ES2762535T3

ES2762535T3 - Virus de la pseudorrabia de los porcinos, composición de vacuna y método de preparación y uso de la misma

Info

Publication number: ES2762535T3
Application number: ES14804814T
Authority: ES
Inventors: Xuke Zhang; Jinzhong Sun; Rui Wu; Feifei Tan; Chaoyong Bai; Kegong Tian
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2020-05-25
Anticipated expiration: 2034-04-30
Also published as: JP6236144B2; CN104004774A; US20160137700A1; JP2016520294A; WO2014190838A1; US20160114029A1; EP2985288A9; CN104004774B; EP2985288A1; EP2985288B1; US9650424B2; CN105255910A; EP2985288A4

Abstract

Una cepa del virus de la pseudorrabia porcina (PRV) que comprende la glicoproteína gD codificada por la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 4; en donde dicha cepa del virus de la pseudorrabia comprende la glicoproteína gB codificada por la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 5; y en donde dicha cepa del virus de la pseudorrabia es la cepa HN1201, cuyo número de acceso es CCTCC NO. V 201311; dicha cepa HN1201 fue depositada en el China Center for Type Culture Collection (CCTCC).

Description

DESCRIPCIÓN

Virus de la pseudorrabia de los porcinos, composición de vacuna y método de preparación y uso de la misma

Campo de la invención

Esta invención se refiere a una composición de vacuna como se define adicionalmente en las reivindicaciones, perteneciente al campo de la virología animal.

Antecedentes

La pseudorrabia, llamada también enfermedad de Aujeszky, es una enfermedad infecciosa aguda causada por el Herpesvirus 1 de los suidos (SuHV1) perteneciente a la subfamilia Alphaherpesviridae para muchas clases de ganado tales como porcino, bovino y ovino, así como aves de corral y animales salvajes, cuyos signos principales son fiebre, picor intenso (excepto en los porcinos) y encefalomielitis. La pseudorrabia en los porcinos está causando daños graves en toda China, y es una de las principales enfermedades que limitan la producción en gran escala de granjas porcinas. La intención puede dar como resultado aborto, partos muertos o fetos momificados en las cerdas preñadas, y signos neurológicos, parálisis y un grado de muerte elevada en los lechones. El virus de la pseudorrabia (PRV) con fuertes propiedades pantrópicas, propiedades neurotrópicas e infectividad latente, puede establecer infección latente de larga duración en el sistema nervioso periférico, y más tarde el hospedador con infección latente comienza a enfermar cuando el virus latente se activa convirtiéndose en el virus infeccioso.

Ha sido indicado por muchos investigadores que puede proporcionarse a los animales vacunados una protección correspondiente por una vacuna subunitaria, que es una vacuna preparada por clonación de los genes antigénicos protectores del patógeno en sistemas de expresión de procariotas y eucariotas con métodos de ingeniería genética a fin de expresar fuertemente tales genes. Hasta ahora, se ha encontrado que cualquiera de las glicoproteínas B, C y D (gB, gC y gD) en las glicoproteínas de PRV puede hacer que el cuerpo genere anticuerpos neutralizantes, que tienen la capacidad de neutralizar el PRV, tanto in-vivo como in-vitro, o indistintamente en presencia o ausencia de complementos. El artículo, Progress in Subunit Vaccine against Pseudorabies Virus Development (Chenghuai Yang, Gaoming Lou, Nanhui Chen, Jiangxi Journal of Animal Husbandry & Veterinary Medicine 2004 Número 3) ha descrito que cualquiera de gB, gC y gD entre las 11 glicoproteínas de PRV que se han encontrado hasta ahora, puede inducir al cuerpo a generar anticuerpos neutralizantes. En ausencia de complementos, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra gB, gC y gD pueden neutralizar el PRV. Los cerdos y ratones inyectados con anticuerpos monoclonales dirigidos contra gB, gC y gD pueden resistir los ataques por las células virulentas de PRV. Por tanto, gB, gC y gD son las proteínas más preferidas para el desarrollo de la vacuna subunitaria de PRV. La glicoproteína gD es un antígeno neutralizante importante, así como la diana principal para anticuerpos protectores, y puede inducir una mejor respuesta protectora. Como ha sido descrito por Marchioli et al. (Journal of Virology 61(12): 3977-3982 (1987)), KR 2003/0045139, US6172186, US6858385 and US6521231, puede prepararse una vacuna para prevención de la pseudorrabia por el uso de gD del virus de la pseudorrabia porcina. Más específicamente, se ha comunicado que una proteína gD de PRV que es 98,8% idéntica a SEQ ID NO:1 (denominada también gp50) protege los ratones y los cerdos contra la exposición letal a PRV (US6172786). Adicionalmente, una vacuna subunitaria que comprende gD de PRV producida en células CHO protege los cerdos contra la infección letal con PRV (Marchioli et al. Journal of Virology 61(12): 3977-3982 (1987). Además, se ha demostrado que una vacuna de DNA plasmídico que codifica la secuencia gD de PRV, y que es 99,5% idéntica a SEQ ID NO:1, induce la formación de anticuerpos neutralizantes anti-PRV y también una respuesta inmune celular específica de PRV (KR 2003/0045139). El PRV porcino tiene solamente un serotipo, por lo que usualmente la inmunidad de protección cruzada entre cepas de PRV porcino está considerada como muy fuerte. Sin embargo, los lechones pueden sufrir todavía de la pseudorrabia porcina típica después de su inyección con vacunas comerciales, con signos tales como fiebre alta de larga duración, depresión, pérdida de apetito, y signos respiratorios y/o neurológicos. Las manifestaciones más importantes incluyen dicha infección entre los cerdos a cualesquiera edades, transmisión horizontal entre las piaras de cerdos, periodo de incubación corto (1 ~ 2 días), grados de morbilidad entre 10% ~ 100%, grado de mortalidad en los cerdos entre 10% ~ 100% (la grado de mortalidad en los lechones puede alcanzar hasta 100%), fiebre alta en los cerdos después de infectarse (40°C ~ 42°C, con duración hasta más de 3 días), disnea, diarrea, respiración sibilante, tos, estornudos, parálisis de los miembros posteriores, posición de perro sentado, caída repentina, convulsiones, posición tumbada de lado, opistótonos, golpeo con los brazos, y finalmente muerte por agotamiento, pudiendo causar también la infección signos de trastorno reproductivo tales como menor calidad del semen de los cerdos macho, así como aborto de las cerdas preñadas (la grado de abortos puede alcanzar hasta 35%), parto prematuro, parto muerto, lechones debilitados (los lechones debilitados mueren hacia los 14 días de edad), etc. Por medio de la técnica anterior, los cerdos vacunados no pueden resistir completamente los ataques del virus salvaje, y sufren además signos como fiebre alta, depresión, pérdida de apetito parcial o completa, con un grado de infección mayor que 30% y un grado de mortalidad entre 10% y 20%. No existen vacunas en la técnica anterior capaces de resolver la pseudorrabia causada por cepas variantes del virus de la pseudorrabia porcina.

