MXPA04000589A - Virus de la rabia atenuado con mutacion de nucleoproteina en el sitio de fosforilacion para vacunacion contra la rabia y terapia genetica en el snc. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un virus mutante el cual contiene una mutacion en un sitio de fosforilacion en una o mas de las proteinas del virus, mutacion la cual hace que el virus sea atenuado, y por lo tanto, pueda ser producida una composicion de vacuna mejorada con este. La invencion tambien se relaciona con composiciones de vacuna que contienen el virus mutante, asi como con metodos para inducir una respuesta inmune, y para proteger mamiferos contra la infeccion por el virus de la rabia. Tambien se incluyen en la invencion metodos para producir el virus mutante y proteinas virales mutantes, incluyendo la produccion del virus mutante en una celula hospedera la cual produce o aun mejor sobreproduce una contraparte natural de la proteina viral mutante, la cual complementa a las otras proteinas virales, de modo que sea optimizada la produccion de la particula viral mutante. La invencion tambien incluye aquellas celulas hospederas en las cuales la produccion viral esta optimizada, asi como las composiciones que incluyen las proteinas virales, solas o en combinacion con el virus intacto, y con metodos para inducir una respuesta inmune o para proteger a un mamifero contra la infeccion, usando el mismo. Tambien incluidos en la invencion estan vectores adecuados para proporcionar un gen a una celula de un humano o un animal, asi como los metodos para proporcionar los mismos.

Description

VIRUS DE LA RABIA ATENUADO CON MUTACION DE NUCLEOPROTEINA EN EL SITIO DE FOSFORILACION PARA VACUNACION CONTRA LA RABIA Y TERAPIA GENETICA EN EL SNC ANTECEDENTES DE LA INVENCION Campo de la Invención La presente invención se relaciona, de manera general, con una composición de vacuna y, métodos para prevenir y tratar infecciones en humanos y animales con ésta. De manera más específica, la invención se relaciona con un virus de la rabia mutante donde la nucleoproteína mutó en el aminoácido donde ocurre la fosforilación. La invención también se relaciona con vectores para proporcionar un gen a un humano o animal, y métodos para proporcionar el gen a éstos.

Descripción de la Técnica Relacionada Dentro de la familia J?iiaj doviridae, el virus de la rabia es el prototipo del género Lyssavirus y el virus de la estomatitis vesicular (VSV) es el prototipo del género Vesiculovirus (Wagner y Rose, 1996) . El ARN genómico es encapsulado con nucleoproteína (N) y este complejo N-ARN junto con la fosfoproteína (P, también llamada NS) y ARN polimerasa dependiente del ARN (L) , forma el complejo RNP . La proteína N de los rhabdovirus, al igual que la proteína N de otros miembros del orden de los monomegavirales , juega papeles vitales en la regulación de la transcripción y reproducción del ARM viral encapsulando en ARN genómico viral sintetizado de novo. Aunque los N del virus de la rabia y VSV N no comparten un alto grado de homología en las secuencias nucleotídica y de proteínas primarias, tienen regiones conservadas y características proteicas similares. Por ejemplo, la proteína N del virus de la rabia tiene cuatro extensiones de aminoácidos conservadas homologas al del VSV (Tordo et al., 1986). Además, existe una estructura helicoidal similar de la proteína N en ambos virus de la rabia y VSV, con una hélice a que continúa desde el N-terminal hasta la mayoría de la proteína, y una vuelta ß hacia el C-terminal (Barr et al., 1991) Sin embargo, existe una diferencia estructural mayor entre el N del virus de la rabia y el VSV N. El N del virus de la rabia está fosforilado mientras que el VSV N no (Sokol y Clark, 1973) . La fosforilación ha sido trazada en el residuo de serina en la posición 389 del N del virus de la rabia (Dietzschold et al., 1987). Anteriormente, se demostró que la desfosforilación de N del virus de la rabia o mutación de la serina 389 a alanina dio como resultado un incremento de la unión a ARN líder sintetizado in vitro (Yang et al., 1999) . Además, la mutación de la serina fosforilada a alanina dio como resultado la reducción de la transcripción y reproducción viral de un ARN minigenómico del virus de la rabia (Yang et al., 1999). Sin embargo, en el sistema de minigenoma, las proteínas virales necesarias para la transcripción y reproducción viral fueron sintetizadas por polimerasa T7 , y de éste modo su síntesis no fue bajo el control de la maquinaria reguladora del virus de la rabia. La rabia ha tenido siempre un aura de tragedia y misterio. Su expresión clínica dramática y su resultado casi siempre fatal garantiza que a la prevención de la rabia se le dé una alta prioridad. A pesar del progreso significativo en la investigación biológica, la rabia sigue siendo una enfermedad global significativa. Anualmente, se estiman más de 70,000 fatalidades humanas, y otros millones requieren tratamiento posexposición (Meslin et al., 1994; Anonymous, 1993) . Aunque los humanos son el hospedero final muerto, la enfermedad es epizoótica o enzoótica en animales domésticos ,así como en la vida silvestre (Fu, 1997; Rupprecht et al., 1995; Smith et al., 1995) . Los perros siguen siendo el reservorio más importante en Asia, Africa, y América Latina donde ocurren la mayoría de los casos de rabia en humanos (Fu, 1997) . En países donde la rabia en los perros es controlada a través de la vacunación de los animales, el número de casos humanos se ha reducido considerablemente (Smith et al., 1995) . Sin embargo, la rabia en la vida silvestre representa un problema más desafiante en esos países (Rupprecht et al., 1995; Smith et al., 1995). La rabia del zorro ha sido endémica en Europa y Norteamérica durante muchos años, aunque un esfuerzo reciente en la vacunación oral ha sido exitoso en la reducción o aún eliminación de la rabia en muchas partes de Europa (Brochier et al., 1991) . En los Estados Unidos, la rabia de la vida silvestre contribuyó a más del 90% de los casos de rabia reportadas (más de 7,000 cada año) en la década pasada (Rupprecht et al., 1995; Smith et al., 1995; Krebs et al., 2000a; Krebs et al., 2000b) y existen al menos cinco reservorios de rabia en la vida silvestre principales que mantienen epizoóticos concurrentes (Smith et al., 1995). La rabia epizoótica en mapaches continúa ocurriendo en todos los estados a lo largo de la costa Este, y se está propagando hacia el Oeste, hacia Ohio, Virginia Occidental, y hacia Alabama (Krebs et al., 2000b). La rabia del zorrillo sigue siendo enzoótica en los estados ^centrales y California (Krebs et al., 2000b) . La rabia del zorro ocurre esporádicamente en Arizona, Alaska, y Texas y también en los estados del este donde la rabia del mapache es epizoótica (Krebs et al., 2000b). La rabia del murciélago está ampliamente distribuida a través de los 48 estados contiguos (Krebs et al., 2000b) . Esas rabias epizoóticas de la vida silvestre presentan una amenaza a la salud de los humanos. Por lo tanto, controlar la rabia y proteger a los humanos contra la infección por el virus de la rabia requiere estrategias de control multicapa, particularmente la vacunación de los humanos antes o después de la exposición, vacunación regular de animales mascota, y vacunación de la vida silvestre. La vacunación de los humanos después de la exposición puede ser fechada hacia atrás en la época de Pasteur cuando él inyectó a Joseph Meister con un virus de la rabia atenuada producido a partir de tejido neuronal (Pasteur et al., 1996) . Desde entonces, las vacunas contra la rabia humana han pasado a través de mejoras sucesivas, particularmente el desarrollo de vacunas de cultivos de células diploides humanas (HDCV) por Koprowski y asociados en el Instituto Wistar (Wiktor et al., 1964). La vacuna de cultivo celular no es solo segura en comparación con las vacunas de cerebro viejas debido a que no contienen tejidos neuronales, sino que también es más efectiva. Las personas inmunizadas con HDCV desarrollaron altos títulos de anticuerpo neutralizante del virus (VNA) tan pronto como a los 10 días después de la inoculación, en comparación con aquellos inmunizados con la vacuna de tejido nervioso en quienes los títulos de anticuerpo neutralizante no alcanzaron niveles protectores hasta 30 días después de la inmunización (Wiktor et al., 1964). Actualmente, muchos de los derivados de vacunas de cultivo tisular son similares a la HDCV, y son efectivos y bien tolerados. Ellos incluyen a la vacuna de células de embrión de pollo purificadas (PCEC, Barth et al., 1984; Se gal et al., 1993), la vacuna contra la rabia de células Vero purificadas (PVRV, Suntharasamai et al., 1986) y la vacuna de células de embrión de pato purificadas (PDRV, Khawplod et al., 1995). Un tratamiento posexposición típico para un individuo mordido por un animal con rabia o que se sospeche que tenga rabia consiste de la administración inmediata de inyecciones múltiples de una de las vacunas de cultivo tisular mencionadas anteriormente. Dependiendo de la naturaleza y seguridad de la mordida, también se recomienda que los individuos reciban antisuero antirrabia preparado ya sea en animales (usualmente en equinos) o preferiblemente en humanos ( inmunoglobulina de la rabia humana, o HRIG) (Anonymous, 2000) . De manera menos frecuente y bajo circunstancias especiales, los humanos considerados en riesgo de exposición a la rabia no evidente, como los oficiales de «control animal, veterinarios y personal de laboratorio que trabaje con el virus son inmunizados contra la rabia, la cual se conoce como vacunación preexposición (Anonymous, 2000) . Aunque las vacunas de cultivo tisular son seguras y efectivas, existen problemas. Debido a que todas esas vacunas son producidas a partir de virus inactivados, se requieren dosis múltiples durante un periodo de tiempo prolongado para estimular respuestas inmunes óptimas (Anonymous, 2000). No completar toda la serie de vacunación puede dar como resultado el desarrollo de enfermedades (Shill et al., 1987; Lumbiganon et al., 1987; Anonymous , 1988). Las reacciones alérgicas a las proteínas contenidas dentro de las vacunas de cultivo celular ocurren en aproximadamente el 6% de los vacunados a quienes se les dieron inyecciones de refuerzo (CDC, 1984) . En realidad, existen algunas evidencias de que las reacciones adversas más severas son hacia la alúmina humana desnaturalizada por la ß-propiolactona usada para inactivar el virus (Warrington et al., 1987; Swanson et al., 1987; Anderson et al., 1987) . Además, el alto costo de esas vacunas de cultivo tisular hace difícil utilizarla efectivamente en países en desarrollo donde se necesita más.

El tratamiento posexposición puede exceder de $2,000 a 3,000 dólares (en los Estados Unidos) por caso (Melter, 1996) . La mayoría de los casos de rabia humana ocurren en países en desarrollo, donde los vacunados no pueden pagar esta ,cantidad. De este modo, una vacuna usada frecuentemente para la rabia en países en desarrollo es de tejido neural animal, usualmente producida en ganado vacuno o en cerebros de ratones lactantes (vacuna de Fuenzalida) (Fuenzalida, 1972).

Usualmente se requieren veintiún dosis de vacuna de tejido nervioso por inyección intraperitoneal , y esas vacunas pueden causar enfermedades neurológicas (Trejos et al., 1974) . La vacunación de mascotas (perros y gatos) en los Estados Unidos es llevada a cabo de acuerdo a lo recomendado en el compendio de la Prevención y Control de la Rabia en Animales por la Asociación Nacional de Veterinarios de Salud Pública Estatal (Anonymous, 2000) . Usualmente los animales mascotas son inmunizados a las 6 semanas de edad y revacunados anual o trienalmente dependiendo de las vacunas usadas (Anonymous, 2000) . La mayoría de las vacunas para la rabia aprobadas para mascotas son virus de la rabia inactivados . Recientemente, fue aprobado el pox ???-us de canario que expresa virus de la rabia G recombinante para la inmunización de gatos (Anonymous, 2000) . Aunque esas vacunas proporcionan protección adecuada en perros y gatos, las vacunas inducen reacciones locales ( ilcock et al., 1986). Además, se requieren inmunizaciones múltiples para mantener una inmunidad suficiente a través de la vida (Anonymous, 2000) . Los perros inmunizados repetidamente con vacunas comerciales pueden no siempre mantener títulos adecuados, y 'únicamente un tercio de los perros mostró títulos de VNA superiores a una línea de 1:5 base (Tims et al., 2000). Adem s, la vacunación de cachorros de menos de 3 meses de edad no induce inmunidad protectora, aunque los anticuerpos maternos transferidos de las perras declinó a niveles indetectables a las 6 semanas de edad (Aghomo et al., 1990) . Existe un periodo de tiempo de mengua del anticuerpo materno hasta el momento de la inmunidad activa en la cual los animales jóvenes pueden no estar protegidos (Mitmoonpi ak et al., 1998 ; Clark et al., 1996). La rabia de la vida silvestre existe en muchos países y continúa representando una amenaza a la salud pública mayor. Los esfuerzos por controlar la rabia de la vida silvestre durante las últimas dos décadas tanto en Europa como en Norteamérica han sido dirigidos hacia la vacunación oral (Baer, 1988) . Inicialmente, se usó un virus de la rabia atenuado, cepa Street Alabama Dufferin B19 (SAD) , y este no causó rabia cuando fue administrado oralmente a zorros (Baer, 1988). Ensayos de campo para vacunar zorros rojos en países Europeos con SAD en cebos de cabeza de pollo dieron como resultado más de 60% de zorros inmunes a la rabia y detuvo la propagación de la enfermedad hacia áreas no tratadas (Wandeler et al., 1998; Schneider et al., 1988). Sin embargo, la SAD causa aún enfermedades en roedores (Winkler et al., 1976) y en animales domésticos (Esh et al.., 1982) . "Posteriormente, se desarrolló un vacuna de virus recombinante que expresa al virus de la rabia G (VRG) (Kieny et al, 1984) y se encontró que era un inmunógeno oral efectivo para mapaches y zorros bajo condiciones de laboratorio (Rupprecht et al., 1986; Blancou et al., 1986) . Además se llevó a cabo la prueba VRG en cebos de harina de pescado en animales en estado silvestre, y se ha demostrado que el VRG es seguro (Brochier et al., 1989; Rupprecht et al., 1993). Ni la morbilidad o mortalidad asociada con la vacuna ni lesiones evidentes o efectos laterales dañinos han sido asociados con la vacunación en especies animales objetivo y no objetivo. La vacuna también es eficaz en la inducción de inmunidad protectora y la aplicación en el campo con VRG dio como resultado la eliminación a gran escala de la rabia del zorro en áreas vacunadas en Europa (Brochier et al., 1991). La aplicación similar del VRG en los Estados Unidos ha dado como resultado un bloqueo de la rabia del coyote difundida en Texas (Fearneyhough et al., 1988), y la rabia del mapache difundida en otros estados (Hanlon et al., 1998; Robbins et al., 1998; Roscoe et al., 1998) . Aunque el VRG es seguro en animales vacunados y eficaz en la estimulación de inmunidad en especies animales objetivo, el incidente reciente que implicó a una mujer embarazada subraya el riesgo de usar esas vacunas recombinantes aún en animales de la vida silvestres, particularmente en áreas densamente pobladas (Rupprecht et "al., 2001) . La mujer fue mordida en el dedo y el antebrazo izquierdo cuando trató de remover un cebo cargado con virus recombinante VRG del hocico de su perro. A los 10 días ella desarrolló una reacción inflamatoria local intensa alrededor de dos lesiones necróticas en los sitios de la mordedura en el antebrazo y adenitis. Ella pasó a desarrollar eitroderma generalizado, el cual eventualmente subsistió después de la exfoliación (Rupprecht et al., 2001). Este incidente arroja dudas sobre el uso a futuro del VRG como vacuna para la rabia para la vida silvestre. Está claro que las vacunas actuales usadas en humanos y otros animales tienen problemas de seguridad, efectividad, y costo. Son necesarias vacunas más efectivas, seguras y baratas para controlar la rabia en animales y prevenir la rabia en humanos . Están siendo desarrolladas y probadas muchas vacunas novedosas incluyendo vacunas de ADN y otras vacunas recombinantes . Han sido encontrados vectores de ADN que expresan el virus de la rabia G que estimulan a células auxiliares T y la producción de virus de la rabia VNA (Xiang et al., 1994) . Además, la inmunización de ratones con esos vectores de ADN protegió a ratones y monos contra infecciones desafiantes posteriores con virus de la rabia letal (Xiang et al., 1994; Ray et al., 1997; Lodmell et al., 1998) . Sin embargo, la inducción de respuesta inmunes por vacunas de ADN usualmente toma más tiempo, y la magnitud de ¦la respuesta inmune es menor en comparación con las vacunas convencionales (Xiang et al., 1994; Osorio et al., 1999). También han sido desarrollados adenovirus humanos recombinantes que expresan los virus de la rabia G (Prevec et al., 1990; Xiang et al., 1996) . Las vacunas de adenovirus recombinante pueden inducir VNA y proteger a los animales vacunados (ratones, perros, zorrillos y zorros) contra infecciones desafiantes (Tims et al., 2000; Prevec et al., 1990; Xiang et al., 1996; Charlton et al., 1992; Wang et al., 1997) . Existen problemas con el vector adenoviral en las respuestas inmunes dirigidas a las proteínas adenovirales ( ang et al., 1997). La inmunidad antiadenovirual preexistente puede evitar la absorción de la vacuna por las células que necesiten la expresión del gen objetivo y, de este modo, dañar las respuestas inmunes activas al antígeno objetivo. Además, la revacunación o vacunación con vector adenoviral que exprese un antigeno objetivo diferente no puede ya ser efectiva. Las vacunas de virus atenuados vivos han sido conocidas desde hace mucho tiempo por ser más efectivas en la inducción de inmunidad humoral y mediada por células duradera, y muchas enfermedades son controladas o erradicadas usando vacunas virales modificadas vivas. La erradicación global de la viruela es lograda esencialmente mediante el uso de una vacuna del virus de la viruela de la vaca menos "virulenta (Henderson, 1980) . La poliomielitis esta sobre el margen de erradicación global debido a la vacunación masiva con vacunas contra la polio vivas (Sabin et al., 1973) . Muchas otras enfermedades virales como el sarampión, las paperas, y la rubéola, por solo nombrar unas cuantas, son puestas bajo control por vacunas con virus modificados vivos (Arvin, 2000) . De este modo, una vacuna de virus de la rabia modificado vivo puede tener ventaja sobre las vacunas autorizadas actualmente al proporcionar inmunidad duradera y reducir la dosis requerida. Como resultado, el costo disminuirá notablemente. Sin embargo, esas vacunas de la rabia modificadas vivas deben ser completamente avirulentas, particularmente para humanos. Hasta este punto, la cepa de SAD del virus de la rabia, la cual fue usada inicialmente para la vacunación de la vida silvestre en los años 8Os (Baer, 1988; Wandeler et al., 1998; Schneider et al., 1988), fue atenuada aún más por selección sucesiva usando anticuerpos monoclonales (Acm) neutralizante, dando como resultado la selección de las cepas SAG1 y SAG2 (Le Blois et al., 1990; Flamand et al., 1993; Schumacher et al., 1993 ; Lafay et al., 1994). La selección de SAG1 y SAG2 usando Acm se basó en el descubrimiento inicial de que la mutación en la glicoproteína en la arginina 333 reduce la virulencia del virus de la rabia (Dietzschold et al., 1983 ; Seif et al., 1985) . El virus SAG1 posee una mutación en la posición 333, donde la arginina está reemplazada por lisina (Lafay et al., 1994) . En comparación con la cepa SAD, la cual es aún patógena en ratones adultos por la ruta de inoculación intracerebral (i.c.), el virus SAG1 es avirulento cuando se da a ratones adultos por vía i.c, intramuscular (i.m.), y por os (Le Blois et al., 1990; Lafay et al., 1994). El virus SAG1 es tan efectivo como el SAD en la vacunación de zorros vía la ruta oral (Le Blois et al., 1990) . Para estabilizar al virus avirulento, fue seleccionado un virus SAG2 con un Acm adicional (Lafay et al., 1994). El SAG2 tiene mutaciones dobles en la posición 333, cambiando de arginina (AGA) a ácido glutámico (GAA) , las cuales reducen aún más la posibilidad de que el virus se convierta en uno del tipo silvestre virulento (wt) (Schumacher at al., 1993; Lafay et al., 1994) . El virus SAG2 es avirulento para roedores, zorros, gatos y perros adultos por cualquier ruta de inoculación (Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994). La vacunación oral de zorros y perros ha dado como resultado la protección contra un desafío letal con el virus de la rabia. Ensayos de campo con SAG2 en la inmunización de zorros y perros demostró su seguridad e inmunogenicidad ( asson et al., 1996) . Sin embargo, el SAG 2 puede inducir rabia en animales lactantes por inoculación i.c. (Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994), dando lugar a la posibilidad de que los animales más jóvenes o animales inmunocomprometidos "puedan aún ser infectados con el virus si desarrollar la enfermedad . Esos virus mutantes seleccionados con cambios en la arginina 333 el pozo de la replica G en cultivo celular, sugiriendo que la velocidad de reproducción viral de esos virus no es afectada (Lafay, et al 1994) . Sin embargo, la investigación de la capacidad de esos virus para invadir el sistema nervioso reveló que el virus puede invadir las neuronas del primer orden pero no se propaga hacia neuronas secundarias o terciarias, indicando que la capacidad de esos virus mutantes para propagarse en el sistema nervioso vía la unión sináptica es reducido (Coulon et al., 1989). La propagación sináptica es la ruta principal para la diseminación del virus en el SNC adulto (Gosztonyi et al., 1993). En animales neonatos, la propagación simpática puede ser la única forma para la diseminación del virus . Debido a que el desarrollo de mielina no puede ser completo en animales neonatos, el virus de la rabia también puede propagarse de neuronas infectadas a no infectadas en animales neonatos brotando de las neuronas infectadas e infectando otras neuronas no infectadas, más o menos como en los cultivos celulares (Díetzschold et al., 1985). Por lo tanto, puede ser necesaria la reducción de la velocidad de reproducción viral para desarrollar vacunas de virus de la rabia avirulentas . Al igual que otros virus de ARN no '¦'segmentados, de una sola hebra, la transcripción y reproducción del virus de la rabia es regulada por una interacción complicada entre los componentes dentro del complejo de ribonucleoproteína (RNP) . La RNP está compuesta del ARN genómico, el cual está encapsulado por la nucleoproteína (N) , junto con la fosfoproteína (P) , y la ARN polimerasa dependiente del ARN (L) ( unner, 1991) . Teóricamente, la mutación de esas proteínas virales puede dar como resultado una de reproducción reducida para el virus de la rabia. Con el desarrollo reciente de la tecnología de la genética inversa para el ARN del virus de hebra negativa (Enami et al., 1990 ; Pattnaik et al., 1990; Pattnaik et al., 1991; Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994), la manipulación del genoma viral para este grupo de virus se ha vuelto, posibles (Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994; Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995) . La aplicación de esta tecnología ha dado come resultado una mejor comprensión de como este grupo de virus regula su transcripción y reproducción (Enami et al., 1990; Pattnaik et al., 1990; Pattnaik et al., 1991; Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994; Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995) y como cada una de las proteínas virales funcionan en el ciclo de reproducción (Pattnaik et al., 1990) y en su patogenicidad (Etessami et al., 2000) . La aplicación de esta tecnología también ha dado como resultado la 'atenuación de esos virus y algunos de ellos podrían ser desarrollados como vacunas (Wertz et al . , 1998) o vectores para terapia genética (Finke et al., 1997) . N es el primer producto transcrito del genoma viral y es expresada abundantemente en células infectadas para todos los ARN de virus de hebra negativa (Wunner, 1991) . Se ha propuesto que N juegue un papel crucial en la transmisión de la transcripción del ARN a la reproducción por encapsulación del ARN genómico naciente (Wunner, 1991) . La mutación de M podría conducir, potencialmente , a un fenotipo atenuado. En realidad, mover la nucleoproteína (N) a otros lugares sobre el genoma viral dio como resultado la atenuación del virus de la estomatitis vesicular (VSV) ( ertz et al., 1998) . Esto lo causó la inhibición de la reproducción viral debido a la expresión reducida de la proteína N. Recientemente, hemos construido un virus de la rabia mutante con cambios sobre el sitios de fosforilación de N y encontramos que la velocidad de reproducción viral se redujo en más de 5 veces y la producción de virus se redujo más de 10,000 veces, indicando la atenuación del virus de la rabia mutante (Wu et al., 2002). La rabia representa aún más un problema de salud pública que produce más de 70,000 muertes humanas cada año. Los humanos quedan infectados con el virus de la rabia principalmente a través de mordidas de animales domésticos y "silvestres con rabia. El control de la infección por el virus de la rabia en animales domésticos y silvestres, por lo tanto, no únicamente reduce la mortalidad en esos animales sino que también reduce el riesgo de exposición a humanos. Las vacunaciones preexposición para personas que están constantemente en riesgo previene además la rabia en humanos, como lo hacen las inmunizaciones posexposíción para personas que sean mordidas por animales con rabia o que se sospeche que tengan rabia. En los últimos pocos años, ha sido usado un vaccinia virus recombinante que expresa la glicoproteína del virus de la rabia (VRG) para controlar la rabia en la vida silvestre. Las vacunas de virus de la rabia inactivadas son usadas para inmunizar animales domésticos, particularmente mascotas. Las vacunas de virus de la rabia purificadas e inactivadas son usadas para humanos en escenarios pre o posexposición. Aunque esas vacunas son efectivas, se requieren vacunaciones anuales para mantener una inmunidad adecuada en mascotas. Para humanos, se requieren dosis múltiples de las vacunas de cultivo tisular inactivadas para estimular respuestas inmunes óptimas. Además, las vacunas de cultivo tisular actuales son caras; de este modo la mayoría de las personas que necesiten vacunaciones (en países en desarrollo) no pueden pagarlas. En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar vacunas contra el virus de la rabia más eficaces y abastecibles . Por lo tanto, en vista de las deficiencias mencionadas anteriormente inherentes a los métodos de la técnica anterior para vacunar humanos y animales contra el virus de la rabia, será evidente que existe aún la necesidad en la técnica de un método seguro y barato para el mismo.

