JP2005510249A - 狂犬病に対するワクチン接種と中枢神経系における遺伝子治療のためのリン酸化部位において核蛋白質が変異した弱毒化狂犬病ウイルス - Google Patents

狂犬病に対するワクチン接種と中枢神経系における遺伝子治療のためのリン酸化部位において核蛋白質が変異した弱毒化狂犬病ウイルス Download PDF

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Abstract

ウイルスの一つまたはそれ以上のタンパク質のリン酸化部位において変異を含む変異体ウイルスが提供され、該変異はウイルスの弱毒化を引き起し、そしてそのために、それと共に改良されたワクチン組成物を提供することができる。本発明は該変異体ウイルスを含むワクチン組成物にも関し、それのみならず、免疫反応を引き起こす方法と狂犬病ウイルスによる感染から哺乳動物を防御する方法にも関する。本発明は変異体ウイルスと変異体ウイルスのタンパク質を作成する方法も含み、該方法は変異体ウイルスタンパク質の野生型の対応物を、生産あるいは過剰生産すら行う宿主細胞中で該変異体ウイルスを産生することを含み、他のウイルスタンパク質が変異体ウイルス微粒子の生成が最適化するように補足する。本発明はウイルス産生が最適化しているそれら宿主細胞も含み、それのみならず、該ウイルスタンパク質を、単独あるいは無傷ウイルスとの組み合わせてのいずれかにおいて含んでいるワクチン組成物、およびそれを使用して免疫反応を誘導する方法、または哺乳動物を感染から防御する方法も含む。本発明はヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達するのに適したベクターのみならず、それを送達する方法もまた含む。

Description

（関連出願に対する相互参照）
本出願は、2001年6月20に出願された米国仮出願番号60/311,354を基にした優先権を主張し、該出願は全ての目的において本出願中に導入されるものである。
（政府の支援）
本研究の一部は、国立アレルギー感染症疾患研究所から、公衆衛生事業支援金AI-33029(Z.F.F)を受けている。政府は本発明において一定の権利を有するものである。
（発明の分野）
本発明は、ヒトに加えて動物の感染症を予防及び治療するワクチン組成物及び方法の全般に関する。より特異的には本発明は変異体狂犬病ウイルスに関し、該ウイルスにおいてリン酸化が起こるアミノ酸において核蛋白質が変異している。本発明はまた、遺伝子をヒト又は動物に送達するためのベクターと、遺伝子をそれに送達するための方法に関する。
（関連分野の説明）
ラブドウイルス科のファミリーの中で、狂犬病ウイルスはリッサ・ウイルス属の代表例であり、水疱性口内炎ウイルス（VSV）はベシクロ・ウイルス属の代表例である（Wagner and Rose, 1996）。ゲノムRNAは核蛋白質（N）によってカプシドに包まれており、このN-RNA複合体は、リン酸化蛋白質（P,NSとも言われている）及びRNA依存性RNAポリメラーゼ（L）と共にRNP複合体を形成する。ラブドウイルスのN蛋白質は、mononegaviraleと同程度に他のメンバー由来のN蛋白質と同じく、デノボ合成されたウイルスRNAをカプシドで包むことにより、ウイルスのRNA転写と複製の制御に重大な役割を果たしている。狂犬病ウイルスNとVSV Nは核酸及び蛋白質の一次配列において高い相同性を有してはいないが、それらは保存された領域と類似した蛋白質特性を有している。例えば、狂犬病ウイルスのN蛋白質は、VSVと相同性を有する4つの保存アミノ酸鎖を有している（Tordo et al.,1986）。加えて、狂犬病ウイルスとVSVの両者においてN蛋白質の類似した螺旋状の構造が存在しており、N末端から続いて多くのタンパク質を通じているα-ヘリックスと、C末端へ向かうβ-ターンを有している（Barr et al., 1991）。
しかしながら、狂犬病ウイルスNとVSV Nの間には一つの大きな構造上の差が存在する。狂犬病ウイルスNはリン酸化されるが、一方、VSV Nはリン酸化されない（Sokol and Clark,1973）。リン酸化は狂犬病ウイルスにおいて389の位置のセリン残基に位置づけられている（Dietzschold et al.,1987）。過去に、狂犬病ウイルスNの脱リン酸化又は389番目のセリンのアラニンへ変異させると、ビトロ合成したリーダーRNAへの結合が増加する結果となることが示された（Yang et al.,1999）。更に、リン酸化されたセリンがアラニンに変異すると、狂犬病ウイルスミニゲノムRNAのウイルス転写と複製が低下する結果となる（Yang et al.,1999）。しかし、ミニゲノムシステムにおいては、ウイルスの転写と複製に必要とされるウイルス蛋白質はT7ポリメラーゼによって合成され、そしてそれらの合成は狂犬病ウイルスの制御装置の支配下にあるわけではない。
狂犬病は常に悲劇と謎の雰囲気を有している。その劇的な臨床的発現と、ほとんど常に致命的な転帰は、狂犬病の予防は高い重要性を有することを保証している。生物学的な研究は顕著に進行したが、狂犬病は未だに顕著な世界的な疾患のままである。毎年、70,000人以上のヒトが死亡者していると評価されており、他の無数のヒトが感染後の治療を必要としている（Meslin et al.,1994;Anonymous,1993）。ヒトは行き止まり宿主（dead-end host）であるが、この疾患は、野生動物のみならず家畜動物においても流行病又は地方病である（Fu,1997;Rupprecht et al.,1995;Smith et al.,1995）。イヌは、ヒト狂犬病の症例の多くが起きているアジア、アフリカ、及びラテンアメリカにおいては最も重要な感染源のままである（Fu,1997）。動物ワクチン接種によりイヌの狂犬病が制御されている国においては、ヒトの症例はかなり減少してきている（Smith et al.,1995）。しかし野生動物の狂犬病は、これらの国においてより困難な問題を引き起こす（Rupprecht et al.,1995; Smith et al.,1995）。キツネの狂犬病は、長い間ヨーロッパと北アメリカに固有であったが、経口でワクチン接種する近年の試みは、ヨーロッパの多くの地域で狂犬病を減少させ、又は撲滅することにさえ成功した（Brochier et al.,1991）。米国では過去１世紀において野生動物の狂犬病は、報告された狂犬病の症例（毎年7,000以上）の90％以上を数え（Rupprecht et al.,1995; Smith et al.,1995; Krebs et al., 2000a; Krebs et al., 2000b）、少なくとも5つの主要な野生動物狂犬病の感染源は家畜流行病共通病のままである（Smith et al.,1995）。東海岸に沿った全ての州において流行性のアライグマ狂犬病は引き続き発生しており、それはオハイオ州、ウエストバージニア州、アラバマ州まで至る西部まで広がっている（Krebs et al.,2000b）。スカンクの狂犬病は中央の州及びカリフォルニア州において流行が続いている（Krebs et al.,2000b）。キツネの狂犬
病はアリゾナ州、アラスカ州とテキサス州、およびアライグマの狂犬病が流行している東部の州においても散発的に発生している（Krebs et al.,2000b）。コウモリの狂犬病は48の隣接した州の間に広汎に広まっている（Krebs et al.,2000b）。野生動物の狂犬病がこのように流行していることはヒトの健康に脅威を与えるものである。そこで狂犬病を制御し、ヒトが狂犬病ウイルスに感染するのを防ぐにためには多層的な制御戦略を必要とし、そのような戦略としては、特に感染前又は感染後におけるヒトのワクチン接種、ペット動物の定期的なワクチン接種、そして野生動物のワクチン接種がある。
感染後のヒトへのワクチン接種は、パスツールが神経組織から作製した弱毒化した狂犬病ワクチンをジョゼフ・マイスターに注射した時代まで遡ることができる（Pasteur et al.,1996）。その時から、ヒト狂犬病ワクチンの改良が成功してきたが、特にウィスター研究所におけるコプロウスキーとその協力者らによるヒト2倍体培養細胞（HDCV）の開発は特に成功している（Wiktor et al.,1964）。組織培養ワクチンは、神経組織を含まないために古い脳ワクチンと比較して安全であるのみならず、より有効でもある。HDCVで免疫された人々は、接種後10日後という短期間で高い力価のウイルス中和抗体（VNA）を作り、それと比較して神経組織ワクチンで免疫した人々の中和抗体力価は免疫後30日まで防御レベルに達しない（Wiktor et al.,1964）。今日において、組織培養ワクチンの誘導体の多くはHDCVに類似したものであり、それら両者は有効であって良く許容されている。それらには精製したニワトリ胚細胞ワクチン（PCEC, Barth et al.,1984; Sehgal et al.,1993）、精製されたベロ細胞狂犬病ワクチン(PVRV, Suntharasamai et al.,1986)、及び精製したアヒル胚細胞ワクチン（PDRV, Khawplod et al.,1995）が含まれる。狂犬病である疑いのある動物、あるいは狂犬病である動物に噛まれた個体における典型的な感染後の治療は、上記の組織培養ワクチンの一つを即座に複数回注射することである。咬傷の性質や重篤度により、動物（通常はウマ）又は好ましくはヒト（ヒト狂犬病免疫グロブリン、又はHRIG）において作製された抗狂犬病抗血清を個体に与えることも推奨される（Anonymous, 2000）。頻度は少なく、且つ特殊な状況下であるが、動物管理官、獣医、ウイルスが存在する研究室に勤務している人など、明らかではない狂犬病感染の危険があると考えられる人は、感染前ワクチン接種として知られている狂犬病に対する免疫を受ける（Anonymous, 2000）。
組織培養ワクチンは安全且つ有効であるが問題がある。これらのワクチンは全て不活性化ウイルスから作製されているので、最適な免疫反応を得るためには長期間にわたる複数回投与が必要とされる（Anonymous, 2000）。全シリーズのワクチン接種を完了することができないと、病気の発症を引き起こす可能性がある（Shill et al.,1987; Lumbiganon et al., 1987; Anonumous, 1988）。細胞培養ワクチン中に含まれる蛋白質に対するアレルギー反応が、追加免疫注射を行ったワクチンのおよそ6%において発症する（CDC, 1984）。もちろん、最も深刻な副作用は、ウイルスを不活性化するのに使用したβ-プロピオラクトンによって変性したヒトアルブミンに対するものであることについては、いくつも証拠がある（Warrington et al., 1987; Swanson et al.,1987; Anderson et al.,1987）。更に、これらの組織培養ワクチンは価格が高いので、それが最も必要とされている発展途上国において有効に使用されることが困難である。感染後の治療は一つの症例につき、2,000から3,000ドル（米国における）を超えるであろう（Melter, 1996）。多くのヒト狂犬病の症例は発展途上国において発生するが、それらの国においてはこの金額を支払う余裕がない。そこで、発展途上国において狂犬病のために頻繁に用いられているワクチンは動物の神経組織由来のものであり、通常は家畜又は乳離れ前のマウス脳のいずれかにおいて作製されたものである（フエンザリダワクチン）（Fuenzalida, 1972）。通常、神経組織ワクチンの腹腔内投与を21回することが必要であるが、そのようなワクチンは神経疾患を引き起こすかもしれない（Trejos et al., 1974）。
