KR102402645B1 - 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 변이주 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전체의 특정 위치에 코돈쌍 탈최적화를 통한 침묵 돌연변이가 도입된 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 변이주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명이 제공하는 바이러스 변이주는 야생형 균주에 비해 약독화되었으며, 돼지 체내에서의 증식성이 저하되어 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방용 백신으로 활용될 수 있다.

Description

유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 변이주 및 이를 포함하는 백신 조성물 {Chimeric strain of European porcine reproductive and respiratory syndrome virus and antiviral vaccines comprising the same}

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 약독화된 변이주에 관한 것으로, 본 발명이 제공하는 PRRSV 변이주는 모균주에 비해 병원성이 낮고 안정성이 높다.

돼지생식기호흡기증후군 (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, 이하 "PRRS"라 한다)은 1987년에 미국에서 최초로 발견된 바이러스 질환으로, 유럽에 이어 1990년대 초에는 아시아에서까지 동정되었다. PRRS는 돼지 써코바이러스 감염증 및 구제역과 함께 국내 양돈산업에 가장 큰 피해를 주는 전염병이며, 전세계적으로 확산되어, 매년 막대한 경제적 손실을 일으키고 있다.

PRRS는 임신한 암퇘지의 생식 불능, 유산이나 조산, 사산의 번식장애를 유발하며, 젖먹이 돼지와 비육돈에게 재채기, 발열 등의 호흡기 증상을 유발한다. 일반적으로 바이러스에 이환된 이후 세균 등의 2차 감염에 의해 심한 호흡기 증상을 야기하지만, 만성적으로 감염된 경우에는 특징적인 임상 증상 없이 증체량 감소 및 폐사율의 증가가 나타난다.

PRRS의 원인이 되는 병원체는 PRRS 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)로, Arterivirus 속, Arteriviridae 과, Nidovirales 목에 속한다. PRRS 바이러스는 positive-sense single stranded RNA(+ssRNA) 유전체를 가지며, 그 크기는 약 15.4kb이고, 9개의 ORF를 갖고 있는 것으로 보고되었다. 유전체의 약 80%는 비구조단백질(Non Structural Protein, NSP)을 코딩하는 ORF1a 및 ORF1b이고, 나머지 20%가 글리코실화된 구조 단백질인 GP2, GP3, GP4, GP5, 및 비글리코실화된 막(Membrane, M) 단백질, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질을 암호화하는 ORF로 구성된다. minor 구조단백질인 GP2, GP3, GP4는 헤테로 삼중합체(heterotrimer)를 형성하여 바이러스가 숙주 세포 내로 침입할 때 작용하며, major 구조단백질인 GP5 및 M은 헤테로 이중합체(heterodimer)를 형성하여 바이러스의 감염력을 높여주는 작용을 한다.

PRRS 바이러스는 RNA 바이러스의 특성상 변이가 심하여 PRRS 바이러스 사이에서도 유전적 차이가 크다. PRRS 바이러스는 크게 북미형과 유럽형으로 나뉘는데, 유럽형을 대표하는 타입 I형(Lelystad virus, LV) 및 북미형 바이러스주(Northern American strain) ATCC VR2332를 대표하는 타입 II 형(VR2332의 유전체 서열은 GenBank 등록번호 AY150564 참조)이 있다.

북미형과 유럽형 간에는 최대 40%까지 유전자 차이가 존재하여 서로 교차 방어가 되지 않는 것으로 알려져 있다. 심지어 같은 타입에 속하는 변이주 간에도 교차 방어가 되지 않는 경우가 보고된 바 있다. 이로 인해, 각 타입의 바이러스에 대해 표준 변이주 기반의 백신은 제작되어 있지만 낮은 교차 방어능으로 인해 PRRS를 효과적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다. 이를 극복하기 위하여 안전성, 면역원성, 및 방어능을 효과적으로 갖춘 백신을 제작하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다.

이러한 한계로 인해, 축산업에 막대한 손해를 끼치는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)의 원인체인 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 발견한 이후 약 30년 동안 이 바이러스에 대한 예방법을 개발하기 위하여 많은 노력이 투자되었음에도 아직까지 효과적인 예방법 및 관리법이 개발되지 않은 실정이다.

돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV) 제어를 위해 불활화 백신과 약독화 생백신 등 다양한 백신이 개발되었으나 오직 감염성이 확보된 약독화 백신만이 만족스러운 수준의 방어 효과를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 앞서 살핀 바와 같이, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)가 유전적으로 매우 다양하게 존재하기 때문에 다양한 바이러스들 간의 교차면역이 부재하여 하나의 백신으로 다양한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 방어하기는 어렵다. 또한 현재 약독화 백신은 다른 동물 종의 세포 주에서 100~200 계대 이상의 연속 계대를 통해서만 생산이 가능하므로 개발 기간이 길고 효능과 안전성의 보장이 어려운 문제가 있다.

본 발명자들은 코돈쌍 탈최적화(Codon Pair Deoptimization), 또는 분자 약독화 기술을 사용하여 약독화된 유럽형 PRRSV를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 약독화된 PRRSV 변이주, 변이주를 포함하는 PRRS의 예방 및/또는 치료용 백신 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, PRRS의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명이 제공하는 상기 약독화된 PRRSV 변이주는 기존 바이러스보다 증식성이 감소되어 백신주로서 안전하다.

본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 변이주에 관한 것이다. 본 발명의 PRRSV 바이러스 변이주는 모균주보다 약독화되어 있어 병원성이 낮고 안정성이 높다. 이에, PRRS 질환의 효과적인 예방 및 치료용 백신으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.

본 명세서에 사용된 "약독화된 바이러스"는 PRRS 질환의 임상 징후를 유발하지 않고 표적 포유동물에서 면역반응을 유발할 수 있는 무독성 바이러스를 의미하기도 하고, 또한 약독화된 바이러스로 감염되고 약독화된 바이러스를 투여받지 못한 동물에서 임상 징후의 발생빈도를 낮추거나, 징후의 중증도가 비-약독화된 PRRS 바이러스로 감염된 "대조군" 동물에 비해 감소된 것을 의미하기도 한다. 이러한 상황에서, "감소/감소된"이란 용어는 앞에서 정의한 대조군에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 더욱 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 100% 이상의 감소를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "백신 조성물"은 PRRS 키메라 바이러스 또는 이의 임의의 면역원성 단편 또는 분획, 바람직하게는 약독화된 PRRS 키메라 바이러스, 예컨대 상기 본 발명의 PRRS 키메라 바이러스일 수 있다. 이는 숙주의 "면역학적 반응"을 PRRSV에 대한 세포 및/또는 항체 매개의 면역 반응으로 유발한다. 백신 조성물은 PRRSV 감염 및 이와 관련된 임상 징후들에 대해 예방 면역을 부여할 수 있는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 "면역 반응"은 상기 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스, 또는 이를 포함하는 백신 조성물을 투여받은 동물에게 투여된 키메라 바이러스 또는 백신에 대한 임의의 세포- 및/또는 항체-매개의 면역 반응을 의미한다. 보통, "면역 반응"은 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: 당해 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γδ T 세포의 생산 또는 활성화. 숙주는 면역원성 조성물이나 백신을 투여받지 않은 대조군에 비해 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소되도록 치료적 또는 예방적 면역학적 반응을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 예방은 최대 전술한 숙주 감염과 관련된 증상들의 결여 및 이를 비롯하여 빈도 또는 중증도의 감소에 의해 증명될 것이다.

본 명세서에 사용된 "돼지들", "돼지" 및 "새끼돼지"는 호환 사용될 수 있다.

"백신을 접종하다"는 PRRS 질환에 노출되기 전에 본 명세서에 기술된 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신을 투여하는 것을 의미한다.

"예방하다" 또는 "예방"은 본 발명의 PRRSV 바이러스 또는 이를 포함하는 백신조성물을 투여받은 결과로서, PRRS의 임상의 발생 빈도, 징후의 중증도 또는 빈도가 감소하는 것을 의미한다. 중증도 또는 빈도의 감소는 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신조성물을 투여받지 않은 동물 또는 동물 그룹과 비교한 결과이다. 상기 동물은 바람직하게는 돼지일 수 있다.

본 명세서의 염기 서열은 편의를 위해 DNA 뉴클레오타이드를 기준으로 기재되었으며, 폴리뉴클레오타이드의 종류가 RNA인 경우에는 염기서열 내 모든 또는 일부 티민(Thymine, T)이 우라실(Uracil, U)로 치환된 서열을 의미한다.

본 명세서에서 특정 염기서열 및/또는 아미노산 "서열로 구성되는"은 상기 서열을 포함하는, 상기 서열을 필수적으로 포함하는, 및/또는 상기 서열로 이루어지는을 모두 포함하며, 필요에 따라 적절히 치환하여 사용될 수 있다.

본 발명은 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스의 변이주를 제공하며, 상기 변이주는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 ORF7 부위에 침묵 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다.

