KR101933931B1 - 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 이를 이용한 백신 - Google Patents

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 이를 이용한 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스의 변이주에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스 변이주는 모균주보다 약독화되어 있어 병원성이 낮고 안정성이 높으면서, 인터페론-알파 및 인터페론-감마의 분비를 향상시켜 PRRS 질환의 효과적인 예방 및 치료용 백신으로 사용할 수 있다.

Description

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 이를 이용한 백신{Mutant strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and antiviral vaccines including the same}
본 발명은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 이를 이용한 백신에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 바이러스 변이주는 모균주에 비해 병원성이 낮고 안전성이 높으면서, 인터페론-알파 및 인터페론-감마의 분비를 향상시킨 변이주를 제공하고 상기 변이주를 이용하여 돼지 생식기 및 호흡기 증후군을 효과적으로 방어할 수 있는 백신을 제공할 수 있다.
돼지 생식기 및 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, 이하 PRRS)은 돼지 써코바이러스 감염증 및 구제역과 함께 국내 양돈산업에 가장 큰 피해를 주는 전염병에 해당한다. PRRS는 임신한 암퇘지의 생식 불능, 유산이나 조산, 사산의 번식장애를 유발하며, 젖먹이 돼지와 비육돈에게 재채기, 발열 등의 호흡기 증상을 유발한다. 일반적으로 바이러스에 이환된 이후 세균 등의 2차 감염에 의해 심한 호흡기 증상을 야기하지만, 만성적으로 감염된 경우에는 특징적인 임상 증상 없이 증체량 감소 및 폐사율의 증가를 나타나게 된다.
이 바이러스 질환은 미국에서 1987년에 최초로 발견되었고, 이어서 유럽에서 발견되었으며, 1990년대 초에 아시아에서 동정되었다. 지금까지, PRRS는 양돈국가에서 풍토병의 특징을 가지며 세계적으로 확산되어, 매년 막대한 경제적 손실을 일으켰다.
PRRS의 원인이 되는 병원체는 Arterivirus 속, Arteriviridae 과, Nidovirales 목에 속하는 PRRS 바이러스이다. PRRS 바이러스는 positive-sense single stranded RNA genome을 갖고 있으며, 크기는 약 15.4 kilobase이다. PRRS 바이러스의 genome은 9개의 ORF를 갖고 있다(Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993). 그 중 비구조단백질(Non Structural Protein, NSP)을 코딩하는 ORF1a 및 ORF1b가 바이러스 지놈의 약 80%를 차지하고 있다(Bautista et al., 2002; Meulenberg et al., 1993; Snijder and Meulenberg, 1998, 2001). 글리코실화된 구조 단백질인 GP2, GP3, GP4, GP5와, 비글리코실화된 막(Membrane, M) 단백질, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질은 나머지 20%를 차지하는 ORF에 의하여 코딩된다. minor 구조단백질인 GP2, GP3, GP4가 heterotrimer를 형성하여 바이러스가 숙주 세포 내로 침입할 때 작용하며, major 구조단백질인 GP5, M은 heterodimer를 형성하여 바이러스의 감염력을 높여주는 작용을 한다.
PRRS 바이러스는 RNA 바이러스의 특성상 변이가 심하여 바이러스 간에 차이가 많이 난다. PRRS 바이러스는 크게 북미형과 유럽형으로 나뉘는데, 유럽형을 대표하는 타입 I형(Lelystad virus, LV) 및 북미형 바이러스주(Northern American strain) ATCC VR2332를 대표하는 타입 II 형(VR2332의 게놈 서열은 GenBank 등록번호 AY150564 참조)(Murtaugh et al., Arch Virol. 1995; 140:1451-1460) 이 있다.
북미형과 유럽형 간에는 최대 40%까지 유전자 차이가 존재하여 서로 교차 방어가 되지 않는 것으로 알려져 있다. 또한 같은 타입에 속하는 변이주 간에도 교차 방어가 되지 않는 경우가 많다(Meng, X. J. et al., 2000). 이로 인해, 각각에 대해 표준 변이주 기반의 백신은 제작되어 있지만 교차 방어능이 좋지 못하기 때문에 PRRS를 효과적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다. 이를 극복하기 위하여 안전성, 면역원성, 및 방어능을 효과적으로 갖춘 백신을 제작하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다.
이 같은 질병의 중요성 때문에 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)의 원인체인 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 발견한 이후 약 20년 동안 이 바이러스에 대한 예방법을 개발하기 위하여 많은 노력이 투자되었음에도 아직까지 효과적인 예방법 및 관리법이 개발되지 않은 실정이다. 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV) 제어를 위해 불활화 백신과 약독화 생백신 등 다양한 백신이 개발되었으나 오직 감염성이 확보된 약독화 백신만이 만족스러운 수준의 방어 효과를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 앞서 살핀 바와 같이, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)가 유전적으로 매우 다양하게 존재하기 때문에 다양한 바이러스들 간의 교차면역이 부재하여 하나의 백신으로 다양한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 방어하기는 어렵다. 또한 현재 약독화 백신은 다른 동물 종의 세포 주에서 100~200 계대 이상의 연속 계대를 통해서만 생산이 가능하므로 개발 기간이 길고 효능과 안전성의 보장이 어려운 문제가 있다.
한국공개특허 제2007-0064666호에는 '돼지의 생식 및 호흡 증후군 바이러스 돌연변이'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1152012호에서는 '돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 균주 및 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 LMY 균주의 NSP1-beta(Non structure protein 1-beta)의 유전자가 mutation된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 병원성이 낮고 안정성이 높으면서, 인터페론-알파 및 인터페론-감마의 분비를 향상시킨 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 변이주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 약독화 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 이용하여, PRRS 질환의 효과적인 예방 및 치료용 백신을 제공하는 것이다.
