KR102193460B1 - 돼지생식기호흡기증후군 예방용 백신 조성물 및 이의 예방 방법 - Google Patents

돼지생식기호흡기증후군 예방용 백신 조성물 및 이의 예방 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지생식기호흡기증후군에 대한 백신 조성물, 보다 상세하게는 약독화된 키메라 바이러스 및 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군에 대한 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군의 예방 방법에 관한 것이다.

Description

돼지생식기호흡기증후군 예방용 백신 조성물 및 이의 예방 방법 {Vaccine composition for preventing porcine reproductive and respiratory syndrome and preventing method thereof}
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군에 대한 백신 조성물, 보다 상세하게는 약독화된 키메라 바이러스 및 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군에 대한 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지생식기호흡기증후군의 예방 방법에 관한 것이다.
돼지생식기호흡기증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, 이하 "PRRS"라 한다.) 은 1987년에 미국에서 최초로 발견된 바이러스 질환으로, 유럽에 이어 1990년대 초에는 아시아에서까지 동정되었다. PRRS는 돼지 써코바이러스 감염증 및 구제역과 함께 국내 양돈산업에 가장 큰 피해를 주는 전염병이며, 전세계적으로 확산되어, 매년 막대한 경제적 손실을 일으키고 있다.
PRRS는 임신한 암퇘지의 생식 불능, 유산이나 조산, 사산의 번식장애를 유발하며, 젖먹이 돼지와 비육돈에게 재채기, 발열 등의 호흡기 증상을 유발한다. 일반적으로 바이러스에 이환된 이후 세균 등의 2차 감염에 의해 심한 호흡기 증상을 야기하지만, 만성적으로 감염된 경우에는 특징적인 임상 증상 없이 증체량 감소 및 폐사율의 증가가 나타난다.
PRRS의 원인이 되는 병원체는 PRRS 바이러스로, Arterivirus 속, Arteriviridae 과, Nidovirales 목에 속한다. PRRS 바이러스는 positive-sense single stranded RNA(+ssRNA) 유전체를 가지며, 그 크기는 약 15.4kb이고, 9개의 ORF를 갖고 있는 것으로 보고되었다. 유전체의 약 80%는 비구조단백질(Non Structural Protein, NSP)을 코딩하는 ORF1a 및 ORF1b이고, 나머지 20%가 글리코실화된 구조 단백질인 GP2, GP3, GP4, GP5, 및 비글리코실화된 막(Membrane, M) 단백질, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질을 암호화하는 ORF로 구성된다. minor 구조단백질인 GP2, GP3, GP4는 헤테로 삼중합체(heterotrimer)를 형성하여 바이러스가 숙주 세포 내로 침입할 때 작용하며, major 구조단백질인 GP5 및 M은 헤테로 이중합체(heterodimer)를 형성하여 바이러스의 감염력을 높여주는 작용을 한다.
PRRS 바이러스는 RNA 바이러스의 특성상 변이가 심하여 PRRS 바이러스 사이에서도 유전적 차이가 크다. PRRS 바이러스는 크게 북미형과 유럽형으로 나뉘는데, 유럽형을 대표하는 타입 I형(Lelystad virus, LV) 및 북미형 바이러스주(Northern American strain) ATCC VR2332를 대표하는 타입 II 형(VR2332의 유전체 서열은 GenBank 등록번호 AY150564 참조)이 있다.
북미형과 유럽형 간에는 최대 40%까지 유전자 차이가 존재하여 서로 교차 방어가 되지 않는 것으로 알려져 있다. 심지어 같은 타입에 속하는 변이주 간에도 교차 방어가 되지 않는 경우가 보고된 바 있다. 이로 인해, 각 타입의 바이러스에 대해 표준 변이주 기반의 백신은 제작되어 있지만 낮은 교차 방어능으로 인해 PRRS를 효과적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다. 이를 극복하기 위하여 안전성, 면역원성, 및 방어능을 효과적으로 갖춘 백신을 제작하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다.
이러한 한계로 인해, 축산업에 막대한 손해를 끼치는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)의 원인체인 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 발견한 이후 약 30년 동안 이 바이러스에 대한 예방법을 개발하기 위하여 많은 노력이 투자되었음에도 아직까지 효과적인 예방법 및 관리법이 개발되지 않은 실정이다.
돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV) 제어를 위해 불활화 백신과 약독화 생백신 등 다양한 백신이 개발되었으나 오직 감염성이 확보된 약독화 백신만이 만족스러운 수준의 방어 효과를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 앞서 살핀 바와 같이, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)가 유전적으로 매우 다양하게 존재하기 때문에 다양한 바이러스들 간의 교차면역이 부재하여 하나의 백신으로 다양한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)를 방어하기는 어렵다. 또한 현재 약독화 백신은 다른 동물 종의 세포 주에서 100 내지 200 계대 이상의 연속 계대를 통해서만 생산이 가능하므로 개발 기간이 길고 효능과 안전성의 보장이 어려운 문제가 있다.
본 발명의 목적은 약독화된 키메라 PRRS 바이러스, 및 어주반트(Adjuvant)를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 약독화된 키메라 PRRS 바이러스, 및 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 예방용 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군의 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 약독화된 키메라 PRRS 바이러스, 및 어주반트(Adjuvant)를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 예방용 백신 조성물을 제공한다. 상기 어주반트(Adjuvant)는 결핵 유래의 톨유사수용체 작용제(Toll-like receptor agonist; TLR agonist)일 수 있다. 상기 백신 조성물은 피내 접종을 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 약독화된 키메라 PRRS 바이러스, 및 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 예방용 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군의 예방 방법을 제공한다. 상기 어주반트(Adjuvant)는 HSP70, HSPX 의 결핵 유래의 톨유사수용체 작용제(Toll-like receptor agonist; TLR agonist)일 수 있다. 상기 투여하는 단계는 피내접종에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 명세서에 사용된 "약독화된 바이러스"는 PRRS 질환의 임상 징후를 유발하지 않고 표적 포유동물에서 면역반응을 유발할 수 있는 무독성 바이러스를 의미하기도 하고, 또한 약독화된 바이러스로 감염되고 약독화된 바이러스를 투여받지 못한 동물에서 임상 징후의 발생빈도를 낮추거나, 징후의 중증도가 비-약독화된 PRRS 바이러스로 감염된 "대조군" 동물에 비해 감소된 것을 의미하기도 한다. 이러한 상황에서, "감소/감소된"이란 용어는 앞에서 정의한 대조군에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 더욱 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 100% 이상의 감소를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "백신 조성물"은 PRRS 키메라 바이러스 또는 이의 임의의 면역원성 단편 또는 분획, 바람직하게는 약독화된 PRRS 키메라 바이러스, 예컨대 상기 본 발명의 PRRS 키메라 바이러스일 수 있다. 이는 숙주의 "면역학적 반응"을 PRRSV에 대한 세포 및/또는 항체 매개의 면역 반응으로 유발한다. 백신 조성물은 PRRSV 감염 및 이와 관련된 임상 징후들에 대해 예방 면역을 부여할 수 있는 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 "면역 반응"은 상기 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스, 또는 이를 포함하는 백신 조성물을 투여받은 동물에게 투여된 키메라 바이러스 또는 백신에 대한 임의의 세포- 및/또는 항체-매개의 면역 반응을 의미한다. 보통, "면역 반응"은 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: 당해 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γδ T 세포의 생산 또는 활성화. 숙주는 면역원성 조성물이나 백신을 투여받지 않은 대조군에 비해 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소되도록 치료적 또는 예방적 면역학적 반응을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 예방은 최대 전술한 숙주 감염과 관련된 증상들의 결여 및 이를 비롯하여 빈도 또는 중증도의 감소에 의해 증명될 것이다.
본 명세서에 사용된 "돼지들", "돼지" 및 "새끼돼지"는 호환 사용될 수 있다.
"백신을 접종하다"는 PRRS 질환에 노출되기 전에 본 명세서에 기술된 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신을 투여하는 것을 의미한다.
"예방하다" 또는 "예방"은 본 발명의 PRRSV 바이러스 또는 이를 포함하는 백신조성물을 투여받은 결과로서, PRRS의 임상의 발생 빈도, 징후의 중증도 또는 빈도가 감소하는 것을 의미한다. 중증도 또는 빈도의 감소는 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신조성물을 투여받지 않은 동물 또는 동물 그룹과 비교한 결과이다. 상기 동물은 바람직하게는 돼지일 수 있다.
본 발명이 제공하는 백신 조성물은 약독화된 키메라 PRRS 바이러스, 및 어주반트(Adjuvant)를 포함한다.
본 발명은 돼지에 영향을 미치는 바이러스 질환인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRSV)에 대해 약독화된 키메라 바이러스를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 구조식 1의 구조를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다:
[구조식 1]
5'-[X]-[Y]-3'
상기 식에서, [X]는 수탁번호 KCTC 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자 (NSP1-alpha 유전자 및 NSP1-beta 유전자)의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 동등한 기능이 유지되는 범위 내에서 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 예를 들어 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 동등한 기능이 유지되는 범위 내에서 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 ORF1a 및 ORF1b 부위의 유전자의 핵산 서열 또는 상기 ORF1a 및 ORF1b 부위의 유전자의 핵산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열이며, 상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 유전자 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 동등한 기능이 유지되는 범위 내에서 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열이다. 본 명세서에 사용된 바로서, 상기 "동등한 기능"은 목적하는 기능과 질적(활성) 및/또는 양적(수준)으로 동일 또는 유사한 기능을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 아미노산 서열이 야생형 유전자가 암호화하는 단백질의 아미노산 서열과 동일한 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 [X]는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 유전자의 핵산 서열에서, 상기 NSP1 유전자에 의해 암호화되는 NSP1 단백질의 아미노산 서열이 동일하게 유지되는 범위 내에서 발생하는 모든 종류의 점 돌연변이 (침묵 돌연변이)를 포함할 수 있으며, 예를 들어 NSP1 유전자의 CBP 수치를 낮추기 위한 목적 범위에서 자유롭게 선택되어 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 [X]는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 유전자의 핵산 서열에서, 222번 위치, 225번 위치, 237번 위치, 240번 위치, 252번 위치, 306번 위치, 309번 위치, 312번 위치, 315번 위치, 324번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 333번 위치, 336번 위치, 339번 위치, 342번 위치, 345번 위치, 357번 위치, 363번 위치, 366번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 381번 위치, 393번 위치, 396번 위치, 543번 위치, 546번 위치, 549번 위치, 555번 위치, 558번 위치, 561번 위치, 573번 위치, 579번 위치, 582번 위치, 588번 위치, 612번 위치, 618번 위치, 621번 위치, 627번 위치, 633번 위치, 639번 위치, 654번 위치, 673번 위치, 675번 위치, 678번 위치, 681번 위치, 684번 위치, 705번 위치, 708번 위치, 729번 위치, 735번 위치, 738번 위치, 741번 위치, 744번 위치, 747번 위치, 771번 위치, 786번 위치, 789번 위치, 792번 위치, 810번 위치, 825번 위치, 828번 위치, 838번 위치, 840번 위치, 846번 위치, 849번 위치, 858번 위치, 867번 위치, 879번 위치, 882번 위치, 885번 위치, 891번 위치, 900번 위치, 903번 위치, 906번 위치, 924번 위치, 936번 위치, 939번 위치, 948번 위치, 954번 위치, 963번 위치, 966번 위치, 1026번 위치, 1029번 위치, 1038번 위치, 1047번 위치, 1053번 위치, 1066번 위치, 1068번 위치, 1086번 위치, 및 1110번 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 25 이상, 66 이상, 80 이상 또는 91개 전체 위치의 염기가 치환된 변이를 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 [X]는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 유전자의 핵산 서열에서, 222번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 225번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 237번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 240번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 252번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 306번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 309번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 312번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 315번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 324번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 327번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 330번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 333번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 336번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 339번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 342번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 345번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 357번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 363번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 366번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 378번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 379번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 381번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 393번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 396번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 543번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 546번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 549번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 555번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 558번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 561번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 573번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 579번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 582번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 588번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 612번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 618번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 621번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 627번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 633번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 639번 위치의 T가 G로 치환된 변이, 654번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 673번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 675번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 678번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 681번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 684번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 705번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 708번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 729번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 735번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 738번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 741번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 744번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 747번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 771번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 786번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 789번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 792번 위치의 T가 G로 치환된 변이, 810번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 825번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 828번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 838번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 840번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 846번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 849번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 858번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 867번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 879번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 882번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 885번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 891번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 900번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 903번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 906번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 924번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 936번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 939번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 948번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 954번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 963번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 966번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1026번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 1029번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 1038번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 1047번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1053번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1066번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 1068번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 1086번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 및 1110번 위치의 T가 C로 치환된 변이로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 25 이상, 66 이상, 80 이상, 또는 상기 91개 변이 모두를 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자(서열번호 12) 및/또는 NSP1-beta (서열번호 1; 서열번호 12의 5 ' 말단 609개 염기 부위)의 핵산 서열, 또는 상기 핵산서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.