米国公衆衛生獣医協会による動物狂犬病予防と制御の要項において推奨されているように、ペット（イヌとネコ）のワクチン接種が米国において行われている（Anonymous, 2000）。通常、ペット動物は6週齢で免疫接種を受け、使用したワクチンに応じて毎年又は三年毎に再びワクチン接種を受ける（Anonymous, 2000）。ペット用に認可された狂犬病ワクチンの多くは不活性化狂犬病ウイルスである。最近、狂犬病ウイルスGを発現している組み換えカナリア痘ウイルスがネコの免疫の目的で認可された（Anonymous, 2000）。これらのワクチンはイヌ及びネコに適切な防御を与えるが、そのワクチンは局所的な反応を引き起こす（Wilcock et al., 1986）。更に、生涯に渡って十分な免疫を維持するためには複数回の免疫化が必要とされる（Anonymous, 2000）。市販のワクチンで繰り返し免疫されたイヌは適切な力価を維持するとは限らないが、イヌの内で1/3のみがベースラインの1:5以上のウイルス中和抗体(VNA)の力価を示した（Tims et al., 2000）。加えて、3月齢以下の幼犬にワクチン接種しても、防御免疫を誘導することはできなかった。しかし、雌イヌから移植された母方（maternal）の抗体は、6週齢までに検出限界のレベル以下に低下した（Aghomo et al., 1990）。母方の抗体が減少する時から活性免疫となる時までの期間があり、その期間の間は幼い動物の防御が行われない（Mitmoonpitak et al., 1998; Clark et al., 1996）。
多くの国で野生動物の狂犬病が起きており、それは大きな公衆衛生の脅威を示すものである。過去2世紀の間のヨーロッパと北アメリカの両者における野生動物の狂犬病を制御しようとする努力は、経口のワクチン接種に向けられてきた（Baer, 1988）。当初、弱毒化狂犬病ウイルスであるストリート・アラバマ・ヂュフェリン（Street Alabama Dufferin : SAD） B19株が使用され、そしてこれはキツネに経口投与した時に狂犬病を引き起こさなかった（Baer, 1988）。ニワトリの頭を餌とした中にSADを入れたものを用いた、ヨーロッパにおいてアカギツネに免疫接種しようとする実地研究は、60％以上のキツネが狂犬病に免疫されるという結果となり、処理をしていない地域への疾患の蔓延が止められた（Wandeler et al., 1998; Schneider et al., 1988）。しかしSADはなお、ゲッシ類（Winkler et al., 1976）と家畜（Esh et al., 1982）において病気を引き起こす。引き続き、狂犬病ウイルスG（VRG）を発現している組み換えワクチニアウイルスが開発され（Kieny et al., 1984）、実験室の条件下においてアライグマとキツネの有効な経口免疫原であることが見出された（Rupprecht et al., 1986; Blancou et al., 1986）。魚粉の餌の中にVRGを入れた試験が野生動物において更に行われ、VRGが安全であることが示された（Brochier et al., 1989; Rupprecht et al., 1993）。標的及び非標的動物種において、ワクチンに伴う疾患率又は死亡率、また肉眼的病変又は有害な副作用のいずれも、ワクチン接種に伴って発生することはなかった。ワクチンは防御免疫を誘導するにも有効であり、VRGを実地投与すると、ヨーロッパのワクチン接種された地域においてキツネの狂犬病が広範囲で絶滅するという結果となった（Brochier et al., 1991）。米国においてVRGを同様に投与すると、テキサス州で蔓延していたコヨーテの狂犬病（Fearneyhough et al., 1998）と他の州で蔓延していたアライグマの狂犬病（Hanlon et al., 1998; Ro
bbins et al., 1998; Rascoe et al., 1998）が遮断されるという結果となった。VRGはワクチンを接種した動物において安全であり、且つ標的の動物種において免疫を刺激するのに有効であるが、妊娠している婦人に関する最近の出来事により、野生動物においても、その様な組み換えワクチンの使用することの危険であること、特に人口密度の高い地域においては危険であることが明らかとなった（Rupprecht et al., 2001）。その婦人は、彼女のイヌの口からVRG組み換えウイルスを有する餌を取り去ろうとした時に指と前腕を噛まれた。10日以内に彼女は、前腕の噛まれた部位における2箇所の壊死損傷の付近に、激しい局所の炎症反応と腺炎を起こした。彼女は全般的な紅皮症を発症したが、剥離が起こった後に最終的には治まった（Rupprecht et al., 2001）。この出来事は野生動物の狂犬病ワクチンとしてVRGを将来において使用することに疑義を生じさせる役割を果たした。
ヒト及び他の動物において現在使用されているワクチンは安全性、有効性、価格において問題があることは明らかである。より有効性が高く、安全で、且つ安価なワクチンが、動物において狂犬病を制御し、ヒトの狂犬病を防御するために必要とされている。DNAワクチンと他の組み換えワクチンを含めて、多くの新規なワクチンの開発と試験が行われている。狂犬病ウイルスGを発現しているDNAベクターは、Tヘルパー細胞と狂犬病ウイルスVNAの産生の両者を刺激することが見出された（Xiang et al., 1994）。更に、これらのDNAベクターでネズミを免疫すると、引き続いて行った致死的な狂犬病ウイルスによる感染からネズミとサルを防御した（Xiang et al., 1994., Ray et al., 1997; Lodmell et al., 1998）。しかし、DNAワクチンによる免疫反応の誘導は通常は長くかかり、免疫反応の大きさは通常のワクチンと比較して低い（Xiang et al., 1994; Osorio et al., 1999）。狂犬病ウイルスGを発現している組み換えヒトアデノウイルスもまた開発された（Prevec et al., 1999; Xiang et al., 1994）。組み換えアデノウイルスワクチンはウイルス中和抗体（VNA）を誘導し、ワクチン接種を受けた動物（マウス、イヌ、スカンク、及びキツネ）を感染の危険から防御することが可能である（Tims et al., 2000; Prevec et al., 1990; Xiang et al., 1996; Charlton et al., 1992; Wang et al., 1997）。アデノウイルスのベクターは、アデノウイルスの蛋白質に対する免疫反応の懸念がある（Wang et al., 1997）。既存の抗アデノウイルス免疫は標的とする遺伝子の発現に必要な細胞によるワクチンの取り込みを防ぐ可能性があり、それで、標的抗原に対する活性免疫反応を損なう。更に、異なった標的抗原を発現しているアデノウイルスベクターによる再ワクチン接種又はワクチン接種は、もう有効ではないかもしれない。
生きた弱毒化ウイルスのワクチンは、長期間に渡るホルモン性及び細胞仲介性の免疫を引き起こすことにおいてより有効であり、多くの疾患は生きた改変ウイルスワクチンを用いることによって制御され、あるいは全滅することが長く知られている。痘瘡の地球的な全滅は、本質的には活性の弱い牛痘ウイルスワクチンを使用することによって達成された（Henderson, 1980）。灰白髄炎は、生ポリオワクチンによるワクチン接種が広汎に広まったために、地球的に全滅する寸前である（Sabin et al., 1973）。2〜3例を挙げると、麻疹、おたふく風邪及び風疹などの他の多くのウイルス疾患は、生の改変ウイルスワクチンにより制御が行われた（Arvin, 2000）。そこで、生の改変狂犬病ウイルスワクチンは、中期間に渡って続く免疫を与え、且つ必要とされる用量が減少することにより、現在認可されているワクチンよりも利点を有するかもしれない。結果として、価格は大きく低下するであろう。しかし、そのような生改変狂犬病ワクチンは、特にヒトに対して、完全に無毒でなければならない。このために、1980年代において野生動物のワクチン接種の目的で最初に用いられた狂犬病ウイルスのSAD株を（Baer, 1988; Wandeler et al., 1998; Schneider et al., 1988）、中和モノクローナル抗体（Mab）を用いて引き続き選抜することにより更に弱毒化し、SAG1とSAG2株が選抜されるという結果となった（Le Blois et al., 1990; Flamand et al., 1993; Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994）。モノクローナル抗体を使用したSAG1とSAG2の選抜は、333番目のアルギニンにおける糖タンパク質の変異は、狂犬病ウイルスの毒性を低下させたという過去の知見に基づいている（Dietzschold et al., 1983; Seif et al., 1985）。SAG1ウイルスは333番目の位置に一つの変異を有しており、アルギニンがリジンにより置換されている（Lafay et al., 1994）。SAD株は成熟したネズミの脳内投与（i.c,）経路の接種においてなお病原性を有しているが、該SAD株と比較して、成熟したネズミに脳内投与（i.c,）により、筋肉内投与（i.m.）により、そして経口投与（os）により与えた時にSAG1ウイルスは無毒である（Le Blois et al., 1990; Lafay et al., 1994）。経口の経路でキツネにワクチンを接種するにあたり、SAG1ウイルスはSADと同じ程度に効果がある（Le Blois et al., 1990）。無毒のウイルスを安定化させるために、更にモノクローナル抗体を用いてSAG2ウイルスを選抜した（Lafay et al., 1994）。SAG2は333番目の位置に二重変異部位を有し、その変異はアルギニン（AGA）からグルタミン酸（GAA）に変化すると、ウイルスが有毒な野生型（wt）に変換する可能性が更に低下する（Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994）。SAG2ウイルスは成熟したゲッシ類、キツネ、ネコ、及びイヌに対して、どのような経路で接種しても無毒である（Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994）。キツネとイヌの経口的なワクチン接種は、狂犬病ウイルスの致死的な感染に対して防御するという結果となる。キツネとイヌをSAG2で免疫するという現地調査により、それの安全性と免疫原性が示された（Masson et al., 1996）。しかし、SAG2を乳離れしていない動物に脳内投与（i.c,）すると狂犬病を引き起こすことができるので（Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994）、幼弱動物又は免疫不全動物はウイルスに感染して疾患を発症するかもしれないという可能性がある。
