KR101245029B1 - 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 - Google Patents

한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101245029B1
KR101245029B1 KR1020120005761A KR20120005761A KR101245029B1 KR 101245029 B1 KR101245029 B1 KR 101245029B1 KR 1020120005761 A KR1020120005761 A KR 1020120005761A KR 20120005761 A KR20120005761 A KR 20120005761A KR 101245029 B1 KR101245029 B1 KR 101245029B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
respiratory syndrome
syndrome virus
korean
vaccine
genital respiratory
Prior art date
Application number
KR1020120005761A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130010426A (ko
Inventor
채찬희
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020120005761A priority Critical patent/KR101245029B1/ko
Publication of KR20130010426A publication Critical patent/KR20130010426A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101245029B1 publication Critical patent/KR101245029B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/082—Arteriviridae, e.g. EAV, PRRSV

Abstract

본 발명의 백신 조성물은 최근 국내에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 인한 감염을 효과적으로 예방할 수 있다. 구체적으로 생식기 질병 예방으로 임신 모돈에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 유산, 사산, 및 조산을 예방한다. 또한 호흡기 질병 예방으로 7-70일령의 자돈에서는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 호흡기 질병을 예방한다.

Description

한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물{Vaccine composition for Korean Porcine reproductive and respiratory syndrome virus}
본 발명은 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물로서, 보다 상세하게는 신규한 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 동정하고, 이를 약독화 또는 사독화시켜 제조된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공하는 것이다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV)는 새끼를 낳는 어미 돼지인 모돈에서 임신 중기에 유산 또는 사산을 유발하고, 어린 새끼 돼지인 자돈에서는 폐렴을 유발하는 바이러스성 질병이다. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 유전형(genotype)은 크게 유렵형(European)과 북미형(North American)으로 나뉘어져 있다.
상기 유럽형과 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 가장 큰 차이점은 면역학적으로 교차반응(cross reaction)을 하지 않는다는 점이다. 다시 설명하면, 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 감염이 되어서 돼지 체내에서 형성된 항체의 경우 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스와 반응을 하지 않는다. 또한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 감염이 되어서 돼지 체내에서 형성된 항체의 경우 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스와 반응을 하지 않는다. 따라서 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 감염을 예방하기 위해서는 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 이용하여 제작한 백신이 필요하고, 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 감염을 예방하기 위해서는 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 이용하여 제작한 백신이 필요한 것이다. 한편 한국공개특허 제2008-4325호에서는 ＰＲＲＳ 백신으로서의 돼지 생식기 호흡기 증후군바이러스 융합 단백질을 개시하고 있으나 이 경우 교차반응에는 한계가 있었다.
