 3회의 별도 PCR 반응으로부터의 PCR 생성물을 T/A 클로닝하고 DNA 서열분석에 사용하여 전장 게놈 컨센서스 서열(서열번호 1 참조)을 발생시켰다.
P129 계대감염 0을 함유하는, DNA 서열분석을 위해 사용된 상기 돼지 혈청의 분취액을 사용하여 일차 돼지 폐포 대식세포(PAM)를 감염시켰다. PAM 감염(계대감염 1)으로부터의 자손 바이러스를 0.1 ㎛ 주사기 필터를 통해 여과하고 사용하여 PK-9 세포를 감염시켰다.
PK-9 세포는 PK0809 돼지 신장 세포주를, 돼지 CD163 유전자의 결실된 버전 및 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 플라스미드로 안정하게 형질감염시킴으로써 유도된 형질전환 세포주이다. PK-9 세포주의 구축 및 특징규명에 대한 세부설명은 이미 기재되어 있다.
PAM 세포로부터의 계대감염 1 바이러스를 PK-9 세포 상에서 증식하도록 적응시키는 것은 어려웠고 다수의 유사한 계통들을 사용하는 여러 번의 시도를 필요로 하였다. 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대해 특이적인 FITC-접합된 단일클론 항체 SDOW17(루랄 테크놀로지스 인코포레이티드(Rural Technologies Inc.), 미국 사우쓰다코타주 브룩킹스 소재)을 사용하는 중복 웰의 면역형광으로 감염을 모니터링하였다. 초기 계대감염은 소수의 작은 초점(foci)을 발생시켰지만 새로운 단일층의 감염을 개시할 정도로 충분한 세포 부재 바이러스 입자를 발생시키지 못하였다. 이들 계대감염들은 감염된 단일층을 아큐타제(Accutase)(트립신 대체물)로 처리하고 세포를 다수의 웰에서 비-형질감염된 PK-9 세포가 첨가된 또는 첨가되지 않은 새로운 배지로 재시딩함으로써 달성되었다. 이러한 여러 번의 계대감염 후, 몇몇 계통들은 형광 초점의 빈도 및 크기에서의 명확한 증가를 보였다. 이들 중 일부는 세포 부재 바이러스 유체의 사용을 통해 계대감염되는 능력을 획득하였다. 계대감염 17까지(PAM 세포 상에서의 계대감염 1, PK-9 상에서의 계대감염 16), 이전 계대감염으로부터의 세포 부재 유체의 희석물을 사용하여 한 계통을 신뢰가능하게 유지할 수 있었고, 상기 계통은 수일 이내에 전체 단일층을 감염시켰다. 상기 바이러스는 임의의 계대감염 수준에서 PK-9 세포에 대한 세포변성(cytopathic) 효과를 야기하지 않았다. 바이러스 계대감염 17에서 RNA를 감염된 PK-9 세포로부터 추출하고 감염성 cDNA 클론의 구축에 사용하였다.
실시예 2
P129-PK 계대감염 17의 감염성 cDNA 클론의 구축
전술된 바와 같이, 골격(backbone) 플라스미드를 사용하여 P129-PK 계대감염 17 바이러스의 감염성 cDNA 클론을 구축하였다. 역전사 및 PCR을 이용하여 상기 바이러스의 게놈을, 중복 영역에서 천연 발생 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 부위를 갖는 3개의 중복 분절로 증폭시켰다. 3회의 별도 PCR 반응으로부터의 생성물을 클로닝하고 서열분석하고 정렬하여 각각의 게놈 분절에 대한 컨센서스 서열을 발생시켰다. 주어진 분절의 3개 클로닝된 생성물들 중 어느 생성물도 그 분절에 대한 예측된 컨센서스 아미노산 서열과 매칭되지 않는 경우, 상기 생성물이 상기 예측된 컨센서스 아미노산 서열에 매칭될 때까지 클론들 중 하나를 서브클로닝 및/또는 부위-지정된 돌연변이유발로 변경시켰다. 표준 클로닝 기법 및 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여 상기 3개의 게놈 분절들과 플라스미드 골격을 연결하였다. pCMV-S-P129-PK17-FL로 명명된 발생된 전장 클론은 PK-9 세포 내로 형질감염되었을 때 감염성을 나타내었다. 이 감염성 cDNA 클론의 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다. 게놈은 이것의 구축에 사용된, 진짜 말단을 갖는 계대감염 17 바이러스와 본질적으로 동일하고, 계대감염 17의 컨센서스 서열에 비해 상대적으로 임의의 삽입 또는 결실을 결여한다. 이 감염성 cDNA 클론의 바이러스 게놈 내에는 조작된 제한 부위 또는 다른 표적화된 변화가 존재하지 않는다.
P129 계대감염 0의 완전 게놈 컨센서스 서열과 감염성 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL의 게놈 서열 사이의 뉴클레오티드 및 아미노산 차이는 표 6에 개별적으로 나열되어 있다. 표 6은 모든 뉴클레오티드 차이 및 발생된 아미노산 차이를 게놈 위치별로 포함한다. 이들 돌연변이들의 부분집합은 IFN 억제(계대감염 0)에서 IFN 비-억제(계대감염 17 감염성 cDNA 클론으로부터 유도된 모든 바이러스들)로의 표현형적 변화의 원인이 된다. 표 7은 뉴클레오티드, 아미노산 및 비-보존된 아미노산 차이를 PRRSV 개방 판독 프레임(ORF) 또는 비-구조 단백질(nsp)별로 요약한다. 표 7의 목적을 위해, 보존되는 것으로서 간주되는 아미노산 군들 중에는 하기 아미노산 군들이 있다: [K, R], [D, E], [L, I, V, A], 및 [S, T].
실시예 3
P129-PK 계대감염 17에서의 결실 돌연변이체
게놈의 2개 영역들 내에서의 결실을 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL 내로 조작 도입하여 5종의 유전적으로 변경된 감염성 클론들을 발생시켰다.
변경될 게놈의 한 영역은 (PRRSV ORF7에 의해 코딩된) 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 위치 41 내지 47에 위치하는 핵 국소화 서열(NLS)이었다. 두 유형의 결실이 만들어졌다. 이들 결실들은 또 다른 PRRSV 감염성 클론과 관련하여 이미 기재되어 있다. 아미노산 잔기 41 내지 49의 야생형 서열은 PG...KN이다. "PG--KS"로서도 공지되어 있는 돌연변이체 "d43/44"에서, 라이신 잔기 43 및 44는 결실되어 있고 아스파라긴 잔기 49는 세린으로 변경되어 있다. "PG--S-KS"로서도 공지되어 있는 돌연변이체 "d43/44/46"에서, 라이신 잔기 43, 44 및 46은 결실되어 있고, 아스파라긴 잔기 49는 세린으로 변경되어 있다. 이들 결실들을 포함하는, pCMV-S-P129-PK17-FL로부터 유도된 감염성 클론들은 각각 pCMV-S-P129-PK17-d43/44 및 pCMV-S-P129-PK17-d43/44/46이다. 미국 특허 제7,544,362호를 참조한다.