Gのアルギニン333が変化したこれらの選抜された変異株ウイルスは細胞培養において良く複製し、それはこれらのウイルスの複製速度は影響されないということを示唆している（Lafay et al., 1994）。しかし、それらのウイルスが神経系に侵入する能力に関する検討を行ったところ、そのウイルスは一次ニューロンには侵入できるが、二次又は三次ニューロンに広まることはできないことが示された。それは、これらの変異ウイルスは神経接合部を介して神経系中に広まる能力が低下していることを示している（Coulon et al., 1989）。成熟した中枢神経系（CNS）においてシナプス伝播はウイルスが広まる主要な経路である（Gosztonyi et al., 1993）。新生児の動物において、シナプス伝播はウイルスが広まる唯一の経路ではないかもしれない。なぜなら、ミエリンの発達は新生児の動物において完成されてなく、狂犬病ウイルスは新生児の動物において、感染したニューロンから発芽して他の非感染ニューロンに感染することにより、狂犬病ウイルスは感染したニューロンから感染していないニューロンへ伝播するかもしれず、多かれ少なかれこれは細胞培養における場合と同様である（Dietzschold et al., 1985）。そこで、ウイルス複製の速度を低下させることが、無毒の狂犬病ウイルスワクチンを開発するにあたり必要とされるかもしれない。他の一本鎖の分節していないRNAウイルスと同様に、狂犬病ウイルスの転写と複製は、リボ核蛋白質複合体(RNP)中の成分間の複雑な相互作用によって制御されている。RNPは、リン蛋白質（P）、及びRNA依存性RNAポリメラーゼ（L）に加えて、核蛋白質（N）によりカプシド化されたゲノムRNAから成る（Wunter, 1991）。理論的には、これらのウイルス蛋白質の変異は、狂犬病ウイルスの複製速度が低下するという結果となる。マイナス鎖RNAウイルスについての逆転写遺伝学技術が近年進歩したことに伴い（Enami et al., 1990; Pattnaik et al., 1990; Pattnaik et al., 1991; Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994）、この群のウイルスゲノムを操作することが可能となってきた（Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994； Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995）。この技術を適用することにより、この群のウイルスがいかに転写と複製を制御するか、（Enami et al., 1990; Pattnaik et al., 1990; Pattnaik et al., 1991; Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994； Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995）、複製サイクル（Pattnaik et al., 1990）と病原性（Etessami et al., 2000）においていかに各々のウイルス蛋白質が機能するか、より良く理解できるようになってきた。この技術を応用することはこれらのウイルスを弱毒化する結果ともなり、それらの中のいくつかはワクチン（Wertz et al., 1998）又は遺伝子治療のためのベクター（Finke et al., 1997）として開発されるかもしれない。
Nはウイルスゲノムから転写される最初の産物であり、全てのマイナス鎖RNAウイルスについて感染した細胞で広汎に発現している（Wunner, 1991）。発生期のゲノムRNAをカプシド化することにより、RNA転写から複製への転移においてNは重要な役割を果たすと言われている（Wunner, 1991）。Nの変異は潜在的に表現型の弱毒化に至るかもしれない。実際に、核蛋白質（N）をウイルスゲノムの他の位置に移動することは、水疱性口内炎ウイルス（VSV）を弱毒化する結果となった（Wertz et al., 1998）。これは、N蛋白質の発現の低下によるウイルス複製の阻害によってもたらされた。近年、我々はNのリン酸化部位が変化した変異体狂犬病ウイルスを構築したところ、ウイルス複製の速度が5倍以下に低下し、且つウイルスの生成が10,000倍以下に低下することを見出したが、これは変異体ウイルスが弱毒化していることを示唆している（Wu et al., 2002）。
狂犬病は未だに公衆衛生に対して脅威を与えており、毎年70,000人以上のヒトの死を引き起こしている。ヒトの感染の多くは、狂犬病の家畜又は野生動物に咬まれることによることによる。そこで家畜又は野生動物においてウイルス感染を制御すると、これらの動物の死亡率を低下させるのみならず、ヒトが感染することの危険性が低下する。狂犬病であるか又は狂犬病の疑いのある動物に咬まれた人々を感染後に免疫するのと同様に、常に危険に曝されている人々に感染前のワクチン接種を行うことは、ヒトの狂犬病を更に防ぐものである。過去数年間において、狂犬病ウイルス糖蛋白質（VRG）を発現している組み換えワクチニアウイルスが、野生動物における狂犬病を制御する目的で使用されてきた。不活性化された狂犬病ウイルスワクチンもまた、特にペットなどの家畜を免疫するのに使用されている。精製され、不活性化された狂犬病ウイルスワクチンが、感染前又は感染後の状況にあるヒトのために使用されている。これらのワクチンは有効であるが、ペットの免疫を適切に保つために、毎年ワクチン接種することが必要とされる。ヒトにおいて、最適の免疫反応を刺激するためには、不活性化された組織培養ワクチンを複数回投与することが必要とされる。更に現在の組織培養ワクチンは高価であり、そのために、ワクチン接種を必要とする多くの人々（発展途上国における）はそれを入手できない。そこで、より有効性が高く、価格が手頃な狂犬病ワクチンを開発する必要性がある。
そこで、ヒトと動物に狂犬病ウイルスに対してのワクチン接種における、上記において述べた先行技術の方法の欠陥を鑑みると、そのための、安全であって且つ価格が安い方法がこの分野において未だに求められていることは明らかである。
（発明の概要）
本発明により変異体ウイルスが提供され、該変異体ウイルスの一又はそれ以上蛋白質においてリン酸化部位に変異を含み、該変異はウイルスの弱毒化を引き起し、そしてそのためにそれは、それと共に改善されたワクチン組成物を提供するものである。
特に本発明により変異体ウイルスが提供され、該ウイルスは389番目の位置にセリン以外のアミノ酸を有する変異体狂犬病ウイルスN蛋白質を含んでいる。加えて該変異体ウイルスは、N蛋白質又は他のウイルス蛋白質（例えばG糖蛋白質中に）の中に一つ又はそれ以上の変異を含むこともある。
本発明は更に、該変異体ウイルスを含むワクチン組成物のみならず、免疫反応を誘導する方法、及び哺乳動物を狂犬病の感染から防御する方法にも関連する。
また本発明は、該変異体ウイルス及び該変異体ウイルス蛋白質を作製する方法も含むものであり、該方法は、変異体ウイルス蛋白質の野生型対応物の生産又は過剰生産さえも行う宿主細胞において変異体ウイルスを生産することを含み、該変異体ウイルス微粒子が最適化されるように他のウイルス蛋白質を補足する。本発明はウイルス産生が最適化されたそれらの宿主細胞もまた含む。
本発明には変異体ウイルス蛋白質をコードする核酸、及びウイルス核酸配列の一部又は全部をコードする核酸もまた含まれる。加えて本発明は、該核酸配列を含む（発現ベクターを含む）ベクター、及び該核酸配列によって形質転換した宿主細胞を含む。
本発明は変異した核酸によってコードされたウイルス蛋白質、該ウイルス蛋白質を単独又は無傷ウイルスと組み合わせて含むワクチン組成物、及びそれを用いて免疫反応を誘導する方法あるいは哺乳動物を感染から防御する方法も含む。
本発明は無傷変異体ウイルスと該変異体ウイルス蛋白質に対する抗体と、それを作製及び使用する方法も含む。
また本発明には、遺伝子をヒト又は動物の細胞に送達するのに適したベクターのみならず、それを送達する方法も含まれる。
（発明の詳細な説明）
本発明は、動物のみならずヒトに使用する有効且つ価格が手頃なウイルスワクチン、それを作製する方法、免疫反応、好ましくは動物及びヒトにおける防御免疫を誘導するためにそれを使用する方法に関する。適したウイルスには、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、エボラウイスル及びインフルエンザウイルス、センダイウイルス、及びウシRSVが含まれるが、それらに限定されるものではない。
特に本発明は、N核蛋白質上のリン酸化が破壊された変異体ウイルスを含む、無毒の生ウイルスワクチンに関する。適したウイルスには、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、エボラウイスル及びインフルエンザウイルスが含まれるがそれらに限定されるものではなく、それら全てはN蛋白質上でリン酸化される。リン酸化は任意の適した手段で破壊されており、そのような手段には挿入、欠失又は好ましくは置換によってリン酸化部位を変化させることを含む。加えて、N蛋白質の他の部位におけるコンセンサス配列の様な、N蛋白質の他の部位における変化によりリン酸化が破壊されることもある。好ましくは、N蛋白質は389番目の位置にセリン以外のアミノ酸を有しており、該アミノ酸は好ましくは中性アミノ酸、より好ましくはアラニンである。好ましくは、該変異体狂犬病ウイルスは図８の配列の一つによりコードされ、変異体狂犬病ウイルスN蛋白質は図９の配列の一つによりコードされ、及び／又は変異体狂犬病ウイルスG蛋白質は図１０の配列の一つによりコードされている。
N蛋白質を変異させることにより、N蛋白質のRNAへの結合、リン酸分子への結合、又はそれ自身への結合に影響を及ぼすことができる。N核蛋白質の結合性をこのように調節することは、複製のようなウイルスの不可欠な機能に影響を及ぼす。
好ましい態様において、本発明は変異体ウイルスを含む無毒の生の狂犬病ワクチンに関するものであり、該変異体ウイルスにおいて、挿入、欠失、置換、又は他の適切な手段の何れかにより、N核蛋白質上におけるリン酸化は破壊されている。好ましくは該ウイルスにおいて、ウイルス複製の速度が低下している（核蛋白質Nを変異させるか、又は狂犬病ウイルスゲノム中において遺伝子を入れ替えることによる）。好ましい態様においては、N核蛋白質の389番目の位置にあるセリンはアラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンによって置換されている。
好ましい態様において、該ウイルスは（糖蛋白質Gの変異により）好ましくは糖蛋白質Gの333番目の位置における変異により神経系において伝播する能力も低下している。
該変異体ウイルスは、好ましくはN蛋白質とG蛋白質のいずれか又は両方において、好ましくは一つ以上の変化を有し、その変異によって野生型（wt）の表現型へ回帰する機会が低下する。
リン酸化部位が保存されている如何なる狂犬病ウイルス株も使用可能である。全ての現在既知である狂犬病ウイルスにおいて、N蛋白質上のリン酸化部位は保存されている。
加えて、体内内における指向性を方向づけるために、本発明の変異体ウイルスは他の型のウイルスのG糖蛋白質を含むことがある。そこで本発明のウイルスは、投与されたヒト又は動物に治療用又は免疫原性の蛋白質を投与することにより、遺伝子治療においても同様に有効である。