한편, 최근 국내에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 인한 감염이 문제되고 있다. 상기 한국형의 경우 북미형보다는 유럽형에 가까우나, 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 사용되는 백신이 한국형에는 교차반응이 쉽게 발생하지 않아 국내에는 적합한 백신이 전무한 실정이다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 해결하려는 과제는 국내에서 발생하는 신규한 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 동정하고, 이를 약독화 또는 사독화시켜 제조된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에서 유래하며, 이를 약독화 또는 사독화시켜 유효성분으로 함유하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 서열번호 1로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 2로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 계대배양하여 이를 약독화 또는 사독화하는 단계를 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11955BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 변이주는 서열번호 3으로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 4로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 변이주는 생균 또는 사균일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상술한 변이주를 유효성분으로 함유하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 서열번호 1로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임)과 97% 이상의 상동성을 가지는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 2로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)과 98% 이상의 상동성을 가지는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 사용된 용어를 설명한다.
용어,"생독 백신"은 살아있는 바이러스 활성 성분을 포함하는 백신을 의미한다. 용어, "약독화(attenuation)"란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
용어, "사독 백신"은 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조가능하다. 예컨대 전 바이러스 백신은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할 백신은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득하여 제조할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 최근 국내에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 인한 감염을 효과적으로 예방할 수 있다. 구체적으로 생식기 질병 예방으로 임신 모돈에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 유산, 사산, 및 조산을 예방한다. 또한 호흡기 질병 예방으로 7-70일령의 자돈에서는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 간질성 폐렴 등 호흡기 질병과 임파절에서 염증을 예방하여 면역억제 효과를 예방한다.
도 1은 본 발명의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF5 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF7 염기서열이다.
도 3은 본 발명의 약독화된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF5 염기서열이다.
도 4는 본 발명의 약독화된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ORF7 염기서열이다.
도 5는 음성대조군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 6은 약독화된 백신접종군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 7은 양성대조군 돼지의 심한 간질성 폐렴 병변을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 8은 음성대조군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 9는 사독백신접종군 돼지의 정상적인 폐장을 나타내는 광학현미경 사진이다.
도 10은 양성대조군 돼지의 심한 간질성 폐렴 병변을 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 최근 국내에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 인한 감염이 문제되고 있으며, 한국형의 경우 북미형보다는 유럽형에 가까우나, 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 사용되는 백신의 경우 한국형에는 교차반응이 쉽게 발생하지 않아 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 예방이 어려운 문제가 있었다.
이에 본 발명에서는 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에서 유래하며, 이를 약독화 또는 사독화시켜 유효성분으로 함유하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 최근 국내에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 인한 감염을 효과적으로 예방할 수 있다.
구체적으로 본 발명자들은 신규한 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 동정하고 이를 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁하였다. 도 1은 기탁번호 KCTC 11954BP 바이러스의 ORF5(오픈 리딩 프레임)의 염기서열(서열번호 1)이고, 도 2는 ORF7(오픈 리딩 프레임)의 염기서열(서열번호 2)이다.