본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스의 변이주에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스 변이주는 모균주보다 약독화되어 있어 병원성이 낮고 안정성이 높으면서, 인터페론-알파 및 인터페론-감마의 분비를 증가시켜 돼지의 면역력을 향상시킴으로써 PRRS 질환의 효과적인 예방 및 치료용 백신으로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 명세서에 사용된 "약독화된 바이러스"는 PRRS 질환의 임상 징후를 유발하지 않고 표적 포유동물에서 면역반응을 유발할 수 있는 무독성 바이러스를 의미하기도 하고, 또한 약독화된 바이러스로 감염되고 약독화된 바이러스를 투여받지 못한 동물에서 임상 징후의 빈도 또는 중증도가 비-약독화된 PRRS 바이러스로 감염된 "대조군" 동물에 비해 감소된 것을 의미하기도 한다. 이러한 상황에서, "감소/감소된"이란 용어는 앞에서 정의한 대조군에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 더욱 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 100% 이상의 감소를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "백신 조성물"은 PRRS 바이러스 변이주 또는 이의 임의의 면역원성 단편 또는 분획, 바람직하게는 약독화된 PRRS 바이러스 변이주, 예컨대 상기 본 발명의 PRRS 바이러스 변이주일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 포함하는 것인, PRRSV 변이주를 의미한다. 이는 숙주의 "면역학적 반응"을 PRRSV에 대한 세포 및/또는 항체 매개의 면역 반응으로 유발한다. 백신 조성물은 PRRSV 감염 및 이와 관련된 임상 징후들에 대해 예방 면역을 부여할 수 있는 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 "면역 반응"은 상기 본 발명의 PRRSV 약독화 바이러스 변이주, 또는 이를 포함하는 백신 조성물을 투여받은 동물에게 투여된 바이러스 변이주 또는 백신에 대한 임의의 세포- 및/또는 항체-매개의 면역 반응을 의미한다. 보통, "면역 반응"은 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: 당해 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γδ T 세포의 생산 또는 활성화. 숙주는 면역원성 조성물이나 백신을 투여받지 않은 대조군에 비해 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소되도록 치료적 또는 예방적 면역학적 반응을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 예방은 최대 전술한 숙주 감염과 관련된 증상들의 결여 및 이를 비롯하여 빈도 또는 중증도의 감소에 의해 증명될 것이다.
본 명세서에 사용된 "돼지들", "돼지" 및 "새끼돼지"는 호환 사용될 수 있다.
"백신을 접종하다"는 PRRS 질환에 노출되기 전에 본 명세서에 기술된 PRRSV 변이주 또는 이를 포함하는 백신을 투여하는 것을 의미한다.
"예방하다" 또는 "예방"은 본 발명의 PRRSV 변이주 또는 이를 포함하는 백신조성물을 투여받은 결과로서, PRRS의 임상 징후의 중증도 또는 빈도가 감소하는 것을 의미한다. 중증도 또는 빈도의 감소는 본 발명의 PRRSV 변이주 또는 이를 포함하는 백신조성물을 투여받지 않은 동물 또는 동물 그룹과 비교한 결과이다.
본 발명은 돼지에 영향을 미치는 바이러스 질환인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRSV)에 대한 약독화된 바이러스 변이주를 제공한다. 구체적으로 상기 바이러스 변이주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 LMY 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)의 Nonstructural protein 1-beta(NSP1-beta)에 포함된 적어도 하나의 염기가 치환된 변이 NSP1-beta를 포함하는 PRRSV 변이주이다.
상기 약독화된 바이러스 변이주는 LMY 모균주 보다 약독화되어 있으며, 약독화된 변이주를 제조하기 위해, 모균주의 NSP1-beta 염기서열(서열번호 1) 중 적어도 하나의 염기를 치환한다.
본 발명자들은 LMY 바이러스 유전체 중 NSP1-beta 부위가 conserve 된 부분임에 착안해, 이 부분의 특정 염기를 일부 치환하였으며 본 발명의 변이주는 LMY의 NSP1-beta 부위가 mutation되며 안정성이 높은 바이러스 변이주이다. 기존에 약독화 PRRSV 백신은 NVSL 97-7895의 ORF1 부위 및 국내에 가장 만연하는 변이주인 LMY의 ORF2에서 ORF7까지의 부위를 포함하는 키메릭 바이러스(국제공개특허: WO2015056850) 등이 공지되어 있을 뿐, 본 발명의 LMY의 NSP1-beta 부위를 mutation시켜 제조한 약독화된 바이러스 변이주는 이제까지 알려진 바가 없다.
본 발명의 일 예에 따르면, 치환하는 염기서열은 공지되어 있는 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 사용하여 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는, 본 발명자들이 개발한 SAVE 프로그램을 이용하여 선택한 것일 수 있다.
구체적으로, 모균주인 LMY 의 genome에서 유전적으로 안전성이 높은 NSP1-beta부위를 본 발명자들이 자체 개발한 SAVE 프로그램으로 분석하여 비교적 Codon Pair Bias (CPB)가 높은 곳을 나타난 염기 서열의 일부 또는 전체를 선택해 치환하여 Deoptimization 시킨 것이다. 상기 SAVE 프로그램을 사용해 바이러스 유전자 코돈이 쌍으로 배열시 상호작용하여 생기는 편향성인, CPB를 컴퓨터 알고리즘을 이용해 수치화하였다. 상기 CPB는 바이러스 유전자의 일부 염기서열 치환을 통해 변동되고, 바이러스의 증식성은 염기서열 치환을 통해 CPB 수치가 감소(deoptimization)되면 증식성이 감소하고, 약독화된다(Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al.). 따라서, CPB 값이 높게 나타난 염기서열을 치환, 바람직하게는 Codon Pair Deoptimization 원리에 따라 silent mutation 시켜 본 발명의 재조합 균주를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기에서 기술한 본 발명의 PRRSV 변이주의 CPB수치는 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)보다 낮은 수치를 나타내며, 바람직하게는 -0.39 내지 0, 더욱 바람직하게는 -0.35 내지 -0.20, 적절하게는 -0.35 내지 -0.26, 예를 들어 -0.3377269630038442 일 수 있다. CPB 수치가 -0.39 미만일 경우, 바이러스 작출에 어려움이 있으며, 0 을 초과할 경우, 작출은 가능하나 증식성이 감소하지 않아 약독화되지 않는다는 문제점이 있다. 따라서, 본 발명의 약독화된 변이주는 상기 CPB 수치를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 CpG, UpA 수치가 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.) 의 1.0배 내지 3.0배를 갖는 PRRSV 변이주를 제공한다. CpG, UpA 비율의 변화는 deoptimization 과정에서 필연적으로 발생하는 결과로서, 진핵세포 유전자의 CpG, UpA의 수치를 증가시키면, cell stress를 유발하여 바이러스의 증식성이 감소되어 바이러스를 약독화 시킬 수 있다(The influence of CpG and UpA dinucleotide frequencies on RNA virus replication and characterization of the innate cellular pathways underlying virus attenuation and enhanced replication, Nucleic Acids Research, 2014, Nicky J. Atkinson et al.).
