KR20220021304A - 돼지 써코바이러스 예방용 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스 감염증의 예방 및/또는 치료용 백신 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 감염증의 예방 방법을 제공한다.
본 발명이 제공하는 백신 조성물은 접종시 부작용이 적고, 돼지 써코바이러스 예방 효과가 우수하며, 특히 다른 바이러스와의 동시 접종에 의한 간섭 효과의 영향을 받지 않고 돼지 써코바이러스 감염증의 예방이 가능하다.

Description

돼지 써코바이러스 예방용 백신 조성물 {Vaccine Composition for preventing porcine circovirus}

본 발명은 돼지 써코바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 백신 조성물과 그 제조 방법 및 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 감염증의 예방 방법을 제공한다.

돼지 써코 2형 바이러스는 국내에서 이유 후 전신 소모성 질환(PMWS)의 주요 원인체로서 자돈의 증체량 감소 및 폐사의 주된 원인으로 지목되고 있다. 비단 이유자돈 뿐 아니라 비육기 돼지에서 돼지 호흡기 복합 증후군의 주요 원인체로서 비육기 돼지의 호흡기 증상을 유발하여 출하 일령을 증가시키고 항생제를 포함한 의료 비용 지출을 증가시켜 문제 되고 있다.

전세계적으로 써코바이러스 백신 시장은 자돈 접종으로 비교적 큰 시장 규모를 차지하고 있으며, 전체 돼지 백신 시장 규모 (2016년 기준 2조 2163억 원)의 약 20%를 차지하는 것으로 추정된다. 국내의 경우에도 국내 써코 바이러스 시장은 약 450 내지 500억원에 이르는 것으로 추산될 정도로 구제역 다음으로 큰 시장을 형성하고 있으며, 대부분의 농가에서 3주령 자돈에 백신을 접종하는 프로그램이 적용되어 있다.

써코바이러스에 대한 백신은 크게 불활화 전바이러스(inactivated whole virus) 백신과 바이러스 유사 입자(virus like particle, VLP)의 2가지로 나뉠 수 있으며, 양자의 효능은 실험적으로 입증된 바 없으나, 우수한 항원의 양으로 인해 VLP 형태의 백신 점유율이 높은 편이다.

현재까지 상용화된 써코바이러스 백신은 PMWS 예방에 지대한 역할을 하였고, 그 효능에 대한 소비자 신뢰도 높은 편이지만, 최근 써코 바이러스의 여러 유전형 중 유전형 d 그룹에 속하는 바이러스가 2012년 이래 전 세계적으로 가장 발생 빈도가 높은 것으로 보고되고 있으며, 이러한 유전형의 분포는 초창기 유전형 a 그룹에 속하는 바이러스의 구조 단백질을 기반으로 제작된 백신의 사용이 무려 10년 이상 지속되면서 유사한 유전형에 속하는 바이러스에 대한 면역이 전반적으로 형성되어 바이러스가 교차면역을 피할 수 있는 유전형으로 분포가 바뀌는 것으로 추측할 수 있다.

기존의 돼지 써코바이러스(PCV) 백신은 2a형 또는 2b형으로서 현재 유행하는 PCV2d형과는 유전자형에서 차이가 있다. 써코 바이러스는 2010년대 이후 유전적 쉬프트(genomic shift)를 통해 기존의 2a형 백신에 의해 유도된 면역을 회피할 수 있는 2d형으로 바뀌고 있는 것으로 분석된다. 실제 농장 가검물 분석 사례에서는 전체 검출된 PCV2(돼지써코바이러스 2) 중 PCV2d가 차지하는 비중이 무려 70%에 달하고 있음을 확인할 수 있다.

이에 현재 유행하는 d 그룹 바이러스에 효과적으로 대항할 새로운 백신의 개발이 필요한 실정이다.

최근 유행하는 PCV2d의 경우, 기존 상용화된 백신을 접종한 농가에서도 병변이 발생하여 새로운 백신 도입의 필요성이 증대하고 있다.

본 발명의 목적은 돼지 써코바이러스 2(PCV2)의 예방 및/또는 치료용 백신 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2의 감염증 예방 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 돼지 써코바이러스 2의 감염증 예방 및/또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 백신 조성물을 사용하여 돼지 써코바이러스 2의 감염증을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 발명은 돼지 써코바이러스 2에 대한 면역화 조성물 및/또는 상기 조성물을 사용하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 명세서에서, "돼지 써코 바이러스"는 돼지 써코 바이러스 2형을 의미하며, 예를 들어, 돼지 써코바이러스 2d형을 의미할 수 있으며, "PCV2" 또는 "PCV2d"와 혼용하여 사용될 수 있다.

