JP2020502080A - 弱毒ブタインフルエンザワクチン並びにその作製および使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、弱毒化ブタインフルエンザ株、特に逆遺伝学アプローチにより生産される株、前記を含む組成物、並びにその生産および使用方法を提供する。

Description

（関連出願の相互引用）
本出願は、米国仮特許出願No. 62／428,062（2016年11月30日に出願され、参照によってその全体が本明細書に含まれる）に対し優先権を主張する。
（参照による取込み）
一切の先行出願およびそれらに引用された、またはそれらの手続き中に引用された全ての文書類（“出願書類引用文書類”）並びに当該出願書類引用文書類に引用または参照された全ての文書類、さらに本明細書に引用または参照された全ての文書類（“本明細書引用文書類”）および本明細書引用文書類に引用または参照された全ての文書類は、本明細書に記載の、または本明細書に参照によって取り込まれた一切の文書類に記載の一切の製品に関する一切の製造業者の指示書、説明書、製品明細書およびプロダクトシートと併せて、参照によって本明細書に含まれ、本発明の実施で利用することができる。本出願におけるいずれのそのような文書類の引用または検証も、そのような文書類が本発明にとって先行技術として利用可能であるということを容認せず、さらにそのような引用特許文書類の有効性、特許性および／または強制力に関する何らの見解も反映しない。GenBankアクセッション番号によって本明細書で参照される全ての配列は参照によってその全体が本明細書に含まれ、さらに前記配列は本出願の出願日現在GenBankで示されている。
（発明の技術分野）
本発明は、全般的には弱毒化ウイルスワクチンに関し、具体的にはブタインフルエンザウイルス（SIV）によって引き起こされる感染／疾患に対して高範囲の安全で効果的な防御をブタ類に提供するワクチンに関する。本発明はさらにまた、弱毒化ウイルスを生産し、試験しさらに放出させる方法に関し、さらにこれらの弱毒化SIVを用いてその必要があるブタ類で防御免疫を引き起こす方法に関する。
（配列表に関する記載）
本出願に関連する配列表は複写紙に代わってテキスト形式で提供され、参照によって本明細書に含まれる。

インフルエンザビリオンは、一本鎖RNAゲノムを含む内部リボヌクレオタンパク質コア（ヘリカルヌクレオキャプシド）、および内側がマトリックスタンパク質（M1）で覆われた外側のリポタンパク質エンベロープを含む。インフルエンザAウイルスゲノムは、8つに分節（セグメント）したマイナスセンスの一本鎖RNA分子から成る。各セグメントはセグメント特異的RNAパッケージングシグナルを有し、それらは5’および3’の両末端で非コード領域および短いコード領域の両方から構成される。8セグメントをもつRNAは11のウイルスタンパク質をコードし、以下を含む：RNA依存RNAポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1およびPA）およびヌクレオタンパク質（NP）（ヌクレオキャプシドを形成する）；マトリックス膜タンパク質（M1、M2）；ヘマグルチニン（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）（ともに表面糖タンパク質であり、脂質含有エンベロープから突き出ている）；非構造タンパク質（NS1）、核外搬出タンパク質（NEP、NS2とも称される）、アポトーシス促進因子PB1-F2。HAはウイルスの細胞結合および侵入に肝要であり、主要な中和抗体の標的であるが、一方、NAは子孫ウイルスの放出で役割を果たし、ウイルス増殖に必須である。ゲノムの転写および複製は核内で生じ、組立ては形質膜上の発芽を介して生じる。

ブタインフルエンザ（SI）は、インフルエンザウイルスA型およびC型によって引き起こされるブタの急性呼吸器疾患である。仔ブタはまたヒトおよびトリの両インフルエンザAウイルスの複製を支持し、異なる宿主に特異的なウイルス間の再集合のための“混合容器”として機能することにより種間伝播で重要な役割を果たすと説明されてきた（Scholtissek, Eur.J.Epidemiol.(1994) 10:455-458）。複数のブタインフルエンザウイルス（SIV）が、ワクチンの利用可能性にもかかわらずブタ集団で循環し続けている。これまでのところ、北米のブタ集団で疾患を引き起こすH1N1、H3N2およびH1N2が優勢なサブタイプである。H3N2サブタイプのSIVは、ヒト、トリおよび古典的ブタウイルスとの間の再集合により生じ急速な進化を遂げて、概ね古典的H1N1 SIVより重篤な疾患を引き起こす。従来のSIVワクチンは複数の抗原性SIV変種に対し防御を示さない。
新規なインフルエンザワクチン株を作製する1つのアプローチは、1つ以上の遺伝子を脱最適化させて、発症させないがその後の病毒性SIVのチャレンジに対して免疫学的応答を惹起する組換え／再集合インフルエンザを作製することであった（例えばUS 2012／026,9849（Research Foundation of the State University of New York）を参照されたい）。しかしながら、このアプローチは、ブタインフルエンザウイルス（SIV）の改変に用いて新規な弱毒化SIVワクチン株を作製する試みには用いられなかった。したがって、ブタインフルエンザ感染の治療および予防の有効策の開発は依然として希求されている。

本発明の1つの目的は、弱毒化ブタインフルエンザウイルス（SIV）、そのウイルスを含む安全で効果的なワクチン、並びにブタインフルエンザウイルス（SIV）によって引き起こされる感染および疾患を治療および予防する方法を提供することである。
いくつかの実施態様では、ワクチンは弱毒化インフルエンザウイルスを含み、前記ウイルスは改変されてあり、当該ウイルスが由来した対応する親株と対比して脱最適化されたコード配列を含む。具体的な実施態様では、安全で効果的なSIVワクチン株は、コドン脱最適化ヘマグルチニン（HA-DO）、ノイラミニダーゼ（NA-DO）、および任意的に非構造（NS-DO）遺伝子のコード配列を保持する。
本発明の別の目的は、本開示にしたがって弱毒化インフルエンザを作製するため逆遺伝学系で使用されるcDNAおよび／またはプラスミドを提供することである。ある実施態様では、cDNAおよび／またはプラスミドは以下を含む：配列番号:22、29、35または105に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有する脱最適化HA配列；配列番号:25、32または38に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有する脱最適化NA；並びに任意的に配列番号:27と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有する脱最適化NS配列。
概して、脱最適化HA、NA（および任意的にNS1）SIVコード配列を用いる再集合体SIVの作製によって、当該HA、NA（および任意的にNS1）配列が由来した病毒性野生型株と比較したとき、弱毒化された病毒性を有する再集合体が得られる。

本発明はさらにまたSIVの新規な弱毒化株に関し、前記弱毒化株は、親のH1N1、H1N2およびH3N2 SIV株と対比して安全で効果的でかつ広範囲の防御免疫（交差防御性免疫を含む）を提供する。
したがって、本発明は、野生型／親ウイルスと対比して、1つ以上のSIV HA、NA（および任意的にNS1）核酸配列にサイレント変異を含む変異ブタインフルエンザウイルスを提供し、前記変異は、親ウイルスと対比して変異／再集合体ウイルスを弱毒化させる。いくつかの実施態様では、親SIVは野生型H1N1、H1N2およびH3N2 SIV株由来のSIV HA、NAおよびNS1核酸分子を含み、各配列は野生型HA、NA（および任意的にNS1）コード配列を含む。他の実施態様では、親SIVは、合成弱毒化または天然弱毒化H1N1、H1N2およびH3N2 SIV株由来のSIV HA、NAおよびNS1核酸分子を含み、各配列は非野生型HA、NA（および任意的にNS1）コード配列を含む。
したがって、本発明の重要な目的は弱毒化再集合体SIVを提供することであり、この弱毒化再集合体SIVは、HA、NA（および任意的にNS1）コード配列の脱最適化バージョンに加えてSIV内部遺伝子の基本セットを含む。
したがって、出願人らは本明細書で初めて、脱最適化HA、NAおよび任意的にNS1コード配列の種々のセットを、TRIGバックボーンのH1N1 SIV M、NP、PA、PB1、PB2（および任意的にNS）配列の同じコアセットと一緒にして安全で効果的な再集合体弱毒化SIVワクチン株を作製できることを開示する。
本発明はさらにまた、インフルエンザに対する免疫学的（若しくは免疫原性）または防御性応答を誘発する方法とともに、インフルエンザまたはインフルエンザによって引き起こされる症状を治療若しくは予防する方法を提供し、前記方法は、弱毒化ウイルスまたは弱毒化ウイルスを含む組成物をその必要がある動物に投与する工程を含む。
少なくとも弱毒化インフルエンザ株および使用のための指示を含むキットもまた提供される。
これらの実施態様およびその他の実施態様は、下記の詳細な説明によって開示されまたは明瞭であり、さらに当該説明に包含される。
本発明の完全でかつ当業者の実施を容易にする開示（本発明の最良の態様を含む）は、添付図面の参照を含む本明細書のこの後の部分でより詳細に示される。添付図面は以下のとおりである。

グループ（1＝vSIV01、2＝vSIV02、3＝vSIV05、4＝vSIV06、5＝コントロール）による包括的％硬化を示すグラフである。 本出願で開示される配列を説明する表である。 感染性再集合体である、逆遺伝学作製ブタインフルエンザウイルス（rgSIV）の作製用に遺伝子セグメントを運ぶために用いられるpHW2000クローニングベクターのマップである。 pHW2000の構築の模式図であり、合成pHW2000クローニング領域およびpcDNA3.1／V5-His Bプラスミドから始まる。 HAセグメント（H1サブタイプ）の3’UTR／シグナル配列およびトランスメンブレン／テールドメイン／5’UTRのPCRアンプリコンを示す。 HAセグメント（H1N2-DO）の3’UTR、シグナル配列（SS）、トランスメンブレンドメイン（TMD）、細胞質テールドメイン（CTD）、および5’UTRを含む配列（配列番号:103）のグラフマップを示す。 pHW2000-H1 SP-TMキメラのクローニングの模式図を示す。 H3エクトドメインPCRアンプリコン（下線部）のヌクレオチド配列である。 pHW2000-HA-DO（H1-H3キメラ）作製のためのクローニング模式図を示す。 pHW2000-HA-DO（H1-H3キメラ）（配列番号:105）のヌクレオチド配列を示す。 チャレンジ後のワクチン免疫動物のグループ平均体温を示すグラフである。 チャレンジ後に治療グループでおよび日毎に観察された呼吸器スコアの発生を示すグラフである。 チャレンジ後に観察された治療グループの毎日の総抑うつスコアを示すグラフである。 グループおよび日にちによるSIV ELISAの結果を示すグラフである。 グループによる包括的％硬化によって示されるチャレンジ後の肺病巣スコアを示す箱ひげ図である。

本発明は、微生物（例えばウイルス、例えばインフルエンザ）の弱毒化に関与するヌクレオチド配列および遺伝子、当該ヌクレオチド配列によってコードされる生成物（例えばタンパク質、抗原、免疫原、エピトープなど）、そのようなヌクレオチド配列、生成物、微生物を生産する方法、並びにその使用（例えばワクチン若しくは免疫原性組成物を調製するため、または免疫学的応答若しくは免疫応答を惹起するため使用、またはベクター、例えば発現ベクター（例えばin vitroまたはin vivo発現ベクター）としての使用）を提供する。
微生物のヌクレオチド配列および遺伝子に導入される変異は、新規で非自明の弱毒化変異体を生じる。これらの変異体は、高度の免疫原性を有する生弱毒化免疫原性組成物または生弱毒化ワクチンの生産に有用である。
変異の同定は、新規で非自明のヌクレオチド配列および遺伝子とともに、当該ヌクレオチド配列および遺伝子によってコードされる新規で非自明の遺伝子生成物を提供する。
本発明は部分的には、本開示の弱毒化SIVでワクチン免疫し続いて病毒性H1N2 SIVでチャレンジしたブタは、非ワクチン接種ブタと比較して、肺病巣および気道からのウイルス排出の有意な減少を示すという注目すべき観察に基づく。これまでに承認された市場の不活化製品は完全には伝播を防止しないので、本チームは、LAIVワクチンを追加の制御手段と併せてブタで使用して排出、伝播および動物から人間への漏出を制限することを含む新規な制御策の導入を推奨する。そのような方策はブタが次の大流行の源となるリスクを最小限にするであろう。