변경될 게놈의 제2 영역은 ORF1a 내의 nsp2의 초가변 영역에 존재하였다. 131개의 아미노산(393개의 뉴클레오티드)의 결실이 또 다른 PRRSV 감염성 클론과 관련하여 이미 기재되어 있다. 이러한 결실을 포함하는, pCMV-S-P129-PK17-FL로부터 유도된 감염성 클론은 pCMV-S-P129-PK17-nsp2이다.
NLS 결실과 nsp2 결실을 겸비하는 감염성 클론도 pCMV-S-P129-PK17-FL 골격 내에서 발생되었고, 이들은 pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44 및 pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46으로 명명되었다.
실시예 4
PK-9 세포 상에서의 바이러스의 발생 및 증식
실시예 3에 기재된 6종의 감염성 클론들을 PK-9 세포 내로 형질감염시켜 표 1에 제시된 6종의 바이러스들을 발생시켰다. 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 사용하여 원형 플라스미드를 PK-9 세포 내로 직접적으로 형질감염시킴으로써 이들 감염성 클론들로부터 바이러스를 발생시켰다. 형질감염 후, 역가를 더 증가시키고 독성을 약화시키기 위해 회수된 바이러스를 PK-9 세포 상에서 다시 연속적으로 계대감염시켰다. 백신 후보물질로서의 시험관내 시험 및 생체내 평가를 위해 스톡을 만들었다. 비-변경된 pCMV-S-P129-PK17-FL 감염성 클론으로부터 유도된 P129-PK17-FL 바이러스의 경우, 상기 바이러스를 돼지로부터 총 52회 계대감염에 도달할 때까지 배양하였다. 이 바이러스의 완전 게놈을 계대감염 24(서열번호 3) 및 52(서열번호 6)에서 서열분석하였다.
실시예 5
P129 - PK 계대감염 17 감염성 cDNA 클론으로부터 유도된 바이러스는 IFN -α 유도를 억제하는 감소된 능력을 갖는다.
바이러스 및 세포. MARC-145 및 ST 세포를 5% 태아소 혈청(FBS) 및 항생제(50 ㎍/ml 젠타미신, 100 UI 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신)로 보충된 변경된 이글(Eagle) 배지(MEM)에서 증식시켰다. 돼지 폐포 대식세포 ZMAC-1 세포를 10% FBS로 보충된 RPMI-1640에서 증식시켰다. 변경된 이글 배지에서 전면생장(confluent) ST 세포 단일층을 0.01의 다중도(multiplicity)로 감염시킴으로써 TGE 바이러스 균주 퍼듀(Purdue)를 제조하였다. 상기 바이러스 접종물을 1시간 후 제거하고, 세포를 5% CO2 대기 하에 37℃에서 2.5% FBS로 보충된 MEM에서 항온처리하였다. 80% 세포변성 효과가 관찰된 후 상기 세포 단일층을 냉동시키고 해동시킴으로써 바이러스를 방출시켰다. TGE 바이러스 스톡을 4℃에서 3,500 rpm으로 15분 동안 원심분리하고 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. (PK-9 세포로부터의) 바이러스 스톡은 다음과 같았다: P129-PK-FL 및 P129-PK-dnsp2-d43/44/46은 계대감염 8/25에서 존재하였다(감염성 클론으로부터 8, 돼지로부터 25). 다른 4종의 바이러스들(P129-PK-d43/44, P129-PK-d43/44/46, P129-PK-dnsp2 및 P129-PK-dnsp2-d43/44)은 계대감염 21/38에서 존재하였다. 상업적 백신 인겔백 PRRS MLV 및 인겔백 PRRS ATP를 제조자의 지시에 따라 재구성하여 감염에 직접적으로 사용하였다는 점을 제외하고 ZMAC-1 세포 상에서 단회 계대감염을 수행함으로써 다양한 PRRS 바이러스들의 작업용 스톡을 제조하였다.
돼지 PBMC의 단리. 헤파린처리된 신선한 정맥혈을 행크 용액으로 희석하고, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 1077(시그마) 구배를 통한 밀도 원심분리로 PBMC를 단리하였다. 세포를 행크 용액으로 2회 세척한 후, 상기 세포를 5% 태아소 혈청(깁코), 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨, 1x 비-필수 아미노산(메디아텍(Mediatech)), 100 U/ml 젠타미신 및 250 mM 2-머캡토에탄올(시그마(Sigma))로 보충된, L-글루타민(메디아텍)을 갖는 RPMI 배지에 현탁하였다.
돼지 플라스마사이토이드 수지상세포의 정제. 돼지 플라스마사이토이드 수지상세포의 정제는 이미 기재된 바와 같이(문헌[Calzada-Nova], 제출됨) 수행되었고, 이들 세포들에 의한 CD4 및 CD172의 특징적인 발현에 기초하였다(문헌[Summerfield et al., 2003]). 요약하건대, 신선한 돼지 PBMC를 0.5% BSA를 갖는 PBS에 현탁하고 최적 양의 돼지 CD172 인식 mAb(74-22-15, VMRD)로 표지하였다. 1회 세척한 후, 상기 세포를 PE에 접합된 이차 염소 항-마우스 항체(서던 바이오텍(Southern Biotech))와 함께 항온처리하였고, 세척 후 FITC-표지된 항-CD4(74-12-4, VMRD)와 함께 항온처리하였다. 분류 게이트(gate)가 CD4+/CD172low 집단에 대해 설정되어 있는 반사 세포 분류기(iCyt) 상에서 PDC를 분류하였다. 분류 후, 세포의 순도를 재분석으로 확인하였다. 모든 경우에서, 순도는 95% 초과이었다.
사이토카인 분비 측정을 위한 분석. PBMC 또는 PDC를 상이한 자극제들로 (37℃, 5% CO2) 16시간 동안 자극하였거나 모의물(mock)로 자극하였다. 항온처리 후, 상업적으로 입수가능한 단일클론 항체(항-돼지 IFN-α mAbs K9 및 F17)로 제조된 샌드위치 ELISA를 이용하여 상기 자극된 세포를 덮는 배지를 IFN-α의 존재에 대해 분석하였다. 요약하건대, 임뮬론(Immulon) II 플레이트(다이나테크 인코포레이티드(Dynatech Inc.))를 4℃에서 밤새 항온처리하여 항-돼지 IFN-α mAb F17(피비엘 레이보레이토리스(PBLLaboratories))로 코팅한 후 5% 태아소 혈청으로 보충된 RPMI 배지로 차단하였다. 1시간 후, 배지를 따라 내고, 시험될 50 ㎕의 상청액을 이중으로 분석 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 항온처리한 후, 상기 분석 웰을 4회 세척한 다음, 바이오틴-표지된 항-돼지 IFN-α mAb K9(피비엘 레이보레이토리스), HRP-접합된 스트렙타비딘(자이메드 레이보레이토리스(Zymed Laboratories)) 및 TMB 기질(KPL)과 함께 순차적으로 항온처리하였다. 광학 밀도를 ELISA 플레이트 판독기로 측정하였다.