본 명세서에서, "백신 조성물"은 PCV2 바이러스 또는 이의 임의의 면역원성 단편 또는 분획, 바람직하게는 약독화된 PCV2 바이러스, 예를 들어 상기 본 발명의 PCV2 바이러스 VLP(virus-like particle) 일 수 있다. 백신 조성물은 PCV2 감염 및 이와 관련된 임상 징후들에 대해 예방 면역을 부여할 수 있는 것 및/또는 면역화하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 "돼지들", "돼지" 및 "새끼돼지"는 호환 사용될 수 있다. 상기 돼지는 이유 자돈기, 육성기 및 비육기로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 성장 단계의 돼지일 수 있다. 상기 이유 자돈기의 돼지는 생후 7일 이상, 14일 이상, 또는 21일 이상부터 체중 30kg에 이르기 전까지의 돼지를 의미하며, 상기 육성기는 돼지의 체중이 30 내지 50kg인 시기를, 상기 비육기는 육성기 이후의 시기를 의미하는 것일 수 있다. 상기 돼지는 양돈 돼지 및/또는 멧돼지일 수 있으며, 품종을 가리지 않으나, 예를 들어, 랜드레이스종, 요크셔종, 듀록종, 버크셔종, 및 대한민국 재래돼지로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상 또는 5종 이상일 수 있으며, 상기 종 사이의 교잡으로 태어난 돼지를 모두 포함한다.

본 명세서에서 "백신을 접종하다"는 PCV 감염성 질환에 노출되기 전에 본 명세서에 기술된 PCV 바이러스의 VLP를 포함하는 백신을 투여하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "예방하다" 또는 "예방"은 본 발명의 PCV2 바이러스의 VLP를 포함하는 백신 조성물을 투여받은 결과로서, PCV2 감염의 임상의 발생 빈도, 징후의 중증도 또는 빈도가 감소하는 것을 의미한다. 중증도 또는 빈도의 감소는 본 발명의 백신조성물을 투여받지 않은 동물 또는 동물 그룹과 비교한 결과이다. 일 구현예에서 상기 동물은 돼지일 수 있다.

본 명세서의 핵산 서열은 편의를 위해 DNA 뉴클레오타이드를 기준으로 기재되었으며, 폴리뉴클레오타이드의 종류가 RNA인 경우에는 핵산 서열 내 모든 또는 일부 티민(Thymine, T)이 우라실(Uracil, U)로 치환된 서열을 의미한다. 본 명세서에 기재된 핵산 서열은 특별한 언급이 없는 한 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 기재되었다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한 온도는 섭씨 온도를 의미한다.

본 발명은 돼지 써코바이러스의 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신 조성물을 제공한다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은, 돼지 써코바이러스 2d형(PCV2d)의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 배큘로바이러스에 의해 생산되는 바이러스 유사 입자(Virus-like particle; VLP)를 항원으로 포함한다.

상기 PCV2d의 캡시드 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 일 예에서, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기 배큘로바이러스는, 상기 PCV2d의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 배큘로바이러스는 PCV2d의 캡시드 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배큘로바이러스는 100회 이내, 50회 이내, 30회 이내, 20회 이내, 10회 이내, 5회 이내, 또는 2회 이내 계대된 바이러스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 VLP는 상기 배큘로바이러스에 의해 생산될 수 있으며, 일 예에서, 상기 배큘로바이러스를 숙주에 감염시켜 제조될 수 있다.

일 예에서, 본 발명이 제공하는 백신 조성물은 상기 항원(VLP)을 2 ug/mL 이상, 5 ug/mL 이상, 10 ug/mL 이상, 2 내지 200ug/mL, 2 내지 100 ug/mL, 2 내지 80 ug/mL, 2 내지 60ug/mL, 5 내지 200ug/mL, 5 내지 100 ug/mL, 5 내지 80 ug/mL, 5 내지 60 ug/mL, 10 내지 200ug/mL, 10 내지 100ug/mL, 10 내지 80 ug/mL, 또는 10 내지 60 ug/mL 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항원이 2ug/dose보다 낮은 함량으로 포함되는 경우, 중화항체가 충분히 형성되지 않을 수 있으며, 써코바이러스 감염증 예방 효과가 나타나지 않을 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 돼지 써코바이러스 (PCV)의 감염과 관련된 감염증(PCV associated diseases)을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 상기 감염증은, 이유후 전신성 소모성 증후군(PMWS), 돼지 피부염 신증 증후군(PDNS), 모돈 번식 장애, 소화기장애, 및 돼지호흡기질병복합체(PRDC)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 또는 상기 모든 질환일 수 있다.

상기 이유후 전신성 소모성 증후군은, 8 내지 16주 또는 5 내지 16주의 돼지에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 질병으로, 소모성 체중 손실, 피부의 창백, 폐의 종대와 간질성 폐렴을 포함하는 호흡기 질병, 피하 림프절의 종대, 설사, 황달, 피하 림프절의 위축, 간의 종대 또는 위축, 및 신장 피질의 백색 반점으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 증상을 보일 수 있다.

상기 돼지 피부염 신증 증후군(PDNS)은 자돈, 육성돈, 성돈에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 3개월 이상의 돼지에서 거의 100%의 폐사율을 보이며, 어린 돼지에서는 약 50%의 폐사율을 보여 치명적이다. 상기 PDNS의 증상으로는 식욕부진, 침체, 엉덩이와 뒷다리 주위 피부의 불규칙한 반점과 구진, 누워서 일어나기를 꺼리는 현상, 및 뻣뻣한 걸음걸이로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 증상이 나타날 수 있다.