特に、狂犬病ウイルスG糖蛋白質は中枢神経系（CNS）細胞への指向性を誘起し、そしてそのために中枢神経系の疾患の治療に適しており、そのような疾患には、それに限定されるものではないが、神経芽細胞腫を含む癌、及び、それに限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病のような神経変性疾患がある。同様にヒト免疫不全ウイルス（HIV）G蛋白質はT細胞に対する指向性を引き起こすために、そこに遺伝子を伝達することによってT細胞を介した疾患の治療を行うのに適しており、そのような疾患には種々の癌、及びHIVを含むT細胞に影響する疾患が含まれる。
水疱性口内炎ウイルス（VSV）のG糖蛋白質は汎親和性であるために、種々の型の細胞に投与する目的で使用される。RSVのG糖蛋白質は上皮への指向性を誘起するために、肺に指向してその疾患の治療に適しており、それに限定されるものではないが、そのような疾患には嚢胞性線維症が含まれる。
本発明は免疫反応、好ましくはヒト又は動物において防御免疫反応を引き起こすために、該変異体ウイルスを使用する方法にも関する。
本発明には、変異体ウイルスを作製するための宿主細胞のみならず、それを作製する方法もまた含まれる。該宿主細胞は好ましくは野生型狂犬病ウイルスのN蛋白質を作製する哺乳動物宿主細胞であり、好ましくはハムスター細胞、より好ましくはBHK細胞、そして最も好ましくは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 ブルーバード大学、マナッサス、VA 20110-2209, USAに寄託番号ATCC PTA-3544として2001年6月20日に寄託されたものである。
G及びNの両者における変異又はこれらの遺伝子の移動はウイルスを弱毒化させ、どの様な年齢であっても、どのような感染経路においても、もはや動物に疾患を引き起こすことができないが、それでもなお、有毒な狂犬病の感染に対して防御する免疫反応を引き起こすことができる。これは以下の事を示す最近の研究に基づいている。1)Nの389番目のリン酸化されたセリンをアラニンに変異させると、ウイルス複製の速度が5倍以下に、ウイルスの生成が10,000倍以下に低下した。2)Gを333番目の残基において変異させると狂犬病ウイルスの毒性と病原性が劇的に低下した。3)関連したウイルスにおいて遺伝子の入れ替えを行うと水疱性口内炎ウイルス（VSV）は弱毒化し、その免疫反応は促進するという結果となった。GとNの両者において変異を有するか、あるいは遺伝子の入れ替えが行われた狂犬病ウイルスは、現在入手できる弱毒化狂犬病ウイルスより更に弱毒化している（それでも新生児の動物において狂犬病を引き起こす）。更に減弱された狂犬病ウイルスが、実験動物においてどの年齢でもどの接種経路でも疾患を引き起こすことがなく、なお免疫原性を有していたら、ヒトと動物のための改変された生狂犬病ウイルスワクチンとして開発することができる。
代わりに本発明のワクチンは、無傷ウイルスの非存在下で単離された変異体N蛋白質を含むことがある。なぜならば、Nリン酸化変異体の凝集の程度は、その対応する野生型よりも大きく、野生型のNを含んでいる組成物と比較してアジュバント効果が増加する可能性があるからである。
本発明のワクチン組成物は、B型肝炎表面抗原（HbsAg）又は狂犬病ウイルスG蛋白質を含むアジュバントを含んでよいが、それに限定されるものではない。該ワクチンは、ハンクス塩基性塩溶液（HBSS）又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む薬学的に許容可能な担体又はベヒクルを用いて調製されても良い。該ワクチン組成物は、好ましい経路である皮内、筋肉内、皮下のみならず、経口、経皮（表皮塗布）又は経鼻を含む、任意の既知の経路で投与することが可能である。
本発明によると、当業者の技術範囲内における従来の分子生物学、微生物学、免疫学、及び組み換えDNA技術を採用することができる。その様な技術は文献において充分に説明されている。例えば、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”(3rd edition, 2001); “Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III, [Ausubel, R. M., ed. (1999及び隔月毎に更新)]; “Cell Biology: A Laboratory Handbook” Volumes I-III, [J.E.Celis,ed.(1994)]; “Current Protocols in Immunology” Volumes I-IV [Coligan,J.E.,ed.(1999及び隔月毎に更新)]; “Oligonucleotide Synthesis” (M.J.Gait ed. 1984); “Nucleic acid Hybridization” [B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]; “Transcription And Translation” [B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)]; "Culture of Animal Cells, 4th edition" [R.I.Freshney, ed. (2000)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1988); Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No.1, Harlow, Ed and Lane, David (Cold Spring Harbor Press, 1998); Using Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow, Ed and Lane, David (Cold Spring Harbor Press,
1999)を見よ。
そこで、この中で登場する際に以下の用語は下記において述べる定義を有するものである。
「レプリコン」はインビボにおけるDNA複製の自律的な単位として機能する任意の遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）であり、即ちそれ自体の制御下で複製することが可能である。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ又はコスミドのようなレプリコンであり、付加された断片を複製させるために他のDNA断片をそれに付加することができる。
「DNA分子」は多量体型のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）を言うものであり、一本鎖、又は二本鎖のいずれの形態であってもよい。この用語は該分子の一次又は二次構造のみに言及するものであり、何らかの特定の三次構造に限定されるものではない。そこでこの用語は見出された二本鎖DNA、とりわけ直線DNA分子（例えば制限断片）、ウイルス、プラスミド、及び染色体を含むものである。特定の二本鎖DNA分子の構造を議論するにあたり、この中で述べる配列は5’から3’の方向で、転写されないDNA鎖までの間の配列のみ（即ちmRNAと相同な配列を有する鎖）を与える、という通常の慣例に従って記載する。
「複製の起点」とはDNA合成に寄与するDNA配列を言う。
DNAの「コード配列」とは、適切な制御配列の制御下でインビボでポリペプチドに転写及び翻訳される二本鎖DNA配列である。コード配列の境界は5’（アミノ）末端における開始コドンと、3’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物の配列、真核生物mRNA由来のcDNA、真核生物（例えば哺乳動物）DNA由来のゲノムDNA、及び合成したDNA配列すら含むものである。ポリアデニル化シグナル及び転写終止配列は通常コード配列の3’に位置するであろう。
転写及び翻訳制御配列は、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、終止因子などのDNA制御配列であり、宿主細胞中においてコード配列を発現させるものである。
「プロモーター配列」は細胞内においてRNAポリメラーゼと結合し、下流（3’方向）のコード配列の転写を開始することが可能なDNA制御領域である。本発明を規定する目的で、該プロモーター配列は転写開始部位におけるその3’末端に結合し、上流（5’方向）に伸長し、バックグラウンド以上の検出可能なレベルの転写を開始するのに必要とされる最小数の塩基又は因子を含む。プロモーター配列中においては、転写開始部位（通常はヌクレアーゼS1によるマッピングによって規定される）のみならず、RNAポリメラーゼの結合を担っている蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）も見出されるであろう。真核動物のプロモーターは、常にではないが、しばしば「TATA」ボックスと「CAT」ボックスを含む。原核動物のプロモーターは、-10と-35のコンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガルノ配列を含む。
「発現制御配列」は他のDNA配列の転写及び翻訳の支配と制御を行うDNA配列である。DNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写する時に、細胞中において、該コード配列は転写及び翻訳制御配列の「支配下」にあり、その後に該コード配列によってコードされる蛋白質へと翻訳される。
コード配列の前に「シグナル配列」を含むことができる。この配列はポリペプチドのN末端のシグナルペプチドをコードし、該配列は宿主細胞と連絡し、該ポリペプチドを細胞表面に向かわせ、あるいは該ポリペプチドを培地中に分泌させ、そして該シグナルペプチドは蛋白質が細胞を離れる前に宿主細胞によって除去される。シグナル配列は原核細胞及び真核細胞が産生する種々の蛋白質と連結していることが見出される。
この中で本発明のプローブに言及する際に使用されている「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つ又はそれ以上、好ましくは3つ以上のリボヌクレオチドから成る分子である定義されている。その正確な大きさは多くの因子に依存し、言い換えると、該ポリヌクレオチドの根本的な機能と使用方法に依存している。
この中で「プライマー」という用語は、精製された制限消化物の中にある天然由来のものであるか、合成により作製されたものであるかのいずれにせよ、オリゴヌクレオチドのことであり、プライマー伸長産物を合成する条件下に置かれた時に合成開始点として作用することが可能であり、該プライマー伸長産物は核酸の鎖に対して相補的であって、ヌクレオチドとDNAポリメラーゼのような誘導剤の存在下で、適切な温度とpHで誘導される。プライマーは一本鎖又は二本鎖のいずれであっても良く、誘導剤の存在下で望みの伸長産物の合成をプライムするのに充分な程長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの由来及び使用方法を含む多くの因子に依存するであろう。例えば、診断目的の場合には、標的配列の複雑さにも依るが、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には15-25個又はそれ以上のヌクレオチドを含む。しかし、含まれるヌクレオチドの数はもっと少なくても良い。