상기 ORF7 부위는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 유전체 중 3'-말단에 가장 가까이 위치하는 ORF로서, PRRSV의 구조 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다. 상기 침묵 돌연변이가 ORF7 부위 외에서 발생하는 경우, 바이러스의 제작이 이루어지지 않을 수 있다. 일 구체예에서, ORF1a 부위 내의 NSP1 단백질을 암호화하는 유전자에 침묵 돌연변이를 도입한 결과, 바이러스의 제작이 이루어지지 않았다.

본 발명이 제공하는 PRRSV 변이주의 ORF7 서열은 야생형 PRRSV의 ORF7 부위에 비해 코돈쌍 편향(Codon Pair Bias, CPB) 이 더 낮은 것일 수 있다. 상기 야생형 PRRSV의 ORF7 부위는 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 코돈쌍 편향은 당업계에 알려진 CPB 산출 목적으로 사용할 수 있는 프로그램, 예를 들어 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 이용하여 계산될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 코돈쌍 편향은 유전자의 일부 염기 서열이 다른 염기로 치환되는 경우에 변동되며, 특히 바이러스의 증식성과 밀접한 관련이 있다. 구체적으로, CPB 수치가 감소되면 바이러스의 증식성이 감소하고 약독화된다.

본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV 변이주의 ORF7 부위의 CPB 수치는 야생형 PRRSV의 ORF7 부위의 CPB 수치에 비해 0.05 내지 0.5, 0.05 내지 0.3, 또는 0.05 내지 0.2 낮은 값을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV 변이주의 ORF7 부위의 CpB 및/또는 UpA 수치는 모균주에 비해 높다. CpG, UpA 비율의 변화는 deoptimization 과정에서 필연적으로 발생하는 결과로서, 진핵세포 유전자의 CpG, UpA의 수치를 증가시키면, cell stress를 유발하여 바이러스의 증식성이 감소되어 바이러스를 약독화 시킬 수 있다. 일 예에서, 본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV 변이주의 CpB 및/또는 UpA 수치는 모균주에 비해 1 내지 5배, 1 내지 3배, 1.1 내지 5배, 1.1 내지 3배, 1.3 내지 5배 또는 1.3 내지 3배의 수치를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 본 발명의 약독화된 PRRSV 변이주의 ORF7 부위의 CpG 수치는 0.7 내지 1.5, 0.7 내지 1.3, 또는 0.7 내지 1.1 일 수 있으며, 상기 변이주의 ORF7 부위의 UpA 수치는 0.3 내지 1.0, 0.3 내지 0.9 또는 0.3 내지 0.8일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 예에서, 본 발명이 제공하는 PRRSV 변이주의 ORF7 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 5의 핵산 서열로 이루어지는 ORF7 부위의 5' 말단으로부터 177번 염기 이후 위치에 침묵 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다. 상기 침묵 돌연변이는 ORF7 부위의 CPB를 낮추기 위한 목적 범위 내에서 자유롭게 도입될 수 있으며, 예를 들어 7개 내지 30개, 또는 7개 내지 22개의 염기가 치환될 수 있다. 침묵 돌연변이가 7개 미만으로 도입되는 경우 바이러스가 충분히 약독화되지 않을 수 있으며, 침묵 돌연변이의 수가 지나치게 많은 경우 바이러스의 제작이 이루어지지 않을 수 있다. 상기 침묵 돌연변이의 수가 상기 상한보다 많은 경우, 지나치게 약독화 되어 바이러스 생존이 불가능해 질 수 있다.

일 예에서, 본 발명이 제공하는 PRRSV 변이주의 ORF7 부위가 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 핵산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

일 예에서 본 발명이 제공하는 PRRSV 변이주의 ORF7 부위는 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 ORF7 부위에 있어서 적어도 다음의 변이를 포함하는 것일 수 있다: 123번째 위치의 C가 T로 치환, 129번 위치의 A가 C로 치환, 177번째 위치의 T가 C로 치환, 180번째 위치의 T가 C로 치환, 186번째 위치의 T가 C로 치환, 189번째 위치의 C가 T로 치환, 204번째 위치의 C가 T로 치환, 213번째 위치의 T가 G로 치환, 222번째 위치의 C가 G로 치환, 264번째 위치의 A가 C로 치환, 267번째 위치의 A가 T로 치환, 288번째 위치의 T가 C로 치환, 291번째 위치의 G가 T로 치환, 297번째 위치의 C가 T로 치환, 309번째 위치의 T가 C로 치환, 315번째 위치의 C가 T로 치환, 327번째 위치의 T가 C로 치환, 330번째 위치의 T가 G로 치환, 336번째 위치의 A가 G로 치환, 339번째 위치의 G가 A로 치환, 348번째 위치의 T가 A로 치환, 및 위치의 354번째 G가 T로 치환된 변이로 이루어지는 군에서 선택되는 7개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상, 또는 22개 이상의 변이로 이루어지는 변이를 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명이 제공하는 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 변이주의 ORF7은 서열번호 2의 핵산 서열이 177번째 염기 이후 영역에 침묵 돌연변이로 변이된 핵산서열로 이루어지고, 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스에 비해 코돈쌍 편향(Codon Pair Bias, CPB)이 낮을 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV 변이주의 ORF7은 서열번호 2의 핵산서열이 다음 중 선택된 하나 이상의 돌연변이에 의하여 변이된 핵산서열로 이루어진 것일 수 있다:

177번째 위치의 T가 C로 치환, 180번째 위치의 T가 C로 치환, 186번째 위치의 T가 C로 치환, 189번째 위치의 C가 T로 치환, 204번째 위치의 C가 T로 치환, 213번째 위치의 T가 G로 치환, 222번째 위치의 C가 G로 치환, 264번째 위치의 A가 C로 치환, 267번째 위치의 A가 T로 치환, 288번째 위치의 T가 C로 치환, 291번째 위치의 G가 T로 치환, 297번째 위치의 C가 T로 치환, 309번째 위치의 T가 C로 치환, 315번째 위치의 C가 T로 치환, 327번째 위치의 T가 C로 치환, 330번째 위치의 T가 G로 치환, 336번째 위치의 A가 G로 치환, 339번째 위치의 G가 A로 치환, 348번째 위치의 T가 A로 치환, 및 354번째 위치의 G가 T로 치환.

보다 구체적으로, 본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV 변이주의 ORF7은 서열번호 2의 핵산서열이 다음의 돌연변이에 의하여 변이된 핵산서열로 이루어진 것일 수 있다:

(1) 177번째 위치의 T가 C로 치환, 180번째 위치의 T가 C로 치환, 204번째 위치의 C가 T로 치환, 213번째 위치의 T가 G로 치환, 222번째 위치의 C가 G로 치환, 264번째 위치의 A가 C로 치환, 및 267번째 위치의 A가 T로 치환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개)의 치환을 포함하는 돌연변이; 또는

(2) (i) 상기 (1)의 돌연변이 및, (ii) 186번째 위치의 T가 C로 치환, 189번째 위치의 C가 T로 치환, 288번째 위치의 T가 C로 치환, 291번째 위치의 G가 T로 치환, 297번째 위치의 C가 T로 치환, 309번째 위치의 T가 C로 치환, 315번째 위치의 C가 T로 치환, 327번째 위치의 T가 C로 치환, 330번째 위치의 T가 G로 치환, 336번째 위치의 A가 G로 치환, 339번째 위치의 G가 A로 치환, 348번째 위치의 T가 A로 치환, 및 354번째 위치의 G가 T로 치환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이의 조합.

다른 예에서는, 본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV 변이주의 ORF7은 서열번호 2의 핵산서열이 123번째 위치의 C가 T로 치환, 129번 위치의 A가 C로 치환, 또는 이들의 조합에 의하여 추가로 변이된 핵산서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 PRRSV 변이주의 모균주는 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스일 수 있으며, 일 예에서, E38 균주일 수 있다. 본 발명이 제공하는 PRRSV 변이주는 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(타입 1)로 분류되는 것일 수 있다.

본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV 변이주는 모균주에 비해 폐 대식세포에 감염되었을 때 TCID₅₀ 값이 0.99배 이하, 0.95배 이하, 0.7배 이하, 0.6배 이하, 또는 0.5배 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에서, 폐 대식세포에 E38 바이러스와 상기 바이러스에 변이를 도입한 변이주를 각각 폐 대식세포에 감염시켜 TCID₅₀ 값을 측정한 결과, 모든 변이주에서 모균주에 비해 낮은 TCID₅₀ 값을 나타내어, 낮은 증식성이 확인되었다. 일 실시예에서, 서열번호 10의 핵산 서열로 이루어지는 ORF7 서열을 갖는 바이러스 변이주는, 폐 대식세포(PAM)에 접종시, 접종후 1일째에 모균주에 비해 약 65% 수준의 TCID₅₀/mL 값을 보였으며, 접종 후 4일 째에는 약 35% 수준의 TCID₅₀/mL 값을 나타내어, 모균주에 비해 현저히 낮은 독성을 확인하였다.