P129-PK 계대감염 17 감염성 cDNA 클론으로부터 유도된 바이러스는 IFN-α 유도를 억제하는 능력을 결여한다. 돼지 폐포 대식세포주 ZMAC-1을 사용하여 4종의 상이한 PRRS 야생형 바이러스 단리물들(P3412, P129, IND5, NADC20)의 군으로부터 작업용 바이러스 스톡을 제조하였다. 또한, PK-9, FK.D4 또는 MARC-145 세포에서 반복된 계대감염을 수행함으로써 세포 배양물에서 증식하도록 적응된, 처음 2종의 야생형 바이러스들의 유도체들로부터 추가 스톡을 제조하였다. 상기 4종의 야생형 단리물들 중 3종의 야생형 단리물들(P129, IND5, NADC20)은 ZMAC-1 세포에서 약 107 TCID50/ml의 역가까지 용이하게 효율적으로 증식한 반면, P3412 야생형 단리물은 단지 105 TCID50/ml의 역가에 도달하였다. 특히, ZMAC-1 세포주에서 제조된 P129 바이러스의 스톡은 상기 바이러스가 적응된 PK-9 또는 MARC-145 세포에서 수득된 역가보다 10배 더 높은 역가에 도달하였다. PBMC에 의한 IFN-α 분비를 자극하는 이들 바이러스의 능력의 조사는 한 경우(단리물 P3412 클론 C)를 제외하고, 매우 적은 양(<50 pg)의 IFN-α가 시험된 PRRS 바이러스 스톡들 중 임의의 PRRS 바이러스 스톡에의 노출에 반응하여 이들 세포들에 의해 분비되었는데, 이 양은 전염가능한 위장염 바이러스(TGEv)인 돼지 코로나바이러스에의 노출의 결과로서 동일한 세포에 의해 생성된 IFN-α의 풍부한 분비(17,540 pg)에 비해 무시할만하다는 것을 보여주었다.
PRRSV는 돼지 PBMC에 의한 IFN-α 생성을 자극할 수 없을 뿐만 아니라 그의 생성을 능동적으로 억제한다. PRRSV의 존재 또는 부재 하에 TGEv에의 노출에 반응하여 PBMC에 의해 분비된 IFN-α의 양을 측정함으로써 PRRSV 스톡의 억제 효과를 측정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 4종의 야생형 PRRS 바이러스 단리물들뿐만 아니라 모든 세포 배양물-적응된 유도체들도 TGEv에 대한 PBMC의 IFN-α 반응에 대한 강한 억제 효과(>80%)를 나타내었다. 전장 P129-PK-FL 바이러스 및 여러 유전적으로 조작된 결실 돌연변이체들을 포함하는, 감염성 cDNA 클론(pCMV-S-P129-PK17-FL)으로부터 유도된 바이러스 스톡 군의 분석을 수행하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 모 야생형 단리물 P129(계대감염 1)의 강한 억제 효과(95%)와 비교하였을 때, P129-PK-FL 바이러스 및 모든 결실 돌연변이체들은 PBMC에서 TGEv에 의한 IFN-α의 유도를 억제하는 유의하게 감소된 능력을 나타내었다. 이들 바이러스들의 IFN-α 표현형을 더 평가하기 위해, 후속 실험을 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스, 모 P129 야생형 균주, 및/또는 뵈링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim)에 의해 제조된 2종의 상업적으로 입수가능한 변경된 PRRSV 생백신(인겔백 PRRS MLV 및 인겔백 PRRS ATP) 사이의 직접적인 비교를 수행하는 데에 집중시켰다. 추가 저-계대감염 기준 단리물인 NVSL-14도 시험하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 4회의 독립적인 실험에서, P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44는 모 P129 바이러스, 상기 2종의 인겔백 약독화된 균주 또는 기준 균주보다 유의하게 더 낮은 IFN-α 억제 효과를 나타내었다. 한 경우에서, P129-PK-FL 또는 P129-PK-d43/44 바이러스에 의한 동시감염은 TGEv에 대한 IFN-α 반응을 명확히 향상시켰다.
표 2에 나타낸 결과는 세포 배양물에서 증식하도록 적응된 야생형 PRRS 바이러스 및 유도체의 인터페론-α 억제 효과를 표시한다. 표시된 PRRS 바이러스 스톡들을 ZMAC-1 세포에서 증식시켰고, 이들 새로 발생된 스톡들의 역가를 ZMAC-1 세포를 사용하여 측정하였다. TGE 바이러스의 존재 또는 부재 하에 표시된 PRRS 바이러스 스톡에 18시간 동안 노출된 돼지 말초혈 단핵세포의 배양 상청액에 존재하는 IFN-α의 양을 ELISA로 측정하였다(*TGEv 단독에 대한 반응).
표 3에 나타낸 결과는 CD163 발현 PK-9 세포에서 증식하도록 적응된 야생형 PRRS 바이러스 P129 및 이의 유전적으로 조작된 유도체의 인터페론-α 억제 효과를 입증한다. TGE 바이러스의 존재 또는 부재 하에 표시된 PRRS 바이러스 스톡에 18시간 동안 노출된 돼지 말초혈 단핵세포(PBMC)의 배양 상청액에 존재하는 IFN-α의 양을 ELISA로 측정하였다(na = 적용불가능함; *TGEv 단독에 대한 반응).
표 4는 야생형 P129 바이러스 및 PRRS 인겔백 백신에 비해 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스의 감소된 인터페론-α 억제 효과를 보여준다. TGE 바이러스의 존재 또는 부재 하에 표시된 PRRS 바이러스 스톡에 18시간 동안 노출된 돼지 말초혈 단핵세포(PBMC)의 배양 상청액에 존재하는 IFN-α의 양을 ELISA로 측정하였다(na = 적용불가능함; *TGEv 단독에 대한 반응).
TGEV에의 노출에 반응하여 PBMC에 의해 분비된 풍부한 양의 IFN-α는 PBMC 집단의 0.3% 미만을 차지하는 세포 부분집합으로부터 주로 유도된다. 이 희귀하지만 중요한 세포 부분집합은 특징적인 플라스마사이토이드 형태로 인해 이 명칭을 부여받은 플라스마사이토이드 수지상세포(PDC)로 구성된다. P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스의 IFN-α 표현형을 더 조사하기 위해, 95% 초과의 순도까지 PBMC로부터 새로 단리된 PDC를 사용하였다는 점을 제외하고 전술된 일련의 실험들과 유사한 일련의 실험들을 수행하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이 일련의 실험들은 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스가 TGEV에 의한 IFN-α 유도의 무시할만한 억제를 야기한다는 것을 확인시켜 주었다. 나아가, 한 실험에서, P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 PRRS 바이러스에 반응하여 일어나는 PDC에 의한 TGEV-매개된 IFN-α 유도에 대한 명확한 향상 효과가 관찰되었다. 대조적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 인겔백 PRRS MLV 바이러스는 IFN-α 반응에 대한 강한 억제 효과를 나타내었다.