그 뒤 동정된 바이러스를 계대배양을 통해 약독화하거나 약독화 이후 사독화를 수행하여 백신 조성물에 적합한 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 제작하고 이를 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11955BP로 기탁하였다. 한편, 도 3은 기탁번호 KCTC 11955BP의 ORF5(오픈 리딩 프레임)의 염기서열(서열번호 3)이고, 도 4는 ORF7(오픈 리딩 프레임)의 염기서열(서열번호 4)로서 붉은색 부분은 원 바이러스인 기탁번호 KCTC 11954BP의 ORF5 및 ORF7과 상이한 부분으로서 이 중 -로 표시한 부분은 결실된 부분을 나타낸 것이다.
그 결과 계대배양된 KCTC 11955BP는 원 바이러스인 기탁번호 KCTC 11954BP의 ORF5과는 97%의 상동성을 가지고 ORF7과는 98%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다.
한편, 질병 원인 바이러스인 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 약독화 또는 사독화는 통상적인 방법으로 시행될 수 있다. 즉, 항원(원인 바이러스)을 포름알데히드, 포르말린, 파라포름알데히드, 베타-프로피올락톤, 에틸렌이민 또는 이의 유도체와 같은 화학제에 노출시키거나 열, 방사선 조사 등의 방법으로 사독할 수 있다. 약독화는 질병 원인균의 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 균주의 염기서열의 특정 결실 또는 균주의 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
한편, 본 발명의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 약독화 또는 사독화시켜 제조한 변이주(기탁번호 KCTC 11955BP)를 포함하는 백신조성물은 생식기 질병 예방으로 임신 모돈에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 유산, 사산, 및 조산을 예방한다. 또한 호흡기 질병 예방으로 7-70일령의 자돈에서는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염에 의한 호흡기 질병을 예방한다.
그러므로 바람직하게는 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 서열번호 1로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임)과 95% 이상 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 2로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)과 95% 이상 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물은 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 예방하는데 효과적이다.
본 발명의 백신 조성물에는 상술한 약독화 또는 사독화 항원 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 여기서 약제학적으로 허용 가능한 담체는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고, 화학적으로 불활성이며, 투여되는 피험체에게 독성이 아닌 담체 매질을 의미한다. 각종 담체들이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 증류수, 염수 또는 미네랄수가 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물에는 약제학적 또는 수의학적으로 허용될 수 있는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 예를 들어 EDTA염, 메티올레이트 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 당업자에게 공지된 기술에 따라 아쥬번트를 첨가할 수 있다. 아쥬번트의 예로는 수산화알루미늄과 같은 광물겔, 리조레시틴과 같은 계면활성제, 사포닌이나 사포닌 유도체와 같은 글리코시드, 란티딘, Avridine, 카보폴(carbopol), 폴리포스파젠, DDA(dimethyldioctadecylammonium bromide), 퀼 에이(quil A), 암피겐, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 제약기술 분야 및 수의학 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 표준기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 백신의 함량은 의학기술분야 및 수의학 기술분야의 당업자들이 투여 대상 개체의 연령, 성별, 체중, 종족 및 상태와 같은 인자 및 투여 경로를 고려하여 결정할 수 있다. 이 조성물은 단독으로 투여하거나 또는 다른 면역학적 항원 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 함께 투여하거나 후속투여를 할 수 있다.
본 발명의 백신이 사용될 수 있는 제형의 예로는 구강, 비강, 항문, 질, 위 내 투여용의 현탁액, 시럽 등과 같은 액상 제제 및 피하, 내피, 근육 내, 또는 정맥 내 투여용의 멸균 현탁 또는 에멀션제제를 포함할 수 있다. 또한 사용 전에 약제학적으로 허용 가능한 희석제에 재현탁되는 가용성 성분 또는 미립자의 고체 제제일 수 있다. 가용성 성분 또는 미립자는 코아세르베이션, 바이아세르베이션, 응고, 분무건조, 기포건조, 침전, 동결건조 등 약제학 분야 및 수의학 분야의 당업자에게 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다.
상기 백신은 수의학적으로 허용되는 다양한 경로를 통해 돼지에 투여될 수 있다. 예를 들어, 근육주사 또는 피내주사 등으로 투여될 수 있다. 투여경로에 따라 수의학 분야의 당업자들이 투여량을 결정할 수 있다. 예컨대 모돈의 경우 2㎖를, 자돈의 경우 1㎖를 접종할 수 있으며 1차 접종 후으로 면역이 완전히 형성되어 2차 접종이 필요 없는 장점이 있다.