ここにおけるプライマーは、特定の標的DNA配列の異なった鎖に対して「実質的に」相補的である。これは、プライマーが、それらの各々の鎖とハイブリブリダイズするのに十分な程に相補的でなければならないことを意味している。そこで、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、残りのプライマー配列を鎖に相補的にした上で、非相補的なヌクレオチド断片をプライマーの5’末端に付加してもよい。代わりに、非相補的な塩基あるいはより長い配列をプライマー内に散在させても良いが、但し、そのプライマー配列はその鎖と十分な相補性を有することによりそれとハイブリダイズし、それによって伸長産物の合成のための鋳型を形成する。
この中において、「制限エンドヌクレアーゼ」と「制限酵素」という用語は細菌酵素を言うものであり、各制限酵素は、特定のヌクレオチド配列あるいはその近傍において二本鎖DNAを切断する。
外来性あるいは異種性のDNAが細胞内に導入されることにより、細胞はそのようなDNAによって「形質転換」される。形質転換するDNAは細胞のゲノムを構成する染色体DNAと結合（共有結合）しているか、あるいは結合していなくてもよい。例えば原核細胞、酵母、及び哺乳動物細胞において、形質転換するDNAは、プラスミドのようなエピソーマルな因子上に維持されても良い。真核細胞において、安定的に形質転換した細胞は該細胞中において形質転換するDNAが染色体と結合するようになったものであり、それによって染色体複製を介して娘細胞に遺伝する。この安定性は、真核細胞が、形質転換するDNAを含む娘細胞の集団から成る細胞系列又はクローンを確立する能力によって示される。「クローン」は、有糸分裂によって一つの細胞又は共通した祖先からもたらされた細胞集団である。「細胞株」は多くの世代にわたってインビトロで安定に成長することができる、初代細胞のクローンである。
2つのDNA配列は、該DNA配列の規定された長さにおいて、ヌクレオチドのおよそ75％（好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは90％または95％）が適合する時には、「実質的に相同」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて入手できる標準的なソフトウェアを使用して比較することにより、又は、例えば、その特定の系のために規定されたストリンジェントな条件の下におけるサザンハイブリダイゼーション実験において決定することができる。適切なイブリダイゼーション条件を決定することは当業者の能力の範囲内である。例えば、Martin et al.,上記; DNA Cloning, Vols. I & II, 上記; Nucleic Acid Hybridization,上記、を見よ。
本技術分野において、各々の特定のアミノ酸をコードするのに下記のコドンを相互的に使用できることは良く知られている。
フェニルアラニン（Phe又はF） UUU又はUUC
ロイシン（Leu又はL） UUA又はUUG又はCUU又はCUC又はCUA又はCUG
イソロイシン（Ile又はI） AUU又はAUC又はAUA
メチオニン（Met又はM） AUG
バリン（Val又はV） GUU又はGUC又はGUA又はGUG
セリン（Ser又はS） UCU又はUCC又はCUA又はUCG又はAGU又はAGC
プロリン（Pro又はP） CCU又はCCC又はCCA又はCCG
スレオニン（Thr又はT） ACU又はACC又はACA又はACG
アラニン（Ala又はA） GCU又はGCG又はGCA又はGCG
チロシン（Tyr又はT） UAU又はUAC
ヒスチジン（His又はH） CAU又はCAC
グルタミン（Gln又はQ） CAA又はCAG
アスパラギン（Asn又はN） AAU又はAAC
リジン（Lys又はK） AAA又はAAG
アスパラギン酸（Asp又はD） GAU又はGAC
グルタミン酸（Glu又はE） GAA又はGAG
システイン（Cys又はC） UGU又はUGC
アルギニン（Arg又はR） CGU又はCGC又はCGA又はCGG又はAGA又はAGG
グリシン（Gly又はG） GGU又はGGC又はGGA又はGGG
トリプトファン（Trp又はW） UGG
終止コドン UAA（オーカー）又はUAG（アンバー）又はUGA（オパール）
上記において特定されたコドンは、RNA配列におけるものであることを理解されたい。DNAにおける対応コドンは、Uの代わりにTを有する。
特定のコドンを異なったアミノ酸をコードするコドンに変えるのと同様に、種々のウイルス蛋白質において変異を作製することができる。そのような変異は、可能な限り最小数のヌクレオチドを変えることにより、容易に行うことができるかもしれない。この種の置換変異を、結果として生じる蛋白質が非保存的であるように（即ち、コドンを変化させることにより、特定の大きさあるいは特性を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸から、他の群に属するアミノ酸にする）、あるいは保存的であるように（即ち、コドンを変化させることにより、特定の大きさあるいは特性を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸からコドンを変化させて、同じ群に属するアミノ酸にすること）行うことができる。そのような保存的な変化は一般的に、得られた蛋白質における構造と機能の変化が少ない。非保存的な変化は得られた蛋白質において、例えばN核蛋白質上におけるリン酸化の欠損がもたらされるなど、構造、活性又は機能の変化をもたらす事が多い。いくつかの場合においては、野生型の表現型へ復帰する可能性を減らすために、ウイルス蛋白質において一つあるいはそれ以上の変化をもたらすことが好ましい。
下記は、アミノ酸の種々のグループ分けの一例である。
非極性R基を有するアミノ酸
アラニン
バリン
ロイシン
イソロイシン
プロリン
フェニルアラニン
トリプトファン
メチオニン
荷電しない極性R基を有するアミノ酸
グリシン
セリン
スレオニン
システイン
チロシン
アスパラギン
グルタミン
荷電した極性R基を有するアミノ酸（pH6.0で負に荷電）
アスパラギン酸
グルタミン酸
塩基アミノ酸（pH6.0で正に荷電）
リジン
アルギニン
ヒスチジン（pH6.0において）
他のグループ分けはフェニル基を有するアミノ酸である。
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
他のグループ分けは分子量による（即ちR基の大きさ）。
グリシン 75
アラニン 89
セリン 105
プロリン 115
バリン 117
スレオニン 119
システイン 121
ロイシン 131
イソロイシン 131
アスパラギン 132
アスパラギン酸 133
グルタミン 146
リジン 146
グルタミン酸 147
メチオニン 149
ヒスチジン 155
フェニルアラニン 165
アルギニン 174
チロシン 181
トリプトファン 204
好ましいアミノ酸置換は、
−正電荷が維持されるようにアルギニンをリジンに置換するもの、逆もまた同様；
−負電荷が維持されるようにアスパラギン酸をグルタミン酸に置換するもの、逆もまた同様；
−遊離のOHが維持されるようにスレオニンをセリンに置換するもの、逆もまた同様；
−遊離のNH2が維持されるようにグルタミンをアスパラギンに置換するもの、逆もまた同様。
特に好ましい性質を有するアミノ酸と置換するためのアミノ酸置換も導入することができる。例えば、他のシステインとジスルフィド架橋することができる可能性がある部位にシステインを導入することができる。ヒスチジンを特に「触媒的」部位（即ち、ヒスチジンは酸又は塩基として作用することが可能であり、生化学的な触媒において最も一般的なアミノ酸である）として導入することができる。平面的な構造であるために特にプロリンが導入され、蛋白質の構造においてEターンを誘導する。
少なくとも約70％のアミノ酸残基（好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90又は95％）が同一であり、又は保存的な置換を示す時には、二つのアミノ酸配列は「実質的に相同」である。
DNAコンストラクトの「非相同」領域はより大きなDNA分子中における同定可能な領域であって、天然ではそのより大きな分子と結合して見出されることがないものである。そこで、その非相同領域が哺乳動物遺伝子をコードする時には、その遺伝子が通常隣接しているであろうDNAは、起源生物のゲノム中で哺乳動物ゲノムDNAと隣接しないものである。異種コード配列の他の例は、コード配列それ自体は天然において見出されないコンストラクトである（例えば、ゲノムコード配列がイントロン又は天然の遺伝子と異なったコドンを有する合成配列を含むcDNAである）。対立遺伝子の変異又は天然由来の変異事象は、この中で規定されたDNAの非相同領域を引き起こすことはない。
「抗体」は特定のエピトープに結合する任意の免疫グロブリンであって、抗体及びその断片を含む。その用語はポリクローナル、モノクローナル、及びキメラ抗体を包含し、最後に言及したものは、米国特許番号4,816,397及び4,816,567において更に詳細に述べられている。
「抗体結合部位」は重鎖と軽鎖の可変及び超可変部位からなり、抗原に特異的に結合する、抗体分子の構造部分である。
この中で種々の文法的な形式で用いられている「抗体分子」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両者を考慮するものである。
抗体分子の例としては、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、及び抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子のそれらの一部があり、本技術分野でFab, Fab’, F(ab’)2及びF(v)として知られているものを含み、その一部はこの中で述べられる治療の目的に好ましい。
抗体分子のFabとFab’部分はそれぞれ、実質的に無傷の抗体分子についてのパパインとペプシンの蛋白質分解反応によって、良く知られている方法により調製される。例えば、Theofilopolousらの米国特許番号4,342,566を見よ。Fab’抗体分子部分もまた既知であり、F(ab’)2部分から、引き続いてメルカプトエタノールと同様に2つの重鎖部分を結合しているジスルフィド結合を還元し、更に引き続いて得られた蛋白質メルカプタンを、ヨードアセトアミドのような試薬によってアルキル化することにより作製される。ここで無傷の抗体分子を含んでいる抗体は好ましい。
種々の文法的な形での「モノクローナル抗体」という用語は、特定の抗原と免疫反応をすることが可能な抗体結合部位を一種類のみ有している抗体を言う。そこで典型的なモノクローナル抗体は、それが免疫反応する抗原に対して単一の結合親和性を示す。そこでモノクローナル抗体には、各々が異なった抗原について免疫特異性を有する複数の抗体結合部位を有する抗体分子が含まれ、それには例えば二重特異的（キメラ）モノクローナル抗体がある。
「薬学的に受容可能な」という用語は、生理学的に容認できるものであって、かつ典型的には、人に投与した時にアレルギー反応、あるいは胃の異常亢進や目眩など類似の不都合な反応を引き起こさない存在である分子と組成物を言う。