또한, 상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 유전자 핵산 서열 또는 상기 서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 구조식 1의 [Y]의 3'말단에 [A]n을 추가로 포함할 수 있다. 상기 n은 염기 A를 포함하는 뉴클레오타이드의 개수로, 10 내지 100의 정수일 수 있다. 바람직하게는 10 내지 80, 10 내지 70, 10 내지 60, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 70, 15 내지 60, 15 내지 50, 15 내지 40, 15 내지 30, 20 내지 30, 20 내지 26의 정수일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 상기 RNA의 역전사체 (DNA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈(genome)으로서의 기능을 가질 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 예는 상기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 키메라 바이러스를 제공한다. 상기 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 RNA일 수 있다.
상기 [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1-beta를 포함하는, NSP1 유전자 부위에 해당하는 것으로, 상기 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI과 PacI 로 처리하여 얻어지는 유전자 단편일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 1 및/또는 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 상기 염기 서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위에 해당하는 것으로, BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 얻어지는 유전자 단편일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 2의 핵산 서열 또는 상기 서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열 을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 구조식 1은 서열번호 4의 핵산서열 또는 상기 핵산 서열과 동등한 기능을 유지하는 범위 내에서 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 서열번호 4의 핵산서열일 수 있다.
하기 표 1에서, LMY ver2의 NSP1 유전자의 염기서열 중 굵은 글씨로 표시된 부분은 NSP1-beta 부위를 의미한다.
설명 염기서열(5' > 3') 서열번호
LMY ver2의NSP1-beta GCCGCCGTATACGACGTCGGACATGGCGCCGTTATGTACGTTGCCGACGAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCGCGGCGGCGACGAAGTTAGATTCGAAACGGTCCCACAGGAGCTTAAGTCGGTTGCGAACCAATTATGTACGTCGTTCCCACCCCACCACGTAGTCGATATGTCTAAGTTCGCCTTTACCGCCCCCGGTTGCGGCGTATCTATGCGGGTCGAACGTCAATACGGCTGTCTCCCCGCCGATACGGTCCCCGAAGGCAACTGTTGGTGGAGCTTGTTCGATTCGCTCCCACTCGAAGTGCAAGGCAAAGAGATTCGCCACGCTAACCAATTCGGGTATCAGACTAAGCATGGCGTATCCGGTAAGTACCTACAGCGTAGGCTGCAAATCAACGGTCTCCGCGCAGTCGCTGACCCTAACGGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTGGCCGAAGAACCTAGTTACCCCGGGTTCGAGGACCTCCTCCGCATAAGGGTTGAGTCTAATACGTCACCATTGGCTAACAAGGACGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC 6
LMY ver2의NSP1 ATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCACGTGTACCCCCAATGCCAGGGTGTTTATGGCGGAGGGCCAAGTTTACTGCACACGATGTCTCAGTGCACGGTCTCTCCTTCCCCTGAATCTCCAAGTTTCTGAGCTCGGGGTGCTGGGCCTATTCTACAGGCCCGAAGAGCCACTCCGGTGGACGTTGCCACGTGCATTCCCCACTGTTGAGTGCTCCCCCGCCGGCGCATGCTGGCTTTCCGCTATCTTTCCAATCGCACGAATGACCAGTGGAAACCTAAACTTCCAACAAAGAATGGTACGGGTCGCCGCCGAAATATACAGAGTCGGGCAACTTACGCCCGCTGTATTGAAGGCTCTGCAAGTATACGAGCGGGGTTGTAGGTGGTATCCCATCGTAGGACCTGTCCCTGGAGTGGCCGTTTTCGCCAACTCCCTGCATGTGAGTGATAGACCTTTCCCGGGAGCAACTCACGTATTAACCAACCTGCCACTCCCGCAGAGACCCAAGCCTGAGGACTTTTGCCCCTTCGAGTGTGCTATGGCCGCCGTATACGACGTCGGACATGGCGCCGTTATGTACGTTGCCGACGAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCGCGGCGGCGACGAAGTTAGATTCGAAACGGTCCCACAGGAGCTTAAGTCGGTTGCGAACCAATTATGTACGTCGTTCCCACCCCACCACGTAGTCGATATGTCTAAGTTCGCCTTTACCGCCCCCGGTTGCGGCGTATCTATGCGGGTCGAACGTCAATACGGCTGTCTCCCCGCCGATACGGTCCCCGAAGGCAACTGTTGGTGGAGCTTGTTCGATTCGCTCCCACTCGAAGTGCAAGGCAAAGAGATTCGCCACGGCCGCCGTATACGCTAACCAATTCGGGTATCAGACTAAGCATGGCGTATCCGGTAAGTACCTACAGCGTAGGCTGCAAATCAACGGTCTCCGCGCAGTCGCTGACCCTAACGGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTGGCCGAAGAACCTAGTTACCCCGGGTTCGAGGACCTCCTCCGCATAAGGGTTGAGTCTAATACGTCACCATTGGCTAACAAGGACGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC 12
BP2017-2의ORF2-ORF7 ATGAAATGGGGTCCATGCAAAGCCTTTTTTACAAAATTGGCCAACTTTTTGTGGATGCTTTCACGGAGTTCTTGGTGTCCATTGTTGATATCATTATATTTTTGGCCATTTTGTTTGGCTTCACCATCGCCGGTTGGCTGGTGGTCTTTTGCATCAGATTGGTTTGCTCCGCGATACTCCGTACGCGCCCTGCCATTCACTCTGAGCAATTACAGAAGATCTTATGAGGCCTTTCTTTCCCAGTGCCAAGTGGACATTCCCACCTGGGGAACTAAACATCCTTTGGGGATGCTTTGGCACCATAAGGTGTCAACCCTGATTGATGAAATGGTGTCGCGTCGAATGTACCGCATCATGGAAAAAGCAGGGCAGGCTGCCTGGAAACAGGTGGTGAGCGAGGCTACGCTGTCTCGCATTAGTAGTTTGGATGTGGTGGCTCATTTTCAGCATCTAGCCGCCATTGAAGCCGAGACCTGTAAATATTTGGCCTCCCGGCTGCCCATGCTACACAACCTGCGCATGACAGGTTCAAATGTAACCATAGTGTATAATAGCACTTTGAATCAGGTGTTTGCTATTTTTCCAACCCCTGGTTCCCGGCCAAAGCTTCATGATTTTCAGCAATGGTTAATAGCTGTACATTCCTCCATATTTTCCTCTGTTGCAGCTTCTTGTACTCTTTTTGTTGTGCTGTGGTTGCGGGTTCCAATACTACGTACTGTTTTTGGTTTCCGCTGGTTAGGGGCAATTTTTCTTTCGAACTCACAGTGAATTACACGGTGTGTCCACCTTGCCTCACCCGGCAAGCAGCCACAGAGATCTACGAACCCGGTAGGTCTCTTTGGTGCAGGATAGGGTATGACCGATGTGAGGAGGATGATCATGACGAGCTAGGGTTTATGGTACCGCCTGGCCTCTCCAGCGAAGGCCACTTGACTAGTGTTTACGCCTGGTTGGCGTTCTTGTCCTTCAGCTACACGGCCCAGTTCCATCCCGAGATATTCGGGATAGGGAATGTGAGTCGAGTTTATGTTGACATCAAACATCAACTCATCTGCGCCGAACATGACGGGCAGAACACCACCTTGCCTCGTCATGACAACATTTCAGCCGTGTTTCAGACCTATTACCAACATCAAGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTAGAATGGCTTCGTCCCTTCTTTTCCTCGTGGTTGGTTTTAAATGTCTCTTGGTTTCTCAGGCGTTCGCCTGCAAACCATGTTTCAGTTCGAGTCTTGCAGATATTAAGACCAACACCACCGCAGCGGCAAGCTTTGCTGTCCTCCAAGACATCAGTTGCCTTAGGCATCGCGACTCGGCCTCTGAGGCGATTCGCAAAATCCCTCAGTGCCGTACGGCGATAGGGACACCCGTGTATGTTACCATCACAGCCAATGTGACAGATGAGAATTATTTACATTCTTCTGATCTCCTCATGCTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCTGAGATGAGTGAAAAGGGATTTAAGGTGGTATTTGGCAATGTGTCAGGCATCGTGGCTGTGTGTGTCAATTTTACCAGCTACGTCCAACATGTCAAGGAGTTTACCCAACGCTCCCTGGTGGTCGACCATGTGCGGTTGCTCCATTTCATGACACCTGAGACCATGAGGTGGGCAACTGTTTTAGCCTGTCTTTTTGCCATTCTGTTGGCAATTTGAATGTTTAAGTATGTTGGAGAAATGCTTGACCGCGGGCTGTTGCTCGCAATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTGTTTTGCTGTGCTCGCCAACGCCAGCAACGACAGCAGCTCCCATCTACAGCTGATTTACAACTTGACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTAGCTAACAAATTTGATTGGGCAGTGGAGAGTTTTGTCATCTTTCCCGTTTTGACTCACATTGTCTCCTATGGTGCCCTCACTACCAGCCATTTCCTTGACACAGTCGCTTTAGTCACTGTGTCTACCGCCGGGTTTGTTCACGGGCGGTATGTCCTAAGTAGCATCTACGCGGTCTGTGCCCTGGCTGCGTTGACTTGCTTCGTCATTAGGTTTGCAAAGAATTGCATGTCCTGGCGCTACGCGTGTACCAGATATACCAACTTTCTTCTGGACACTAAGGGCGGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCTGTCATCATAGAGAAAAGGGGCAAAGTTGAGGTCGAAGGTCATCTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGTGGCAACCCCTATAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCCTTAGATGACTTCTGTCATGATAGCACGGCTCCAGAAAAGGTGCTTTTGGCGTTTTCTATTACCTACACGCCAGTGATGATATATGCCCTAAAGGTGAGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCTTCTGCACCTTTTGATCTTCCTGAATTGTGCTTTCACCTTCGGGTACATGACTTTCGCGCACTTTCAGAGTACAAATAAGGTCGCGCTCACTATGGGAGCAGTAGTTGCACTCCTTTGGGGGGTGTACTCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTTGAAAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTAAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAACAGGGAGTGGTAAACCTTGTCAAATATGCCAAATAACAACGGCAAGCAGCAGAAGAGAAAGAAGGGGGATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGCTGGGTAAGATCATCGCTCAGCAAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGAAAGAAAAATAAGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTTCCTCTAGCGACTGAAGATGATGTCAGACATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCGTCAATCCAGACCGCCTTTAATCAAGGCGCTGGGACTTGCACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCTACGCATCATACTGTGCGCCTGATCCGCGTCACAGCATCACCCTCAGCATGA 2
[A]n AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3
Figure 112020030932283-pat00001
Figure 112020030932283-pat00002
Figure 112020030932283-pat00003
Figure 112020030932283-pat00004
Figure 112020030932283-pat00005
(상기 표에서, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드(RNA)는 서열번호 2 내지 4, 6 및 12에 제시된 서열 중 T가 U로 치환된 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.)
본 발명은 구조식 1의 폴리뉴클레오타이드를 지놈으로 포함하는 PRRSV 키메라 바이러스를 제공한다. 상기 PRRSV 키메라 바이러스는 1 내지 80계대, 1 내지 70계대, 1 내지 60계대, 1 내지 50 계대, 1 내지 40 계대, 1 내지 30 계대, 1 내지 20 계대, 또는 1 내지 10 계대 배양된 자손 바이러스를 포함하는 것일 수 있다.
[구조식 1]
5'-[X]-[Y]-3'
상기 식에서, [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자 및/또는 NSP1-beta의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열이며, 상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 유전자 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열이다.
예컨대, 상기 [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1 유전자 및/또는 NSP1-beta의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.
또한, 상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위의 유전자 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 구조식 1의 [Y]의 3'말단에 [A]n을 추가로 포함할 수 있다. 상기 n은 염기 A를 포함하는 뉴클레오타이드의 개수로, 10 내지 100의 정수일 수 있으며, 예컨대, 10 내지 80, 10 내지 70, 10 내지 60, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 15 내지 80, 15 내지 70, 15 내지 60, 15 내지 50, 15 내지 40, 15 내지 30, 20 내지 30, 20 내지 26의 정수일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 상기 RNA의 역전사체 (DNA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈(genome)으로서의 기능을 가질 수 있다. 이에, 본 발명의 다른 예는 상기 구조식 1의 구조를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 키메라 바이러스를 제공한다. 상기 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 RNA일 수 있다.