Compendio de la invención

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

A fin de resolver la deficiencia de la técnica anterior, la presente invención está orientada a proporcionar una cepa del virus de la pseudorrabia porcina como se define en las reivindicaciones para preparación de vacunas como se definen en las reivindicaciones que, por ensayos en animales, se ha demostrado proporcionan una función inmune satisfactoria para la pseudorrabia porcina.

La presente invención proporciona una cepa del virus de la pseudorrabia porcina que comprende la glicoproteína gD codificada por la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 4; en donde dicha cepa del virus de la pseudorrabia comprende la glicoproteína gB codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 5; y en donde dicha cepa del virus de la pseudorrabia es la cepa HN1201, cuyo número de acceso es CCTCC NO. V 201311; dicha cepa HN1201 fue depositada en el China Center for Type Culture Collection (CCTCC) en fecha 20 de mayo, 2013.

En la presente invención, la "secuencia de nucleótidos" se refiere a una secuencia de ácido desoxirribonucleico (DNA), que puede transcribirse en una secuencia de RNA correspondiente.

En la presente invención, el término "glicoproteína gD" se refiere a una proteína estructural requerida para la infección de PRV, que es una de las glicoproteínas principales en la superficie de la envoltura de las partículas maduras de virus, llamada también proteína gp50.

En la presente invención, el término "homología" se refiere al nivel de semejanza entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos. La homología entre secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos puede calcularse por cualesquiera métodos apropiados bien conocidos en la técnica, por ejemplo, la secuencia diana de aminoácidos (o nucleótidos) y la secuencia de referencia de aminoácidos (o nucleótidos) se alinean, pudiendo inducirse lagunas en caso necesario para optimizar el número de los aminoácidos (o nucleótidos) idénticos entre dos secuencias alineadas, y el porcentaje de los aminoácidos (o nucleótidos) idénticos entre dos secuencias alineadas puede calcularse de acuerdo con ello. La alineación de secuencias de aminoácidos (o nucleótidos) y el cálculo de la homología pueden realizarse utilizando software bien conocido en la técnica. Ejemplos de dicho software incluyen, pero no se limitan a, BLAST (al que puede accederse a través del sitio de Internet National Center for Biotechnology lnformation, NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi o puede encontrarse en Altschul S. F. et al, J. Mol. Biol, 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res. , 25:3389-3402(1997) ), ClustalW2 (al que puede accederse a través del sitio de Internet del European Bioinformatics Institute, EBI, http://www. eji. ac. uk/Toolsa/clustalw2/, o puede encontrarse en Higgins D. G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402(1996); Larkin M. A. et al, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21):2947-8(2007)), and TCoffee (al que puede accederse a través de un sitio en Internet del Swiss Institute of Bioinformatics, SIB, http://tcoffee. vital-it. ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee cgi/index. cgi, o puede encontrarse en, Poirot O. et al, Nucleic Acids Res., 31(13):3503-6(2003); Notredame C. et al, J. Mol. Biol, 302(1):205-17(2000)) etc. Está plenamente dentro del alcance de los conocimientos de una persona experta en la técnica que cuando se utiliza el software para realizar el alineamiento de secuencias, pueden utilizarse los parámetros por defecto proporcionados por el software o ajustar los parámetros proporcionados por el software conforme a la condición actual.

Dicha cepa de PRV comprende la glicoproteína gB codificada por la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 5 del listado de secuencias.