この中で使用される「動物を感染から防御するのに十分な」という用語は、疾患が普通に引き起こす病理学的な特徴の少なくとも一つの顕著な臨床的な変化を防御し、且つ、少なくともおよそ30パーセント、より好ましくは少なくともおよそ50パーセント、最も好ましくは少なくともおよそ90パーセント低下させるのに十分な量を意味するものである。
臨床的には、人々における狂犬病の最初の症状は、倦怠感、熱、又は頭痛のような非特異的なインフルエンザ様の徴候である。不快感又は感染部位（咬み傷）の知覚障害があるかもしれず、数日中に脳の機能不全、不安感、錯乱、興奮の症状に進行し、精神錯乱、異常行動、幻覚及び不眠症へ進行する。
狂犬病感染の細胞内の病理は脳炎及び脊髄炎によって規定され、中枢神経系（CNS）全体に渡っておこるリンパ球、多核白血球、及び形質細胞の血管周囲への湿潤を含む。海馬の錯体細胞と小脳のプルキンエ細胞を含む神経細胞中と、脊髄神経節を含む中枢神経系中の皮質と他領域のニューロン内に、細胞質好酸性封入体（ネグリ小体）があることがある。
発現制御配列がDNA配列の転写と翻訳の支配と制御をしている時には、そのDNA配列は発現制御配列と「機能を発現するように結合」している。「機能を発現するように結合」という用語には、発現するべきDNA配列の先頭に適切な開始シグナル（例えばATG）を有すること、正しい読み枠を維持して発現制御配列の制御下でDNA配列を発現させること、該DNA配列によってコードされる望みの産物を生産することが含まれるものである。組み換えDNA分子中に挿入しようとする遺伝子が適切な開始シグナルを有していない場合には、その様な開始シグナルを該遺伝子の先頭に挿入することができる。
「ストリンジュントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーションと洗浄の両者において5 x SSCと65℃と実質的に同等の塩と温度の条件をいう。しかしそのような「ストリンジュントなハイブリダイゼーション条件」は、緩衝中のナトリウムとマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さと濃度、不適合パーセント、フォルムアミドパーセントなどを含む特定の条件に依存しており、当業者はその事を理解するであろう。「ストリンジュントなハイブリダイゼーション条件」を規定するにあたってやはり重要であるのは、ハイブリダイズする2つの配列がRNA-RNA, DNA-DNA又はRNA-DNAのいずれであるのかという事である。良く知られている式に従って当業者はそのようなストリンジュントなハイブリダイゼーション条件を容易に決定することが可能であり、ハイブリダイゼーションは予想あるいは決定したTmから通常は10-20℃低く、もし必要ならばより厳しい条件で洗浄する。
本発明は更に、本発明の治療方法を実施するのに有効な治療組成物を検討するものである。披験治療組成物は混合物中に、薬学的に受容可能な賦形剤（担体）、及びこの中で述べられた活性成分として、一つ又はそれ以上の変異体狂犬病ウイルス、変異体狂犬病ウイルスポリペプチド又はその断片を含む。好ましい態様において該組成物は、免疫反応、好ましくは狂犬病に対する防御免疫反応を引き起こすことができる抗原からなる。
活性成分としてポリペプチド、類似物又は活性断片を含む治療組成物の調製は、本技術分野において良く知られている。典型的にはそのような組成物は液体溶液又は懸濁液のいずれかの注射可能な物質として調製されるが、注射前に液体溶液又は懸濁液とするのに適した固形も調製される。該調製物は乳化することもできる。活性治療成分はしばしば、薬学的に受容可能であって活性成分と適合性を有する賦形剤と混合されている。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール又はそのような物、及びそれらの組み合わせがある。加えてもし望むならば、該組成物は、活性物質の効果を促進する保湿又は乳化剤、pH緩衝剤などの少量の補助物質を含むことができる。
ウイルス、ポリペプチド又はそれらの断片を、中和された薬学的に受容可能な塩の型として、治療用及び／又は免疫原組成物へ製剤することができる。薬学的に受容可能な塩には、酸添加塩（ポリペプチド又は抗体分子の遊離アミノ酸基と形成する）及び、例えば塩酸又はリン酸などの無機塩、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機塩と形成したものが含まれる。遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第2鉄のような無機塩基、及び、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインのような有機塩基から得ることもできる。
治療用及び／又は免疫原となるウイルス、ポリペプチド、又は断片を含む組成物は通常、例えば投与単位として投与されている。本発明の治療組成物について「投与単位」という用語が使用された時、その用語はヒトにおいて単一用量として適切な物質的に別個の単位を言うものであり、各単位は担体やベヒクル等の必要とされる希釈剤と関連して、望む治療効果及び／又は免疫原としての効果を得られるように計算された活性物質の所定の量を含有する。
本組成物は、投与形態に適合する態様において、治療目的又は免疫原として有効な用量を投与される。投与される量は治療の対象、その対象が活性成分を免疫系で使用する能力、および発現を望む程度に依存する。投与すべき活性成分の正確な量は医師の判断に依り、各個体に固有のものである。しかしポリペプチドの投与における適切な用量は、各個体の体重1キログラムにつき１日あたりの活性成分が、約0.1から20、好ましくは約0.5から約10、より好ましくは1から数ミリグラムであり、投与経路に依存する。ウイルス投与において適切な容量は105感染単位から(i.u.)から107i.u.である。初期投与及び追加抗原注射の適切なやり方も変更可能であるが、典型的なやり方は、初期投与に続いて注射をすることにより7日毎に反復投与を行うか、あるいは他の投与を行うというものである。
本組成物は下記の活性物質；即ち抗生物質、ステロイドのうち一つ又はそれ以上を更に含むことができる。
本発明の他の特徴は、この中に開示したウイルスに機能を発現するように挿入したDNA配列の発現である。本技術分野において良く知られているように、DNA配列を適切な発現ベクター中の発現制御配列と機能を発現するように結合し、その発現ベクターを用いて適切な宿主を形質転換することにより該DNA配列を発現させることができる。
そのように、本発明のDNA配列と発現制御配列を、機能を発現するように結合することには、当然に、すでに該DNA配列の一部となっていなくても、開始コドンであるATGをDNA配列の上流の正しい読み枠に与えることも含まれる。
本発明のウイルス蛋白質をコードするDNA配列を発現するにあたり、広範囲の宿主／発現ベクターの組み合わせを採用することができる。有用な発現ベクターには、例えば、染色体DNA配列、非染色体DNA配列及び合成DNA配列の断片からなるものがある。適切なベクターには、SV40の誘導体及び既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドcol E1, pCR1, pBR322, pMB9およびそれらの誘導体、RP4のようなプラスミド；ファージDNA、例えばファージλの多くの誘導体、例えばNM989、及び他のファージDNA、例えばM13及び線維状一本鎖ファージDNA；2μプラスミド又はその誘導体などの酵母プラスミド；真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫（バキュウイルス）又は哺乳細胞において有用なベクター；プラスミドとファージDNAの組み合わせから得られたベクター、例えばファージDNAを使用するために改変されたプラスミド又は他の発現制御配列；およびその様なものが含まれる。
広範囲の発現制御配列における任意のもの−それに機能を発現するように結合されたDNA配列の発現を制御する配列−をこれらのベクターにおいて使用し、本発明のDNA配列を発現させることできる。そのような有用な発現制御ベクターには、例えば、SV40の早期又は後期プロモーター、CMV、ワクチニア、ポリオーマ又はアデノウイルス、lacシステム、trpシステム、TACシステム、TRCシステム、LTRシステム、ファージλの主要なオペレーター及びプロモーター領域、fd被覆蛋白質の制御領域、3-ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖系酵素、酸ホスファターゼのプロモーター（例えばPho5）、酵母α-交接因子、及び、原核又は真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子発現を制御していると知られている他の配列、及びそれらの種々の組み合わせが含まれる。
広範囲の宿主細胞も、本発明のウイルス蛋白質をコードしているDNA配列を発現するのに有用である。これらの宿主細胞には良く知られている真核細胞及び原核細胞宿主が含まれ、例えば、大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセスなどの株、酵母などの真菌、及びCHO, R1.1, B-W及びL-M細胞などの動物細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばCOS1, COS7, BSC1, BSC40及びBMT10）、昆虫細胞（例えばSf9）、BHK細胞、及び組織培養中のヒト細胞と植物細胞が含まれる。
全てのベクター、発現制御配列、及び宿主は、本発明のDNA配列の機能を発現するにあたって同じく機能する訳ではないことを理解するべきである。同じ発現系において全ての宿主が同じように良く機能する訳でもないであろう。しかし本技術分野の当業者は、適切なベクター、発現制御配列と宿主を過度の実験を要することなく選択し、本発明の範囲を逸脱することなく望みとする発現を達成することが可能である。例えば、ベクターを選択するにあたり、宿主内でベクターが発現する必要があるために、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び該ベクターによってコードされる任意のその他の蛋白質の発現、例えば抗生物質マーカーの発現なども考慮しなければならない。
発現制御配列を選択するにあたり通常は種々の因子が考慮されるであろう。これらには、例えば、系の相対的な強さ、その制御性、及び発現しようとしている特定のDNA配列又は遺伝子との特に潜在的な二次構造に関する適合性が含まれる。適切な変異ウイルスベクターは、例えばその複製能のみならず、発現させるDNA配列によりコードされる産物の毒性、あるいは変異体ウイルスの宿主に対する毒性も考慮して選択されるであろう。
これらのデータ及び他の因子を考慮して本技術分野の当業者は、本発明のDNA配列を発現するであろう、種々のベクター／発現制御配列／宿主の組み合わせを構築することができるであろう。
本発明のヌクレオチド配列から他の変異体ウイルス蛋白質を調製することを更に意図することができる。例えばウイルスポリペプチド材料をペプシンで消化することにより、断片のような類似物の調製もなされるであろう。ウイルス蛋白質をコードする配列の標準的な部位特異的変異を行うことにより、ムチンのような他の類似物を作製することができるであろう。免疫原性又は防御活性を有する変異体を、既知のインビボ及び／又はインビトロアッセイによって同定することができるであろう。