상기 [X]는 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 NSP1-beta를 포함하는, NSP1 유전자 부위에 해당하는 것으로, 상기 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI과 PacI 로 처리하여 얻어지는 유전자 단편일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 1 및/또는 서열번호 12의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 [Y]는 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 ORF2 내지 ORF7 부위에 해당하는 것으로, BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 얻어지는 유전자 단편일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 2의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 구조식 1은 서열번호 4 및/또는 서열번호 12의 핵산서열 또는 상기 핵산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 서열번호 4 및/또는 서열번호 12의 핵산서열일 수 있다.
일 구체예는 지놈으로서 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산서열을 포함하는 상기 PRRSV 키메라 바이러스를 제공하며, 이를 LMY+BP2017라고 명명하였다. 상기 LMY+BP2017 바이러스는 수탁번호 KCTC 13394BP 을 갖는 바이러스일 수 있다.
상기 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 뼈대가 되는, LMY ver2 변이주는 LMY 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)의 서열번호 5의 Nonstructural protein 1 beta (NSP1b)에 포함된 적어도 하나의 염기가 치환된 변이 NSP1-beta를 포함하는 PRRSV 변이주 및/또는 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 단백질을 암호화하는 유전자에 포함된 적어도 하나의 염기가 치환된 변이 NSP1를 포함하는 PRRSV 변이주일 수 있다.
상기 LMY 균주의 NSP1 및/또는 NSP1-beta를 암호화하는 유전자의 염기서열에서 치환되는 염기서열은 공지되어 있는 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 사용하여 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는, 본 발명자들이 개발한 SAVE 프로그램을 이용하여 선택한 것일 수 있다. 구체적으로, 모균주인 LMY 의 genome에서 유전적으로 안전성이 높은 NSP1 부위를 본 발명자들이 자체 개발한 SAVE 프로그램으로 분석하여 비교적 Codon Pair Bias (CPB)가 높은 곳을 나타난 염기 서열의 일부 또는 전체를 선택해 치환하여 Deoptimization 시킨 염기서열일 수 있다. 상기 Deoptimization시킨 염기 서열은, 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 LMY 균주의 NSP1 단백질을 암호화하는 유전자의 222번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 225번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 237번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 240번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 252번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 306번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 309번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 312번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 315번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 324번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 327번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 330번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 333번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 336번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 339번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 342번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 345번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 357번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 363번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 366번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 378번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 379번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 381번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 393번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 396번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 543번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 546번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 549번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 555번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 558번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 561번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 573번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 579번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 582번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 588번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 612번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 618번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 621번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 627번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 633번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 639번 위치의 T가 G로 치환된 변이, 654번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 673번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 675번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 678번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 681번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 684번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 705번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 708번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 729번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 735번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 738번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 741번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 744번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 747번 위치의 T가 A로 치환된 변이, 771번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 786번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 789번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 792번 위치의 T가 G로 치환된 변이, 810번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 825번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 828번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 838번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 840번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 846번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 849번 위치의 G가 A로 치환된 변이, 858번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 867번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 879번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 882번 위치의 C가 G로 치환된 변이, 885번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 891번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 900번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 903번 위치의 C가 A로 치환된 변이, 906번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 924번 위치의 G가 T로 치환된 변이, 936번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 939번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 948번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 954번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 963번 위치의 A가 T로 치환된 변이, 966번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1026번 위치의 A가 G로 치환된 변이, 1029번 위치의 G가 C로 치환된 변이, 1038번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 1047번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1053번 위치의 T가 C로 치환된 변이, 1066번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 1068번 위치의 A가 C로 치환된 변이, 1086번 위치의 C가 T로 치환된 변이, 및 1110번 위치의 T가 C로 치환된 변이로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 25 이상, 66 이상, 80 이상, 또는 상기 91개 변이 모두를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 SAVE 프로그램을 사용해 바이러스 유전자 코돈이 쌍으로 배열 시 상호작용하여 생기는 편향성인, CPB를 컴퓨터 알고리즘을 이용해 수치화할 수 있으며, 바이러스의 증식성은 CPB 수치가 감소(deoptimization)되면 증식성이 감소하고, 약독화 되므로(Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias, Science, 2008, J. Robert Coleman et al.), CPB 수치가 높은 일부 염기서열을 CPB 수치가 낮은 염기서열로 치환하거나, 바람직하게는 Codon Pair Deoptimization 원리에 따라 침묵 돌연변이(silent mutation) 시켜 본 발명의 키메라 바이러스 제조에 사용되는 약독화된 LMY ver2 변이주를 제조할 수 있다. 상기 LMY ver2 변이주는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진, NSP1-beta 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진, NSP1 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스의 지놈을 포함하는 세포를 제공할 수 있다. 상기 세포는 상기 키메라 바이러스를 다량 제조하기 위해, 상기 키메라 바이러스의 지놈(DNA, RNA, 또는 이를 포함하는 벡터), 또는 상기 지놈을 포함하는 키메라 바이러스가 트랜스펙션(형질감염 또는 형질주입)되는 세포를 의미하며, 상기 목적 범위 내라면 세포의 종류를 특별히 한정하지는 않는다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 PRRSV의 키메라 바이러스 또는 이의 계대 배양된 자손을 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신 조성물을 제공할 수 있다.
상기 키메라 바이러스는 수탁번호 KCTC 13675BP일 수 있으며, 상기 계대 배양된 자손은 상기 키메라 바이러스를 1 내지 80계대, 1 내지 70계대, 1 내지 60계대, 1 내지 50 계대, 1 내지 40 계대, 1 내지 30 계대, 1 내지 20 계대, 또는 1 내지 10 계대 배양된 자손 바이러스를 포함하는 것일 수 있다.
상기 계대 배양된 자손은, 유전체 내 NSP1 단백질을 암호화하는 유전자로서, 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 NSP1 변이 유전자의 핵산 서열에서, 222번 위치, 225번 위치, 237번 위치, 240번 위치, 252번 위치, 306번 위치, 309번 위치, 312번 위치, 315번 위치, 324번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 333번 위치, 336번 위치, 339번 위치, 342번 위치, 345번 위치, 357번 위치, 363번 위치, 366번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 381번 위치, 393번 위치, 396번 위치, 543번 위치, 546번 위치, 549번 위치, 555번 위치, 558번 위치, 561번 위치, 573번 위치, 579번 위치, 582번 위치, 588번 위치, 612번 위치, 618번 위치, 621번 위치, 627번 위치, 633번 위치, 639번 위치, 654번 위치, 673번 위치, 675번 위치, 678번 위치, 681번 위치, 684번 위치, 705번 위치, 708번 위치, 729번 위치, 735번 위치, 738번 위치, 741번 위치, 744번 위치, 747번 위치, 771번 위치, 786번 위치, 789번 위치, 792번 위치, 810번 위치, 825번 위치, 828번 위치, 838번 위치, 840번 위치, 846번 위치, 849번 위치, 858번 위치, 867번 위치, 879번 위치, 882번 위치, 885번 위치, 891번 위치, 900번 위치, 903번 위치, 906번 위치, 924번 위치, 936번 위치, 939번 위치, 948번 위치, 954번 위치, 963번 위치, 966번 위치, 1026번 위치, 1029번 위치, 1038번 위치, 1047번 위치, 1053번 위치, 1066번 위치, 1068번 위치, 1086번 위치, 및 1110번 위치로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 25 이상, 66 이상, 80 이상 또는 91개 전체 위치의 염기는 유지되어, 변이가 일어나지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 백신은 생백신 또는 사백신일 수 있으나, 생백신인 것이 바람직하다. 구체적으로, 본원에 기술된 약독화된 PRRS 키메라 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체에 전술한 하나 이상의 바이러스주를 생존 상태로 함유하는 변형 생백신일 수 있다. 또한, 또는 대안적으로, 불활성화된 바이러스를 사백신을 제조하는 데에도 사용할 수 있다.
상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주반트(Adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함할 수 있다.
상기 부형제 및/또는 어주반트(Adjuvant)는, 결핵 유래의 톨유사수용체의 작용제 (Toll-like receptor agonist; TLR agonist)일 수 있으며, 예를 들어, 열충격단백질 (Heat shock protein, HSP) 70(GenBank Accession no. EU747334.1), HSP70의 단편, HSPX(서열번호 15) 및 HSPX의 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 또는 4종일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 TLR agonist는 포유동물로부터 유래한 것일 수 있고, 상기 HSP70의 일부 부위는 HSP70의 C-말단일 수 있으며, 상기 HSP70의 C-말단은 서열번호 13의 염기서열에 의해 암호화되는 부위일 수 있다. 일 구현예에서 상기 부형제 및/또는 어주반트는, HSP70 또는 서열번호 13로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 HSP70 C-말단부위; 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 HSPX 또는 상기 HSPX 단백질의 단편으로서 연속하는 10개 내지 50개의 아미노산으로 이루어지는 단편의 조합으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 HSP70, HSP70 단편, HSPX 단백질, 및/또는 HSPX 단백질 단편은 정제 목적으로 N-말단 부위에 태그, 예를 들어 히스티딘 태그(His-Tag)를 부착한 것일 수 있다. 상기 His-Tag은 목적 범위 내에서 히스티딘의 수를 자유롭게 조절할 수 있으며, 예를 들어, 3 내지 20개, 3 내지 15개, 3 내지 10개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 또는 5 내지 10개일 수 있다. 일 예에서 상기 히스티딘 태그는 서열번호 14의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기 TLR 작용제를 부형제 및/또는 어주반트로 사용함으로써, 폴리머 및/또는 오일과 같은 다른 형태의 부형제 및/또는 어주반트를 사용한 경우와 비교하여 우수한 결핵 백신의 PRRS 예방 효과를 및 면역 효과를 얻을 수 있다. 일 예에서, HSP70 또는 HSP70의 단편 및 HSPX를 함께 접종한 경우 각 HSP를 개별적으로 추가한 경우보다 IFNγ의 분비가 증가함을 확인하였다.
상기 부형제 및/또는 어주반트는 백신 1회 투여량 내 각각 10 내지 1000ug, 10 내지 500ug, 10 내지 300ug, 또는 10 내지 100ug의 함량으로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 부형제 및/또는 어주반트의 함량은 투여 대상의 건강 상태, 체중, 백신 조성물의 투여량, 제형, 및/또는 투여 방법 등을 고려하여 적절히 변경될 수 있다. 부형제 및/또는 어주반트의 농도가 낮은 경우 적절한 면역 증강 효과를 얻을 수 없으며, 상기 농도가 지나치게 높은 경우 안전성이 저하될 우려가 있다.
한편, 백신 조성물에 포함된 본 발명의 약독화 키메라 바이러스의 유효량은 바이러스의 유효 용량이 투여된 동물에서 면역 반응을 유인하거나 유인할 수 있는 바이러스의 양일 수 있다. 유효한 양은 백신 성분 및 투여 스케줄에 의존적일 수 있다. 백신 조성물의 투여량은 TCID50 2 내지 6, 바람직하게는 3 내지 4, 범위이나, 개체의 종류에 따라 달라 질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 키메라 바이러스를 포함하는 PRRS 예방용 백신의 1회 투여량 내 키메라 바이러스 함량은 TCID50 50 내지 5x105, 50 내지 3x105, 50 내지 1x105, 75 내지 5x105, 75 내지 3x105, 75 내지 1x105, 100(1x102) 내지 5x105, 100(1x102) 내지 5x105, 또는 100(1x102) 내지 1x105일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여 대상 돼지의 품종, 성장 단계, 및 체중을 고려하여 필요에 따라 적절히 용량을 변경하여 사용할 수 있다.
본 발명의 LMY-BP2017 키메라 바이러스의 지놈, 및 이를 포함하는 백신 조성물은 PRRS 질환의 영향으로부터 돼지를 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또한, PRRS 키메라 바이러스의 면역원성 단편 또는 분획을 비롯한 서브유닛도 PRRS 질환의 영향으로부터 돼지를 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 PRRS를 유발하는 PRRS 바이러스주에 돼지가 노출되기 전에 예방적으로 투여될 수 있고, 상기 바이러스주에 돼지가 노출됨과 동시에 돼지에 투여될 수 있고, 바이러스주에 표적 돼지가 노출된 후 치료적으로 투여될 수 있다.