いくつかの実施態様では、本発明は、病気の漏出／伝播を軽減させる弱毒化SIVの能力を評価する新規なモデルを提供する。いくつかの実施態様では、動物は、本開示のもう1つの弱毒化SIVでワクチン免疫される。動物が防御免疫を発達させるために十分な期間が経過した後、動物を病毒性SIV株の有効量でチャレンジすることができる。典型的には、投与されるチャレンジ株の量は、ワクチン免疫動物でコントロール／擬似ワクチン免疫動物と対比して防御免疫（異種防御免疫を含む）をワクチンが引き出したか否かを当業者が決定し得るために十分である。
いったん動物をチャレンジしたら、それらを歩哨動物の近くに配置して、ワクチン免疫がSIV伝播から歩哨動物を防御する程度を評価できる。いくつかの実施態様では、ワクチン免疫動物およびコントロール動物を歩哨動物グループと十分に近接して配置することができる。したがって、動物が十分な量のウイルスを排出している場合、歩哨動物は暴露されて感染するであろう。ワクチン免疫動物および歩哨動物の各グループは、ワクチン免疫動物の1つのグループと一緒に収容された歩哨動物が、別のグループのワクチン免疫動物またはコントロールによって排出されたチャレンジウイルスに暴露されないように互いに物理的に隔離することができる。
ある実施態様では、本発明は、インフルエンザまたはインフルエンザによって引き起こされる疾患に対して安全で効果的な免疫応答をブタに提供することができる弱毒化ブタインフルエンザウイルス（SIV）株を提供する。

いくつかの実施態様では、脱最適化配列は以下を提供することによって作製される：配列番号:21、28または34に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％配列同一性を有する野生型HA配列、配列番号:24、31または37に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％配列同一性を有する野生型NA配列、および任意的に配列番号:1に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％同一性を有する野生型NS1配列。いくつかの実施態様では、これらの野生型配列は、野生型の病毒性H1N1、H1N2またはH3N2 SIV株と同一である。
具体的な実施態様では、変異ウイルスは、以下に対応する（すなわち逆相補性であり、チミジンの代わりにウラシルを有する）vRNA核酸配列を含む：配列番号:22、29、35または105（HA-DO）；配列番号:25、32または38（NA-DO）；および任意的に配列番号:27（NS₁-DO）に示される脱最適化DNA配列。前記vRNA核酸配列は、病毒性の野生型／親ウイルスと対比して弱毒化／非病毒性である変異ウイルスを生じる。
いくつかの実施態様では、残りのSIV遺伝子セグメント（すなわちM、NP、PA、PB1、PB2および任意的にNS）は野生型コード配列を含む。具体的な実施態様では、野生型（すなわち非脱最適化）配列はH1N1 SIV M、NP、PA、PB1、PB2（および任意的にNS）配列である。

いくつかの実施態様では、H1N1 NS1野生型コード配列は、配列番号:1に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、NS1野生型コード配列は配列番号:1に示される配列を含む。
いくつかの実施態様では、H1N1 M1野生型コード配列は、配列番号:3に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、M1野生型コード配列は配列番号:3に示される配列を含む。
いくつかの実施態様では、H1N1 M2野生型コード配列は、配列番号:5に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、M2野生型コード配列は配列番号:5に示される配列を含む。
いくつかの実施態様では、H1N1 NP野生型コード配列は、配列番号:9に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、NP野生型コード配列は配列番号:9に示される配列を含む。
いくつかの実施態様では、H1N1 PA野生型コード配列は、配列番号:13に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、PA野生型コード配列は配列番号:13に示される配列を含む。
いくつかの実施態様では、H1N1 PB1野生型コード配列は、配列番号:15に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、PB1野生型コード配列は配列番号:15に示される配列を含む。
いくつかの実施態様では、H1N1 PB2野生型コード配列は、配列番号:17に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、PB2野生型コード配列は配列番号:17に示される配列を含む。

他の実施態様では、非脱最適化コード配列はまたH1N2またはH3N2 SIV株から入手することができる。例えば、HA、NA（および任意的にNS1）コード配列は、脱最適化前に配列番号:40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74または76に示される配列を含むことができる。さらにまた、基本株（すなわち“野生型” H1N1、H1N2またはH3N2 SIV株）はまたそれ自体、それらのより病毒性の親株の合成弱毒化または天然弱毒化バージョンであってもよい。
別の特徴では、本発明は上記で詳述した弱毒化インフルエンザ株を含む免疫学的組成物を提供する。ある実施態様では、組成物はさらにまた医薬的若しくは獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含む。
いくつかの実施態様では、免疫学的組成物はその貯蔵能力を改善するために多様な成分を含むことができる。ワクチンは、例えば加速安定性試験を用いて処方および試験することができる。いくつかの実施態様では、以下の成分組み合わせを用いて、本発明の安定なワクチン処方物を生産することができる：
−シュクロース、リン酸緩衝剤、グルタミン酸、ウシ血清アルブミン；
−ダイズペプトン、デキストラン70、グルタミン酸、シュクロース；
−ゼラチン、カゼイン水解物、シュクロース；
−デキストラン40、ソルビトール、カゼイン水解物、シュクロース。
したがって、いくつかの実施態様では、適切なポリマーは、デキストラン40、デキストラン70、PEG、ポビドン、または前記の組合せを含むことができる。適切な動物タンパク質には、カゼイン水解物、ゼラチン、ウシ血清アルブミン（BSA）、ラクトアルブミン水解物が含まれ、さらに非動物性タンパク質にはダイズペプトンが含まれ得る。適切な炭水化物成分にはシュクロース、ラフィノース、ラクトースが含まれ、さらに適切な緩衝剤にはリン酸およびヒスチジンが含まれ得る。いくつかの有益な処方成分には、PEGおよびポビドン、ラクトアルブミン水解物、ラフィノースおよびラクトース、並びにヒスチジンが含まれる。

いくつかの実施態様では、免疫学的組成物は以下の安定化成分のいずれかまたは全てを含むことができる：約0.1から約2.5％のポリマー増量剤（例えばデキストラン、PEG、ポビドンなど）、約0.1から約4.5％の糖アルコール（例えばソルビトール、マンニトールなど）、約0.1から約2.5％の動物タンパク質（例えばカゼイン水解物、ゼラチン、BSA、LAHなど）、約0.1から約2.5％の植物タンパク質（例えばダイズペプトンなど）、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、約1.0から約7.5％の炭水化物（例えばラクトース、ラフィノース、シュクロース、前記の組合せなど）。
いくつかの実施態様では、免疫学的組成物は以下の成分（各々は組成物のw／v（g／100mL）で表されている）を含むことができる：
−約0.5から約1.0％の第一のタンパク質タイプ、約0.5から約1.0％の第二のタンパク質タイプ、および約2.0から約5.0％の非還元糖；
−約0.5から約1.0％のゼラチン、約0.5から約1.0％のカゼイン水解物（CH）、および約2.0から約5.0％のシュクロース；
−約1.0から約2.0％のポリマー、約1.0から約2.0％の非動物性タンパク質、約0.25から約0.5％のグルタミン酸塩、および約2から約5％の非還元糖；
−約1.0から約2.0％のデキストランポリマー、約1.0から約2.0％のダイズペプトン、約0.25から約0.5％のL-グルタミン酸一カリウム塩、約2％から約5％のシュクロース；
−約1.0から約2.0％のBSA、約0.05％のKH₂PO₄、約0.14％のK₂HPO₄、約0.03％から約0.1％のグルタミン酸塩、および約2から約5％のシュクロース；
−約1.2から約2.4％のデキストランポリマー、約1.2から約2.4％のソルビトール、約0.6から約1.2％のCH、約0.75から約1.5％のゼラチン、約0.15から約0.31％のKH₂PO₄、約0.0375から約0.075％のK₂HPO₄、および約2から約5％のシュクロース。

ある実施態様では、組成物は、病毒性ブタインフルエンザのチャレンジに対して防御免疫応答をブタ類で提供する。防御は同種性、異種性または両方であり得る。いくつかの実施態様では、組成物はさらにまた、ブタインフルエンザ以外の他の病原体に関連する少なくとも1つの追加抗原を含む。
別の実施態様では、当該少なくとも1つの追加の抗原は、マイコプラズマ・ヒオニューモニアエ（M.ヒオ（M. hyo））、PCV2、PRRSV、SIV、またはブタ類で感染および病気若しくは病気に対する感受性を生じることができる他の病原体、または前記の組合せから選択される。
いくつかの実施態様では、組合せは三価H1N1、H1N2およびH3N2ワクチン組成物を含む。そのような組成物は、若いブタに例えば鼻内ルートを介して投与することができる。他の組合せには、粘膜投与用粉末処方の1用量MLV、ブタのすぐそばで再構成されるマルチ用量サシェ提示物、およびコドン脱最適化M2遺伝子陰性SIV組成物が含まれる。
ある実施態様では、本発明は動物をワクチン免疫する方法を提供し、前記方法は弱毒化SIV組成物の少なくとも1回の投与を含む。別の実施態様では、ブタ類は、分娩前約3週間から約6週間の雌ブタまたは未経産ブタである。さらに別の実施態様では、得られた仔ブタは、非ワクチン免疫雌ブタから生じた仔ブタと比較して軽減罹患率および／または死亡率を有し得る。他の実施態様では、ワクチン免疫される動物は仔ブタである。仔ブタは任意の齢（約1日齢から約30日齢を含む）であり得る。いくつかの実施態様では、仔ブタは約1日齢から約2−4週齢である。

ある実施態様では、本発明はインフルエンザウイルスを調製する方法を提供し、前記方法は、感染性インフルエンザウイルスを得るために有効な量で本発明の組成物と細胞を接触させる工程を含む。前記方法は、さらにまたウイルスを単離する工程を含むことができる。
別の実施態様では、本発明は遺伝子デリバリービヒクルを調製する方法を提供し、前記方法は、インフルエンザウイルスを得るために有効な量で本発明の組成物と細胞を接触させる工程およびウイルスを単離する工程を含む。本発明はさらにまた、本発明の組成物と接触させた細胞を提供する。
ある実施態様では、本発明は、弱毒化ブタインフルエンザの生産のために複数のベクターを含む脊椎動物細胞を提供する。前記ベクターは、インフルエンザウイルスHA、NA（および任意的にNS1）のコード配列、に作動できるように連結されたプロモーターを含むベクターを含み、ここでHA、NA（および任意的にNS1）コード配列は、病毒性親SIV株に存在する非脱最適化HA、NAおよびNS1コード配列と対比して脱最適化されたコドンである。
本発明はさらにまた遺伝子生成物を包含し、前記生成物は抗原、免疫原およびエピトープを提供し、単離された遺伝子生成物として有用である。
そのような単離された遺伝子生成物はまた、そのエピトープとともに抗体の生成に有用であり、前記抗体は診断への適用で有用である。
そのような遺伝子生成物（エピトープ、抗原または免疫原を提供または生成することができる）はまた、ワクチンとともに免疫原性または免疫学的組成物のために有用である。