이때, 양돈 농장에서 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 모돈에서 유산, 사산, 및 조산 등의 생식기 문제를 유발되는 농장의 경우 모돈에게 분만후 2-3주가 경과된 시점에서 백신을 직접 접종한다. 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 돼지 생식기 호흡기 증후군이 7일령에서 18일령의 어린 포유자돈 시기에 유발되는 경우, 어린 포유자돈에 백신을 직접 접종할 시간적 여유가 없으므로, 임신한 모돈에게 상기 백신을 접종하여 모돈에서 형성된 항체가 초유를 통하여 포유자돈에게 이행되게 하여, 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 돼지 생식기 호흡기 증후군을 예방할 수 있다.
그리고, 3주령 이상의 이유자돈이나 육성돈에서 돼지 생식기 호흡기 증후군이 유발되는 경우에는 포유자돈, 이유자돈, 또는 육성돈에 직접 백신을 접종하여 이를 예방할 수 있다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예 및 실험예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 동정
서울대학교 수의과 대학 병리학 교실에 진단을 위하여 의뢰(의뢰번호 : 090450)된 3일령의 포유자돈(생돈)의 폐장에서 분리하여 KEU090450분리주로 명명하였다. 분리주 KEU090450(기탁번호 KCTC 11954BP)돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 open reading frame (ORF) 5 (서열번호 1, 도 1)와 ORF7(서열번호 2, 도 2)을 분석하였다.
분리주 KEU090450의 특성을 구체적으로 확인하기 위하여 국내에서 분리한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스인 KNA090690(기탁번호 KCTC 11956BP), 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스인 Lelystad virus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore; GenBank accession number EF536003), 베링거 잉겔하임에서 사용한 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스인 VR-2332(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore; GenBank accession number M90262)에 대한 ORF5 (open reading frame 5)와 ORF7 (open reading frame 7)에 대한 아미노산 염기 배열 순서의 유사성을 비교하여 그 결과를 표 1 및 표 2에 나타내었다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스간의 ORF5의 아미노산 염기 배열 유사성
KEU090450
KNA090690
(북미형)		 VR2332
(북미형)		 Lelystad
(유렵형)
KEU090450
100 68 68 88
KNA090690
(북미형)		 68 100 89 65
VR2332
(북미형)		 68 89 100 68
Lelystad
(유렵형)		 88 65 68 100
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스간의 ORF7의 아미노산 염기 배열 유사성
KEU090450
KNA090690
(북미형)		 VR2332
(북미형)		 Lelystad
(유렵형)
KEU090450
100 67 69 92
KNA090690
(북미형)		 67 100 96 68
VR2332
(북미형)		 69 96 100 67
Lelystad
(유렵형)		 92 68 67 100
상기 표 1 및 표 2를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 KEU090450 분리주는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 중 유럽형에 비교적 유사하기는 하지만 유럽형과는 또 다른 염기서열의 특징을 보여주는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 KEU090450 분리주를 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁하고 이를 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스로 명명하였다.
< 실시예 2> 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 약독화 백신( 생독백 신)의 제조
Marc-145 세포주에 처음 배양 할 때에는 5% FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM이라는 배지를 사용한다. 그후 Marc-145 세포주가 단층(monolayer)을 형성하게 되면 2.5% FBS가 함유된 DMEM으로 바꾼 후에 실시예 1의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종할 때 까지 Marc-145 세포주를 단층(monolayer)으로 유지하였다.
한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 Marc-145 세포주에 접종한 후에 세포주가 변성이 되면서 형성되는 cytopathic effect (CPE)가 전체 Marc-145 세포주의 75% 정도 유발되면 -70℃에 얼려 보관하였다. 그 후 바이러스가 감염된 Marc-145 세포주를 배양하고 있는 플라스크를 냉동과 녹임 과정인 “freezing and thawing” 한 후 5000g에서 15분간 원심한 후 상층액을 거름종이를 이용하여 일차로 걸러주었다. 걸러준 상층액을 0.8μm syringe filter로 여과한 후, 여과액을 다시 0.45μm syringe filter로 여과한다. 그후 이 여과액을 단층이 형성되어 있는 Marc-145 세포주에 접종을 하고 일주일 간 세포를 관찰한다. 그 후 다시 세포주가 바이러스 감염에 의하여 변성이 되면서 형성되는 cytopathic effect (CPE)가 전체 Marc-145 세포주의 75% 정도 유발되면 상기 과정을 반복하여 다시 새로운 Marc-145 세포주에 접종한다. 이러한 계대방법을 50회 반복하여, 야외 분리 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 약독화하여 생독 백신주로 사용하고 이를 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁번호 KCTC 11955BP로 기탁하였다.