SUMARIO DE LA INVENCION De acuerdo con la presente invención, se proporciona un virus mutante el cual contiene una mutación en un sitio de fosforilación en una o más de las proteínas del virus, mutación la cual hace que el virus sea atenuado, y por lo tanto puede ser producido en la composición de vacuna mejorada con este. En particular, se proporciona un virus de la rabia mutante, donde el virus contiene una proteína N del virus de la rabia mutante, la cual tiene un aminoácido diferente a la serina en la posición 389. Adicionalmente , el virus mutante puede contener una o más mutaciones dentro de la proteína N, o en otras de las proteínas virales, por ejemplo, en la glicoproteína G. La invención también se relaciona con composiciones de vacunas las cuales contienen el virus mutante, así como métodos para inducir una respuesta inmune, y para proteger mamíferos contra la infección por el virus de la rabia. También se incluyen en la invención métodos para ¦producir el virus mutante y las proteínas virales mutantes, incluyendo la producción del virus mutante en una célula hospedera la cual produce o aún sobreproduce una contraparte natural de la proteína natural mutante, que complementa las otras proteínas virales de modo que la producción de la partícula viral mutante sea optimizada. La invención también incluye a aquellas células hospederas en las cuales la producción viral está optimizada. También se incluyen dentro de la invención los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas virales mutantes, y ácidos nucleicos que codifican para una porción de, o toda la secuencia de ácido nucleico viral. Además, la invención incluye vectores que contienen las secuencias de ácido nucleico, incluyendo los vectores de la expresión, y células hospederas transformadas con las secuencias de ácido nucleico . La invención también incluye las proteínas virales codificadas por los ácidos nucleicos mutantes, composiciones de vacunas que incluyen las proteínas virales, solas o en combinación con el virus intacto, y con métodos para inducir una respuesta inmune o protectora a un mamífero contra la infección usando la misma. La invención también incluye anticuerpos para el virus mutante intacto y para las proteínas virales mutantes, y métodos para producir y usar los mismos . v También se incluyen en la invención vectores adecuados para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, así como métodos para proporcionar las mismas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra que la fosforilación de N afecta a la transcripción del ARN viral en el minigenoma.

Fueron infectadas células BSR con vaccinia virus recombinante vTF7-3 y a continuación transíectadas con el plásmido pRP, pT7T-L, pSDI-CAT junto con pRM (RN) , pRN-SA (SA) , pRN-SG (SG) , pRN-SD (SD) , pRN-SN (SN) , pRN-SE(SE) O pRN-SQ (SQ). Las células transfectadas con otros plásmidos pero sin N que expresan el plásmido (-N) fueron incluidas como controles. Las células fueron cosechadas para la medición de la actividad CAT por el ensayo Quan-T-CAT . Barras de error, desviaciones estándar. La Figura 2 demuestra que la fosforilación de N del virus de la rabia afecta la transcripción y reproducción del ARN viral. Las células BSR infectadas y transfectadas como se describió en la Figura 1 fueron cosechadas para su hibridación por manchado Northern o inmunoprecipitació . Fue purificado el ARN mensajero del ARN total y fueron purificados analógicos genómicos de RNP inmunoprecipitada con anticuerpos anti-N policlonales . Esas preparaciones ARN fueron hibridadas con la sonda de ADNc de CAT. El ARN total 'fue hibridado con una sonda oligosentido para la medición del ARN sentido negativo transcrito del plásmido que expresa el minigenoma. La proteína N expresada en las células fue inmunoprecipitada con anticuerpos anti-N policlonal. La figura 3 describe los efectos de las concentraciones de N sobre la transcripción viral . Fueron infectadas células BSR con vaccinia virus recombinante vTF7-3 y a continuación fueron transfectadas con los plásmidos pRP, pT7T-L, pSDI-CAT junto con pRN, pRN-SA (SA) , pRN-SD (SD) , o pRN-SE (SE) . Fueron usadas varias concentraciones (5,10, 15, y 20 ^ig) de plásraido de N o N imitante. Las células fueron cosechadas para el ensayo de CAT. La Figura 4 describe las curvas de crecimiento del virus para virus de la rabia t mutante en células BSR. Fueron infectadas células BSR con virus wt (L16) y virus mutante (L16A, L16D, o L16E) a una multiplicidad de infección (moi) de 1 ffu/célula y fueron removidas alícuotas del virus a los puntos temporales indicados y sometidas a titulación de virus . La Figura 5 muestra la detección de transcriptos virales y ARN genómico con la sonda N o G del virus de la rabia. El ARN total fue preparado a partir de células BSR infectadas con L16, L16A (A), L16D (D) , o L16E (E) y fue "hibridado con la sonda N (panel de la izquierda) o sonda G (panel de la derecha) . Los ARNm respectivos, el ARN genómico, (y los transcriptos de lectura completa posibles (RT) y/o ARN interfiriente defectuoso (DI) también están indicados. El ARN total también fue hibridado con la sonda de ß actina (panel inferior) . La cantidad de transcriptos de N y G y los productos de ARN genómico en relación a los del virus wt fueron cuantificados por densitometría . La Figura 6 muestra que la fosforilación de N también modula la transcripción viral . Las células BSR fueron infectadas con L16, L16A (A), L16D (D) , o L16E (E) ,- tratadas 1 hora más tarde sin (A) o con (B) CHX; y cosechadas a los puntos en el tiempo indicados para el aislamiento del ARN total. El ARN fue hibridado con una sonda de N. Los ARNm respectivos, el ARN genótnico, y los posibles transcriptor RT también son indicados. Al ARN total también fue hibridado con una sonda de ß actina (parte inferior) . Las cantidades de transcriptos de N en relación a los del virus wt fueron cuantxficados por densitometría. La Figura 7 muestra la cuantxficación de la relación entre el ARN genómico y el ARN antigenómico en las células infectadas y viriones purificados. Los ARN totales de las células infectadas o viriones purificados fueron hibridados con la sonda sentido o ribosondas antisentido preparadas a partir de pRN por transcripción in vi tro. Los niveles de ARN genómico y antigenómico fueron determinados por densitometría. La Figura 8 muestra un modelo propuesto para la fosforilación de N y su función en la transcripción y reproducción viral. N, una vez sintetizada, interactúa con P y/o L. En esta etapa, la N no está fosforilada. Es posible que a través de la interacción de N con (encapsulación de) al ARN genómico, N pase a través de cambios conformidacionales , los cuales exponen el sitio de fosforilación. Una vez que N es fosforilado, la repulsión de carga entre el ARN genómico y N ayuda a que L tenga acceso al patrón genómico para el inicio de la transcripción y reproducción del ARN viral. La figura 9 muestra la secuencia de ácido nucleico de la rabia completa. (L16 (nt 1235-1237), el TCT que codifica para la serina sobre la proteína N está con negrillas y subrayado) . La Figura 9A muestra la secuencia L16 natural (SEQ ID NO : 55) . La Figura 9B muestra la secuencia L16A (SEQ ID NO: 56), donde la serina ha sido reemplazada con alanina sobre la secuencia de N. La Figura 9C muestra la secuencia de L16Q (SEQ ID NO: 57), donde la serina ha sido reemplazada con glutamina sobre la secuencia de N. La Figura 9D muestra la secuencia de L16QG333 (SEQ ID NO: 58) , donde la serina ha sido reemplazada con glutamina sobre la proteína N en el nt 1235-1237 [TCT a CAA] (subrayado y con negrillas) y la arginina ha sido reemplazada con ácido glutámico en el nt 4370-4372 [AGA a GAA] (subrayado, con negrillas y con cursivas) . La Figura 10 muestra la secuencia de ácido nucleico de la proteína G del virus de la rabia. La Figura 10A (SEQ ID NO: 59) muestra la Arg 333 subrayada. La Figura 10B (SEQ ID NO: 60) muestra el Glu que es reemplazado a la Arg en la posición 333. La Figura 11 muestra la secuencia de ácido nucleico de la proteína N del virus de la rabia. La Figura HA muestra la secuencia natural (SEQ ID NO: 61) , la cual está subrayada a la serina fosforilada. La Figura 11B (SEQ ID NO: 62) muestra la mutación de serina a alanina (subrayado) . La Figura 11C (SEQ ID NO: 63) muestra la mutación de serina a glicina (subrayado) . La Figura 11D (SEQ ID NO: 64) muestra la mutación de serina a glutamina (subrayado) .

DESCRIPCION DETALLADA La presente invención se relaciona con vacunas de virus efectivas y proporcionables para humanos así como para animales, con métodos para fabricar las mismas, y con métodos para usar las mismas para inducir una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta inmune protectora en animales y humanos. Los virus adecuados incluyen, pero no se limitan a, el virus del sarampión, virus Respiratorio Sincitial (RSV) , virus de ébola y virus de la influenza, virus Sendai y RSV bovino . En particular, la invención se relaciona con (vacunas de virus vivos avirulentas que contiene virus mutantes en los cuales la fosforilaci'ón sobre la nucleoproteína N ha sido perturbada. Los virus adecuados, incluyen, pero no se limitan a, el virus del sarampión, virus Sincitial Respiratorio (RSV) , virus del ébola y virus de la influenza, los cuales están todos fosforilados sobre la proteína N. La fosforilación es perturbada por cualesquier medios adecuados, incluyendo la alteración del sitio de fosforilación por inserción, supresión o preferiblemente por sustitución. Además, la fosforilación puede ser perturbada por cambios en otras porciones de la proteína N, como la secuencia de consenso en otro sitio en la proteína N. Preferiblemente, la proteína N tiene un aminoácidos diferente a la serina en la posición 389, preferiblemente un aminoácido neutro, y de manera más preferible, alanina. Preferiblemente, el virus de la rabia mutante es codificado por una de las secuencias de la Figura 8, la proteína N del virus de la rabia mutante es codificada por una de las secuencias de la Figura 9, y/o la proteína G del virus de la rabia mutante es codificada por una de las secuencias de la Figura 10. La proteína N puede mutar para afectar la unión de la proteína N al ARN, a una porción de fosfato, o a sí misma. Esta modulación de las propiedades de unión de la nucleoproteína N afecta las funciones vitales del virus, como la reproducción. En una modalidad preferida, la invención está dirigida a vacunas del virus de la rabia vivas, avirulentas, que contienen virus mutantes en los cuales la fosforilación sobre la nucleoproteína N ha sido perturbada, ya sea por inserción, supresión, sustitución u otros medios apropiados. Preferiblemente, el virus tiene una velocidad de reproducción viral reducida (por la mutación de la nucleoproteína N o por reorganización de los genes dentro del genoma del virus de la rabia) . En una modalidad preferida una serina en la posición 389 de la nucleoproteína N es sustituida con alanina, glicina, glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico o asparagina . En una modalidad preferida, los virus también tienen una capacidad reducida para propagarse en el sistema nervioso (por mutación de la glicoproteína G) , preferiblemente en la posición 333 de la glicoproteína G. Los virus mutantes también pueden tener, de manera preferible, más de un cambio en cualquiera o ambas de las proteínas N y G, de modo que las oportunidades de reversión al fenotipo natural (wt) se reduzcan. Puede ser usada cualquier cepa del virus de la rabia en la cual el sitio de fosforilación este conservado. El sitio de fosforilación sobre la proteína N de todos los virus de la rabia conocidos hasta ahora está conservado. Además, el virus mutante de la invención puede ''contener una glicoproteína G de otro tipo de virus, para dirigir el tropismo de virus dentro del cuerpo. De este modo, los virus de la presente invención son probablemente útiles en terapia genética, para administrar proteínas terapéuticas o inmunogénicas a los humanos o animales a los cuales sean administrados . En particular, la glicoproteína G del virus de la rabia produce un tropismo por las células del CMS, y de este modo es adecuada para tratar enfermedades del CNS como el cáncer, incluyendo pero sin limitarse al neuroblastoma , y enfermedades neurodegenerativas incluyendo, pero sin limitarse a, la enfermedad de Alzheimer, enfermedades de Parkinson, enfermedad de Huntington. De igual modo, la proteína G del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) produce un tropismo por células G, y de este modo es adecuada para tratar trastornos mediados por células T mediante la entrega de genes a estas, incluyendo varios cánceres, y enfermedades que afectan a las células T, incluyendo el VIH. La glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) es pantrópica, y de este modo puede ser usada para administrarse a varios tipos de células. La glicoproteína G del RSV causa un tropismo por el epitelio, y de este modo es adecuada para la dirección hacia el pulmón y el tratamiento de trastornos del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, la fibrosis quística. La invención también se relación con métodos de uso del virus mutante para inducir una respuesta inmune, y de manera preferible, una respuesta inmune protectora en un humano o animal . También se incluyen en la invención células hospederas para producir el virus mutante, así como un método para producir las mismas. Preferiblemente, la célula hospedera es una célula hospedera de mamífero la cual produce una proteína N del virus de la rabia natural, preferiblemente una célula de hámster, de manera más preferible una célula BHK, y de manera más preferible, una célula hospedera la cual fue deposita en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, como número de depósito ATCC PTA-3544 en Julio 20,2001. La mutación sobre ambas de G y N o reubicación de esos genes conduce a la atenuación del virus en un grado tal que el virus no causa enfermedad en animales de ninguna edad ni por ninguna ruta de infección; aunque pueden inducir respuestas inmunes que proporcionen protección contra desafíos del virus de la rabia virulentos. Esto se basa en estudios recientes que demuestran lo siguiente. 1) la mutación de la serina fosforilada en 389 de N a alanina redujo la velocidad de reproducción viral en más de 5 veces y la producción del virus en más de 10,000 veces. 2) la mutación de G en el residuo 333 redujo dramáticamente la "virulencia y patogenicidad del virus de la rabia. 3) el arreglo de los genes en un virus relacionado, el virus de la estomatitis vesicular (VSV) , dio como resultado una atenuación y mejora de sus respuestas inmunes. Los virus de la rabia con mutaciones sobre ambas de G y N o con genes rearreglados son más atenuados que los virus de la rabia atenuados actualmente disponibles (que inducen aún rabia en animales neonatos) . Pueden ser desarrollados virus de la rabia atenuados adicionales que sean incapaces de inducir enfermedades en animales experimentales de cualquier edad y por cualquier ruta de inoculación, permaneciendo aún inmunogénicos en vacunas para la rabia vivas, modificadas para humanos y animales. De manera alternativa, la vacuna de la presente invención puede contener proteína N mutante asilada, en ausencia de virus intacto. Debido a que el mutante de fosforilación de N se agrega en un mayor grado que su contraparte natural , puede tener efectos adyuvantes mayores en comparación con las composiciones que contienen N natural. Las composiciones de vacuna de la invención pueden contener un adyuvante, incluyendo, pero sin limitarse, a antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg) o proteína G del virus de la rabia. La vacuna puede ser preparada usando cualquier portados o vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo solución salina básica de Hanks (HBSS) o. solución "salina amortiguada con fosfato (PBS) . Las composiciones de vacuna pueden ser administradas por cualquier ruta conocida, incluyendo la intradérmica, intramuscular y subcutánea, las cuales son las preferidas, así como la oral, vía la piel (abrasión epidérmica) o intranasal . De acuerdo con la presente invención pueden ser empleadas técnicas de biología molecular, microbiología, inmunología y ADN recombinante convencionales dentro del conocimiento de la técnica. Esas técnicas son explicadas completamente en la literatura, véase por ejemplo, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3rd edition, 2001) ,- "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III [Ausubel, R. M. , ed. (1999 y actualizado eventualmente)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook "Volúmenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994)]; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-IV [Coligan, J.E., ed. (1999 y actualizada eventualmente)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B . D. Hames & S. J. Higgins eds . (1985)]; "Transcrxption And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Culture of Animal Cells, 4ta edición" [R. I. Freshney, ed. (2000)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1998); Using Antibodies : A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I Harlow, Ed y Manual, Harlow, Ed and La e, David (Cold 'Spring Harbor Press, 1999) . Por lo tanto, si aparece aquí, los siguientes términos tendrán las definiciones expuestas a continuación. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo plásmido, cromosoma, virus) que funcione como una unidad autónoma de reproducción de ADN in vivo; es decir, capaz de reproducirse bajo su propio control. Un "vector" es un replicón con un plásmido, fago o cósmido, al cual puede ser unido otro segmento de ADN para llevar a cabo la reproducción del segmento unido. Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) o su forma de una sola hebra, o una hélice de doble hebra. Este término se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a cualesquier formas terciarias particulares . De este modo, el término incluye al ADN de doble hebra encontrado, nter alia, en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En la discusión de la estructura de moléculas de ADN de doble hebra particulares, las secuencias pueden ser descritas aquí de acuerdo a la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' junto con la hebra no transcrita de ADN (es decir la hebra que tiene una secuencia homóloga al ARNm) . Un "origen de reproducción" se refiere a. aquellas Secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN . Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN de doble hebra que es transcrita y traducida en un polipéptido in vivo cuando es colocado bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los limites de la secuencia de codificación son determinados por un codón de inicio en el (amino) terminal 5' del codón de finalización de la traducción en el (carboxilo) terminal 3'. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, secuencias procaríóticas , ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamíferos) , y aún secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y terminación de la transcripción de la secuencia se ubicará usualmente 3 ' a la secuencia codificadora . Las secuencias de control transcripcional y translacional son secuencias reguladoras de ADN, como promotores, mej oradores, señales de poliadenilación, terminadores , y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificadora en una célula huésped. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora corriente abajo (dirección 3') . Para propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora es unida en su 3' "terminal por el sirio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (en dirección a 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente por el trazo con nucleasa SI) , así como dominios de unión de proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos con frecuencia, pero no siempre, contienen casillas de "TATA" y casillas de "CAT" . Los promotores procarióticos contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de las secuencias de consenso -10 y -35. Una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de ADM que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificadora está "bajo el control" de secuencias de control de la transcripción y traducción en una célula cuando al ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora en ARNm, el cual es entonces traducido en la proteína codificada con la secuencia codificadora. Una "secuencia señal" puede ser incluida antes de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica para un péptido señal, N-terminal al polipéptido, que se comunica con la célula hospedera para dirigir el polipéptido a la "superficie celular o para secretar polipéptido a los medios, y este péptido señal es capturado por la célula hospedera antes de que la proteína abandone la célula. Las secuencias señal pueden ser encontradas asociadas con una variedad de proteínas nativas a procarxotes y eucariotes . El término "oligonucleótido" , como se usa aquí para referirse a la sonda de la presente invención, se define como una molécula comprendida de dos o más ribonucleótidos, preferiblemente más de tres . Su tamaño exacto dependerá de muchos factores los cuales, a su vez, dependen de la función y uso final del oligonucleótido . El termino "cebador" como se usa aquí se refiere a un oligonucleótido, ya sea natural como en una digestión de restricción purificada o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando es colocado bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión de cebador, el cual es complementario a una hebra de ácido nucleico, es inducida, en presencia de nucleótidos y un agente inductor como una ADN polimerasa y una temperatura y pH adecuados . El cebador puede ser de una sola hebra o de doble hebra y puede ser suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura, fuente del cebador y uso del método. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, el cebador oligonucleotídico típicamente contiene 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos . Los cebadores aguí son seleccionados para ser "sustancíalmente" complementarios a diferentes hebras de una secuencia de ADN objetivo particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridarse con sus hebras respectivas .