본 발명의 약독화된 PRRSV 균주는 모균주보다 높은 CpG, UpA 수치를 가지며, 바람직하게는 모균주의 1.0배 내지 3.0배 높은 수치를 갖고, 예를 들어 상기 본 발명의 약독화된 변이주의 CpG는 1.1753, UpA 는 1.03 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 예는 상기 본 발명의 약독화된 변이주와 이의 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)를 돼지의 폐 대식세포에 접종하고 측정한 변이주의 TCID50의 값이, 모균주의 TCID50 값에 비해 0.01 배 내지 0.1배의 TCID50 값을 갖는 변이주를 제공한다. 바람직하게는 상기 측정기간은 2일 내지 5일 후이며, 상기 TCID50 값은 0.05배 내지 0.1배 일 수 있다.
본 발명의 PRRSV 변이주는 모균주 보다 낮은 TCID50 값을 가지며, 모균주보다 증식성이 약하며, 약독화되어있다.
또 다른 본 발명의 일 예는, 상기 변이주와 이의 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)를 돼지에 접종하고 측정한 변이주의 Interferon alpha(IFN alpha) 함량이, 모균주의 1.2배 내지 5.0배 바람직하게는 1.2배 내지 3.0배를 갖는 변이주를 제공한다. 상기 측정기간은 적절하게는 7일 내지 14일 후이며, 예를 들어 7일 뒤 IFN alpha 수치가 모균주 LMY ver0를 기준으로 1.3 배, 14일 뒤 측정한 IFN alpha 수치가 2.7 배일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 예는 본 발명의 약독화된 변이주와 이의 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)를 돼지에 접종하고 측정한 변이주의 Interferon gamma 분피세포의 수가 모균주의 1.1 내지 3.0배, 바람직하게는 1.1 내지 2.0배, 예를 들어 1.6배인 변이주를 제공한다. 상기 측정기간은 적절하게는 15일 내지 25일 후, 바람직하게는 21일 후일 수 있다.
따라서, 본 발명의 약독화된 변이주 또는, 이를 포함하는 백신조성물을 돼지에 접종했을 때, IFN alpha 및 IFN gamma 의 분비가 증가하였으며, 본 발명은 돼지의 체내 면역인자의 발현을 증가시켜 PRRS에 대한 면역 효과를 현저히 상승시킨다.
한편, 상기 본 발명의 바이러스 변이주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 LMY 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)의 Nonstructural protein 1-beta(NSP1-beta)에 포함된 적어도 하나의 염기가 치환된 변이 NSP1-beta를 포함하는 PRRSV 변이주일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열 중 1개 내지 203개의 염기서열이 치환되거나, 더욱 바람직하게는 1개 내지 66개의 염기서열이 치환된 변이주일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 변이주는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 LMY 균주의 NSP1-beta(Nonstructural protein 1-beta) 염기서열 중 5'말단으로부터 3, 6, 9, 15, 18, 21, 33, 39, 42, 48, 72, 78, 81, 87, 93, 99, 114, 133, 135, 138, 141, 144, 165, 168, 189, 195, 198, 201, 204, 207, 231, 246, 249, 252, 270, 285, 288, 298, 300, 306, 309, 318, 327, 339, 342, 345, 351, 360, 363, 366, 384, 396, 399, 408, 414, 423, 426, 486, 489, 498, 507, 513, 526, 528, 546, 및 570 번째 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기가 치환된 변이 NSP1-beta를 포함하는 변이주일 수 있으며, 바람직하게는 하기 표 1의 염기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기가 치환된 변이 NSP1-beta를 포함하는 변이주일 수 있다.
순서 염기 순서 염기 순서 염기 순서 염기 순서 염기
3 C 99 G 231 C 345 T 507 C
6 C 114 T 246 C 351 T 513 C
9 A 133 T 249 T 360 C 526 C
15 C 135 A 252 G 363 A 528 C
18 C 138 T 270 T 366 C 546 T
21 A 141 G 285 C 384 T 570 C
33 T 144 G 288 T 396 C
39 C 165 C 298 C 399 C
42 T 168 T 300 C 408 C
48 C 189 C 306 G 414 C
72 C 195 C 309 A 423 T
78 C 198 T 318 G 426 C
81 C 201 C 327 C 486 G
87 T 204 C 339 C 489 C
93 C 207 A 342 G 498 T
또 다른 본 발명의 일예에 따르면, 상기 변이주는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2로 이루어진 NSP1-beta 염기서열을 포함하는, 변이주일 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 변이주는 기탁번호 KCTC 13394BP (LMY ver2 변이주로 명명)를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예는 앞서 설명한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 약독화 변이주를 포함하는 세포를 제공한다.
상기 세포는 변이주 바이러스를 다량 제조하기 위해, 변이주 바이러스 DNA, 또는 이를 포함하는 벡터, 또는 변이주 바이러스가 트랜스펙션되는 세포를 의미하며, 세포의 종류를 특별히 한정하지는 않는다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 약독화 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 변이주는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 백신은 생백신 또는 사백신일 수 있으나, 생백신인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본원에 기술된 약독화된 PRRS 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체에 전술한 하나 이상의 바이러스주를 생존 상태로 함유하는 변형 생백신일 수 있다. 또한, 또는 대안적으로, 불활성화된 바이러스를 사백신을 제조하는 데에도 사용할 수 있다.
한편, 백신 조성물에 포함된 본 발명의 약독화 변이주의 유효량은 바이러스의 유효 용량이 투여된 동물에서 면역 반응을 유인하거나 유인할 수 있는 바이러스의 양일 수 있다. 유효한 양은 백신 성분 및 투여 스케줄에 의존적일 수 있다.