실험 단락에 기재된 결과는 P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 PRRS 바이러스뿐만 아니라 pCMV-S-P129-PK17-FL 감염성 cDNA 클론의 다른 유도체도 감염된 PBMC 또는 PDC 세포에서 TGEV에 의한 IFN-α의 유도를 억제하는 크게 감소된 능력을 갖는다는 것을 보여준다. 이것은 야생형(저-계대감염) PRRS 바이러스 및 2종의 상업적으로 입수가능한 변경된 생바이러스 백신(인겔백 PRRS MLV 및 인겔백 PRRS ATP)을 사용하였을 때 관찰된 IFN 억제 효과와 현저히 대조된다. P129-PK-FL 및 P129-PK-d43/44 바이러스가 PDC의 이 중요한 기능을 최소한으로 억제한다는 관찰결과는, 이들 세포들이 바이러스 감염에 대한 선천성 면역을 매개함에 있어서 주요 역할을 수행하는 한, 잠재적으로 유의하다.
본 발명이 CD163 수용체를 재조합적으로 발현하는 허용 세포 상에서 증식하도록 적응된 임상적으로 효과적인 상업적 백신 바이러스를 제공하고, 이러한 바이러스 및 백신이 역사적인 "유인원 세포" 배양 기술에 의존하지 않고 이 배양 기술에 의해 어느 시점에서도 개발되지 않았다는 것을 인식해야 한다. 구체적으로 미국 특허 제7,754,464호를 참조한다.
실시예 6
백신 후보물질의 안전성 및 효능
PRRS에 대한 백신으로서의 안전성 및 효능을 평가하기 위해, pCMV-S-P129-PK17-FL 감염성 cDNA 클론으로부터 유도된 3종의 바이러스들, 즉 P129-PK-FL(계대감염 7/24), P129-PK-d43/44(계대감염 17/34) 및 P129-PK-d43/44/46(계대감염 17/34)을 어린 돼지 호흡기 질환 모델에서 평가하였다. 이들 바이러스들의 기원은 도 8에 제시되어 있고, 실험 디자인(치료군)은 표 5에 나열되어 있다. 저-계대감염 독성 PRRSV 단리물 NADC20을 7주령(백신접종 후 4주)에서 이종 챌린지에 사용하였다. 대조 치료군은 모의물 백신 및 상업적 PRRS 백신 인겔백 MLV를 포함하였다.
비-치료(NT)군은 다음과 같았다: NT1 돼지들을 관찰하여 공급원 돼지의 건강 상태를 모니터링하였다. 이들을 별도로 수용하였고 PRRSV 챌린지 전에 부검하였다. NT2 돼지들은 백신접종된 돼지들(T02 내지 T05 각각에 대해 치료군 당 총 2마리)의 2개 축사들 사이의 축사에서 별도로 수용된 접촉 대조군이었다. NT3 돼지들은 백십접종된 돼지들(치료군(T01 내지 T05) 당 총 2마리)을 갖는 축사 당 1마리씩 수용된 접촉 대조군이었다. NT3 돼지들만이 T01 군으로 배정되었다.
백신접종 후, 백신접종된 동물들의 직장 온도를 측정하여 T01(모의물 백신) 치료군과 비교하였다. 결과는 도 1에 제시되어 있다. 백신들 중 어떤 백신도 발열을 유도하지 않았다. 모든 군들의 평균 직장 온도는 백신접종 후 관찰 기간 전체에 걸쳐 104℃ 미만이었다.
챌린지 후, 돼지의 직장 온도를 측정하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있다. 백신접종받지 않은 T01 돼지들은 104℃ 초과의 유지된 발열을 보였다. 대조적으로, 상기 3종의 백신들은 챌린지 후 발열을 유의하게 감소시켰다. P129-PK-FL은 발열의 감소에서 가장 효과적이었다.
동물들의 체중을 백신접종 전 및 후에 기록하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있다. 체중을 연구의 -1일째 날(백신접종 전), 10일째 날, 24일째 날, 27일째 날(챌린지 전) 및 37일째 날에 기록하였다. 백신접종받지 않은 돼지들에서, 독성 NADC20 바이러스를 사용한 챌린지는 10일의 관찰 기간 동안 체중 증가를 거의 완전히 방지하였다. 상기 백신들은 다양한 정도로 이 효과를 무효화하였다.
챌린지된 동물들의 폐를 챌린지 후 부검시 조사하였다. 병소에 관여하는 각각의 폐의 백분율은 도 4에 제시되어 있다. T01 모의물 백신 군의 평균 폐 병소 관여는 25.1%이었다. 상기 백신들은 다양한 정도로 폐 병소를 감소시켰다. P129-PK-FL은 가장 효과적이었고 폐 병소 관여를 1.1%까지 감소시켰다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 폐 평가 점수(LAS)를 이용하여 폐 병소의 중증도를 평가하였다. 상기 3종의 백신들은 LAS를 감소시켰다. P129-PK-FL은 모의물 백신접종된 군에서 평균 LAS를 1.63에서 0.14로 감소시켰다.
백신접종 및 챌린지 둘다로 PRRSV에 대한 혈청 항체를 유도하였다. 연구의 27일째 날 및 37일째 날에 IDEXX ELISA S/P 비를 측정하였다. 결과는 도 6에 제시되어 있다. P129-PK-FL을 사용한 백신접종은 가장 높은 수준의 항-PRRS 항체를 유도하였다.
챌린지된 돼지의 혈청 중의 바이러스혈증을 PAM 세포 상에서 적정하였다. 결과(TCID50/mL)는 도 7에 제시되어 있다. P129-PK-FL은 챌린지 후 바이러스혈증을 감소시킴에 있어서 가장 효과적이었다.