ある特徴では、本発明はヌクレオチド配列または遺伝子に弱毒化させる変異を含むウイルスを提供し、ここで当該変異は遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質の生物学的活性を改変し、当該ウイルスの病毒性の弱毒化を生じる。
特に、本発明は、弱毒化ブタインフルエンザ株および前記弱毒化ブタインフルエンザ株を含むワクチン（動物で免疫原性応答を惹起する）、特にブタ類で応答を引き出し、誘発しまたは刺激する弱毒化ブタインフルエンザ株を包含する。
特に、問題のブタインフルエンザ弱毒化株は、野生型病毒性親株と対比して遺伝子に病毒性に関連する変異を有する。本開示の変異を有する株に加えて、開示の病毒性遺伝子に変異をいくつも有する弱毒化株を本発明の実施に用いることができることは理解される。
別の特徴では、新規な弱毒化再集合体ブタインフルエンザ株は、ブタインフルエンザおよびブタインフルエンザによって引き起こされる感染／疾患に対する安全で有効なワクチンに処方される。
ある実施態様では、ブタインフルエンザワクチンはさらにまたアジュバントを含む。具体的な実施態様では、アジュバントは粘膜用アジュバント、例えばキトサン、メチル化キトサン、トリメチル化キトサン、または前記の誘導体若しくは組合せである。
ある実施態様では、アジュバントは細菌全体および／またはウイルスを含み、以下が含まれる：H.パラスイス（H.parasuis）、クロストリジウム、ブタインフルエンザウイルス（SIV）、ブタシルコウイルス2（PCV2）、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）、マンヘイミア、パスツレラ、ヒストフィルス、サルモネラ、大腸菌（Escherichia coli）、または前記の組合せおよび／または変種。いくつかの実施態様では、アジュバントはIgM、IgG、IgA、および／または前記の組合せの動物における産生を増加させる。

本明細書で用いられるように、“遺伝子”は広い意味で用いられ、コードおよび非コード配列（すなわち上流および下流調節配列、プロモーター、5’／3’UTR、イントロンおよびエクソン）を包含するであろう。遺伝子のコード配列のみを指すことが意図される場合には、“遺伝子のコード配列”または“CDS”という用語が本開示全体にわたって互換的に用いられるであろう。具体的な核酸、例えば配列番号:17に示される配列（親ウイルスcRNA“センス”鎖のDNA配列等価物）が議論されるとき、当業者は直ちにその配列の全ての誘導可能な形態（mRNA、vRNA、cRNA、DNA、タンパク質など）を思い浮かべるであろう。例えば、インフルエンザウイルスはマイナス一本鎖RNAウイルス（ssRNA）である。複製のために、そのマイナスssRNA（本明細書では“vRNA”と定義される）はプラスまたはセンスRNA（本明細書では“cRNA”と定義される）に転写されねばならない。宿主細胞機構はcRNAを用いるために接収されて、ウイルスタンパク質およびvRNAを生成する。当業者は周知の遺伝暗号を用いて、日常的にDNA配列からvRNA、cRNAおよびペプチド配列を誘導することができる。
本明細書で用いられるように、“野生型”は、配列または株がそれが天然から単離されたときと同じ遺伝子配列を含むことを意味することが意図される。例えば、ウイルス感染動物の細胞、組織または器官から回収された“野外単離株”は“野生型”ウイルスである。これらの野外単離株内に含まれる遺伝子セグメントは野生型ポリヌクレオチド配列を含み、前記配列は野生型ポリペプチドをコードする。“非野生型”株および配列は、遺伝子工学技術を用いるか、または細胞、組織若しくは器官で野生型若しくは改変ウイルスを連続的に継代することによって改変されてある株および配列である。細胞継代は弱毒化ウイルスを生成する周知の技術である。

“抗原”または“免疫原”とは、特異的な免疫応答を宿主動物で誘発する物質を意味する。抗原は以下を含むことができる：全生物（殺滅、弱毒化または生）；生物のサブユニットまたは部分；免疫原性特性を有する挿入物を含む組換えベクター；宿主動物に提示したとき免疫応答を誘発することができるDNA片またはフラグメント；ポリペプチド、エピトープ、ハプテンまたは前記の任意の組合せ。また別に、免疫原または抗原は毒素または抗毒素を含むことができる。
“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”および“ポリペプチドフラグメント”という用語は、本明細書では互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。当該ポリマーは直鎖状または分枝していてもよく、改変アミノ酸またはアミノ酸アナローグを含むことができ、さらにアミノ酸以外の化学的部分によって中断されていてもよい。当該用語はまた、天然にまたは介入（例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作若しくは改変、例えば標識若しくは生物活性成分との結合）によって、改変されてあるアミノ酸ポリマーを包含する。
本明細書で用いられる“免疫原性または抗原性ポリペプチド”という用語は、いったん宿主に投与されたら、当該タンパク質に対向する液性および／または細胞性タイプの免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性なポリペプチドを含む。好ましくは、当該タンパク質フラグメントは、タンパク質全体と実質的に同じ免疫学的活性有する。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは、少なくとも1つのエピトープまたは抗原決定基を含むか、本質的に前記から成るか、または前記から成る。本明細書で用いられる“免疫原性”タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質の完全長配列、そのアナローグ、またはその免疫原性フラグメントを含む。“免疫原性フラグメント”とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載の免疫学的応答を惹起するタンパク質のフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、当業界で周知の多数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば以下を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66（Glenn E.Morris, Ed., 1996）。例えば線状エピトープは、例えば固体支持体上で多数のペプチド（当該タンパク質分子の複数の部分に対応する）を同時に合成し、当該ペプチドが支持体に付着している間に当該ペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。そのような技術は当業界で公知であり、例えば以下に記載されている：U.S.Pat.No.4,708,871；Geysen et al., 1984；Geysen et al., 1986。同様に、立体的エピトープは、例えばX線結晶学および二次元核磁気共鳴によってアミノ酸の空間配座を決定することによって容易に同定される。例えば上掲書（Epitope Mapping Protocols）を参照されたい。T.パルバ（T.parva）のタンパク質に特に応用可能な方法がPCT／US2004／022605（参照によってその全体が本明細書に含まれる）に完全に記載されている。

本明細書で考察されるように、本発明は当該抗原性ポリペプチドの活性なフラグメントおよび変種を包含する。したがって、“免疫原性または抗原性ポリペプチド”という用語はさらにまた当該配列に対する欠失、付加および置換を意図するが、ただし当該ポリペプチドの機能が本明細書に定義する免疫学的応答を生じることを条件とする。“保存的変動”という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による交換、または核酸配列中のヌクレオチドの交換であってコードされるアミノ酸残基が変化しないか、または別の生物学的に類似する残基である交換を指す。これに関して、特に好ましい置換は一般的には本質的に保存的で、すなわち1つのアミノ酸ファミリー内で生じる置換であろう。例えば、アミノ酸はおおむね以下の4つのファミリーに分けられる：（1）酸性-−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（2）塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（4）非荷電極性--グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンはときに芳香族アミノ酸として分類される。保存的変動の例には以下が含まれる：1つの疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）による別の疎水性残基の置換；または1つの極性残基による別の極性残基の置換（例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、またはグルタミンによるアスパラギンの置換など）；または生物学的活性に大きな影響を与えない構造的に関連するアミノ酸によるあるアミノ酸の同様な保存的交換。対応分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、当該タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない小さなアミノ酸置換を有するタンパク質は、したがって対応ポリペプチドの定義内である。これらの分子によって生成されるポリペプチドはいずれも本明細書に含まれる。“保存的変動”という用語はまた、非置換親のアミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用を含むが、ただし当該置換ポリペプチドに対して生じた抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応することを条件とする。

“エピトープ”という用語は、特異的なB細胞および／またはT細胞が応答する抗原またはハプテン上の部位を指す。当該用語はまた、“抗原決定基”または“抗原決定部位”と互換的に用いられる。同じエピトープを認識する抗体は、1つの抗体がある標的抗原に対する別の抗体の結合を封鎖する能力を示す簡単な免疫アッセイで同定され得る。
ある組成物またはワクチンに対する“免疫学的応答”は、問題の組成物またはワクチンに対する細胞性および／または抗体媒介性免疫応答の宿主における発達である。通常、“免疫学的応答”には以下の作用の1つ以上が含まれる（ただしこれらに限定されない）：問題の組成物またはワクチンに含まれる1つの抗原または複数の抗原に特異的に向けられる抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、および／または細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は、新規な感染に対する耐性が強化され、および／または当該疾患の重篤度が軽減されるような治療性または防御性免疫学的応答を示す。そのような防御は、感染宿主によって通常示される症状および／または臨床徴候の緩和または欠如、より迅速な回復期間、および／または感染宿主内のウイルス力価の低下によって示されるであろう。
“動物”によって哺乳動物、鳥類などが意図される。本明細書で用いられる動物または宿主には哺乳動物および人間が含まれる。動物は、ウマ類（例えばウマ）、イヌ類（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ類（例えばライオン、トラ、イエネコ、野生ネコ、他の大型のネコ、およびチーターおよびオオヤマネコを含む他のネコ類）、ヒツジ類（例えばヒツジ）、ウシ類（例えば畜牛）、ブタ類（例えばブタ）、トリ（例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリ）、霊長類（例えば原猿類、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿）、フェレット、アザラシおよび魚類から選択できる。“動物”という用語はまた発達の全段階（新生児期、胚性期および胎児期を含む）の個々の動物を含む。

特段の説明がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は、本開示が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。単数用語“a”、“an”および“the”は、文脈が明瞭にそうでないことを示さないかぎり複数の対応語を含む。同様に、“or”という語は、文脈が明瞭にそうでないこと示さないかぎり“and”を含むことが意図される。
本開示で特に請求項および／または文節中で、例えば“comprises（含む）”、“comprised”、“comprising”などという用語は、米国特許法で前記用語が帰属する意味を有することは留意されるべきである。例えばそれら用語は、“includes（含む）”、“included”、“including”などを意味することができる。さらに例えば“consisting essentially of”および“consists essentially of”という用語は米国特許法でこれらの語に割り当てられた意味を有し、例えば、それらは明瞭に記載されない成分を許容するが、先行技術で見出されまたは当該発明の基本的な若しくは新規な特徴に影響を及ぼす成分を排除する。
本明細書で用いられる“about（約）”という用語は、およそ、〜の範囲、おおざっぱに、または周辺を意味する。“約”という用語が数字の範囲と一緒に用いられるとき、前記用語は、示された数値の上下の境界を広げることによって当該範囲を修正する。概して、“約”という用語は、本明細書では記載の値の上下10％の変動によって数値を修正するために用いられる。ある特徴では、“約”という用語は、当該用語とともに用いられている数のプラスまたはマイナス20％の数値を意味する。したがって、約50％は45％−55％の範囲を意味する。本明細書でエンドポイントによって示される数字の範囲は、当該範囲内に包含される全ての数および部分を含む（例えば1から5は1、1.5、2、2.75、3、3.90、4および5を含む）。全ての数およびその部分は“約”という用語によって修正されると推定できることは理解されよう。