上記において述べたように、ウイルス又はウイルス蛋白質をコードするDNA配列を、クローニングより、むしろ合成によって調製することができる。標準的な方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから完全なコード配列へと組み立てることにより、完全な配列が組み立てられる。例えば、Edge et al., Science, 223; 1299 (1984); Jay et al., J.Biol.Chem., 259:6311(1984)を見よ。
合成DNA配列により、ウイルス蛋白質変異体又は突然変異蛋白質を発現するであろう遺伝子を構築することが便利になる。代わりに、突然変異蛋白質をコードするDNAを、天然ウイルス遺伝子又はcDNAの部位特異的な変異生成により作製することができ、通常のポリペプチド合成を用いて突然変異蛋白質を直接に作製することができる。
非天然アミノ酸を蛋白質中に部位特異的に導入する一般的な方法は、Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffin, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (April 1989)において述べられている。非天然アミノ酸を含む類似物を作製するのにこの方法を使用することができる。
下記の実施例は本発明の好ましい態様をより十分に述べるために提示されるものである。しかし、それらはいかなる意味においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
（狂犬病ウイルスNはゲノムRNAを好んでカプシド化する）
狂犬病ウイルスNは、他のマイナス鎖RNAウイルス由来のNと同様に、デノボで合成されたゲノムRNAをカプシド化することにより、ウイルスの転写及び複製の制御において重要な役割を果たす（Yang et al.,1998）。狂犬病ウイルスNの機能を検討するために、狂犬病ウイルスNをバキュロウイルスの系で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによってほぼ均質になるまでNを精製した（Fu et al.,1991）。精製されたNを使用してRNAをカプシド化した時、Nが試験した全てのRNA転写産物と結合することが見出された（Yang et al., 1998）。これらには、狂犬病ウイルスのプラス鎖のリーダーRNA（L-70）、狂犬病ウイルスNのmRNAの5’末端（N-70）、およびコントロール非ウイルスRNA（bluscript RNA, B-70）が含まれる。しかし、組み換え体Nと狂犬病ウイルスリーダーRNAの間の相互作用は、組み換え体NとN mRNAの間の相互作用よりも少なくとも3倍大きく、組み換え体NとコントロールRNAの間の相互作用よりも10倍大きく、Nはプラス鎖のリーダーRNAを好んでカプシド化することを示している。
（狂犬病ウイルスNのリン酸化はウイルスの転写と複製を制御する）
狂犬病ウイルスNはリン酸化され（Sokol et al., 1973）、そのリン酸化部位は389番目の位置のセリンであると同定されている（Sietzschold et al., 1987）。デノボ合成されたゲノムRNAをカプシド化することにより、Nはウイルスの転写と複製の制御に重要な役割を果たすから（Wunner, 1991）、Nのリン酸化はウイルスの転写と複製に影響するかもしれない。ウイルスの転写と複製においてNのリン酸化が制御的な役割を果たすかどうかを調べるために、ConzelmannとSchnellによって述べられた逆遺伝学（Conzelmann et al., 1994）を用いて狂犬病ウイルスのミニゲノムを発現させ、ウイルスRNAの転写と複製におけるNリン酸化の影響を直接に試験した。T7ポリメラーゼによって標的化されたプラスミドpSDI-CATからミニゲノムを発現させた。ミニゲノムをT7ポリメラーゼに標的化したプラスミドpSDI-CATより発現させた。細胞内で発現した時ミニゲノムRNAは、合間でCATコード配列と隣接している狂犬病ウイルスゲノムの3’末端から68のヌクレオチドと、5’末端から169のヌクレオチドを含んでいた（Conzelmann et al., 1994）。pRP, pT7T-L, pT7T-G, pT7T-M及びpRN又はpRN -S389Aと共に、プラスミドpSDI-CATをBHK細胞中にトランスフェクトし、トランスフェクションして48時間後に細胞を回収した。標準的なCATアッセイを用いて細胞抽出物からCAT活性を測定した。pRNでトランスフェクトした細胞において強いCAT活性が検出された。野生型Nを変異したN（セリンからアラニン）と置換したとき、CAT活性は20％だけ検出され、Nのリン酸化の欠如はウイルス転写が減少する結果となることを示唆している。しかし野生型Nと変異体Nの両者が存在している時には、約80％のCAT活性が検出され、それは、リン酸化されないNはドミナントネガティブの調節因子ではないことを示している（Yang et al., 1999, Appendix 1）。
Nのリン酸化もウイルス複製に影響するどうか調べるために、継代実験（passage experiment）を行った。最初のトランスフェクション由来の上清を回収し、pRP, pT7T-L及びpRN、又はpRN -S389Aでトランスフェクトした新鮮なBHK細胞を感染させるのに使用した。CATアッセイで測定するために48時間後に細胞を回収した。最初のトランスフェクションと引き続いての継代実験の両者において野生型のNを使用したときに、最大のCAT活性（100％）が検出された。最初のトランスフェクションにおいて野生型Nを使用し、継代実験において変異したNを使用したときには43％のCAT活性が検出され、それは、Nのリン酸化は実際にミニゲノムの転写に影響することを示唆している。最初のトランスフェクションにおいて変異したNを使用し、継代実験において野生型Nを使用したときには61％のCAT活性が検出され、それは、変異したNは最初のトランスフェクションにおいて、効率が低いにせよ、ミニゲノムの複製を支持していることを示唆している。しかし、最初のトランスフェクションと継代実験の両者において変異したNを使用したときには、CAT活性は13％しか検出されず、それは、Nリン酸化の欠如するとウイルスRNAの転写と複製の両者が減少する結果となることを示唆している（Yang et al., 1999, Appendix 1）。
389番目の位置のセリンをアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に変異し、ミニゲノム中での狂犬病ウイルスの転写と複製に対するこれらの変異の影響を検討し、それのみならず、完全に感染性を有しているウイルスについても検討した。セリンを他のそれぞれのアミノ酸に変異させると非リン酸化Nが合成され、ミニゲノム中でウイルス転写と複製が低下するという結果となった。SからAとSからDの変異も、全長の感染性ウイルスにおいてウイルス転写と複製の両者が低下する結果となった。成長曲線の研究により、SからAに変異した変異体ウイルス（L16A）の複製は、野生型ウイルス（L16）よりも10,000倍も低いことが示唆された。狂犬病ウイルス遺伝子プローブを用いたノザンハイブリダイゼーションにより、Nがリン酸化されなかったときには、ウイルスの転写と複製の速度は、変異体ウイルスにおいて10倍も低下することが示された。ミニゲノムシステムと全長の感染性ウイルスから得られたデータを解釈すると、狂犬病ウイルスNは複製に必要であることが示された。感染細胞のシクロヘキシミド処理に関する研究を更に行うことにより、Nがリン酸化されなかったときにはウイルス転写も低下していることが示された。考え合わせるとこれらの結果は、狂犬病ウイルスの転写と複製の過程において、Nリン酸化が重要な役割を果たしていることの決定的な証拠を与えるものである。
（細胞、ウイルス、プラスミド、及び抗体）
BSR（BHKの１クローン）とBSR T7/5（T7ポリメラーゼを安定して発現しているBSR細胞、[Buchholz et al., 1999]）をダルベッコの最小必須培地中で生育させ、先に述べたようにプラスミドによってトランスフェクトした（Yang et al., 1999）。細菌T7 RNAポリメラーゼを発現している組み換えワクチニアウイルス（vTF7-3）を既に述べたように調製した（Fuerst et al., 1986）。完全に感染性を有するウイルス（pSAD-L16）、狂犬病ウイルスミニゲノム（pSDI-CAT）、狂犬病ウイルスL（pT7T-L）、糖蛋白質（pT7T-G）、及び基質蛋白質（pT7T-M）（Buchholz et al., 1999; Conzelmann et al., 1987; Schnell et al., 1984）を発現させるために使用したプラスミドをK.Conzelmann博士から入手した。N（pRN）とP（pRP）を発現させるためのプラスミドは既に述べられている（Fu et al., 1994）。狂犬病ウイルスNに対するポリクローナル抗体をウサギにおいて既に述べられているように調製した（Fu et al., 1994）。
（部位特異的変異生成）
Weinerらの方法（1994）を用いて、部位特異的変異生成により狂犬病ウイルスNの389番目のセリンをA,G,D,N,E又はQへ変異した。表1にまとめたように6対のプライマーを合成し、それらのプライマーは、セリンコドンを変異させる結果となる1個又は2個のヌクレオチドの変化を含むように設計されている。鋳型としてpRNを用いて、3つのプライマー対の各々でPCRを行った（Fu et al., 1994）。メチル化及び半メチル化したDNAをGmeATC部位において消化するDpnIによってPCR産物を消化し、それによってpRN DNA鋳型を消化した。消化されなかったPCR産物（メチル化されていない）を用いて、コンピーテントなXL-1 Blue細胞を形質転換した。プラスミドにおける変異をヌクレオチド配列決定によって確認した。
Figure 2005510249
感染性を有するクローンに狂犬病ウイルスN上の変異を誘導するために、完全に感染性を有するクローン（pSAD-L16）（狂犬病ウイルスゲノムのヌクレオチド配列482-4041 [Conzelmann et al., 1990]）由来のNのセリンコドンを含むSphI断片を、pGEM-3ZのSphI部位へクローン化した。pRNについて上記で述べたような変異を構築するために使用する鋳型として、得られたプラスミドを使用した。代理ベクターにおいて389番目の位置におけるセリンを、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸に変異させた。配列解析によって確認した後、変異したSphI断片のそれぞれをクローン化してpSAD-L16へ戻した。予期した変異を有し、方向性が正しい3つの変異したクローンが得られ、それぞれpSAD-L16A, pSAD-L16D及びpSAD-L16Eと名付けた。
（トランスフェクション）
プラスミドによるBSR細胞のトランスフェクションを既に述べられた様に行った(Yang et al., 1999)。簡単に言うと、細胞あたり5プラーク形成単位（pfu）の感染多重度（moi）で、組み換えワクチニアウイルス（vTF7-3）をBSR細胞に感染させた。感染して1時間後にリポフェクタミンを用いて（Life Technologies, Rockville, MD）、組み合わせの異なる混合したプラスミドにより細胞をトランスフェクトした。更に解析をおこなうために、トランスフェクトされた細胞を所定の時間で回収した。