Por lo tanto, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del patrón. Por ejemplo, un fragmento nucleotídico no complementario puede ser unido al extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia del cebador siendo complementaria l'a hebra. De manera alternativa, pueden ser interpuestas bases no com lementarios o secuencias más largas en el cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga complementariedad suficiente con la secuencia de la hebra a hibridar con esta y por lo tanto forma el patrón para la síntesis del producto de extensión. Como se usan aquí, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales cortan ADN de doble hebra en o cerca de una secuencia nucleotídica específica. Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno o heterólogo cuando tal ADN ha sido introducido dentro de la "célula. El ADN transformante puede o no ser integrado (ligado covalentemente) al ADN cromosomal constituyendo el genoma de la célula. En procariotes, levaduras, y células de mamífero por ejemplo, el ADN transformante puede ser mantenido sobre un elemento episomal como un plásmido . Con respecto a células eucarióticas , una célula transformada establemente es una en la cual el ADN transformante ha sido integrado en un cromosoma de modo que es heredado por las células hijas a través de la reproducción del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de las células eucarióticas para establecer líneas celulares o clonas comprendidas de una población de células hijas que contengan al ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis . Una "línea celular" es una clona de una célula primaria que es capaz de crecer de manera estable in vi tro por muchas generaciones . Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homologas" cuando al menos aproximadamente el 75% (preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, y de manera más preferible al menos aproximadamente el 90 ó 95%) de los nucleótidos se aparean sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homologas pueden ser identificadas comparando las secuencias usando programas y sistemas de programación estándar 'disponibles en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, condiciones rigurosas, de acuerdo a lo definido por ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo ¡Maniatas et al., supra; DNA Cloning, Vols I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. Es bien sabido en la técnica que pueden ser usados los siguientes codones de manera intercambiable para codificar para cada aminoácido específico: Fenilalanina (Phe o F) UUU o UUC Leucina (Leu o L) UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG Isoleucina" (lie o I) AUU o AUC o AUA Metionina ( et o M) AUG Valina (Val o V) GUU o GUC de GUA o GUG Serina (Ser o S) UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC Prolina (Pro o P) CCU o CCC o CCA o CCG Treonina (T r o T) ACU o ACC o ACA o ACG Alanina (Ala o A) GCU o GCG o GCA o GCG Tirosina (Tyr o Y) UAU o UAC Histidina (His o H) CAU o CAC Glutamina (Gln o Q) CAA o CAG Asparagina (Asn o N) AAU o AAC Lisina (Lys o K) AAA O AAG Acido Aspártico (Asp o D) GAU o GAC Acido Glutámico (Glu o E) GAA o GAG Cisteina (Cys o C) UGU o UGC Arginina (Arg o R) CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG Glicina (Gly o G) GGU o GGC o GGA o GGG Triptófano (Trp o W) UGG Codón de terminación UAA (ocre) o UAG (ámbar) o UGA (ópalo) Deberá comprenderse que los codones especificados anteriormente son para secuencias de A . Los codones correspondientes para el ADN tienen una T sustituida por ü.

Pueden ser producidas mutaciones en las diferentes proteínas virales de modo que un codón particular sea cambiado a un color que codifique para un aminoácido diferente. Esa mutación puede ser producida fácilmente haciendo los menos cambios posibles de nucleótido. Una mutación de sustitución de este tipo puede ser pz'oducida para cambiar un aminoácido en la proteína resultante en una forma no conservativa (es decir, cambiando el codón de un aminoácido perteneciente a un grupo de aminoácidos que tenga un tamaño o características particulares o un aminoácido que pertenezca a otro grupo) o en una forna conservativa (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenezca a un grupo de aminoácidos que tenga un tamaño o característica particular a un aminoácido perteneciente al mismo grupo) . Ese cambio conservativo generalmente conduce a menos cambio en la estructura y función de la proteína resultante. Es más "probable que un cambio no conservativo altere la estructura, actividad o función de la proteína resultante, como los cambios inducidos por la ausencia de fosforilación sobre la nucleoproteína N. Puede ser preferible, en algunos casos, efectuar más de un cambio en la proteína viral, para reducir la posibilidad de la reversión al fenotipo natural. Los siguientes son un ejemplo de varios grupos de aminoácido : Aminoácidos con grupos R no polares Alanina Valina Leucina Isoleucina Prolina Fenilalanina Triptófano Metionina aminoácidos con grupos R polares sin cambio Glicina Serina Treonina Cisteína Tirosina ^Asparagina Glutamina Aminoácidos con grupos R polares cargados (cargados negativamente a pH 6.0) ácido aspártico ácido glutámico Aminoácidos básicos (cargados positivamente a pH 6.0) Lisina Arginina Histidina (a pH 6.0) otro grupo puede ser aquellos aminoácidos con grupo fenilo: Fenilalanina Triptófano Tirosina Otro grupo puede ser de acuerdo al peso molecular (es decir, el tamaño de los grupos R) Glicina 75 Alanina 89 Serina 105 Prolina 115 Valina 117 Treonina 119 Cisteína 121 Leucina 131 Isoleucina 131 Asparagina 132 ácido aspártico 133 Glutamina 146 Lisina 146 ácido glutámico 147 etionina 149 Histidina (a pH 6.0) 155 Fenilalanina 1S5 Argiriina 174 Tirosina 181 Triptófano 204 Las sustituciones particularmente preferidas son: - Lys por Arg y viceversa de modo que pueda ser mantenida una carga positiva; - Glu por Asp y viceversa de modo que pueda ser mantenida una carga negativa; - Ser por Thr de modo que pueda ser mantenida libre de -OH; y - Gln por Asn de modo que pueda ser mantenida libre de N¾ . Las sustituciones de aminoácidos también pueden ser introducidas para sustituir una aminoácido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, puede ser introducido un sitio potencial de Cys para puentes disulfuro con otra Cys. Puede ser introducida una Cys como un sitio particularmente "catalítico" (es decir, que la His puede actuar como un ácido o base y este es el aminoácido más común en la catálisis bioquímica) . Puede ser introducida Pro debido a su estructura particularmente plana, la cual induce vuelta JE en la estructura de la proteína. Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homologas" cuando al menos aproximadamente 70% de los aminoácidos residuales (preferiblemente al menos aproximadamente el 80% y de manera más preferible al menos aproximadamente 90 ó 95%) son idénticos, o representan sustituciones conservativas. Una región "heteróloga" del constructo de ADN es un segmento identificarle de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra en asociación con la molécula más grande en la naturaleza. De este modo, cuando la región heteróloga codifica para un gen de mamífero, el gen usualmente será flanqueado por ADN que no flanquea al ADN genómico de mamífero y del genoma del organismo de origen. Otro ejemplo de una secuencia codificadora heteróloga es un constructo donde la secuencia codificadora en si no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia codificadora genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que contienen diferentes codones que el gen nativo) . Las variaciones alélicas o eventos de mutación que ocurren en la naturaleza no dan lugar a , regiones "heterólogas de ADN como se definió aquí. Un "anticuerpo" es una inmunoglobulina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se unen a un epitopo específico. El término abarca anticuerpos policlonales , monoclonales y quiméricos, el último mencionado descrito con mayor detalle en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,816,397 y 4,816,567. Un "sitio de combinación de anticuerpo" es aquélla porción estructural de una molécula de anticuerpo comprendida de una cadena pesada y ligera variable y regiones hipervariables que se unen' específicamente al antígeno. La frase molécula de anticuerpo" en sus diferentes formas gramaticales como se usa aquí contempla una molécula de inmunoglobulina intacta y una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina. Las moléculas de anticuerpo ejemplares son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contiene el paratopo, incluyendo aquellas porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v), porciones las cuales son preferidas para usarse en los métodos terapéuticos descritos aquí . Las porciones Fab y F(ab' ) 2 de moléculas de anticuerpo son preparadas por la reacción proteolítica de la papaína y pepsina, respectivamente, sobre moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas por métodos que son bien conocidos. Por ejemplo, véase la Patente Estadounidense No. 4,342,566 de Theofilopolous et al. Las porciones de la molécula de anticuerpo Fab' son también conocidas y son producidas a partir de las F(ab')2 seguidas por la reducción de los enlaces de sulfuro que enlazan las dos porciones de cadena pesada como con mercaptoetanol , y seguida por la alquilación del mercaptano de proteína resultante con el reactivo como la yodoacetamida . Un anticuerpo que contiene moléculas de anticuerpo intactas es el preferido aquí. La frase "anticuerpo monoclonal" en sus diferentes formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene únicamente una especie de sitio de combinación de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un antígeno particular. Un anticuerpo monoclonal de este modo presenta típicamente una sola afinidad de unión por cualquier antígeno con el cual inmunorreacciona . Un anticuerpo monoclonal puede por lo tanto contener una molécula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada una inmunoespecífica para un antígeno diferente,- por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico) . La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y típicamente no producen una •reacción alérgica o adversa similar, como un trastorno gástrico, mareos y similares, cuando se administra a un humano . La frase "suficiente para proteger a un animal de la infección" se usa aquí para el significado de una cantidad suficiente para prevenir, y de manera preferible reducir en al menos aproximadamente el 30%, de manera más preferible de al menos el 50%, de manera más preferible de al menos el 90%, un cambio clínicamente significativo en al menos una característica de una patología causada normalmente por la enfermedad . Clínicamente, los primeros síntomas de la rabia en personas pueden ser signos similares a los de un catarro no específico, como malestar, fiebre o cefalea. Puede haber incomodidad o parestesia en el sitio de exposición (mordida) , que progresa dentro de días a síntomas de disfunción cerebral, ansiedad, confusión, agitación, progresando hasta el delirio, comportamiento anormal, alucinaciones e insomnio. La patología celular de la infección de la rabia es definida por encefalitis y mielitis, incluyendo infiltración perivascular con linfocitos, leucocitos polimorfonucleares , y células plasmáticas a través de todo el SNC . Pueden existir cuerpos de inclusión eosinofllicos citoplásmicos (cuerpos de Negri) en células neuronales, incluyendo células piramidales del hipocampo y células de Purkinje del cerebelo, y dentro de ¦neuronas de la corteza y otras regiones del SNC, incluyendo los ganglios espinales . Una secuencia de ADN está "ligada operativamente" a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de ADN. El término "ligado operativamente" incluye que tiene una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) en la parte frontal de la secuencia de ADN a ser expresada y mantener el marco de lectura correcta para permitir la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del producto deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que uno desee insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal de inicio apropiada, esa señal de inicio puede ser insertada en la parte frontal del gen. El término "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones de concentración de sal y temperatura sustancialmente equivalentes a SSC 5x y 65 °C tanto para la hibridación como para el lavado. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que esas "condiciones de hibridación rigurosas" dependen de condiciones particulares, incluyendo la concentración de sodio y magnesio en el amortiguador, la longitud y concentración de la secuencia nucleotídica, por ciento de mal apareamiento, por ciento de '•'formamida y similares. También importante en la determinación de las "condiciones de hibridación rigurosas" es si las dos secuencias hibridantes son ARN-ARN, AD -ADN o ARN-ADN. Esas condiciones de hibridación rigurosas son determinadas fácilmente por un experto en la técnica de acuerdo a fórmulas bien conocidas, donde la hibridación es típicamente de 10 a 20 °C menor que la Tm predicha o determinada con lavados de mayor rigurosidad, si se desea. La presente invención contempla además composiciones terapéuticas útiles para practicar los métodos terapéuticos de esta invención. Una composición terapéutica objetivo incluye en mezcla, un excipiente (portador) farmacéuticamente aceptable y uno más de un virus de la rabia mutante, un polipéptido de virus de la rabia mutante o fragmento del mismo, como se describe aquí como un ingrediente activo. En una modalidad preferida, la composición comprende un antígeno capaz de inducir una respuesta inmune, y, de manera preferible una respuesta inmune protectora contra la rabia. La preparación de composiciones terapéuticas que contienen polipéptidos , análogos o fragmentos activos como ingredientes activos es bien comprendida en la técnica. Típicamente, esas composiciones son preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también pueden ser preparadas formas sólidas adecuadas en solución, o en suspensión en, líquidos para inyección. La preparación también puede ser emulsificada . El ingrediente terapéutico activo con frecuencia es mezclado con los excipientes, los cuales son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsificantes , agentes amortiguadores de pH los cuales mejoran la efectividad del ingrediente activo. Un virus, polipéptido, o fragmento del mismo puede ser formulado en una composición terapéutica, y/o inmunogénica como formas de sales farmacéuticamente aceptables neutralizadas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen a las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido o molécula de anticuerpo) y que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como el acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de los grupos carboxilo libres también pueden ser derivadas de bases inorgánicas como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y también bases orgánicas como la isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, "procaína y similares. Las composiciones terapéuticas y/o inmunogénicas que contienen virus, polipéptido o fragmentos son administradas, de manera convencional en una dosis unitaria, por ejemplo. El término "dosis unitaria" cuando se usa con referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico y/o inmunogénico deseado en asociación con el diluente requerido, es decir, el portador, o vehículo. Las composiciones son administradas en una forma compatible con la formulación de la dosis, y en una cantidad terapéutica o inmunogénicamente efectiva. La cantidad a ser administrada depende del sujeto a ser tratado, la capacidad del sistema inmune del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y el grado de expresión deseado. Pueden ser administradas cantidades precisas del ingrediente activo requerido dependiendo del juicio del médico y las peculiaridades de cada individuo. Sin embargo, para la administración de polipéptido, las dosis adecuadas pueden fluctuar de aproximadamente 0.1· a 20, de manera preferible de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 10, y de manera más preferible de 1 a varios miligramos de ingrediente activo por "kilogramo de peso corporal del individuo por día y dependiendo de la ruta de administración. Para la administración viral, la dosis adecuadas pueden ser de lO5 unidades infecciosas (u.i.) a 107 u.i. Los regímenes adecuados para la administración inicial e inyecciones de refuerzos también se encuentran disponibles, pero son tipificados por una administración inicial seguida por dosis repetida a intervalos de 7 días por una inyección posterior u otra administración.

Las composiciones terapéuticas pueden incluir además uno o más de los siguientes ingredientes activos: un antibiótico, un esteroide. Otra característica de esta invención es la expresión de secuencias de ADN insertadas de manera operable en los virus descritos aquí . Como también es sabido en la técnica, las secuencias de ADN pueden ser expresadas ligándolas operativamente a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector de expresión para transformar un hospedero apropiado. Ese enlace operativo de una secuencia de ADN de esta invención a una secuencia de control de expresión, por supuesto, incluye, sino es ya parte de la secuencia de ADN, la provisión de un codón de inicio, ATG, en el marco de lectura' correcto corriente activa de la secuencia de ADN. Puede emplearse una amplia variedad de "combinaciones de hospedero/vector de expresión en la expresión de las secuencias de ADN que codifican para las proteínas virales de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir de segmentos de secuencias de ADN croraosomal , no cromosomal y sintéticas. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, los plásmidos de E. coli col El, pC l, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos como el RP ; ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados del fago ?, por ejemplo NM989 y otros ADN de fago, por ejemplo, el I3 y ADN de fago de una sola hebra, filamentoso; plásmidos de levadura como el plásmido 2µ o derivados del mismo; vectores útiles en células eucarióticas , como los vectores útiles en células de insectos (baculovirus) o mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, como los plásmidos que han sido modificados para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de expresión; y similares. Puede ser usada cualquiera de una variedad de secuencias de control de expresión -- secuencias que controlen la expresión de la secuencia de ADN ligada operativamente a este -- en los vectores para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Esas secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores inicial o tardío de SV40, C V, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, las regiones operadora y promotora principales del fago ?, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolí icas , los promotores de la ácido fosfatasa (por ejemplo, Pho5) , los promotores de los factores de apareamiento a de la levadura, y otras secuencias que se sabe controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos. Una amplia variedad de células hospederas son útiles para expresar las secuencias de ADM que codifican para las proteínas virales de esta invención. Esos hospederos pueden incluir hospederos eucarióticos y procarióticos bien conocidos, como las cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos como levaduras, y células de animales, como las células CHO, Rl.l, B-W y L-M, células de riñon de Mono Verde Africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, y BMT10 ) , células de insecto (por ejemplo Sf9) , células BHK, y células humanas y células de plantas en cultivos tisulares . Se comprenderá que no todos los vectores , secuencias de control de expresión y hospederos funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADM de esta invención. Tampoco todos los hospederos funcionarán 'igualmente con el mismo sistema de expresión. Sin embargo un experto en la técnica podrá seleccionar los vectores, secuencias de control de expresión y hospederos adecuados sin experimentación indebida para lograr la expresión deseada sin apartarse del alcance de esta invención. Por ejemplo, en la selección de un vector, el hospedero debe ser considerado debido a que el vector debe funcionar en éste. El número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias, y la expresión de cualesquier otras proteínas codificadas por el vector, como marcadores de antibiótico, también deberán ser considerados . En la selección de una secuencia de control de expresión, normalmente se considerarán una variedad de factores. Esos incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa del sistema, su capacidad de control, y su compatibilidad con la secuencia de ADN o gen particular a ser expresado, particularmente con respecto a estructuras secundarias potenciales . Los vectores virales imitantes adecuados serán seleccionados mediante la consideración de, por ejemplo, su capacidad reproductiva, así como la toxicidad al hospedero del producto codificado por las secuencias de ADN a ser expresadas, o por el virus mutante. Considerando esos y otros factores un experto en la técnica podrá construir una variedad de combinaciones/vector de secuencia de control de expresión/hospedero que expresarán "las secuencias de ADN de esta invención. Se pretende además que puedan ser preparadas otras proteínas virales mutantes a partir de secuencias nucleotídicas de la presente invención. Pueden ser producidos análogos, como fragmentos, por ejemplo, por digestión con pepsina del material polipeptídico viral. Otros análogos, como las muteínas, pueden ser producidos por mutagénesis dirigida al sitio estándar de secuencias que codifiquen para proteínas virales. Los mutantes exhiben actividad inmunogénica o protectora, pueden ser identificados por ensayos in vivo y/o in vi tro conocidos. Como se mencionó anteriormente, una secuencia de ADN que codifica para el virus o proteínas virales puede ser preparado de manera sintética en lugar de ser clonada. La secuencia completa es montada superponiendo los oligonucleótidos preparados por métodos estándar y montados en una secuencia codificadora completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981) ; Nambair et al., Science, 223:1299 (1984) ; Jay et al., J. Biol . Chem., 259:6311 (1984) . Las secuencias de ADN sintéticas permiten la construcción conveniente de genes que expresaran las proteínas mutantes o "muteinas" . De manera alternativa, el ADN que codifica para las muteinas puede ser producido por mutagénesis dirigida al sitio de genes virales nativos o ADNc, y las muteinas pueden ser producidas directamente usando la síntesis polipeptídica convencional. Un método general para la incorporación específica al sitio de aminoácidos no naturales en proteínas es descrito en Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahi11 , ichael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244: 182-188 (Abril 1989) . Este método puede ser usado para crear análogos con aminoácidos no naturales . Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar de manera más completa las modalidades preferidas de la invención. Ellos no deberán ser considerados, sin embargo, como limitantes del amplio alcance de la invención.

EJEMPLO 1 La N del virus de la rabia preferiblemente encapsula al ARN genómico. La N del virus de la rabia, al igual que otras N de ARN virus de hebra negativa, juega papeles importantes en la regulación de la transcripción y reproducción viral encapsulando el ARN genómico sintetizado de novo (Yang et al., 1998) . Para investigar la función de N del virus de la rabia, la N del virus de la rabia fue expresada en el sistema de baculovirus y purificada la N casi hasta la homogeneidad por cromatografía de afinidad (Fu et al., 1991) . Cuando la N purificada fue usada para encapsular ARN, se encontró que esta N se unía a todos los transcriptos de ARN probados (Yang et al., 1998) . Esos incluyen ARN líder ,de hebra positiva del virus de la rabia (L-70) , el extremo 5' del ARNm de la N del virus de la rabia (N-70) , y ARN no viral control (ARN bluescript, B-70) . Sin embargo, la interacción entre la N recombinante y el ARN líder del virus de la rabia fue al menos tres veces mayox- que entre la N recombinante y el ARNm de N y 10 veces mayor que entre la N recombinante y el ARN control, indicando que N encapsula preferiblemente al ARN líder de hebra positiva.