組成物
本発明はブタインフルエンザワクチンまたは組成物に関し、前記組成物は、弱毒化ブタインフルエンザ株および医薬的または獣医的に許容できる担体、賦形剤、またはビヒクルを含むことができ、動物で応答を引き出し、誘発し、または刺激する。
“核酸”および“ポリヌクレオチド”という用語は、直鎖状または分枝する一本鎖若しくは二本鎖、またはそのハイブリッドのRNAまたはDNAを指す。当該用語はまた、RNA／DNAハイブリッドを包含する。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチド）およびヌクレオチドアナローグ、ウラシル、他の糖および結合基（例えばフルオロリボースおよびチオレート）、並びにヌクレオチド分枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列はさらにまた、重合後に標識成分と例えば複合化によって改変され得る。本定義に含まれる他のタイプの改変は、キャップ、天然に存在するヌクレオチドの1つ以上のアナローグによる置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチドまたは固体支持体に結合させるための手段の導入である。ポリヌクレオチドは化学合成によって入手されかまたは微生物から誘導され得る。
“遺伝子”という用語は広範囲に用いられて、生物学的機能と密接に関連する任意のポリヌクレオチドセグメントを指す。したがって、遺伝子はゲノム配列のようにイントロンおよびエクソンを含むか、またはcDNAのように単にコード配列を含むか、および／またはそれらの発現に要求される調節配列を含む。例えば、遺伝子はまた、mRNAまたは機能的RNAを発現するか、または特定のタンパク質をコードする核酸フラグメントを指し、前記は調節配列を含む。

“単離された”生物学的成分（例えば核酸またはタンパク質または細胞内小器官）は、当該成分が天然に存在する生物の細胞内の他の生物学的成分（例えば他の染色体並びに染色体外DNAおよびRNA、タンパク質、並びに細胞内小器官）から実質的に分離されてあるかまたは精製されてある成分を指す。“単離され”てある核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。当該用語はまた、化学的合成とともに組換え技術によって調製された核酸およびタンパク質を包含する。
“保存的変動”という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による交換、または核酸配列中のヌクレオチドの交換であってコードされるアミノ酸残基が変化しないか、または別の生物学的に類似する残基である交換を指す。これに関して、特に好ましい置換は一般的には上記に記載したように本質的に保存的である。
“組換え体”という用語は、天然には存在しない、または天然には見出されない配置で別のポリヌクレオチドに連結される、半合成若しくは合成起原のポリヌクレオチドを意味する。
“異種”は、比較されている実体の残余部が遺伝的に別個の実体に由来することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、遺伝子工学技術によって異なる供給源に由来するプラスミドまたはベクターに挿入することができ、当該ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。本来のコード配列から取り出され、本来の配列以外のコード配列に作動的に連結されたプロモーターは異種プロモーターである。
本発明のポリヌクレオチドは、追加の配列、例えば同じ転写ユニット内の追加のコード配列、制御エレメント（例えばプロモーター）、リボソーム結合部位、5’UTR、3’UTR、転写終了因子、ポリアデニル化部位、同じ若しくは異なるプロモーターの制御下にある追加の転写ユニット；クローニング、相同組換え、および宿主細胞の形質転換を可能にする配列；および本発明の実施形態を提供するために所望され得る任意の構築物を含むことができる。

使用方法および製品
本発明は以下の実施形態の方法を含む。ある実施態様では、弱毒化ブタインフルエンザ株および医薬的若しくは獣医的に許容できる担体またはビヒクルを含む組成物を動物に投与する工程を含む、動物をワクチン免疫する方法が開示される。本実施態様のある特徴では、当該動物はブタ類である。
本発明のある実施態様では、プライム-ブーストレジメンを利用することができる。前記レジメンは、少なくとも1回の主投与および少なくとも1回のブースター投与で構成され、少なくとも1つの共通のポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を使用する。典型的には、主要投与で用いられる免疫学的組成物またはワクチンは、ブースターとして用いられるものと本質的に相違する。しかしながら、同じ組成物を主要投与およびブースター投与として用いてもよいことは留意される。この投与プロトコルは“プライム-ブースト”と呼ばれる。
プライム-ブーストレジメンは、少なくとも1回のプライム投与および少なくとも1回のブースト投与を含み、少なくとも1つの共通のポリペプチドおよび／またはその変種またはフラグメントを使用する。プライム投与で用いられるワクチンは、後のブースターワクチンとして用いられるものと本質的に相違することができる。プライム投与は1回以上の投与を含むことができる。同様にブースト投与も1回以上の投与を含むことができる。
いくつかの実施態様では、プライムワクチン免疫は、本開示の再集合体弱毒化SIVワクチン処方物の1つを用いて実施することができる。そのような実施態様では、ブーストは同じ弱毒化SIVワクチン処方物を用いて実施するか、または異なる弱毒化SIVワクチン処方物を用いて実施することができる。他の実施態様では、プライムワクチン免疫は自原性ワクチン（すなわちブタ類集団で現在循環している株をベースにするかそれらに由来するワクチン）を用いて実施できる。そのような実施態様では、ブーストワクチン免疫は、同じ自原性ワクチンまたは本明細書に開示する1つ以上の弱毒化SIVワクチン処方物を用いて実施することができる。プライムおよびブーストの他の効果的な組合せは、本発明がこれまで開示されてきたので当業者には容易に明らかとなろう。

標的種が哺乳動物である組成物の一回分用量の体積、例えばブタまたはブタ類組成物（ウイルス抗原を基剤にする）の一回分用量の体積は、概ね約0.1から約2.0mL、約0.1から約1.0mL、約0.5から約1.0mLである。
ワクチンの有効性は、最後の免疫後約2から4週間に動物（例えばブタ類）をブタインフルエンザ病毒株でチャレンジすることによって試験できる。同種および異種株をチャレンジに用いてワクチンの有効性が試験される。IMまたはSC注射、スプレー（鼻内、眼内、気管内、および／または経口的）によって動物をチャレンジすることができる。チャレンジの前後に関節、肺臓、脳、および／または口からサンプルを収集し、ブタインフルエンザ特異的抗体の存在について分析することができる。
プライム-ブーストプロトコルで用いられる本発明の弱毒化ウイルス株を含む組成物は、医薬的または獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤または賦形剤中に含まれている。本発明のプロトコルはブタインフルエンザから動物を防御し、および／または感染動物における疾患の進行を予防する。
好ましくは、多様な投与が1から6週間離して実施される。具体的な実施態様では、時間間隔は約3から約5週間である。より具体的な実施態様では、間隔は約4週間であり、年に1回のブースターもまた想定される。ブタ類は最初の投与時に少なくとも約3−4週齢であるか、または1日齢でさえ可能である。
いくつかの実施態様では、開示の弱毒化SIVワクチン処方物は各妊娠期間中に投与できる。したがって、いくつかの実施態様では、雌ブタは1年に約2から約3回ワクチン免疫することができる（すなわち、プライム-ブーストワクチン免疫レジメンを用いる事例では1年に約4から約6回）。雌ブタに特に有用な投与ルートは筋肉内（IM）である。
本明細書の開示は例示として提供され、本発明はそれらに限定されないことは当業者には理解されるべきである。本明細書の開示および当業界の知識から、当業者は投与回数、投与ルート、およびそれぞれの注射プロトコルで用いられる用量を煩瑣な実験を実施することなく決定することができる。

本発明の別の実施態様は、動物でブタインフルエンザに対して免疫学的または防御性応答を引き出しまたは誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、弱毒化ブタインフルエンザ免疫学的組成物またはワクチンおよび動物で免疫応答を惹起するために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示書を含む。
本発明の別の実施態様は、動物でブタインフルエンザに対して免疫学的または防御性応答を惹起する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本発明の弱毒化ブタインフルエンザ株および免疫応答を動物で惹起するために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示書を含む。
本発明のさらに別の特徴は、上記に記載の本発明のプライム-ブーストワクチン免疫のためのキットに関する。当該キットは、以下の少なくとも2つのバイアルを含むことができる：第一のバイアルは、本発明のプライムワクチン免疫のためのワクチンまたは組成物を含み、第二のバイアルは本発明のブーストワクチン免疫のためのワクチンまたは組成物を含む。有利には、当該キットは追加の第一または第二のバイアルを、追加のプライムワクチン免疫のためおよび追加のブーストワクチン免疫のために含むことができる。
医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体またはビヒクルまたは賦形剤は当業者には周知である。例えば、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体またはビヒクルまたは賦形剤は、0.9％NaCl（例えば生理食塩水）溶液またはリン酸緩衝液であり得る。本発明の方法に用いることができる他の医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体またはビヒクルまたは賦形剤にはポリ-(L-グルタミン)またはポリビニルピロリドンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体またはビヒクルまたは賦形剤は、ベクター（または本発明のベクターからin vitroで発現されるタンパク質）の投与を促進する任意の化合物または化合物の組合せであり得る。有利には、当該担体、ビヒクルまたは賦形剤はトランスフェクションを促進するか、および／またはベクター（またはタンパク質）の保存を改善することができる。用量および一回分用量の体積は一般的な説明として本明細書で考察される。これらはまた当業界の知識と併せて本開示から当業者によって煩瑣な実験を実施することなく決定され得る。

本発明の免疫学的組成物またはワクチンは1つ以上のアジュバントを含むか、または本質的に前記から成ることができる。本発明の実施に用いられる適切なアジュバントは以下である：（1）アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸およびアルケニル誘導体ポリマー、（2）免疫刺激配列（ISS）、例えば1つ以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al., 1996；WO98／16247）、（3）水中油エマルジョン、例えばSPTエマルジョン（以下の147ページに記載されている：“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”（M.Powell, M.Newman, Plenum Press 1995））およびエマルジョンMF59（同じ論文の183ページに記載）、（4）第四アンモニウム塩を含む陽イオン脂質（例えばDDA）、（5）サイトカイン、（6）水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、（7）サポニン、または（8）本明細書に引用され参照によって取り込まれる任意の文書類で考察されている他のアジュバント、または（9）前記の任意の組合せ若しくは混合物。
ある実施態様では、アジュバントには粘膜の基底層からの吸収改善を促進するものが含まれる。いくつかの例には、MPL、LTK63、毒素、PLG微粒子、その他いくつか（Vajdy, M.Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627）が含まれる。ある実施態様では、アジュバントはキトサンであり得る（Van der Lubben et al.2001；Patel et al.2005；Majithiya et al.2008；US Patent Serial No.5,980.912）。

いくつかの実施態様では、本発明は弱毒化ブタインフルエンザウイルス（SIV）を含むワクチンを提供し、前記ウイルスは、脱最適化SIVヘマグルチニン（HA）遺伝子、脱最適化SIVノイラミニダーゼ（NA）遺伝子、非脱最適化SIV M、NP、PA、PB1およびPB2遺伝子、および任意的に脱最適化SIV NS1遺伝子をコードする核酸分子を含み、ここで、弱毒化表現型の原因は、対応する病毒性親SIV株（脱最適化遺伝子の野生型バージョンを含む）と対比して、脱最適化遺伝子のSIVにおける存在である。
いくつかの実施態様では、弱毒化SIV株は脱最適化NS1遺伝子を含む。
いくつかの実施態様では、病毒性親SIV株は天然のSIV単離株である。いくつかの実施態様では、病毒性親SIV株はH1N1、H1N2またはH3N2株である。
いくつかの実施態様では、脱最適化HA遺伝子は配列番号:22、29または105に示される配列を有する核酸分子を含み、さらに、脱最適化NA遺伝子は配列番号:25、32または38に示される配列を有する核酸分子を含む。
いくつかの実施態様では、脱最適化HAおよびNA遺伝子は、それぞれ配列番号:22および25に、それぞれ配列番号:29および32に、またはそれぞれ配列番号:105および38に示される配列を有する核酸分子を含む。
いくつかの実施態様では、脱最適化NS1遺伝子は配列番号:27に示される配列を有する核酸配列を含む。