상기 원 바이러스인 기탁번호 KCTC 11954BP와 이를 계대배양을 통해 약독화한 바이러스인 기탁번호 KCTC 11955BP의 open reading frame 5(도 3, 서열번호 3) 와 ORF7(도 4, 서열번호 4) 를 분석하였다. 원래 분리된 바이러스와 약독화된 바이러스를 비교하면 ORF5의 경우 97%의 동질성(homology)을 가지고 있으면 약독화된 바이러스에서는 12개의 아미노산의 결손(deletion)이 관찰되었다. 또한 ORF7의 경우에는 원래 분리된 바이러스와 약독화된 바이러스에서 98%의 동질성(homology)을 가지고 있으면 약독화된 바이러스에서는 1개의 아미노산의 결손(deletion)이 관찰되었다(도 1 ~ 4 및 서열번호 1 ~ 4 참조).
그 뒤 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 생독백신 1ml에는 약독화된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 1x105 TCID50(tissue culture infective dose 50%)가 함유하도록 제작하였다.
< 실시예 3> 생독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가
그룹 실험동물 생독백신 접종 시기 바이러스 공격접종
음성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 무접종
양성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 임신 80일령 접종
백신접종군 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 임신 80일령 접종
백신대조군 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 무접종
표 3과 같은 방법으로 실시예 2에서 제조된 생독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 4에 나타나였다. 상기 표 3에서 음성대조군은 백신을 접종하지 않고 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스도 접종하지 않아서 정상적인 분만을 시행하는 모돈를 의미하고, 양성대조군은 백신을 접종하지 않고 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만 접종하여 모돈이 면역이 되어 있지 않기 때문에 유산 또는 사산을 유발하는 모돈를 의미하며, 백신접종군은 백신을 접종한 후에 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종하여 백신의 효과를 판정하기 위한 모돈을 의미하며, 백신대조군은 백신을 접종한 후에 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종하지 않아서 모돈에서 백신의 안전성을 검사하는 모돈을 의미한다.
그룹 검사 모돈 두수 생식기 질환 관찰 여부
정상분만 생식기 질환
유산 사산 조산
음성대조군 5 5 0 0 0
양성대조군 5 0 3 1 1
백신접종군 5 5 0 0 0
백신대조군 5 5 0 0 0
표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 생독백신을 접종한 후 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 5두 모두에서 정상 분만을 하였다 (백신접종군). 반면에 생독백신을 접종하지 않고 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 5두 모두에서 유산 3두, 사산 1두, 조산 1두가 발병하였다 (양성대조군). 따라서 본 발명의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 생독백신은 모돈에서 유산, 사산, 조산 등의 생식기 질환을 예방하는 것으로 확인되었다.
< 실시예 4> 생독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가
그룹 실험동물 생독백신
접종 시기		 바이러스
공격접종		 안락사 시기
음성대조군 1주령 자돈 15두 무접종 무접종 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
양성대조군 1주령 자돈 15두 무접종 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신접종군 1주령 자돈 15두 2주령 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신대조군 1주령 자돈 15두 2주령 무접종 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
표 5와 같은 방법으로 실시예 2에서 제조된 생독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 6에 나타내었다.
그룹 검사 자돈 두수 호흡기 질환 관찰 여부
정상 폐장 간질성 폐렴
심함 중간 경미
음성대조군 15 15 0 0 0
양성대조군 15 0 11 3 1
백신접종군 15 12 0 1 2
백신대조군 15 15 0 0 0
실험결과 음성 대조군에서는 정상적인 폐장이 관찰되었다 (도 5). 생독백신을 접종한 후 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 모두 정상적인 폐장이 관찰되었다 (백신접종군; 도 6). 반면에 생독백신을 접종하지 않고 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염된 폐장에서 11두에서는 심한 간질성 폐렴(interstitial pneumonia; 도 7)이, 3두에서는 중간정도의 간질성 폐렴이, 1두에서는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었다 (양성대조군). 따라서 본 발명의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 생독백신은 자돈에서 간질성 폐렴 등 호흡기 질환을 예방하는 것으로 확인되었다.
