CN111321125B

CN111321125B - 重组流感病毒及其在疫苗中的应用

Info

Publication number: CN111321125B
Application number: CN202010078691.2A
Authority: CN
Inventors: 陈凌; 王洋; 潘蔚绮
Original assignee: Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Medical University
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2040-02-03
Also published as: CN111321125A

Abstract

本发明涉及人畜共患传染病学领域，具体而言，涉及一种重组流感病毒及其在疫苗中的应用。该重组流感病毒基因组如下基因区域发生突变而被减毒：PB2的127‑2217位碱基片段；HA的48‑1712位碱基片段；NP的106‑1422位碱基片段；NA的42‑1346位碱基片段；NS的166‑495位碱基片段。采用去病毒化策略重编码病毒基因组能够降低流感病毒的致病力约2×10⁴倍；并且重组流感病毒依然具有良好的免疫原性，其制备得到的疫苗可对同源和异源攻毒能够提供完全保护力。

Description

重组流感病毒及其在疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及人畜共患传染病学领域，具体而言，涉及一种重组流感病毒及其在疫苗中的应用。

背景技术

流感病毒疫苗是流感病毒防控的主要手段。流感病毒减毒活疫苗的接种能够模拟天然病毒感染过程，并具有提供细胞免疫反应、交叉免疫保护的优点。目前商用的季节性流感病毒减毒活疫苗的有效性较低，并且其基因组仅有5个冷适应突变，具有发生回复突变的可能，从而导致疫苗毒力返强的风险。采用基因组密码子或密码子对重编码的方法制备的流感病毒减毒活疫苗表现出了令人振奋的结果，是新型流感疫苗的一个研究方向。研究人员分别选择人使用频率低的密码子或密码子对、禽流感病毒基因组使用高的密码子和易发生终止突变的密码子等策略分别对人流感病毒基因组进行重编码。其中，禽流感病毒与人流感病毒基因组差异十分有限，Fan等对季节性人流感病毒基因组8个节段进行禽流感病毒化改造，仅引入了373个沉默突变，病毒致弱效果不明显。Nogales等对A/PR/8/34流感病毒NS基因密码子进行去人源化改造，引入135个沉默突变，得到的病毒对小鼠的致死能力下降32倍。Eckard Wimmer研究组采用去人源化策略对流感病毒HA和NA节段或者NP、PB1、HA节段密码子对进行去人源化改造，分别引入618和903个沉默突变，所构建的病毒对小鼠的致死能力分别下降超过105倍和约104倍。因此流感病毒基因组重编码能够有效降低流感病毒在体内外的致病力，并且随着沉默突变数量的增加，改造病毒的减毒效果也会越明显。然而，人基因组偏好使用第三位密码子为GC的密码子，而流感病毒偏好使用第三位密码子为AT的密码子。目前，没有直接采用流感病毒使用率低的密码子对流感病毒基因组进行改造的研究，且减毒病毒的突变经常是不太确定的，因而其构建存在难度，还常常存在回复突变的问题。

发明内容

当前流感疫苗存在低效性和广谱性差的缺陷，新型流感疫苗的探索迫在眉睫。本发明采用基因组密码子去流感病毒化重编码策略，向流感病毒PB2、HA、NP、NA、NS基因中共引入1717个沉默突变，得到了一株体内外复制能力、体内致病力均明显减弱的新型流感病毒减毒活疫苗株（以下可简称PR8rp）。疫苗株PR8rp能够诱导足够的免疫应答，1 PFU剂量单次免疫即能够对同源毒株攻毒提供完全保护。不仅如此，PR8rp减毒活疫苗对异源病毒攻毒也能够提供完全保护。总之，病毒基因组密码子去病毒化策略能够大幅度降低流感病毒的毒力，并且能够对机体提供足够的同源和交叉保护力。

具体的，本发明涉及一种重组流感病毒，该病毒基因组被引入如下基因区域突变中的至少一种而被减毒：

PB2的127-2217位碱基片段替换为SEQ ID NO:1；

HA的48-1712位碱基片段替换为SEQ ID NO:2；

NP的106-1422位碱基片段替换为SEQ ID NO:3；

NA的42-1346位碱基片段替换为SEQ ID NO:4；

NS的166-495位碱基片段替换为SEQ ID NO:5。

采用去病毒化策略重编码病毒基因组能够降低流感病毒的致病力约2×104倍；并且重组流感病毒依然具有良好的免疫原性，其制备得到的疫苗可对同源和异源攻毒能够提供完全保护力。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及SEQ ID NO:1~5中的任一项所示的核酸、包含其的载体以及被所述重组流感病毒所感染的细胞。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及所述病毒的制备方法。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及包含所述重组流感病毒的疫苗及试剂盒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中PR8和PR8rp病毒噬斑形态；