본원에 기술된 약독화된 변이주 및 이를 포함하는 백신 조성물은 PRRS 질환의 영향으로부터 돼지를 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또한, PRRS 바이러스 변이주의 면역원성 단편 또는 분획을 비롯한 서브유닛도 PRRS 질환의 영향으로부터 돼지를 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약독화된 변이주 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 PRRS를 유발하는 PRRS 바이러스주에 돼지가 노출되기 전에 예방적으로 투여될 수 있고, 상기 바이러스주에 돼지가 노출됨과 동시에 돼지에 투여될 수 있고, 바이러스주에 표적 돼지가 노출된 후 치료적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약독화된 PRRSV 변이주, 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 경구, 비경구, 피하, 근육내, 피내, 설하, 경피, 직장, 경점막, 흡입을 통한 표면적, 협측 투여를 통해, 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다. 또한, PRRS 바이러스, 바람직하게는 약독화된 PRRS 바이러스는 약독화된 바이러스의 서방출을 허용할 수 있는 이식체 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약독화된 PRRSV 변이주 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 주사, 흡입 또는 이식을 통해 투여될 수 있고, 주사가 특히 바람직하다. 백신접종 또는 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라 PRRS 바이러스, 바람직하게는 약독화된 PRRSV 변이주 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 1회 또는 여러 번, 또한 간헐적으로, 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 다른 투여량으로 투여될 수 있다. 주사는 원하는 양으로 주사하거나 피하 혹은 비강에 분무하여 주입할 수 있다, 또는 대안적으로 연속 주입일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 약독화 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 변이주 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.) DNA로부터 상기 NSP1-beta 변이 DNA 를 제조하는 단계, 상기 변이 NSP1-beta DNA를 벡터에 클로닝하는 단계, 및 상기 클로닝된 벡터를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, 약독화 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 변이주 제조방법을 제공한다.
상기 변이주는 앞서 설명한 것과 동일하며, CPB(codon pair bias) 수치가 -0.39 내지 0 일 수 있으며, CpG, UpA 수치가 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.) 의 1.0배 내지 3.0배일 수 있다.
상기 벡터를 클로닝하는 단계는 일반적으로 알려진 클로닝 기술을 사용할 수 있으며, 그 종류를 특별히 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 본 발명의 백신 조성물을 투여함으로써 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 것을 포함하는 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 조성물을 피하 주사, 정맥내 주사, 진피내 주사, 비경구 주사, 근육내 주사, 무침(needle free) 주사, 전기천공, 경구 전달, 비내 전달, 구비강(oronasal) 전달, 또는 그의 임의의 조합에 의해 투여할 수 있다.
본 발명은 전술한 임의의 방법을 수행하기 위한 키트(kit)를 제공할 수 있다. 이 키트는 용기, 바람직하게는 본 발명의 약독화된 PRRS 바이러스 변이주를 함유하는 백신 조성물, 약제학적으로 허용되는 담체, 보강제 및 PRRS 감염의 임상 징후 또는 효과, 바람직하게는 PRRS의 빈도 또는 중증도를 경감시키도록 이를 필요로 하는 동물에게 상기 면역원성 조성물을 투여하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 주사 수단 및/또는 다른 형태의 투여 수단을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 용매를 포함할 수 있다. 약독화된 백신은 동결건조될 수 있고, 용매로 복원되어 주사 및/또는 흡입용 용액이 될 수 있다. 용매는 물, 생리식염수, 완충액 또는 보강 용매일 수 있다. 키트는 약독화된 바이러스, 용매 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 분리 용기를 포함할 수 있다. 사용설명서는 하나 이상의 용기에 부착된 라벨 및/또는 인쇄물일 수 있다.
본 발명에 따른 PRRSV 바이러스 변이주는 돼지에서 Type I Interferon를 현저히 증가시킴으로써 PRRS 를 효과적으로 방어하는데 이용할 수 있으며, 이에 PRRS용 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 PRRSV LMY ver2와 LMY의 계통수(Phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 2는 PRRSV LMY ver2와 LMY의 돼지폐포대식세포(Porcine Alveolar Macrophage cell; PAM cell) 에서의 증식성 차이를 나타낸다.
도 3은 돼지에 PRRSV LMY ver2, PRRSV LMY ver0, PRRSV VR ver2, PRRSV VR ver0, NC 접종 후 Interferon alpha 분비 차이를 비교한 것이다.
도 4는 돼지에 PRRSV LMY ver2, PRRSV LMY ver0, Ingelvac PRRS MLV 및 PBS 접종 후 Interferon gamma 분비 차이를 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 약독화된 재조합 PRRSV 균주의 제조
1-1. SAVE 프로그램을 이용한 Deoptimization
재조합 PRRS(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) 바이러스 균주는 기존 검역본부에서 분리한 PRRS균주인 LMY균주(GenBank accession no.DQ473474.1.)의 NSP1-beta(Non structure protein 1-beta)(서열번호: 1)의 유전자 염기서열 중 66개 염기를 치환하여 제조하였으며, 상기 제조된 변이 염기서열을 갖는 변이 NSP1-beta(서열번호 2)를 하기 표 2에 나타냈고, LMY ver2로 명명하였다.
명칭 염기서열 서열번호
LMY의 NSP1 beta 유전자 GCTGCTGTCTACGATGTTGGTCATGGCGCCGTCATGTATGTGGCCGATGAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCGTGGCGGGGATGAAGTAAGATTTGAAACTGTCCCACAGGAGCTCAAGTCGGTTGCGAACCAACTCTGCACCTCCTTCCCACCCCACCACGTAGTGGACATGTCTAAGTTCGCCTTTACAGCCCCTGGGTGTGGTGTTTCTATGCGGGTCGAACGTCAATATGGCTGTCTCCCCGCTGACACTGTCCCCGAAGGCAACTGCTGGTGGAGCTTGTTTGACTCGCTCCCATTGGAAGTCCAGGGCAAAGAAATTCGCCATGCTAACCAATTTGGCTACCAGACCAAGCATGGTGTCTCTGGTAAGTACCTACAGCGGAGGCTGCAAATTAATGGTCTCCGAGCAGTAGCTGACCCAAATGGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTAGCGGAAGAACCCAGTTACCCTGGGTTTGAGGACCTCCTCAGAATAAGGGTTGAGTCTAACACGTCACCATTGGCTAACAAGGATGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC 1
LMY ver2
NSP1 beta 유전자		 GC C GC C GT A TACGA C GT C GG A CATGGCGCCGT T ATGTA C GT T GCCGA C GAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCG C GGCGG C GA C GAAGT T AGATT C GAAAC G GTCCCACAGGAGCT T AAGTCGGTTGCGAACCAA T T A TG T AC G TC G TTCCCACCCCACCACGTAGT C GA T ATGTCTAAGTTCGCCTTTAC C GCCCC C GG T TG C GG C GT A TCTATGCGGGTCGAACGTCAATA C GGCTGTCTCCCCGC C GA T AC G GTCCCCGAAGGCAACTG T TGGTGGAGCTTGTT C GA T TCGCTCCCA C T C GAAGT G CA A GGCAAAGA G ATTCGCCA C GCTAACCAATT C GG G TA T CAGAC T AAGCATGG C GT A TC C GGTAAGTACCTACAGCG T AGGCTGCAAAT C AA C GGTCTCCG C GCAGT C GCTGACCC T AA C GGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACT G GC C GAAGAACC T AGTTACCC C GGGTT C GAGGACCTCCTC C G C ATAAGGGTTGAGTCTAA T ACGTCACCATTGGCTAACAAGGA C GAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC 2
구체적으로, 상기 재조합 균주 LMY ver2는 일반적으로 알려진 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램 또는, 본 발명자들이 개발한 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 이용하여 Codon Pair Deoptimization 원리(표 1)에 따라 silent mutation 시켜 제조하였다.