본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV 변이주는 돼지에 감염되었을 때 혈중 바이러스 역가가 야생형 균주의 바이러스 감염시 역가(Log (genomic copies/ml)) 대비 95% 이하, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 또는 35% 이하로 나타나는 것일 수 있다. 일 실시예에서 돼지에 E38 바이러스와 상기 바이러스에 변이를 도입한 변이주를 각각 감염시킨 결과, 모든 변이주에서 모균주에 비해 낮은 바이러스 역가를 나타내어, 돼지의 체내에서 증식할 수 있는 최대 역가가 낮고 빠르게 소멸되는 안전한 균주가 생성되었음을 확인하였다.

본 발명은 또한 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 제조 방법을 제공한다.

본 발명이 제공하는 약독화된 PRRSV의 제조 방법은, 야생형 PRRSV의 유전체 내 ORF7 부위의 5' 말단으로부터 177번 염기 이후 위치에 침묵 돌연변이를 도입하는 단계; 및 상기 변이가 도입된 바이러스(변이주)를 제작하는 단계를 포함한다.

상기 ORF7 부위의 5' 말단은, PRRSV 유전체 핵산 서열 중 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단과 대응하는 부위를 의미한다. 상기 침묵 돌연변이가 ORF7 외의 위치에 도입되는 경우, 바이러스의 제작이 이루어지지 않는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 변이주에 도입된 침묵 돌연변이는 야생형 바이러스의 ORF7 부위에 비해 변이주의 ORF7 부위의 CPB 값을 낮추는 것일 수 있다. 상기 CPB에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

상기 침묵 돌연변이의 위치와 수 및 종류는 상기 바이러스 변이주에 도입된 침묵 돌연변이와 같다.

상기 야생형 PRRSV는 유럽형(Type 1) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스일 수 있으며, 일 예에서, E38 균주일 수 있다.

상기 침묵 돌연변이를 도입하는 단계는, 점돌연변이를 도입하기 위한 목적 범위에서 통상의 기술자가 적절한 방법을 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 염기서열의 합성, 변이가 도입된 프라이머쌍의 이용, 및/또는 상용화된 키트를 이용하는 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 변이가 도입된 PRRSV 바이러스 변이주의 감염성 클론은, 바이러스의 유전체를 복수 개, 예를 들어 2 내지 10개, 2 내지 8개, 3 내지 10개, 3 내지 8개, 5 내지 10개, 또는 5 내지 8개의 단편으로 나누어 각 단편에 해당하는 DNA를 각각 합성하는 단계; 및 상기 각 단편을 연결하는 단계를 수행하여 바이러스 변이주의 감염성 클론을 제조할 수 있다. 일 실시예에서, 변이가 도입된 PRRSV 바이러스 변이주의 감염성 클론은, 바이러스이 유전체를 6개의 단편으로 나누어 각 단편에 해당하는 DNA를 각각 합성한 후, 각 단편을 연결하여 바이러스 변이주의 감염성 클론을 제조하였다.

일 예에서, 상기 각 단편을 연결하는 단계는 상기 제조된 각 단편을 제한효소로 처리하는 단계 및 리가아제(ligase)로 연결하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 약독화된 PRRSV 변이주 및/또는 상기 변이주의 계대 배양된 자손을 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 PRRSV 변이주에 대한 내용은 상술한 바와 같다.

상기 돼지 생식기 호흡기 증후군은 유럽형(타입 1) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의해 발병하는 것일 수 있다.

상기 계대 배양된 자손은 상기 바이러스 변이주를 1 내지 80계대, 1 내지 70계대, 1 내지 60계대, 1 내지 50 계대, 1 내지 40 계대, 1 내지 30 계대, 1 내지 20 계대, 또는 1 내지 10 계대 배양된 자손 바이러스를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 돼지 생식기 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 조성물은 당업자에게 공지된 추가 성분을 포함할 수 있고, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 1,000 mg/kg(체중)의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

일 예에서 상기 약학적 조성물은 백신 조성물일 수 있다. 상기 백신은 생백신 및/또는 사백신일 수 있으며, 구체적으로, 본원에 기술된 약독화된 PRRS 키메라 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체에 전술한 하나 이상의 바이러스주를 생존 상태로 함유하는 변형 생백신일 수 있다. 또한, 또는 대안적으로, 불활성화된 바이러스를 사백신을 제조하는 데에도 사용할 수 있다.

상기 백신은 PRRS의 예방 목적 범위에서 투여 대상의 체중, 연령, 식이 단계 및/또는 면역력을 고려하여 적절한 농도의 PRRSV 변이주를 포함할 수 있다. 예를 들어 백신 조성물 내의 바이러스 변이주 투여량은 TCID₅₀ 2 내지 6, 또는 TCID₅₀ 3 내지 4, 범위이나, 개체의 종류에 따라 달라 질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 백신 조성물은 돼지에 투여될 수 있으며, 상기 돼지는 이유 자돈기, 육성기 및 비육기로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 성장 단계의 돼지일 수 있다. 상기 이유 자돈기의 돼지는 생후 7일 이상, 14일 이상, 또는 21일 이상부터 체중 30kg에 이르기 전까지의 돼지를 의미하며, 상기 육성기는 돼지의 체중이 30 내지 50kg인 시기를, 상기 비육기는 육성기 이후의 시기를 의미하는 것일 수 있다. 상기 돼지는 양돈 돼지 및/또는 멧돼지일 수 있으며, 품종을 가리지 않으나, 예를 들어, 랜드레이스종, 요크셔종, 듀록종, 버크셔종, 및 대한민국 재래돼지로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상 또는 5종 이상일 수 있으며, 상기 종 사이의 교잡으로 태어난 돼지를 모두 포함한다.

상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약독화된 PRRSV 변이주, 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 경구, 비경구, 피하, 근육내, 피내, 설하, 경피, 직장, 경점막, 흡입을 통한 표면적, 협측 투여를 통해, 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다. 또한, 약독화된 PRRSV 변이주는 약독화된 바이러스의 서방출을 허용할 수 있는 이식체 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약독화된 PRRSV 변이주 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 주사, 흡입 또는 이식을 통해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 백신접종 또는 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라 약독화된 PRRSV 변이주 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 1회 또는 여러 번, 또한 간헐적으로, 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 동일한 양 또는 다른 투여량으로 투여될 수 있다. 주사는 원하는 양으로 주사하거나 피하 혹은 비강에 분무하여 주입할 수 있다, 또는 대안적으로 연속 주입할 수 있다.

일 예에서 상기 약학적 조성물은, 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 키트의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 용기, 바람직하게는 본 발명의 약독화된 PRRS 키메라 바이러스를 함유하는 백신 조성물, 약제학적으로 허용되는 담체, 보강제 및 PRRS 감염의 임상 징후 또는 효과, 바람직하게는 PRRS의 빈도 또는 중증도를 경감시키도록 이를 필요로 하는 동물에게 상기 면역원성 조성물을 투여하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 주사 수단 및/또는 다른 형태의 투여 수단을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 용매를 포함할 수 있다. 약독화된 백신은 동결건조될 수 있고, 용매로 복원되어 주사 및/또는 흡입용 용액이 될 수 있다. 용매는 물, 생리식염수, 완충액 또는 보강 용매일 수 있다. 키트는 약독화된 바이러스, 용매 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 분리 용기를 포함할 수 있다. 사용설명서는 하나 이상의 용기에 부착된 라벨 및/또는 인쇄물일 수 있다.

본 발명이 제공하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 변이주는 모균주보다 약독화 되어 있어 병원성이 낮고, 안정성이 높으며 돼지의 면역력을 향상시킴으로써 PRRS 질환의 효과적인 예방 및/또는 치료용 백신으로 사용될 수 있다.

도 1은 E38 모균주와 각 변이주의 ORF7 부위의 핵산 서열을 정렬하여 비교한 결과이다. 서열번호 범례 앞 원의 색은 각 핵산 서열의 ORF7을 포함하는 바이러스의 제작 성패를 나타낸다 (푸른색: 제작 성공, 붉은색: 제작 실패).
도 2는 제작된 각 바이러스를 돼지의 폐 대식세포(PAM)에 감염시킨 후 시간에 따른 바이러스의 증식성을 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 제작된 각 바이러스를 돼지에 접종 후 시간의 경과에 따른 혈중 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다. * 표시는 통계적으로 유의미한 결과를 의미한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되지 아니한다.

하기 실시예에서, PRRSV의 유전체인 RNA는 쉽게 파괴되므로, 별도의 언급이 없는 한 모든 PRRSV의 유전체 처리는 DNA를 합성하여 작업을 수행한 후 이로부터 RNA를 제조하여 세포의 형질감염에 이용되었다.

준비예 1. 모균주 정보

변이주를 제조하기 위한 모균주로 국내에서 분리된 유럽형 PRRSV인 E38 균주를 검역본부로부터 제공받았으며 (한국수의유전자원은행 (http://kvcc.kahis.go.kr/pms/web/gene/pmsGeneMain.do?iNo=3&iType=01&iSubType=01&searchKeyword1=&searchKeyword2=vr1800004&searchKeyword3=&searchCondition=0&searchKeyword=vr1800004&searchSale=0)에 기탁; 유전자원번호 KVCC-VR1800004), 상기 E38 균주의 전체 유전체 서열은 서열번호 1에 나타내었다.