본 발명이 제공하는 백신 조성물은 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)의 예방, 예를 들어 북미형 PRRSV에 의해 발병하는 PRRS의 예방에 이용될 수 있다. 일 예에서 상기 북미형 PRRSV는 타입 II형 VR2332 바이러스 균주(strain)일 수 있다.
본 발명의 약독화된 PRRSV 키메라 바이러스, 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 경구, 비경구, 피하, 근육내, 피내, 설하, 경피, 직장, 경점막, 흡입을 통한 표면적, 협측 투여를 통해, 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다. 또한, 약독화된 PRRS 키메라 바이러스는 약독화된 바이러스의 서방출을 허용할 수 있는 이식체 형태로 투여될 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 약독화된 PRRSV 키메라 바이러스 백신은 피내 접종에 의해 투여되는 것일 수 있다. 상기 피내 접종 방법은, 일반 근육 접종 방식과 달리, 피부에 존재하는 항원제시 면역세포인 랑게르한스 세포(Langerhans cell)를 직접 자극할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 약독화된 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 주사, 흡입 또는 이식을 통해 투여될 수 있고, 주사가 특히 바람직하다. 백신접종 또는 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라 약독화된 PRRSV 키메라 바이러스 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 1회 또는 여러 번, 또한 간헐적으로, 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 동일한 양 또는 다른 투여량으로 투여될 수 있다. 주사는 원하는 양으로 주사하거나 피하 혹은 비강에 분무하여 주입할 수 있다, 또는 대안적으로 연속 주입할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은, 돼지에 투여될 수 있으며, 상기 돼지는 이유 자돈기, 육성기 및 비육기로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 성장 단계의 돼지일 수 있다. 상기 이유 자돈기의 돼지는 생후 7일 이상, 14일 이상, 또는 21일 이상부터 체중 30kg에 이르기 전까지의 돼지를 의미하며, 상기 육성기는 돼지의 체중이 30 내지 50kg인 시기를, 상기 비육기는 육성기 이후의 시기를 의미하는 것일 수 있다. 상기 돼지는 양돈 돼지 및/또는 멧돼지일 수 있으며, 품종을 가리지 않으나, 예를 들어, 랜드레이스종, 요크셔종, 듀록종, 버크셔종, 및 재래돼지로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상 또는 5종 이상일 수 있으며, 상기 종 사이의 교잡으로 태어난 돼지를 모두 포함한다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스는 상기 키메라 바이러스와 이의 모균주(GenBank accession no.DQ473474.1.)를 돼지의 폐 대식세포에 접종하고 측정한 바이러스의 TCID50의 값이, 모균주의 TCID50 값에 비해 0.01 배 내지 0.1배의 TCID50 값을 갖는 바이러스일 수 있다. 바람직하게는 상기 측정기간은 2일 후이며, 상기 TCID50 값은 0.05배 내지 0.1배 일 수 있다. 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스는 모균주 보다 낮은 TCID50 값을 가지며, 모균주보다 증식성이 감소되고 약독화 되어있다.
또한, 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스와 이의 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)를 돼지에 접종하고 측정한 변이주의 중화 항체 함량이, 모균주의 2배 내지 8배, 바람직하게는 2배 내지 4배를 갖는 바이러스를 제공한다. 상기 측정기간은 적절하게는 28일 후인 것이 바람직하다. 중화항체라 함은 대표적인 북미형 PRRSV 균주인 VR2332에 대항하는 중화능력을 보유한 항체를 의미한다. 따라서, 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스 또는, 이를 포함하는 백신조성물을 돼지에 접종할 경우, 돼지의 중화항체의 역가가 증가시키며 돼지의 면역인자의 발현을 증가시켜 PRRS에 대한 면역 효과를 현저히 상승시킬 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기에서 기술한 본 발명의 PRRSV 키메라 바이러스 LMY+BP2017의 CPB수치는 LMY 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.)보다 낮은 수치를 나타내며, 바람직하게는 -0.39 내지 0, 더욱 바람직하게는 -0.35 내지 -0.20, 적절하게는 -0.35 내지 -0.26, 예를 들어 -0.2393184052058128일 수 있다. CPB 수치가 -0.39 미만일 경우, 바이러스 작출에 어려움이 있으며, 0을 초과할 경우, 작출은 가능하나 증식성이 감소하지 않아 약독화 되지 않는다는 문제점이 있다. 따라서, 본 발명의 약독화된 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 상기 CPB 수치를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 CpG, UpA 수치가 모균주(Accession No. GenBank accession no.DQ473474.1.) 의 1.0배 내지 3.0배를 갖는 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 제공한다. CpG, UpA 비율의 변화는 deoptimization 과정에서 필연적으로 발생하는 결과로서, 진핵세포 유전자의 CpG, UpA의 수치를 증가시키면, cell stress를 유발하여 바이러스의 증식성이 감소되어 바이러스를 약독화 시킬 수 있다. 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 모균주보다 높은 CpG, UpA 수치를 가지며, 바람직하게는 모균주의 1.0배 내지 3.0배 높은 수치를 갖고, 예를 들어 상기 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스의 CpG는 1.1753, UpA 는 1.03 일 수 있다.
본 발명이 제공하는 백신 조성물은 백신 접종 후 혈중 사이토카인의 분비를 증가시킬 수 있다. 상기 사이토카인은 인터페론 알파(Interferon alpha, IFNa), 인터류킨 8(Interleukin 8, IL-8), 및 인터류킨 12(Interleukin 12, IL-12)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상, 2종 이상 또는 3종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인터페론 알파는 백신 접종 후 1주일 이내에 혈중 함량이 백신 비접종군 대비 1.5배 내지 500배, 1.5 내지 450배, 1.5 내지 300배, 2 내지 500배, 2 내지 450배, 또는 2 내지 300배 증가할 수 있다. 또 다른 일 예에서, 상기 인터페론 알파는 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 백신 접종 후 1주일 혈중 함량이 어주반트(Adjuvant)를 포함하지 않는 백신 접종군 대비 1.5 내지 50배, 1.5 내지 30배, 1.5 내지 20배, 2 내지 50배, 2 내지 30배, 또는 2 내지 20배일 수 있다.
상기 인터류킨 8의 혈중 함량은 백신 접종군에서 백신 비접종군에 비해 1.2 내지 100배, 1.2 내지 70배, 1.2 내지 50배, 1.3 내지 100배, 1.3 내지 70배, 또는 1.3 내지 50배 증가할 수 있다. 또 다른 일 예에서, 상기 인터류킨 8의 혈중 함량은 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 백신 접종군에서 어주반트(Adjuvant)를 포함하지 않는 백신 접종군에 비해 1.5 내지 20배, 1.5 내지 10배, 1.5 내지 5배, 2 내지 20배, 2 내지 10배, 또는 2 내지 5배 증가할 수 있다.
상기 인터류킨 12의 혈중 함량은 백신 접종군에서 백신 비접종군에 비해 1 내지 10배, 1 내지 5배, 1 내지 3.5배, 1.2 내지 10배, 1.2 내지 5배 또는 1.2 내지 3.5배 증가할 수 있다. 또 다른 일 예에서, 백신 접종 후 5일 이내 또는 3일 이내 인터류킨 12의 혈중 함량은 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 백신 접종군에서 어주반트(Adjuvant)를 포함하지 않는 백신 접종군에 비해 1.5 내지 5배, 1.5 내지 3배, 1.5 내지 2.5배, 2 내지 5배, 2 내지 3배, 또는 2 내지 2.5배 증가할 수 있다.
상기 인터페론 알파, 인터류킨 8 및/또는 인터류킨 12의 함량은 상기 부형제 및/또는 어주반트가 첨가되었을 때 상기 부형제 및/또는 어주반트 미첨가 백신에 비해 변화폭이 더 클 수 있다. 일 예에서, 백신 접종후 3일째에 인터페론 알파의 함량은 어주반트(Adjuvant)를 포함하지 않는 백신 접종군에 비해 어주반트(Adjuvant)를 포함한 백신 접종군에서 10배 이상 높았다 (도 7). 일 예에서, 인터류킨 8의 함량은 어주반트(Adjuvant)를 첨가하지 않은 백신을 접종한 그룹보다 어주반트(Adjuvant)를 첨가한 백신을 접종한 그룹에서 2배 또는 3배 이상 높은 수치를 나타내었다. 일 예에서, 백신 접종 후 3일째의 인터류킨 12의 함량은 어주반트(Adjuvant)를 포함하지 않는 백신 접종군에 비해 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 백신 접종군에서 2배 이상 높았다.
본 발명이 제공하는 백신 조성물은 돼지에 투여(접종)되었을 때 항-PRRSV 항체(Anti-PRRSV antibody)의 혈중 함량을 증가시킨다. 일 실시예에서, 본 발명의 백신 조성물을 돼지에 주입한 후 항-PRRSV 항체(anti-PRRSV antibodies)의 생성량을 ELISA로 측정한 결과, 어주반트(Adjuvant)의 포함 유무에 관계 없이 7일 이내에 항체가 생성됨을 확인하였으며, 어주반트(Adjuvant)가 첨가된 경우 백신 접종 후 21일간 항체 생성량이 더 많았다. 일 예에서,
일 예에서, 접종일로부터 42일까지 어주반트(Adjuvant)가 첨가된 백신 접종군(VC1)에서의 중화항체 역가는 어주반트(Adjuvant)가 첨가되지 않는 백신 접종군(VC2)에 비해 1 내지 5배, 1 내지 3배 또는 1 내지 2.5배일 수 있으며, 접종일로부터 28일까지의 중화항체 역가는 상기 VC1에서 VC2에 비해 1.5 내지 5배, 1.5 내지 3배, 1.5 내지 2.5배, 2 내지 5배, 2 내지 3배, 또는 2 내지 2.5배일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 백신 조성물은 돼지에 접종되었을 때 PRRSV에 특이적인 인터페론 감마(IFNr) 분비 세포를 증가시킬 수 있다. 상기 인터페론 감마 분비 세포는 어주반트(Adjuvant)가 첨가된 백신 접종 시 어주반트(Adjuvant)를 첨가하지 않은 백신에 비해 1 내지 20배, 1 내지 10배, 1 내지 5배, 1.1 내지 20배, 1.1 내지 10배, 또는 1.1 내지 5배 더 많이 나타날 수 있다.
일 실시예에서, 상기 키메라 바이러스(LMY+BP2017)만을 포함하는 백신 조성물, 상기 키메라 바이러스와 어주반트(Adjuvant)(HSP70의 C-말단 및 HSPX)를 포함하는 백신 조성물을 각각 돼지에 투여하여 대조군과 감염 실험을 진행하여 감염일 이후 감염된 바이러스의 유전체 복제수를 측정하였다. 그 결과, 감염 후 7일째에는 어주반트(Adjuvant) 첨가 여부에 관계없이 대조군과 약 100배의 감염 바이러스 유전체 차이를 나타내었으나, 감염 후 14일이 경과하자, 대조군에서의 감염 바이러스 유전체 복제수에는 큰 차이가 없었던 반면, 어주반트(Adjuvant)를 첨가한 백신 접종군에서는 1000배 내지 10000배 감소하였으며, 어주반트(Adjuvant)를 첨가하지 않은 백신 접종군에서도 감염 바이러스 유전체 복제수가 10배 내지 1000배 감소하였음을 확인하였다. 따라서 본 발명이 제공하는 백신 조성물은 PRRSV에 대해 유효한 면역력을 가진다.
본 발명의 일 예에 따르면, 수탁번호 13394BP를 갖는 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI과 PacI 로 처리하여 폴리뉴클레오타이드 절편을 제조하는 단계, 수탁번호 KCTC 13393BP를 갖는 BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 폴리뉴클레오타이드 절편을 제조하는 단계, 및 상기 LMY ver 2의 폴리뉴클레오타이드 절편과 BP2017-2의 폴리뉴클레오타이드 절편을 재조합하여 감염성 클론(infectious clone)을 제조하는 단계를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스를 생산하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 LMY ver2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI과 PacI 로 처리하여 제조된 폴리뉴클레오타이드 절편은 NSP1-beta를 암호화하는 부위를 포함할 수 있다.
상기 BP2017-2 변이주의 지놈을 제한효소 AscI 와 PacI 로 처리하여 제조된 폴리뉴클레오타이드 절편은 ORF2 내지 ORF7 부위를 포함할 수 있다.
상기 절편을 재조합하는 단계에서 리가아제(ligase)를 사용할 수 있으며, 상기 제조한 감염성 클론을 세포에 접종해 키메라 바이러스를 제조할 수 있다.