EJEMPLO 2 La fosforilación de N del virus de la rabia modula la transcripción y reproducción viral. La N del virus de la rabia es fosforilada (Sokol et al., 1973) y su sitio de fosforilación ha sido identificado como serina en la posición 389 (Dietzschold et al., 1987) . Debido a que N juega papeles importantes en la regulación de la transcripción y reproducción viral encapsulando al ARN genómico sintetizado de novo ( unner, 1991) , la fosforilación de N puede afectar a la transcripción y reproducción viral . Para determinar si la fosforilación de N juega un papel regulador en la transcripción y reproducción viral , se usaron sistemas genéticos inversos descritos Conzelmann e Schnell (Conzelmann et al., 1994) para expresar el minigenoma del virus de la rabia y probar directamente los efectos sobre la fosforilación de N sobre la transcripción y reproducción de ,ARN viral. El minigenoma fue expresado y el plásmido pSDI-CAT dirigido por la polimerasa T7. Cuando se expresa en células, el ARN minigenomico contiene 68 nucleótidos del extremo 3' y 169 nucleótidos del extremo 5' del genoma del virus de la rabia flanqueado por la secuencia que codifica para CAT entre ellos (Conzelmann et al., 1994) . El plásmido pSDI-CAT, junto con pRP, pT7T-L, pT7T-G, pT7T-M, y pRN o pRN-S389A, fue transfectado en células BHK, y las células fueron cosechadas 48 horas después de la transíección . La actividad de CAT fue medida del extracto celular usando el ensayo de CAT estándar. Se detectó una fuerte actividad de CAT en células transfectadas con pRM. Cuando la N wt fue reemplazada con la N imitada (serina a alanina) , únicamente se detectó una actividad de 20% de CAT sugiriendo que la ausencia de fosforilación de N da como resultado una disminución de la transcripción viral. Sin embargo, cuando ambas de la N wt y la N mutante estuvieron presentes, se detectó una actividad de CAT de aproximadamente el 80%, indicando que la N no fosforilada no es un regulador negativo dominante (Yang et al., 1999, Appendix 1). Para determinar si la fosforilación de N también afecta a la reproducción viral, se efectuaron experimentos de pase. El sobrenadante de la transfección inicial fue cosechado y usado para la infección de BHK frescas transfectadas con pRP, pT7T-L, y pRN o pRN-S389A. Las células •fueron cosechadas 48 horas después para la medición de la actividad de CAT. La mayor actividad de CAT (100%) fue detectada cuando se uso N wt en ambos experimentos de pasaje de transfección inicial y posteriores. Cuando se uso N wt en la transfección inicial y la M mutante en el experimento de pase, de detectó una actividad CAT del 43%, indicando que la fosforilación de N en realidad afecta la transfección del minigenoma. Cuando se usó N mutada en la transfección inicial y la N wt en el experimento de pase, se detectó una actividad de CAT del 61%, indicando que la N mutante soportó la reproducción del minigenoma en la transfección inicial, aunque con baja eficiencia. Sin embargo, únicamente se detectó una actividad de CAT del 13% cuando se uso N mutante en la transfección inicial y en el experimento de pase, sugiriendo que la ausencia de fosforilación de N da como resultado una disminución de ambas de la transcripción y reproducción de ARN viral (Yang et al'., 1999; Apéndice 1) .

EJEMPLO 3 La serina en la posición 389 fue sometida a una mutación a alanina, ácido aspártico o ácido glutámico y fueron examinados los efectos de esas mutaciones sobre la transcripción y reproducción del virus de la rabia en el minigenoma, así como con el virus infeccioso completo. La mutación de la serina a cada uno de los otros aminoácidos dio como resultado la síntesis de una N no fosforilada y la reducción de la transcripción y reproducción viral en el minigenoma. Las mutaciones de S a A y S a D también dan como resultado la reducción de la transcripción y reproducción viral en virus infecciosos de longitud completa. Los estudios de la curva de crecimiento indicaron que la producción del virus mutante con la mutación de S a A (L16A) fue con mucho 10000 veces menor que la del virus natural (116) . La hibridación por manchas Northern con sondas del gen del virus de la rabia revelaron que las velocidades de transcripción y reproducción viral fueron reducidas hasta 10 veces en el virus nvutante cuando N no fue fosforilada. La interpretación de los datos del sistema de minigenoma y el virus infeccioso de longitud completa indican que la fosforilación de N del virus de la rabia es necesaria para la reproducción. Estudios adicionales que implican el tratamiento con cicloheximida de células infectadas revelaron que la transcripción viral también se redujo cuando N no fue fosforilada. Tomados juntos, esos resultados proporcionan evidencia definitiva de que la fosforilación de N juega un papel importante en el proceso de transcripción y reproducción del virus de la rabia . Células, virus, plásmidos, y anticuerpos. Se hicieron crecer BSR (una clona de BHK) y BSR T7/5 (células BSR que expresan de manera estable polimerasas T7, .[Buchholz ¾ al., 1999] ) en medio esencial mínimo de Dubecco y se transfectaron con plásmidos como se describo anteriormente (Yang et al . , 1999) . Los vaccinia virus recombinantes que expresan ARN polimerasa T7 bacteriana (vTF7-3) fueron preparados como se describió (Fuerst et al., 1986) . Los plásmidos usados para la expresión del virus infeccioso completo (pSAD-L16) , minigenoma del virus de la rabia (pSDI- CAT) , L del virus de la rabia (pT7T-L) , glicoproteína (pT7T- G) , y proteína de la matriz (pT7T-M) (Buchholz et al., 1999; Conzelmann et al., 1987; Schnell et al . , 1984) fueron obtenidas de Dr. K. Conzelmann. Los plásmidos para la expresión de N (pRN) y P (pRP) fueron construidos previamente (Fu et al., 1994) . El antisuero policlonal contra M del virus de la rabia fue preparado en conejos como se describió anteriormente (Fu et al., 1991) . Mutagénesis dirigida al sitio. La mutación de la serina 389 de N del virus de la rabia a A, G, D, N, E o Q fue llevada a cabo por mutagénesis dirigida al sitio, usando el método de Weiner et al (1994) . Fueron sintetizados seis pares de cebadores como se resume en la tabla 1 y fueron diseñados para que tuvieran uno o dos cambios nucleotídicos que dieron como resultado la mutación del codón de serina. Se efectuó una PCR con cada uno de los tres pares de cebadores usando pRN (Fu et al., 1994) como patrón. Los productos de la PCR fueron sometidos a digestión con Dpnl, la cual digiere ADN imetilado y semimetilado en el sitio ATC de Gme, digiriendo por lo tanto el patrón de ADN de pRN. Los productos de la PCR no digeridos (no metilados) fueron usados para transformar células XL-1 Blue competentes. Las mutaciones en los plásmidos fueron confirmadas por secuenciamiento nucleotidico . Tabla 1. Cebadores usados para producir mutaciones de serina en la posición 389 a alanina, ácido aspártico y, ácido glutámico sobre N del virus de la rabia. (Las letras negrillas representan al codón mutante) Para introducir las mutaciones sobre N del virus de la rabia en clona infecciosa, se clonó un fragmento de Sphl que contenía el codón de serina de N para la clona infecciosa completa (pSAD-L16) (secuencias nucleotídicas 482-4041 del genoma del virus de la rabia [Conzelmann et al., 1990]) en el sitio Sphl del pGEM-3Z. El plásmido resultante fue usado con un patrón para la construcción de las mutaciones como se describió anteriormente para pRN. La serina en la posición 389 fue sometida a mutación a alanina, ácido aspártico, o ácido glutámico en el vector sustituto. Después de la confirmación por análisis de secuencia, cada uno de los fragmentos Sphl fue clonado nuevamente a pSAD-L16. Se obtuvieron tres clonas mutantes con la mutación y orientación correcta esperadas y se designaron como pSAD-L16A, pSAD-L16D, y pSAD-L16E, respectivamente. Transfección. La transfección de células BSR con plásmidos fue efectuada como se describió anteriormente (Yang et al., 1999) . De manera breve, las células BSR fueron infectadas con vaccinia virus recombinante (vTF7-3) a una multiplicidad de infección (moi) de 5 unidades formadoras de placa (ufp) por célula. Una hora después de la infección, las células fueron transfectadas con diferentes combinaciones de plásmidos mezclados usando Lipofectamina (Life Technologies, Rockville, MD) . Las células transfectadas fueron cosechadas a los puntos temporales indicados para su análisis adicional. Ensayo de clorenfenicol acetil transferasa (CAT) . Las actividades de la CAT fueron medidas con el ensayo Quan-T-CAT (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) de acuerdo al protocolo del fabricante. Las células transfectadas fueron lisadas, y los sobrenadantes fueron incubados con cloranfenicol y [3H] acetil coenzima A biotinilada. Entonces se agregaron perlas recubiertas con estreptavidina a la reacción. Después los materiales radioactivos libres fueron removidos, los sedimentos fueron resuspendido en fluido de destellos para su cuantificación por espectrometría de destellos. Las actividades de CAT fueron expresadas como conteos por minuto. Las actividades de CAT relativas de células transfectadas con cada una de las proteínas N mutadas fueron calculadas usando la actividad de CAT en células transfectadas con N wt como 100%. Mareaje radioactivo e inmunoprecipitación de proteínas. Las células BSR transfectadas o infectadas fueron marcadas con [35S] metionina o [32P] ácido fosfórico (Amersham Pharmacia Biotech) como se describió anteriormente (Yang et al., 1999) . Las células fueron cosechadas y sometidas a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-N seguida por electroforesis sobre gel de poliacrilamida al 12%/SDS al 10% y autorradiografía . Manchado Northern y Western. Las células BSR transfectadas o infectadas, o los virus purificados fueron sometidos a manchado Northern y/o Western. Para el manchado Northern, las células BSR fueron lisadas con reactivo de Trizon (Life Technologies) y el ARN total fue preparado de acuerdo a las especificaciones del fabricante. El ARNm de Poli A+ fue purificado del ARN total usando el equipo de aislamiento de ARNm (Roche, Indianapolis , IN) . Las preparaciones de ARN fueron desnaturalizadas con amortiguador de fosfato de sodio 10 mM (pH 7.4) con un contenido de 50% (v/v) de formamida a 65 °C durante 15 min y se sometieron electroforesis sobre un gel agarosa al 1.1% que contenía formaldehído 1.1 M y fosfato de sodio 10 mM. El ARN fue entonces transferido a y fijado covalentemente sobre una membrana de nylon para la hibridación con sondas de CAT, gen del virus de la rabia o ß-actina. La cuantificación de las bandas ARN se efectuó por densitometría . Para las manchas Western, las células BSR fueron lisadas con amortiguador RIPA, y las proteínas fueron separadas directamente por SDS- PAGE . Después de transferir a una membrana de nitrocelulosa, la N del virus de la rabia fue detectada por anticuerpos monoclonales anti-N de conejo como se describió (Fu et al. 1991) . Selección de virus de la rabia mutantes . La selección de virus mutantes se efectuó en células BSR infectadas con vTF7-3 (Fuerst et al., 1986) , o en células BSR T7/5 (Buchholz et al., 1999,· Schnell et al:, 2000) .

-Brevemente, las células BSR fueron infectadas con VTF7-3 a una moi de 1. Una h más tarde, las células fueron transfectadas con 10 mg de pRN, 2.5 mg de pRP, 1.5 mg de pT7T-L, y 10 mg de pSAD-L16, pSAD-L16A, pSAD-L16D, o pSAD- L16E. Después de incubar durante 48 horas, las células fueron resuspendidas con el medio y sometidas a tres ciclos de congelamiento y descongelamiento para liberar al virus asociado con la célula. Los vaccinia virus fueron eliminados por centrifugación y a continuación por filtración a través de una unidad de filtración de a 0.2 m (Millipore) como se describió anteriormente (Schnell - et al 1994), De manera alternativa, las células BSR T7/5 fueron transfectadas con 10 mg de pSAD-16 o pSAD-L16A, junto con 10 mg de pTIT-N, 2.5 mg de pTIT-P, y 2.5 mg TIT-L como se describió (Schnell et al., 2000) . Para confirmar que los virus mutantes contenían las mutaciones deseadas, fue extraído el ARN total de las células BSR infectadas con cada uno de esos virus y sometido a amplificación por PCR para el gen de N usando 10 g de cebadores (SEQ ID NOS: 13-14) (51 CTACAATGGATGCC-GAC3 ' ) y 304 ( 51 TTGACGAAGATCTTGCTCAT31 ) como se describió anteriormente (Smith et al., 1991) . Esos cebadores pueden amplificar la secuencia que codifica para N completa a partir de ARN genómico. El fragmento amplificado fue secuenciado directamente usando el cebador (SEQ ID NO: 15) 113 (5 ' GTAGGATGCTATATGGG3 ' ) (Smith et al., 1991), el cual precede inmediatamente al área de la mutación sobre el gen de N. Los virus mutantes que contienen las mutaciones .de S a A, S a D, y S a E fueron designados como L16A, L16D, y L16E, respectivamente. Curva de crecimiento del virus . Las células BSR que crecieron en placas de seis pozos fueron infectadas con virus de la rabia wt o mutante a una moi de 1 ffu/célula. Después de la incubación a 37°C durante 1 hora, los virus inoculados fueron removidos y las células fueron lavadas con PBS para remover cualquier virus no absorbido. Las células fueron reabastecidas con medio fresco, y fueron removidos 100 mi de sobrenadante de cultivo a las 6, 12, 24, 36, 48, 60, y 72 horas de la infección. Las alícuotas de virus fueron tituladas por duplicado en células BSR como se describió anteriormente (Fu et al., 1996) . Tratamiento de células infectadas con CHX. La cicloheximida (CHX) fue comprada de Sigma (St. Louis, Mo.) y fue agregada a células infectadas con virus de la rabia a una concentración final de 150 vg/ l 1 hora después de la infección como se describió anteriormente (3) . A las 6, 12, y 24 horas después de la infección, las células fueron cosechadas y el ARN fue extraído de la hibridación de manchas Northern . Los efectos de la fosforilación de N sobre la transcripción y reproducción viral son causados probablemente >al menos en parte por la carga negativa neta de la porción fosfato.. Anteriormente, se demostró que la fosforilación de N del virus de la rabia juega papeles importantes en el proceso de transcripción y reproducción viral (Yang et al., 1999) . La mutación de la fosfoserina a alanina da como resultado la reducción de la transcripción y reproducción del minigenoma del virus de la rabia. Para determinar si los efectos de la fosforilación de N del virus de la rabia sobre la transcripción y reproducción viral son causados por la carga negativa neta de la porción fosfato o la estructura de S o ambas, la serina fosforilada en la posición 389 de la N fue sometida a mutación a A, G, D, N, E y Q. Las células BSR fueron infectadas con vaccinia virus recombinante vTF7-3 seguida por la transfección con plásmidos que expresan el minigenoma del virus de la rabia (pSDI-CAT) , L del virus de la rabia (pT7T-L) , y P del virus de la rabia (pRP) , junto con plásmidos que expresan N o N mutante de la rabia (pRN, pRN-SA, pRN~SG, pRM-SD, pRN-SN; pRN-SE o pRN-SQ) , como se describió anteriormente (Conzelmann y Schnell, 1994; Yang et al., 1999) . Después de incubar durante 48 horas, las células BSR fueron cosechadas, y las actividades de CAT fueron medidas usando el ensayo Quan-T-CAT. Las actividades de CAT relativas, las cuales son una medida de la transcripción del minigenoma en células transíectadas con cada uno de los plásmidos de N mutante, fueron calculadas usando la. actividad ¦de CAT en células transfectadas con N wt como 100%. Los resultados son resumidos en la Fig. 1. Las actividades de CAT con relación a N wt fueron del 6, 9, 28, 40, 46, y 62%, en células transfectadas con pRN-SG, pRN-SA, pRN-SN, pRN-SD, pRN-SQ, y pRN-SE, respectivamente. En células transfectadas con todos los otros plásmidos pero que carecían de un plásmido que exprese N, la actividad de CAT relativa fue de menos del 2% (no se muestran los datos) . Esos resultados sugieren que los efectos de la fosforilación de N sobre la transcripción o reproducción viral o ambas, son causados probablemente al menos en parte por la carga negativa neta de la porción fosfato y la estructura del residuo de serina. El incremento o disminución de las concentraciones del plásmido que expresa N no puede compensar los efectos de la fosforilación de N sobre la transcripción y reproducción viral. En el estudio de los efectos de la fosforilación de la proteína P de VSV, Spadafora et al. (1996) observaron que la P no fosforilada era mucho menos activa en el soporte de la transcripción viral a concentraciones bajas. Para determinar si la concentración de N tiene algún efecto sobre la capacidad de las proteínas N mutantes para lograr la transcripción y reproducción óptima en el minigenoma en el virus de la rabia, se usaron varias concentraciones (5, 10, 15 y 20 mg) de los plásmidos que expresan N o N mutante (pRN-SA, pRN-SD, o pRN-SE) para la transíección, y las células '•'fueron cosechadas para el ensayo de CAT. Como se presenta en la Fig. 2, 10 mg de cada plásmido que expresa N mutante y 15 mg de la N wt (pRN) dieron como resultado actividades de CAT óptimas. Una cantidad más grande o más pequeña condujo a actividades de CAT ligeramente reducidas (20%) , indicando que el incremento o disminución de la concentración de N no tiene un impacto mayor sobre la transcripción viral de cualquiera de N wt o N mutante. Para asegurar que los niveles de N expresados correspondieran a la cantidad del plásmido que expresa N agregado, las células transfectadas fueron Usadas con amortiguador RIPA, y los Usados celulares fueron sometidos a análisis por SDS-PAGE, seguido por manchado Western utilizando anticuerpos anti-N policlonales (Fu et al., 1994) . Como se muestra en el fondo de la Figura 2, la cantidad de N expresada por cada una de las proteínas wt o mutante fue proporcional a las concentraciones de plásmidos que expresan N agregados. La fosforilación de N del virus de la rabia afecta a la transcripción y reproducción del minigenoma del virus de la rabia. En un estudio anterior (Yang et al., 1999) y el estudio descrito anteriormente, las actividades de CAT fueron ensayadas únicamente ¦ para medir la transcripción y reproducción viral . Para determinar aún si la fosforilación de N afecta a la transcripción o reproducción viral, o ambas, se efectuaron hibridaciones de manchas Northern para medir (' los transcriptos y los análogos genómicos en las células transfectadas . Para medir la transcripción viral, se preparó el ARN total de células transfectadas , y se purificó el ARNm de poliA+ del ARN total. Para medir la reproducción viral, las células transfectadas fueron extraídas con H20 destilada y el complejo RNP fue inmunoprecipitado con anticuerpos anti- M policlonales. El complejo fue sometido a tratamiento con reactivo de Trizon para obtener análogos genómicos. Las preparaciones de ARN fueron hibridadas con una sonda de CAT marcada con [a-32P] -dCTP por traducción cortada del ADNc de CAT. Como se muestra en la Fig. 3, las cantidades de transcriptos de CAT y los análogos de ARN genómicos se redujeron cuando la N no se fosforiló. Las actividades de transcripción y reproducción fluctuaron de altas hasta bajas en el orden de N wt, N con mutaciones de S a E, S a D, y S a A. Las cantidades de transcriptos de CAT en las células transfectadas con pRN-SA, p N-SD, o pRN-SE fueron del 17, 63, y 85% de la N wt (pRN) , respectivamente. Esas correspondieron bien con las actividades de CAT relativas mostradas en la Figura 1. Las cantidades de análogos genómicos en las células transfectadas con pRN-SA, pRN-SD, o pRN-SE fueron del 12, 55, y 95% de la cantidad en células que expresan N wt (pRN) , respectivamente, demostrando que la síntesis de ambos transcriptos virales y análogos genómicos en el sistema del minigenoma son afectadas por la fosforilación de N. Para excluir la posibilidad de que la transcripción y reproducción reducida en las células transfectadas con plásmidos que expresan N mutante fuera causada por diferentes niveles de N' sintetizada, las células transfectadas fueron marcadas con [35S] metionina y Usadas con amortiguador RIPA. La N marcada fue inmunoprecipitada con . anticuerpos anti-N y analizada por SDS-PAGE. Como se muestra en la Figura 3., fueron inmunoprecipitadas cantidades similares de N o N mutante en las células transfectadas con diferentes constructos de N. Para confirmar que los mutantes de N no están en realidad fosforilados , las células transfectadas fueron marcadas con [32P] ácido fosfórico. Después de la lisis con amortiguador RIPA, la N marcada fue inmunoprecipitada con anticuerpos anti-N y analizada por SDS-PAGE. Unicamente la N wt fue fosforilada, mientras que todas las proteínas N mutantes no (Fig. 3) .

Construcción ? selección de virus de la rabia mutantes. En el sistema del minigenoma, fueron sintetizadas las proteínas virales necesarias para la transcripción y reproducción viral por polimerasa T7, y de este modo su síntesis no estuvo bajo el control de la maquinaria reguladora del virus de la rabia. Por lo tanto, fue necesario determinar los efectos de la fosforilación de N del virus de la rabia sobre al transcripción y reproducción viral en virus ^infecciosos completos. Hasta este punto, las mutaciones de la serina 389 sobre la N a alanina (L16A) , ácido aspártico (L16D) , o ácido glutámico (L16E) fuero introducidas a la clona infecciosa de longitud completa (Schnell et al., 1994) .

(L16A, L16D y L16E fueron depositadas en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA, como números de depósito ATCC PTA-3541, PTA- 3542 y PTA-3543, respectivamente, en Julio 20,2001. Después de la transfección de esas clonas en células BSR, se obtuvieron el virus L16 wt asi como los virus mutantes L16D, y L16E. Sin embargo, el L16A no fue rescatado en células BSR. Por lo tanto, las células BSR T7/5 (Buchholz et al., 1999) fueron usadas para la selección de L16A y L16A fue rescatado exitosamente. La RT-PCR y el secuenciamiento directo confirmaron que esos virus mutantes contenían las mutaciones deseadas. El ARN genómico del virus wt (L16) retuvo el codón para la serina (UCU) en la posición 389, mientras que los ARN genómicos de los virus L16A, L16D, y L16E tuvieron la serina (UCU) sustituida con alanina (GCU) , ácido aspártico (GAU) , y ácido glutámico (GAA) , respectivamente. Para confirmar que esos virus mutantes expresan N no fosforilada, las células BSR infectadas con cada uno de los virus fueron marcadas con cualquiera de [35S] metionina o [32P] ácido fosfórico y fueron sometidas a inmunoprecipitación y análisis en PAGE. Como fue el caso en el sistema del minigenoma, la N marcada con [35S] "metionina fue detectada en células BSR infectadas con cada uno de los virus, mientras que la N marcada con [32P] ácido fosfórico fue detectada solo en células BSR infectadas con L16 (no se muestran los datos) , indicando que la mutación de serina en la posición 389 abóle la fosforilación de N en virus infecciosos completos . Los virus de la rabia mutante se reproducen más lentamente que los virus wt . Inicialmente, el virus de la rabia wt (L16) , los virus mutantes L16D, y L16E crecieron a títulos altos (>107 ffu/ml) en células BSR 37°C, pero el L16A creció pobremente (títulos <104 ffu/ml) . Para superar esta dificultad, el L16A fue propagado en células BSR a 31°C como se describió para el VSV imitante ( ertz et al., 1998) y el L16A creció a títulos más altos (>105 FU/mi) . Las curvas de crecimiento de los virus de la rabia WT así como mutantes fueron investigadas infectando células BSR con cada uno de los virus a una moi de un 1 ffu por célula. Como se muestra en la Figura 4, el virus wt (L16) creció consistentemente mejor que los virus mutantes y alcanzó un título de más de 109 pfu/ml en el pico de producción de virus (60 h) . A este tiempo, la velocidad de crecimiento para los virus mutantes se quedó atrás, particularmente para L16A. Este rendimiento fue de solo 105 pfu/célula, al menos 4 unidades log (10,000 veces) menos que el virus wt . Esos datos indican - que la fosforilación de N promueve la producción de virus, posiblemente a través de la regulación o modulación de la transcripción y reproducción del virus de la rabia. La fosforilación de N modula la transcripción y reproducción viral en el virus de la rabia infeccioso completo. Los datos de la curva de crecimiento presentados en la Figura 4 indican que el crecimiento de los virus mutantes con N no fosforilada, particularmente el virus mutante L16A, se redujo de manera severa. Esto podría dar como resultado la inhibición de la transcripción o reproducción viral, o ambas.