상기 국내 분리종 E38과 미국형 PRRSV(VR-2332) 및 유럽형 PRRSV(Amervac, Lelystad 및 Lena 균주) 바이러스주의 전체 유전체 서열 상동성을 비교한 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

PRRSV 타입	북미형 (Type II)	유럽형 (Type I)
바이러스 균주	VR-2332	Amervac	Lelystad	Lena
E38과의 서열 상동성(Identity, %)	58.2	88	88.9	79.2

준비예 2. 코돈쌍 탈최적화

상기 E38 바이러스를 모균주로 하여, 유전체 합성 단계에서 코돈쌍 탈최적화(Codon pair deoptimization)을 적용하여 약독화된 감염성 클론(infectious clone)을 제조하였다.

코돈쌍 탈최적화의 대상이 되는 유전자는 각각 NSP1 및 ORF-7을 선정하였으며, 일반적으로 알려져 있는 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램 또는, 본 발명자들이 개발한 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 이용하여 Codon Pair Deoptimization 원리에 따라 염기서열 중 일부를 침묵 돌연변이(silent mutation) 시켜 제조하였다.

우선, SAVE 프로그램을 이용해 E38(국내 분리종) 바이러스의 유전자 코돈이 쌍으로 배열시 상호작용하여 생기는 편향성인 CPB (Codon Pair Bias) 값을 컴퓨터 알고리즘을 이용해 수치화하였다. 상기 CPB 수치는 바이러스 유전자의 일부 염기 서열이 다른 염기로 치환되는 경우에 변동되며, 바이러스의 증식성과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 바이러스의 증식성은 염기서열 치환을 통해 CPB 수치가 감소되면 (Deoptimization), 증식성이 감소하고 약독화 된다.

비교예 1. NSP1 부위에 대한 코돈 탈최적화 바이러스 변이주의 제조

1-1. 코돈쌍 탈최적화

PRRSV 중 NSP1 단백질을 암호화하는 유전자 부위는 PRRSV의 유전체 중 유전적 안정성이 높은 것으로 알려져 있다. 따라서 E38(국내 분리종) PRRSV의 상기 NSP1 유전자 부위에 대해 SAVE 프로그램을 이용, CPB 값이 비교적 높게 나타난 염기 부위에 대해 코돈쌍 탈최적화를 적용하였다.

상기 방법으로 디자인 된 각 균주에 대한 코돈쌍 탈최적화 전후의 CPB, CpG 및 UpA 수치는 하기 표 2에 나타내었다. 상기 CpG 및 UpA 수치는 코돈쌍 탈최적화 과정에서 필연적으로 발생하는 결과로서, 유전자 내에서 CpG, 또는 UpA 수치가 증가하면 세포 스트레스(cell stress)를 유발하여 바이러스의 증식성이 감소되는 것으로 알려져 있다.

모균주	코돈 탈최적화	CPB	CpG	UpA	nt
E38	X (original)	-0.0511	0.7361	0.4878	-
E38	O (NSP1)	-0.2491	1.0859	0.8464	78

상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, NSP1 유전자에 대한 코돈 탈최적화를 적용한 결과, E38과 Lelystad 바이러스 균주 모두에서 CBP 값이 감소하였으며, CpG 및 UpA 수치 또한 증가하여, 상기와 같은 변이 유전체를 갖는 바이러스의 증식성이 모균주에 비해 감소되었음을 시사하였다.

1-2. 바이러스 변이주의 감염성 균주의 제작 확인

상기 디자인된 변이 균주를 제작하기 위해, E38 또는 Lelystad 균주의 유전체(코돈 탈최적화된 변이 포함)를 6개의 단편으로 나누어 각각 DNA를 합성하였다. 각 단편은 제한효소로 처리된 후 ligase로 연결하여 하나의 감염성 클론을 제조하였다.

상기 감염성 클론은 high copy vector에 삽입한 후, 리포펙타민(lipofectamine)을 이용해 BHK cell (한국 세포주 은행)에 형질감염하여 감염성 바이러스의 제작을 시도하였다.

그러나, NSP1 유전자의 코돈 탈최적화가 이루어진 E38 바이러스 변이주의 제작은 이루어지지 않았다.

실시예 1. ORF7 부위에 대한 코돈 탈최적화 바이러스 변이주의 제조

1-1. ORF7 부위의 코돈쌍 탈최적화

ORF7은 PRRSV 유전체의 3' 말단 부위에 존재하는 부위로서, 상기 유전체의 3' 말단 부위의 387nt 길이에 해당하는 부위를 지칭한다.

비교예 1-1과 실질적으로 동일한 방법으로, E38 바이러스에 대한 ORF7 부위에 대한 코돈쌍 탈최적화를 SAVE 프로그램을 이용해 수행하였으며, 이에 따라 ORF7 부위에 침묵 돌연변이(silent mutation)가 도입된 변이주를 설계하였다. 하기 표 3에 모균주와 변이주의 CPB, CpG, UpA 및 nt 수치를 나타내었다. 각 수치에 대한 설명은 상기 비교예 1-1에 기재된 바와 같다.

코돈 탈최적화	CPB	CpG	UpA	nt
X (모균주)	-0.0371	0.5714	0.2610	-
O (ORF7, 7개)	-0.0963	0.7520	0.3589	7
O (ORF7, 22개)	-0.2251	1.0797	0.6185	22

상기 표 3에서, 모균주 및 각 변이주의 ORF 서열을 서열번호 2 내지 4에 나타내었다. 구체적으로, 서열번호 2는 모균주의 ORF7 부위 핵산 서열을, 서열번호 3은 7개 변이를 포함하는 균주의 ORF7 부위 핵산 서열을, 서열번호 4는 상기 표 3에서 22개 변이를 포함하는 균주의 ORF7 부위 핵산 서열이다.

서열번호 3의 핵산 서열은, 서열번호 2의 핵산 서열에서, 177번째 T가 C로, 180번째 T가 C로, 204번째 C가 T로, 213번째 T가 G로, 222번째 C가 G로, 264번째 A가 C로, 및 267번째 A가 T로 각각 치환된 침묵 돌연변이를 포함된다.

서열번호 4의 핵산 서열은, 서열번호 2의 핵산 서열에서, 48번째 A가 G로, 108번째 C가 G로, 111번째 G가 A로, 123번째 C가 T로, 129번째 a가 c로, 153번째 T가 C로, 162번째 A가 G로, 171번째 C가 G로, 174번째 G가 A로, 177번째 T가 C로, 180번째 T가 C로, 186번째 T가 C로, 189번째 C가 T로, 204번째 C가 T로, 213번째 T가 G로, 222번째 C가 G로, 264번째 A가 C로, 267번째 A가 T로, 285번째 C가 T로, 288번째 T가 C로, 291번째 G가 T로, 및 297번째 C가 T로 각각 치환된 침묵 돌연변이를 포함한다. 즉, 상기 서열번호 4의 핵산 서열은 서열번호 3이 가지는 돌연변이 모두를 포함하면서, 48번, 108번, 111번, 123번, 129번, 153번, 162번, 171번, 174번, 186번, 189번, 285번, 288번, 291번 및 297번 위치의 변이15개를 추가로 더 포함한다.

E38을 모균주로 한 변이주의 경우, ORF7에 도입된 변이의 수가 증가함에 따라 CPB 수치가 감소하고, CpG 및 UpA 수치는 증가하였다.

1-2. 바이러스 변이주의 감염성 균주의 제작

비교예 1-2와 실질적으로 동일한 방법으로 상기 실시예 1-1에서 설계된 각 바이러스 변이주 (코돈 탈최적화된 바이러스 변이주)를 제작하였다.

그 결과, 7개의 염기에 침묵 돌연변이가 도입된, 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 ORF7를 가지는 변이주의 경우에만 제작이 성공적으로 이루어진 반면 E38의 ORF7에 침묵 돌연변이가 22개 도입된, 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 ORF7을 가지는 변이주의 제작은 이루어지지 않았다.

실시예 2. ORF7 내 침묵돌연변이 수 및 위치에 따른 바이러스 제작

2-1. 침묵 돌연변이 수에 따른 바이러스 제작 확인

상기 실시예 1-2에서의 바이러스 제작 결과를 토대로, E38 모균주에 대해 침묵 돌연변이의 수에 의존적으로 바이러스가 제작되는 지 여부를 확인하기 위해, 추가로 Codon pair deoptimization을 통해 14개, 16개, 18개 및 20개 염기가 치환된 침묵 돌연변이를 도입하여 바이러스 제작 가부를 확인하였다.