Preferiblemente, dicho PRV conforme a la invención comprende la glicoproteína gC codificada por la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO. 3 del listado de secuencias.

Preferiblemente, dicha cepa de PRV es la cepa HN1201 (virus de la pseudorrabia, cepa HN1201), cuyo número de acceso es CCTCC NO. V 201311; la cepa HN1201 fue depositada en el China Center for Type Culture Collection (CCTCC) en fecha 20 de mayo 2013, cuya dirección es Wuhan University, Wuhan City, Hubei Province.

El término "cultivo" se refiere a cultivos de diferentes pasos del virus, conocidos por los expertos en la técnica, que pueden tener sólo variaciones minúsculas de un paso a otro. Preferiblemente, dicho cultivo es un cultivo dentro de 5 ~ 35 pasos.

Otra finalidad de la invención es proporcionar una composición de vacuna que comprende una cantidad inmune de vacuna desactivada de dicha cepa del virus de la pseudorrabia porcina HN1201, o de una vacuna subunitaria que comprende el antígeno de la proteína G de la cepa PRV HN1201 codificado por la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 4, y un adyuvante oleoso, como se define en las reivindicaciones.

Preferiblemente, la composición de vacuna conforme a la presente invención comprende dicho PRV o antígeno del mismo como componente activo.

Opcionalmente, el antígeno puede comprender proteína gB con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 o uno cuyo fragmento comparte al menos 95% de homología con la secuencia de SEQ ID NO. 2.

Opcionalmente, el antígeno puede comprender proteína gC con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3 o uno cuyo fragmento comparte al menos 95% de homología con la secuencia de SEQ ID NO. 3.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "vacunas vivas" se refiere a vacunas preparadas por virus que pueden reproducirse todavía en el hospedador o en las células y mientras tanto se ha debilitado su virulencia. Como se utiliza en esta memoria, el término "atenuado" se refiere a una reducción artificial de la virulencia de los patógenos por mutación de genes mediante preparación de patógenos que están privados de patogenicidad, pero mantienen inmunogenicidad. Generalmente, la atenuación puede conseguirse por irradiación UV, procesamiento químico o subcultivo continuo de orden alto in vitro. La alteración artificial de los genes atenúa la virulencia por, v.g., la deleción de algunos nucleótidos específicos en la secuencia dada.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "vacuna desactivada", denominada también vacuna no viva, se refiere a una suspensión de virus desactivado utilizada como antígeno para producir inmunidad. Ejemplos de vacunas desactivadas incluyen vacunas de virus enteros y vacunas de virus divididos. Por empleo de métodos conocidos es fácil producir vacunas desactivadas. Por ejemplo, pueden obtenerse vacunas de virus enteros desactivadas por tratamiento con solución de formaldehído. Vacunas de virus divididos pueden prepararse con envolturas de virus después de tratamiento con éter.

La expresión "vacuna subunitaria" se refiere a una vacuna preparada por expresión sumamente eficaz del gen antigénico protector de un patógeno mediante clonación del mismo en un sistema de expresión procariota o eucariota. Una vacuna subunitaria tiene menos riesgo de reacciones adversas que una vacuna de virus entero. Por ejemplo, la proteína gD o proteína gC de PRV expresada puede utilizarse para preparar vacunas subunitarias.

La expresión "vacuna peptídica sintética" se refiere a un pequeño péptido que comprende solamente el componente de determinantes inmunógenos, es decir una vacuna preparada por síntesis de un péptido protector corto conforme a la secuencia de aminoácidos de proteínas naturales, y adición de un adyuvante después de unión de las mismas a un vehículo.

Preferiblemente, dicha composición de vacuna de la invención comprende una vacuna desactivada de la cepa PRV HN1201 o cultivo de la misma, cuyo contenido no es menor que 1060TCID50/ml.

Preferiblemente, dicha composición de vacuna de la presente invención puede comprender 1060TCID50/ml PRV por cerdo. La vacuna no puede desencadenar eficazmente la generación de anticuerpos cuando la cantidad de dicho PRV utilizada es menor que 1060TCID50/ml. Por otra parte, la cantidad excesiva puede no ser económica.

Preferiblemente, dicha composición de vacuna comprende 25-100 pg/dosis de antígeno de la proteína gD de la cepa PRV HN1201 o cultivo de la misma.

Adicionalmente, dicha vacuna de la pseudorrabia de la presente invención puede utilizarse junto con otros patógenos o antígeno desactivados para preparar vacunas combinadas o vacunas complejas contra diversas enfermedades, con inclusión de la pseudorrabia. Como se utiliza en esta memoria, la expresión "vacuna combinada" se refiere a una vacuna preparada con la mezcla de virus por mezcladura del virus de la pseudorrabia de la presente invención con al menos un virus diferente. La expresión "vacuna compleja" se refiere a una vacuna preparada a partir de virus y bacterias. Por ejemplo, el virus de la pseudorrabia de la presente invención puede mezclarse o combinarse con el virus de la fiebre clásica de los porcinos, el virus del síndrome reproductivo y respiratorio de los porcinos, el circovirus en los porcinos y/o Haemophilus parasuis y micoplasma.

Dicha composición de vacuna comprende adicionalmente adyuvante 206 (SEPPIC, Francia).