상기 번식 장애는 PCV2에 대한 항체 역가가 낮은 수준의 모돈에서 주로 감염되어 분만시 사산이 증가하고, 다양한 크기의 미라 태아가 발생하는 등의 증상을 보이는 것으로 알려져 있다. PCV2 감염으로 유산하는 모돈에서는 발열과 식욕부진이 보고되고 있으며, 임신일 118일 이상의 분만 지연 또는 가임신이 나타나기도 한다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 상기 조성물이 투여된 돼지에서 PCV에 대한 중화항체의 생성을 유도할 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은, 접종에 의한 부작용, 예를 들어, 조직 병변, 발열, 화농 발생, 및/또는 증체량 감소가 일어나지 않아 접종 대상 돼지에게 안전하며, 돼지의 생산량을 유지할 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은, 돼지 써코바이러스를 포함하는 복수의 바이러스 감염에 의한 간섭 효과가 일어나지 않는 것일 수 있다. 상기 복수의 바이러스 감염은 PCV2와 PRRSV의 감염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 간섭 효과가 일어나 지 않는 경우 돼지 써코바이러스 감염증 예방에 효과적이다. 일 구현예에서, PCV2와 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 동시 감염시 PRRSV에 의한 증상은 나타났으나, PCV2 감염에 의한 증상은 나타나지 않아, PRRSV 감염에 의한 간섭 효과를 받지 않음이 확인되었다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주반트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함할 수 있다. 일 예에서 상기 어주반트는 카보머(carbomer)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서 상기 카보머는 1 내지 10mg/dose, 1 내지 5 mg/dose, 또는 1 내지 3mg/dose 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 경구, 비경구, 피하, 근육내, 피내, 설하, 경피, 직장, 경점막, 흡입을 통한 표면적, 협측 투여를 통해, 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다. 또는, 항원의 서방출을 허용할 수 있는 이식체 형태로 투여될 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 예를 들어, 주사, 흡입 또는 이식을 통해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 백신접종 또는 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라 백신 조성물은 1회 또는 여러 번, 또한 간헐적으로, 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 동일한 양 또는 다른 투여량으로 투여될 수 있다. 주사는 원하는 양으로 주사하거나 피하 혹은 비강에 분무하여 주입할 수 있다, 또는 대안적으로 연속 주입할 수 있다.

일 예에서 상기 백신 조성물은, 돼지 써코바이러스 감염 예방 또는 치료용 키트의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 용기, 바람직하게는 본 발명의 백신 조성물, 약제학적으로 허용되는 담체, 보강제 및 PCV 감염의 임상 징후 또는 효과, 바람직하게는 PCV 감염증의 빈도 또는 중증도를 경감시키도록 이를 필요로 하는 동물에게 상기 백신 조성물을 투여하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 주사 수단 및/또는 다른 형태의 투여 수단을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 용매를 포함할 수 있다. 약독화된 백신은 동결건조될 수 있고, 용매로 복원되어 주사 및/또는 흡입용 용액이 될 수 있다. 용매는 물, 생리식염수, 완충액 또는 보강 용매일 수 있다. 키트는 약독화된 바이러스, 용매 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 분리 용기를 포함할 수 있다. 사용설명서는 하나 이상의 용기에 부착된 라벨 및/또는 인쇄물일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물의 제조 방법은, PCV2d의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자 및/또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 배큘로바이러스를 제조하는 단계; 상기 배큘로바이러스를 숙주에 감염시켜 VLP를 제조하는 단계, 및 상기 VLP를 불활화하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 배큘로바이러스를 제조하는 단계는 배큘로바이러스의 형질도입 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한없이 적용하여 수행될 수 있다. VLP를 불활화하는 단계는 VLP 불활화 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한없이 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 백신 조성물을 투여하여 돼지 써코바이러스 감염증을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 돼지 써코바이러스 감염증을 예방하는 방법은 본 발명이 제공하는 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함한다.

상기 백신 조성물, 투여 방법, 써코바이러스 감염증은 상술한 바와 같다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 PCV2의 감염 예방이 가능하며, 음성 대조군에 비해 유의적으로 높은 중화항체 역가 및 항체가를 가지고, PCV2 감염으로 인한 증체량 감소를 방지할 수 있으며, 혈중 PCV2 바이러스 농도를 감소시킬 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 돼지 써코바이러스 type 2에 의한 림프조직 내에서의 림프구 손실, 염증, 집락 형성을 예방할 수 있다.

본 발명이 제공하는 백신 조성물은 다른 종류의 바이러스, 예를 들어 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)와의 동시 감염 조건에서도 병원체간의 간섭효과에 의한 PCV2 감염 예방 효과에 영향을 받지 않는다.

도 1은 돼지써코바이러스(PCV)의 계통수이다.
도 2는 백신 효능 평가를 위한 동시 공격 접종 실험에서 각 그룹에서의 혈중 PCV2에 대한 항체가 측정 결과 그래프이다.
도 3은 백신 효능 평가를 위한 동시 공격 접종 실험에서 각 그룹에서의 PRRSV에 대한 혈중 항체가 측정 결과 그래프이다.
도 4는 백신 효능 평가를 위한 동시 공격 접종 실험에서 공격접종 당일, 7일 후 및 14일 후의 혈청 내 PCV2 항원량 그래프이다.
도 5는 백신 효능 평가를 위한 동시 공격 접종 실험에서 공격접종 당일, 7일 후 및 14일 후의 혈청 내 PRRSV 항원량 그래프이다.
도 6은 백신 효능 평가를 위한 동시 공격 접종 실험에서 공격 접종(Challenge)으로부터 경과 일수에 따른 평균 일간 증체율(ADWG) 측정 결과 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.