图2为本发明一个实施例中PR8和PR8rp病毒在MDCK细胞上的生长曲线，**, P<0.01，***, P<0.001；

图3为本发明一个实施例中PR8和PR8rp病毒在小鼠体内的复制能力，**, P<0.01；

图4为本发明一个实施例中；PR8和PR8rp病毒对小鼠的致病力，A-B：不同剂量PR8病毒鼻腔感染小鼠后体重变化（A）和存活率情况（B）；C-D：不同剂量PR8rp病毒鼻腔感染小鼠后体重变化（C）和存活率情况（D）；

图5为本发明一个实施例中PR8和PR8rp病毒对小鼠的同源保护力，A-B：不同剂量PR8或PR8rp接种小鼠4周后PR8病毒鼻腔感染小鼠后体重变化（A）和存活率情况（B）；

图6为本发明一个实施例中不同病毒接种小鼠四周后，PR8病毒攻毒后3天小鼠肺病毒滴度；

图7本发明一个实施例中PR8（A）和PR8rp（B）病毒疫苗的安全有效区间；

图8本发明一个实施例中PR8和PR8rp病毒疫苗诱导产生的抗体效价，A-B：PR8（A）和PR8rp（B）病毒疫苗诱导产生的血凝抑制（HI）抗体效价；C-D：PR8（C）和PR8rp（D）病毒疫苗诱导产生的微量中和（MN）抗体效价；

图9 发明一个实施例中PR8rp病毒疫苗对H1N1/CA09的攻毒保护，A：体重变化；B：存活率。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种重组流感病毒，该病毒基因组被引入如下基因区域突变中的至少一种而被减毒：

PB2的127-2217位碱基片段替换为SEQ ID NO:1；

HA的48-1712位碱基片段替换为SEQ ID NO:2；

NP的106-1422位碱基片段替换为SEQ ID NO:3；

NA的42-1346位碱基片段替换为SEQ ID NO:4；

NS的166-495位碱基片段替换为SEQ ID NO:5。

本发明所提供的病毒主要通过沉默突变以减毒。如本文所用的，术语“沉默突变”是指在生物的基因组中核苷酸的变化，其不显著改变生物的表型。沉默突变可发生在非编码区(内含子内的基因的外侧)，或它们可发生在外显子内。当它们发生在外显子或编码区内时，它们不导致编码的氨基酸序列的变化(即，同义取代)，或导致插入具有与原始氨基酸类似性质的备选氨基酸，在任一情况下表型不存在显著变化。

在一些实施方式中，所述重组流感病毒为甲型流感病毒。

在一些实施方式中，所述重组流感病毒为A/Puerto Rico/8/1934（A/PR/8/34）株流感病毒。

在一些形式中，当与野生型病毒在各个宿主中的复制相比，重组流感病毒在哺乳动物宿主中，和/或禽类宿主中具有较慢的复制。在一些形式中，重组流感病毒产生类似于由野生型病毒产生的抗体-介导的免疫。在一些形式中，重组流感病毒产生类似于由野生型病毒产生的细胞-介导的免疫。在一些形式中，重组流感病毒产生类似于由野生型病毒产生的抗体-介导的免疫和细胞-介导的免疫。在一些形式中，重组流感病毒在33ºC和37ºC下以基本上相同的速率复制。

如本文所用的，术语“野生型病毒”是指在自然中、在其宿主中、在基因操作或其它类型的有意人工操作之前存在时，呈天然形式的病毒。

本发明还涉及分离的核酸，其选自SEQ ID NO:1~5中的一种或多种。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及载体，其含有如上所述的分离的核酸。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和其他表达控制元件（例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等）。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及细胞，其被如上所述的重组流感病毒所感染。