いくつかの実施態様では、非脱最適化M、NP、PA、PB1およびPB2は以下である：
a）SIV H1N1遺伝子であって、各遺伝子が、配列番号:19（M）、配列番号:9（NP）、配列番号:13（PA）、配列番号:15（PB1）および配列番号:17（PB2）に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有するもの、または
b）SIV H1N2遺伝子であって、各遺伝子が、配列番号:44（M）、配列番号:48（NP）、配列番号:52（PA）、配列番号:54（PB1）および配列番号:56（PB2）に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有するもの、または
c）SIV H3N2遺伝子であって、各遺伝子が、配列番号:62（M1）、配列番号:64（M2）、配列番号:68（NP）、配列番号:72（PA）、配列番号:74（PB1）および配列番号:76（PB2）に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有するもの。
いくつかの実施態様では非脱最適化M、NP、PA、PB1およびPB2は以下である：
a）SIV H1N1遺伝子であって、各遺伝子が、配列番号:19（M）、配列番号:9（NP）、配列番号:13（PA）、配列番号:15（PB1）および配列番号:17（PB2）に示される配列を含むもの、または
b）SIV H1N2遺伝子であって、各遺伝子が、配列番号:44（M）、配列番号:48（NP）、配列番号:52（PA）、配列番号:54（PB1）および配列番号:56（PB2）に示される配列を含むもの、または
c）SIV H3N2遺伝子であって、各遺伝子が、配列番号:62（M1）、配列番号:64（M2）、配列番号:68（NP）、配列番号:72（PA）、配列番号:74（PB1）および配列番号:76（PB2）に示される配列を含むもの。

別の特徴では、本発明は、ブタ類で防御免疫応答を誘発するためにワクチン組成物を提供し、前記組成物は本開示の1つ以上の弱毒化ブタインフルエンザウイルスを含み、ここで、当該防御応答はワクチン接種後約3週間以内に引き出される。
いくつかの実施態様では、ワクチン組成物は1つ以上の弱毒化SIVを含み、前記SIVは、脱最適化SIVヘマグルチニン（HA）遺伝子、脱最適化SIVノイラミニダーゼ（NA）遺伝子、非脱最適化SIV M、NP、PA、PB1およびPB2遺伝子、および任意的に脱最適化SIV NS1遺伝子をコードする少なくとも1つの核酸分子を含む。当該弱毒化SIVが非脱最適化NS遺伝子を含む事例では、前記SIVは脱最適化NS1遺伝子もまた含まない。
いくつかの実施態様では、当該弱毒化表現型の原因は、対応する親SIV（当該脱最適化遺伝子の野生型バージョンを含む）と対比して、当該脱最適化遺伝子の再集合体SIVにおける存在である。いくつかの実施態様では、弱毒化SIV株は、脱最適化NS1遺伝子、脱最適化HA遺伝子および脱最適化NA遺伝子セグメントを含むが、ただし残余のSIV遺伝子セグメントは脱最適化されないことを条件とする。
いくつかの実施態様では、ワクチン組成物はさらにまた医薬的若しくは獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含む。いくつかの実施態様では、ワクチンは、病毒性ブタインフルエンザチャレンジに対してブタ類で防御免疫応答を提供する。いくつかの実施態様では、防御は同種性である。他の実施態様では、防御は同種性および異種性の両方である。さらに他の実施態様では、ワクチンは多数のタイプの弱毒化再集合体SIVを含み、病毒性ブタインフルエンザチャレンジおよび／または病毒性SIV H1N1、H1N2およびH3N2サブタイプへのその後の暴露に対してブタ類で防御免疫応答を惹起する。

いくつかの実施態様では、ワクチン組成物はさらにまた、ブタインフルエンザ以外のブタ病原体に関連または由来する少なくとも1つの追加の抗原を含む。
いくつかの実施態様では、当該少なくとも1つ以上の追加の抗原は、マイコプラズマ・ヒオニューモニアエ（M.hyo）、ブタシルコウイルス2（PCV2）、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（PRRSV）、またはブタ類で感染し疾病若しくは疾病に対する感受性を生じることができる他の病原体に対する免疫応答をブタ類で惹起することができる。
別の特徴では、本発明はブタ類対象動物で防御免疫応答を惹起する方法を提供し、前記方法は、当該対象動物に本開示のワクチン組成物の予防的または治療的に有効な用量を投与する工程を含み、前記ワクチン組成物は本開示の弱毒化SIVを最小限含む。
いくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、少なくとも1つのアジュバントを対象動物に投与する工程を含む。
別の特徴では、本発明は動物をワクチン免疫する方法を提供し、前記方法は、少なくとも本開示のワクチン組成物の少なくとも1回投与を含む。
当該方法のいくつかの実施態様では、ブタ類は分娩前約3週から約6週間の雌ブタである。
当該方法のいくつかの実施態様では、得られる仔ブタは、非ワクチン免疫雌ブタ由来の仔ブタと比較して軽減罹患率および／または死亡率を有する。

別の特徴では、本発明は、弱毒化再集合体ブタインフルエンザウイルス（SIV）の生産のための複数のベクターを含むワクチン生産組成物を提供し、前記複数のベクターには、SIV HA、NA（および任意的にNS1）cDNAに作動できるように連結されたプロモーターを含むベクターが含まれ、ここで当該HA、NA（および任意的にNS1）cDNAは、対応する病毒性SIV株のHA、NAおよびNS1コード配列と対比して脱最適化コード配列をコードする。本明細書で用いられるように、“ワクチン生産組成物”は、当該組成物が適切な宿主細胞（例えばHEK細胞）にトランスフェクトされるとき、再集合体インフルエンザワクチン株が生産されることを意味する。
いくつかの実施態様では、組成物は脱最適化HAおよびNA遺伝子を含むプラスミドを含み、当該脱最適化HAおよびNA遺伝子は、それぞれ配列番号:22および25に、それぞれ配列番号:29および32に、またはそれぞれ配列番号:105および38に示される配列を有する核酸分子を含み、さらに任意的に、当該脱最適化NS1遺伝子が配列番号:27に示される配列を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施態様では、脱最適化HAおよびNA遺伝子は、それぞれ配列番号:91および92に、それぞれ配列番号:93および94に、またはそれぞれ配列番号:105および96に示される配列を有する核酸分子を含み、さらに任意的に、当該脱最適化NS1遺伝子は配列番号:90に示される配列を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施態様では、ベクターは以下のTRIG遺伝子セグメントを含む：NS（配列番号:83）、M（配列番号:82）、NP（配列番号:81）、PA（配列番号:80）、PB1（配列番号:79）、PB2（配列番号:78）。
いくつかの実施態様では、ベクターは以下のTRIG遺伝子セグメントを含む：NS（配列番号:83）、M（配列番号:82）、NP（配列番号:81）、PA（配列番号:80）、PB1（配列番号:79）、PB2（配列番号:78）。

いくつかの実施態様では、プラスミドは以下に示される配列を有する：a）配列番号:109および110；b）配列番号:108、109および110；c）配列番号:111および112；d）配列番号:108、111および112；e）配列番号:115および114；またはf）配列番号:108、115および114。
いくつかの実施態様では、プラスミドが適切なウイルス生産細胞にトランスフェクトされるとき、vSIV01、vSIV02、vSIV03、vSIV04、vSIV05およびvSIV06から選択される弱毒化再集合体ウイルスが生産されレスキューされ得る。
別の特徴では、本発明はインフルエンザウイルスを調製する方法を提供し、前記方法は、再集合体弱毒化感染性インフルエンザウイルス粒子の産生に有効な量の請求項19から26のいずれか1項に記載の組成物と細胞を接触させる工程を含む。
別の特徴では、本発明は、開示の複数の逆遺伝学系ベクター（SIV遺伝子セグメントをコードする）を含む細胞を提供する。
さらに別の特徴では、本発明は、弱毒化H1N1 SIVの有効量および弱毒化H3N2 SIVの有効量を含む二価弱毒化SIVワクチンを提供する。
いくつかの実施態様では、二価弱毒化SIVワクチンは、弱毒化H1N2 SIVの有効量および弱毒化H3N2 SIVの有効量を含む。
いくつかの実施態様では、本発明は、弱毒化H1N1 SIVの有効量、弱毒化H1N2 SIVの有効量、および弱毒化H3N2 SIVの有効量を含む三価の弱毒化SIVワクチンを提供する。

参考文献
Coleman JR et al.Virus attenuation by genome-scale changes in codon pair bias.Science 2008.320(5884):1784-1787.PMID: 18583614.
Mueller S et al.Live attenuated influenza virus vaccines by computer-aided rational design.Nat.Biotechn.2010.28:723-727.PMID: 20543832.
Yang C et al.Deliberate reduction of hemagglutinin and neuraminidase expression of influenza virus leads to an ultra-protective influenza vaccine in mice.Proc.Natl., Acad.Sci.USA 2013.110:9481-9486.PMID: 23690603.
Le Nouen C et al.Attenuation of Human Respiratory Syncytial Virus by Genome Scale Codon-Pair Deoptimization.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Aug 25 2014.pii: 201411290.PMID: 25157129.
Altschul SF, Madden TL.1997.Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res.25:3389-3402.
Bragstad K et al.2008.The evolution of human influenza A viruses from 1999 to 2006: A complete genome study.Virology J.5:40.
Cai Z et al.2010.A computational framework for influenza antigenic cartography.PLoS Computational Biology, 6(10):e1000949.
Cottey R et al.2001.Influenza virus.Curr.Protoc.Immunol.19.11:1-32.
Das SR et al.2011.Fitness costs limit influenza A virus hemagglutinin glycosylation as an immune evasion strategy.Proc.Natl.Acad.Sci.108:E1417-E1422.
Desselberger U et al.1978.Biochemical evidence that “new” influenza virus strains in nature may arise by recombination (reassortment).Proc.Natl.Acad.Sci.75:3341-3345.
Hause BM et al.2011.Genetic and antigenic characterization of recent human-like H1 (δ-cluster) swine influenza virus isolates.J.Swine Health Prod.19:268-276.
Hause BM et al.2010.Antigenic categorization of contemporary H3N2 swine influenza virus isolates using a high-throughput serum neutralization assay.J.Vet.Diagn.Invest.22:352-359.
Hay AJ et al.2001.The evolution of human influenza viruses.Philos.T.R.Soc.B.356:1861-1870.
Hensley SE et al.2011.Influenza A virus hemagglutinin antibody escape promotes neuraminidase antigenic variation and drug resistance.PLoS ONE 6:e15190.
Hoffmann E et al.2001.Universal primer set for the full length amplification of al influenza viruses.Arch.Virol.146:2275-2289.
Hoffmann E et al.2000.A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids.Proc.Natl.Acad.Sci.97:6108-6113.
Karasin AI et al.2006.Identification of human H1N2 and human-swine reassortant H1N2 and H1N1 influenza A viruses among pigs in Ontario, Canada (2003-2005).J.Clin.Microbiol.44:1123-1126.
Long J et al.2011.Evolution of H3N2 influenza virus in a guinea pig model.PLoS ONE 6:e20130.
Lorusso A et al.2012.Contemporary epidemiology of North American lineage triple reassortant influenza A viruses in pigs.Curr.Top.Microbiol.Immunol.Jan.22 [epub ahead of print].
Sali A, Potterton L.1995.Evaluation of comparative protein modeling by MODELLER." Proteins 23: 318-326.
Schild G et al.1974.Antigenic variation in current influenza A viruses: evidence for a high frequency of antigenic ‘drift’ for the Hong Kong virus.Bull.World Health Organ.51:1-11.
Strengell M et al.2011.Minor changes in the hemagglutinin of influenza A(H1N1)2009 virus alter its antigenic properties.PLoS ONE 6:e25848.
Vincent AL et al.2009.Characterization of a newly emerged genetic cluster of H1N1 and H1N2 swine influenza virus in the United States.Virus Genes 39:176-185.
以下の非限定的な実施例によってこれから本発明をさらに詳しく述べるであろう。