본 발명은 서울시 산학연 협력사업(Seoul R&BD Program)의 지원을 받아 수행되었다 (BT190094).

실시예 1. 백신의 제작

백신 제조를 위해 돼지 써코바이러스 PCV2d (genebank No. KM924369)의 캡시드 단백질(capsid protein)을 인공적으로 합성하여 제작한 유전자를 백미드에 삽입하여 역유전학적으로 배큘로바이러스를 제조하였다. 상기 배큘로바이러스는 폴리헤드린 프로모터(polyhedron promoter) 하위에 PCV2d ORF2가 삽입되어 캡시드 단백질이 발현되도록 설계 제작되었다.

도 1에 돼지 서코바이러스의 계통수를 나타내었으며, 계통수 중 본 발명에서 사용된 백신 제조용 균주는 적색 박스로 표시하였다.

1-1. 단백질 항원 생산용 sf-9 세포의 대량 배양

sf 균주는 배양용 배지 25mL를 첨가한 125mL sterile Erlenmeyer flask에, 125rpm shaking incubator에서 3일간 배양하였다. sf 세포가 5x10⁶ cells/mL에 도달하면 세포의 생존율이 99% 이상인지 확인하고 1L sterile Erlenmeyer flask에 20mL을 분주하고, 배양용 배지 180mL를 첨가하여 총 200mL에 0.5x10⁶ cells/mL이 되도록 하였다. 이를 다시 1 내지 2일간 배양하여 세포 농도가 1x10⁶cells/mL가 되도록 하였으며, 계대 배양은 목적하는 수량까지 반복 수행되었다.

바이러스 접종 전 계대 배양시에는 계대 후 24 내지 36시간 경과 후 광학현미경으로 관찰하여 1x10⁶ cells/mL (세포 생존율 99% 이상)가 되었을 때 접종하였다.

1-2. 바이러스 접종 및 항원의 수집

pfu가 측정된 배큘로바이러스주를 배양용 배지에 희석하여(virus seed) 5moi로 접종하고, 72시간 배양하였다. 72시간 경과 후 세포 생존율이 60% 이하가 되었을 때 세포를 수거하고, 동량의 PBS를 섞어 재부유하여 항원을 수집하였다.

1-3. 배큘로바이러스의 불활화

수집된 항원액에 BEI(binary ethyleneimine)를 1%(v/v)가 되도록 (0.0001M) 첨가하고 37

에서 24시간 반응하여 완전히 불활화하였다. 중화액 2M sodium thiosulfate를 최종 농도 2mM이 되도록 첨가하고 다시 2시간 동안 실온에서 반응하여 BEI를 중화시킨 후 보존제로 Formaldehyde 0.1%(v/v)를 첨가하였다.

1-4. 시험 백신의 제조

최종 제조된 시험 백신은 상기 VLP를 항원(RP 1 이상)으로 함유하고 있으며, 적절한 면역 증강제(Adjuvant; 카보머(carbomer))를 첨가하여 사용하였다.

상기 카보머(제조사: Lubrizol)를 2mg/dose로 정량하였으며, PBS에 수화한 후 5N NaOH를 최종 pH가 7.4가 되도록 첨가하여 카보머를 수화하고 121

에서 40분간 고압증기멸균(autoclave)하였다.

상기 정제 항원과 상기 처리를 마친 카보머 혼합하고 교반하여 최종 pH가 6.0 내지 8.0이 되도록 하고, 소분하여 2 내지 8

의 냉암소에서 보관하였다.

실시예 2. PCV2 공격접종에서의 백신 효능 평가

PRRSV는 PCV2의 증식을 증폭시키는 역할이 있어, 임상적으로 PCV2로 인한 질환은 대부분 PRRSV를 비롯한 농장의 상재하는 병원체의 동시 감염이 주요한 요인으로 알려져 있다.

제조한 시험 백신의 효능을 검증하기 위해 PCV2와 PRRSV(돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)를 동시에 공격 접종하여 PCV2와 PRRSV의 동시 감염 조건에서 PCV2로 인한 병변과 증상의 방어 가능성을 확인하였다.

공격접종을 위한 바이러스 중 PCV2 바이러스는 국내 발병한 유전형 d 그룹의 써코바이러스로서 서울대학교 수의과대학에서 PCV 백신을 접종하던 농장에서 발병한 PMWS 위축 자돈에서 2014년에 분리한 PCV2d 균주인 SNUVR140004(GenBank No. KJ437506)를 사용하였다. PRRSV 공격접종 균주는 서울대학교 수의과대학에서 2000년대에 폐렴과 위축이 동반된 자돈에서 분리한 강병원성 북미형 균주 SNUVR090851 (Genbank no. JN315685)를 사용하였다. ORF5를 기반으로 한 분류 체계상, 상기 PRRSV 바이러스는 Lineage 1에 속한다. 상기 PRRSV 균주는 자돈의 폐에서 폐렴 유발이 확인된 것으로, 감염 이후 일시적인 고열과 간질성 폐렴 그리고 증체량 감소를 유도하는 것으로 알려져 있다.