구체적으로, ORF7의 14개 염기가 치환된 변이주(E38_ORF7_CPD14_NUM_O)의 ORF7 염기서열은 서열번호 5, 16개 염기가 치환된 변이주(E38_ORF7_CPD16_NUM_X)의 ORF7 염기 서열은 서열번호 6, 18개의 염기가 치환된 변이주(E38_ORF7_CPD18_NUM_X)의 ORF7 염기서열은 서열번호 7, 및 20개의 염기가 치환된 변이주(E38_ORF7_CPD20_NUM_X)의 ORF7 염기서열은 서열번호 8로 표시되었다.

보다 구체적으로, 서열번호 5의 핵산 서열은 서열번호 2의 핵산 서열로 나타내어지는 모균주(E38)의 ORF7 핵산 서열에서 123번째 C가 T로, 129번째 A가 C로, 177번째 T가 C로, 180번째 T가 C로, 186번째 T가 C로, 189번째 C가 T로, 204번째 C가 T로, 213번째 T가 G로, 222번째 C가 G로, 264번째 A가 C로, 267번째 A가 T로, 288번째 T가 C로, 291번째 G가 T로, 및 297번째 C가 T로 치환된 침묵 돌연변이를 포함한다.

서열번호 6의 핵산 서열은, 상기 서열번호 5가 가지는 변이를 모두 포함하며, 추가로 108번째 C가 G로, 및 111번째 G가 A로 치환된 변이를 더 포함한다.

서열번호 7의 핵산 서열은, 상기 서열번호 5가 가지는 변이를 모두 포함하며, 추가로 153번째 T가 C로 치환, 162번째 A가 G로 치환, 171번째 C가 G로 치환, 및 174번째 G가 A로 치환된 변이를 더 포함한다.

서열번호 8의 핵산 서열은, 상기 서열번호 6 및 서열번호 7의 핵산서열이 가지는 모든 변이를 포함한다. 구체적으로, 서열번호 5가 가지는 변이를 모두 포함하며, 추가로 108번째 C가 G로, 111번째 G가 A로, 153번째 T가 C로, 162번째 A가 G로, 171번째 C가 G로, 및 174번째 G가 A로 치환된 변이를 더 포함한다.

바이러스의 제작은 비교예 1-2와 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었으며, E38_ORF7_cpd14_num_o 변이주만이 바이러스 제작에 성공하였으나, 나머지 3종의 변이주(E38_ORF7_cpd16_num_x, E38_ORF7_cpd18_num_x 및 E38_ORF7_cpd20_num_x)는 제작에 실패하였다.

따라서 침묵 돌연변이가 14개 이상인 경우에는 바이러스 제작에 침묵 돌연변이의 수 이외의 다른 요소가 관여함을 확인하였다.

2-2. 침묵 돌연변이 위치에 따른 바이러스 제작

상기 실시예 2-1의 결과를 토대로, 침묵 돌연변이의 위치가 바이러스의 제작 가능성에 영향을 미치는 지 여부를 확인하기 위해, 실시예 1-2에서 제작되지 않은 22개 변이를 가진 바이러스 및 상기 실시예 2-1에서 사용된 E38_ORF7_cpd18_num_x과 공통 위치에 존재하는 변이를 토대로, 모균주의 ORF7 염기서열(서열번호 2)에서 침묵 돌연변이가 18개 (E38_ORF7_cpd18_position_O), 및 22개 (E38_ORF7_cpd22_position_O) 도입된 변이주를 각각 설계하고, 바이러스 제작 가부를 확인하였다.

상기 E38_ORF7_cpd18_position_O 변이주는 서열번호 9의 핵산 서열로 이루어지는 ORF7 부위를 가지며, 구체적으로, 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 야생형 ORF7 부위의 123번 위치의 C가 T로 치환, 129번 위치의 A가 C로 치환, 177번 위치의 T가 C로 치환, 180번 위치의 T가 C로 치환, 186번 위치의 T가 C로 치환, 189번 위치의 C가 T로 치환, 204번 위치의 C가 T로 치환, 213번 위치의 T가 G로 치환, 222번 위치의 C가 G로 치환, 264번 위치의 A가 C로 치환, 267번 위치의 A가 T로 치환, 288번 위치의 T가 C로 치환, 291번 위치의 G가 T로 치환, 297번 위치의 C가 T로 치환, 309번 위치의 T가 C로 치환, 315번 위치의 C가 T로 치환, 327번 위치의 T가 C로 치환, 및 330번 위치의 T가 G로 치환된 변이를 포함한다.

상기 E38_ORF7_cpd22_position_O 변이주는 서열번호 10의 핵산 서열로 이루어지는 orf7 서열을 가지며, 구체적으로, 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 야생형 바이러스의 orF7 부위 중 상기 E38_ORF7_cpd18_position_O 균주가 가지는 모든 변이를 포함하고, 추가로 336번 위치의 A가 G로 치환, 339번 위치의 G가 A로 치환, 348번 위치의 T가 A로 치환, 및 354번 위치의 G가 T로 치환된 변이를 더 포함한다.

상기 각 바이러스의 제작은 비교예 1-2와 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었으며, E38_ORF7_cpd18_position_O 및 E38_ORF7_cpd22_position_O 균주 모두 제작에 성공하였고, 상기 E38_ORF7_cpd22_position_O 변이주는 생물자원센터 (KCTC)에 2019년 11월 5일자로 기탁되었으며, 수탁번호 KCTC 14016BP를 받았다.

도 1에 상기 실시예 1-1 내지 2-2에서 디자인 된 각 바이러스의 ORF7 위치의 변이 부위를 중심으로 한 서열 비교 정렬 (sequence alignment) 결과를 나타내었다. 바이러스의 제작에 성공한 E38_ORF7_CPD14_NUM_O 변이주(ORF7의 핵산 서열: 서열번호 5)와 달리, 서열번호 5의 ORF7 서열에서 108번 및 111번 염기만이 추가 치환된 변이주(E38_ORF7_cpd16_num_X, ORF7 핵산 서열: 서열번호 6)와 상기 서열번호 5의 ORF 서열 중 153번째, 162번째, 171번째 및 173번째 염기가 치환된 변이주(E38_ORF7_CPD18_NUM_X) 에서는 제작이 이루어지지 않았다. 상기 E38_ORF7_cpd16_num_X 와 E38_ORF7_cpd18_num_X의 두 변이주의 변이 위치를 모두 포함하는 E38_ORF7_cpd20_num_x 및 서열번호 4의 핵산 서열로 이루어지는 ORF7 부위를 포함하는 바이러스 변이주 역시 바이러스가 제작되지 않아, 각 변이가 도입되었던 위치인 서열번호 5의 핵산 서열에서 48번 염기, 108 내지 111번 염기, 또는 153 내지 173번 염기는 코돈쌍 탈최적화의 대상에서 배제되어야 함을 확인하였다.

이후 14개 염기 치환 균주(E38_ORF7_cpd14_num_O)에 추가로 297번 염기 뒤쪽의 309, 315, 327, 330번 염기를 치환한 균주(18개 염기 치환 균주, e38_orf7_cpd18_position_o)는 제작에 성공하였고 상기 18개 염기 치환 균주의 ORF7 서열에서 4개 염기를 치환한 336, 339, 348, 358번 염기를 치환한 균주 (22개 염기 치환 균주, e38_orf7_cpd22_position_o)도 제작에 성공하였다.

상기 데이터를 통해 약독화된 유럽형(Type I) PRRSV의 감염성 클론을 얻기 위한 코돈쌍 탈최적화(codon pair deoptimization)는 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 ORF7 부위의 177번 염기 이후에 치환 부위를 적용해야함을 확인하였다.

실시예 3. 바이러스 변이주의 약독화 확인

제작에 성공한 바이러스 4종 (E38_ORF7_cpd7_O, E38_ORF7_cpd14_num_o, E38_ORF7_cpd18_position_o, 및 E38_ORF7_cpd22_position_o) 에 대해 in vivo에서 약독화 여부를 확인하였다. 대조군으로는 상기 변이주들의 모균주인 E38 (original)을 이용하였다.

돼지의 폐 대식세포(Porcine Alveolar Macrophage, PAM)에 상기 4종의 변이주 또는 모균주를 각각 감염시킨 후, 각 바이러스의 증식성을 TCID₅₀ 측정으로 확인하였다.

보다 구체적으로, RPMI 배지(10%(v/v) FBS, 1%(w/v) penicillin, streptomycin 포함) 2ml가 포함된 6well plate에 PAM 세포를 well당 2 X 10⁶ cells/well의 비율로 분주하였다. 다음으로, 제작된 균주와 모균주를 각각 서로 다른 well에 MOI 0.01의 비율로 접종하고 접종 1시간 후 모든 상층액을 제거한 후, 유지액 RPMI 배지(조성 상동)를 2ml 분주하였다. 이후 1일, 2일, 3일, 4일 마다 각각의 well의 상층액을 수거하여 TCID₅₀(Tissue culture infective dose 50)을 측정하였다. TCID₅₀은 시험 전일 미리 96 well plate에 MARC-145 세포 2 X 10⁵ cell/well을 DMEM 배지(10%(v/v) FBS, 1%(w/v) penicillin, streptomycin) 100ul와 함께 분주하여 부착시킨 것을 사용하였다.