脱最適化ブタインフルエンザウイルスの構築
材料／方法
簡単に記せば、三重再集合内部遺伝子（triple reassortant internal gene, TRIG）ブタインフルエンザウイルス（SIV）（A／swine／North Carolina／3793／08（H1N1））“基本ゲノム”から開始し、再集合体改変生弱毒化（MLV）インフルエンザウイルス（LAIV）を、標準的な8プラスミド逆遺伝学アプローチ（Hoffman, 2003; US 9,216,211（Merial, Inc.））を用いて作製した。再集合体LAIVを作製するために、TRIG配列をコドン脱最適化HA（配列番号:22、29、35または105）、NA（配列番号:25、32または38）およびNS（配列番号:27）に添加した。脱最適化配列を以下の塩基配列で開始して作製した：H1N1 HA（配列番号:21）、H1N2 HA（配列番号:28）、およびH3N2 HA（配列番号:34）；H1N1 NA（配列番号:24）、H1N2 NA（配列番号:31）、およびH3N2 NA（配列番号:37）。本来のコードアミノ酸を変更することなく、基本CDSをコンピュータ支援コドン脱最適化に付した。LAIV構築物のCDSの内容は表1に要約される。

表1：vSIV01、vSIV02、vSIV03、vSIV04、vSIV05およびvSIV06に存在するCDS

TRIG配列を、野生型H1N1または野生型H1N2 SIV株のいずれに由来するHA-DO、NA-DOおよびNS1-DOと組み合わせても感染性再集合体SIVビリオンが回収された。対照的に、TRIG配列をH3N2 SIV株由来HA-DO、NA-DOおよびNS1-DOと組み合わせると感染性再集合体SIVビリオンは回収されなかった。したがって、出願人らは、H1N1またはH1N2インフルエンザ株のいずれに由来するHA、NAおよびNS1遺伝子もH1N1系TRIG遺伝子と首尾よく結合されて弱毒化再集合体SIVを生成できる（が、１つのH3N2株はそうではない）という広い原則を示した。
H3N2由来HA-DO、NA-DOおよびNS1-DO配列はTRIG配列と首尾よく結合して感染性ビリオンを生成できなかったという思いがけない問題に対処するために、出願人らは、H3N2コドン脱最適化HA遺伝子のキメラバージョンを考案および構築した。簡単に記せば、野生型H3N2 HA（配列番号:34）およびNA（配列番号:37）遺伝子コード配列をコドン脱最適化に付し（Codagenix）、コドン脱最適化H3N2 HA-DO（配列番号:35）およびH3N2 NA-DO（配列番号:38）を生成した。コードされるアミノ酸配列は同じままであり、したがって配列番号:34および35はともに配列番号:36に示されるアミノ酸配列をコードし、配列番号:37および38はともに配列番号:39に示されるアミノ酸配列をコードする。加えて、A／swine／NC／3793／2008(H1N1)のNS1遺伝子のコード配列をコドン脱最適化して、NS1-DO（配列番号:27）を生成した。
A／swine／North Carolina／3793／2008（H1N1）に由来する6つの内部遺伝子セグメントをpHW2000クローニングベクター(図3A)（配列番号:107）でクローニングして以下を作製した：pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS。pHW2000自体は二重プロモーターテールカセット、pHW2000クローニング領域（5’および3’EcoRV制限部位を含む）を合成することによって作製した（以下を参照されたい（参照によってその全体が本明細書に含まれる）：Virology 267, 310-317, 2000）。続いて、抗生物質耐性遺伝子カセットおよびpUC起点を、HincII制限フラグメントを切り出し、前記フラグメントを当該二重プロモーター含有EcoRVフラグメントと一緒に連結することによってpCDNA3.1／V5-His Bから採取した。得られたプラスミドがpHW2000であり、その構築は図3Bに模式図で示されている。
その各々が二重プロモーターカセット（pCMV-tI-制限部位-pIh-BGH）および1つ以上のインフルエンザウイルス遺伝子セグメントを含む複数のプラスミドを細胞にトランスフェクトして、感染性インフルエンザウイルス粒子を生成することができる（例えば以下を参照されたい（参照によってその全体が本明細書に含まれる）：US 2005／0186563 A1（St.Jude Children’s Research Hospital））。
本発明のSIV再集合体ウイルスの配列および組合せが今や開示されたが、任意の適切な逆遺伝学系を利用して本明細書に開示するインフルエンザ粒子を生成できることは当業者には理解されるであろう。例えば、開示の脱最適化されたTRIG配列を発現させて、完全な感染性再集合体ビリオンを8プラスミド系（US 6,951,754 B2（St.Jude））または単一プラスミド系（US 9,163,219 B2（Arizona Board of Regents））を用いて生成できよう（両文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
完全な“TRIG”H1N1セグメントは以下の配列指定を有する：PB2（配列番号:78）；PB1（配列番号:79）；PA（配列番号:80）；NP（配列番号:81）；M（配列番号:82）；NS（配列番号:83）。HAおよびNAは以下の配列指定を有する：H1N1のHA（配列番号:84）；H1N1のNA（配列番号:85）；H1N2のHA（配列番号:86）；H1N2のNA（配列番号:87）；H3N2のHA（配列番号:88）；H3N2のNA（配列番号:89）。
H3N2再集合体SIVを生成するために、コドン脱最適化H3N2 HA（HA-DO）（配列番号:95）およびNA（NA-DO）（配列番号:96）遺伝子セグメントを化学的に合成し（GenScript）、サブクローニングによってpHW2000でクローニングした：pHW2000-H3N2-HA-DO（配列番号:113）およびpHW2000-H3N2-NA-DO（配列番号:114）。pHW2000-TRIG-NS-DO（配列番号:108）も同様に構築した（コドン脱最適化NS1遺伝子（配列番号:90）を含む）。

ウイルスレスキュー：8つの逆遺伝子学プラスミド（TRIG（H1N1）由来の内部セグメントプラスミド（PB2、PB1、PA、NP、M、NSまたはNS-DO）およびH3N2由来のコドン脱最適化HA、NAセグメントから成る）の共同トランスフェクションを、リポフェクタミン2000CD（Invitrogen）を製造業者のプロトコル（表2および3）にしたがって用いて実施した。しかしながら、トランスフェクション／継代における3回の別個の試みで感染性ウイルスのレスキューは成功しなかった。

表2：H3N2 HA、NA脱最適化ウイルスのための逆遺伝学プラスミド

表3：H3N2 HA、NA、NS脱最適化ウイルスのための逆遺伝学プラスミド

種々のNAセグメントによるトランスフェクション：脱最適化H3N2ウイルスはレスキューできなかったので、コドン脱最適化NAセグメント（H1N2 NA-DO；配列番号:94；A／Swine／NC／0036-2／2010（H1N2）由来）をH3N2 NA-DOの代わりに用いた（表4および5）。H1N2 NA-DOは同じプロトコルによりコドン脱最適化H1N2ウイルスのレスキューを支持した（すなわちHA-DO、NA-DO、NS1-DOを有するH1N2再集合体ウイルスが容易に回収された）。NAは細胞のSIV放出に重要な役割を有するので、出願人らはH1N2-NA-DOを用いてH3ウイルスの回収を試みた。さらにまた、このアプローチは妥当であると思われる。なぜならば、両NAがN2サブタイプであり、さらに約92％のアミノ酸同一性を有するからである。しかしながら、H3／H1N2-NA-DO再集合体ウイルスは回収できなかった。このことは、HAが問題であってNAはそうではないかもしれないということを示した。したがって、キメラHAセグメントを考案し構築した。

表4：H1N2 NAセグメントを有するコドン脱最適化H3N2のトランスフェクション

表5：H1N2 NAセグメントを有するコドン脱最適化H3N2のトランスフェクション

残念なことに（さらに予想に反するが）、感染性再集合体ウイルスのレスキューは、コドン脱最適化H1N2 NAセグメント（pHW2000-H1N2 NA-DO）を用いては達成されなかった。したがって、TRIG PB2、PB1、PA、NP、M、（NS）およびH3N2 HA-DO、（TRIG NS-DO）の組合せはレスキュー可能量の感染性ウイルスを生じなかった。再集合体H3N2 SIVを生成するさらに別の試みで、異なる脱最適化HAまたはNAセグメントの組合せを用い、H3N2 HAおよびNAのバックボーンプラスミドとの適合性を試験した（表6および7）。やはり、感染性ウイルスは多くの試みにもかかわらずレスキューされなかった。

表6：種々のHAセグメントによるウイルスレスキューのためのトランスフェクション

表7：種々のNAセグメントによるウイルスレスキューのためのトランスフェクション

キメラHAの構築：再集合体SIVはH3N2 HA-DOまたはH3N2 NA-DOを用いてはレスキューできなかったので、キメラHA-DOセグメントを構築した。前記キメラでは、H3N2のエクトドメインが、H1N2 HA-DOタンパク質のシグナル配列（SS）およびトランスメンブレンドメイン(TMD)／細胞質テールドメイン(CTD)と融合された（配列番号:86）。したがって、HA（H3N2）のエクトドメインをコードするポリヌクレオチド配列を、H1N2 HAタンパク質のSS、TMDおよびCTDを含むpHW2000でクローニングした(pHW2000-H1 SP-TM)。
pHW2000-H1 SP-TMの構築：HAセグメントの3’UTR／シグナル配列をPCRで増幅した。pUC57-Kan-H1N2 HA-DO由来のBm-HA-Fおよび3-Revプライマーセットを用いた(表8、図4)。さらにまた、HAセグメントのTMD、CTDおよび5’UTRを、pUC57-Kan-H1N2 HA-DOから5-ForおよびBm-HA-Rプライマーセットを用いてPCRによって増幅した(表8、図4)。2つのPCRアンプリコンはオーバーラップ配列（21 nt、5’-GACACAATATGTGTAGGCTAC-3’）（配列番号:103）を有し、全領域の増幅を可能にした。2つのPCRアンプリコンの混合物を鋳型として用い、HAセグメントの3’UTR／SS／TMD／CTD／5’UTRをBm-HA-フォワードおよびBm-HA-リバースプライマーセットで増幅した(H₁キメラPCRアンプリコン)(図5)。

表8：pHW2000-H1 SP-TMの構築に用いたプライマー

pHW2000-H1 SP-TMの構築：H₁キメラPCRアンプリコンをBsmBI制限部位によってpHW2000でクローニングした(図6)。
H3エクトドメインのPCR増幅およびpHW2000-H ₁ -SP-TMキメラへのクローニング：HA（H3N2）のエクトドメインをH3ectFP（配列番号:101）およびH3ectRP（配列番号:102）プライマーによりpUC57-Kan-H3N2-HA-DOから増幅した(図7)。次に、H3エクトドメインPCRアンプリコン(図7)をNdeIおよびEcoRV部位によってpHW2000-H1 SP-TMキメラでクローニングした(図8)。得られたプラスミドのヌクレオチド配列をシーケンシング分析によって確認した(図9)。
H3N2ウイルスのレスキュー：内部セグメントを含む逆遺伝学プラスミド、pHW2000-HA-DO（H1-H3キメラ）およびpHW2000-H3N2-NA-DOまたはpHW2000-H1N2-NA-DO、pHW2000-H1N1-NA-DOの共同トランスフェクションを、リポフェクタミン2000CDを用いて上記で詳述し下記に要約するように実施した(表9、10および11)。