Un objetivo más de la presente invención es proporcionar un método para preparar dicha composición de vacuna que comprende los pasos siguientes: amplificación y cultivo de la cepa PRV HN1201, desactivación, y mezcla subsiguiente con adyuvante 206 (SEPPIC, Francia), y mezcladura concienzuda, como se define en las reivindicaciones.

Específicamente, el método comprende los pasos: (1) inoculación de las cepas de la vacuna PRV en células sensibles respectivas, y cultivo de las células sensibles inoculadas; y recolección posterior del cultivo de células; y (2) tratamiento de los virus obtenidos en el paso (1) con solución de formaldehído, BPL (p-beta-propiolactona) o BEI (etilenimina binaria).

Las células sensibles pueden ser líneas de células continuas o líneas de células primarias. Las células sensibles adaptadas al cultivo de PRV incluyen, pero no se limitan a, líneas de células continuas tales como la línea de células ST (ATCC CRL-1746), la línea de células PK-15 (ATCC CCL-33), la línea de células Marc-145 de riñón del mono verde africano (ATCC CRL-12219), la línea de células MDBK Madin-Darby de riñón de bovino (ATCC CCL-22), la línea de células de cornete de bovino BT (ATCC CRL-1390), la línea de células Vero (ATCC CCL-81), la línea de células BHK-21 (ATCC CCL-10), la línea de células continua de riñón de cerdo (tales como IBRS-2, véase p. ej. DECASTRO, M. P. 1964. Behavior of foot and mouth disease virus in cell culture: susceptibility of the IB-RS-2 swine cell line. Arquivos Instituto Biologica 31:63-78), la línea de células continua de riñón de conejo (RK, p. ej. ATCC CCL-106) etc., y líneas de células primarias tales como fibroblastos de embrión de pollo y células de riñón de porcino, etc. Las células primarias pueden aislarse y prepararse a partir de tejidos de animales por métodos bien conocidos en la técnica.

La composición de vacuna conforme a la presente invención puede prepararse en formas de dosificación orales o formas de dosificación no orales. Se prefieren las formas de dosificación no orales que pueden administrarse por ruta intradérmica, ruta intramuscular, ruta intraperitoneal, ruta intravenosa, ruta subcutánea, ruta intranasal o ruta epidural.

Otra finalidad de la invención es proporcionar un método para preparación de la composición de vacuna, que comprende los pasos: (1) clonación de dicho gen gD recombinante de PRV; (2) expresión de dicha proteína gD recombinante de PRV; y (3) mezcladura de dicho antígeno de la proteína gD de PRV con adyuvante 206 (SEPPIC, Francia) y emulsionamiento de la mixtura resultante.

Una afinidad adicional de la invención es proporcionar dicha composición de vacuna para su uso en el tratamiento de la infección de PRV.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "enfermedades relacionadas con PRV" puede referirse adicionalmente a enfermedades causadas por infección de PRV. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, signos neurológicos obvios, estado letárgico, gritos, diarrea con vómito, y fiebre en los lechones infectados, y aborto, fetos momificados o nacidos muertos o trastorno reproductivo en las cerdas preñadas infectadas.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "enfermedades relacionadas con PRV" puede referirse adicionalmente a enfermedades con manifestaciones importantes que incluyen, pero no se limitan a, infección entre los cerdos a cualesquiera edades, transmisión horizontal entre las piaras de cerdos, periodo de incubación corto (1 ~ 2 días), grados de morbilidad entre 10% ~ 100%, grado de mortalidad en los cerdos entre 10% ~ 100% (la grado de mortalidad en los lechones puede alcanzar hasta 100%), fiebre alta en los cerdos después de infectarse (40°C ~ 42°C, con duración hasta más de 3 días), disnea, diarrea, respiración sibilante, tos, estornudos, parálisis de los miembros posteriores, posición de perro sentado, caída repentina, convulsiones, posición tumbada de lado, opistótonos, golpeo con los brazos, y finalmente muerte por agotamiento, y signos de trastorno reproductivo causados por la infección tales como menor calidad del semen de los cerdos macho, así como aborto de las cerdas preñadas (la grado de abortos puede alcanzar hasta 35%), parto prematuro, parto muerto, lechones debilitados (los lechones debilitados mueren hacia los 14 días de edad), etc. Las diferencias entre los signos descritos anteriormente y los signos causados por la infección del virus de la pseudorrabia regular en la técnica anterior son: en los cerdos adultos (cuyo peso es superior a 50 kg), fiebre alta de los cerdos infectados (40°C ~ 42°C, que puede durar hasta más de 3 días), disnea, diarrea, respiración sibilante, tos, estornudos, parálisis de los miembros posteriores, posición de perro sentado, caída repentina, convulsiones, posición tumbada de lado, opistótonos, golpeo con los brazos, y finalmente muerte por agotamiento; incidencia repentina de pseudorrabia en lechones recién nacidos y lechones de edad inferior a 4 semanas, que da como resultado ulterior la muerte masiva con una mortalidad mayor que 90%; manifestaciones principales en los lechones infectados que incluyen temperatura corporal elevada superior a 41°C, pérdida completa del apetito, signos neurológicos obvios y diarrea; y en los lechones inmediatamente antes o después del destete, principalmente signos respiratorios, tales como disnea, tos y narices moqueantes, etc.