본 발명이 상기 실시예 및 첨부물(이들 각각의 전체 내용은 전체적으로 참고로 도입됨)에 대해 기재되어 있지만, 변경 및 변이가 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예 7
감염성 cDNA 클론 PCMV-S-P129로부터 감염성 cDNA 클론 PCMV-S-P129-PK17-FL의 유도
당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 부위-지정된 돌연변이유발 기법을 이용하여 전술된 PRRSV 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129로부터 본 발명의 PRRSV 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL을 용이하게 유도할 수 있다. PRRSV 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129는 미국 특허 제6,500,662호에 기재되어 있고 수탁번호 203489 하에 ATCC에 기탁되어 있다. 이 클론에서 PRRSV 게놈의 DNA 서열은 수탁번호 AF494042로서 진뱅크(NCBI) 데이터베이스에서도 입수가능하다. 부위-지정된 돌연변이유발 키트는 다수의 공급자들로부터 상업적으로 입수가능하고 큰 플라스미드 내의 다수의 부위에서 다수의 동시적인 뉴클레오티드 변화를 만들 수 있다. 이러한 키트는 체인지(Change)-IT(상표) 다중 돌연변이 부위-지정된 돌연변이유발 키트(아피메트릭스(Affymetrix)/USB), 퀵체인지 라이트닝(QuikChange Lightning) 다중 부위-지정된 돌연변이유발 키트(아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) - 스트라타진 프로덕츠(Stratagene Products)), 및 AMAP 다중 부위-지정된 돌연변이유발 키트(엠비엘 인터네셔날(MBL International))를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
PRRSV 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129(ATCC로부터 입수가능함)와 본 발명의 PRRSV 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL 사이의 뉴클레오티드 변화의 목록은 표 8에 제시되어 있다. 모든 변화들이 게놈의 단백질 코딩 영역에 존재한다. 상업적 부위-지정된 돌연변이유발 키트와 함께 74개의 돌연변이유발성 프라이머들 및 다수의 순차적인 반응들을 이용하여 pCMV-S-P129 감염성 클론 내로 도입하여 본원에 기재된 pCMV-S-P129-PK17-FL과 서열 면에서 동일한 플라스미드 분자를 발생시킬 수 있는 총 74개의 뉴클레오티드 변화가 존재한다. 실제로, 단일 돌연변이유발성 프라이머를 사용하여 약 50개 내지 60개의 뉴클레오티드들 내의 돌연변이들의 클러스터(cluster)를 서로 변화시킬 수 있기 때문에 74개 미만의 돌연변이유발성 프라이머들을 사용하여 동일한 결과를 수득할 수 있다. 예를 들면, 단일 돌연변이유발성 프라이머를 사용하여 뉴클레오티드 965, 992 및 1009일 수 있는 뉴클레오티드 735, 750 및 756을 변화시킬 수 있다. 따라서, 프라이머의 수는 약 60까지 감소된다.
상기 74개의 뉴클레오티드 변화들 중 대다수(42개)가 동일한 의미를 갖는 변화 또는 "침묵" 변화인데, 이것은 이들이 동일한 아미노산을 코딩한다는 것을 의미한다. 이들 뉴클레오티드 변화들은 상기 바이러스의 인터페론 유도 또는 억제 표현형에 대한 임의의 측정가능한 효과를 가질 것 같지 않다. 남은 32개의 뉴클레오티드 변화들은 동일한 의미를 갖지 않는 변화 또는 "비-침묵" 변화이고, 바이러스 단백질에서 아미노산 변화를 초래한다. 이들 32개의 뉴클레오티드 변화들은 상기 바이러스의 인터페론 유도/억제 표현형의 직접적인 원인이 되는 것으로 예측되고 감염성 클론 pCMV-S-P129에 의해 코딩된 바이러스를 감염성 클론 pCMV-S-P129-PK17-FL에 의해 코딩된 바이러스에 의해 나타나는 인터페론 표현형과 동일한 인터페론 표현형으로 전환시키도록 변화되어야 한다. 이러한 변화는 관련 뉴클레오티드들 중 일부의 클러스터링을 고려한 경우조차도 최대 32개의 돌연변이유발성 프라이머들을 필요로 할 것이다.
실시예 8
감염성 cDNA 클론 PCMV-S-P129-PK17-FL의 드 노보 합성
부위-지정된 돌연변이유발에 대한 대안으로서, 적절한 5' 및 3' 어댑터 서열들을 이용하여 본 발명의 PRRS 바이러스 게놈을 드 노보로 화학적으로 합성할 수 있고 PRRS 감염성 cDNA 클론 pCMV-S-P129(수탁번호 203489로서 ATCC로부터 입수가능함)를 위해 사용된 플라스미드 골격 또는 유사한 플라스미드 골격 내로 클로닝할 수 있다. 50 kb 초과의 길이(PRRSV 게놈은 약 15.5 kb임)를 갖는 유전자의 주문제작 합성은 진스크립트(GenScript), DNA 2.0 및 바이오 베이직 인코포레이티드(Bio Basic Inc.)를 포함하나 (이들로 한정되지 않는) 다수의 판매회사로부터 상업적 서비스로서 이용가능하다. 게놈의 측면에 위치하는 5' PacI 및 3' SpeI 제한 효소 부위를 이용하여 감염성 클론 pCMV-S-P129에서 바이러스 게놈을 치환시킴으로써 합성 바이러스 게놈을 pCMV-S 벡터 내로 직접적으로 클로닝한다. 상기 합성 게놈을 절단하기 위해, 24-뉴클레오티드 연장부(밑줄로 표시된 PacI 부위를 포함하는 5'-GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-게놈-3')를 상기 합성 게놈의 5' 말단 내에 구축하고, 83-뉴클레오티드 연장부(밑줄로 표시된 SpeI 부위를 포함하는 5'-게놈-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3')를 상기 합성 게놈의 3' 말단 내에 구축한다. 플라스미드 및 합성 게놈을 PacI 및 SpeI로 절단한 후, 적절한 단편들을 정제하고, DNA 리가제(ligase)를 사용하여 연결하고, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 잘 공지되어 있는 표준 클로닝 기법을 이용하여 스크리닝 및 증식을 위해 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 내로 형질전환시킨다.
생물학적 물질의 기탁
하기 생물학적 물질들(미국 특허 제6,500,662호 참조)은 1998년 11월 19일자로 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 기탁되었고 하기 수탁번호를 배정받았다.
플라스미드 pT7P129A, 수탁번호 203488
플라스미드 pCMV-S-P129, 수탁번호 203489
하기 미국 특허들의 완전한 본문 및 개시내용은 전체적으로 기재된 것처럼 본원에 참고로 도입된다: 미국 특허 제6,500,662호 및 제7,618,797호.