상기 바이러스가 분리된 발병 농장은 3주령 자돈에 일괄적으로 써코바이러스 백신을 접종하였음에도 지속적으로 위축자돈이 발생하였으며 해당 농장의 돼지에게서는 서혜부 림프절에 심각한 병변이 확인되었다.

백신 효능 평가를 위해, 공격 접종 실험을 하기 표 1와 같이 디자인하였다.

그룹	접종 백신	투여량 (IM)	마리수 (두)	일정
				0주차	4주차	6주차
백신군	PCV2 VLP	1ml	5	접종	공격접종	부검
양성대조군	PBS		5	접종	공격접종	부검
음성대조군	PBS		5	접종	-	부검

구체적으로, PCV2에 항원 항체반응 음성인 건강한 3주령 이유자돈을 각 그룹당 5두씩 배정하여, 백신군의 이근부에 시험백신을 1mL 접종하였다. 대조군의 경우 PBS를 시험백신과 동량 접종하였다. 백신 접종일(0주차)로부터 4주 후 7주령이 된 시점에 모든 그룹에 상기 공격접종 바이러스를 비강 접종하였다. 공격 접종 바이러스 용량은 PCV2와 PRRSV 각각TCID₅₀ 5역가 3ml씩 사용하였다. 공격 접종일로부터 2주 후 전두수에 대해 부검하였다.

2-1. PCV2 항체검사 결과

위 효능 평가 중 백신 접종일로부터 1주일(7일) 간격으로 ELISA를 이용해 혈중 항체가를 측정하였다. 구체적으로 Biocheck PCV2 SK105 ELISA를 수행하였으며, 제품의 소개된 계산법에 따라 S/P ratio를 환산하였다. S/P ratio가 0.5 이하인 경우 (환산역가 1071 이하)는 음성으로 처리하였다.

도 2에 백신군(group1), 양성대조군 (group2) 및 음성대조군(group3)에서의 혈중 항체가 측정 결과 그래프를 나타내었다. 백신 접종 후 1주일부터 일부 항체 양전된 개체가 백신군에서 확인되었으며, 공격접종일 이후 (28일 이후)에도 백신군은 유의적으로 일정하게 비접종군에 비해 높은 항체가를 보였다.

하기 표 2에 공격접종일 당시(Dpi28)의 혈중 PCV2 중화항체가를, 표 3에 공격접종 2주 후(Dpi42)의 혈중 중화항체가를 나타내었다. 하기 표의 중화항체가는 모두 Log2 환산수치로 나타내었다.

개체번호	백신군	양성대조군	음성대조군
1	5	0	0
2	4	0	0
3	4	0	0
4	4	0	0
5	4	0	0
평균	4.2	0	0
표준편차	0.44	0	0

개체번호	백신군	양성대조군	음성대조군
1	5	3	0
2	6	0	0
3	5	0	0
4	4	0	0
5	6	0	0
평균	5.2	0.6	0
표준편차	0.83	1.34	0

백신군에서는 접종 28일차에 모든 개체에서 중화항체가 확인되었으며, 대조군에 비해 유의하게 높았다. 또한 공격접종 이후 백신군에서는 공격 이전에 비해 항체가의 상승이 일정하게 나타났으며, 양성대조군에 비해 유의적으로 높은 일당증체량을 보였다. 면역학적 지표로서 PCV2 방어에 가장 중요한 것으로 알려진 항체 및 중화항체 역가가 공격접종 전까지 평균 4.2(Log2) 수준으로 안정적으로 유도되어, 본 발명의 시험 백신이 PCV2 예방에 효과적임을 확인하였다.

2-2. PRRSV 항체검사 결과

위 효능 평가 중 공격접종일로부터 1주일(7일) 간격으로 IDEXX herdcheck PRRS 3XR 키트를 사용하여 PRRSV에 대한 항체가를 측정하였다. 제품의 소개된 계산법에 따라 S/P ratio를 환산하였다. S/P ratio가 0.5 이하인 경우 (환산역가 1071 이하)는 음성으로 처리하였다. 각 그룹 내 개체의 항원량 합계의 평균값을 계산하여 t-검정(Student's t-test)을 통해 통계처리하였다.

도 3에 PRRSV에 대한 항체가 측정 결과를 나타내었다. 백신군 (group 1)과 양성 대조군(group 2)에서 모두 차이 없이 공격접종일로부터 14일 경과 시점에 항체 양전이 확인되었으며, 양 그룹 간의 유의적인 차이는 확인되지 않았다.

또한 PRRSV를 이용한 중화항체 시험을 수행하였으나, 시험 결과 어떠한 개체의 혈청에서도 공격한 PRRSV에 대한 중화항체는 확인되지 않아 PCV2와 차이를 보였다.