상기 세포는 키메라 바이러스를 다량 제조하기 위해, 키메라 바이러스 DNA 또는 RNA, 또는 이를 포함하는 벡터, 감염성 클론, 키메라 바이러스가 트랜스펙션되는 세포를 의미하며, 세포의 종류를 특별히 한정하지는 않는다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 백신 조성물을 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
바람직한 형태로서, 본 발명의 돼지 생식기 호흡기 증후군의 예방 또는 치료용 조성물은 당업자에게 공지된 추가 성분을 포함할 수 있고, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 1,000 mg/kg(체중)의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명의 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 키메라 바이러스 지놈을 포함하는 백신 조성물을 돼지에 투여함으로써 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도할 수 있으며, PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도해, 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물을 투여함으로써 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방할 수 있다.
구체적으로, 상기 방법은 조성물을 피하 주사, 정맥내 주사, 진피내 주사(피내주사, intradermal injection), 비경구 주사, 근육내 주사, 무침(needle free) 주사, 전기천공, 경구 전달, 비내 전달, 구비강(oronasal) 전달, 또는 그의 임의의 조합에 의해 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명이 제공하는 백신 조성물은 돼지 생식기 호흡기 증후군의 예방 및/또는 치료를 위해 피내주사 되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예는, 상기 백신 조성물을 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방 및/또는 치료용 키트를 제공한다. 상기 키트는 용기, 바람직하게는 본 발명의 약독화된 PRRS 키메라 바이러스를 함유하는 백신 조성물, 약제학적으로 허용되는 담체, 보강제 및 PRRS 감염의 임상 징후 또는 효과, 바람직하게는 PRRS의 빈도 또는 중증도를 경감시키도록 이를 필요로 하는 동물에게 상기 면역원성 조성물을 투여하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 주사 수단 및/또는 다른 형태의 투여 수단을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 용매를 포함할 수 있다. 약독화된 백신은 동결건조 될 수 있고, 용매로 복원되어 주사 및/또는 흡입용 용액이 될 수 있다. 용매는 물, 생리식염수, 완충액 또는 보강 용매일 수 있다. 키트는 약독화된 바이러스, 용매 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 분리 용기를 포함할 수 있다. 사용설명서는 하나 이상의 용기에 부착된 라벨 및/또는 인쇄물일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 약독화된 키메라 바이러스와 어주반트(Adjuvant)를 포함함으로써 돼지생식기호흡기증후군의 예방 효과가 현저히 증가하여, PRRSV에 의한 질병 예방 효과가 우수하다.
도 1은 PRRS 바이러스의 일반적인 ORF 분포를 나타낸 모식도이다.
도 2는 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 유전체 배열을 나타낸 모식도이다.
도 3은 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 계통수 그림이다.
도 4은 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 증식성을 LMY 바이러스와 비교한 실험 그래프이다.
도 5는 각 바이러스 및 PBS를 주입한 대조군에서의 중화항체 생성 결과 그래프이다.
도 6은 SPF 돼지에 백신 접종 이후 시간의 경과에 따른 혈청 내 사이토카인(Cytokine)의 수치 그래프이다.
도 7은 백신 접종 이후 돼지의 혈청 내에서 측정한 ELISA S/P ratio와 중화항체 역가 그래프이다.
도 8은 백신 접종 이후 돼지의 혈액에서 분리한 PBMC (Peripheral blood mononuclear cell )에서 PRRSV 항원에 특이적으로 IFNγ를 분비하는 세포 수 측정 결과 그래프이다.
도 9는 공격접종 이후 혈청에서 감염된 PRRSV의 Viral load 의 그룹 별 차이를 분석한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 약독화된 재조합 PRRS 바이러스(PRRSV) 변이주의 제조 및 검증
PRRS 백신 제조를 위해, 약독화된 키메라 PRRS 바이러스 (PRRS virus)주를 제조하였다. 이를 위해 PRRS 바이러스 중 북아메리카 타입의 분리주에 속하며, 검역본부에서 분리한, LMY 변이주(GenBank Accession no. DQ473474.1), 및 2017년 충남 공주시 남산리 남산농장에서 분리된 BP2017-2 바이러스주를 이용하였다.
상기 약독화된 키메라 바이러스주는 상기 LMY 균주의 변이주의 비구조단백질(Non structural Protein 1, NSP1; 서열번호: 11) 부위를 포함하는 ORF1a 및 ORF1b; 및 충남 공주시 남산리 남산농장에서 2017년에 분리된 BP2017-2의 ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, 및 ORF7 부위를 포함하도록 디자인하였다.
1-1. LMY ver2 변이주 제작
농림축산식품부 농림축산검역본부에서 분리한 PRRS 바이러스인, LMY 변이주를 사용해 NSP1 부위의 유전자의 염기서열 중 91개의 염기를 치환하여 LMY ver2변이주를 제조하였다. 상기 NSP1 부위의 유전자는 NSP1-alpha 부위에서 25개 염기가, NSP1-beta 부위에서 66개 염기가 치환되었다. 상기 변이 바이러스주는 LMY ver2로 명명하였다.
상기 변이주 LMY ver2는 SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 이용하여 코돈쌍 탈최적화(Codon Pair Deoptimization)의 원리에 따라 염기서열의 일부에 침묵 돌연변이(silent mutation)를 도입하여 제조하였다.
구체적으로, SAVE(Synthetic Attenuated Virus Engineering) 프로그램을 사용해 LMY 바이러스의 유전자 코돈이 쌍으로 배열시 상호작용하여 생기는 편향성인 CPB(codon pair base)값을 컴퓨터 알고리즘을 이용해 수치화하였다. CPB 수치는 LMY 바이러스 유전자의 일부 염기서열이 다른 염기서열로 치환될 시 변동되며, 바이러스의 증식성과 밀접한 관련이 있다. 바이러스의 증식성은 염기서열 치환을 통해 CPB 수치가 감소(deoptimization)되면, 증식성이 감소하고 약독화된다.
본 발명자들은 키메라바이러스의 모균주 중 하나인 LMY 균주의 유전체에서 유전적으로 안정성이 높은 NSP1부위(NSP1-alpha 및 NSP1-beta, 서열번호 11)를 선정하여 SAVE 프로그램으로 분석하였으며, CPB값이 비교적 높게 나타난 염기 부위 중 NSP1-alpha 부위에서 25개, NSP1-beta 부위에서 66개, 총 91개의 염기를 선택해 다른 염기로 치환하여 탈최적화(Deoptimization)시켜 LMY 바이러스 변이주를 제조하였다. 상기 방법으로 제조된 NSP1의 91개 염기서열이 돌연변이(서열번호 12)된 LMY 바이러스 변이주를 "LMY ver2"로 명명하였으며, 관련 염기서열을 하기 표 1에 나타냈다. 하기 표 1에서, LMY ver2 NSP1 beta 유전자의 핵산 서열 중 돌연변이가 도입된 부분은, 굵은 글씨와 밑줄로 표시하였다.
상기 방법으로 제조된 LMY ver2는 2017년 11월 14일자로 한국생명공학연구원에 기탁되어, 수탁번호 KCTC13394BP를 부여 받았다.
명칭 염기서열 (5' > 3') 서열번호
LMY의 NSP1 beta 유전자 GCTGCTGTCTACGATGTTGGTCATGGCGCCGTCATGTATGTGGCCGATGAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCGTGGCGGGGATGAAGTAAGATTTGAAACTGTCCCACAGGAGCTCAAGTCGGTTGCGAACCAACTCTGCACCTCCTTCCCACCCCACCACGTAGTGGACATGTCTAAGTTCGCCTTTACAGCCCCTGGGTGTGGTGTTTCTATGCGGGTCGAACGTCAATATGGCTGTCTCCCCGCTGACACTGTCCCCGAAGGCAACTGCTGGTGGAGCTTGTTTGACTCGCTCCCATTGGAAGTCCAGGGCAAAGAAATTCGCCATGCTAACCAATTTGGCTACCAGACCAAGCATGGTGTCTCTGGTAAGTACCTACAGCGGAGGCTGCAAATTAATGGTCTCCGAGCAGTAGCTGACCCAAATGGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTAGCGGAAGAACCCAGTTACCCTGGGTTTGAGGACCTCCTCAGAATAAGGGTTGAGTCTAACACGTCACCATTGGCTAACAAGGATGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC 5
LMY ver2 NSP1 beta 유전자 GC C GC C GT A TACGA C GT C GG A CATGGCGCCGT T ATGTA C GT T GCCGA C GAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCG C GGCGG C GA C GAAGT T AGATT C GAAAC G GTCCCACAGGAGCT T AAGTCGGTTGCGAACCAA T T A TG T AC G TC G TTCCCACCCCACCACGTAGT C GA T ATGTCTAAGTTCGCCTTTAC C GCCCC C GG T TG C GG C GT A TCTATGCGGGTCGAACGTCAATA C GGCTGTCTCCCCGC C GA T AC G GTCCCCGAAGGCAACTG T TGGTGGAGCTTGTT C GA T TCGCTCCCA C T C GAAGT G CA A GGCAAAGA G ATTCGCCA C GCTAACCAATT C GG G TA T CAGAC T AAGCATGG C GT A TC C GGTAAGTACCTACAGCG T AGGCTGCAAAT C AA C GGTCTCCG C GCAGT C GCTGACCC T AA C GGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACT G GC C GAAGAACC T AGTTACCC C GGGTT C GAGGACCTCCTC C G C ATAAGGGTTGAGTCTAA T ACGTCACCATTGGCTAACAAGGA C GAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC 6
LMY의 NSP1 유전자 ATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCACGTGTACCCCCAATGCCAGGGTGTTTATGGCGGAGGGCCAAGTTTACTGCACACGATGTCTCAGTGCACGGTCTCTCCTTCCCCTGAATCTCCAAGTTTCTGAGCTCGGGGTGCTGGGCCTATTCTACAGGCCCGAAGAGCCACTCCGGTGGACGTTGCCACGTGCATTCCCCACTGTTGAGTGCTCCCCCGCCGGGGCCTGCTGGCTTTCTGCAATCTTTCCAATTGCACGAATGACCAGTGGAAACCTAAACTTCCAACAAAGAATGGTACGGGTCGCAGCTGAGATCTACAGAGTTGGCCAGCTCACCCCTGCAGTTTTGAAGGCTCTACAAGTTTATGAGCGGGGTTGCCGCTGGTATCCCATTGTTGGACCTGTCCCTGGAGTGGCCGTTTTCGCCAACTCCCTGCATGTGAGTGATAGACCTTTCCCGGGAGCAACTCACGTATTAACCAACCTGCCACTCCCGCAGAGACCCAAGCCTGAGGACTTTTGCCCCTTCGAGTGTGCTATGGCTGCTGTCTACGATGTTGGTCATGGCGCCGTCATGTATGTGGCCGATGAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCGTGGCGGGGATGAAGTAAGATTTGAAACTGTCCCACAGGAGCTCAAGTCGGTTGCGAACCAACTCTGCACCTCCTTCCCACCCCACCACGTAGTGGACATGTCTAAGTTCGCCTTTACAGCCCCTGGGTGTGGTGTTTCTATGCGGGTCGAACGTCAATATGGCTGTCTCCCCGCTGACACTGTCCCCGAAGGCAACTGCTGGTGGAGCTTGTTTGACTCGCTCCCATTGGAAGTCCAGGGCAAAGAAATTCGCCATGCTAACCAATTTGGCTACCAGACCAAGCATGGTGTCTCTGGTAAGTACCTACAGCGGAGGCTGCAAATTAATGGTCTCCGAGCAGTAGCTGACCCAAATGGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTAGCGGAAGAACCCAGTTACCCTGGGTTTGAGGACCTCCTCAGAATAAGGGTTGAGTCTAACACGTCACCATTGGCTAACAAGGATGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC 11
LMY ver2 NSP1 유전자 ATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCACGTGTACCCCCAATGCCAGGGTGTTTATGGCGGAGGGCCAAGTTTACTGCACACGATGTCTCAGTGCACGGTCTCTCCTTCCCCTGAATCTCCAAGTTTCTGAGCTCGGGGTGCTGGGCCTATTCTACAGGCCCGAAGAGCCACTCCGGTGGACGTTGCCACGTGCATTCCCCACTGTTGAGTGCTCCCCCGCCGG C GC A TGCTGGCTTTC C GC T ATCTTTCCAAT C GCACGAATGACCAGTGGAAACCTAAACTTCCAACAAAGAATGGTACGGGTCGC C GC C GA A AT A TACAGAGT C GG G CA A CT T AC G CC C GC T GT A TTGAAGGCTCT G CAAGT A TA C GAGCGGGGTTG TA G G TGGTATCCCAT C GT A GGACCTGTCCCTGGAGTGGCCGTTTTCGCCAACTCCCTGCATGTGAGTGATAGACCTTTCCCGGGAGCAACTCACGTATTAACCAACCTGCCACTCCCGCAGAGACCCAAGCCTGAGGACTTTTGCCCCTTCGAGTGTGCTATGGC C GC C GT A TACGA C GT C GG A CATGGCGCCGT T ATGTA C GT T GCCGA C GAGAGAGTCTCCTGGGCCCCTCG C GGCGG C GA C GAAGT T AGATT C GAAAC G GTCCCACAGGAGCT T AAGTCGGTTGCGAACCAA TTA TG T AC G TC G TTCCCACCCCACCACGTAGT C GA T ATGTCTAAGTTCGCCTTTAC C GCCCC C GG T TG C GG C GT A TCTATGCGGGTCGAACGTCAATA C GGCTGTCTCCCCGC C GA T AC G GTCCCCGAAGGCAACTG T TGGTGGAGCTTGTT C GA T TCGCTCCCA C T C GAAGT G CA A GGCAAAGA G ATTCGCCA C GCTAACCAATT C GG G TA T CAGAC T AAGCATGG C GT A TC C GGTAAGTACCTACAGCG T AGGCTGCAAAT C AA C GGTCTCCG C GCAGT C GCTGACCC T AA C GGACCTTTCGTCGTACAGTACTTCTCCGTCAAGGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACT G GC C GAAGAACC T AGTTACCC C GGGTT C GAGGACCTCCTC C G C ATAAGGGTTGAGTCTAA T ACGTCACCATTGGCTAACAAGGA C GAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGGC 12
(상기 표 3에서, LMY ver2 NSP1 유전자의 핵산 서열 중 굵은 글씨와 밑줄로 표시한 부분은 LMY NSP1 유전자 또는 LMY NSP1-beta 유전자에서 변이가 일어난 염기부분이다.)