우선, SAVE 프로그램을 사용해 바이러스 유전자 코돈이 쌍으로 배열시 상호작용하여 생기는 편향성인, CPB(codon pair bias)를 컴퓨터 알고리즘을 이용해 수치화하였다. CPB는 바이러스 유전자의 일부 염기서열 치환을 통해 변동되며, 바이러스의 증식성은 염기서열 치환을 통해 CPB 수치가 감소(deoptimization)되면 증식성이 감소하고, 약독화된다(Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al.).
따라서, 본 발명자들은 모균주인 LMY 의 genome에서 유전적으로 안전성이 높은 NSP1-beta부위를 SAVE 프로그램으로 분석하여 비교적 CPB가 높게 나타난 염기 부위를 66개 선택해 치환하여 Deoptimization 시켰다.
Codon Pair Deoptimization LMY Codon Pair Bias(CPB) : 0.016079236408108866
LMY ver2 Codon Pair Bias(CPB) : -0.3377269630038442
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, NSP1 beta의 CPB 수치에서 LMY ver2 가 LMY보다 현저히 감소함을 확인하였으며, 이로부터 본 발명의 재조합 LMY ver2의 증식성이 기존 모균주보다 감소하고, 약독화된 균주임을 알 수 있었다.
다음으로, LMY ver2 클론을 제조하기 위해 우선, LMY PRRS의 전체 유전자 서열(GenBank accession no.DQ473474.1.)을 7개의 단편(Fragments)으로 나누어 각각 합성하였다. 상기 7개의 단편 중 단편 1이 NPS-1 beta 부위로 66개 염기가 치환된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 DNA 단편으로 합성하였다. 합성된 단편 유전자는 순서대로 하기 표 4의 제한효소로 자른 뒤 ligase로 연결하여 하나의 감염성 클론(infectious clone)을 제조하였다. 상기 완성된 감염성 클론을 CMV 프로모터 및 ampicillin 저항성 유전자를 탑재한 high copy vector에 삽입한 후, lipofectamine을 이용하여 BHK cell에 transfection하여 최종적으로 본 발명의 재조합 바이러스를 작출하였다.
단편 제한효소 Tm (℃) 완충액 제한효소 인식부위
1 AsiSI 37 CutSmart GCGATCGC
XhoI 37 CutSmart CTCGAG
2 XhoI 37 NEB3.1 CTCGAG
MluI 37 NEB3.1 ACGCGT
3 MluI 37 NEB3.1 ACGCGT
NsiI 37 NEB3.1 ATGCAT
4 NsiI 37 CutSmart ATGCAT
SpeI 37 CutSmart ACTAGT
5 SpeI 37 CutSmart ACTAGT
AscI 37 CutSmart GGCGCGCC
6 AscI 37 CutSmart GGCGCGCC
AfeI (blunt) 37 CutSmart AGCGCT
7 AfeI (blunt) 37 CutSmart AGCGCT
PacI 37 CutSmart TTAATTAA
상기 재조합 균주 LMY ver2는 2017년 11월 14일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 13394BP를 수여받았다.
실시예 1-2. LMY ver2의 CpG 및 UpA 수치 측정
실시예 1-1의 silent mutation에 의해 치환된 염기서열을 갖는 LMY ver2와 parent strain인 LMY NSP1 beta 유전자 내 CpG, UpA의 비율을 SSE program (version 1.2)을 이용하여 측정하였다.
유전자의 CpG, UpA 비율의 변화는 deoptimization 과정에서 필연적으로 발생하는 결과로서, 진핵세포 유전자의 CpG, UpA의 수치가 증가시키면, cell stress를 유발하여 바이러스의 증식성이 감소된다.
구분 CpG UpA
LMY 0.6394 0.7066
LMY ver2 1.1753 1.03
표 5에 나타난 바와 같이, LMY ver2의 CpG 및 UpA의 수치가 모균주 LMY 대비 본 발명의 재조합 균주에서 상승함을 확인하였으며(표 5), 이로부터 LMY ver2의 증식성이 LMY와 비교해 현저히 감소됨을 알 수 있었다.
실시예 2. 균주의 동정 및 상동성 비교
2-1. LMY ver2 균주의 동정
실시예 1에서 합성한 LMY ver2 균주와 LMY균주(GenBank accession no.DQ473474.1.)를 sequencing 하여 동정하였다. 구체적으로 바이러스의 NSP1 beta 부위를 포함한 1bt~1654nt 까지 탐지 가능한 하기 표 6의 프라이머 세트를 사용해 Intron 사의 one step RT PCR kit를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 구체적으로, 45℃에서 30분, 95℃에서 5분 initial RT 과정을 거친 후 94℃에서 30초, 61℃에서 30초 72℃에서 2분 동안 반응 시켰으며, 이 과정을 38회 반복하였다. 다음으로 PCR결과 증폭산물을 sequencing 하여 각각 균주의 동정을 완료하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
Forward primer ATGACGTATAGGTGTTGGCTCTA 3
Reverse primer CTGAGGATTTGGATGGCATT 4
2-2. 타 균주와의 상동성 비교
실시예 1에서 재조한 본 발명의 재조합 바이러스 균주 LMY ver2와 알려진 PRRS 균주와의 유전적 차이를 확인하기 위해, bioedit program을 사용하여 각 균주의 NSP1-beta 부위 sequence identity 측정하였으며, 상동성 비교 결과를 표 7에 나타냈다.