Para investigar si la transcripción y reproducción viral fueron inhibidas en virus de la rabia infecciosos mutantes, fueron infectadas células BSR a una moi de 1 con el virus wt L16 así como con los virus mutantes L16A, L16D, o L16E. El ARN total aislado a las 40 hr p. i. fue analizado por hibridación de manchas Northern usando sondas hechas a partir de ADNc de N (Fu et al., 1991) o la glicoproteína (G) ADNc (Fu et al., 1993). Esas sondas pueden distinguir los transcriptos de N o G (1.4 kb y 1.8 kb) del ARN genómico (12 kb) . Como se ilustra en la Figura 5, cada sonda detectó ambos ARN genómicos y los transcriptos N o G. Además, los transcriptos de lectura completa (RT) y/o ARN interfiriente defectuoso (DI) también fueron detectados. Las bandas inmediatamente encima de los transcriptos de N y G, cuando son híbridadas con sondas de G o N, pueden representar transcriptos de R . La banda inmediatamente abajo, del ARN ¡genómico, cuando es hibridada con la sonda de G, puede representar al transcripto de RT (G o L) o ADN DI. Para el virus L16A, las cantidades. de ARN genómico viral y transcriptos fueron de 10-12% y 21-28% del virus wt, respectivamente. Para el virus L16D, las cantidades de ARN genómico y transcriptos virales fueron del 41-45% y del 60-65% de los virus wt, respectivamente. Para el virus L16E, las cantidades de ARN genómico y transcriptos virales fueron del 100% del virus de w . De manera general, la inhibición de la reproducción viral (10-12% y 41-54%) fue más severa que en la transcripción (21-28% y 60-65%) en células "infectadas con virus L16A y L16D. Esas observaciones, junto con los datos obtenidos del sistema del minigenoma, indican que N no fosforilada da como resultado la reducción de la reproducción viral óptima. En el sistema del minigenoma la reproducción viral no depende de la transcripción viral debido a que la transcripción de N estuvo bajo el control de la polimerasa T7 y el nivel de N no fosforilada fue similar al de N wt . Aunque las cantidades de ARN genómico se redujeron cuando N no está fosforilada (Fig. 2), se demuestra que la fosforilación de N es requisito para la reproducción viral óptima. Para determinar mejor si la fosforilación de N también afecta a la transcripción viral, se efectuaron experimentos para desacoplar el proceso de transcripción del proceso de reproducción inhibiendo la síntesis de proteína de "novo en células infectadas con CHX. Fueron infectadas células BSR con cada uno de los virus a 1 moi de 3 FFU por célula, y a 1 h después de la infección se agregó CHX al medio de cultivo a una concentración final de 150 ng/ml para inhibir completamente la síntesis de proteína (3) . Células infectadas sin tratamiento con CHX fueron incluidas como controles. A las 6, 12, y 24 h después de la infección, las células fueron cosechadas y se extrajo el ARN para la hibridación de manchas Northern con la sonda N del virus de la rabia. Sin CHX, todos los virus se reprodujeron debido a que las cantidades de ARN genómico se incrementaron para cada uno de los virus como función del tiempo (Figura 6A) . La eficiencia en la transcripción y reproducción viral para cada uno de los virus fue similar a la que se muestra en la Figura 5 en cada punto temporal. Con la adición de CHX al medio de cultivo, la reproducción del virus fue inhibida debido a que la cantidad de ARN genómico no se incrementó para ninguno de los virus a cada uno de los puntos temporales (Figura 6B) . Además, la síntesis de la proteína N del virus de la rabia fue inhibida en células BSR tratadas con CHX (no se muestran los datos) . Sin embargo, las cantidades de transcriptos para cada uno de los virus se incrementó durante el mismo periodo de tiempo. La cuantificación de los transcriptos a cada punto en el tiempo para cada uno de los virus con relación a la cantidad de L16 t indicó que las eficiencias de transcripción para L16A, L16D, y L16E fueron del 8 al 12%, 53 a 65%, y 91 a 100%, respectivamente, para cada virus L16 wt . Los resultados demuestran definitivamente que la N no fosforilada, excepto la N con mutación de S a E, también inhibe la transcripción viral . La N no fosforilada no alteró la relación entre el ARN genómico y el ARN antigenómico . La N no fosforilada se unió más fuerte al ARN líder que la N fosforilada (Yang et al., 1999). Por lo tanto, es posible que la fosforilación de N juegue un papel en la transcripción y reproducción viral encapsulando más ARN antigenómico que ARN genómico. Esto se debe a que la N no fosforilada, debido a que ésta se une más fuerte al ARN antigenómico (Yang et al., 1999), el primer paso en la reproducción viral, puede reducir la síntesis de ARN genómico de Hebra negativa en la progenie, cambiando de este modo la relación de ARN genómico a antigenómico. Para probar esta hipótesis, el ARN total es traído de células BSR infectadas con cada uno de los virus wt o mutante fue sometido a hibridación de manchas Northern con ribosonda sentido (transcritas por polimerasa T7) o antisentido (transcritas por polimerasa SP6) producidas a partir de patrón de pRN. El ARN también fue preparado de viriones purificados de células BSR infectadas con cada uno de los virus. Las relaciones de ARN genómico y ARN antigenómico en las células infectadas para los virus wt y imitantes fue ^'aproximadamente similar (3:1) (Figura 7). Las relaciones de esos virus encontradas en los viriones purificadas también fueron similares (16:1 a 19:1) para cada uno de esos virus. Esos datos indican que la fosforilación de N probablemente no afecta la encapsulación y empaquetamiento preferenciales del ARN genómico sobre el ARN antigenómico. Ambas de la transcripción y reproducción del virus de la rabia son reducidas cuando la serina fosforilada de la N es sometida a mutación, ha sido demostrado en el sistema minigenómico y con. virus infeccioso. Cuando N no fue fosforilada, las velocidades de transcripción y reproducción se redujeron hasta 10 veces cuando se compararon con la N fosforilada. El rendimiento- viral para esos virus imitantes se redujo hasta 10,000 veces, particularmente cuando la serina fosforilada mutó a alanina. Esos datos sugieren que la fosforilación de N del virus de la rabia, aunque no es absolutamente necesaria, es importante en la modulación de la transcripción y reproducción del virus de la rabia. Además, la interpretación de los datos también sugiere que los efectos de la fosforilación de N del virus de la rabia sobre la transcripción y reproducción viral se debe a una combinación de la estructura de la serina y la carga negativa neta de la porción fosfato. La mutación de la serina fosforilada de N del virus de la rabia a los aminoácidos neutros alanina y glicina redujo la transcripción y reproducción viral hasta 10 veces. De manera alternativa, la mutación de la fosfoserina a ácido aspártico o ácido glutámico, ambos de los cuales contienen cadenas laterales ácidas que están cargadas negativamente a pH fisiológico, restableció las actividades de transcripción y reproducción viral en más del 60% y 80% de la N fosforilada. Sin embargo, cuando S mutó a N o Q, ambos de los cuales tienen estructurales similares a aquellas de D y E pero que carecen de carga negativa, las actividades de transcripción viral se redujeron al menos un tercio pero fueron aún mayores que aquellas resultantes de las mutaciones de S a A o S a G. Además, el hecho de que el virus mutante L16A creciera mejor a 31°C que a 37°C indica la sensibilidad a la temperatura del virus mutante. Esos resultados sugieren que tanto la estructura del aminoácido como la carga neta negativa de la porción fosfato son importantes para la transcripción y reproducción viral . En el N de virus de la rabia, al igual que su contraparte VSV, juega papeles vitales en la regulación de la transcripción y reproducción de ARN viral encapsulando el ARN genómico viral sintetizado de novo ( agner y Rose, 1996; Wertz et al., 1987; Wunner, 1991,23, 25,27). El hecho de que N del virus de la rabia, pero no N de VSV, sea fosforilada a dado lugar a preguntas de cómo está implicada la fosforilación en la regulación de la transcripción y ¦reproducción del ARN del virus de la rabia (Wunner, 1991) . Yang et al., 1999, y estudios presentados aquí sugieren que la transcripción y reproducción viral del minigenoma, así como el virus infeccioso completo, fueron inhibidas cuando la N no está fosforilada. Las cantidades de ambos transcriptos virales y análogos genómicos fueron menores en células transfectadas con constructos de N no fosforilada que en células transfectadas con N fosforilada. De manera similar, las cantidades de transcriptos virales y ARN genómico fueron menores en células infectadas con virus mutantes que expresan la N no fosforilada con células infectadas con virus wt . En el sistema del minigenoma , la reducción observada en la transfección y reducción viral no se debió a diferencias en la expresión de la proteína N mutante en las células transfectadas , debido a que no fueron detectadas diferencias en el nivel de expresión de N en los ensayos. El estudio también trató sobre sí la fosforilación de N afecta la transcripción y reproducción virales o ambas . Un escenario posible sería que la fosforilación de N afecta a la transcripción y reproducción virales, o ambas. La cuantificación de transcriptos virales y ARN genómico en el minigenoma y el virus infeccioso indicó que ambos niveles de transcripto viral y ARN genómico (o análogo) se redujeron cuando N no fue fosforilada (Figuras 2 y 5) . Sin embargo, esos datos no necesariamente significan que la N no 'fosforilada inhibe a la transcripción y reproducción virales debido a la complejidad inherente de la transcripción y reproducción virales en las células infectadas ( agner y Rose, 1996) . La reducción en la reproducción del genoma viral da como resultado menos patrones para la transcripción, y esto probablemente hará disminuir la acumulación de ARNm viral. Por otro lado, la reducción a la transcripción reduce la cantidad de N y eventualmente conduce a la reducción en la reproducción. No obstante, puede concluirse de los datos obtenidos en el sistema del minigenoma que la N fosforilada favorece la reproducción viral . La reproducción viral se reduce cuando la M no es fosforilada en el sistema del minigenoma (véase la Figura 2) a pesar del hecho de que, en el sistema del minigenoma, la reproducción viral no depende de la transcripción viral debido a que la transcripción de N está bajo el control de la polimerasa T7. En realidad, la inmunoprecipitación indicó que el nivel de N no fosforilada fue similar al de N wt del sistema minigenómico . Para demostrar mejor si y como la fosforilación de N también afecta a la transcripción viral, desacoplamos la transcripción viral de la reproducción viral inhibiendo la síntesis de proteína tratando células infectadas con CHX. La reproducción viral depende de la síntesis de novo de la proteína de N viral, mientras que la transcripción no (25) . Bajo esas condiciones, la reproducción viral se redujo pero •la transcripción viral no (Figura 6), lo cual permitió la evaluación de los efectos de la fosforilación de W sobre la transcripción viral independientemente de la reproducción viral. Los datos demuestran que la fosforilación de N también modula la txanscripción viral debido a que la transcripción viral fue inhibida casi en un 90% cuando M no fue fosforilada, particularmente cuando S fosforilada mutó a A. De este modo, los datos demuestran que la fosforilación de N favorece la transcripción y reproducción virales . En todos los ARN virus de una sola hebra en sentido negativo, el virus de la rabia el complejo RNP es la unidad infecciosa (Wunner., 1991). La interacción complicada entre los componentes dentro del complejo RNP da origen a la transcripción y reproducción del virus ( agner y Rose, 1996; ertz et al., 1987} . Previamente, se mostró que la desfosforilación de N del virus de la rabia purificada encapsula más a ARN líder que la N fosforilada (Yang et al., 1999) . La mutación de la serina en la posición 389 de N del virus de la rabia a alanina también dio como resultado el incremento en la unión al ARN líder en comparación con la N t . La fosforilación de N afecta a la transcripción y reproducción virales. De este modo es posible que una fuerte unión de N no fosforilada al ARN pueda evitar que L tenga acceso al AUN genómico para Iniciar la transcripción y reproducción viral . Aunque N permanece unida al ARN genómico durante los procesos de transcripción y reproducción a través del esqueleto de fosfato (Emerson, 1982), la N asociada con el patrón tiene que desplegarse transitoriamente de modo que L pueda hacer contacto con el ARN patrón (Bannerjee y Chattopadhya , 1990) . La fosforilación de N puede debilitar la interacción entre N y ARN genómico y por lo tanto permite que L tenga acceso a y se una al patrón de ARN para iniciar la transcripción y reproducción. Esta hipótesis es apoyada por datos tanto en el sistema minigenómico como en el virus infeccioso. Cuando la serina fosforilada mutó a los aminoácidos neutros A y C, la transcripción y reproducción virales se redujeron al máximo. Cuando la serina fosforilada mutó a ácido aspártico o ácido glutámico cargado negativamente, las actividades de transfección y reproducción se restablecieron en más de 60 al 90% de los niveles de N wt . La cantidad de transcripto y producto de reproducción en las células infectadas con virus muíante L16E (serina cambiada a ácido glutámico) fue esencialmente equivalente a la de las células infectadas con el virus L16 wt . Esto ocurrió aún cuando la producción de virus en células infectadas con L16E fue ligeramente menor que en las células infectadas con L16. Debido a que el ARN genómico es el patrón para la transcripción y la reproducción ( agner y Rose, 1996) , es concebible que la N fosforilada facilite el inicio de la transcripción y reproducción . Debido a que la fosforilación de N afecta su eficiencia para encapsular al ARN líder (Yang et al., 1999) , es posible que la fosforilación de N conduzca a la encapsulación de más ARN antigenómico que genómico (Wunner, 1991) . La N no fosforilada, puede unirse fuertemente al ARN genómico, el primer paso de la reproducción viral, puede reducir la síntesis de la ADN genómico. La relación entre el ARN genómico y el ARN antigenómico permaneció constante en células (aproximadamente 3:1) infectadas con el virus wt o con uno de los virus mutantes . Las relaciones entre el ARN genómico y antigenómico en los viriones purificados de todos los virus también fueron similares (aproximadamente 20:1) . La relación del ARN genómico al ARN antigenómico medido fue diferente a la que se reportó previamente (50:1) (Finke y Conzelmann, 1997) . La discrepancia puede deberse a los métodos y cuantificación usados en esos dos estudios . El ARN fue cuantificado con densitometría en los experimentos de la presente, mientas que el ARN fue cuantificado por imagen de fósforo en el estudio reportado anteriormente. No obstante, los datos reportados aquí indican que la fosforilación de N no afecta a la encapsulación de ARN genómico o antigenómico. Recientemente, Kawaí et al. (1999) reportó que N fosforilada es detectada únicamente en la nucleocapsula , mientras, que N en la masa de N libre (principalmente en el complejo de N-P) no está fosforilada. Sobre la base del ese estudio y datos presentados aquí, se propuso el siguiente modelo para explicar como N del virus de la rabia es fosforilada y como la fosforilación de N del virus de la rabia modula la reproducción y transcripción virales (Figura 8) . N no está fosforilada en la N libre o en el heterocomplej o N-P, posiblemente debido a la conformación. Es posible que el sitio de fosforilación este sepultado en esta etapa. Es ventajoso que N no sea fosforilada antes de encapsular al ARN genómico debido a que la N no fosforilada tiene mayor afinidad por el ARN genómico que la N fosforilada (Yang et al., 1999) . La interacción (encapsulación) del ARN genómico con el complejo N-P puede inducir cambios conformacionales de N, lo cual permite que N interactúe con la cinasa, o exponga la serina 389 a la fosforilación, o ambas. La fosforilación de N a su vez puede afectar la interacción entre N y el ARN genómico. Después de la fosforilación, la repulsión de carga entre la fosfoserina cargada negativamente y el ARN cargado negativamente puede debilitar a la interacción entre N y el ARN. Esto podría permitir que N tuviera acceso a y se uniera al ARN genómico, iniciando por lo tanto al transíección y reproducción del ARN viral . Las evidencias que apoyan este modelo provienen de dos estudios. La N no fosforilada se une al ARN genómico más fuerte que la N fosforilada (Yang et al., 1999), y el sitio de fosforilación (residuo 389) está cerca del dominio de unión de ARN putativo (residuos 289 a 352) ( ouznetzoff et al., 1992) . La N no fosforilada, debido a la unión más fuerte con el ARN, podría prevenir que L tuviera acceso al patrón genómico. En consecuencia, la eficiencia de la transcripción y reproducción del ARN viral se reduce.

EJEMPLO 4 Construcción de virus de la rabia virulento con mutaciones en N y G y determinación de su virulencia e inmunogenicidad La mutación de la serina fosforilada, particularmente a alanina, inhibió la transcripción y reproducción virales en el minigenoma del virus de la rabia y con el virus infecciosos (Wu et al., 2001; Yang et al., 1999) . El virus producido para este virus mutante (L16A) fue al menos 4 unidades log menor que el virus wt (Wu et al . , 2001) . Todos esos datos indican que la mutación sobre N puede inhibir la reproducción viral y de este modo puede atenuar al virus. Anteriormente se ha reportado que la mutación sobre G, particularmente el aminoácido arginina en la posición 333, dio como resultado la atenuación del virus de la rabia (Dietzschold et al., 1983) . Los virus de la rabia atenuados con mutación en la arginina 333 de G han reducido la capacidad de propagación de neuronas infectadas principalmente a neuronas secundarias o terciarias en CNS (Coulon et al, 1989) . Sin embargo, ' la velocidad de reproducción de esos virus mutantes en cultivos celulares no fue diferente a la del virus wt, indicando que la mutación de G en la posición 333 no da como resultado una reducción en la velocidad de producción (Lafay et al., 1994) . Esto puede explicar como esos virus mutantes pueden aún causar rabia en animales neonatos vía inoculación intracerebral directa (Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994) . La mutación de N y G conducirá a una atenuación mayor del virus de la rabia hasta un grado en el que el virus ya no causará enfermedad en animales de cualquier edad o cualquier ruta de inoculación. Esto se debe a que esos virus mutantes no únicamente tendrán menor capacidad para invadir al sistema nervioso, sino que también tendrán una velocidad de reproducción reducida. Por lo tanto, los virus de la rabia virulentos pueden ser seleccionados construyendo mutaciones sobre ambas proteínas N y G para determinar su virulencia e inmuogenicidad. Constructo y selección del virus de la rabia virulentos por mutación de G y N: Se construyeron virus de la rabia (L16A, L16D, y L16E) con mutación en el sitio de ¡fosforilación de N (Wu et al., 2001) . Puesto que la velocidad de reproducción de L16D y L16E es similar a la del virus L16 wt, se introdujo una mutación de G en 333 en L16 y L16A por mutagénesis dirigida al sitio como se describió anteriormente (Wu et al., 2001) usando los cebadores (SEQ ID NOS: 16-17) ( 5 ' ATGCTCACTACAAGTGAAACTTGGAATCAG3 ' y 5 ' GGAGGA CTCAT CCAAGTT CACTTGTAG3 ' ) . Esos cebadores dan como resultado la mutación del residuo de arginina (AGA) a ácido glutámico (GAA) . Como ha sido reportado anteriormente para SAG2 , son cambiados dos nucleótidos, lo cual reduce la posibilidad de que G regrese a su genotipo virulento (Schumac er et al., 1993; Lafay et al., 1994). Un fragmento (secuencias nucleotídicas 3854-8273 del genoma del virus de la rabia) (Conzelmann et al., 1990) que contienen el codón de arginina de G de la clona infecciosa completa del wt (pSAD-L16) (Schnell et al., 1994) es cortado con Xhol y clonado en pGEM-3Z en el mismos sitio. El plásmido resultante es usado como patrón para la construcción de la mutación, usando el método de Weiner et al. (Weiner et al., 1994) y los cebadores mostrados anteriormente. La arginina en la posición 333 mutó a ácido glutámico en el vector sustituto. Después del análisis de secuencia para confirmar la mutación, los fragmentos Xhol mutantes serán clonados nuevamente a pSAD-Ll6 y pSAD-L16A en el sitio Xhol. Las clonas mutantes con la mutación esperada y la orientación correcta son designadas como pSAD-L16G333 y pSAD-L16A333 , respectivamente. Para seleccionar virus mutantes con mutaciones en G y N, las células BS T7/5 son transfectadas con 10 ^ig de pTIT-N, 2.5 µ-g de pTIT-P, 2.5 ^ig de pTIT-L, junto con 10 µ de pSAD-L16G333 o pSAD-L16AG3 3 , como se describió ( u et al., 2001,- Schnell et al., 2000). Las células son reabastecidas con medios frescos y cultivadas otros tres días antes de que el sobrenadante sea transferido a células BSR frescas. Dos días después de la infección, los virus son detectados usando anticuerpos N del virus de la rabia conjugados con FITC. La tinción positiva de las células indicará el rescate exitoso del virus infeccioso. El virus es propagado para su análisis adicional . Esos dos virus seleccionados serán designados como L16G333 y L16AG333, respectivamente . Para analizar mejor los virus mutantes, se determinaron curvas de crecimiento infectando células BSR con cada uno de los virus a una moi de 1. Se incluyeron L16 y L16A para comparación. Después de 1 hora de adsorción, el inoculo de virus es removido y las células lavadas tres veces con PBS . A continuación, se agregará medio fresco. Son removidas alícuotas de medio de cultivo a las 6, 12, 18, 24, 36, 60 y 72 horas p.i y usadas para la titulación del virus como se describió (Wu et al., 2001). Este experimento es repetido tres veces y el título promedio de cada .virus es usado para efectuar comparaciones. Para determinar si esos virus mutantes tienen una velocidad de reproducción viral reducida, son infectadas células BSR a una moi de 1 y cosechadas a las 40 hr p.i para el aislamiento del ARN total, usando el método descrito (Wu et al., 2001) . El ARN genómico viral y los transcritos en las preparaciones de ARN son analizados por hibridación de manchas Northern usando sondas hechas de ADNc de N (Fu et al., 1991) y G (Fu et al., 1993). La cuantificación del ADN se efectuó por densitometría o poi" fosfoimágenes de las bandas de ARN. De manera alternativa, las células BSR infectadas con esos virus son marcadas metabólicamente con [3H] uridina (33 iCi/mL) durante 4 r en presencia de actinomicina D (5 µg/ml) , de acuerdo a lo descrito para el VSV ( ertz et al., 1998) . Las células son entonces cosechadas para la extracción del ARN. El ARN es analizado por electroforesis sobre gel y cuantificado por densitometría . Las relaciones molares serán calculadas a partir de la densidad de cada transcripto y el ARN genómico. Estudios de las curvas del crecimiento del virus muestran que el L16G333 crece en cultivo celular a los mismos títulos altos que el L16 debido a que estudios anteriores mostraron que el virus de la rabia atenuado con mutación de G en 333 creció también como el virus wt en cultivo celular (Lafay et al., 1994) . De igual modo, el L16AG333 crece en cultivo celular a los mismos títulos que el virus mutante L16A ( u et al., 2001) y su rendimiento será al menos 4 unidades log menor que el del virus wt . La hibridación de manchas Northern y la marcación con [3H] uridina indica que la velocidad de reproducción viral se redujo al menos 5 veces para el L16A y el L16AG333 cuando se comparó con el L16 y el L16G333 como se observó anteriormente (Wu et al., 2001). Esto sugiere que la mutación de N en el sitio de fosforilación reduce la capacidad del virus de la rabia para reproducirse.