Como se utiliza en esta memoria, el término "prevención" se refiere todas las conductas orientadas a inhibir la infección del virus de la pseudorrabia o retardar la aparición de la enfermedad por administración de la composición de vacuna. El término "tratamiento" se refiere a todas medidas orientadas a aliviar o curar los signos causados por la infección de PRV mediante la administración de la composición de vacuna conforme a la presente invención.

Breve Descripción de los Dibujos

Figura 1. Resultado del análisis de homología entre las secuencias de aminoácidos de gC en la cepa HN1201 y la cepa SA215.

Figura 2. Resultado del análisis de homología entre las secuencias de aminoácidos de gD en la cepa HN1201 y la cepa SA215.

Listado de secuencias

SEQ ID NO. 1 es la secuencia de aminoácidos de gD en la cepa PRV HN1201.

SEQ ID NO. 2 es la secuencia de aminoácidos de gB en la cepa PRV HN1201.

SEQ ID NO. 3 es la secuencia de aminoácidos de gC en la cepa PRV HN1201.

SEQ ID NO. 4 es la secuencia de nucleótidos de gD en la cepa PRV HN1201.

SEQ ID NO. 5 es la secuencia de nucleótidos de gB en la cepa PRV HN1201.

SEQ ID NO. 6 es la secuencia de nucleótidos de gC en la cepa PRV HN1201.

Descripción detallada

La descripción de la presente invención se proporciona adicionalmente como sigue con referencia a las realizaciones específicas, y las características y ventajas de la presente invención se harán más evidentes a partir de la descripción siguiente. Sin embargo, estas realizaciones son sólo ilustrativas, pero no constituyen limitación alguna del alcance de la presente invención, que está definido únicamente por las reivindicaciones.

La expresión "por cerdo" se refiere a la cantidad de vacuna inyectada a cada cerdo.

En la invención, el término "TCID⁵⁰" se refiere a la dosis infectiva de cultivo de tejido del 50%, una forma de representar la infectividad viral.

El medio líquido Medio Esencial Mínimo (MEM) se prepara con medio MEM seco pulverizado adquirido de Life Technologies, Corp. conforme a las instrucciones.

El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) en la presente invención se prepara con referencia al método de preparación del Apéndice A de GB/T18641-2002 Diagnostic Techniques for Aujeszk's Disease.

El término "PBS" es la abreviatura para Solución Salina Tamponada con Fosfato, y PBS 0,01 mM de pH 7,4 se prepara como se describe en Molecular cloning: Laboratory manuals, 3a edición.

Ejemplo 1

Recogida y aislamiento de los virus

Se recogió tejido cerebral de porcino en condiciones asépticas a partir de muestras aisladas de muestras de la provincia de Henan sospechosas de padecer infección de pseudorrabia, añadidas en medio líquido MEM en una ratio de 1:10 (V:V), y se trituró para preparar una suspensión de tejido. Después de 3 veces de congelación-descongelación repetidas, la suspensión de tejido se centrifugó a 2000 rpm durante 15 minutos. Se recogió luego el sobrenadante, se filtró a través de un filtro de 0,2 pm se subcultivó en células PK-15 y se incubó a 37°C durante 1h, después de lo cual se cambió el medio por adición de medio líquido MEM suplementado con suero de bovino fetal al 2%, y se incubó a 37°C durante 5 días. El PRV se detectó con el kit de detección de PRV PCR (Beijing Anheal Laboratories Co., Ltd), y el resultado fue positivo; el kit PCR se empleó para detectar la contaminación con virus exótico (kit de detección RT-PCR del virus reproductivo porcino y el virus del síndrome respiratorio, kit de detección del parvovirus porcino y kit de detección del virus de la fiebre clásica del cerdo RT-PCR, adquiridos todos ellos de Beijing Anheal Laboratories Co., Ltd) para el virus aislado y el resultado de la detección PCR fue negativo, indicando una especie viral pura.

La cepa PRV aislada se depositó en la China Type Culture Collection el 20 de mayo de 2013 y se designó cepa HN1201 (virus de la pseudorrabia, cepa HN1201) cuyo número de acceso es CCTCC NO. V 201311 y la dirección de conservación es Wuhan University, Wuhan City, Hubei Province.

Ejemplo 2

Características genéticas del virus aislado

Las características genéticas del virus aislado en el Ejemplo 1 se determinaron por medio de análisis de genes. Se utilizó como molde DNA genómico preparado a partir del virus de la pseudorrabia aislado de células PK-15, con los cebadores que se muestran en la Tabla 1 para reacciones de amplificación PCR. Se utilizó el Cebador 5.0 para designar la secuencia cebadora para amplificación de los genes gB, gC y gD, respectivamente.

El DNA genómico extraído se utilizó como molde para preparar el sistema de amplificación PCR siguiente: 100 pg DNA molde, 0,5 pl DNA-polimerasa PrimerSTAR HS (2,5 U/pl), 25 pL tampón 2 x PrimerSTAR GC, 1 pL de cada cebador aguas arriba y aguas abajo (10 pmol/pl), 4 pl de mezcla dNTP (2,5 mM cada uno), ajustado a un volumen final de 50 pl con agua destilada. Se llevó a cabo una reacción PCR en dos pasos por una desnaturalización inicial durante 10 segundos a 98°C, seguida por reasociación y extensión a 68°C (todo el tiempo se calcula por 1 kb/minuto) y se realizaron 30 ciclos en total. Las reacciones PCR se finalizaron a 4°C. El análisis de los productos de amplificación se condujo por electroforesis en gel de agarosa al 1% que contenía bromuro de etidio. Se determinaron las secuencias de los productos PCR. Los datos de las secuencias se analizaron por Lasergene.