在一些实施方式中，所述细胞为禽类和哺乳动物的细胞，包括它们的卵（蛋）或胚胎细胞等。

禽类例如野生或经过驯化的鸡、鸭、鹅、天鹅、大雁、鸽子、鹌鹑，其中特别是各种水禽。

哺乳动物例如人、猴、猪、马、猫、犬、海豹、鲸鱼等。

在一些实施方式中，人的细胞选自CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞。

在一些实施方式中，犬的细胞选自MDCK细胞。

在一些实施方式中，猴的细胞选自Vero细胞。

本发明还提供如上所述的重组流感病毒的制备方法，该方法包括在能够将所述重组流感病毒的基因组核酸片段组装到病毒颗粒中的条件下将该片段引入宿主细胞。

本发明还涉及疫苗，其含有如上所述的重组流感病毒。

上述，本领域技术人员应当理解，与所述重组流感病毒在遗传上基本上相同的病毒，或与所述重组病毒在碱基替换方式上基本相同的病毒，或含有与所述重组流感病毒在遗传上基本上相同的病毒的疫苗也在本申请的保护范围内。如本文所用的，术语“在遗传上基本上相同”是指病毒颗粒，其中它们的基因组的核酸序列，或由它们的基因组产生的氨基酸序列，显示至少98%或至少99%序列同源性。

本发明所提供的疫苗优选地还包括佐剂。适用于本发明疫苗的佐剂包括可增强针对所述重组流感病毒中B细胞表位的抗体反应的佐剂，以及可增强细胞介导的针对所述重组流感病毒中T细胞表位的反应的佐剂。这些佐剂是本领域所熟知的。

在一些实施方式中，所述佐剂选自明矾、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烯、角鲨烷、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly（I：C），以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。

其中完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烷和明矾一般不用于人。

可与本发明所述重组流感病毒一起应用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如，氢氧化物或磷酸盐)。尤其适用于本发明的优选佐剂是氢氧化铝凝胶，诸如AlhydrogelTM。对氢氧化铝凝胶而言，是将所述嵌合体蛋白与该佐剂混合，使每一剂量含有大约50到大约800微克铝，优选含有大约400到大约600微克铝。另一种尤其优选的佐剂是可获得自SuperfosBiosector，Denmark的商标为Adju-PhosTM的磷酸铝。初期的磷酸铝颗粒具有板状形态，直径为大约50到大约100nm，产物中的最终颗粒尺寸为大约0.5到大约10μ。磷酸钙毫微粒(CAP)是由Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)研制的一种佐剂。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。

疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过鼻腔途径的疫苗接种，但本发明还考虑了口腔和皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。

上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。

本发明的另一个实施方式涉及成套试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

接种容器优选为医用注射器或者滴鼻器。

本发明进一步提供了保护动物免于流感病毒、特别是甲型流感病毒的方法，其包括给所述动物施用有效量的根据本发明的疫苗。

在一些实施方式中，所述动物为如上所定义的禽类和哺乳动物。

有效量定义为在它被施用的个体中将诱导免疫应答的所述疫苗的量，导致在个体中针对所述疫苗的分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。针对疫苗的所述分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答针对用强毒流感病毒株的攻击也是有效的。

所述有效量优选经口或口鼻或肌内施用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

1. 流感病毒基因组密码子重编码策略

根据流感病毒密码子使用的偏好性，选择流感病毒基因组使用率较低的密码子对A/Puerto Rico/8/1934（A/PR/8/34）流感病毒基因组进行重编码设计。密码子改造区域避开非编码区和包装信号，并且保持氨基酸不变，设计原则见下（表1）。共向基因组PB2、HA、NP、NA和NS节段中引入1717个沉默突变（表2）。

表1 密码子改造设计原则

表2 重编码病毒基因节段特征

2. 重编码流感病毒的体外复制能力

我们通过反向遗传技术拯救了PB2、HA、NP、NA和NS节段密码子重编码，其他节段来自于野生型A/PR/8/34的重编程流感病毒（PR8rp）。通过测序证明所得到的PR8rp病毒基因组与预期相符，并且在鸡胚中进行5次传代不会出现回复突变。将PR8rp与实验室保存的野生型PR8病毒在MDCK细胞上进行噬斑试验，结果显示病毒在MDCK孵育5天后，PR8rp噬斑大小显著小于野生型PR8病毒（图1）。

将野生型PR8病毒和PR8rp病毒以MOI=0.01在MDCK细胞中分别孵育12、24、36、48、60和72 h，检测不同时间点的病毒滴度，并绘制生长曲线。结果显示，PR8rp在MDCK细胞上的复制能力在36-72 h均显著低于野生型PR8病毒（P=0.0005-0.0033）（图2）。