2-3. 공격접종 바이러스의 혈청 항원 검사

공격접종일로부터 1주일(7일) 간격으로 각 그룹의 모든 개체에서 채혈하여 공격한 PCV2 또는 PRRSV에 특이적인 프라이머(서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6)를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(realtime PCR) 기법으로 혈청 1ml에 존재하는 PCV2 바이러스의 항원량을 정량하였다.

- PCV2 특이적 정방향 프라이머 (서열번호 3): GTATTCAAAGGGCACAGTGAGG

- PCV2 특이적 역방향 프라이머 (서열번호 4): GCACCATCGGTTATACTGTCAAGAAA

- PRRSV 특이적 정방향 프라이머(서열번호 5): GAAGAGAAACCCGGAGAAGC

- PRRSV 특이적 역방향 프라이머(서열번호 6): CGTAGGCAAACTAAATTCCACAG

도 4에 공격접종 당일(0), 공격 접종일로부터 7일 후 (7) 또는 공격 접종일로부터 14일 후(14)의 혈청 내 PCV2 항원량, 도 5에 동일한 날짜의 PRRSV 항원량을 표시하였다. 각 항원량은 Log10 변환하여 나타내었다. 통계 처리는 개체별 항원량 합계를 사용하지 않고, 그룹 내 개체의 항원량 합계의 평균값을 계산하여 t-검정(Student's t-test)으로 수행하였다.

PCV2는 공격접종 7일 및 14일 이후 혈청 내 항원량이 양성 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였음이 확인되었다. 백신군의 혈청 내 바이러스의 양은 양성 대조군에 비해 평균 10⁴배에서 10⁵배 감소하였다. 음성 대조군에서는 어떠한 바이러스도 검출되지 않았다.

PRRSV에서는 음성 대조군에서는 어떠한 바이러스도 검출되지 않았으나, PCV2와 달리 백신군(group1)과 양성대조군(group2)에서 유의한 차이가 나타나지 않았다.

2-4. 림프조직의 병리학적 병변 스코어 및 항원량 확인

상기 실시예 2의 실험 후 각 개체로부터 림프 조직을 분리하여 포르말린에 고정하고, 포매 과정을 거쳐 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 실시하였다. H&E 염색된 장기는 각각 현미경을 이용해 병변을 관찰하였다. PCV2에 의한 병변이 가장 특징적으로 보이는 서혜부 림프절의 경우, 임파구의 감소(lymphoid depletion)의 정도에 따라 0 내지 3 등급으로 구분하였으며, 그 기준은 상기 표 8과 동일한 기준으로 산정되었다.

각 그룹간의 병변을 기록하고 Kruskal-Wallis 방법으로 통계 처리한 후 유의성이 있으면 Mann-Whitney test 방법을 이용하여 5개 그룹간의 병리조직학적 임파구 감소(lymphoid depletion) 병변의 차이를 비교하하였다.

또한 부검 대상으로부터 각각 림프 조직을 채취한 뒤 무게를 측정하여 유제를 제조하였다. 이후 조직 1g당 존재하는 PCV2 및 PRRSV의 항원량을 정하기 위해 서열번호 3 및 서열번호 4의 핵산 서열로 이루어지는 PCV2 특이적 프라이머 세트, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 핵산 서열로 이루어지는 PRRSV 특이적 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(realtime PCR)을 수행하였다. 항원량 검사의 유의성 검사는 개체별 항원량 합계를 사용하지 않고, 그룹 내 개체의 항원량 합계의 평균값을 계산하여 t-검정(Student's t-test)을 통해 통계처리하였다.

하기 표 4에 림프 조직 병변 스코어링 결과 및 항원량 측정 결과를 나타내었다. 항원량 측정 결과는 모두 log10 변환된 수치로 기재되었다.

	백신군	양성대조군	음성대조군
병변 등급(점수)	0.45	2.1	0
표준편차	0.32	0.13	0
PCV2 항원량(PCV2 genomic copies/g)	3.84	7.84	0
표준편차	2.2	0.74	0
PRRSV 항원량(PRRSV genomic copies/g)	6.42	6.1	0
표준편차	0.81	1.05	0

백신군에서의 조직 병변 스코어는 0.45±0.32, 양성대조군에서의 스코어는 2.1±0.13, 음성대조군에서의 병변 스코어는 0으로 확인되었다. 즉 백신군에서 양성대조군에 비해 통계적으로 유의하게 낮은 조직 병변 수치를 보였으며, 평균적으로 정상 내지 경증 사이의 병변이 확인되었다.양성 대조군은 백신군에 비해 유의적인 임파구 감소(lymphoid depletion)을 보였으며, 림프구의 소실이 명백하게 나타났다. 또한 일부 개체의 림프 조직에서는 병변 부위가 섬유 조직으로 대체된 것이 확인되어, 감염 이후 증식한 PCV2에 의한 병변이 뚜렷하게 관찰되었으나, 백신군에서는 뚜렷한 병변이 관찰되지 않았다.

PCV2 항원량의 경우, 백신군에서는 대조군에 비해 약 10000배 가량 유의적으로 낮은 항원량이 확인되었다. 따라서 백신군에서 바이러스의 증식이 억제되어 PCV2에 의한 림프 조직 병변(실시예 2-2) 또한 감소하였음을 추정할 수 있다.