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SEQUENCE LISTING <110> Zoetis LLC <120> NORTH AMERICAN PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME (PRRS) VIRUS AND USES THEREOF <130> PC33979A <140> PCT/IB2011/055003 <141> 2011-11-09 <150> US 61/412,006 <151> 2010-11-10 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P129-PK-FL passage 17 complete genome (15,450 nt) full length infectious clone <400> 1 atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60 ggcacagccc aaaacttgct gcacggaaaa cgcccttctg tgacagcctt cttcagggga 120 gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ctggagttgc actgctttac ggtctctcca 180 cccctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240 ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300 tgaatctcca agttcctgag cttggggtgc tgggcctatt ttataggccc gaagagccac 360 tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgtcgagtg ctcccctgcc ggggcctgct 420 ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa 480 gaatggtgcg ggttgcagct 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cggtgacgca cctgaaattg gtctccctta 8100 caagctgtac cctgttaggg gcaaccctga gcgggtaaaa ggagttttac agaatacaag 8160 gtttggagac ataccttaca aaacccccag tgacactggg agcccagtgc acgcggctgc 8220 ctgcctcacg cccaatgcca ctccggtgac tgatgggcgc tccgtcttgg ctactaccat 8280 gccctccggt tttgaattgt atgtaccgac cattccagcg tctgtccttg attatcttga 8340 ctctaggcct gactgcccca aacagttgac agagcacggc tgtgaggatg ccgcattgag 8400 agacctctcc aagtatgact tgtccaccca aggctttgtt ttacctgggg ttcttcgcct 8460 tgtgcgtaag tacctgtttg cccacgtggg taagtgcccg cccgttcatc ggccttccac 8520 ttaccctgcc aagaattcta tggctggaat aaatgggaac aggtttccaa ccaaggacat 8580 tcagagcgtc cccgaaatcg acgttctgtg cgcacaggcc gtgcgagaaa actggcaaac 8640 tgttacccct tgtaccctca agaaacagta ttgtgggaag aagaagacta ggacaatact 8700 cggcaccaat aatttcattg cgttggccca ccgggcagcg ttgagtggtg tcacccaggg 8760 cttcatgaaa aaggcgttta actcgcccat cgccctcggg aaaaacaaat ttaaggagct 8820 acagactccg atcttaggca ggtgccttga agctgatctt gcatcctgtg atcgatccac 8880 acctgcaatt gtccgctggt ttgccgccaa 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gtcggggttt cgagccccgg gaaagccgca aaagcagtgt gcacattgac 11460 ggatgtgtac ctcccagacc ttgaggccta cctccaccca gagactcagt ccaagtgctg 11520 gaaagttatg ttggacttca aggaagttcg actgatggtc tggaaagaca agacggccta 11580 tttccaactt gaaggccgct atttcacctg gtatcagctt gcaagctacg cctcgtacat 11640 ccgtgttcct gtcaactcca cggtgtatct ggacccctgc atgggccctg ccctttgcaa 11700 cagaagagtt gtcgggtcca cccattgggg agctgacctc gcagtcaccc cttatgatta 11760 cggtgctaaa atcatcttgt ctagcgctta ccatggtgaa atgcctcctg gatacaagat 11820 tctggcgtgc gcggagttct cgctcgacga cccagtcaag tacaaacaca cctggggttt 11880 tgaatcggat acagcgtatc tgtatgagtt caccggaaac ggtgaggact gggaggatta 11940 caatgatgcg tttcgtgcgc gccagaaagg gaaaatttat aaggccactg ctaccagcat 12000 gaagttttat tttcccccgg gccccgtcat tgaaccaact ttaggcctga attgaaatga 12060 aatggggtct atacaaagcc tcttcgacaa aattggccag ctttttgtgg atgctttcac 12120 ggaatttttg gtgtccattg ttgatatcat catatttttg gccattttgt ttggcttcac 12180 catcgccggt tggctggtgg tcttttgcat cagattggtt tgctccgcgg tattccgtgc 12240 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ctggttcttg tagtgagtgc aaaccccccc tagggaaagg 9780 cacaagccct ctagatgagg tgttagaaca agtcccgtat aagcctccac ggactgtaat 9840 catgcatgtg gagcagggtc tcacccctct tgacccaggc agataccaga ctcgccgcgg 9900 attagtctcc gttaggcgtg gcatcagagg aaatgaagtt gacctaccag acggtgatta 9960 tgctagcacc gccctactcc ccacttgtaa agagatcaac atggtcgctg tcgcctctaa 10020 tgtgttgcgc agcaggttca tcatcggtcc gcccggtgct gggaaaacat actggctcct 10080 tcagcaggtc caggatggtg atgtcattta cacaccgact caccagacca tgctcgacat 10140 gattagggct ttggggacgt gccggttcaa cgtcccagca ggtgcaacgc tgcaattccc 10200 tgccccctcc cgtaccggcc cgtgggttcg catcctagcc ggcggttggt gtcctggtaa 10260 gaattccttc ttggatgaag cagcgtattg taatcacctt gatgtcttga ggctccttag 10320 caaaaccacc ctcacctgtc tgggagactt caaacaactc cacccagtgg gttttgattc 10380 tcattgctat gtttttgaca tcatgcctca gacccagttg aagaccatct ggagattcgg 10440 acagaacatc tgtgatgcca tccaaccaga ttacagggac aaacttgtgt ccatggtcaa 10500 cacaacccgt gtaacccacg tggaaaaacc tgtcaagtat gggcaagtcc tcacccctta 10560 ccacagggac cgagaggacg gcgccatcac aattgactcc agtcaaggcg ccacatttga 10620 tgtggtcaca ctgcatttgc ccactaaaga ttcactcaac aggcaaagag cccttgttgc 10680 tatcaccagg gcaagacatg ctatctttgt gtatgaccca cacaggcaat tgcagagcat 10740 gtttgatctt cctgcgaagg gcacacccgt caacctcgca gtgcaccgtg atgagcagct 10800 gatcgtactg gatagaaata ataaagaatg cacagttgct caggctctag gcaacggaga 10860 taaatttagg gccaccgaca agcgcgttgt agattctctc cgcgccattt gtgctgatct 10920 ggaagggtcg agctctccgc tccccaaggt cgcacacaac ttgggatttt atttctcacc 10980 tgatttgaca cagtttgcta aactcccggt agaccttgca ccccactggc ccgtggtgac 11040 aacccagaac aatgaaaagt ggccggatcg gctggttgcc agccttcgcc ctgtccataa 11100 gtatagccgt gcgtgcattg gtgccggcta tatggtgggc ccctcggtgt ttctaggcac 11160 ccctggggtc gtgtcatact acctcacaaa atttgtcaag ggcgaggctc aagtgcttcc 11220 ggagacagtc ttcagcaccg gccgaattga ggtggattgc cgggagtatc ttgatgacag 11280 ggagcgagaa gttgctgagt ccctcccaca tgccttcatt ggcgacgtca aaggcaccac 11340 cgttggggga tgtcatcatg tcacctccaa ataccttccg cgcttccttc ccaaggaatc 11400 agtcgcggta gtcggggttt cgagccccgg gaaagccgca aaagcagtgt gcacattgac 11460 ggatgtgtac ctcccagacc ttgaggccta cctccaccca gagactcagt ccaagtgctg 11520 gaaagttatg ttggacttca aggaagttcg actgatggtc tggaaagaca agacggccta 11580 tttccaactt gaaggccgct atttcacctg gtatcagctt gcaagctacg cctcgtacat 11640 ccgtgttcct gtcaactcca cggtgtatct ggacccctgc atgggccctg ccctttgcaa 11700 cagaagagtt gtcgggtcca cccattgggg agctgacctc gcagtcaccc cttatgatta 11760 cggtgctaaa atcatcttgt ctagcgctta ccatggtgaa atgcctcctg gatacaagat 11820 tctggcgtgc gcggagttct cgctcgacga cccagtcaag tacaaacaca cctggggttt 11880 tgaatcggat acagcgtatc tgtatgagtt caccggaaac ggtgaggact gggaggatta 11940 caatgatgcg tttcgtgcgc gccagaaagg gaaaatttat aaggccactg ctaccagcat 12000 gaagttttat tttcccccgg gccccgtcat tgaaccaact ttaggcctga attgaaatga 12060 aatggggtct atacaaagcc tcttcgacaa aattggccag ctttttgtgg atgctttcac 12120 ggaatttttg gtgtccattg ttgatatcat