3. 重编码流感病毒在小鼠体内的致病性

由于重编码病毒在体外复制能力降低，为了确定重编码病毒在体内的复制能力是否也相应降低，我们将不同剂量的PR8或PR8rp病毒分别滴鼻感染BALB/c小鼠，感染后3天取肺，通过噬斑试验检测肺匀浆液中病毒滴度。结果显示，PR8rp病毒在小鼠肺部复制能力比PR8病毒显著降低约500倍（图3）。

为了研究重编码病毒是否在小鼠体内表现出低致病性，我们将不同剂量的PR8病毒或PR8rp病毒分别对BALB/c小鼠进行了滴鼻接种，并监测小鼠的体重和存活率，计算了MLD50（图4）。结果显示，10 PFU剂量PR8病毒接种即可使小鼠产生20%的死亡，102 PFU剂量PR8病毒接种后小鼠存活率为0。PR8野生型病毒的MLD50为24 PFU。而100~104 PFU剂量PR8rp病毒接种不会使小鼠致死。105 PFU和106 PFU剂量PR8rp病毒接种后，小鼠存活率分别为80%和40%。PR8rp病毒的MLD50为4.8×105 PFU，比PR8病毒高2×104倍，即PR8rp病毒在小鼠体内的致病力比PR8病毒低2×104倍。

4. 重编码流感病毒疫苗在小鼠体内的保护力

为了研究重编码病毒对小鼠能够提供的同源保护力，将不同剂量的PR8病毒或PR8rp病毒分别对BALB/c小鼠进行了滴鼻接种，接种后4周以1000×MLD50剂量PR8病毒对小鼠进行攻毒。结果显示，PR8 1 PFU和PR8rp 1 PFU病毒剂量的接种均可以对小鼠同源病毒攻毒提供完全保护（图5）。因此，PR8和PR8rp病毒的小鼠半数保护量（MPD50）均小于1 PFU。

我们进一步分析了攻毒后3天和5天小鼠肺病毒滴度，结果显示PR8 10 PFU、PR8rp10 PFU和PR8rp 104 PFU病毒剂量接种的小鼠，在攻毒后第3天和第5天均检测不到肺病毒滴度（图6）。而滴鼻接种PBS的对照组小鼠，在攻毒后第3天和第5天的肺病毒滴度分别为1.4×107和9.8×105。表明PR8和PR8rp病毒接种均能提供有效的保护。

5. 重编码流感病毒疫苗安全和有效区间

根据病毒的MLD50和MPD50，我们计算了PR8和PR8rp病毒的疫苗安全、有效区间。结果显示，PR8病毒的疫苗安全、有效区间仅在1 PFU周围，而PR8rp病毒的疫苗安全、有效区间为1~104 PFU，远远高于PR8病毒（图7）。

6. 重编码流感病毒疫苗刺激产生体液免疫反应

收集PR8和PR8rp病毒接种后4周的小鼠血清，通过血凝抑制（hemagglutinationinhibition，HI）试验、微量中和（microneutralization，MN）试验等方法检测小鼠体液免疫反应。图8结果显示，PR8rp能够有效诱导小鼠产生HI和MN抗体。

7. 重编码流感病毒疫苗的异源攻毒保护力

为了评价减毒活疫苗PR8rp是否能够提供异源保护力，分别对10 PFU和104 PFU减毒活疫苗PR8rp一次免疫后4周的小鼠进行10×MLD50 A/California/04/2009（H1N1/CA09）异源毒株攻毒（图9）。攻毒结果显示，10 PFU PR8rp免疫小鼠在攻毒后表现出明显的体重下降，但是10 PFU PR8rp对H1N1/CA09攻毒仍然能够提供80%的保护力。104 PFU PR8rp免疫小鼠在攻毒后表现没有明显的体重下降，104 PFU PR8rp对H1N1/CA09攻毒能够提供完全保护力。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州医科大学