1-2. LMY ver2 변이주의 약독화 정도 확인
다음으로, LMY ver2 변이주의 약독화 정도를 확인하기 위해, CPB 값을 측정하였다. 하기 표 2에 각 바이러스에 대한 CPB 값 측정 결과를 나타내었다. LMY 모균주의 CPB 값은 약 0.016 정도로 측정되었으나, LMY ver2 변이주의 CPB 값은 약 -0.33 정도로 측정되어, 이로부터 LMY ver2 변이주의 증식성이 기존 모균주보다 감소되었으며, 약독화된 균주임을 알 수 있었다.
바이러스 균주 NSP1 부위 Codon Pare Deoptimization (CBP)
LMY NSP1 0.01392516640897059
LMY ver2 NSP1 -0.2393184052058128
LMY NSP1-beta 0.016079236408108866
LMY ver2 NSP1-beta -0.3377269630038442
1-3. LMY ver2 변이주의 감염성 클론 제작
LMY ver2의 감염성클론(infectious clone)을 제조하였다.
우선, LMY 모균주의 전체 유전자 서열(GenBank Accession no.DQ473474.1)을 7개의 단편(Fragments)으로 나누어 각각 합성하였다. 상기 7개의 단편은 제한효소의 위치와 합성 가능한 크기 등을 고려하여 각 단편의 크기가 2500 내지 3500bp의 크기가 되도록 설계되었다. 하기 표 5에 각 단편 제조에 사용된 제한효소 정보를 나타내었다.
상기 7개의 단편 중 NSP1에 해당하는 부위(표 5의 단편 1)를 LMY 균주의 NSP1 부위의 유전자 염기서열 중 91개 염기가 치환된 DNA 단편(서열번호 12)으로 합성하였다. 합성된 단편 유전자는 순서대로 하기 표 5의 제한효소로 자른 뒤 연결 효소(ligase)로 연결하여 하나의 감염성 클론(infectious clone)을 제조하였다.
단편 제한효소 Tm (℃) 완충액 제한효소 인식부위
1 AsiSI 37 CutSmart GCGATCGC
XhoI 37 CutSmart CTCGAG
2 XhoI 37 NEB3.1 CTCGAG
MluI 37 NEB3.1 ACGCGT
3 MluI 37 NEB3.1 ACGCGT
NsiI 37 NEB3.1 ATGCAT
4 NsiI 37 CutSmart ATGCAT
SpeI 37 CutSmart ACTAGT
5 SpeI 37 CutSmart ACTAGT
AscI 37 CutSmart GGCGCGCC
6 AscI 37 CutSmart GGCGCGCC
AfeI (blunt) 37 CutSmart AGCGCT
7 AfeI (blunt) 37 CutSmart AGCGCT
PacI 37 CutSmart TTAATTAA
1-4. 키메라 바이러스 클론의 제작 및 동정
PRRS 바이러스는 총 8개의 ORF, 즉 ORF1a, ORF1b, 및 ORF2 내지 7을 포함하고 있다. 도 1에 이러한 PRRS 바이러스 유전체의 일반적인 ORF 분포 모식도를 나타내었다.
상기 LMY ver2 변이주의 전체 구조 유전자를 포함하는 유전체 영역에서 ORF2 내지 ORF7의 부위를 제한효소인 AscI 및 PacI를 사용하여 절단하여, ORF1a 및 ORF1b에 해당하는 영역을 분리하였다.
이어서, BP2017-2 균주(수탁번호 KCTC 13393BP)의 유전체 영역 중 LMY ver2 변이주의 ORF2 내지 ORF7의 부위에 대응하는 부분을 상기 LMY ver2의 유전체 절단에 사용된 것과 동일한 AscI 및 PacI 제한효소로 절단하여, ORF2 내지 ORF7 부위를 분리하였다.
이후, LMY ver2 변이 균주의 ORF1a 및 ORF1b 영역과, 상기 BP2017-2 균주의 ORF2 내지 ORF7 부위에 해당하는 영역을, ligase로 연결하여 하나의 재조합 감염성 클론(infectious clone)을 제조하였으며, 상기 재조합 감염성 키메라 바이러스 클론을 LMY+BP2017 로 명명하였다. 상기 키메라 바이러스 클론은 약자로 "LMY+BP"로 나타내기도 하였다.
하기 표 6에 사용된 제한효소를 나타내었다.
단편 제한효소 Tm (℃) 완충액 제한효소 인식부위 서열번호
ORF2 내지 7 AscI 37 CutSmart GGCGCGCC 7
PacI 37 CutSmart TTAATTAA 8
상기 LMY+BP2017 키메라 균주의 동정을 위해, 상기 키메라 균주와 LMY균주(GenBank accession no.DQ473474.1.)의 NSP1 beta 부위에 대한 염기서열 분석을 수행하였다.
구체적으로 LMY 바이러스의 NSP1 beta 부위를 포함해 1 내지 1654nt까지 탐지 가능한 하기의 프라이머 세트와 one step RT PCR 키트(Intron)를 이용해 PCR을 수행하였으며, 구체적으로, 45℃에서 30분, 95℃에서 5분간 initial RT 과정을 거친 후 94℃에서 30초, 61℃에서 30초 72℃에서 2분 동안 반응시켰으며, 이 과정을 38회 반복하였다. 다음으로 PCR결과 증폭산물을 sequencing 하여 각각 균주의 동정을 완료하였다.
Forward primer (서열번호 9): 5'-ATGACGTATAGGTGTTGGCTCTA-3'
Reverse primer (서열번호 10): 5'-CTGAGGATTTGGATGGCATT-3'
또한 상기 재조합 바이러스 균주 LMY+BP chimera와 기존에 알려진 PRRS 균주와의 유전적 차이를 확인하기 위해, bioedit program을 사용하여 각 균주의 NSP1-beta 부위 sequence identity 측정하였으며, 상동성 비교 결과를 하기 표 7에 나타냈다.
구분 염기서열 상동성 (Identity%)
LMY 92.4
P129 80.1
DC 79.4
JA142 79.8
PL97-1 85
Henan-A14 78.3
VR 2332 85
KNU-12-KJ4 75.5
CA-2 77.9
VR 2385 84.7
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 상동성 비교 결과 LMY+BP chimera바이러스가 여타의 PRRS 균주와는 다른 고유한 서열을 보유하고 있음을 알 수 있었다.
상동성 비교 결과를 바탕으로, bioedit program을 사용하여 계통수를 분석하였으며 Bootstrap을 1000회 반복하였다. 이를 바탕으로 대략적인 LMY+BP2017 키메라 바이러스와 LMY의 계통수(Phylogenetic tree) 를 작성하였으며, 이를 도 2에 나타냈다. 도 2의 계통수로부터, 본 바이러스의 계통을 알 수 있었다.
상기 완성된 감염성 클론을 CMV 프로모터 및 앰피실린(ampicillin) 저항성 유전자를 탑재한 high copy vector에 삽입한 후, 리포펙타민(lipofectamine)을 이용해 BHK cell(한국세포주은행)에 형질감염 하고, 최종적으로 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 작출하였다. 최종 제조된 상기 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 TCID50방법으로 정량하여 이용되었다.
상기 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 2018년 10월 24일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC13675BP를 수여받았다.
1-5. LMY+BP2017 키메라 바이러스의 계대에 따른 변이 유지여부 확인
LMY+BP2017 키메라 바이러스를 계대했을 때 변형된 부위가 언제까지 유지되는지를 확인하였다. PRRS 바이러스 수용성 세포주로 알려진 MARC-145 세포에서 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 30회 계대 과정을 거쳐 안정화시켰으며, 10계대 마다 유전자 변이를 확인하기 위해 상기 실시예 1-4와 동일한 방법을 사용해 서열 분석(Sequencing) 작업을 진행하였다.
Sequencing 확인결과, 30계대 안정화 이후에도 본 바이러스의 유전자 치환부위가 유지됨을 확인하였다. 하기 표 8에 각 계대수에 따른 염기 변이의 수 (nt change), 변이 위치 (mutation site), 및 아미노산 변이 여부 (a.a change)를 나타내었다.
계대수 P1 P10 P20 P30 P40
nt change - 1 2 3 4
mutation site - NSP2(867nt, C>T) NSP2
(867nt, C>T)
ORF2a
(72nt, T>G)		 NSP2
(867nt, C>T)
ORF2a
(72nt, T>G)
(291nt, G>T)		 NSP2
(867nt, C>T)
(1718~2251nt deletion)
ORF2a
(72nt, T>G)
(291nt, G>T)
a.a change - 0(Asp>Asp) 0
(Asp>Asp)
(Ser>Ser)		 1
(Asp>Asp)
(Ser>Ser)
(Met>Ile)		 2
(Asp>Asp)
(179aa deletion)
(Ser>Ser)
(Met>Ile)
상기 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 30회 이상 계대를 진행한 경우에도 ORF1a의 NSP1a 또는 NSP1b 유전자 상의 변이는 그대로 유지하였으며, NSP2 단백질 또는 ORF2a에서의 변이만이 확인되었다. 따라서 40회 계대가 이루어진 후에도 실시예 1에서 제작된 바이러스의 NSP1 단백질을 암호화하는 유전자의 변이가 유지됨을 확인하였다.
1-5. LMY+BP2017 키메라 바이러스의 증식성 확인
LMY+BP2017 키메라 바이러스의 증식성을 평가하기 위해, 먼저 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 NSP1 beta 유전자 내 CpG, UpA의 비율과 모균주인 LMY의 NSP1 beta 유전자 내 CpG 및 UpA 수치를 측정하였다.
바이러스 유전자의 CpG, UpA 비율의 변화는 코돈 탈최적화 과정에서 필연적으로 발생하는 결과로, 유전자의 CpG, UpA의 수치가 증가하면, 세포 스트레스가 유발되어 바이러스의 증식성이 감소한다. LMY+BP2017 키메라 바이러스와 LMY 바이러스의 NSP1β 유전자 내 CpG, UpA의 비율을 SSE program (version 1.2, http://www.virus-evolution.org/Downloads/Software/)을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 아래 표 9에 나타냈다.
바이러스 CpG UpA
LMY 0.6394 0.7066
LMY+BP2017키메라 1.1753 1.03
표 9에 나타난 바와 같이, LMY+BP2017 키메라 바이러스의 CpG 및 UpA의 수치가 모균주 LMY와 대비해 상승함을 확인하였으며, 이로부터 LMY+BP2017 키메라 바이러스의 증식성이 LMY 모균주와 비교해 현저히 감소됨을 간접적으로 확인할 수 있었다.