반면 PRRSV항원은 백신군과 대조군 모두 유의한 차이를 보이지 않았으며, 음성 대조군에서는 어떠한 바이러스도 검출되지 않았다.

2-5. 폐조직 병리학적 병변 스코어

실시예 2의 접종을 마친 후 각 그룹의 개체를 부검하여 폐장을 적출하고 포르말린에 고정한 후 포매 과정을 거쳐 H&E 염색을 실시하였다. 염색된 장기는 현미경으로 관찰하여 병변도를 관찰하였으며, 폐장에서 간질성 폐렴(interstitial pneumonia)의 정도는 하기 표 5의 기준으로 스코어링하였다. 각 그룹간 병변을 기록하고 Kruskal-Wallis 방법으로 통계처리한 후 유의성이 있으면 Mann-Whitney test 방법을 이용하여 유의성을 분석하였다.

레벨	등급 (점수)	비고
정상(Normal)	0	- 폐포벽(Alveolar wall)의 어떠한 비후(thickness)도 관찰되지 않음
경증(Mild)	1	- 폐포벽의 두께와 폐포낭(alveolar sac) 직경이 동일하거나 더 비후된 병소가 전체의 10% 미만
중등-다발성(Moderate multifocal)	2	- 폐포벽의 두께와 폐포낭(alveolar sac)의 직경이 동일하거나 더 비후된 병소가 전체의 40% 미만
중등-미만성(Moderate diffuse)	3	- 폐포벽의 두께와 폐포낭(alveolar sac)의 직경이 동일하거나 더 비후된 병소가 전체의 80% 미만
중증 (Severe)	4	- 폐포낭(alveolar sac)의 존재가 확인되지 않음 또는 출혈을 동반함

추가로, 상기 실시예 2-4와 실질적으로 동일한 방법으로 폐조직에서의 항원량을 실시간 중합효소연쇄반응을 이용해 확인하였다.하기 표 6에 폐조직에서의 병변 스코어 및 항원량 측정 결과를 나타내었다.

	백신군	양성대조군	음성대조군
병변 등급(점수)	2.1	2.35	0
표준편차	0.45	0.48	0
PCV2 항원량(PCV2 genomic copies/g)	2.22	5.48	0
표준편차	2.05	0.87	0
PRRSV 항원량(PRRSV genomic copies/g)	7.84	8.08	0
표준편차	0.55	0.55	0

분석 결과, 백신군과 양성 대조군은 유의적인 차이를 보이지 않고 모두 중등-다발성 수준 이상의 간질성 폐렴을 보였다. PRRSV 항원의 경우 백신군과 양성대조군에서 유의한 차이를 보이지 않았으나, PCV2의 경우 대조군보다 백신군에서 유의하게 낮은 항원량을 보였다. 폐장은 PCV2가 증식하는 주요 장기는 아니지만, PAM cell에 대하여 PCV2가 감수성을 보이며, 돼지호흡기복합증후군(Porcine respiratory disease complex; PRDC)의 주요 원인체가 PCV2임을 고려할 때, 동시 공격접종 조건에서 PCV2가 폐장에서 증식했을 가능성이 있으며, 또는, 조직 유제액에 포함된 혈액에 잔류한 PCV2가 탐지된 결과일 가능성도 있다.

즉, 폐장에서 PCV2의 증식 여부는 확실하지 않으나, 백신군은 조직에서 최소한 PCV2 항원량은 감소시킬 수 있음이 확인되었다. 폐에서의 간질성 폐렴은 PRRSV의 증식과 관련된 것으로 보이며, PCV2 백신은 조직에서 PRRSV의 증식을 엊게하지 못하므로 간질성 폐렴 병변을 감소시키지 못한 것으로 추정된다.

2-6. 직장 체온 및 평균증체율(ADWG) 평가

공격접종 이후 2일째 되는 날 각 그룹의 직장 체온을 측정하였다. 그룹 간의 통계적 차이는 ANOVA test 후 사후 검정(Tukey t-test)을 통해 유의성을 확인하였다. 백신군은 섭씨 40.2도(표준편차 0.7), 양성대조군은 섭씨 40.3도(표준편차 0.46) 수준의 체온을 보였으며, 음성대조군은 섭씨 38.9도(표준편차 0.2)를 나타내 음성대조군에 백신군과 양성대조군 모두 통계적으로 유의미하게 높은 체온을 보였다. 백신과 양성대조군 간에는 유의미한 체온 차이가 나타나지 않았다. 이러한 체온 차이는 상술한 폐병변에 의한 것으로 추정된다.

평균 일간 증체율(Average Daily weight Gain; ADWG)은 공격접종일 당일(0일)부터 7일, 7일부터 14일째 되는 날의 체중을 각각 측정하여 구하였다. 그룹 간의 통계적 차이는 ANOVA test 후 사후 검정(Tukey t-test)을 통해 유의성을 확인하였다.