<120> 重组流感病毒及其在疫苗中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2091

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

tacacgtcgg gccgtcagga gaagaacccg gcgttacgta tgaagtggat gatggcgatg 60

aagtacccga tcacggcgga caagcgtatc acggagatga tcccggagcg taacgagcag 120

ggccagacgt tatggtcgaa gatgaacgac gcgggctcgg accgtgtcat ggtctcgccg 180

ttagcggtca cgtggtggaa ccgtaacggc ccgatcacga acacggtcca ctacccgaag 240

atctacaaga cgtactttga gcgtgtcgag cgtttaaagc acggcacgtt tggcccggtc 300

cactttcgta accaggtcaa gatccgtcgt cgtgtcgaca tcaacccggg ccacgcggac 360

ttatcggcga aggaggcgca ggacgtcatc atggaggtcg tctttccgaa cgaggtcggc 420

gcgcgtatct taacgtcgga gtcgcagtta acgatcacga aggagaagaa ggaggagtta 480

caggactgta agatctcgcc gttaatggtc gcgtacatgt tagagcgtga gttagtccgt 540

aagacgcgtt ttttaccggt cgcgggcggc acgtcgtcgg tctacatcga ggtcttacac 600

ttaacgcagg gcacgtgttg ggagcagatg tacacgccgg gcggcgaggt ccgtaacgac 660

gacgtcgacc agtcgttaat catcgcggcg cgtaacatcg tccgtcgtgc ggcggtctcg 720

gcggacccgt tagcgtcgtt attagagatg tgtcactcga cgcagatcgg cggcatccgt 780

atggtcgaca tcttacgtca gaacccgacg gaggagcagg cggtcgacat ctgtaaggcg 840

gcgatgggct tacgtatctc gtcgtcgttt tcgtttggcg gctttacgtt taagcgtacg 900

tcgggctcgt cggtcaagcg tgaggaggag gtcttaacgg gcaacttaca gacgttaaag 960

atccgtgtcc acgagggcta cgaggagttt acgatggtcg gccgtcgtgc gacggcgatc 1020

ttacgtaagg cgacgcgtcg tttaatccag ttaatcgtct cgggccgtga cgagcagtcg 1080

atcgcggagg cgatcatcgt cgcgatggtc ttttcgcagg aggactgtat gatcaaggcg 1140

gtccgtggcg acttaaactt tgtcaaccgt gcgaaccagc gtttaaaccc gatgcaccag 1200

ttattacgtc actttcagaa ggacgcgaag gtcttatttc agaactgggg cgtcgagccg 1260

atcgacaacg tcatgggcat gatcggcatc ttaccggaca tgacgccgtc gatcgagatg 1320

tcgatgcgtg gcgtccgtat ctcgaagatg ggcgtcgacg agtactcgtc gacggagcgt 1380

gtcgtcgtct cgatcgaccg ttttttacgt atccgtgacc agcgtggcaa cgtcttatta 1440

tcgccggagg aggtctcgga gacgcagggc acggagaagt taacgatcac gtactcgtcg 1500

tcgatgatgt gggagatcaa cggcccggag tcggtcttag tcaacacgta ccagtggatc 1560

atccgtaact gggagacggt caagatccag tggtcgcaga acccgacgat gttatacaac 1620

aagatggagt ttgagccgtt tcagtcgtta gtcccgaagg cgatccgtgg ccagtactcg 1680

ggctttgtcc gtacgttatt tcagcagatg cgtgacgtct taggcacgtt tgacacggcg 1740

cagatcatca agttattacc gtttgcggcg gcgccgccga agcagtcgcg tatgcagttt 1800

tcgtcgttta cggtcaacgt ccgtggctcg ggcatgcgta tcttagtccg tggcaactcg 1860

ccggtcttta actacaacaa ggcgacgaag cgtttaacgg tcttaggcaa ggacgcgggc 1920

acgttaacgg aggacccgga cgagggcacg gcgggcgtcg agtcggcggt cttacgtggc 1980

tttttaatct taggcaagga ggacaagcgt tacggcccgg cgttatcgat caacgagtta 2040

tcgaacttag cgaagggcga gaaggcgaac gtcttaatcg gccagggcga c 2091

<210> 2

<211> 1665

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

ttagtcttat tatcggcgtt agcggcggcg gacgcggaca cgatctgtat cggctaccac 60

gcgaacaact cgacggacac ggtcgacacg gtcttagaga agaacgtcac ggtcacgcac 120

tcggtcaact tattagagga ctcgcacaac ggcaagttat gtcgtttaaa gggcatcgcg 180

ccgttacagt taggcaagtg taacatcgcg ggctggttat taggcaaccc ggagtgtgac 240

ccgttattac cggtccgttc gtggtcgtac atcgtcgaga cgccgaactc ggagaacggc 300

atctgttacc cgggcgactt tatcgactac gaggagttac gtgagcagtt atcgtcggtc 360