Tabla 1. Secuencias de los cebadores PCR

Ejemplo 3

Test de patogenicidad del virus

3.1 Patogenicidad del virus en lechones de diferentes días de edad

6 lechones de 34 ~ 35 días de edad que eran negativos para anticuerpos de pseudorrabia se dividieron aleatoriamente en 2 grupos, uno con 4 lechones (grupo experimental) y el otro con 2 lechones (grupo de control), en donde el grupo experimental se inoculó con la cepa PRV HN1201 por instilación intranasal (la dosis de exposición es 2 x 10⁸⁰TCID⁵⁰/lechón) y el grupo de control se inoculó con medio DMEM. Mientras tanto, se inocularon 4 lechones de 49 días de edad con el tercer paso de la cepa virulenta HN1201 después de la preservación (la dosis de exposición fue 2 x 10⁸⁰TCID⁵⁰/lechón), y el control son todavía lechones de 35 días de edad. Después de la inoculación del virus, se determinó diariamente la temperatura de los lechones, y se observaron los signos clínicos y el estado de la muerte. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Patogenicidad de la cepa PRV HN1201 en lechones de diferentes días de edad

Los resultados demostraron que la inoculación con la cepa PRV HN1201 en los lechones con diferentes días de edad podía conducir a la aparición de la pseudorrabia en los lechones, así como la muerte de más de 3/4 de los lechones inoculados.

3. 2 Patogenicidad del virus a diferentes dosis en los lechones

8 lechones de 49 días de edad que eran negativos para anticuerpos de la pseudorrabia se dividieron aleatoriamente en 2 grupos, cada uno con 4 lechones, y se utilizaron adicionalmente 2 lechones más como control. Los grupos experimentales se inocularon con 2 x10⁷⁰TCID⁵⁰/lechón de la cepa PRV HN1201 o 2 x 10⁸⁰TCID⁵⁰/lechón por instilación intranasal, respectivamente, y el grupo de control se inoculó con medio DMEM. Después de la inoculación del virus, se determinó diariamente la temperatura corporal de los lechones, y se observaron los signos clínicos y el estado de la muerte. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Patogenicidad de diferentes dosis de la cepa PRV HN1201 en los lechones

Los resultados demostraron que la inoculación con diferentes dosis de la cepa PRV HN1201 aislada clínicamente en los lechones de 49 días de edad podía conducir de hecho a la aparición de pseudorrabia en los lechones, de los cuales murieron 4/4.

Ejemplo 4

Preparación de la vacuna de PRV desactivada

El cultivo de diferentes pasos de la cepa aislada se inoculó, conforme a la Tabla 4, en un cultivo de células PK-15 para formar un lote de siembra que se inoculó luego en una monocapa de cultivo de células PK al 1% (V/V) de la cantidad del medio de virus de líquido y se puso en una incubadora rotativa a 37°C. El medio celular que contenía virus se cosechó cuando el efecto citopático de las células alcanzó 80%; los virus se cosecharon después de 2 tandas de congelación-descongelación y se evaluó el título de virus. Se añadió solución de formaldehído al 10% (V/V) a diferentes pasos de la solución de virus respectivamente, con una concentración final de 0,2% (V/V). La solución de virus se desactivó a 37°C durante 18 horas, agitando durante 10 minutos cada 4 horas, y se diluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7, 4 hasta el contenido de virus que se muestra en la Tabla 4, se mezcló con adyuvante 206 (SEPPIC, Francia) conforme a la ratio volumétrica de 54:46, y se agitó a 120 rpm durante 15 minutos a 30°C.

Tabla 4. Preparación de cada grupo de vacunas de pseudorrabia

Ejemplo 5

Ensayo de inmunogenicidad de las vacunas desactivadas

16 lechones de 21 días de edad que eran negativos para anticuerpos PRV se dividieron aleatoriamente en 4 grupos, cada uno con 4 lechones, y se inyectaron con vacunas conforme a la Tabla 5. Dos grupos inyectados con vacunas desactivadas se inyectaron con 2 ml/lechón de las vacunas contra la pseudorrabia desactivadas preparadas en el Ejemplo 4. Como vacuna de control, se aplicó la cepa SA215 de vacuna viva preparada utilizando el método descrito en el documento CN101186902 conforme al método para determinación de la inmunogenicidad en la memoria descriptiva de la patente. El grupo de control se inoculó con 2 ml/lechón de medio DMEM.

Tabla 5. Agrupación del ensayo de inmunogenicidad

Después de la inmunización con las vacunas, se determinaron semanalmente los títulos de anticuerpos neutralizantes de los grupos de vacunas desactivadas conforme al método del test de neutralización del suero GB/T18641-2002 Diagnostic Techniques for Aujeszk's Disease. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Títulos de anticuerpos neutralizantes en diferentes momentos en los lechones después de inmunización con vacunas de PRV desactivadas

El resultado de la Tabla 6 indicaba que la inmunización con vacunas PRV desactivadas en los lechones puede producir títulos neutralizantes altos que aumentan con el tiempo de inmunización.