상기 수거한 상층액은 200ul씩 96 well plate의 맨 왼쪽 well에 일렬로 분주하고 나머지 well에는 DMEM 배지(FBS, 항생제 무첨가)를 180ul씩 분주하였다. 다음으로, 왼쪽에서부터 차례로 20ul씩 multi-pipet으로 채취하고 오른쪽 well에 분주하면서 10진 희석하여 접종용 바이러스를 준비하였다. Tip을 바꾸며 차례로 희석하고 마지막 12번째 well은 음성 대조군으로 유지하였다(상층액 무첨가 DMEM 배지).

상기 준비된 바이러스 희석액은 MARC-145 cell이 부착된 plate에 접종되었다. 이때, MARC-145 cell의 배양액은 모두 제거하고 PBS 200ul을 각 well에 분주하고 버리기를 3회 반복하여 세척(washing) 과정을 수행하였다. 이후 준비된 바이러스 희석액을 well당 100ul씩 분주하여 접종하였으며, 접종 2시간 이후 접종액을 모두 제거하고 새로운 유지액(DMEM 배지, 10%(v/v) FBS, 1%(w/v) penicillin, streptomycin)을 100ul 분주하였다. 분주 후 약 7일간 세포에서 세포 병변 효과(cytopathogenic effect, CPE)의 일종인 클럼핑(Clumping)과 세포사멸(Apoptosis)의 발생 여부를 확인하였다.

최종 수치는 CPE 현상이 관찰되지 않은 well의 바로 이전 희석 배수를 기준으로, 8개 바이러스 접종액 중 절반인 4개 well이 CPE를 보일 수 있는 희석 배수를 구하였다.

도 2에 상기 TCID₅₀ 분석 결과 그래프를 나타내었다. 도 2에서 * 표시된 데이터는 통계적으로 유의미한 차이를 보였음을 의미하며, 각 균주는 모두 편의상 'E38-변이의 수'의 형태로 표시되었다. 4종의 변이주 모두 모균주(E38-original)에 비해 낮은 증식성을 보였으며, 코돈쌍 탈최적화가 많이 이루어진 균주일수록 약독화되었고, 특히 E38-18 및 E38-22 균주에서는 통계적으로 유의미하게 약독화 되었음을 확인하였다.

구체적으로, E38-22 균주의 경우 접종 후 1일째에 모균주에 비해 약 65% 수준의 TCID₅₀/mL 값을 보였으며, 접종 후 4일째에는 약 35% 수준의 TCID50/mL 값을 나타내어 모균주에 비해 현저히 약독화 되었음을 확인하였다.

실시예 4. 바이러스 변이주의 돼지 체내 증식성(역가) 분석

제작된 각 바이러스 변이주의 돼지 체내에서의 증식성 분석을 위해, 실험용 돼지에 각 바이러스를 접종한 후, 혈액 내 바이러스의 RNA 함량을 Real-time PCR을 이용해 측정하였다. 각 실험에 사용된 돼지 그룹의 정보는 아래 표 4에 나타내었다.

그룹	접종 균주	마리수
T01 (대조군)	E38 (Original)	5
T02	E38_ORF7_cpd7_o	5
T03	E38_ORF7_cpd14_num_o	5
T04	E38_ORF7_cpd18_position_o	5
T05	E38_ORF7_cpd22_position_o	5

실험에 사용한 돼지는 돼지는 SPF 돼지로서 PRRSV에 대해서 어떠한 항원 항체반응도 나타내지 않는 것이 확인된 3주령 자돈을 사용하였다. 다음으로, 이유한 3주령 자돈에 비강 내 각각의 바이러스를 5 TCID₅₀/2ml씩 접종하였다. 접종일로부터 0(접종 당일), 7, 14, 21, 및 28일차에 돼지의 목정맥에서 혈액을 3ml 채취하여 혈청을 분리하고 분리된 혈청에 포함되어있는 바이러스의 RNA를 Intron 사의 Viral gene-spin viral DNA/RNA extraction kit를 이용하여 추출하였다.

구체적으로, 우선 채취한 혈청 150ul을 lysis buffer 250ul 와 혼합하고 15초간 vortex 하였으며 10분간 실온에서 incubation 하고 binding buffer를 350ul를 혼합한 후 가볍게 vortex 하였다. 총 750ul mix를 column에 옮기고 1분간 13,000 rpm으로 원심분리 한 후, 여과액을 버리고 washing buffer A 500ul 를 column에 첨가하여 동일하게 1분간 13000rpm으로 원심분리 하였다. 다시 여과액을 버리고 washing buffer B 500ul를 column에 첨가하여 동일하게 1분간 13000rpm으로 원심분리 하였다. 마지막 여과액을 버리고 다시 동일하게 원심분리 하여 모든 alcohol 성분을 제거하였다. Elution buffer 30ul를 넣고 1분간 incubation 한 뒤 원심 분리하여 최종적으로 RNA를 추출하였다.

상기 추출된 RNA 2ul를 TOPscript RT DRY MIX kit(Enzynomics)를 사용하여 역전사시켜 cDNA를 합성하였다. 이미 건조상태로 준비된 kit의 tube에 추출한 RNA 2ul와 DEPC DW 18ul를 혼합하여 50℃에서 1시간 incubation 이후 95℃에서 10분간 incubation 하여 반응을 종결하였다.

다음으로, Realtime method를 이용하여 혈청 1ml 당 탐지된 합성한 cDNA genomic copy의 양을 측정하였다. Sybr green mix(thermos fisher) 10ul에 DEPC DW 7.5ul와 하기 표 5에 나타낸 PRRSV specific primer 세트(서열번호 11 내지 12) 10pmol를 0.5ul 혼합한 mix에 상기에서 합성한 cDNA 2ul를 넣고 PCR 반응을 수행하였다. 구체적으로, 95℃에서 30초, 60℃에서 어닐링, 60℃에서 1분간 elongation 시켜 DNA를 증폭하고, 추가적으로 융해곡선(dissociation curve)을 구하기 위한 반응을 수행하였다. 총 35cycle 반응을 반복하였으며, 역치 값에 따라 샘플별로 Ct 값을 산출하였고 33 이상은 제외하였다. Ct값은 standard curve에 대입하여 genomic copy 로 환산하여 표기하였다.

PRRSV 특이적 프라이머	염기서열(5'>3')	서열번호
Forward primer (PRRSV_forward)	TGGCCAGTCAGTCAATCAAC	11
Reverse primer (PRRSV_reverse)	AATCGATTGCAAGCAGAGGGAA	12

각 그룹의 바이러스 접종 후 시간의 경과에 따른 혈중 바이러스 역가 그래프를 도 3에 나타내었다. 도 3에서, * 표시는 통계적으로 유의한 결과를 의미하며, 각 바이러스는 기재의 편의상 'E38-변이의 수' 형식으로 표기하였다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바이러스 접종일로부터 7일, 14일, 및 21일 후에 측정한 돼지의 혈중 바이러스 역가는 E38_ORF7_cpd22_position_o를 접종하였을 때, 기존의 모균주 E38 보다 통계적으로 유의적으로 낮게 측정되었으며, 접종 후 지속적으로 모균주에의 역가 대비 33% 내지 63% 수준의 낮은 역가를 유지하였고, 28일 째에는 E38_ORF7_cpd22_position_o의 역가는 0으로 측정되어, 돼지 체내에서 증식성이 매우 낮음을 확인하였다.

이를 통해 본 발명의 유럽형 PRRSV에 대한 codon pair deoptimization을 통해 생체 내에서 증식할 수 있는 최대 역가가 낮고 빠르게 소멸되는 안전한 균주를 만들 수 있음을 확인하였다.