EJEMPLO 5 Determinación de la virulencia del virus de la rabia con mutaciones en G y N. Para determinar la virulencia de esos virus mutantes, se seleccionaron ratones de dos grupos de edad (neonatos y ratones de 5 a 6 semanas de edad) . El virus SAD atenuado (L16) puede inducir a enfermedad en ratones de 5 a 6 semanas de edad (Winkler et al., 1976), y el SAG-2 (con mutación sobre la G, similar al L16G333) puede inducir enfermedad en ratones neonatos (Schumacher et al., 1993) por inoculación intracerebral . Existen 4 virus a ser probados que incluyen el LIS wt y los virus L16A, L16G333, y L16AG333 mutantes. Se probaron tres dosis (105,10s y 107 ffu) para cada virus . Son necesarios un total de 12 grupos de ratones ICR (diez en cada grupo, de Harían) a la edad de 5 a 6 semanas de edad para este experimento. Se incluyó un grupo extra como controles. Los animales serán infectados con 10 µ? que contienen la dosis deseada con inoculación i.c. Para el grupo control, los ratones serán inyectados con 10 µ? de solución salina por la ruta i.c. Los animales serán observados dos veces al día durante 20 días para determinar signos clínicos de la rabia como collarín de pelo, ataxia y parálisis. Los ratones moribundos y los ratones al final del experimento serán sometidos a eutanasia por inhalación de C02. La tasa de mortalidad para cada uno de los grupos será registrada y analizada estadísticamente usando la prueba T o la prueba X2. Para probar la virulencia de esos virus en animales neonatales, son necesarios un total de 12 carnadas de ratones ICR (cada ratón preñado usualmente tiene de 8 a 11 carnadas, Harían) para este experimento. Cada carnada es infectada con una dosis de un virus. Es incluida una carnada extra como control . Los ratones neonatos a un día de edad son infectados con 10 µ? de volumen que contienen las dosis deseadas de cada virus por inoculación i.c. Para el grupo control, los ratones neonatos son inyectados con 10 µ? de solución salina por la ruta i.c. Los animales son observados dos veces al día durante 20 días para carnadas muertas. Los ratones sobrevivientes al final del experimento son sometidos a eutanasia por inhalación de C02 · La tasa de mortalidad de cada una de las carnadas son registradas y analizadas estadísticamente usando la prueba T de student o la prueba X2. El virus L16 natural (wt) induce la rabia en ratones de 5-6 semanas de edad y en ratones neonatos como ha sido demostrado anteriormente (Winkler et al., 1976). Los animales de 5-6 semanas de edad infectados muestran signos clínicos al día 5 a 6 p.i. y se tornan moribundos el día 6 a 8 p.i. Los neonatos infectados muestran signos clínicos severos o mueren al día 4 a 5 p.i. Como se describió para el SAG2 (Schumacher et al., 1993), el L16G333, el virus que contiene la mutación en la arginina 333 de la G, pero no la mutación en el sitio de fosforilación de la N, no inducirá ninguna enfermedad en animales de 5-6 semanas de edad. Sin embargo, puede inducir signos clínicos en neonatos. Los cerebros de los animales a los cuales se administró L16 son removidos de esos animales para el aislamiento y genouipificación del virus. Los títulos de virus son determinados en animales enfermos como se describió anteriormente (Fu et al., 1996) . Para la genotipificación, es preparado el ARN total de los cerebros y usados para los cebadores usando RT-PCR (SEQ ID NOS: 13-14) lOg (51 CTACAATGGATGCCGAC3 ' ) y 304 (5 ' TTGACGAAGATCTTGCTCAT3 ' ) como se describió (Smith et al., 1991). Esos cebadores pueden amplificar la secuencia que codifica para N completa del ARN genómico. El fragmento amplificado es secuenciado directamente usando el cebador 113 (SEQ ID NO: 15) (51 GTAGGATGCTATATGGG3 ' ) (Smith et al., 1991), el cual precede inmediatamente al área de las mutaciones sobre el gen de N. Si los títulos para el virus mutante son similares a los virus wt y el análisis de secuencia indica la reversión de la serina mutada sobre N, este indica que el virus se ha revertido. En este caso, la serina muta a lisina o glutamina, lo cual cambia dos o los tres nucleótidos del codón de serina, haciendo menos probable la reversión.

Si el virus de la rabia (L16A) con mutación en el sitio de fosforilación de N no induce ninguna enfermedad en ningún grupo de animales, esto demuestra que la reducción de la velocidad de reproducción por si sola también puede conducir la atenuación del virus de la rabia en un grado que puede no causar ya enfermedad en animales neonatos. Esos virus mutantes están suficientemente atenuados y son desarrollados como vacunas del virus de la rabia vivas. El virus (L16AG333) que contiene mutaciones en la arginina 333 de G y el sitio de fosforilación de N, no inducirá ninguna enfermedad por infección i.c. en animales a ninguna edad, incluyendo los neonatos. De este modo, la mutación sobre ambas de G y N vuelve al virus de la rabia avirulento debido a que ese virus imitante no únicamente reduce la capacidad de propagación dentro del sistema nervioso (Coulon et al., 1989) sino que también reduce la "velocidad de reproducción (Wu et al., 2002) . Si estos virus estimulan una respuesta inmune active animales en inoculados (véase adelante) , son candidatos ideales para desarrollar vacunas del virus de la rabia vivas avirulentas . EJEMPLO 6 Determinación de la iimmogenicidad de virus de la rabia mutantes. Para determinar la inmuogenicidad de la rabia (L16AG333) con mutación en G y N, se seleccionaron ratones adultos. Para comparación, se incluyeron L16, L16A, L16G333.

Se probaron tres dosis (105,106, y 107 ffu) para cada virus y esto determinará la dosis mínima de un virus que puede estimular la inmunidad protectora. Cada una de las dosis de virus son usadas para cada una de las tres rutas de inoculación, es decir intramuscular (i.m.), intradérmica (i.d.), y subcutánea (s.c). Son necesarios un total de 36 grupos de ratones ICR (10 en cada grupo) para este experimento. Se incluyó un grupo extra como controles. Los animales son inmunizados con un volumen de 50 µ? que contiene el virus deseado a la dosis deseada por i.m., i.d., o s.c. Los ratones en el grupo control son dejados sin vacunar. Los ratones son sangrados para la medición de VNA a la 1, 2, 3, y 4 semanas después de la inmunización. Después del último sangrado, los ratones son desafiados i.m. en la pata trasera con 10 MIMLD50 (dosis letal i.m. para el 50% de los ratones) del virus CVS-24 como se describió (Fu et al., 1991). Los vanimales son observados dos veces diariamente para el desarrollo de síntomas neurológicos o muertes durante 20 días. Las tasas de mortalidad son registradas y analizadas estadísticamente para cada grupo de animales. Para la medición de anticuerpos de neutralización anti-virus de la rabia, se empleó la prueba de inhibición de enfoque fluorescente rápido (RFFIT) como se describió (Hable, 1996; Briggs et al., 1996). Brevemente, el suero es diluido e incubado con aproximadamente 50 TCID50 de la variante CVS-11 del virus de la rabia durante 90 minutos. Se agregan células BH y se dejan incubar durante 24 horas. Las células son fijadas en incubadas con anticuerpo antirrabia marcado con FITC (Centocor) . Las células infectadas con virus son contadas y los títulos de anticuerpos son calculados usando el método de Reed y Muench (Reed et al., 1938) . El desarrollo de VNA es comparado entre todos los grupos de ratones por análisis estadísticos usando análisis de varianza de dos vía con interacciones (Littell et al., 1996). El virus L16 wt y todos los virus de la rabia mutante son capaces de inducir respuestas inmunes por esas rutas de inmunización parenterales . Ninguno de esos virus causará enfermedad en ratones adultos por la ruta de inmunización periférica, como ha sido demostrado anteriormente por el virus L16 wt (Finke et al., 2000) . Los títulos de ft desarrollados en ratones por inmunización con •L16G333 pueden ser más altos que aquellos con virus con mutaciones en G y N debido a que esos virus tienen una velocidad de reproducción reducida. De este modo puede requerirse una dosis más alta para L16A y L16AG333 que contienen la mutación sobre el sitio de fosforilación de N para inducir inmunidad protectora que el virus wt (L16) o virus que contiene solo mutación sobre la arginina 333 de G (L16G333) . También es posibles que las respuestas de VNA inducidas por los virus mutantes en G y N sean similares a aquellas inducidas por L16G333 aún cuando este virus pueda reproducirse mejor en cultivo celular in vi tro que en virus con mutaciones en G y N. Aquellos virus que crecen mejor en cultivo celular pueden no tener la ventaja de la situación in vivo, debido a que esos virus tienen capacidad reducida para propagarse in vivo (Coulon et al., 1989) . Si el virus (L16AG333) con mutación en G y N induce títulos de V A comparables a los L16G333 y protege al 100% de los animales inmunizados contra el desafío con virus de la rabia virulento, aún esto no inducirá ninguna enfermedad en animales neonatos por infección i.c. (véase más arriba), este virus es probado adicionalmente como una vacuna del virus de la rabia avirulenta dirigido a especies de animales como mapaches, perros o aún humanos por diferentes rutas de inmunización . Debido a la velocidad de replicación reducida, el virus de la rabia mutante L16A (que contiene la mutación de serina a alanina) crece muy lentamente y su rendimiento es 4 unidades log menor que el virus L16 wt (Wu et al., 2002) . La propagación de este virus a 31°C incrementó la producción de virus, pero el rendimiento de virus es aún más bajo que el virus wt . Para superar esta dificultad, se estableció una línea celular que expresa de manera estable N fosforilada para la propagación de virus con mutación sobre el sitio de fosforilación de N. Esto se basó en la observación previa de que la N no fosforilada no es un regulador negativo dominante y su función inhibidora sobre la transcripción y reproducción virales puede ser superada por la transcomplementacion con N fosforilada (Yang et al., 1999). Para establecer una línea celular que exprese de manera estable N fosforilada, es digerida la secuencia que codifica para la N viral de la rabia a partir de pRM con Xbal y PstI (Yang et al., 1998) . El fragmento es cortado con Klenow y clonado en pcDNA3 (Invitrogen) en el sito de EcoRV. El plásmido resultante es secuenciado para la confirmación de la orientación, y entonces el plásmido correcto (pcDNA3-N) es transfectado en células BHK. A las 48 horas después de la transíección, las células son cosechadas. Se efectúa una dilución limitada acoplada con detección de la expresión de N para seleccionar células transfectadas de manera estable. Las células cosechadas son diluidas 10 veces en serie en placas de 96 pozos, y se les agrega medio selectivo que contiene 50 de G 418. Las células son incubadas adicionalmente durante 1 semana, y las células que expresan N son identificadas por anticuerpos anti-N del virus de la rabia conjugados con FITC (Centoco) . Las células que expresan M (BHK-N) son clonadas adicionalmente y usadas para la propagación de virus de la rabia con N mutante. El nivel de expresión de N en estas células es verificado de vez en vez. Una vez establecida la línea celular que expresa N estable (BHK-N) , los virus de la rabia mutantes incluyendo al L16A, L16AG333, son propagados en células BH -N. Si es obtenible el título del virus de 107 ffu/ml o mayor, esto indicará que las células de BHK-N proporcionaran suficiente N fosforilada para que el virus mutante se reproduzca a títulos altos . Aunque la velocidad de reproducción reducida y la capacidad reducida para propagarse dentro del sistema nervioso hace al L16AG333 un candidato ideal para desarrollar vacunas del virus de la rabia avirulentas, la mutación sobre N de serina (UCU) a alanina (GCU) sobre L16A y L16AG333 únicamente cambia un nucleótido del codón de la serina. Siempre es posible que el residuo de alanina pueda mutar nuevamente a serina y el virus regrese al genotipo L16, particularmente bajo la velocidad de reproducción reducida severa. Aunque L16A fue pasado al cultivo células más de 10 veces, no ha ocurrido reversión. Para evitar la reversión, la ferina (TCT) es sometida a mutación a glicina (GGT) o glutamina (CAA) , los cual cambia dos de los tres nucleótidos en el codón de serina, haciendo menos probable la reversión. La glicina es un aminoácido neutro y tiene una estatura similar a l de la alanina. La glutamina tiene la misma estructura que el ácido glutámico pero sin la carga negativa. La mutación de la serina fosforilada a glicina o glutamina puede tener el mismo efecto que la mutación de serina a alanina sobre la transducción y reproducción viral (Wu et al., 2001) . Esas mutaciones se llevan a cabo fácilmente de acuerdo a lo descrito en Wu et al . , 2001.

EJEMPLO 7 Construcción de virus de la rabia avirulento por reubicación del gen de N del virus de la rabia a lo largo del genoma del virus y determinación de su virulencia e inmunogenicidad Estudios con un virus relacionado, el VSV, mostraron que el rearreglo de N dentro del genoma de VSV dio como resultado la atenuación del VSV ( ertz et al., 1998).

En ese estudio, el gen de N fue reubicado de la primera posición del genoma a la segunda, la tercera, o la cuarta posiciones a lo largo del genoma de VSV. La reubicación de N dio como resultado una reducción gradual en la expresión de N, en consecuencia una reducción de la reproducción viral. La 'translocación de N también dio como resultado la atenuación gradual del virus en animales . Aunque todos los ratones infectados intranasalmente con VSV WT a una dosis de 300 ufp murieron, y ninguno de los ratones infectados con la misma dosis de N4 (el gen de N es reubicado a la cuarta posición a lo largo del genoma) desarrollaron la enfermedad. La reubicación del gen de N a lo largo del genoma del virus de la rabia también puede conducir a atenuación del virus de la rabia. De este modo, se construyó un virus de la rabia avirulento reubicando el gen de N del virus de la rabia, a la segunda, tercera o cuarta posición dentro del genoma del virus de la rabia. Los virus de la rabia con N reubicada, si están suficientemente atenuados, tienen ventajas sobre el virus con N mutante en el sitio de fosforilación debido a que los cambios en los virus con N reubicada serán irreversibles (Wertz et al., 1998) . Aunque la reubicación del gen de N dio como resultado la atenuación de VSV, N4 causó aún la enfermedad y muerte en ratones cuando se inoculó una dosis más alta (Wertz et al.., 1998) . La mutación de G en la arginina 333 también se incorporó en los virus con N reubicada para atenuar" aún más el virus de la rabia.