Los lechones se expusieron con 2 x 10⁸⁰TCID⁵⁰/lechón de la cepa PRV HN1201 el día 28 después de la inmunización, se observaron los signos clínicos y el estado de la muerte como se muestra en la Tabla 7. Después de la exposición, se determinó diariamente la temperatura corporal de los lechones como se muestra en la Tabla 8.

Tabla 7. Exposición viral para los lechones después de la inmunización con vacunas de PRV desactivadas

Tabla 8. Cambio de temperatura corporal después de exposición para los lechones inmunizados con vacunas de

PRV

Los resultados de las Tablas 7 y 8 indicaban que la inmunización de los lechones con vacunas PRV desactivadas podía proporcionar un grado de protección de 100% (4/4) a los lechones, aun cuando la infección de virus no pudo evitarse (los lechones presentaban signos clínicos), mientras que todos los lechones en el grupo de control habían muerto el día 4 después de la exposición, por lo que las vacunas de PRV desactivadas pueden proporcionar protección excelente. Adicionalmente, la temperatura corporal de los lechones inmunizados con las vacunas desactivadas aumentaba durante menos tiempo comparada con la vacuna viva como vacuna de control, y aquéllos mantenían también un apetito básicamente normal sin signo clínico alguno, lo que indicaba una protección inmune excelente.

Ejemplo 6

Preparación de la proteína gD de PRV

1. Amplificación del gen gD de PRV

Las células PK-15 perfectamente sanas se inocularon con la cepa PRV HN1201 o cultivo de la misma de diferentes pasos (la cepa de PRV era la cepa HN1201 (virus de la pseudorrabia, cepa HN1201), cuyo número de acceso era CCTCC NO. V 201311; la cepa HN1201 fue depositada en el China Center for Type Culture Collection (CCTCC), cuya dirección era Wuhan University, Wuhan City, Hubei Province) el día 20 de mayo de 2013, y el cultivo de diferentes pasos era el cultivo dentro de 5 ~ 35 pasos. El DNA genómico de PRV se extrajo utilizando el Kit de Extracción de RNA/DNA MiniBEST Viral Ver. 3.0 (TAKARA) después de la recolección de los virus. La amplificación PCR se realizó utilizando 1 pL de DNA genómico como molde y los cebadores específicos de gD siguientes:

gDSF: 5' ATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC 3' y

gDSR: 5' CTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3'.

En la reacción PCR se utilizó la polimerasa de alta fidelidad Prime STAR® HS DNA Polymerase con Tampón GC (TAKARA). Las condiciones de amplificación fueron: 94°C 3 min; 94°C 30 s, 68 °C 90 s, 30 ciclos; 72°C 5 min. El producto PCR se designó gD, cuya secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ No. 4, y la secuencia de aminoácidos pueden deducirse como se muestra en SEQ No. 1.

2. Adquisición e identificación del Bácmido recombinante

El producto PCR, gD obtenido de la amplificación con la polimerasa de alta fidelidad se clonó en el vector pFastBac/HBM-TOPO (Invitrogen, A11339). El sistema de clonación era como sigue: 4 pL producto PCR, gD, 1 pl de solución salina, 1 pl vector TOPO; 6 pl en total. La mixtura se mezcló a fondo y se incubó a la temperatura ambiente durante 5 minutos, después de lo cual se utilizó para transformar células competentes One Shot® Mach1™ T1R. La mezcla de transformación se extendió en placas que contenían ampicilina. Se seleccionó una sola colonia para identificar la direccionalidad de inserción del gen gD, y el plásmido con la direccionalidad de inserción correcta se suministró a Invitrogen para su secuenciación, a fin de comprobar la secuencia correcta. El plásmido con la secuencia correcta se designó pFastBac/HBM-TOPO-gD.

Después de la transformación del plásmido pFastBac/HBM-TOPO-gD en células DH10Bac competentes, se produjo la transposición entre el plásmido pFastBac/HBM-TOPO-gD y el Bácmido plasmídico lanzadera en las células competentes, y el plásmido recombinante resultante se extrajo utilizando el Kit Miniprep de DNA Plasmídico Purelink™ HiPure (Invitrogen), y la inserción de gD se identificó con el cebador pUCM13 directo/pUCM13 inverso. El Bácmido positivo se designó Bacmid-gD.

3. Transfección para la obtención de baculovirus recombinante

Este paso se llevó a cabo basándose en el método proporcionado por las instrucciones del Sistema de Expresión Secretada Bac-to-Bac HBM TOPO (Invitrogen). Se estratificaron 8 x 105 células sf9 en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, se realizó la transfección conforme a las instrucciones del agente de transfección Cellfectin® II después de la adherencia de las células: 8 jL de Cellfectin® II y 1 |jg de DNA Bacmid-gD se diluyeron respectivamente con 100 jL de medio SF-900 II y se mezcló vorticialmente. El DNA diluido se combinó con el agente diluido Cellfectin® II (volumen total ~ 210 jL), se mezcló concienzudamente y se incubó durante 15-30 minutos a la temperatura ambiente. Se añadió luego gota a gota a las células la mixtura de transfección. El sobrenadante del cultivo de células, marcado como baculovirus P0 recombinante vBac-gD, se recogió 72 horas después de la transfección o hasta que fue visible el efecto citopático. El baculovirus P0 recombinante vBac-gD infectó las células sf9, y después de tres tandas de amplificación el baculovirus P3 recombinante resultante vBac-gD se utilizó para expresión de la proteína recombinante.