表9：コドン脱最適化HA-DO-H1-H3／H3N2 NA-DOウイルスのための逆遺伝学プラスミド

表10：コドン脱最適化HA-DO-H1-H3／H1N2 NA-DOウイルスのための逆遺伝学プラスミド

表11：コドン脱最適化HA-DO-H1-H3／H1N1 NA-DOウイルスのための逆遺伝学プラスミド

3つのウイルス全部がHEK細胞でのトランスフェクションおよびMDCK細胞での継代から回収された。コドン脱最適化HA H1-H3キメラ（配列番号:105）、およびコドン脱最適化NAセグメント（H3N2）（配列番号:96）を有する回収ウイルスはvSIV03と称された。加えて、脱最適化HAおよびNAセグメントウイルスを有する脱最適化NSセグメントが同じプロトコルを用いて回収された(表12および13)。

表12：コドン脱最適化H3ウイルスのための逆遺伝学プラスミド

表13：コドン脱最適化H3ウイルスのための逆遺伝学プラスミド

H1-H3キメラHAセグメントを用いることによって、コドン脱最適化HA、NAセグメントまたはコドン脱最適化HA、NA、NSセグメントを有する感染性インフルエンザウイルスが首尾よく回収され増殖した。コドン脱最適化HA H1-H3キメラ（配列番号:105）、コドン脱最適化NA（配列番号:96)、およびコドン脱最適化NSセグメント（配列番号:90）を有する回収ウイルスはvSIV04と称された。
したがって、8つのpHW2000系の逆遺伝学プラスミドのうち6セットを用いて、vSIV01、vSIV02、vSIV03、vSIV04、vSIV05およびvSIV06を本明細書に記載するように作製し試験した。

表14：vSIV01、vSIV02、vSIV03、vSIV04、vSIV05およびvSIV06を作製するために用いられた遺伝子セグメント

H1N2サブタイプチャレンジに対する弱毒化ブタインフルエンザワクチンの防御有効性
材料と方法：本試験は雌および去勢雄から成る50匹のヨークシャー雑種ブタを含み、前記ブタはSIV ELISA陰性と確認され、0日目に約4週齢であった。仔ブタは以下から供給された：Midwest Research Swine, Princeton Sow herd。全てのブタがそのサイズおよび齢に適切な市販のペレット化ブタ飼料に自由にアクセスでき、さらに自動飲水装置による給水に自由にアクセスできた。仔ブタは、鼻対鼻接触ができない同室内の異なる囲いに処置グループごとに収容された。
0日目に、全動物にそれらの対応する試験ワクチンの2mL（各鼻孔に1mL）で鼻内ワクチン免疫を実施した。21日目に、全動物に2mLのSIV H₁N₂サブタイプ（各鼻孔に1mL）で鼻内チャレンジを実施した。実験生成物の操作および投与時には適切な予防対策、技術および安全対策にしたがった。スクリーニングの目的で試験の開始前に、さらに0、21および26日目に血清力価分析のためにブタから血液を収集した。鼻拭き取り検体を1、7、22、24および26日目にブタから収集し、qRT-PCRによるウイルス複製検出に用いた。21日目（チャレンジ前）から26日目まで、直腸体温をブタから収集した。-7日目から26日目まで毎日、一般健康診査を実施し記録した。22日目から26日目までチャレンジ後の臨床観察を実施し記録した。肺葉当たりのパーセント硬化／肺炎関与の概算による病理調査のために全ての肺臓に視覚的にアクセスし、病理調査は処置の割振りを知らされていない獣医が下記式にしたがって実施し生データとして記録した：
包括的パーセント硬化＝[(％LA*0.05)＋(％LC*0.06)＋(％LD*0.29)＋(％RA*0.11)＋(％RC*0.10)＋(％RD*0.34)＋(％I*0.05)]*100
各肺臓の右側中央葉のサンプルを1％ホルマリンで固定し、免疫組織化学（IHC）スコアについて評価した。さらにまた、各肺臓の同様な切片を新鮮なままで維持し、RT-PCR試験によって分析した。

表15：実験ワクチンの詳細（“DO”＝脱最適化配列）；PBS陰性コントロール；6.0log10 TCID50／mLのSIV 10-0036-1 051515（H1N2）によるチャレンジ

表16：試験グループ

結果：図1はグループによる包括的％硬化を示す箱ひげ図を示す。肺炎組織について発生の評価を得るという目的では、10％以上のパーセント肺炎組織スコアを有する仔ブタは陽性として分類され、10％未満のパーセント肺炎組織スコアを有する仔ブタは陰性と分類された。重要なことに、脱最適化HA（HA-DO）およびNA脱最適化（NA-DO）遺伝子を含むrgSIV（グループ1、2、3および4）は、PBSコントロールと比較して肺病巣の顕著な防御を提供する。
さらにまた、HA-DO、NA-DOおよびNS1-DOを含むrgSIV（グループ2および4）は、脱最適化されたHAおよびNA遺伝子のみを有する対応するrgSIV（それぞれグループ1および3）よりも強化された防御傾向を示す。チャレンジ株は病毒性H1N2であるので、グループ1および2に投与されたrgSIVは本質的に同種防御を惹起するそれらの能力について評価され、一方、グループ3および4に投与されたrgSIVは本質的に異種防御を惹起するそれらの能力について評価されているということを書き留めることはまた重要である。これは、少なくとも部分的には、グループ3および4の動物で引き出された防御は、グループ5の動物（すなわちコントロールグループ）で引き出された防御と比較したとき顕著であったが、グループ1および2の動物で引き出された防御ほどは強くなかった理由を説明する。
出願人らは、脱最適化HA、NAおよび／またはNS1の多くの異なる組合せを本発明の実施に用いることができることを想定している。例えば、H1N2からの防御が所望される場合、脱最適化HA、NAおよびNS1を他の5つのTRIGセグメントに添加して（または所望するならば別のSIVバックボーン株にさえ添加して）、高度に効果的な弱毒化H1N2脱最適化rgSIVを生成できる。

表17：陽性肺炎組織スコアの発生

表18：ウイルス負荷

表19：グループによる陽性PCRの結果の発生

表20：プラセボグループに対してワクチン接種グループのPCRの結果を比較するための発生の統計要旨、ウィルコクソン検定のP値および緩和割合

表21：日にちとグループによるSIV血清学の最小二乗平均（LSM）

結論：チャレンジ後肺病巣スコアは全ての処置グループで顕著に低下した。グループvSIV01およびvSIV02は肺病巣の予防に役立ち、一方、グループvSIV05およびvSIV06は肺病巣の制御に役立った。vSIV01およびvSIV02については、緩和の割合は100％であり、同種チャレンジの完全な防御を示した。有望なことに、vSIV05およびvSIV06の緩和割合はそれぞれ70％および82％であり、異種チャレンジに対し顕著なレベルの肺病巣交差防御を示している。そのようなレベルは、本出願人らが当該開示発明を開発した時点での業界の知識状況からは予想し得ない。最後に、ワクチン接種後の異常反応（抑うつおよびアナフィラキシーを含む）は全く観察されなかった。

H1N1またはH3N2サブタイプチャレンジに対する弱毒化ブタインフルエンザワクチンの仔ブタにおける防御有効性
本試験は、特段の記載がなければ概ね実施例2に記載した方法を用いて実施した（詳細は表22に要約される）。簡単に記せば、一腹仔を無作為抽出要件として用いて、仔ブタを6つの処置グループの1つに割り当てた。ワクチン接種後（ただしチャレンジ前）、グループ1、2、4および5の仔ブタをコントロールから離れた別々の部屋に収容した（全接種動物を1部屋／2部屋に収容）。異なるワクチン接種グループのブタは鼻対鼻接触をしなかった。しかしながら、グループ1および4はチャレンジ前に一緒に収容した。
21日目のチャレンジ前にグループ1、2および3に割り当てた仔ブタを混ぜて一緒に収容し、グループ4、5および6に割り当てた仔ブタを混ぜて一緒に収容し、試験終了まで維持した。

表22：試験設計

実施例2に提示した結果によって示される防御有効性から見れば、グループ1、2、4および5のワクチンは、対応するコントロールワクチン、3および4よりも顕著に強い防御免疫を惹起するであろうと予測された。
結果：図14は、グループの包括的パーセント硬化を示す箱ひげ図を示す。

表23：コントロールグループに対するワクチン接種グループの包括的パーセント硬化の比較についてのウィルコクソン試験のP値および緩和割合

表24：コントロールグループに対するワクチン接種グループの顕微鏡的肺IAV病巣の比較についてのウィルコクソン試験のP値および緩和割合

表25：コントロールグループに対するワクチン接種グループの肺IAV IHCスコアの比較についてのウィルコクソン試験のP値および緩和割合

表26：コントロールグループに対するワクチン接種グループのチャレンジ後における鼻道のウイルス負荷発生の比較についてのフィッシャーの正確確率検定のP値および防御割合

結論：顕著なワクチン効果が、コントロールグループと比較したとき一価および三価ワクチンの両方で観察された。これはまた顕微鏡病巣についてもその通りであったが、ただしグループ4（三価／H3N2チャレンジ）は例外であった（顕著な減少を示さなかった）。このグループではコントロールグループと比較してスコアは低く、選別バイアスの産物の可能性があったが、ただしこの観察は、下記に記載する同じグループで観察されたIHCスコアと一致する。
肺コロニー形成については、H1N1でチャレンジされたコントロールグループと比較して、グループ1および2で観察される顕著なワクチン効果が存在した。ワクチンの影響は、H3N2でチャレンジされたコントロールと比較してグループ4および5では観察されなかった。鼻からの排出については、全てのワクチン接種グループで顕著なワクチン効果が観察された（コントロールと比較して排出を防いだ）。H1N1チャレンジを受けたグループについては、臨床的呼吸器指標は、ワクチン接種動物で6観察日のうち4日でコントロールよりも低かった。H3N2チャレンジを受けたグループについては、臨床的呼吸器指標はワクチン接種動物で6観察日のうち2日で低かった。抑うつスコアは、コントロールと比較してH1N1チャレンジを受けた接種動物で低かったが、しかしながらH3N2チャレンジを受けたものについては、抑うつは非常にわずかのブタで観察され、したがって適切には評価できない。チャレンジ後の体温はコントロールと比較して全てのワクチン接種グループで低かった。最後に、異常なワクチン接種後反応（抑うつおよびアナフィラキシーを含む）は観察されなかった。

チャレンジウイルスの伝播に対するワクチン免疫の影響を評価する歩哨動物モデルの開発および実施
本試験は、特段の記載がなければ概ね実施例3に記載した方法を用いて実施されるが、ただし陽性コントロール歩哨動物の混ぜ合せが加えられる（詳細は表27に要約される）。
実際のウイルスの伝播を評価するために、排出ウイルスの単なる測定（例えば鼻拭き取り検体およびウイルス検出）の代わりに、歩哨動物モデルを開発することが必要であった。出願人らは、コントロールおよびワクチン接種動物を歩哨動物とチャレンジ後すぐにまたは時にはチャレンジ後に混ぜ合わせることでは最適な条件が得られるか否かは確実には予測できないであろうと考えた。SIV放出ピークは通常では病毒性SIV株への暴露から約48時間後に発生することがわかっているので、混ぜ合せを開始する良好な時間は約12時間から約36時間であろうと考えた。24時間の遅延をこの試験では選択した。混ぜ合せにおけるこの遅延は、チャレンジウイルスが当該収容環境に吸収され分散されるために十分な時間を与えるであろう。また別には、動物はチャレンジ後すぐに混ぜ合わせてもよい。