또한, 상기 키메라 바이러스의 증식성 감소를 직접 확인하기 위해, 돼지 폐 대식세포(PAM, Porcine Alveolar Macrophage)에서 LMY+BP2017 키메라 바이러스와 이의 모균주인 LMY를 접종한 이후, 작출되는 바이러스의 양을 TCID50으로 측정하여 확인하였다.
구체적으로, RPMI 배지(10%(v/v) FBS, 1%(w/v) penicillin/streptomycin 포함) 2ml가 포함된 6 웰 플레이트에 PAM 세포를 웰당 2 X 106 cell/well의 비율로 분주하였다. 다음으로, LMY와 LMY+BP2017 키메라 바이러스를 각각 서로 다른 웰에 MOI 0.01의 비율로 접종하고 접종 1시간 후에 모든 상층액을 제거하였으며, 유지액 RPMI 배지(10%(v/v) FBS, 1%(w/v) penicillin/streptomycin 포함)를 2ml 분주하였다. 분주하고 2일이 지난 후, 각각의 웰의 상층액을 수거하여 TCID50(Tissue culture infective dose50)을 측정하였다.
이후 실험에서 사용되는 세포는 TCID50 측정 전날에 미리 96웰에 MARC-145 세포 2X105 cell/well을 DMEM 배지(10%(v/v) FBS, 1%(w/v) penicillin/streptomycin) 100ul와 함께 분주하여 부착시킨 것을 사용하였다.
접종할 바이러스는 다음과 같이 준비하였다. 앞서 수거한 상층액을 200uL씩 96 웰 플레이트의 맨 왼쪽 웰에 일렬로 분주하였으며, 나머지 웰에는 DMEM 배지(FBS, 항생제 무첨가)를 180㎕씩 분주하였다. 다음으로, 왼쪽에서부터 차례로 multi-pipet을 사용해 20㎕씩 채취하고 오른쪽 웰에 분주하면서 10진 희석하였다. 매 희석마다 피펫 팁을 바꾸며 차례로 희석하고 마지막 12번째 웰은 음성 대조군으로 유지하였다. 준비된 바이러스 희석액을 MARC-145 cell이 부착된 plate에 접종하였다. 이때, MARC-145 cell의 배양액은 모두 제거하고 PBS 200㎕를 각 웰에 분주하고 버리기를 3회 반복하여 washing 과정을 수행하였다. 이후 준비된 바이러스 희석액을 웰당 100㎕씩 분주하여 접종하였으며, 접종 2시간 이후 접종액을 모두 제거하고 새로운 유지액(DMEM 배지, 10% FBS, 1% penicillin, streptomycin)을 100㎕ 분주하였다.
분주 후, 약 7일간 세포에서 CPE(Cytopathogenic effect)의 일종인 Clumping과 apoptosis의 발생여부를 확인하였으며, 최종적으로 CPE가 보이지 않은 웰의 바로 이전 희석배수를 기준으로 8개 바이러스 접종액 중 절반인 4개 웰이 CPE를 보일 수 있는 희석배수를 구하였다. 1ml를 기준으로 10을 곱해 최종 수치를 계산하였다.
LMY+BP2017 키메라 균주와 모균주 LMY 균주를 돼지 폐 대식세포(PAM cell)에 접종하고 1일 내지 2일이 지난 후 측정한 TCID50 값을 하기 표 10 및 도 4에 나타냈다.
바이러스 종류 바이러스 접종일에 따른 TCID50 값
1일 2일
LMY 5.2 7.3
LMY+BP2017 5.1 5.2
상기 표 10 및 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 균주를 접종하고 바이러스가 본격적으로 작출되기 시작하는 2일에 측정한 TCID50의 값이 LMY+BP2017 키메라가 LMY 보다 100배 낮은 TCID50 값을 나타냈다. 이로부터 PRRS의 주요 감염 세포인 PAM(Porcine Alveolar Macrophage) cell에서 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스는 증식성이 LMY에 비해 최소 10배 이상 감소함을 알 수 있었으며, 본 발명의 LMY+BP2017 키메라 바이러스가 모균주 LMY 보다 증식성이 감소되어 약독화 되어있음을 확인할 수 있었다.
1-6. 중화항체 분비 양상 확인
본 발명의 키메라 바이러스를 접종한 이후, 중화항체 분비 양상을 확인하기 위하여, 3주령 돼지 12두를 4마리씩 3개의 그룹으로 나누어 각각 LMY(105 TCID50), LMY+BP2017 키메라 바이러스 (105 TCID50), PBS 를 2ml씩 접종하였다. 4주 후 각 그룹의 돼지의 정맥에서 혈액을 채혈하여 혈청을 2ml 분리하였으며, 혈청 내 중화항체의 양을 측정하였다.
모든 혈청 sample을 검사 시작 전에 45분 동안 56℃에서 heat inactivation시켰다. Inactivation되어 있는 혈청을 RPMI 1640 배지(10% FCS, 20mM L-glutamine, antibiotic-antimycotic mixture-100IU/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 50μg/ml gentamycin, 0.25 mg/ml amphotericin B)에 넣고 2배씩 차례로 희석시켰다. 이어서 각각의 희석된 혈청을 100㎕씩 채취해, 미리 준비된 VR2332균주 200 TCID50/ml 100μl와 섞어 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이션 시킨 후, 전날 미리 배양해 둔 monolayer 상태의 Marc-145 세포를 접종하였다. 이어서 37℃에서 한 시간 배양한 후의 모든 접종액은 제거하였으며, 이를 RPMI 배양액 200㎕로 대체하였다. 이 후, 37℃에서 배양하면서 매일 cytopathic effect(CPE)를 확인하였으며, 5일 간 배양한 후 각 웰의 CPE를 확인하였다. CPE가 없는 well은 SDOW 17 항체를 이용한 염색을 통해 바이러스의 성장을 확인하였다. 중화항체 역가(titer)는 바이러스의 성장의 징후가 전혀 없는 가장 높은 희석배수의 역수를 산출해 측정하였으며, 측정결과를 아래 표 11 및 도 5에 나타냈다.
구분 LMY LMY+BP2017 chimera PBS (대조군)
중화항체(Log2) 2.75 4.75 0
표 11 및 도 5에 나타낸 바와 같이, LMY+BP2017 키메라 바이러스가 LMY 모균주에 비해 세포에서 유의적으로 높은 중화항체를 분비시킴을 확인할 수 있었다. 따라서 LMY 모균주에 비해 LMY+BP2017 키메라 바이러스에 의하여 유도된 중화항체의 역가가 4배 가량 증가되었음을 확인하였다.
준비예 2. 어주반트(Adjuvant) 의 제조
PRRSV에 의한 면역 유도 효율을 증가시키기 위해, 마이코박테리움(Mycobacterium)의 열충격 단백질 70(Heat shock protein 70, HSP70) C-말단(terminal)과 열충격 단백질 X(Heat shock protein X, HSPX)를 면역보조제로서 사용하였다.
본 발명자들은 상기 HSP70의 C-말단 및 HSPX를 PRRS 백신의 면역보조제로서 적정용량을 사용하기로 하였다. 상기 적정 용량은 HSP70의 C-말단 및 HSPX 각각 10ug 이상이 되도록 상황에 따라 적절히 조절하여 이용되었다.
HSP70과 HSPX는 E. coli 단백질 발현 시스템을 이용하여 생산 및 정제하였다. 구체적으로, 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 HSP70 C-말단 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 HSPX 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 N-말단에 6개의 히스티딘 태그(His-tag)를 암호화하는 염기 서열(서열번호 14)을 부착하여, pET 28a 벡터 (Novagen 사)에 삽입하여, E. coli BL21 (ECOS 사) 에서 IPTG를 이용해 발현을 유도하였다.
상기 과발현된 HSP70 C-terminal과 HSPX는 상기 His-Tag이 부착된 단백질의 정제용 Ni-NTA를 이용하여 정제 후 농도를 측정하였다.
IPTG를 이용하여 발현을 유도한 뒤 Ni-NTA를 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질은 BSA를 이용하여 농도를 측정하고 이후 시험에 이용되었다.
실시예 1. 시험 백신의 제조
상기 준비예 1의 방법으로 제조된, 약독화된 PRRSV(LMY+BP2017 키메라 바이러스)를 백신주로, 어주반트(Adjuvant)로는 HSP70 (C-terminal)과 HSPX를 혼합하여 피내 접종(Intradermal injection)용 시험 백신을 제조하였다.
상기 피내 접종용 시험 백신은, 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 백신(VC1) 및 포함하지 않는 백신(VC2)의 두 가지 종류가 제조되었다.
VC1과 VC2 모두 1회 투여량 0.5ml에, 약독화된 PRRSV 3.8/TCID50가 포함되었으며, 상기 VC1에는, HSP70 (C-terminal) 10ug 및 HSPX 10ug이 포함되었다.
실시예 2. 시험 백신의 효능 확인
2-1. 시험 백신의 접종
접종 대상 돼지는 SPF(specific pathogenic free) 돼지로, PRRSV에 대해 어떠한 항원 항체반응도 나타나지 않음을 확인한 3주령 자돈을 이용하였다. 백신 접종군(VC1 접종군(VC1) 및 VC2 접종군(VC2)), 백신 대신 동량의 인산완충생리식염수(Phosphate buffered saline, PBS)를 주입한 대조군(양성대조군(UVC) 및 음성대조군(UVUC))에 대해 각각 5두의 돼지를 이용, 총 20두의 돼지에 대해 공격 접종 실험을 수행하였다.
시험 개시일에 4종의 그룹에 각각 백신 또는 PBS를 가스주입식 피내 주사기를 이용해 0.5ml 접종하고, 4주(4w) 경과 후 공격접종을 수행하였다. 상기 공격 접종은 국내에서 분리된 북미형 PRRSV로서 강독주인 SNU090851 바이러스를 1x105 TCID50/mL 농도로 비강 주입하여 수행하였다. 양성대조군은 PBS 주입 후 공격 접종을 수행하였고, 음성대조군 돼지에 대해서는 PBS 주입 후 공격 접종을 수행하지 않았다. 공격 접종일로부터 2주 후 (시험 개시일로부터 6주 후) 각 그룹의 돼지를 부검하여 바이러스 감염에 의한 증상의 완화 정도를 비교 분석하였다. 하기 표 12에 실험 설계 내용을 요약하여 나타내었다.
그룹 그룹명 접종균주 투여량 마리수 일정
TCID50 두 0주 4주 6주
백신군
+어주반트(Adjuvant)		 VC1 LMY+BP2017 3.8 5 접종 공격접종 부검
백신군 VC2 LMY+BP2017 3.8 5 접종 공격접종 부검
양성대조군 UVC PBS - 5 접종 공격접종 부검
음성대조군 UVUC PBS - 5 접종 부검
2-2. 백신 접종에 따른 혈중 사이토카인 분비 변화
상기 실시예 2-1의 실험 결과 각 그룹에서의 사이토카인(Cytokine) 분비 양상의 변화를 확인하기 위해, microsphere-based Fluorescent Assay 를 통해 porcine cytokine을 분석하였다. 구체적으로, 백신접종(0주) 후 3일째, 7일째 및 14일 째에 각 그룹 돼지의 목 정맥에서 혈액을 3ml씩 채취하여 혈청을 분리하였다. 상기 혈청 내 사이토카인 함량을 Luminex 사의 키트와 분석 장비를 이용해 측정하였다.
구체적으로, eBioscience 사의 ProcartaPlex Porcine Cytokine & Chemokine 키트를 이용하여, 키트의 가이드라인에 따라 인터페론 알파(Interferon alpha, IFNa), 인터류킨 8(Interleukin 8, IL-8), 인터류킨 12(Interleukin 12, IL-12)의 함량을 측정하였다. IFNα의 경우 초기 항바이러스 면역 기전에 주요한 인자로 작용하는것으로 알려져 있어, 백신의 항원에 대한 면역 반응을 강화시켜줄 수 있을 것으로 예상된다. IL-8의 경우 톨유사 작용제(TLR agonist)에 의해 분비가 촉진되는 것으로 알려져 있다. IL-12의 경우 전염증반응(proinflammatory reaction) 을 유도하는 물질로서 백신에 의한 면역 반응을 초기에 유도하는 데 역할을 할 것으로 예상된다.
도 6에 상기 인터페론 알파, 인터류킨 8, 및 인터류킨 12의 함량 측정 결과 그래프를, 하기 표 13에 그 결과를 나타내었다.