Construcción del virus de la rabia avirulento por reubicación del gen de N. Para reubicar el gen de N dentro del genoma del virus de la rabia, se construyeron dos plásmidos . El plásmido pSAD-L16G333 es digerido con Xhol, el cual removerá un fragmento de aproximadamente 4.5 kb (3854- 8273 del genoma del virus de la rabia) (Conzelmann et al., 1990) del plásmido. El pSAD-L16G333 es elegido debido a que este plásmido ya contiene la mutación de la arginina 333 sobre G. La remoción del fragmento de Xhol y del pSAD-L16G333 ayuda a la mutagénesis posterior debido a los tamaños más pequeños. Después de la digestión y recuperación de los dos fragmentos (10.5 kb y 4.5 kb) , el fragmento largo es autoligado para formar el plásmido pSAD-L16G333 Xhol, el cual contiene los genes de N, P, M, y G y L parciales. Este plásmido también contiene las secuencias intergenéticas entre N y P, entre P y M y entre M y G. De este modo, este es usado para reubicar el M a la segunda y tercera posiciones, la cual está entre P y M y entre M y G. Los fragmentos pequeños son clonados en el vector pGEM-3Z en el sitio Xhol y designado como pGEM-Xhol . Este plásmido contiene la unión intergénica G-L y es usado para reubicar la N de la cuarta posición entre G y L. Para construir virus recombinantes con N rearreglada, la N en la primera posición es suprimida del plásmido pSAD-L16G333XhoI usando la ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart (Lundberg et al., 1991) (Stratagene) . Son sintetizados dos cebadores (SEQ ID NOS : 18-19) (5 'ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3 ' y •5 ' CATTTTTGCTTTGCAATTGACAATGTC3 ' ) y usados en la reacción de PCR. Esos dos cebadores amplificarán un fragmento de 9 kb, dando como resultado la supresión del gen de N de muy al inicio del transcripto de N incluyendo la región no traducida en el extremo 5' , la región codificadora, la región no traducida en el extremo 3 , y la secuencia intergénica entre N y P. La ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart crea extremos romos (Lundberg et al., 1991) en los fragmentos amplificados y de este modo pueden ser autoligados . Los plásmidos ligados son secuenciados en la unión de la mutación para asegurarse de que no existan mutaciones espurias en la secuencia líder y la secuencia inicial del ARNm de P. El plásmido resultante es designado con pSAD-PMG y será usado para la construcción de las clonas con N arreglada. Debido a que la ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart puede amplificar hasta 15 kb de la secuencia del vector de ADN (Stratagene) , no existe problema debido a que el plásmido pSAD-L16G333XhoI es solo de aproximadamente 10 kb de tamaño. Debido a que cada transcripto del virus de la rabia comienza con AACA, se creó un sitio de restricción Hpal único (GTTAAC) en cada una de las uniones del gen para la clonación del gen de N. Para clonar el gen de N en la segunda posición a lo largo del genoma, se creó primero un sitio único Hpal entre los genes de P y M, inmediatamente después de la secuencia intergénica. Esto se logró con mutagénesis. dirigido al sitio usando el método de Weiner et al. (Weiner et al., 1994) . Se sintetizaron dos cebadores (SEQ ID NOS: 20-21) (51 TCAACATGAAAAAAACAGTTAACACCACT3 ' y 5 'AGGGGTGTTAACTGTTTTTTTCATGTTGA3 ' y se usaron para construir el sitio Hpal único entre los genes de P y M sobre pSAD-PMG. La mutación es confirmada por análisis de secuencia y el plásmido es designado como pSAD-PH G. Entonces todo el gen de N del inicio del transcripto hasta la secuencia intergénica es amplificado, usando la ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart con los cebadores (SEQ ID NOS: 22-23) 51 ACACCCCTACAATGGATGCCG3 ' y 5 "GTTTTTTTCATGATGGATATACAC3 y entonces clonar en el sitio Hpal del pSAD-PHMG. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la orientación correcta. La introducción del sitio Hpal, aunque no cambia el inicio del transcripto con N insertada, altera la secuencia intergénica. De este modo, tiene que restablecerse la secuencia intergénica. Esto se lleva a cabo por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS: 24-25) 5 ' ATGGAAAAAAACAGGCAACTG3 ' y 5 ' AGTTGCCTGTTTTTTTCCATG3 ' . Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la secuencia intergénica correcta y designado como pSAD-PNMG. Finalmente, será cortado un fragmento de Xhol del pGEM-Xhol y clonado en el sitio Xhol del pSAD-PNMG para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con el gen de N clonado en la segunda posición. Este plásmido es designado como pSAD-N2, y contiene la secuencia de longitud completa del virus de la rabia exacta excepto que el gen de N se ubica entre los genes de P y M a lo largo del genoma del virus de la rabia. Para clonar el gen de N en la tercera posición a lo largo del genoma, se crea un sitio Hpal único entre los genes de M y G, inmediatamente después de la secuencia intergénica. Esto se lleva a cabo por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS: 26-27) 5 ' GATGTGAAAAAAACTGTTAACATCCCTC3 ' y 5 ' AGGGATGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3 ' lo cual conduce a la construcción de un sitio de Hpal único entre los genes de y G sobre el pSAD-PMG. La mutación es confirmada por análisis de secuencia, y el plásmido es designado como pSAD-PMHG. Entonces todo el gen N amplificado como se describió anteriormente será clonado en el sitio de Hpal del pSAD-PMHG. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la orientación correcta. La introducción del sitio de Hpal altera un nucleótido en la secuencia intergénica. De este modo, la secuencia intergénica es restablecida por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS: 28- 29) 5 ' TGAAAAAAACTATTAACATCCCTC3 ' y 5 ' AGGGATGTTAATAGTTTTTTTCAC31. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la secuencia intergénica correcta y designado como pSAD-PMNG. Nuevamente, el fragmento de Xhol será clonado en el pSAD-PMNG para crear la clona de virus de la rabia de longitud completa con el gen de N clonado en la tercera posición. Este plásmido es designado como pSAD-N3. Para clonar el gen de N en la cuarta posición a lo largo del genoma, se crea un sitio de Hpal único entre los genes de G y L, inmediatamente después de la secuencia intergénica de G+ Y (Conzelmann et al., 1990). Esta mutación es introducida al gen sobre el plásmido pGEM-Xhol debido a que este plásmido contiene la secuencia intergénica entre los genes de G y L . Esto es llevado a cabo por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS: 30-31) 5 ' CAGAAGAACAACTGTTAACACTTCTC31 y 51 AGAAGTGTTAACAGTTGTTCTTCTG3 ' lo cual conducirá a la construcción de un sitio de Hpal único entre los genes de G y L sobre el pGEM-Xhol . La mutación es confirmada por análisis de secuencia y el plásmido es designado como pGEM-GHL. Entonces todo el gen de N amplificado como se describió anteriormente es clonado en el sitio Hpal del pSAD-GHL. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado un plásmido con la orientación correcta. La introducción del sitio de Hpal altera dos nucleótidos en la secuencia intergénica. De este modo, se restablece la secuencia intergénica por mutagénesis dirigida al sitio usando los siguientes cebadores (SEQ ID NOS : 32-33) (5 ' AACAACTGGCAACACTTCTC3 ' y 5 'AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC31. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la secuencia intergénica correcta y es designado como pGEM-GNL. El fragmento de Xhol que contiene G, N, y L es cortado y clonado en los sitios Xhol del pSAD-PMG para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con el gen de N en la cuarta posición. Este plásmido es designado como pSAD-N4, y contendrá la secuencia de longitud completa del virus de la rabia exacta excepto que el gen de N se localiza entre los genes de G y L a lo largo del genoma del virus de la rabia. Para seleccionar esos virus con genes de N reubicados, esos plásmidos que contienen el genoma viral de longitud completa son transíectados individualmente en células BSR T7/5, junto con pTIT-N, pTIT-P y TIT-L, como se describió (Wu et al., 2001; Schnell et al., 2000). Las células son reabastecidas con medio fresco y cultivadas durante otros 3 días antes de que el sobrenadante sea transferido a células BSR frescas. Dos días después de la infección, el virus es detectado usando anticuerpos anti-N del virus de la rabia conjugado con FITC . La tinción positiva de las células indicará el rescate exitoso del virus infeccioso. Esos virus son designados como L16N2G333, L16N3G333 y L16W4G333. El virus es propagado para su. análisis adicional en células BHK o células BHK-N. Para analizar mejor esos virus rearreglados , son determinadas curvas de crecimiento de esos virus infectando células BSR con cada uno de los virus a una moi de 1. Se incluye el L16G333 como comparación. Después de 1 hora de adsorción, el inoculo de virus es removido y las células son lavadas tres veces con PBS . A continuación se agregará medio fresco 6, 12, 18, 24, 36, 60, y 72 h p.i. y son removidas alícuotas .del medio de cultivo a las usadas para la titulación del virus como se describió (Wu et al., 2001) . Este experimento es repetido tres veces y el título promedio de cada virus es usado como comparación. Para determinar si esos virus con N reubicada tienen una velocidad de reproducción viral reducida, son infectadas células BS con L16G33 o cada uno de los virus con N reubicada a una moi de 1 y cosechadas a las 40 hr p. i. para el aislamiento del ARN total, usando el método descrito (Wu et al., 2001). El ARN viral y los transcriptos genómicos en las preparaciones de ARN son analizados por hibridación de manchas Northern usando sondas hechas de ambos ADNc de N (Fu et al., 1991) y G (Fu et al., 1993) . La cuantificación del ARN es efectuada por densitometría o fosfoimágenes de las bandas de ARN. Alternativamente, las células BSR infectadas con esos virus son marcadas metabólreamente con [3H] uridina (33 durante 4 horas en presencia de actinomicina D (5 'como se describió para el VSV (Wertz et al., 1998) . Las células son entonces cosechadas para la extracción del ARN. El ARN es analizado por electroforesis sobre gel y cuantificado por densitometría. Se determinan y comparan la relación molar entre los cinco transcriptos y el ARN genómico entre esos virus . Estudios de curvas de crecimiento muestran que el rendimiento del virus para esos virus es en el orden L16G333, L16N2G333, L16N3G333 y L16N4G333. En el estudio de reubicación de N de VSV, se encontró que el rendimiento del virus se redujo hasta 4 unidades log para el virus N4 cuando se comparó con el VSV WT (Wertz et al., 1998). El rendimiento del virus para L16N4G333 se redujo hasta en 4 unidades log cuando se comparó con el del L16G333. La hibridación de manchas Northern y la marcación con [3H] uridina indica que a velocidad de reproducción viral (ARN genómico) se redujo para los virus con N reu icada cuando se comparó con L16G333, con el L16N4G333 siendo la más baja. Además, la relación molar entre los cinco transcriptos virales se alteró, dependiendo de la posición relativa de la N a lo largo del genoma viral. Para L16G333, las cantidades de transcriptos están en el orden de N > P > M > G > L; L16N2G333, P > N > M > G > L; L16N3G333, P > N > > G > L; y L16N4G333,P > M > G > N > L. Esos datos juntos indicarán que reubicando N a lo largo del genoma del virus de la rabia, la velocidad de reproducción 'del virus de la rabia se reduce, lo cual puede dar como resultado la atenuación del virus con N reubicada. Debido a que la mutación de G en la arginina 333 es incorporada en esos virus con M reubicada, esos virus con N reubicada no únicamente tendrán u a velocidad de reproducción reducida sino que también tendrá una capacidad reducida para invadir al sistema nervioso. Los virus de la rabia con N reubicada, si están suficientemente atenuados, tienen ventajas sobre los virus con N mutante en el sitio de fosforilación debido a que los cambios hechos en el virus con N reubicada serán irreversibles (Wertz et al., 1998), mientras que la mutación puntual en el sitio de fosforilación ( u et al., 2002) puede revertirse a su genotipo virulento. Si cualquiera de esos virus con N reubicada no causan ya enfermedad en ratones neonatos por inoculación i.c. (véase más adelante), tendrán el potencial para ser desarrollados con una vacuna del virus de la rabia aviruler.ta. Determinación de la virulencia de virus de la rabia con N reubicada. Para determinar la virulencia de virus de la rabia con N reubicada, se seleccionaron ratones de dos grupos de esas (neonatos y ratones de 5 a 6 semanas de edad) . Para comparación, se incluyó L16G333. El L16G333 puede inducir la enfermedad en ratones neonatos, pero no en ratones más viejos (Schumacher et al., 1993) por inoculación intracerebral . Existen 4 virus a ser probados, incluyendo L16G333, L16-ftf2G333, L16-N3G333, L16-N4G333. Se probaron tres dosis (105, 10s y 107 ffu) para cada virus. Son necesarios un total de 12 grupos de ratones ICR (diez en' cada grupo) a la edad de 5 a 6 semanas para este experimento . Se incluyó un grupo extra como controles. Los animales son infectados con 10 µ? que contienen la dosis deseadas por inoculación i.c. Para el grupo control, los ratones son inyectados con 10 µ? de solución salina por la ruta i.c. Los animales son observados dos veces al día durante 20 días para detectar signos de rabia clínica como collarín de pelo, ataxia y parálisis. Los ratones moribundos y los ratones al final del experimento son sometidos a eutanasia por inhalación de C02. La tasa de mortalidad para cada uno de los grupos es registrada y analizada estadísticamente usando la prueba T de student o la prueba X2. Para probar la virulencia de esos virus en animales neonatos, es necesario un total de 12 carnadas de ratones IC . Cada carnada es infectada con un virus . Se incluyó una carnada extra como control . Los ratones neonatos al día 1 de edad son infectados con un volumen de 10 µ? que contiene las dosis deseadas de virus mutantes por inoculación i.c. Para el grupo control, los ratones neonatos son inyectados con 10 µ? con solución salina por la ruta i.c. Los animales son observados dos veces al día durante días para carnadas muertas. Los ratones sobrevivientes al final del experimento son sometidos a eutanasia por inhalación con C02. La tasa de mortalidad para cada una de las carnadas se ha registrado y analizado estadísticamente usando la prueba T de student o la prueba X2. El L16G333 no induce enfermedad en animales de 5 a 6 semanas de edad. Para los virus con N reubicada, la virulencia está en el orden de L16G333 > L16N2G333 > L16N3G333 > L16N4G333. Debido a que esos virus contienen la mutación sobre la arginina 333 de G, no causarán ninguna enfermedad en ratones de 5 a 6 semanas' de edad pero pueden causar enfermedad en los neonatos . Debido a que los estudios con VSV indican que la velocidad de reproducción para el virus N4 se redujo severamente ( ertz et al., 1998), la velocidad de reproducción para el L16N4G333 también puede reducirse dramáticamente. Debido a que el L16-N4G333 también contiene la mutación sobre arginina 333 de G, este no únicamente tendrá una velocidad de reproducción reducida sino que también tendrá una capacidad reducida para propagarse en el CNS . De este modo, este puede no causar ninguna enfermedad en neonatos. Si este es el caso, el L16-N4G333 tendrá potencial para ser desarrollado como una vacuna del virus de la rabia avirulenta. El L16N2G333 y L16N3G333 también pueden ser avirulentos en animales neonatos, pero también pueden ser desarrollados como vacunas para el virus de la rabia virulentas .

Determinación de la inmunogenicidad del virus de la rabia con N reubicada. Para determinar inmunogenicidad de esos virus con N reubicada, se seleccionaron ratones adultos.

Existen 4 virus a ser probados incluyendo L16G333, L16N2G333, L16N3G333, y L16N4G333. Se probaron tres dosis (105, 106, y 107 ffu) por cada virus y esto determinará la dosis mínima de un virus que puede estimular una unidad protectora. Cada una de las dosis del virus es usada para cada una de las tres rutas de inoculación, es decir i. m. , i. d., y s. c. Son necesarios un total de 36 grupos de ratones IC adultos (diez en cada grupo) para este experimento. Será introducido un grupo extra como controles. Los animales son inmunizados con un volumen de 50 µ? que contiene el virus deseado a la dosis deseada por i. m. , i. d-, o s. c. Los ratones en el grupo control son dejados sin vacunar. Los ratones son sangrados para la medición de VNA (Hable, 1996; Briggs et al., 1996) a la 1, 2, 3, y 4 semanas después de la inmunización. Después del último sangrado, los ratones son desafiados i. m. en la pata trasera con 10 MILD50 (dosis letal i.m. para el 50% de los ratones) de virus CVS-24 como se describió (Fu et al., 1991) . Los animales son observados dos veces al día para el desarrollo de síntomas neurológicos y muertes durante 20 días. Las tasas de mortalidad son registradas y analizadas estadísticamente para cada grupo de animales. Todos los virus de la rabia con N reubicada son capaces de inducir respuestas inmunes por esas rutas palenterales de inmunización. Ninguno de esos virus causa enfermedad en ratones adultos por rutas periféricas de inmunización. Los títulos de VNA desarrollados en ratones por inmunización L16G333 pueden ser más altos que en aquellos inmunizados con virus con N reubicada. Debido a las diferencias en la velocidad de reproducción, los niveles de VNA pueden ser del orden de L16G333 > L16N2G333 > L16N3G333 > L16N4G333. Es posible que los niveles de A inducidos por esos virus con N reubicada sean similares . La inmunización con cualquiera de esos virus conduce a protección contra el desafío . El virus que puede inducir VNA comparable a la del L16G333 y proporcionar una protección del 100%, pero que no induce enfermedad en animales neonatos y crece mejor en el cultivo celular in vi tro, es seleccionado para ser probada adicionalmente en especies de animales objetivo como mapaches, perros, o aún humanos. Como para los virus con mutación sobre el sitio de fosforilación de N, los virus con N reubicada pueden crecer bien en cultivo celular debido a la velocidad de reproducción reducida como se reportó para el VSV (Wertz et al . , 1998) . Esos virus se hacen crecer en células BH -N que expresan establemente N fosforilada. Debido a que la velocidad de reproducción reducida se debe al nivel reducido de N en las células infectadas (Wertz et al., 1998), la suplementación de N en las células BHK-N incrementa el rendimiento del virus para esos virus con N reubicada. Debido a la similitud de secuencia entre el espacio que abarca el extremo de P, la región intergénica entre P y M, hasta el inicio del transcripto de M y que abarca del extremo de M, la región intergénica entre M y G, y el inicio del transcripto de G, la inserción del sitio de Hpal único puede ser difícil en las uniones P-M y M-G sobre el pSAD-PMG. De este modo, la temperatura de recocido en las reacciones de PCR varía, son seleccionadas clonas múltiples, y solamente son seleccionadas las mutaciones deseadas para su clonación adicional . Como se reportó para el VSV, N4, el cual es el virus imitante con la M en la cuarta posición a lo largo del genoma de VSN, aún causó enfermedad y muerte en ratones cuando se inoculó a una dosis más alta (Wertz et al . , 1998) . Si el virus de la rabia con N reubicado puede mantener virulencia residual, la serina se somete a mutación a alanina en el sitio de fosforilación de N para atenuar aún más los virus con N reubicada. Si las respuestas inmunes inducidas por los virus con N reubicadas son bajas debido a que la velocidad de reproducción de esos virus disminuyó severamente, son construidos virus con mayor expresión de G, el cual es el único antígeno que induce anticuerpos neutralizantes virales protectores (Cox et al., 1977) . Esto se logra remezclando los genes dentro del genoma del virus de la rabia.

EJEMPLO 8 Construcción del virus de la rabia avirulento mezclando los genes dentro del genoma del virus de la rabia y determinación de la virulencia e inmunogenicidad de esos virus de la rabia mezclados. Además de la reubicación del gen de N a lo largo del genoma de VSV, el remezclado de los genes dentro del genoma de VSV también condujo a cambios fenotípicos del VSV (Ball et al., 1999) . Aunque algunos de los VSV remezclados adquirieron características más virulentas cuando se compararon con los virus wt, otros VSV remezclados mostraron una velocidad de reproducción reducida en cultivo celular y virulencia reducida en animales (Ball et al., 1999) . De manera más importante, mover G de la cuarta posición a la primera posición no solo dio como resultado una atenuación del virus, sino que también condujo a respuestas inmunes aceleradas y mejoradas en animales (Flanagan et al., 2000) . De este modo, se construyó un virus de la rabia avirulento remezclando genes del virus de la rabia dentro del genoma del virus de la rabia, particularmente moviendo G de la cuarta posición a la primera posición y remezclando los genes de P, M y G . Adem s, la mutación de G en la arginina 333 es incorporada en todos y cada uno de los virus remezclados para atenuar aún más al virus de la rabia. Construcción de virus de la rabia avirulento remezclando genes del virus de la rabia dentro del genoma viral. Para remezclar los genes dentro del genoma del virus de la rabia, se siguió el procedimiento usado para reubicar el gen de N como se describió anteriormente. Para construir virus de la rabia con G en la primera posición, se usaron los plásmidos pGEM-GHL y pSAD-L16G333XhoI . Primero, son suprimidos los genes de N, P, y M del plásmido pSAD-L16G333XhoI. Se sintetizaron dos cebadores (SEQ ID NOS: 34 y 19) ( 5 'ACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3 ' y 5 ' CATTTTTGCTTTGCAATTGACAATGTC31 ) y se usaron en la reacción de PCR usando al ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart (Lundberg et al., 1991) (Stratagene) . Esos dos cebadores amplifican un fragmento de 7.3 kb, dando como resultado la supresión de los genes de N, P, y M de muy al principio del transcripto de N hasta la secuencia intergenética entre M y G. La ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart crea extremos romos (Lundberg et al., 1991) en los fragmentos amplificados y de este modo son autoligados. Los plásmidos ligados son secuenciados en la unión de la mutación para asegurarse de que no existan mutaciones espiras en la secuencia líder y en la secuencia de inicio del ARNm de G. Los plásmidos resultantes son designado como pSAD-L16G. Son construidos tres clonas del virus de la rabia con G en la primera posición en combinación con N en la segunda (G1N2), en la tercera (G1N3), o en la cuarta posición (G1N4) . Para construir la clona G1N2 , los genes de N, P, y M del inicio del transcripto de N a la secuencia intergénica de M (3.2 kb) son amplificados del pSAD-L16G333XhoI usando la ADN polimerasa PfuTurbo con los cebadores ( SEQ ID NOS: 22 y 35) 51ACACCCCTACAATGGATGCCG3 ' y 5 ' ATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3 ' . El fragmento amplificado es clonado en el sitio de Hpal del pGEM-GHL. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la orientación correcta. Entonces se restablece la secuencia intergénica por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS : 36-37 ) (5 'AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT31 y 5 ' GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3 ' . Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la secuencia intergénica corregida y designado como pGEM-GNMPL . Finalmente, el fragmento de Xhol de pGEM-GNMPL es clonado en el pSAD-G para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con el gen G clonado en la primera posición. El plásmido es designado como pSAD-L16GlN2G333. Para construir la clona G1N3 , los genes de P, N, y M del inicio del transcripto de P hasta la secuencia intergénica de M (3.2 kb) son amplificados del pSAD-PNMG, como se construyó en el punto específico 2, usando ADN polimerasa Pfu con los cebadores (SEQ ID NOS: 38-39) 5 ' ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3 ' y 5 ' TAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG31. •El fragmento amplificado es clonado en el sitio de Hpal de pGEM-GHL, también como se construyó en el punto 2 específico. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la orientación correcta. Entonces, se restablece la secuencia intergénica por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS : 0 y 37) ( 51 AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3 ' y 51 GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3 ' . Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la secuencia intergénica correcta y designado como pGEM-GPNML. Finalmente, el fragmento de Xhol del pGEM-GPNML es clonado en el pSAD-G para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con el gen G clonado en la primera posición y N en la tercera posición. Este plásmido es designado como pSAD-L16GlN3G333. Para construir la clona G1N , los genes de P, M, y N del inicio del transcripto de P hasta la secuencia intergénica de N (3.2 kb) son amplificados del pSAD-PMNG usando ADN polimerasa PfuTurbo con los cebadores (SEQ ID NOS : 38 y 23) 51 ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC31 y 51 GTTTTTTTCATGATGGATATACAC31 y clonados en el sitio de Hpal del pGEM-GHL. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la orientación correcta. Entonces se establece la secuencia intergénica por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS : 36-37) (5 ' AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3 ' y 5 ' GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3 ' ) . Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionada la secuencia intergénica corregida y designado como pGEM-GPMNL . Finalmente, el fragmento de Xhol del pGEM-GPMNL es clonado en el pSAD-G para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con el gen G clonado en la primera posición y N en la cuarta posición. Este plásmido es designado como pSAD-L16GlN4G333.

Existen, además del virus wt (P-M-G) , cinco posibles combinaciones (P-G-M, M-P-G, M-G-P, G-M-P, y G-P-M) para remezclar los genes de P, M, y G dentro del genoma del virus de la rabia. Para construir M-P-G, M-G- , y P-G-M, son usados los plásmidos pGEM-Xhol y pSAD-L16G333XhoI . Primero, será suprimido el gen de P del plásmido pSAD~L16G333XhoI . Son sintetizados dos cebadores (SEQ ID NOS: 41-42) (5 'ACACCACTGATAAAATGAACCTCC31 y 51 GTTTTTTTCATGATGGATATAGAG31 y usados en la reacción de PCR usando la ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart (Stratagene) . Esos dos cebadores amplifican un fragmento de 9.5 kb, dando como resultado la supresión del gen de P de muy al principio del transcripto de P hasta la secuencia intergénica entre P y N. La ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart crea extremos romos (Lundberg et al., 1991) en los fragmentos amplificados y de este modo pueden ser autoligados. Los plásmidos ligados son secuenciados en la unión de la mutación para asegurarse de que no existan mutaciones espurias en las resistencias no traducidas de N, la secuencia intergénica de N, y la secuencia inicial para el ARNm de M. El plásmido resultante es designado como pSAD-NMG. Para remezclar los genes en el orden de N-M-P-G-L, es creado un sitio de restricción de Hpal único (GTTAAC) sobre el pSAD-NMG en la unión del gen entre M y G . Esto se lleva a cabo por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores ( (SEQ ID NO: 26-27) 5 ' GATGTGAAAAAAACTGTTAACATCCCTC3 ' y 5 'AGGGATGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3 ' como se describo para la reubicación del gen de N. La mutación es confirmada por análisis de secuencias y el plásmido es designado como pSAD- NMHG. Finalmente, todo el gen de P, desde el inicio del transcripto hasta la secuencia intergénica, es amplificado usando ADN polimerasa PfuTurbo con los cebadores (SEQ ID NOS: 18 y 43) 5 ' CACCCCTCCTTTCGAACCATCCC31 y 5 ' CCTGTTTTTTTCATGTTGACTTTGGG31 y se clona en el sitio de Hpal di pSAD-PMHG. Después de la confirmación por análisis de secuencia, fue seleccionado el plásmido con la orientación correcta. Entonces se restablece la secuencia intergénica por mutagénesis dirigida al sitio usando los siguientes cebadores (SEQ ID NOS: 24-25) (5 ' ATGGAAAAAAACAGGCAACTG3 ' y 5 ' AGTTGCCTGTTTTTTTCCATG3 ' ) . Después de la confirmación por análisis de secuencia, fue seleccionado el plásmido con la secuencia intergénica corregida y designado como pSAD-NMPG.