< 실시예 5> 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 사독백신의 제조
실시예 2의 약독화된 생독 백신주에 대하여 0.7% 용량의 포르말린 원액(40%)을 첨가한 후 12시간 내지 24시간 동안 바이러스를 사독화 시킨다. 그 후 다시 알루미늄겔[All(OH)3 gel]을 사독화 시킨 바이러스 액의 10% 용량으로 첨가하여 사독백신을 제조하였다.
한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 사독백신 1ml에는 사독화된 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스가 1x105 TCID50(tissue culture infective dose)가 함유하도록 제작하였다.
< 실시예 6> 사독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가
그룹 실험동물 생독백신 접종 시기 바이러스 공격접종
음성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 무접종
양성대조군 임신 80일령 모돈 5두 무접종 임신 80일령 접종
백신접종군 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 임신 80일령 접종
백신대조군 임신 80일령 모돈 5두 교배 2주전 무접종
표 7과 같은 방법으로 실시예 5에서 제조된 사독백신의 모돈에 대한 생식기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 8에 나타내었다.
그룹 검사 모돈 두수 생식기 질환 관찰 여부
정상분만 생식기 질환
유산 사산 조산
음성대조군 5 5 0 0 0
양성대조군 5 0 2 2 1
백신접종군 5 4 0 0 1
백신대조군 5 0 0 0 0
표 8에서 확인할 수 있듯이, 사독백신을 접종한 후 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 4두에서 정상 분만하였고, 단지 모돈 1두에서만 조산이 관찰되었다 (백신접종군). 반면에 사독백신을 접종하지 않고 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 임신 모돈 5두 모두에서 유산 2두, 사산 2두, 조산 1두가 발병하였다 (양성대조군). 따라서 본 발명의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 사독백신은 모돈에서 유산, 사산, 조산 등의 생식기 질환을 예방하는 것으로 확인되었다.
< 실시예 7> 사독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가
그룹 실험동물 생독백신
접종 시기		 바이러스 공격접종 안락사 시기
음성대조군 1주령 자돈 15두 무접종 무접종 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
양성대조군 1주령 자돈 15두 무접종 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신접종군 1주령 자돈 15두 2주령 4주령 접종 (백신접종후 2주 경과) 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
백신대조군 1주령 자돈 15두 2주령 무접종 5주령 (바이러스 공격 접종후 1주 경과후)
표 9와 같은 방법으로 실시예 5에서 제조된 사독백신의 자돈에 대한 호흡기 질병예방 평가를 수행하고 그 결과를 표 10에 나타내었다.
그룹 검사 자돈 두수 호흡기 질환 관찰 여부
정상 폐장 간질성 폐렴
심함 중간 경미
음성대조군 15 15 0 0 0
양성대조군 15 0 9 4 2
백신접종군 15 11 0 2 2
백신대조군 15 15 0 0 0
실험결과 음성 대조군에서는 정상적인 폐장이 관찰되었다 (도 8). 사독백신을 접종한 후 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 11두에서는 정상적인 폐장이 관찰되었고 (도 9), 2두에서는 중간정도의 간질성 폐렴이, 2두에서는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었다 (백신접종군). 반면에 사독백신을 접종하지 않고 야외에서 분리된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 접종한 15두 자돈의 경우 바이러스 공격접종 후 1주일이 경과된 시점에서 안락사 시킨 후 폐장의 병리조직학적 병변을 관찰하면 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 감염된 폐장에서 9두에서는 심한 간질성 폐렴(interstitial pneumonia) (도 10)이, 4두에서는 중간정도의 간질성 폐렴이, 2두에서는 경미한 간질성 폐렴이 관찰되었다 (양성대조군). 따라서 본 발명의 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 사독백신은 자돈에서 간질성 폐렴 등 호흡기 질환을 예방하는 것으로 확인되었다.
본 발명은 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방에 대단히 유용하다.
한국생명공학연구원 KCTC11954BP 20110704 한국생명공학연구원 KCTC11955BP 20110704