구분 염기서열 상동성
(Identity%)
LMY 92.4
P129 80.1
DC 79.4
JA142 79.8
PL97-1 85
Henan-A14 78.3
VR 2332 85
KNU-12-KJ4 75.5
CA-2 77.9
VR 2385 84.7
표 7에 나타난 바와 같이, 상동성 비교 결과 LMY ver2 바이러스가 여타의 PRRS 균주와는 다른 고유한 서열을 보유하고 있음을 알 수 있었다.
2-3. 세포 계대 연구
실시예 1에서 제작한 LMY ver2를 계대했을 때 변형된 부위가 언제까지 유지되는지를 확인하였다. MARC cell에서 본 발명의 LMY ver2 바이러스를 30회 계대 과정을 거쳐 안정화시켰으며 10계대 마다 유전자 변이를 확인하기 위해 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 사용해 Sequencing 작업을 진행하였다.
Sequencing 확인결과, 30계대 안정화 이후에도 본 바이러스의 치환부위가 유지됨을 확인하였다.
2-4. 계통수
실시예 2-2의 상동성 비교 결과를 바탕으로, bioedit program을 사용하여 계통수를 분석하였으며 Bootstrap을 1000회 반복하였다. 이를 바탕으로 LMY ver2와 LMY의 계통수(Phylogenetic tree) 를 작성하였으며, 이를 도 1에 나타냈다. 도 1의 계통수로부터, 본 바이러스의 계통을 알 수 있었다.
실시예 3: LMY와 LMY ver2의 증식성 비교
실시예 1에서 제조한 LMY ver2 균주와 이의 모균주인 LMY의 돼지 폐 대식세포(PAM, Porcine Alveolar Macrophage)에서의 증식성 차이를 확인하기 위해, 접종 이후 작출되는 바이러스의 양을 TCID50으로 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타냈다.
구체적으로, RPMI 배지(10% FBS, 1% penicillin, streptomycin 포함) 2ml 가포함된 6well plate에 PAM 세포를 well당 2 X 106 cell/well의 비율로 분주하였다. 다음으로, LMY와 LMY ver2를 각각 서로 다른 well에 MOI 0.01의 비율로 접종하고 접종 1시간 후 모든 상층액을 제거한 후, 유지액 RPMI 배지(10% FBS, 1% penicillin, streptomycin 포함) 를 2ml 분주하였다. 이후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 마다 각각의 well의 상층액을 수거하여 TCID50(Tissue culture infective dose50)을 측정하였다. TCID50는 전날 미리 96 well plate에 MARC-145 세포 2 X 105 cell/well을 DMEM 배지(10% FBS, 1% penicillin, streptomycin) 100ul와 함께 분주하여 부착시킨 것을 사용하였다.
구체적으로, 접종할 바이러스는 다음과 같이 준비하였다. 상기 수거한 상층액을 200ul씩 96 well plate의 맨 왼쪽 well에 일렬로 분주하고 나머지 well에는 DMEM 배지(FBS, 항생제 무첨가)를 180ul씩 분주하였다. 다음으로, 왼쪽에서부터 차례로 20ul씩 multi-pipet으로 채취하고 오른쪽 well에 분주하면서 10진 희석하였다. Tip을 바꾸며 차례로 희석하고 마지막 12번째 well은 음성 대조군으로 유지하였다.
다음으로, 준비된 바이러스 희석액을 MARC-145 cell이 부착된 plate에 접종하였다. 이때, MARC-145 cell의 배양액은 모두 제거하고 PBS 200ul을 각 well에 분주하고 버리기를 3회 반복하여 washing 과정을 수행하였다. 이후 준비된 바이러스 희석액을 well당 100ul씩 분주하여 접종하였으며, 접종 2시간 이후 접종액을 모두 제거하고 새로운 유지액(DMEM 배지, 10% FBS, 1% penicillin, streptomycin)을 100ul 분주하였다.
분주 후, 약 7일간 세포에서 CPE(Cytopathogenic effect)의 일종인 Clumping과 apoptosis의 발생여부를 확인하였으며, 최종적으로 CPE가 보이지 않은 well의 바로 이전 희석배수를 기준으로 8개 바이러스 접종액 중 절반인 4개 well이 CPE를 보일 수 있는 희석배수를 구하였다. 1ml를 기준으로 10을 곱해 최종 수치를 계산하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 각각의 균주를 돼지 폐 대식세포(PAM cell)에 접종하고 1일 내지 5일이 지난 후 측정한 TCID50 값을 하기 표 8에 나타냈다.
TCID50/ml
접종
이후 일수		 1 2 3 4 5
LMY 2.50 5.10 4.53 3.70 3.07
LMY ver2 2.77 3.80 2.63 2.23 1.95
표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 균주를 접종하고 바이러스가 본격적으로 작출되기 시작하는 2일 후부터 5일까지 측정한 TCID50의 값이 LMY ver2가 LMYver0 보다 10~100배 낮은 TCID50 값을 나타냈다. 이로부터 PRRS의 주요 감염 세포인 PAM(Porcine Alveolar Macrophage) cell에서 본 발명의 LMY ver2 균주는 증식성이 LMY에 비해 최소 10배 감소함을 알 수 있었으며, 본 발명의 LMY ver2 바이러스가 모균주 LMY 보다 증식성이 감소되어 약독화 되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 균주 접종 후 Interferon alpha 분비 양상 확인
균주를 접종한 이후 돼지에서의 Cytokine 분비 양상을 변화를 확인하기 위해 동물실험을 수행하였다. 실험한 돼지의 cytokine 분비 양상은 Luminex porcine cytokine assay를 통해 확인하였으며, 구체적인 실험 설계는 하기 표 9와 같다.
그룹 접종 균주 돼지 마리수
T01 LMY ver2 5
T02 LMY ver0 5
T03 - 5
실험에 사용한 돼지는 SPF 돼지로서 PRRSV에 대해서 어떠한 항원 항체반응이 없음을 확인한 3주령 자돈을 사용하였다. 다음으로, 이유한 3주령 자돈의 이근부에 각각의 바이러스를 5 TCID50/2ml을 접종하였다. T03그룹은 PBS 2ml을 접종하였다. 접종 이후 7일째, 14일째에 목정맥에서 혈액을 3 ml 채취하여 혈청을 분리하고 분리된 혈청의 cytokine을 luminex를 이용하여 측정하였다. 키트는 eBioscience사의 ProcartaPlex Porcine Cytokine & Chemokine 을 사용하였으며, 측정가능한 porcine cytokine은 IFNα, IFNν, IL-1beta, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, IL-12p40이였으나, 이 중 IFNα 에서 유의적인 효과차이를 확인하였다.