^Finalmente, el fragmento de Xhol del pGEM-Xhol es clonado en el pSAD-NMPG para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con el gen P clonado entre los genes de M y G. Este plásmido es designado como pSAD-L16MPG. Para remezclar los genes en el orden de N-M-G-P-L, todo el gen de P amplificado como se describió anteriormente es clonado en el sitio de Hpal único del pGEM-GHL. Después de la confirmación por análisis de secuencia, fue seleccionado el plásmido con la orientación correcta. Entonces se restablece la secuencia intergénica por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS: 32-33) 5 ' AACAACTGGCAACACTTCTC31 y 5 ' AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC31. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la secuencia intergénica corregida y designado como pGEM-GPL . El fragmento Xhol pGEM-GPL es cortado y clonado en los sitios de Xhol de pSAD-NMG para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con el gen de P clonado entre los genes G y L. Este plásmido es designado como pSAD-L16MGP. Para remezclar los genes en el orden de N-P-G-M-L, el gen de M es suprimido de la clona pSAD~L16G333XhoI . Son sintetizados dos cebadores (SEQ ID NOS: 44 y 43) ( 5 ' ACATCCCTCAAAGACTCAAGG3 ' y 5 ' CCTGTTTTTTTCATGTTGACTTTGG31 ) y usados en la reacción de PCR usando la ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart (Lundberg et al., 1991) (Stratagene) . Esos ;dos cebadores amplificaran un fragmento de 9.5 kb, dando como resultado la supresión del gen de M desde muy al principio del transcripto de hasta la secuencia intergénica entre y G. La ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart crea extremos romos (Lundbex^g et al., 1391) en los fragmentos amplificados y de este modo el fragmento de PCR puede ser áutoligado. Los plásmidos ligados son secuenciados en la unión de la mutación para asegurarse de que no existan mutaciones espurias en las tres secuencias no codificadoras de P, la secuencia intergénica, y la secuencia de inicio para el AR m de G. El plásmido resultante es designado como pSAD-NPG. El gen de M completo es amplificado usando los cebadores (SEQ ID NOS: 45-46) 5 ' AACACCACTGATAAAATGAACCTCC3 ' y 51AATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3 ' y clonado en el sitio de Hpal único del pGEM-GHL. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la orientación correcta. Entonces se restablece la secuencia intergénica por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS : 32-33) 5 'AACAACTGGCAACACTTCTC31 y 51 AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3 ' . Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la secuencia intergénica corregida y designado como pGEM-GML. El fragmento de Xhol del pGEM-GML es cortado y clonado en los sitios de Xhol del pSAD-NPG para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con el gen de M clonado entre •los genes de G y L. Este plásmido es designado como pSAD-PGM. Para construir G- -P y G-P-M, son usados los plásmidos pGEM-GML y pSAD-L16G333XhoI . Primero, los genes de P y M son suprimidos de la clona pSAD-L16G333XhoI . Son sintetizados los cebadores (SEQ ID NOS: 34 y 42) 5 'ACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3 ' y 5 ' GTTTTTTTCATGATGGATATAGAG3 ' y usados en la reacción de PCR usando la ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart (Lundberg et al., 1991) (Stratagene) . Esos dos cebadores amplificaran un fragmento de 8.5' kb, como resultado la supresión de los genes de P y M de muy al principio del transcripto de P hasta la secuencia intergénica entre M y G. La ADN polimerasa PfuTurbo Hotstart crea extremos romos (Lundberg et al., 1991), y los fragmentos amplificados pueden ser autoligados. Los plásmidos ligados son secuenciados en la unión de la mutación para asegurarse de que no existan mutaciones espúreas en el extremo 3 de la secuencia de N, la secuencia intergénica, y la secuencia de inicio para el ARNm de G. El plásmido resultante es designado como pSAD-NG. Para remezclar los genes en el orden N-G-M-P-L, se ha creado un sitio de Hpal único entre los genes de M y L sobre el pGEM-GML . Son sintetizados dos cebadores (SEQ ID NOS : 47- 8) (5 ' GATGTGAAAAAAACTGTTAACACTTCTC3 ' y 51 AGAAGTGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3 ' ) y usados para la PCR usando ADN polimerasa pfu. La mutación es confirmada por análisis de ;secuencia, y el plásmido es designado como pGEM-GMHL. Entonces todo el gen P amplificado como se describió anteriormente es clonado en el sitio de Hpal del pGEM-GMHL . Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la orientación correcta. Entonces, se restablece la secuencia intergénica con los cebadores (SEQ ID NOS: 49-50) 5 ' GATGTGAAAAAAACTATTAACACCC3 ' y 5 ' GGTGTTAATAGTTTTTTTCACATCC3 ' . Después de la confirmación por análisis de secuencia, el plásmido con orientación correcta es designado como pGEM-GMPL. El fragmento de Xhol es cortado del pGEM-GMPL y clonado en el sitio de Xhol del pSAD-NG para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con los genes en el orden de N-G-M-P-L. Este plásmido es designado como pSAD-L16GMP. Para remezclar los genes en el orden de N-G-P-M-L, es creado un sitio de Hpal único entre los genes de G y M sobre el GEM-GML. Son sintetizados dos cebadores (SEQ ID NOS: 51-52) (5 'AGAAGAACAACTGTTAACACCACTG31 y 5 ' AGTGGTGTTAACAGTTGTTCTTCTG3 ' ) y usados para la PCR. La mutación es confirmada por análisis de secuencia, y el plásmido es designado como pGEM-GHML. Entonces todo el gen de P amplificado como se describió anteriormente es clonado en el sitio de Hpal del pGEM-GHML. Después de la confirmación por análisis de secuencia, es seleccionado el plásmido con la orientación correcta. Entonces la secuencia intergénica tiene (gue ser restablecida por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores (SEQ ID NOS: 53-54) : 51 GAAGAACAACTAAGAACACCACTG3 ' y 51 GTGGTGTTCTTAGTTGTTCTTCTG3 ' . Después de la confirmación por análisis de secuencia, el plásmido con la orientación correcta es designado como pGEM-GPML . El fragmento de Xhol es finalmente cortado del pGEM-GPML y clonado en el sitio de Xhol del pSAD-NG para crear la clona del virus de la rabia de longitud completa con los genes en el orden de N-G-P-M-L.

Este plásmido es designado como pSAD-L16GPM. Para seleccionar los virus de la rabia remezclados, esos plásmidos con genes remezclados son transfectados individualmente en células BSR T7/5, junto con pTIT-N, pTIT-P, y TIT-L, como se describió (Schnell et al., 2000) . Las células son reabastecidas con medio fresco y cultivadas durante otros tres días antes de que el sobrenadante sea transferido a células BSR f escas . Dos días después de la infección, el virus es detectado usando anticuerpos anti N del virus de la rabia conjugados con FITC. La tinción positiva de esas células indica el rescate exitoso del virus infeccioso. Esos virus son designados como L16G1N2G333, L16G1W3G333, L16G1N4G333, L16G PG333 , L16 GPG333, L16PGMG333, L16GPMG333 , y L16MPGG333 , respectivamente. El virus es propagado para su análisis adicional en células BHK o células BHK-M. Para analizar aún más esos virus remezclados, son determinadas curvas de crecimiento de esos virus infectando células BSR con cada uno de los virus a un moi de 1. Se incluyó al L16G333 para comparación. Después de 1 hora de adsorción, el inoculo del virus es removido y la células lavadas tres veces con PBS . A continuación se agregará medio fresco. Son removidas alícuotas del medio de cultivo a las 6, 12, 18, 24, 36, 60 y 72 hr p. i. y se usan para la titulación del virus como se describió (Wu et al., 2001). Este experimento es repetido tres veces y el título promedio de cada virus es usado como comparación. Para determinar si esos virus remezclados tienen una velocidad de reproducción viral reducida, son infectadas células BSR a una moi de 1 ffu/célula y cosechadas a 40 hr p. i. para el aislamiento del ARN total, usando el método descrito (Wu et al., 2001). El ARN genómico viral y los transcriptos en las preparaciones de ARN son analizadas por hibridación de manchas Northern usando sondas hechas de ADNc de N (Fu et al., 1991) y G (Fu et al., 1993). La cuantificación del ARN es efectuada por densometría o fosfoimágenes de las bandas de ARN. De manera alternativa, las células BSR infectadas con esos virus son marcadas metabólicamente con [3H] uridina (33 µ??/a??) durante 4 horas en presencia de actinomicina D (5 , como se describió para el VSV (Wertz et al., 1998) . Las células son entonces cosechadas para la extracción del ARN. El ARN es analizado por electroforesis sobre gel y cuantificado por densitometría . La relación molar entre los cinco transcriptos y el ARN genómico es determinada por densitometría y comparada entre esos virus . Son construidos y seleccionados virus de la rabia mutantes con el gen de G movido a la primera posición. Además, esos virus también contienen la mutación en la arginina 333 de G. El orden del gen en esos virus mutantes es confirmado por RT-PCR. Estudios de crecimiento de gen del virus muestran que el rendimiento del virus muestran que el rendimiento del virus es en el orden de L16G333, L16G1M2G333, L16G1N3G333 , y L16G1N4G333. De igual modo, la hibridación de manchas Northern y la marcación con [3H] uridina indica que la velocidad de reproducción viral (ARN genómico) es la más alta para L16G333, seguida por L16G1N2G333, L16G1N3G333, y L16G1N4G333. Además, la relación molar entre los cinco transcriptos virales es alterada, dependiendo de la posición relativa de los genes a lo largo del genoma viral . Para el L16G333, las cantidades de transcriptos están en el orden de N > P > M > G > L; L16G1N2G333,G > N > P > M > L; L16G1N3G333, G > P > N > M > L; y L16G1M4G333, G > P > M > N > L. Debido a que la mutación de G en la arginina 333 es incorporada en esos virus remezclados, esos virus no únicamente tienen una velocidad de reproducción reducida sino que también tienen una capacidad reducida para invadir al ;sistema nervioso. También se construyeron y seleccionaron virus de la rabia mutantes con los genes de P, M y G remezclados dentro del genoma del virus de la rabia. Además, esos virus remezclados también contienen la mutación de G en la arginina 333. El orden genético en esos virus mutantes es confirmado por RT-PCR. Si los resultados del VSV remezclados son una indicación (Ball et al., 1999), los estudios de curvas de crecimiento del virus demuestran que el rendimiento del virus para algunos de esos virus (L16MPGG333, L16MGPG333 , y L16PG G333) es mayor que el del L16G333. El rendimiento del virus para otros virus remezclados (L16GPMG333 y L16GMPG333) es menor que para el L16G333. De igual modo, la hibridación por manchado Northern y la marcación con [3H] uridina indica que la velocidad de reproducción viral (ADN genómico) se incrementó para L16MPGG333, L16MGPG333 , y L16PMGG333, mientras que la velocidad de reproducción viral (ARN genómico) disminuyó para L16GPMG333 y L16GMPG333 cuando se comparó con la de L16G333. Además, la relación molar entre los cinco transcriptos virales está alterada, dependiendo de la posición relativa de esos genes a lo largo del genoma viral. Para L16G333 , las cantidades de transcriptos están en el orden de N > P > M > G > L; L16MPGG333, N > M > P > G > L; L16 GPG333, M > M > G > P > L; L16PMGG333, N > P > > G > L; L16GPMG333, N > G > P > > L; y L16GMPG333 , N > G > M > P > ;L. Debido a que la mutación de G a arginina 333 es incorporada en esos virus remezclados, esos virus no únicamente tienen una velocidad de reproducción reducida sino que también tienen una capacidad reducida para invadir al sistema nervioso.

Determinación de la virulencia de esos virus de la rabia remezclados. Para determinar la virulencia de los virus remezclados, se seleccionaron ratones de dos grupos de edad (neonatos y ratones de 5 a 6 semanas de edad) . Existen 9 virus a ser probados, incluyendo L16G333, L16G1N2333, L16G1N3G333, L16G1N4G333, L16-PGMG333, L16-GPMG333, L16-GMPG333, L16-MGPG333, y L16-MPGG333. Se probaron tres dosis (105, 106 y 107 ffu) para cada virus. Son necesarios un total de 27 grupos de ratones ICR (diez en cada grupo) a la edad de 5 a 6 semanas de edad para este experimento. Se incluyó un grupo extra como control. Los animales son infectados con 10 µ? que contiene la dosis deseada de inoculación i.c. Para el grupo control, los ratones son inyectados con 10 µ? de solución salina por la ruta i.c. Los animales son observados dos veces al dia durante 20 días para detectar signos de rabia clínica como collarín de pelo, ataxia y parálisis. Los ratones moribundos y los ratones al final del experimento son sometidos a eutanasia por inhalación de C02. La tasa de mortalidad para cada uno de los grupos es registrada y 'analizada estadísticamente usando la prueba T de student o la prueba X2. Para probar la virulencia de esos virus en animales neonatos, es necesario un total de 27 carnadas de ratones ICR para este estudio. Cada carnada es infectada con cada dosis de un virus. Se incluyó una carnada extra como control. Los ratones neonatos al día 1 de edad son infectados con un volumen de 10 µ? que contiene las dosis deseadas de virus mutantes por inoculación i.c. Para el grupo control, los ratones neonatos son inyectados con 10 µ? con solución salina por la ruta i.c. Los animales son observados dos veces al día durante 20 días para determinar las carnadas muertas. Los ratones sobrevivientes al final del experimento son sometidos a eutanasia por inhalación con C02. La tasa de mortalidad para cada una de las carnadas se ha registrado y analizada estadísticamente usando la prueba T de student o la prueba X2. El L16G333 no indujo ninguna enfermedad en los animales de 5 a 6 semanas de edad. Sin embargo, puede inducir signos clínicos en neonatos. La infección por virus con G movida hacia al primera posición, es decir, L16G1N2G333, L16G1N3G333 y L16G1N4G333, no induce enfermedad en ratones de 5 a 6 semanas de edad, debido a que todos esos virus tienen la arginina 333 mutante a ácido glutámico. Ball et al. (Ball «et al., 1999) reportaron que la patogenicidad de VSV con P, M y G no se correlaciona con la velocidad de cultivo celular. Unicamente aquellos virus que son menos virulentos que L16G333 son probados adicionalmente para determinar su antigenicidad e inmunogenicidad . Determinación de la inmunogenicidad de esos virus de la rabia remezciados . Para determinar la inmunogenicidad de esos virus remezclados, se seleccionaron ratones adultos.

Existen 9 virus a ser probados incluyendo L16G333, L16G1N2G333, L16G1N4G333L, L16-PGMG333, L16-GPMG333, L16-GMPG333, L16-MGPG333 y L16-MPGG333. Se probaron tres dosis (105, 106 y 107 ffu) para cada virus y esto determinará la dosis mínima de un virus que puede estimular inmunidad protectora. Nuevamente se usaron tres rutas de inoculación, es decir i. m. , i. d. y s. c. Son necesarios un total de 81 grupos de ratones ICR (diez en cada grupo) para este experimento. Se incluyó un grupo extra como controles. Los animales son inmunizados con un volumen de 50 µ? que contiene el virus deseado a la dosis deseada por i.m., i.d., o s.c. Los ratones en el grupo control son dejados sin vacunar. Los ratones son sangrados para la medición de V A (Hable, 1996; Briggs et al., 1996) a la 1, 2, 3, y 4 semanas después de la inmunización. El desarrollo de VNA es comparado entre todos los grupos de ratones por análisis estadístico usando el análisis de varianza de dos días con interacciones (Litell et «al., 1996). A las cuatro semanas después de la inmunización, los ratones son desafiados i.m. en la pata trasera con 10 MIMLD50 (dosis letal i.m. para el 50% de los ratones) de virus CVS-24 como se describió (fu et al., 1991). Los animales son observados dos veces al día para el desarrollo de síntomas neurológicos y muertes durante 20 días. Los animales son observados dos veces al día y las tasas de mortalidad son registradas y analizadas estadísticamente para cada grupo de animales .

Todos los virus de la rabia mutante son capaces de inducir respuestas inmunes para esas rutas parenterales de inmunización. Ninguno de esos virus causa enfermedad en ratones adultos por ruta periférica de inmunización. Los ratones inmunizados con aquellos virus con G en la primera posición pueden desarrollar respuestas VIA más altas y más rápidas que los ratones inmunizados con L16G333 y aquellos virus remezclados con G en otras posiciones. Esto es muy importante para el tratamiento posexposición debido a que es necesaria una respuesta inmune rápida para neutralizar a los virus entrantes para evitar la infección del SNC. Los virus remezclados que inducen títulos de VNA comparables o más altos como el L16G333 y protegen al 100% de los animales inmunizados contra un desafío común de la rabia virulenta, aunque no inducirán ninguna enfermedad en animales neonatos por infección i.c. (véase más arriba), son , probados ,'adicionalmente como vacunas del virus de la rabia avirulentas dirigidas a especies animales como mapaches, perros, o aún humanos por diferentes rutas de inmunización. Los efectos sobre los mutantes de N de la mutación de la serina fosforilada (S) a alanina (A) , glicina (G) , ácido aspártico (D) , asparagina (N) , ácido glutámico (E) , y glutamina (Q) fueron investigados examinando la transcripción y reproducción viral en el minigenoma así como en el virus rescatado. Los resultados de esos estudios revelaron que la transcripción y reproducción virales se redujeron cuando N no está fosforilada y de este modo la fosforilación de N juega un papel importante en la modulación de la transcripción y reproducción del virus de la rabia. Además, esos resultados indican que los efectos de la fosforilación de N sobre la transcripción y reproducción viral se deben a combinaciones de la carga negativa de la porción fosfato y la estructura del residuo de serina. Aunque la invención ha sido descrita e ilustrada aquí con referencia a varios materiales, procedimientos y ejemplos específicos, deberá comprenderse que la invención no está restringida a las combinaciones de materiales particulares, y los procedimientos seleccionados para ese propósito. Pueden estar implicadas numerosas variaciones de esos detalles como será apreciado por aquellos expertos en la técnica. La siguiente es una lista de documentos relacionados con la descripción anterior y particularmente con los procedimientos y discusiones experimentales. Los documentos deberán ser considerados como incorporados como referencia en su totalidad. Aghomo, H. O., Oduye, O. 0., Rupprecht, C. E . 1990. The serologícal response of young dogs to the Flury LEP strain of rabies virus vaccine. Vet . Res. Commun. 4: 415-425. Anderson, M. C, Baer, H. , Frazier, D. J. , Quinnan, G . V. 1987. 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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un virus de la rabia mutante, caracterizado porque comprende una proteína de N de virus de la rabia, donde la proteína N no está fosforilada. 2. Un virus de la rabia mutante, caracterizado porque comprende una proteína N del virus de la rabia mutante, donde la proteína N comprende un aminoácido diferente a la serina en la posición 389. 3. El virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el aminoácido 389 es un aminoácido neutro. 4. El virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el aminoácido en la posición 389 es alanina, glicina, glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico o asparagina . 5. El virus de la rabia mutante de conformidad ;con la reivindicación 4, caracterizado porque el aminoácido en la posición 389 es alanina. 6. El virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína N del virus de la rabia mutante es codificada por la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63 o la SEQ ID NO: 64. 7. El virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína N del virus de la rabia mutante es codificada por la SEQ ID NO: 8. El virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además una glicoproteína G mutante. 9. El virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la glicoproteína G comprende un aminoácido diferente a la arginina en la posición 333. 10. El virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la glicoproteína G comprende una Glu en la posición 333. 11. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable . 12. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 2 y un portador farmacéuticamente aceptable . 13. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de confox-midad con la reivindicación 3 y un portador farmacéuticamente aceptable . 14. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 5 y un portador farmacéuticamen e aceptable . 15. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 6 y un portador farmacéuticamente aceptable . 16. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 7 y un portador farmacéuticamente aceptable . 17. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 8 y un portador farmacéuticamente aceptable . 18. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de conformidad ¦'con la reivindicación 9 y un portador farmacéuticamente aceptable . 19. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende al virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable. 20. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 11 efectiva para inducir la respuesta i mune. 21. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 12 efectiva para inducir la respuesta inmune. 22. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 13 efectiva para inducir la respuesta inmune . 23. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 14. efectiva •para inducir la respuesta inmune . 24. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 15 efectiva para inducir la respuesta inmune. 25. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 16 efectiva para inducir la respuesta inmune . 26. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 17 efectiva para inducir la respuesta i mune. 27. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 18 efectiva para inducir la respuesta inmune. 28. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de la rabia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 19- efectiva para inducir la respuesta inmune. 29. Un método para proteger a un mamífero contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 11 efectiva para proteger al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 30. Un método para proteger a un animal contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 12 efectiva para proteger al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 31. Un método para proteger a un mamífero contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 13 efectiva para " proteger al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 32. Un método para proteger a un mamífero contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 14 efectiva para proteger al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 33. Un método para proteger a un mamífero contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 15 efectiva para, proteger •al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 34. Un método para proteger a un mamífero contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 16 efectiva para proteger al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 35. Un método para proteger a un mamífero contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 17 efectiva para proteger al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 36. Un método para proteger a un mamífero contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 18 efectiva para proteger al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 37. Un método para proteger a un mamífero contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar al mamífero . una cantidad de la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 19 efectiva para proteger al mamífero contra la infección por el virus de la rabia. 38. Una célula hospedera para la producción del virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porqué comprende una célula hospedera de mamífero la cual produce una proteína N del irus de la rabia natural . 39. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de hámster. 40. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la célula hospedera es una célula BHK. 41. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la célula fue depositada con el número de depósito ATCC ???-3544. 42. Un método para producir un virus de la rabia mutante, caracterizado porque comprende hacer crecer el virus de la rabia mutante en la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 38. 43. Un vector para proporcionar el gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 1. 4 . Un vector para proporcionar el gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 2. 45. Un vector para proporcionar el gen a una Célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 3. 46. Un vector para proporcionar el gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 4. 47. Un vector para proporcionar el gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 5. 48. Un vector para proporcionar el gen a una célula de un humana o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 6. 49. Un vector para proporcionar el gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 7. 50. Un vector para proporcionar el gen a una •célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 8. 51. Un vector para proporcionar el gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia mutante de conformidad con la reivindicación 9. 52. Un vector para proporcionar el gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende el gen proporcionado a ser insertado de manera operable en el virus de la rabia imitante de conformidad con la reivindicación 10. 53. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 43. 54. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 44. 55. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 45. 56. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 46. 57. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 47. 58. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 48. 59. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 49. 60. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 50. 61. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 51. 62. Un método para proporcionar un gen a una célula de un humano o animal, caracterizado porque comprende administrar al humano o animal el vector de conformidad con la reivindicación 52.