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Vaccine composition for Korean Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <130> P1 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 710 <212> DNA <213> korean porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF5 <400> 1 caatgagggg gggctacaac catcgcttgt ttgttcgcca ttctcttggc gatatgagat 60 gttctcacaa attggggcgt ttcttgattc cgcactcttg cttttggtgg ctttttttgc 120 tgtgtaccgg cttgtcctgg tcctttgccg atggcaacgg caacagctcg acataccaat 180 acatatataa cttgacgata tgcgagctga atgggaccgc ctggttgtcc acccactttc 240 cttgggtagt cgagaccttt gtgctttacc cggttgcgac tcacattctc tcactgggtt 300 ttctcacaac aagccatttc tttgatgcgc tcggtctcgg cgctgtgtcc atcacagggt 360 ttcttgacaa acgatatgtg ctcagcagta tctacggcgc ctgtgctctt gctgcgttcg 420 tgtgcttcgc tactcgtgct gttaaaaatt gtatggcttg ccgctacgcc cgtactcggt 480 tcaccaactt cattgtggac gaccggggga ggattcatcg gtggaagtcc ccggtagtag 540 tggagaaact gggcaaagcc gaaattggcg gcgatcttgt caccatcaaa catgttgtcc 600 tcgaaggggt taaagctcaa cccttgacga ggacttcagc tgagcaatgg gaagcctaga 660 tggtttttgc gatgaacctg ccgctgtgca aaatcttgtg ctagccttta 710 <210> 2 <211> 486 <212> DNA <213> Korean porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF7 <400> 2 gctgttaacc ggggagtggt taacctcgtc aagtatggcc ggtagaaacc agagccagaa 60 gaaaaagaaa aacacagctc caatggggaa tggccagtca gtcaatcaac tgtgccaatt 120 gctgggtaca atgataaagt cccagcgcca gcggtccagg ggaggacaag ctaaaaagaa 180 gaagcctgag aagccacatt ttcccttggc tgctgaagat gacatccggc atcacctcac 240 ccagactgaa cgttccctct gcttgcaatc gattcagacg gctttcaatc aaggcgcagg 300 aactgcgtcg ctttcatcca gtgggaaggt cagttttcag gttgagttca tgttaccggt 360 tgctcataca gtgcgcttga ttcgcgtgac ctctacatcc gctagtcagg atgtaaatta 420 attgacagtc aggtgaatgg ccgcgattgg cgtgtggcct ctgagtcacc tattcaatta 480 gggcga 486 <210> 3 <211> 716 <212> DNA <213> Korean attenuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF5 <400> 3 caatgagggg gggctacaac catcgcttgt ttgttcgcca ttctcttatt agagatgact 60 acattggtga cgctcttgag tccgcttctt gtttttgttg gattttattc cggtgtactg 120 gcttgtatgg tacttagccg atgtacggca actgctcgac ataccaatac atatataact 180 tgacgatatg cgagctgaat gggaccgcct ggttgtccac ccactttcct tgggtagtcg 240 agacctttgt gctttacccg gttgcgactc aaattctctc actgggtttt ctcacaacaa 300 gccatttctt tgatgcgctc ggtctcggcg ctgtgtccat caaagggttt cttgacaaac 360 gatatgtgct cagcagtatc tacggcgcct gtgctcttgc tgcgttcgtg tacttcgcta 420 ctcgtgctgt taaaaattgt atggcttgcc gctacgcccg tactcggttc accaacttca 480 ttgtggacga ccgggggagg attcatcggt ggaagtcccc ggtagtagtg gagaaactgg 540 gcaaagccga aattggcggc gatcttgtca ccatcaaaca tgttgtcctc gaaggggtta 600 aagctcaacc cttgacgagg acttcagctg agcaatggga agcctagatg gtttttgcga 660 tgaacctgcc gctgtgcaaa aatcttgtag ctagccttta gcatttaaca ttaaaa 716 <210> 4 <211> 488 <212> DNA <213> Korean attenuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF7 <400> 4 gctgttaaag gggatttttt aacctcgtca agtatggccg gtagaaacca gagccagaag 60 aaaaagaaaa acacagctcc aatggggaat ggccagtcag tcaatcaact gtgccaattg 120 ctgggtacaa tgataaagtc ccagcgccag cggtccaggg gaggacaagc taaaaagaag 180 aagcctgaga agccacattt taccttggct gctgaagatg acatccggca tcacctcaac 240 cagactgaac gttccctctg cttgcaatcg attcagacgg ctttcaatca aggcgcagga 300 actgcgtcgc tttcatccag tgggaaggtc agttttcagg ttgagttcat gttaccggtt 360 gctcatacag tgcgcttgat tcgcgtgacc tctacatccg ctagtcagga tgtaaattaa 420 tttgacagtc aggtgaatgg ccgcgattgg cgtgtggcct ctgagtcacc tatacaattg 480 ggggcaaa 488