한국생명공학연구원 KCTC14016BP 20191105

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tatcatcagt caacttcaag 7320 gtttgaccac tgagcaagct ttaaactgtt agccgccagc ggcttgaccc gctgtggccg 7380 cggcggctta gttgtgactg aaacggcggt gaaaattata aaataccaca acagaacttt 7440 caccttgggc cctttagacc ttaaagtcac ttccgaggtg gaggtgaaga aatcaactga 7500 gcagggccac gctgttgtgg caaatttatg ttccggtgtc gttttgatga gacctcaccc 7560 accgtccctt attgacgttc ttctgaaacc cggacttgac acgacacccg gcattcaacc 7620 ggggcatggg gccgggaata tgggcgtgaa cggctctact tgggactttg aaactgcgcc 7680 cacaaaggca gaactcgagt tatccaagca aataattcaa gcatgtgaag ttaggcgcgg 7740 ggatgccccg aacctccaac tcccttacaa gctctatcct gttagggggg atcctgaacg 7800 gcataggggc cgcctcatca acaccaggtt tggagatttg tcctacaaaa ctcctcaaga 7860 caccaagtcc gcaatacatg cggcttgttg cctacatccc aacggggccc ccgtgtctga 7920 tggtaaatcc acattaggca ccactcttca acacggtttt gagctttatg tccctactgt 7980 gccctacagt gtcatggagt accttgattc acgccctgac acccctttca tgtgcactaa 8040 acatggcact tccaaggctg ctgcagagga tctccaaaaa tatgacctgt ccacccaagg 8100 gtttgtccta cctggggttc tgcgcctagt gcgcagattc 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aagcccagct tccttggctg 9000 caggattgag ggagggcgac aactagtccc caatcgcgac cgcattctcg ccgctcttgc 9060 ataccacatg aaggcacaga atgcttcaga gtattatgca tctgctgccg caatcctgat 9120 ggattcatgt gcttgcattg accatgaccc tgagtggtat gaggatctta tttgcggcat 9180 tgccaggtgc gctcgccaag atggctacag ttttcccggc ccggcatttt ttatgtccat 9240 gtgggaaaag ctgaaaagtc acaatgaggg aaaaaaattc cgccactgcg gcatctgtga 9300 cgccaaagcc gaccatgcgt ccgcctgtgg acttgatttg tgtttgttcc actcgcattt 9360 tcaccagcac tgcccagtca ctctgggttg tggccaccat gccggttcaa aggaatgcca 9420 gcagtgccag tcacctgttg gagctggcag gtcccctctt gataccgtgc ttaaacaaat 9480 cccgtataaa cctcctcgca ctgttatcat gaaggtggat aataagacga cagccctcga 9540 tccaggaaga tatcagtccc gtcgaggtct cgttgcagtc aagaggggta ttgcaggcaa 9600 tgaagttgat cttgctgatg gagactacca ggtagtgccc cttttgccga cttgcaaaga 9660 cataaatatg gtgaaggtgg cttgcaatgt gctactcagc aagttcatag taggaccacc 9720 aggttccgga aagactacct ggttgttgag tcaggtccag gacgatgatg tcatctacac 9780 acccacccat cagaccatgt ttgatatagt cagtgctctc aaagtttgca ggtattctgt 9840 tccaggagcc tcaggactcc cttttccacc acccgccaga tccgggccgt gggttaggct 9900 cattgccagc gggcacattc ccggccgagt atcgtacctc gatgaggcag gatattgtaa 9960 tcatctggac atccttagac tgctttccaa aacacccctt gtgtgcttag gtgaccttca 10020 gcaacttcac cctgtcggct tcgattccta ctgttatgtt tttgatcaaa tgcctcagaa 10080 gcagctgacc actatttata gatttggccc caacatctgc gcagccatcc agccctgtta 10140 cagggaaaaa cttgaatcca aggctaggaa caccagggtg gtttttacca cccggccagt 10200 gacctttggt caggtactga caccatacca taaagatcgc gttggctctg caataaccat 10260 cgactcatcc caaggggcca cctttgatgt tgtgacatta cacctgccat ccccgaagtc 10320 cctgaataaa tcccgagcac ttgtagccat tactcgggcg agacacgggt tgttcattta 10380 cgacccccat ggccagctcc aggagttttt taacctgagc cctgagcaca ctgactgcaa 10440 ccttgtgttc agccgtgggg atgagctggt agttctgaat gcggacaatg cggtcacaac 10500 tgtagcgaag gccctagaga cgggtccgtc ccgcttccga gtgtcagacc cgagatgcaa 10560 gtctctttta gccgcttgct cggccagtct ggaggggagc tgcatgccac taccacaagt 10620 ggcacataac ctggggtttt acttttcccc cgacagccca gtatttgcac ctcttccaaa 10680 agagttggca ccgcattggc cagtggttac ccaccagaat aatcgggcgt ggcctgatcg 10740 gctcgttgct agcatgcgcc caattgatgc ccgctacagc aaaccaatgg tcggtgcagg 10800 gtatgtagtc gggccgtcca cctttctcgg cacccccggt gtggtgtcat actatctcac 10860 actgtacgtc aagggcgagc cccaggcctt gccggaaaca cttgtttcaa cagggcgtat 10920 agccacggac tgtcgggagt atctcgacac ggctgaggag gaggcagcaa aagaactccc 10980 ccacgcattt attggcgatg tcaaaggtac caaggtcggg ggatgtcatc acatcacatc 11040 aaaatacctg cctaggtttc tgcccaagga ctccgttgcc gtagttggag taagttcgcc 11100 cggcaaagct gctaaagccg tgtgcactct caccgatgtg tacctccctg aacttcggcc 11160 gtatttgcaa cctgagacgg catcgaaatg ctggaaactc aagttagact tcagggacgt 11220 tcgattgatg gtctggaaag gagccactgc ctacttccaa ttggaagggc tcacatggtc 11280 ggcgttgccc gattatgcca ggtttattca gctgcccaaa gacgccattg tatacattga 11340 tccatgtata ggaccggcga cggccaaccg taaggtcgtg cgaaccacgg actggcgggc 11400 cgacctggca gtgacaccgt atgattacgg ggcccagtac attttgacaa cagcctggtt 11460 cgaggacctc gggcctcagt ggaaaatttt ggggttgcag ccctttaggc gggcatttgg 11520 ctttgaaaac accgaggact gggcaatcct tgcgcgccgt atgaatgacg gcaaggacta 11580 cattgactac aactggaatt gcgtccgagg acgcccacac gctatccacg ggcgcgctcg 11640 tgaccatacc tatcattttg ccttgggcac ggaattgcag gtggagctgg gtaaacccga 11700 ctgccgcctg agctagcacc gtgaacctga agtgatgcaa tggggtcgtt gtggagtaaa 11760 attagccagt tgtttgtgga cgccttcacg gagtttcttg ttagtgtggt tgatatcgtc 11820 atctttcttg cgatactgtt tgggttcacc gtcgcaggat ggttattggt ctttcttctc 11880 agattggttt gctccgcgat tctccgttcg cgctctgcca ttcactctcc cgaactatcg 11940 aaggtcttat gaaggcttgc tacccaattg cagaccggac gtcccacaat tcgcattcaa 12000 acacccgttg ggtatgcttt ggcacatgcg ggtctcccac ttaattgatg agatggtctc 12060 tcgccgcatt taccagacta tggaacattc aggtcaagcg gcctggaagc aggtagttgg 12120 tgaggccact ctcacgaagc tatcaaagct cgacatagtc acccatttcc aacacctggc 12180 cgcagtggag gcggattctt gccgctttct tagctcacga ctcgtgatgc taaagaatct 12240 tgtcgttggc aatgtaagcc tacaatacaa caccacgttg gaccacgttg agctcatttt 12300 ccccactcca ggcacgaggc ccaagttgac cgatttcaga caatggctga tcagtgtaca 12360 tgcttccatt ttttcctctg tagcttcatc tgtcactttg ttcgtggtgc tttggcttcg 12420 agttccaatt ctacgctatg tttttggttt ccattggctc acggcaacac atcattcgag 12480 ctaaccatca attacaccat atgcatgccc tgccgcacca gtcaagcggc taaacaaagg 12540 cttgaacccg gtcatagcat gtggtgcaaa atagggcaca ccagctgtga ggagagtgac 12600 cacgatgagt tgttaatgac tatcccgtcc gggtacgata acctcaaact tgagggctat 12660 tatgcttggc tagccttctt gtccttttcc tacgcggccc aatttcatcc ggagctgttt 12720 ggaataggga atgtgtcgcg cgtcttcgtg gacaagcgac accaggccat ttgtgcggtg 12780 catgatggac tcaattcaac cgtacccatt aatcacaaca tctccgcatc gtatgcggtg 12840 tactatcatc atcaaataga cggaggcaat tggttccacc tagaatggct gcggccattc 12900 ttttcctcct ggttggtgct caacgtctca tggtttctga ggcgttcgcc tgcaagccct 12960 gcttctcgac gcatttatca gatattgaga ccaacacgac cgcggctgcc ggtttcatgg 13020 tccttcagga aatcgaatgt ctccagcctc acagggactc agcagcgcag cagagcgttc 13080 cctataagaa acagtcgcaa tgtcgccaag ccgtcggcac cccccagtac atcacgataa 13140 cggctaatgt gaccgacgaa tcatacttgt ataacgcgga tctgctgatg ctttccgcgt 13200 gccttttcta cgcctcagaa atgagcgaga aaggcttcaa agttatcttt gggaatgtct 13260 ctggcgttgt ttccgcttgc gtcaatttca cagattacgt ggcccatgtg acccaacaca 13320 cccagcagca ccatctggta attgatcatg tccgattact gcatttcctg tctccatcta 13380 caatgaggtg ggccacaacc atcgcttgtt tgttctccat tctcttggcg atatgagatg 13440 ttctcacaaa ttggggtgtt tcttgattcc gcactcttgc ttttggtggc tttttttgct 13500 gtgtatcggc ttgtcctggt cctttgccga tggcaacggc aacagctcga cataccaata 13560 catatataac ttgacgatat gcgagctgaa tgggaccgcc tggttgtcta cccacttttc 13620 ttgggcagtc gagacctttg tgctttaccc ggttgcgact cacattctct cactgggttt 13680 tctcacaaca agccatttct ttgatgcgct cggtctcggc gctgtgtcca tcacagggtt 13740 ttgtggcaaa cgatatgtgc tcagcagtat ctacggcgct tgtgctcttg cagcgttcgt 13800 gtgcttcgcc atccgtgctg ctaaaaattg tatggcttgc cgctacgccc gcacccggtt 13860 caccaacttc attgtagacg accgggggag gattcatcgg tggaagtccc cggtggtggt 13920 ggagaaattt ggcaaagccg aaattggcgg cggtcttgtc accatcaaac atgtcgtcct 13980 cgaaggggtt aaagctcaac ccttgacgag gacttcggct gagcaatggg aagcctagac 14040 agtttttgcg atgatcctgc tgctgtgcaa aagcttgtgc tagcctttag cattacatac 14100 acacctataa tgatatatgc ccttaaggtg tcacgcggtc ggctcttagg gctgctgcac 14160 atcctgatat tcctgaactg ctcctttact ttcgggtaca tgacgtatgt gcacttccaa 14220 tccgccaacc gtgtcgcact cactttgggg gccgttgttg ccctcctgtg gggcgtttat 14280 agcttcacag agtcatggaa gttcattact ttcagatgca gattgtgttg cctaggccgg 14340 cgatacattc tggcccctgc ccaccacgta gaaagtgctg caggtctcca ttcaatccca 14400 gcgtctggta accgagcata cgctgtgaaa aagcccggac taacatcagt aaacggcact 14460 ctagtaccag gacttcggag cctcgtgctg ggcggcaaac gagctgttaa acgaggagtg 14520 gttaacctcg tcaagtatgg ccggtagaaa ccagagccag aagaaaaaga gaaacacagc 14580 tccaatgggg aatggccagt cagtcaatca actgtgccaa ttgctgggta caatgataaa 14640 gtcccagcac caacggtcca ggggaggaca ggctaaaaag aaaaagcctg agaagccaca 14700 ttttcccttg gctgctgaag atgacatccg gcatcacctc acccaaactg aacgttccct 14760 ctgcttgcaa tcgatccaga cggctttcaa tcaaggcgca ggaactgcgt cgctttcatc 14820 cagtgggaag gtcagttttc aggttgagtt catgttgccg gttgctcata cagtgcgctt 14880 gattcgcgtg acttctacat ccgccagtca ggatgcaaat taacttgaca gtcaggtgaa 14940 tggccgcgat tggcgtgtgg cctctgagtc acctattcaa ttagggcgat cacatggggg 15000 tcatacttaa ttaggcaaga accatgtgac cgaaattaaa aaaa 15044 <210> 2 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_original <400> 2 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccaat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtccca gcaccaacgg 120 tccaggggag gacaggctaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cttggctgct 180 gaagatgaca tccggcatca cctcacccaa actgaacgtt ccctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagtgg gaaggtcagt 300 tttcaggttg agttcatgtt gccggttgct catacagtgc gcttgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 3 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_CPD7_O <400> 3 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccaat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtccca gcaccaacgg 120 tccaggggag gacaggctaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cttggccgcc 180 gaagatgaca tccggcatca ccttacccaa acggaacgtt cgctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgccggtact gcgtcgcttt catccagtgg gaaggtcagt 300 tttcaggttg agttcatgtt gccggttgct catacagtgc gcttgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 4 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_CPD22_X <400> 4 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccgat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtcgca acaccaacgg 120 tctaggggcg gacaggctaa aaagaaaaag cccgagaagc cgcattttcc gttagccgcc 180 gaagacgata tccggcatca ccttacccaa acggaacgtt cgctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgccggtact gcgtcgcttt catctagcgg taaggttagt 300 tttcaggttg agttcatgtt gccggttgct catacagtgc gcttgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 5 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_CPD14_NUM_O <400> 5 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccaat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtccca gcaccaacgg 120 tctaggggcg gacaggctaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cttggccgcc 180 gaagacgata tccggcatca ccttacccaa acggaacgtt cgctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgccggtact gcgtcgcttt catccagcgg taaggttagt 300 tttcaggttg agttcatgtt gccggttgct catacagtgc gcttgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 6 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_CPD16_NUM_X <400> 6 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccaat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtcgca acaccaacgg 120 tctaggggcg gacaggctaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cttggccgcc 180 gaagacgata tccggcatca ccttacccaa acggaacgtt cgctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgccggtact gcgtcgcttt catccagcgg taaggttagt 300 tttcaggttg agttcatgtt gccggttgct catacagtgc gcttgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 7 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_CPD18_NUM_X <400> 7 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccaat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtccca gcaccaacgg 120 tctaggggcg gacaggctaa aaagaaaaag cccgagaagc cgcattttcc gttagccgcc 180 gaagacgata tccggcatca ccttacccaa acggaacgtt cgctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgccggtact gcgtcgcttt catccagcgg taaggttagt 300 tttcaggttg agttcatgtt gccggttgct catacagtgc gcttgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 8 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_CPD20_NUM_X <400> 8 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccaat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtcgca acaccaacgg 120 tctaggggcg gacaggctaa aaagaaaaag cccgagaagc cgcattttcc gttagccgcc 180 gaagacgata tccggcatca ccttacccaa acggaacgtt cgctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgccggtact gcgtcgcttt catccagcgg taaggttagt 300 tttcaggttg agttcatgtt gccggttgct catacagtgc gcttgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 9 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_CPD18_POSITION_O <400> 9 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccaat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtccca gcaccaacgg 120 tctaggggcg gacaggctaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cttggccgcc 180 gaagacgata tccggcatca ccttacccaa acggaacgtt cgctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgccggtact gcgtcgcttt catccagcgg taaggttagt 300 tttcaggtcg agtttatgtt gccggtcgcg catacagtgc gcttgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 10 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E38_ORF7_CPD22_POSITION_O <400> 10 atggccggta gaaaccagag ccagaagaaa aagagaaaca cagctccaat ggggaatggc 60 cagtcagtca atcaactgtg ccaattgctg ggtacaatga taaagtccca gcaccaacgg 120 tctaggggcg gacaggctaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cttggccgcc 180 gaagacgata tccggcatca ccttacccaa acggaacgtt cgctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgccggtact gcgtcgcttt catccagcgg taaggttagt 300 tttcaggtcg agtttatgtt gccggtcgcg catacggtac gcttgatacg cgttacttct 360 acatccgcca gtcaggatgc aaattaa 387 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRRSV_forward <400> 11 tggccagtca gtcaatcaac 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRRSV_reverse <400> 12 aatcgattgc aagcagaggg aa 22