보다 구체적인 키트의 사용 방법은 다음과 같다. Standard curve를 만들기 위해 standard mix 1 vial을 2000g에서 10초간 원심분리하고, Vial에 universal assay buffer 50ul을 넣고 10초간 vortex 한 후 다시 2000g에서 10초간 원심 분리 하였다. 이후 10분간 얼음에서 incubation하여 안정화시켰다. 이후 PCR tube strip에 standard mix를 200ul을 넣고 그 외 tube에는 universal assay buffer를 150ul씩을 넣었다. 다음으로, Mix를 50ul 따서 옆의 tube에 넣고 pipetting 하여 혼합시켰다. 차례로 혼합액을 50ul씩 따서 옆의 tube로 pipetting 하여 희석액을 준비하였다. Strip의 마지막 tube는 universal assay buffer 200ul를 넣었다.
다음으로, 키트에 포함된 96 well plate에 30초간 voltex한 Bead Mix를 well당 50ul씩 분주하고 magnetic washer에 고정하여 Bead가 바닥에 가라앉을 수 있게 2분간 유지하였다. 상층액을 magnetic washer에 고정된 상태로 바닥에 털어 제거한 뒤 Wash buffer를 150ul씩 넣고 bead가 다시 가라앉을 수 있게 1분간 magnetic washer로 고정하고 이후 다시 상층액을 바닥에 털어 제거하여 washing과정을 마무리하였다.
다음 단계로 Plate 와 magnetic washer를 분리한 뒤 모든 well에 universal assay buffer 25ul를 넣고, 다음으로 standard 희석액과 돼지 혈청을 25ul씩 넣은 후, 키트에 들어있는 plate seal로 잘 동봉한 뒤 커버를 이용해 빛을 차단하였다. 그리고 실온에서 500rpm 조건에서 30분간 shaking 하고 4도에서 overnight incubation 하였다. Incubation 이후 500rpm 조건에서 30분간 shaking 하고, 다시 magnetic washer에 plate를 고정하고 2분간 유지해 bead를 바닥에 고정시켰다. Seal을 제거하고 바닥에 상층액을 털어서 제거하였다. Wash buffer 150ul를 모든 well에 넣고 다시 magnetic washer에 1분간 고정하고 상층액을 털어 제거하였다. 동일한 washing 과정을 2회 반복하였다.
미리 20배 희석한 Detection antibody를 모든 well에 25ul를 넣고 seal로 동봉한 뒤 커버를 이용해 빛을 차단하였다. 500rpm 조건에서 30분간 shaking 해주면서 실온에서 incubation 하였다. 이후 다시 위의 washing 과정을 2회 반복하였다.
Plate를 magnetic washer에서 분리한 후, streptavidin-PE를 모든 well에 50ul씩 분주하였다. seal로 동봉한 뒤 커버를 이용해 빛을 차단하였다. 500rpm 조건에서 30분간 shaking 해주면서 실온에서 incubation 하였다. 이후 다시 위의 washing 과정을 2회 반복하였다.
마지막 washing 이후 Reading buffer를 120ul씩 모든 well에 분주한 후, 500rpm 조건에서 5분 동안 shaking 한 뒤 Luminex 장비로 cytokine을 측정하였다. 결과는 standard curve를 기준으로 해당 혈청의 측정 수치를 picogram 단위로 환산하였다. 결과 측정된 Interferon alpha 수치를 하기 표 10과 도 3에 나타냈다.
균주명 IFN alpha (단위 : pg/ml)
Dpi7
(균주접종 후 7일째 측정)		 dpi14
(균주접종 후 14일째 측정)
LMY ver2 32.8775 25.3333
LMY ver0 25.3625 9.3625
NC 4.7366 1.43
표 10에 나타낸 바와 같이, 실험 각각의 균주 백신을 접종한 후 7일 뒤 혈청에서 측정한 IFN alpha 수치가 모균주인 LMY ver0를 기준으로 LMY ver2가 1.3 배 높았으며, 14일 뒤 측정한 IFN alpha 수치가 LMY ver0를 기준으로 2.7 배 높게 나타났다.
즉, LMY ver0보다 LMY ver2를 접종했을 때, Interferon alpha 의 분비가 현저히 증가하였으며, 본 발명의 LMY ver2 균주가 Interferon alpha 면역인자의 발현을 증가시켜 돼지의 면역 효과를 상승시키며, 한국형 PRRSV 백신으로써 우수한 효능을 가짐을 확인하였다.
실시예 5: 균주 접종 후 Interferon gamma 분비 양상 확인
실시예 1에서 제조한 재조합 균주(LMY ver2)와 모균주(LMY ver0), Ingelvac MLV(Boehringer Ingelheim), 대조군 PBS 각각을 돼지에 접종한 이후 돼지에서의 PRRSV 특이적인 Interferon gamma 분비 양상을 확인하기 위해 동물실험을 수행하였다. 실험한 돼지의 Interferon gamma 분비 양상은 porcine IFN gamma ELISPOT kit 를 이용해 확인하였으며, 구체적인 실험 설계는 하기 표 11에 나타냈다.
그룹 접종 균주 돼지 마리 수
T01 LMY ver2 4
T02 LMY ver0 4
T03 Ingelvac MLV 4
T04 PBS 4
실험에 사용한 돼지는 SPF 돼지로서 PRRSV에 대해서 어떠한 항원 항체반응이 없는 것이 확인된 3주령 자돈을 사용하였다. 다음으로, 이유한 3주령 자돈의 이근부에 각각의 바이러스를 5 TCID50/2ml을 접종하였으며, T04그룹은 PBS 2ml을 접종하였다. 접종 이후 21일째에 돼지의 목정맥에서 혈액을 3ml 채취하여 ficoll을 이용하여 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)를 분리하고 분리된 PBMC중에서 PRRS에 특이적인 IFN gamma를 분비하는 세포의 수를 ELISPOT reader machine을 이용하여 측정하였다.