表27：試験設計−歩哨動物モデルの条件

ワクチンは以下の事例で伝播を減少させることが示される：
（a）混ぜ合わせグループ1および2
今や出願人らがこのアプローチを完成させたので、多数のワクチンをチャレンジウイルスの伝播を減少させるそれらの能力について試験することができる。歩哨動物モデル試験の設計と実施例2および3で開示した試験設計との間の重要な相違は、陽性コントロールグループが含まれることである（すなわち、各ワクチンについて空域／収容環境につき2グループが存在する）。この特色は、チャレンジと混ぜ合わせとの間の時間の猶予という選択肢と併せて、歩哨動物モデルがウイルス伝播に対する任意のSIVワクチンの影響を測定すること可能にする。

改変生ワクチンの遺伝的安定性
目的：野生型ウイルスとのin vivo共同接種後の改変生ワクチンの遺伝的安定性を評価し、さらにIAVワクチンを用いてブタのVAERDの潜在的発生を評価すること。表28は全体的な試験設計を提示する。
主要変数：以下を評価した:1）共同接種されたワクチンおよびチャレンジウイルスのin vivo継代後に回収されたワクチンウイルスのコドン脱最適化HA、NAおよびNS1遺伝子の遺伝的安定性；2）in vivo継代後にMLV IAVワクチンを投与されたブタの肺病巣およびウイルス排出の評価に基づくワクチン関連強化呼吸器疾患（VAERD）；および3）試験ワクチンの有効性。
ワクチン免疫およびチャレンジ：仔ブタは0日目および21日目に右鼻孔にワクチンを2用量投与された。全ての仔ブタは21日目に左の鼻孔に適切なチャレンジ材料の1用量を投与された。
毎日の臨床的観察：全ての仔ブタを一般的健康状態およびIAV疾患の徴候（発熱、無気力、呼吸困難）について毎日観察した。

表28：試験設計

改変生ワクチンのin vitro安定性
ワクチンをST細胞で連続継代した。表29に示すようにvSIV01、vSIV02、vSIV05およびvSIV06は極めて安定であった。
表9：配列分析はvSIVはST細胞での10継代後に安定であることを示した

微粒子散剤として処方されたワクチン
3つのマスターシードウイルス（MSV）、vSIV02（H1N2）、vSIV04（H3N2）およびvSIV06（H1N1）をイヌ細胞株MDCKで作製した。ウイルスを安定化成分と一緒にして凍結乾燥するか、および／または以前に記載した技術を用いてガラス化した（例えば以下を参照されたい：US 2013／0040370 & US 2016／0256554（ともにMerial, Inc.））。乾燥させた生物学的材料を続いて製粉して微粒子散剤を生成した。この散剤を時間経過における安定性についてアッセイした。

表30：散剤として処方された一価vSIV04（H3N2）の安定性

表31：散剤として処方された三価vSIV02（H1N2）、vSIV04（H3N2）、vSIV06（H1N1）の安定性

したがって、本発明の免疫学的組成物は、乾燥、微粒子散剤として処方されるとき安定である。
*************
本発明の好ましい実施態様を詳細に記載してきたが、上記で規定した発明は上記説明に示される特定の詳細説明に限定されないことは理解されるべきである。なぜならば、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく多くの明白なその変形が可能だからである。

Claims (30)

1. 弱毒化ブタインフルエンザウイルス（SIV）株を含むワクチンであって、脱最適化SIVヘマグルチニン（HA）遺伝子、脱最適化SIVノイラミニダーゼ（NA）遺伝子、非脱最適化SIV M、NP、PA、PB1およびPB2遺伝子、および任意的に脱最適化SIV NS1遺伝子をコードする核酸分子を含み、当該弱毒化表現型の原因が、当該脱最適化遺伝子の野生型バージョンを含む対応する病毒性親SIV株と対比して、脱最適化遺伝子のSIVにおける存在である、前記ワクチン。
2. 弱毒化SIV株が脱最適化SIV NS1遺伝子を含む、請求項1に記載のワクチン。
3. 病毒性親SIV株が天然のSIV単離株である、請求項1に記載のワクチン。
4. 病毒性親株がH1N1、H1N2またはH3N2株である、請求項1に記載のワクチン。
5. 脱最適化HA遺伝子が配列番号:22、29または105に示される配列を有する核酸分子を含み、さらに、脱最適化NA遺伝子が配列番号:25、32または38に示される配列を有する核酸分子を含む、請求項1に記載のワクチン。
6. 脱最適化HAおよびNA遺伝子が、それぞれ配列番号:22および25に、それぞれ配列番号:29および32に、またはそれぞれ配列番号:105および38に示される配列を有する核酸分子を含む、請求項1に記載のワクチン。
7. 脱最適化NS1遺伝子が配列番号:27に示される配列を有する核酸配列を含む、請求項6に記載のワクチン。
8. 非脱最適化M、NP、PA、PB1およびPB2が以下である、請求項1に記載のワクチン：
   a．各遺伝子が、配列番号:19（M）、配列番号:9（NP）、配列番号:13（PA）、配列番号:15（PB1）および配列番号:17（PB2）に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有するSIV H1N1遺伝子、または
   b．各遺伝子が、配列番号:44（M）、配列番号:48（NP）、配列番号:52（PA）、配列番号:54（PB1）および配列番号:56（PB2）に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有するSIV H1N2遺伝子、または
   c．各遺伝子が、配列番号:62（M1）、配列番号:64（M2）、配列番号:68（NP）、配列番号:72（PA）、配列番号:74（PB1）および配列番号:76（PB2）に示される配列と少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％同一性を有するSIV H3N2遺伝子。
9. 非脱最適化M、NP、PA、PB1およびPB2が以下である、請求項1に記載のワクチン：
   a．各遺伝子が、配列番号:19（M）、配列番号:9（NP）、配列番号:13（PA）、配列番号:15（PB1）および配列番号:17（PB2）に示される配列を含むSIV H1N1遺伝子、または
   b．各遺伝子が、配列番号:44（M）、配列番号:48（NP）、配列番号:52（PA）、配列番号:54（PB1）および配列番号:56（PB2）に示される配列を含むSIV H1N2遺伝子、または
   c．各遺伝子が、配列番号:62（M1）、配列番号:64（M2）、配列番号:68（NP）、配列番号:72（PA）、配列番号:74（PB1）および配列番号:76（PB2）に示される配列を含むSIV H3N2遺伝子。
10. ワクチン接種から約3週間以内にブタ類動物で防御免疫応答を誘発することができる、請求項1または2に記載のワクチン。
11. さらにまた、医薬的または獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含み、病毒性ブタインフルエンザチャレンジに対してブタ類で防御免疫応答を提供する、請求項10に記載のワクチン。
12. さらにまた、ブタインフルエンザ以外のブタ病原体に関連または由来する少なくとも1つの追加の抗原を含む、請求項11に記載のワクチン。
13. 少なくとも1つ以上の追加の抗原が、マイコプラズマ・ヒオニューモニアエ（Mycoplasma hyopneumoniae（M.hyo））、ブタシルコウイルス2（PCV2）、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（PRRSV）、またはブタ類で感染し疾病若しくは疾病感受性を生じることができる他の病原体に対する免疫応答をブタ類で惹起することができる、請求項12に記載のワクチン。
14. ブタ類対象動物で防御免疫応答を惹起する方法であって、請求項1−9または11−13のいずれか1項に記載のワクチンの予防的または治療的有効量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
15. さらにまた、少なくとも1つのアジュバントを対象動物に投与する工程を含む、請求項14に記載の方法。
16. 動物をワクチン免疫する方法であって、請求項1−9または11−13のいずれか1項に記載のワクチンの少なくとも1回の投与を含む、前記方法。
17. ブタ類が分娩前約3週間から約6週間の雌ブタである、請求項16に記載の方法。
18. 得られた仔ブタが非ワクチン免疫雌ブタから生じた仔ブタと比較して軽減罹患率および/または死亡率を有する、請求項17に記載の方法。
19. 請求項1−9または11−13のいずれか1項に記載のワクチンの製造のために使用するワクチン生産用組成物であって、弱毒化再集合体ブタインフルエンザウイルス（SIV）の生産のための複数のベクターを含み、前記複数のベクターには、SIV HA、NA（および任意的にNS1）cDNAに作動できるように連結されたプロモーターを含むベクターが含まれ、ここで当該HA、NA（および任意的にNS1）cDNAは、対応する病毒性SIV株のHA、NAおよびNS1コード配列と対比して脱最適化コード配列をコードする、前記組成物。
20. 脱最適化HAおよびNA遺伝子が、それぞれ配列番号:22および25に、それぞれ配列番号:29および32に、またはそれぞれ配列番号:105および38に示される配列を有する核酸分子を含み、さらに任意的に、当該脱最適化NS1遺伝子が配列番号:27に示される配列を有する核酸配列を含む、請求項19に記載のワクチン生産組成物。
21. 脱最適化HAおよびNA遺伝子が、それぞれ配列番号:91および92に、それぞれ配列番号:93および94に、またはそれぞれ配列番号:105および96に示される配列を有する核酸分子を含み、さらに任意的に、当該脱最適化NS1遺伝子が配列番号:90に示される配列を有する核酸配列を含む、請求項19に記載のワクチン生産組成物。
22. ベクターが以下のTRIG遺伝子セグメントを含む、請求項19に記載のワクチン生産組成物：NS（配列番号:83）、M（配列番号:82）、NP（配列番号:81）、PA（配列番号:80）、PB1（配列番号:79）、PB2（配列番号:78）。
23. ベクターが以下のTRIG遺伝子セグメントを含む、請求項21に記載のワクチン生産用組成物：NS（配列番号:83）、M（配列番号:82）、NP（配列番号:81）、PA（配列番号:80）、PB1（配列番号:79）、PB2（配列番号:78）。
24. プラスミドが以下に示される配列を有する、請求項19に記載のワクチン生産組成物：
    a．配列番号:109および110
    b．配列番号:108、109および110、
    c．配列番号:111および112、
    d．配列番号:108、111および112、
    e．配列番号:115および114、または
    f．配列番号:108、115および114
25. プラスミドが適切なウイルス生産細胞にトランスフェクトされた場合、vSIV01、vSIV02、vSIV03、vSIV04、vSIV05およびvSIV06から選択される弱毒化再集合体ウイルスが生産され、レスキューされ得る、請求項24に記載のワクチン生産用組成物。
26. 弱毒化ブタインフルエンザウイルス（SIV）ワクチン株を調製する方法であって、再集合体弱毒化感染性インフルエンザウイルス粒子の生産に有効な量の請求項１９に記載のワクチン生産用組成物と細胞を接触させる工程を含む、前記方法。
27. 請求項19に記載のワクチン生産用組成物を含む細胞。
28. 弱毒化H1N1 SIVの有効量および弱毒化H3N2 SIVの有効量を含む二価ワクチンであって、前記SIVの各々が請求項1に記載の弱毒化SIVである、前記ワクチン。
29. 弱毒化H1N2 SIVの有効量および弱毒化H3N2 SIVの有効量を含む二価ワクチンであって、前記SIVの各々が請求項1に記載の弱毒化SIVである、前記ワクチン。
30. 弱毒化H1N1 SIVの有効量、弱毒化H1N2 SIVの有効量、および弱毒化H3N2 SIVの有効量を含む三価ワクチンであって、前記SIVの各々が請求項1に記載の弱毒化SIVである、前記ワクチン。

Images