catatttttg gccattttgt ttggcttcac 12180 catcgccggt tggctggtgg tcttttgcat cagattggtt tgctccgcgg tattccgtgc 12240 gcgccctgcc attcaccctg agcaattaca gaagatccta tgaggccttt ctttctcagt 12300 gccgggtgga cattcccacc tggggggtaa aacacccttt ggggatgttt tggcaccata 12360 aggtgtcaac cctgattgat gaaatggtgt cgcgtcgaat gtaccgcgtc atggataaag 12420 cagggcaagc tgcctggaaa caggtggtga gcgaggctac gctgtctcgc attagtagtc 12480 tggatgtggt ggctcatttt caacatcttg ccgccattga agccgagacc tgtaaatatt 12540 tggcttctcg actgcccatg ctacacaacc tgcgcatgac agggtcaaat gtaaccatag 12600 tgtataatag cactttaaat caggtgtttg ctatttttcc aacccctggt tcccggccaa 12660 agcttcatga ttttcagcaa tggctaatag ctgtacattc ctccatattt tcctctgttg 12720 cagcttcttg tactcttttt gttgtgctgt ggttgcgggt tccaatgcta cgtactgttt 12780 ttggtttccg ctggttaggg gcaatttttc tttcgaactc atggtgaatt acacggtgtg 12840 tccaccttgc ctcacccgac aagcagccgc tgaggtcctt gaacccggta ggtctctttg 12900 gtgcaggata gggcatgacc gatgtgggga ggacgatcac gacgaactgg ggttcatggt 12960 tccgcctggc ctctccagcg aaagccactt gaccagtgtt tacgcctggt tggcgttcct 13020 gtccttcagc tacacggccc agttccatcc cgagatattt gggataggga acgtgagtga 13080 agtttatgtt gacatcaagc accaattcat ctgcgccgtt catgacgggc agaacaccac 13140 cttgcctcgc catgacaata tttcagccgt atttcagacc tactatcaac atcaggtcga 13200 cggcggcaat tggtttcacc tagaatggct gcgtcccttc ttttcctctt ggttggtttt 13260 aaatgtttcg tggtttctca ggcgttcgcc tgcaagccat gtttcagttc gagtctttca 13320 gacatcaaaa ccaacactac cgcagcatca ggctttgttg tcctccagga catcagctgc 13380 cttaggcatg gcgactcgtc ctttccgacg attcgcaaaa gctctcaatg ccgcacggcg 13440 atagggacac ctgtgtatat caccatcaca gccaatgtga cagatgagaa ttacttacat 13500 tcttctgatc tcctcatgct ttcttcttgc cttttctatg cttctgagat gagtgaaaag 13560 ggattcaagg tggtatttgg caatgtgtca ggcatcgtgg ctgtgtgtgt caactttacc 13620 agctacgtcc aacatgtcaa agagtttact caacgctcct tggtggtcga tcatgtgcgg 13680 ctgcttcatt tcatgacacc tgagaccatg aggtgggcaa ccgttttagc ctgtcttttt 13740 gccatcctac tggcaatttg aatgttcaag tatgttgggg aaatgcttga ccgcgggctg 13800 ttgctcgcga ttgctttctt tgtggtgtat cgtgccgttc tggtttgctg tgctcggcaa 13860 cgccaacagc agcagcagct ctcatttcca gttgatttat aacttgacgc tatgtgagct 13920 gaatggcaca gattggctgg cagaaaaatt tgattgggcg gtggagactt ttgtcatctt 13980 tcccgtgttg actcacattg tttcctattg tgcactcacc accagccatt tccttgacac 14040 agttggtctg gttactgtgt ccaccgccgg gttttatcac gggcggtatg tcttgagtag 14100 catctacgcg gtctgtgctc tggctgcgtt gatttgcttc gttattaggc ttgcgaagaa 14160 ctgcatgtcc tggcgctact cttgtaccag atataccaac ttccttctgg acactaaggg 14220 cagactctat cgttggcggt cgcccgttat catagaaaaa aggggtaagg ttgaggtcga 14280 aggtcatctg atcgacctca aaagagttgt gcttgatggt tccgtggcaa cccctttaac 14340 cagagtttca gcggaacaat ggggtcgtct ctagacgact tttgccatga tagcactgct 14400 ccacaaaagg tgcttttggc gttttccatt acctacacgc cagtaatgat atatgctcta 14460 aaggtaagtc gcggccgact gctagggctt ctgcaccttt tgatctttct gaattgtgct 14520 tttaccttcg ggtacatgac attcgcgcac tttcagagca caaatagggt cgcgctcgct 14580 atgggagcag tagttgcact tctttggggg gtgtactcag ccatagaaac ctggaaattc 14640 atcacctcca gatgccgttt gtgcttgcta ggccgcaagt acattctggc ccctgcccac 14700 cacgtcgaaa gtgccgcggg ctttcatccg attgcggcaa atgataacca cgcatttgtc 14760 gtccggcgtc ccggctccat tacggttaac ggcacattgg tgcccgggtt gaaaagcctc 14820 gtgttgggtg gcagaaaagc tgttaaacag ggagtggtaa accttgtcaa atatgccaaa 14880 taacaacggc aagcagcaaa agaaaaagaa ggggaatggc cagccagtca accagctgtg 14940 ccagatgctg ggtaaaatca tcgcccagca aaaccagtcc agaggcaagg gaccgggcaa 15000 gaaaagtaag aagaaaaacc cggagaagcc ccattttcct ctagcgaccg aagatgacgt 15060 caggcatcac ttcacccctg gtgagcggca attgtgtctg tcgtcgatcc agactgcctt 15120 taaccagggc gctggaactt gtaccctgtc agattcaggg aggataagtt acactgtgga 15180 gtttagtttg ccgacgcatc atactgtgcg cctgatccgc gtcacagcat caccctcagc 15240 atgatgggct ggcattcttt aggcacctca gtgtcagaat tggaagaatg tgtggtggat 15300 ggcactgatt gacattgtgc ctctaagtca cctattcaat tagggcgacc gtgtgggggt 15360 aaaatttaat tggcgagaac catgcggccg caattaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 15420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 15450 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 735, ORF1a: 182, Nsp1b: 2, passage 0 amino acid <400> 7 Ala Met Ala Asp Val Tyr Asp 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 735, ORF1a: 182, Nsp1b: 2, passage 17 amino acid <400> 8 Ala Met Ala Asn Val Tyr Asp 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 735, ORF1a: 182, Nsp1b: 2, passage 52 amino acid <400> 9 Ala Met Ala Asn Val Tyr Asp 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 756, ORF1a: 189, Nsp1b: 9, passage 0 amino acid <400> 10 Ile Ser His Asp Ala Val Met 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 756, ORF1a: 189, Nsp1b: 9, passage 17 amino acid <400> 11 Ile Gly His Asn Ala Val Met 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 756, ORF1a: 189, Nsp1b: 9, passage 52 amino acid <400> 12 Ile Gly His Asn Ala Val Met 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 992, ORF1a: 267, 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genome position 1096, ORF1a: 302, Nsp1b: 122, passage 0 amino acid <400> 19 His Gly Val Pro Gly Lys Tyr 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 1096, ORF1a: 302, Nsp1b: 122, passage 17 amino acid <400> 20 His Gly Val His Gly Lys Tyr 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 1096, ORF1a: 302, Nsp1b: 122, passage 52 amino acid <400> 21 His Gly Val His Gly Lys Tyr 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2106, ORF1a: 639, Nsp2: 256, passage 0 amino acid <400> 22 Ala Ala Lys Ile Asp Gln Tyr 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2106, ORF1a: 639, Nsp2: 256, passage 17 amino acid <400> 23 Ala Ala Lys Val Asp Gln Tyr 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2106, ORF1a: 639, Nsp2: 256, passage 52 amino acid <400> 24 Ala Ala Lys Val Asp Gln Tyr 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2185, ORF1a: 665, Nsp2: 282, passage 0 amino acid <400> 25 Pro Ser Ala Met Asp Thr Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2185, ORF1a: 665, Nsp2: 282, passage 17 amino acid <400> 26 Pro Ser Ala