Claims (10)

1. ORF7이 서열번호 2의 핵산 서열에서 123번 위치의 C가 T로 치환, 129번 위치의 A가 C로 치환, 177번 위치의 T가 C로 치환, 180번 위치의 T가 C로 치환, 186번 위치의 T가 C로 치환, 189번 위치의 C가 T로 치환, 204번 위치의 C가 T로 치환, 213번 위치의 T가 G로 치환, 222번 위치의 C가 G로 치환, 264번 위치의 A가 C로 치환, 267번 위치의 A가 T로 치환, 288번 위치의 T가 C로 치환, 291번 위치의 G가 T로 치환, 297번 위치의 C가 T로 치환, 309번 위치의 T가 C로 치환, 315번 위치의 C가 T로 치환, 327번 위치의 T가 C로 치환, 및 330번 위치의 T가 G로 치환된 핵산 서열로 이루어지는,
   약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 변이주.
2. 제1항에 있어서, 상기 ORF7은 서열번호 2의 핵산 서열이 336번 위치의 A가 G로 치환, 339번 위치의 G가 A로 치환, 348번 위치의 T가 A로 치환, 354번 위치의 G가 T로 치환, 또는 이들의 조합에 의하여 추가로 변이된 핵산 서열로 이루어지고,
   상기 변이주는 야생형 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스에 비해 코돈쌍 편향 (Codon Pair Bias, CPB)이 낮은 것인, 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 변이주.
3. 제1항에 있어서, 상기 ORF7은 서열번호 2의 핵산 서열이 336번 위치의 A가 G로 치환, 339번 위치의 G가 A로 치환, 348번 위치의 T가 A로 치환 및 354번 위치의 G가 T로 치환에 의하여 추가로 변이된 핵산 서열로 이루어지는, 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 변이주.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 변이주는 야생형 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스에 비해 코돈쌍 편향 (Codon Pair Bias, CPB)이 낮은 것인, 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 변이주.
5. 제1항에 있어서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스인 것인, 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주.
6. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 예방용 약학적 조성물.
7. 제6항에 있어서 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군은 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군인, 조성물.
8. 제6항에 있어서 상기 조성물은 백신 조성물인, 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 백신은 생백신인, 조성물.
10. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 약독화된 돼지 생식기 호흡기 바이러스 변이주를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 예방용 키트.

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