접종 균주 IFN gamma secreting cell/106 PBMCs
LMY ver2 159.12
LMY ver0 101
Ingelvac PRRS MLV 37.25
PBS 7.87
상기 표 12 및 도 4에 나타난 바와 같이, 각각의 균주 백신을 접종한 후 21일 뒤 분리된 PBMC에서 유도된 PRRS에 특이적으로 반응하는 IFN gamma 분비 세포의 수가 모균주 LMY ver0를 기준으로 LMY ver2가 1.6 배 높았으며, Ingelvac PRS MLV를 기준으로 4.3 배 높게 나타났다. 도 4에 나타난 바와 같이, LMY ver2를 접종했을 때 가장 PRRS에 대항하는 Interferon gamma 분비 세포가 많은 것을 확인하였으며, 특히 시중에 상용화된 Ingelvac MLV 백신에 비해 유의적으로 Interferon gamma 분비세포의 수가 높게 나타났다.
즉, LMY ver0보다 LMY ver2를 접종했을 때, Interferon gamma 의 분비가 증가하였으며, 본 발명의 LMY ver2 균주가 Interferon gamma 면역인자의 발현을 증가시켜 돼지의 면역 효과를 상승시켰으며, 시판되고 있는 Ingelvac PRRS MLV 바이러스 백신과 비교해 본 발명의 LMY ver2 백신이 현저히 우수한 면역 효능을 가짐을 확인하였다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13394BP
수탁일자 : 20171114
<110> BioPoA, Inc. <120> Mutant strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and antiviral vaccines including the same <130> DPP20176966KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMY NSP1-beta DNA <400> 1 gctgctgtct acgatgttgg tcatggcgcc gtcatgtatg tggccgatga gagagtctcc 60 tgggcccctc gtggcgggga tgaagtaaga tttgaaactg tcccacagga gctcaagtcg 120 gttgcgaacc aactctgcac ctccttccca ccccaccacg tagtggacat gtctaagttc 180 gcctttacag cccctgggtg tggtgtttct atgcgggtcg aacgtcaata tggctgtctc 240 cccgctgaca ctgtccccga aggcaactgc tggtggagct tgtttgactc gctcccattg 300 gaagtccagg gcaaagaaat tcgccatgct aaccaatttg gctaccagac caagcatggt 360 gtctctggta agtacctaca gcggaggctg caaattaatg gtctccgagc agtagctgac 420 ccaaatggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 480 aaactagcgg aagaacccag ttaccctggg tttgaggacc tcctcagaat aagggttgag 540 tctaacacgt caccattggc taacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 600 tggtacggc 609 <210> 2 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMY ver2 NSP1-beta DNA <400> 2 gccgccgtat acgacgtcgg acatggcgcc gttatgtacg ttgccgacga gagagtctcc 60 tgggcccctc gcggcggcga cgaagttaga ttcgaaacgg tcccacagga gcttaagtcg 120 gttgcgaacc aattatgtac gtcgttccca ccccaccacg tagtcgatat gtctaagttc 180 gcctttaccg cccccggttg cggcgtatct atgcgggtcg aacgtcaata cggctgtctc 240 cccgccgata cggtccccga aggcaactgt tggtggagct tgttcgattc gctcccactc 300 gaagtgcaag gcaaagagat tcgccacgct aaccaattcg ggtatcagac taagcatggc 360 gtatccggta agtacctaca gcgtaggctg caaatcaacg gtctccgcgc agtcgctgac 420 cctaacggac ctttcgtcgt acagtacttc tccgtcaagg agagttggat ccgccacttg 480 aaactggccg aagaacctag ttaccccggg ttcgaggacc tcctccgcat aagggttgag 540 tctaatacgt caccattggc taacaaggac gaaaaaattt tccggtttgg cagtcataag 600 tggtacggc 609 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for LMY NSP1-beta DNA amplification <400> 3 atgacgtata ggtgttggct cta 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for LMY NSP1-beta DNA amplification <400> 4 ctgaggattt ggatggcatt 20

Claims (17)

  1. 기탁번호 KCTC 13394BP의, 약독화 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 변이주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 돼지의 폐 대식세포에서 측정한 변이주의 TCID50의 값이 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)에 비해 0.01 배 내지 0.1배인 변이주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이주와 이의 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)를 돼지에 접종하고 측정한 변이주의 Interferon alpha 함량이, 모균주의 1.2배 내지 5.0배를 갖는 변이주.
  6. 제1항에 있어서, 돼지에 상기 변이주를 접종하고 측정한 변이주의 Interferon gamma 분피세포의 수가 이의 모균주의 1.1 내지 3.0배인 변이주.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 변이주를 포함하는 세포.
  11. 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 약독화 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 포함하는 백신 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 백신 조성물은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함하는, 백신 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 백신은 생백신인 백신 조성물.
  14. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 Nonstructural protein 1-beta (NSP1-beta)을 돌연변이 위치로 선택하는 단계, 및
    PRRSV NSP1-beta 암호화 핵산서열의 염기 치환으로 침묵 돌연변이를 제조하여, CPB 값이 -0.39 내지 0을 갖는 돌연변이 NSP1-beta를 함유하는 PRRSV 변이주를 제조하는 단계를 포함하는,
    기탁번호 KCTC 13394BP의 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 돌연변이 NSP1-beta를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 기탁번호 KCTC 13394BP의 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 제조방법.
  16. 삭제
  17. 제11항의 조성물을 투여함으로써 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 것을 포함하는 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200081225A (ko) * 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 바이오포아 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신
WO2023128051A1 (ko) * 2021-12-30 2023-07-06 주식회사 바이오포아 돼지생식기호흡기증후군바이러스 유래 펩타이드를 발현하는 키메라 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015533474A (ja) 2012-07-18 2015-11-26 サウス ダコタ ボード オブ リージェンツ 新規なアルテリウイルスタンパク質および発現機構

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015533474A (ja) 2012-07-18 2015-11-26 サウス ダコタ ボード オブ リージェンツ 新規なアルテリウイルスタンパク質および発現機構

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank: DQ473474.1, 2006.09.25.
J. Virol. 90 (9), 4454-4468 (2016).*
Vet. Microbiol. 117 (2-4), 248-257 (2006).

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200081225A (ko) * 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 바이오포아 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신
CN113544140A (zh) * 2018-12-27 2021-10-22 Biopoa株式会社 猪繁殖与呼吸综合征病毒的嵌合病毒及使用其的疫苗
KR102335864B1 (ko) * 2018-12-27 2021-12-06 주식회사 바이오포아 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신
WO2023128051A1 (ko) * 2021-12-30 2023-07-06 주식회사 바이오포아 돼지생식기호흡기증후군바이러스 유래 펩타이드를 발현하는 키메라 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물

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