도 6에 공격접종(Challenge)으로부터 경과 일수에 따른 ADWG 측정 결과 그래프를 나타내었다. 공격 접종 이전까지 백신군과 대조군은 유의한 체중 증가량 차이를 보이지 않았다. 공격 접종일 당시 각 그룹의 체중은 백신군은 평균 17.1kg, 양성 대조군은 16.9kg, 음성 대조군은 17.7kg이었으나, 공격 접종 이후 14일 경과 후, 각 그룹의 ADWG는 양성 대조군은 77.1±61.9g/day, 백신군은 328.5±89.2g/day, 음성 대조군은 520±49g/day를 보였다.

백신군에서 음성대조군에 비해 낮은 증체량을 보인 것은 PRRSV의 증식에 따른 폐렴과 동반된 임상 증상으로 예측되며, 양성 대조군에 비해 백신군에서 증체량이 유의미하게 회복되어, 본 발명의 백신 조성물이 PCV 감염에 의한 증체량 감소를 방지할 수 있음을 확인하였다.

상기 실시예 2-1 내지 2-6의 결과로부터 상기 시험 백신은 국내 분리 강병원성 PCV2와 PRRSV의 동시 감염 조건에서도 안정적으로 PCV2로 인한 병변과 증상을 방어할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에서 제공하는 시험 백신은 동시 감염 상황에서 발생할 수 있는 병원체 간의 간섭효과의 영향을 받지 않음이 확인되었다.

구체적으로, 면역학적 지표로서 PCV2 방어에 가장 중요한 것으로 알려진 항체 및 중화항체의 역가는 공격접종 전까지 평균 4.2(Log2) 수준으로 안정적으로 유도된 것을 확인하였다. 일반 항체가 (ELISA)역시 백신군이 유의적으로 높은 항체가를 보였다. 공격접종 이후 임상증상은 백신군이 양성대조군에 비해 유의적으로 높은 일당증체량을 보여주었으며 조직검사소견에서 림프절의 병변과 PCV2 항원의 양 또한 백신군이 양성대조군에 비해 유의적으로 낮은 수치를 보였다. 혈중에서 PCV2 바이러스는 최소 10000배 가량 감소시킨 것으로 확인되었다. 결론적으로 본 발명이 제공하는 PCV2 백신은 국내 분리된 강병원성 PCV2와 PRRSV의 동시 감염 조건에서도 안정적으로 PCV2로 인한 병변과 증상을 방어할 수 있음을 확인하였다. 또한 동시 감염 상황에서 발생할 수 있는 병원체 간의 간섭효과에 본 발명이 제공하는 PCV2 백신이 영향을 받지 않음을 확인하였다.

<110> BioPoA, Inc. REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Vaccine Composition for preventing porcine circovirus <130> DPP20201000KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2d capsid_amino acid <400> 1 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Leu Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro 225 230 <210> 2 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2d capsid_gene <400> 2 atgacgtatc caaggaggcg ttaccgcaga cgccgacacc gcccccgcag ccatcttggc 60 cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120 aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caagcgtacc 180 acagtcaaaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt 240 cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300 gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360 actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca atgccctaac ctatgacccc 420 tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctat 480 ttcaccccca aacctgtcct tgataggaca ctcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540 aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtgg accacgtagg cctcggcact 600 gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660 ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaacccct aa 702 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2_primer_forward <400> 3 gtattcaaag ggcacagtga gg 22 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2_primer_reverse <400> 4 gcaccatcgg ttatactgtc aagaaa 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRRSV_primer_forward <400> 5 gaagagaaac ccggagaagc 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRRSV_primer_reverse <400> 6 cgtaggcaaa ctaaattcca cag 23

Claims (10)

1. 돼지 써코바이러스 2d형(PCV2d)의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 배큘로바이러스에 의해 생산되는 바이러스 유사 입자(Virus-like particle; VLP)를 항원으로 포함하는, 돼지 써코바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 백신 조성물
2. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 백신 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 VLP는 돼지 써코바이러스 2d형의 캡시드 단백질을 포함하는 것인, 백신 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스 감염증은 이유후 전신성 소모성 증후군(PMWS), 돼지 피부염 신증 증후군(PDNS), 모돈 번식 장애, 소화기장애, 및 돼지호흡기질병복합체(PRDC)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 것인, 백신 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주반트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인, 백신 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 돼지 써코바이러스를 포함하는 복수 개의 바이러스 감염시 간섭효과를 받지 않는 것인, 백신 조성물.
7. 돼지 써코바이러스 2d형(PCV2d)의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 배큘로바이러스를 제조하는 단계;
   상기 배큘로바이러스를 숙주에 감염시켜 바이러스 유사입자(VLP)를 제조하는 단계;
   상기 바이러스 유사입자를 불활화하는 단계;를 포함하는, 돼지 써큘로바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 백신의 제조 방법.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 써큘로바이러스 감염증의 예방 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 돼지 써큘로바이러스 감염증은 이유후 전신성 소모성 증후군(PMWS), 돼지 피부염 신증 증후군(PDNS), 모돈 번식 장애, 소화기장애, 및 돼지호흡기질병복합체(PRDC)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 것인, 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 백신 조성물은 주사, 흡입, 및 이식으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 투여되는 것인, 방법.

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