4. Infección de células High-five con el baculovirus recombinante para expresión de la proteína recombinante El baculovirus recombinante P3 vBac-gD se inoculó en células High-five (Invitrogen, B85502). Se realizó un cultivo de suspensión de células High-five en un matraz Erlenmeyer de 500 ml y las células se inocularon con el virus a una MOI de 1 cuando la densidad de células alcanzó 7,0 x 105 células/ml. El sobrenadante del cultivo de células se recogió 72 horas después de la infección. Se empleó un Sistema de Filtración en Flujo Tangencial (Millipore) para concentrar el volumen hasta 1/10 del original. Se utilizó 1% (V%) de Tritón X-100 (Sigma) para desactivar el baculovirus, y el contenido de proteína determinado por el método de densidad óptica SDS-PAGE era 200 jg/ml.

Ejemplo 7

Preparación de las vacunas subunitarias de PRV

Los antígenos subunitarios preparados en el Ejemplo 6 se diluyeron con PBS (pH = 7,4) hasta los contenidos de proteína indicados en la Tabla 9, se mezclaron con adyuvante 206 (SEPPIC, Francia) a una ratio volumétrica de 54:46, y se agitaron a 120 rpm durante 15 minutos a 30°C.

Tabla 9. Preparación de cada grupo de las vacunas subunitarias de la pseudorrabia

Ejemplo 8

Ensayo de inmunogenicidad de las vacunas en los cerdos

12 lechones de 21 días de edad que eran negativos para anticuerpos PRV se dividieron aleatoriamente en 3 grupos, cada uno con 4 lechones, y se inyectaron con 2 ml/lechón de las vacunas subunitarias contra PRV preparadas en el Ejemplo 7 conforme a la Tabla 10. El grupo de control se inoculó con 2 ml/lechón de medio DMEM.

Tabla 10. Agrupación del ensayo de inmunogenicidad

Los lechones se expusieron con 2 x 10⁸⁰TCID⁵⁰/lechón de la cepa PRV HN1201 el día 28 después de la inmunización, y se observaron los signos clínicos y el estado de la muerte como se muestra en la Tabla 11. Después de la exposición, se determinó diariamente la temperatura corporal de los lechones como se muestra en la Tabla 12.

Tabla 11. Exposición viral para los lechones después de inmunización con las vacunas subunitarias de PRV Grupo Signos clínicos y estado de la muerte Grado de protección

Tabla 12. Cambio de temperatura corporal de los lechones inmunizados con las vacunas subunitarias de PRV después de la exposición

Los resultados de las tablas 11 y 12 indicaban que la inmunización con las vacunas subunitarias de PRV para lechones podría proporcionar un grado de protección de 100% (4/4) a los lechones, aun cuando la infección de virus no podía evitarse (los lechones presentaban signos clínicos), en tanto que todos los lechones de control habían muerto el día 4 después de la exposición, por lo que las vacunas subunitarias de PRV pueden proporcionar una protección excelente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cepa del virus de la pseudorrabia porcina (PRV) que comprende la glicoproteína gD codificada por la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 4;

en donde dicha cepa del virus de la pseudorrabia comprende la glicoproteína gB codificada por la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO. 5; y en donde dicha cepa del virus de la pseudorrabia es la cepa HN1201, cuyo número de acceso es CCTCC NO. V 201311; dicha cepa HN1201 fue depositada en el China Center for Type Culture Collection (CCTCC).

2. Una composición de vacuna, que comprende una cepa del virus de la pseudorrabia porcina desactivada tal como se describe en la reivindicación 1, o una vacuna subunitaria que comprende el antígeno de la proteína gD de la cepa PRV HN1201 tal como se describe en la reivindicación 1, y un adyuvante.

3. La composición de vacuna tal como se describe en la reivindicación 2, en donde dicha composición de vacuna comprende una vacuna desactivada de la cepa PRV HN1201, en una concentración no inferior a 10⁶⁰TCID⁵⁰/ml.

4. La composición de vacuna tal como se describe en la reivindicación 2, en donde dicha composición de vacuna comprende 25-100 pg/dosis de antígeno de la proteína gD de la cepa PRV HN1201.

5. Un método para la preparación de una composición tal como se describe en la reivindicación 2, que comprende los pasos: amplificación y cultivo de la cepa PRV HN1201, desactivación, y mezcladura subsiguiente a fondo con un adyuvante.

6. Un método para la preparación de una composición de vacuna tal como se describe en la reivindicación 2 que comprende los pasos: (1) clonación de dicho gen gD recombinante de PRV; (2) expresión de dicha proteína gD recombinante de PRV; y (3) mezcladura de dicho antígeno de la proteína gD de PRV con un adyuvante y emulsión de la mixtura resultante.

7. La composición de vacuna tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2-4 para su uso en el tratamiento de infección de PRV.