Thr Asp Thr Ser 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2185, ORF1a: 665, Nsp2: 282, passage 52 amino acid <400> 27 Pro Ser Ala Thr Asp Thr Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2403, ORF1a: 738, Nsp2: 355, passage 0 amino acid <400> 28 Leu Val Ser Val Leu Ser Lys 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2403, ORF1a: 738, Nsp2: 355, passage 17 amino acid <400> 29 Leu Asn Ser Leu Leu Ser Lys 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 2403, ORF1a: 738, Nsp2: 355, passage 52 amino acid <400> 30 Leu Asn Ser Leu Leu Ser Lys 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 3019, ORF1a: 943, Nsp2: 560, passage 0 amino acid <400> 31 Ala Pro Met Tyr Gln Asp Glu 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 3019, ORF1a: 943, Nsp2: 560, passage 17 amino acid <400> 32 Ala Pro Met Cys Gln Asp Glu 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 3019, ORF1a: 943, Nsp2: 560, passage 52 amino acid <400> 33 Ala Pro Met Cys Gln Asp Glu 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4477, ORF1a: 1429, Nsp3: 72, passage 0 amino acid <400> 34 Cys Ala Pro Lys Gly Met Asp 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4477, ORF1a: 1429, Nsp3: 72, passage 17 amino acid <400> 35 Cys Ala Pro Thr Gly Met Asp 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4477, ORF1a: 1429, Nsp3: 72, passage 52 amino acid <400> 36 Cys Ala Pro Thr Gly Met Asp 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4705, ORF1a: 1505, Nsp3: 148, passage 0 amino acid <400> 37 Pro Lys Val Val Lys Val Ser 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4705, ORF1a: 1505, Nsp3: 148, passage 17 amino acid <400> 38 Pro Lys Val Ala Lys Val Ser 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 4705, ORF1a: 1505, Nsp3: 148, passage 52 amino acid <400> 39 Pro Lys Val Ala Lys Val Ser 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 5985, ORF1a: 1932, Nsp4: 129, passage 0 amino acid <400> 40 Ala Gly Glu Leu Val Gly Val 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 5985, ORF1a: 1932, Nsp4: 129, passage 17 amino acid <400> 41 Ala Gly Glu Ile Val Gly Val 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 5985, ORF1a: 1932, Nsp4: 129, passage 52 amino acid <400> 42 Ala Gly Glu Ile Val Gly Val 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 7419, ORF1a: 2410, Nsp7: 217, passage 0 amino acid <400> 43 Ala Asp Phe Asp Pro Glu Lys 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 7419, ORF1a: 2410, Nsp7: 217, passage 17 amino acid <400> 44 Ala Asp Phe Asn Pro Glu Lys 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 7419, ORF1a: 2410, Nsp7: 217, passage 52 amino acid <400> 45 Ala Asp Phe Asn Pro Glu Lys 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 8831, ORF1a/1b: 2881, Nsp9: 429, passage 0 amino acid <400> 46 Gln Thr Pro Val Leu Gly Arg 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 8831, ORF1a/1b: 2881, Nsp9: 429, passage 17 amino acid <400> 47 Gln Thr Pro Ile Leu Gly Arg 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 8831, ORF1a/1b: 2881, Nsp9: 429, passage 52 amino acid <400> 48 Gln Thr Pro Ile Leu Gly Arg 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 13,857, ORF5: 29, passage 0 amino acid <400> 49 Ala Val Leu Val Asn Ala Asn 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 13,857, ORF5: 29, passage 17 amino acid <400> 50 Ala Val Leu Gly Asn Ala Asn 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 13,857, ORF5: 29, passage 52 amino acid <400> 51 Ala Val Leu Gly Asn Ala Asn 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,578, ORF6: 74, passage 0 amino acid <400> 52 Val Ala Leu Thr Met Gly Ala 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,578, ORF6: 74, passage 17 amino acid <400> 53 Val Ala Leu Ala Met Gly Ala 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,578, ORF6: 74, passage 52 amino acid <400> 54 Val Ala Leu Ala Met Gly Ala 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,780, ORF6: 141, passage 0 amino acid <400> 55 Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,780, ORF6: 141, passage 17 amino acid <400> 56 Pro Gly Ser Ile Thr Val Asn 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> genome position 14,780, ORF6: 141, passage 52 amino acid <400> 57 Pro Gly Ser Ile Thr Val Asn 1 5

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  13. 북아메리카 PRRS 바이러스를 코딩하는 감염성 RNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로서, 상기 DNA 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  14. 제13항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자로 형질감염된 숙주 세포.
  15. (a) 제13항에서 정의된 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 코딩된 유전적으로 변경된 북아메리카 PRRS 바이러스, (b) 감염성의 상기 폴리뉴클레오티드 분자, (c) 플라스미드 형태의 상기 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 (d) 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 바이러스 벡터; 및
    수의학적 용도의 담체
    를 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 동물을 보호하는 백신으로서, 상기 PRRS 바이러스가 감염에 대한 면역보호를 생성하는 양으로 PRRS 바이러스에 의한 감염에 대한 면역보호 반응을 이끌어낼 수 있는, 백신.
  16. PRRS 바이러스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 DNA 서열에 상응하는 RNA 서열인, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  17. PRRS 바이러스의 야생형 균주에 의해 천연적으로 감염된 돼지 동물과 제15항에 따른 백신으로 백신접종된 돼지 동물을 구별하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 진단 키트.
  18. 제15항에 있어서,
    서열번호 5의 게놈 서열을 갖는 야생형 P129 PRRS 바이러스에 비해 감소된 인터페론-α 억제 효과를 갖는, 백신.
  19. 제13항에 있어서,
    서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  20. 제13항에 따른 임의의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열의 상보체인 RNA 폴리뉴클레오티드 분자.
  21. 제13항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는, PRRS 바이러스를 생산하는 시험관내(in-vitro) 방법.
  22. 제13항에 따른 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 전사할 수 있는 프로모터를 갖는 플라스미드로부터 RNA 전사체를 수득한 후, 이를 숙주 세포에 형질감염시키는 단계를 포함하는, PRRS 바이러스를 생산하는 시험관내 방법.
  23. 제13항에 따른 서열의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 숙주 세포내에서 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 전사할 수 있는 프로모터를 포함하는 플라스미드.
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