사이토카인 접종 그룹 백신 접종 후 경과 시간에 따른 사이토카인 농도(pg/mL)
3일 7일 (dpi7) 14일 (dpi14)
IFNa VC1 90.416 1.8 0.302
VC2 5.468 0.866 0.356
UVC 0.4 0.32 0.28
UVUC 0.26 0.24 0.52
IL-8 VC1 298.538 162.012 215.312
VC2 100.998 59.538 57.43
UVC 6 30 43
UVUC 46 10 70.6
IL-12 VC1 479.56 328.57 541.728
VC2 239.816 360.062 411.304
UVC 175.454 340.554 169.84
UVUC 196.6098 301.825 308.8998
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 백신 접종 3일차에 VC1 그룹에서 IFNa, IL-8 및 IL-12 함량이 다른 그룹에 비해 유의미하게 높은 값을 보였다. 특히 IL-8은 접종 7일째에도 높은 수치를 보였다.
2-3. 백신 접종에 따른 항체 반응 및 중화항체 역가 확인
본 발명의 백신 접종에 따른 중화항체 역가 확인을 위해 ELISA 항체가 측정을 수행하였다.
상기 실시예 2-1의 방법으로 접종 실험을 수행하고, 접종 대상 돼지들로부터 혈액을 채취하여 통상의 방법으로 혈청을 분리한 후 ELISA (HerdCheck PRRS X3 Ab test, IDEXX Laboratories Inc, Westbrook, ME, USA) 키트를 이용하여 ELISA를 진행하였다.
중화항체 역가 확인은 다음과 같이 진행하였다. 상기 분리된 혈청 샘플을 검사 시작 전에 45분 동안 60℃에서 불활성화(heat inactivation)하였다. 불활성화 완료된 혈청을 RPMI 1640 배지(10%(v/v) Fetal Calf Serum(FCS), 20mM L-glutamine, antibiotic-antimycotic mixture-100IU/ml, penicillin, 100μg/ml streptomycin, 50μg/ml gentamycin, 0.25 mg/ml amphotericin B)와 2배씩 차례로 희석하였다. 상기 희석된 혈청을 100μl씩, 미리 준비된 키메라 바이러스(LMY+BP2017) 200 TCID50/ml 100μl와 섞어 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후 전날 미리 배양해 둔 단일막(monolayer) 상태의 Marc-145 cell에 접종하였다. 접종 후 37℃에서 한 시간 배양 후 배양액을 RPMI 배양액 200μl로 교체하였다. 이후 다시 37℃에서 배양하면서 매일 cytopathic effect(CPE)를 확인하였다. 총 5일 간 배양한 후 각 well 의 CPE를 확인하였다. 중화항체 역가(titer)는 바이러스의 성장의 징후가 전혀 없는 가장 높은 희석배수의 역수를 산출하였다. 도 7에 ELISA 결과 및 항체 역가 실험 결과를 나타내었다.
도 7에서 확인할 수 있듯, 본원의 키메라 바이러스를 포함하는 백신을 접종한 VC1 및 VC2 그룹에서는 모두 7일 이내에 Anti-PRRSV 항체가 측정되기 시작했으며, 백신을 접종하지 않은 양성 대조군(UVC) 및 음성대조군(UVUC)에서는 27일 이전에는 항체가 전혀 생성되지 않음을 확인하였다.
하기 표 14에 백신 접종 후 경과일수(dpi)에 따른 각 실험군 및/또는 대조군에서의 항-PRRSV 항체 역가 측정 결과를 나타내었다. 항체 역가 또한 대조군인 UVC와 UVUC 그룹 모두에서 유의미한 역가를 보이지 않았으나, 백신 접종군(VC1 및 VC2)에서는 접종 후 항체 역가가 VC1에서 28일째에 4, 42일째에 10.4, VC2에서 28일 째에 1.6, 42일 째에 9.6으로 측정되었다.
백신 접종일 후 경과일수 28 42
VC1 4 10.4
VC2 1.6 9.6
UVC 0 0
UVUC 0 0
어주반트(Adjuvant)가 함께 첨가된 백신을 투여한 실험군(VC1)은 어주반트(Adjuvant)를 포함하지 않는 백신 투여군(VC2) 보다 높은 항체 역가를 나타내, HSP70의 C-말단 부위 및 HSPX가 첨가된 경우의 면역 증강 효과 또한 확인할 수 있었다.
2-4. 백신 접종에 따른 인터페론 분비 변화
상기 실시예 2-1의 실험에서, 백신 접종 이후 일주일 단위로 돼지의 목 정맥에서 3ml의 혈액을 채취하여 피콜(ficoll)을 이용해 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여, 상기 PBMC 중 PRRSV에 특이적인 IFNγ 를 분비하는 세포의 수를 측정하였다. 상기 IFNγ는 바이러스의 증식을 억제하는 주요한 세포성 면역 지표이다. 세포 수 측정은 ELISPOT reader machine을 이용하였다.
하기 표 15 및 도 8에 인터페론 감마 분비 세포의 수 측정 결과 및 그 그래프를 나타내었다.
접종후 경과일수 0 7 14 21 28 42
VC1 0 24 176.8 320.4 193.6 240.6
VC2 0 0 30.2 32.2 74.3 193
UVC 0 0 0 4 1 6
UVUC 0 0 0 0 0 0
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 백신 접종 이후 시간이 경과함에 따라 실험군(VC1 및 VC2)에서의 IFNr 분비 세포의 수가 증가하였으며, 특히 어주반트(Adjuvant)가 함께 첨가된 시험 백신(VC1)을 접종한 돼지에서의 IFNr 분비 세포의 수가 통계적으로 유의미하게, 대조군에 비해 월등히 증가한 것을 확인하였다. 따라서 본원의 키메라 바이러스를 포함하는 백신 및 상기 백신에 어주반트(Adjuvant)가 포함된 백신 조성물의 면역 효능이 확인되었으며, 어주반트(Adjuvant)가 첨가된 경우의 면역 효능이 보다 강화된 것을 확인하였다.
2-5. 백신 접종에 따른 PRRSV 유전자 복제수 변화
상기 실시예 2-1의 실험에서, 공격 접종 후 돼지 혈청 내 감염된 PRRSV의 유전자 복제수를 확인하기 위해 Realtime PCR 을 수행하였다.
실시예 2-1의 공격접종 이후 0, 7, 및 14일차(각각 0dpc, 7dpc, 및 14dpc)에 각 그룹의 돼지의 목정맥에서 혈액을 3ml 채취하여 혈청을 분리하고 분리된 혈청에 포함되어있는 바이러스의 RNA를 Intron 사의 Viral gene-spin viral DNA/RNA extraction kit를 이용하여 추출하였다.
구체적으로, 채취한 혈청 150ul을 lysis buffer 250ul 와 혼합하고 15초간 vortex 하였으며 10분간 실온에서 반응하고 binding buffer를 350ul를 혼합한 후 가볍게 vortex 하였다. 총 750ul mix를 column에 옮기고 1분간 13000 rpm으로 원심분리 한 후, 여과액을 버리고 washing buffer A 500ul 를 column에 첨가하여 동일하게 1분간 13000rpm으로 원심 분리하였다. 다시 여과액을 버리고 washing buffer B 500ul를 column에 첨가하여 동일하게 1분간 13000rpm으로 원심분리 하였다. 마지막 여과액을 버리고 다시 동일하게 원심분리 하여 모든 알코올 성분을 제거하였다. Elution buffer 30ul를 넣고 1분간 반응한 뒤 원심 분리하여 최종적으로 RNA를 추출하였다.
최종적으로 추출한 RNA 2ul를 TOPscript RT DRY MIX kit를 사용하여 역전사시켜 cDNA를 합성하였다. 이미 건조상태로 준비된 kit의 tube에 추출한 RNA 2ul와 DEPC DW 18ul를 혼합하여 50℃에서 1시간 incubation 이후 95℃에서 10분간 incubation 하여 반응을 종결하였다.
다음으로, Realtime method를 이용하여 혈청 1ml 당 탐지된 합성한 cDNA genomic copy의 양을 측정하였다. SYBR green mix(Thermos fisher) 10ul에 DEPC DW 7.5ul와 PRRSV specific primer 세트 10pmol을 0.5ul 혼합한 mix에 상기에서 합성한 cDNA 2ul를 넣고 PCR 반응을 수행하였다.
PRRSV Specific Primer F (서열번호 16): 5'-GAAGAAAAACCCGGAGAAGC-3'
PRRSV Specific Primer R (서열번호 17): 5'-CGTAGGCAAACTAAACTCCACAG-3'
구체적으로, 95℃에서 30초, 60℃에서 1분간 elongation 시켜 DNA를 증폭하고, 추가적으로 dissociation curve를 구하기 위한 반응을 수행하였다. 총 35cycle 반응을 반복하였으며, 역치 값에 따라 샘플별로 Ct 값을 산출하였고 33 이상은 제외하였다. Ct값은 standard curve에 대입하여 genomic copy 로 환산하여 표기하였다. 공격접종 후 7일 14일에 감염된 PRRSV의 혈중 바이러스 양은 백신군이 비 백신군에 비해 유의적으로 낮았으며 이는 백신 실질적으로 감염된 강독 PRRSV에 대한 면역을 제공하여 증식을 억제하였음을 의미한다.
한국생명공학연구원 KCTC13393BP 20171114 한국생명공학연구원 KCTC13394BP 20171114 한국생명공학연구원 KCTC13675BP 20181024
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cggagcttcc 180 cggggtcgac cccgacaagg acgtcgacat tatggtccgc gatggtcagc tgaccatcaa 240 ggccgagcgc accgagcaga aggacttcga cggtcgctcg gaattcgcgt acggttcctt 300 cgttcgcacg gtgtcgctgc cggtaggtgc tgacgaggac gacattaagg ccacctacga 360 caagggcatt cttactgtgt cggtggcggt ttcggaaggg aagccaaccg aaaagcacat 420 tcagatccgg tccaccaact aactcga 447 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRRSV specific primer F <400> 16 gaagaaaaac ccggagaagc 20 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRRSV specific primer R <400> 17 cgtaggcaaa ctaaactcca cag 23

Claims (10)

  1. 약독화된 키메라 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 및 어주반트(Adjuvant)를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 예방용 백신 조성물에 있어서,
    상기 약독화된 키메라 바이러스의 유전체의 NSP1 유전자는, 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 NSP1 유전자의 핵산 서열에서, 222번 위치, 225번 위치, 237번 위치, 240번 위치, 252번 위치, 306번 위치, 309번 위치, 312번 위치, 315번 위치, 324번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 333번 위치, 336번 위치, 339번 위치, 342번 위치, 345번 위치, 357번 위치, 363번 위치, 366번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 381번 위치, 393번 위치, 396번 위치, 543번 위치, 546번 위치, 549번 위치, 555번 위치, 558번 위치, 561번 위치, 573번 위치, 579번 위치, 582번 위치, 588번 위치, 612번 위치, 618번 위치, 621번 위치, 627번 위치, 633번 위치, 639번 위치, 654번 위치, 673번 위치, 675번 위치, 678번 위치, 681번 위치, 684번 위치, 705번 위치, 708번 위치, 729번 위치, 735번 위치, 738번 위치, 741번 위치, 744번 위치, 747번 위치, 771번 위치, 786번 위치, 789번 위치, 792번 위치, 810번 위치, 825번 위치, 828번 위치, 838번 위치, 840번 위치, 846번 위치, 849번 위치, 858번 위치, 867번 위치, 879번 위치, 882번 위치, 885번 위치, 891번 위치, 900번 위치, 903번 위치, 906번 위치, 924번 위치, 936번 위치, 939번 위치, 948번 위치, 954번 위치, 963번 위치, 966번 위치, 1026번 위치, 1029번 위치, 1038번 위치, 1047번 위치, 1053번 위치, 1066번 위치, 1068번 위치, 1086번 위치, 및 1110번 위치의 염기가 치환된 변이를 포함하며,
    상기 키메라바이러스의 유전체의 ORF2 내지 ORF7은 서열번호 2의 핵산서열로 이루어지고,
    상기 어주반트(Adjuvant)는, 열충격단백질 70(Heat shock protein 70, HSP70), HSP70의 단편 및 열충격단백질 X(Heat shock protein X, HSPX)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 수탁번호 KCTC13675BP인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 백신의 1회 투여량 내 상기 키메라 바이러스 함량이 TCID50 50 내지 5x105 인, 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 피내 투여되는 것인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)의 예방 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 돼지는 이유 자돈기, 육성기 및 비육기로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 성장 단계의 돼지인 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 투여 단계는 상기 백신 조성물을 피내 투여하는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 백신 조성물의 1회 투여량 내 상기 키메라 바이러스 함량이 TCID50 50 내지 5x105 인, 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 백신 조성물의 투여 단계는, 1회 또는 복수 회 수행되는 것인, 방법.
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