tcgtcgtttg agcgttttga gatctttccg aaggagtcgt cgtggccgaa ccacaacacg 420

aacggcgtca cggcggcgtg ttcgcacgag ggcaagtcgt cgttttaccg taacttatta 480

tggttaacgg agaaggaggg ctcgtacccg aagttaaaga actcgtacgt caacaagaag 540

ggcaaggagg tcttagtctt atggggcatc caccacccgc cgaactcgaa ggagcagcag 600

aacatctacc agaacgagaa cgcgtacgtc tcggtcgtca cgtcgaacta caaccgtcgt 660

tttacgccgg agatcgcgga gcgtccgaag gtccgtgacc aggcgggccg tatgaactac 720

tactggacgt tattaaagcc gggcgacacg atcatctttg aggcgaacgg caacttaatc 780

gcgccgatgt acgcgtttgc gttatcgcgt ggctttggct cgggcatcat cacgtcgaac 840

gcgtcgatgc acgagtgtaa cacgaagtgt cagacgccgt taggcgcgat caactcgtcg 900

ttaccgtacc agaacatcca cccggtcacg atcggcgagt gtccgaagta cgtccgttcg 960

gcgaagttac gtatggtcac gggcttacgt aacacgccgt cgatccagtc gcgtggctta 1020

tttggcgcga tcgcgggctt tatcgagggc ggctggacgg gcatgatcga cggctggtac 1080

ggctaccacc accagaacga gcagggctcg ggctacgcgg cggaccagaa gtcgacgcag 1140

aacgcgatca acggcatcac gaacaaggtc aacacggtca tcgagaagat gaacatccag 1200

tttacggcgg tcggcaagga gtttaacaag ttagagaagc gtatggagaa cttaaacaag 1260

aaggtcgacg acggcttttt agacatctgg acgtacaacg cggagttatt agtcttatta 1320

gagaacgagc gtacgttaga ctttcacgac tcgaacgtca agaacttata cgagaaggtc 1380

aagtcgcagt taaagaacaa cgcgaaggag atcggcaacg gctgttttga gttttaccac 1440

aagtgtgaca acgagtgtat ggagtcggtc cgtaacggca cgtacgacta cccgaagtac 1500

tcggaggagt cgaagttaaa ccgtgagaag gtcgacggcg tcaagttaga gtcgatgggc 1560

atctaccaga tcttagcgat ctactcgacg gtcgcgtcgt cgctggtgct tttggtctcc 1620

ctgggggcaa tcagtttctg gatgtgttct aatggatctt tgcag 1665

<210> 3

<211> 1317

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

aacgcgacgg agatccgtgc gtcggtcggc aagatgatcg gcggcatcgg ccgtttttac 60

atccagatgt gtacggagtt aaagttatcg gactacgagg gccgtttaat ccagaactcg 120

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gagcacccgt cggcgggcaa ggacccgaag aagacgggcg gcccgatcta ccgtcgtgtc 240

aacggcaagt ggatgcgtga gttaatctta tacgacaagg aggagatccg tcgtatctgg 300

cgtcaggcga acaacggcga cgacgcgacg gcgggcttaa cgcacatgat gatctggcac 360

tcgaacttaa acgacgcgac gtaccagcgt acgcgtgcgt tagtccgtac gggcatggac 420

ccgcgtatgt gttcgttaat gcagggctcg acgttaccgc gtcgttcggg cgcggcgggc 480

gcggcggtca agggcgtcgg cacgatggtc atggagttag tccgtatgat caagcgtggc 540

atcaacgacc gtaacttttg gcgtggcgag aacggccgta agacgcgtat cgcgtacgag 600

cgtatgtgta acatcttaaa gggcaagttt cagacggcgg cgcagaaggc gatgatggac 660

caggtccgtg agtcgcgtaa cccgggcaac gcggagtttg aggacttaac gtttttagcg 720

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<210> 4

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Claims

1.重组流感病毒，该病毒基因组被引入如下基因区域突变而被减毒：

PB2的127-2217位碱基片段替换为SEQ ID NO:1；

HA的48-1712位碱基片段替换为SEQ ID NO:2；

NP的106-1422位碱基片段替换为SEQ ID NO:3；

NA的42-1346位碱基片段替换为SEQ ID NO:4；

NS的166-495位碱基片段替换为SEQ ID NO:5；所述重组流感病毒为A/PR/8/34株流感病毒。

2.细胞，其被权利要求1所述的重组流感病毒所感染。

3.权利要求1所述的重组流感病毒的制备方法，该方法包括在能够将所述重组流感病毒的基因组核酸片段组装到病毒颗粒中的条件下将该片段引入宿主细胞。

4.疫苗，其含有权利要求1所述的重组流感病毒。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其进一步包含佐剂。

6.成套试剂盒，其包含权利要求4或5所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。