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 계대배양하여 이를 약독화 또는 사독화하여 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11955BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 제조하는 단계;
    를 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC 11954BP로 기탁된 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 서열번호 1로 표시되는 ORF5(오픈 리딩 프레임)과 97% 이상의 상동성을 가지는 ORF5(오픈 리딩 프레임) 및 서열번호 2로 표시되는 ORF7(오픈 리딩 프레임)과 98% 이상의 상동성을 가지는 ORF7(오픈 리딩 프레임)을 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주를 포함하는 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물.
  8. 삭제
KR1020120005761A 2012-01-18 2012-01-18 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 KR101245029B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120005761A KR101245029B1 (ko) 2012-01-18 2012-01-18 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120005761A KR101245029B1 (ko) 2012-01-18 2012-01-18 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110071054A Division KR101191518B1 (ko) 2011-07-18 2011-07-18 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130010426A KR20130010426A (ko) 2013-01-28
KR101245029B1 true KR101245029B1 (ko) 2013-03-18

Family

ID=47839678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120005761A KR101245029B1 (ko) 2012-01-18 2012-01-18 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101245029B1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101502360B1 (ko) * 2013-03-20 2015-03-25 주식회사 옵티팜 신규한 국내형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스
KR102099878B1 (ko) 2013-07-11 2020-04-10 삼성전자 주식회사 반도체 패키지
KR20150045873A (ko) * 2013-10-19 2015-04-29 건국대학교 산학협력단 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주
KR102402645B1 (ko) * 2020-01-29 2022-05-26 주식회사 바이오포아 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 변이주 및 이를 포함하는 백신 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030082960A (ko) * 2001-03-09 2003-10-23 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 Ｐｒｒｓ 바이러스의 약독화된 생균 균주

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030082960A (ko) * 2001-03-09 2003-10-23 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 Ｐｒｒｓ 바이러스의 약독화된 생균 균주

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130010426A (ko) 2013-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3710095B2 (ja) ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルスの増殖方法並びにワクチンにおけるその使用
JP6236144B2 (ja) 豚ヘルペスウイルス、ワクチン組成物及びその製造方法と応用
JP4300252B2 (ja) 豚ミステリー病に関与するウイルス物質
KR101554080B1 (ko) 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법
ITTO940713A1 (it) Vaccino per la prevenzione della sindrome riproduttiva e respiratoria porcina.
KR101245029B1 (ko) 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물
KR20080111100A (ko) 마이코플라즈마 ｐｒｒｓｖ에 대한 백신
KR101281361B1 (ko) 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 및 이를 포함하는 혼합백신 조성물
KR101191518B1 (ko) 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물
KR20160020453A (ko) 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(prrsv) 변이주 및 이를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 백신 조성물
KR100790801B1 (ko) 동물용 불활화 백신의 제조방법
KR101345786B1 (ko) 신규한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 및 그의 용도
KR101549744B1 (ko) 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 마이코플라즈마성 폐렴 예방을 위한 혼합백신 조성물
CN115074334B (zh) 猪流行性腹泻病毒株、扩增培养方法、及其制备的疫苗组合物、制备方法和应用
KR101420850B1 (ko) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 백신
KR20240051388A (ko) 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 및 이의 용도
CN111849924B (zh) 类nadc30猪蓝耳病强毒株、弱毒株及其应用
KR102089655B1 (ko) 소 코로나바이러스 감염증 예방용 kwd20v-102 주의 약독화 생백신 조성물
KR20240028924A (ko) 높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 불활화 백신 조성물
KR101624485B1 (ko) 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(prrsv) 변이주 및 이를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 예방 또는 치료용 백신 조성물
KR20220021304A (ko) 돼지 써코바이러스 예방용 백신 조성물
CN117003860A (zh) 猫杯状病毒卵黄抗体的制备及其应用
JPH0773493B2 (ja) ウシのウイルス性下痢症ウイルス変異株

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160122

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170224

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180222

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190221

Year of fee payment: 7