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）アッセイ）
Quan-T-CATアッセイ（Amersham Pharmacis Biotech, Piscataway, NJ）を用いて製造業者のプロトコールに従ってCAT活性を測定した。トランスフェクトされた細胞を溶解し、上清をビオチン化したクロラムフェニコールおよび［3H］アセチルコエンザイムAと共にインキュベートした。ストレプトアビジンを被覆したビーズを反応物に添加した。遊離の放射活性材料を除去した後に、シンチレーション分光分析で定量するためにペレットをシンチレーション溶液中に再懸濁させた。１分あたりのカウント数としてCAT活性を表現した。変異したN蛋白質のそれぞれによってトランスフェクトした細胞における相対的なCAT活性を、野生型Nでトランスフェクトした細胞におけるCAT活性を100％として計算した。
（蛋白質の放射ラベルと免疫沈降）
トランスフェクトまたは感染したBSR細胞を、既に述べられた様に（Yang et al., 1999）、[35S]メチオニン又は[32P]リン酸（Amersham Pharmacia Biotech）のいずれかによりラベル化した。細胞を回収して抗N抗体によって免疫沈降し、引き続いて12%ポリアクリルアミド/10%SDSゲル上における電気泳動とオートラジオグラフィーを行った。
（ノザンとウエスタンブロッティング）
トランスフェクトまたは感染したBSR細胞または精製したウイルスを、ノザン及び／又はウエスタンブロッティングにかけた。ノザンブロッティングのために、トライゾン試薬（Life Technologies）によりBSR細胞を溶解し、製造業者の記載事項に従って全RNAを調製した。mRNA単離キット（Roche, Indianapolis, IN）を用いて全RNAからポリA+mRNAを精製した。50%(v/v)ホルムアミドを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）により、RNA調製物を65℃で15分間変性し、1.1Mホルムアミドと10mMリン酸ナトリウムを含んでいる1.1%アガロースゲル上で電気泳動した。そしてCAT、狂犬病ウイルス遺伝子、あるいはβ−アクチンプローブとハイブリダイゼーションさせるために、RNAを転写してナイロン膜上に共有結合で固定化した。RNAバンドの定量化はデンシトメトリーで行った。ウエスタンブロットをするために、BSR細胞をRIPAバッファーで溶解し、蛋白質をSDS-PAGEで直接分離した。ニトロセルロース膜に転写した後に、狂犬病ウイルスNをウサギ抗-Nポリクローナル抗体により、述べられた様に検出した（Fu et al., 1991）。
（変異体狂犬病ウイルスの選択）
vTF7-3により感染したBSR細胞（Fuerst et al., 1986）あるいはBSR T7/5細胞（Buchholz et al.,1999; Schnell et al.,2000）のいずれかにおいて、変異体ウイルスの選択を行った。簡単に言うと、1moiのvTF7-3でBSR細胞を感染させた。1時間後、細胞を10mgのpRN, 2.5mgのpRP, 1.5mgのpT7T-Lおよび10mgのpSAD-L16, pSAD-L16A, pSAD-L16DまたはpSAD-L16Eによりトランスフェクトした。48時間インキュベーションした後に細胞を培地に再懸濁し、凍結と解凍を3サイクル行って細胞と結合したウイルスを遊離させた。遠心分離によってワクチニアウイルスを除去し、その後0.2mフィルターユニット（ミリポア）を通じて既に述べられた様に濾過した（Schnell et al., 1994）。代わりに、10mgのpTIT-N、2.5mgのpTIT-Pおよび2.5mgのpTIT-Lと共に、BSR T7/5細胞を10mgのpSAD-L16またはpSAD-L16Aによって、既に述べられた様にトランスフェクトした（Schnell et al., 2000）。その変異体ウイルスが望みとする変異を含んでいることを確認するために、それらの各ウイルスによって感染させたBSR細胞から全RNAを抽出し、プライマー（配列番号13-14）10g（5’CTACAATGGATGCC-GAC3’）と304（5’TTGACGAAGATCTTGCTCAT3’）を用いてN遺伝子を既に述べた様に増幅した（Smith et al., 1991）。これらのプライマーはゲノムRNAから完全なNコード配列を増幅することができる。増幅された断片を、N遺伝子上の変異部位の直前にあるプライマー（配列番号15）113（5’GTAGGATGCTATATGGG3’）（Smith et al., 1991）を用いて直接的に配列決定した。SからA、SからD、およびSからEの変異を有する変異体ウイルスをそれぞれL16A, L16D, L16Eと名付けた。
（ウイルス成長曲線）
6穴プレート中で成長しているBSR細胞を1ffu/細胞のmoiで野生型又は変異体狂犬病ウイルスに感染させた。37℃で1時間感染させた後にウイルス接種材料を除去し、細胞をPBSで洗浄して非吸着ウイルスを除去した。細胞に新鮮培地を補給し、感染して6, 12, 24, 36, 48, 60と72時間後に100mlの培養上清を除去した。BSR細胞中でウイルスの一定量を2連で既に述べられた様に力価測定した（Fu et al., 1996）。
（感染細胞のCHXによる処理）
シクロヘキサミド（CHX）をシグマ（St.Louis,Mo.）から購入し、既に述べられた様に、感染の1時間後に、狂犬病ウイルスで感染した細胞に最終濃度150μl/mlで添加した（3）。感染して6, 12及び24時間後、細胞を回収してノザンブロットハイブリダイゼーションを行うためにRNAを抽出した。
ウイルスの転写と複製におけるNリン酸化の影響はおそらく、少なくとも部分的にはリン酸部分の正味の負電荷により引き起こされる。過去に、狂犬病ウイルスNのリン酸化はウイルスの転写と複製の過程において受容な役割を果たすことが示された（Yang et al.,1999）。リン酸化セリンからアラニンへへ変異すると、狂犬病ウイルスミニゲノムの転写と複製が低下するという結果となる。ウイルスの転写と複製に対する狂犬病ウイルスNのリン酸化の影響が、リン酸部分の正味の負電荷により、あるいはSの構造により、若しくは両者によって引き起こされるものかを決定するために、Nの389番目の位置にあるリン酸化セリンを、A, G, D, N, E及びQに変異させた。BSR細胞を組み換えワクチニアウイルスvTF7-3に感染させ、引き続いて狂犬病ウイルスミニゲノム（pSDI-CAT）、狂犬病ウイルスL（pT7T-L）、狂犬病ウイルスP（pRP）を発現しているプラスミドによって、狂犬病N又はN変異体（pRN, pRN-SA, pRN-SG, pRN-SD, pRN-SN, pRN-SE又はpRN-SQ）を発現しているプラスミドと共に、既に述べられた様にトランスフェクトした（Conzelmann and Schnell, 1994; Yang et al.,1999）。接種して48時間後にBSR細胞を回収し、Quan-T-CATアッセイを用いてCAT活性を測定した。相対的CAT活性は、変異したNプラスミドのそれぞれによってトランスフェクトした細胞におけるミニゲノム転写の測定値であり、野生型Nによってトランスフェクトされた細胞における活性を100％として計算した。この結果を図１に要約する。野生型Nに対するCAT活性は、pRN-SG, pRN-SA, pRN-SN, pRN-SD, pRN-SQ及びpRN-SEにつきそれぞれ、6, 9, 28, 40, 46及び62％であった。他の全てのプラスミドによってトランスフェクトされているが、N-発現プラスミドを欠如している細胞においては、相対的なCAT活性は2％以下であった（データ示さず）。これらの結果は、ウイルスの転写又は複製あるいは両者におけるNリン酸化の影響はおそらく、少なくともその一部分は、リン酸部分の正味の負電荷とセリン残基の構造によりもたらされることを示している。
N-発現プラスミドの濃度を増加あるいは減少させることによって、ウイルス転写と複製におけるN-リン酸化の影響を補償することはできない。VSV P蛋白質のリン酸化の影響を研究する中で、Spadaforaら（1996）は、リン酸化されていないPは低濃度でウイルス転写を支持する活性がずっと低いことが見出した。狂犬病ウイルスミニゲノムで転写と複写を最適化する変異体N蛋白質の能力に対して、Nの濃度が何らかの影響を及ぼすかを測定するために、N又は変異体N（pRN-SA, pRN-SD, 又はpRN-SE）を発現しているプラスミドを用いて種々の濃度（5, 10, 15と20mg）でトランスフェクトし、細胞を回収してCATアッセイを行った。図２に示される様に、各変異体Nを発現しているプラスミド10mgと野生型N（pRN）の15mgがCAT活性を最適化するという結果となった。量がそれより多いかあるいは少ないとCAT活性は僅かに低下し（20％）、これは、Nの濃度の増加あるいは減少は、野生型Nまたは変異体Nのいずれにおいても、ウイルス転写に大きな影響を及ぼさないことを示唆している。発現したNのレベルが、添加されたN発現プラスミドの量に対応していることを保証するために、トランスフェクトした細胞をRIPA緩衝液によって溶解し、細胞溶解液をSDS-PAGE解析にかけ、引き続いて抗N-抗体ポリクローナルを用いたブロッティングを行った（Fu et al., 1994）。図2の下に示される様に、野生型又は変異型N蛋白質の各々について発現したNの量は、添加したN発現プラスミドの濃度と比例していた。
狂犬病ウイルスNのリン酸化は狂犬病ウイルスミニゲノムの転写と複製の両者に影響する。過去の研究（Yang et al., 1999）と上記の研究において、CAT活性を用いてウイルスの転写と複製をアッセイした。Nのリン酸化がウイルスの転写または複製、あるいはそれ両者に影響するかを更に測定するために、ノザンプロットハイブリダイゼーションを行って、トランスフェクトされた細胞中における転写産物とゲノム類似物を測定した。ウイルスの転写を測定するために、蒸留水でトランスフェクトされた細胞から全RNAを調製し、ポリA+ mRNAを全RNAから精製した。ウイルスの複製を測定するために、蒸留水でトランスフェクトされた細胞を抽出し、RNP複合体をポリクローナル抗N-抗体で免疫沈降した。その複合体をトライゾン試薬によって処理し、ゲノムアナログを得た。CATcDNAからニックトランスレーションを行うことにより[α-32P]-dCTPで標識化されたCATプローブを、RNA調製物とハイブリダイズさせた。Nがリン酸化されなかった時には、図３に示す様に、CAT転写産物とゲノムRNA類似物の量は減少した。転写と複製の活性は、野生型N、SからEに変異したN、SからDに変異したN、SからAに変異したNの順番で、高活性から低活性となった。pRN-SA、pRN-SDまたはpRN-SEによりトランスフェクトされた細胞のCAT転写産物の量は、それぞれ野生型Nの17, 63および85％であった。これらは図１に示した相対的CAT活性に対応する。pRN-SA、pRN-SDまたはpRN-SEによりトランスフェクトされた細胞におけるゲノム類似物の量は、野生型N（pRN）を発現している細胞における量の12, 55と95％にそれぞれ相当し、ミニゲノムシステムにおけるウイルス転写産物とゲノム類似物の合成は両者よもNリン酸化によって影響されることを示している。
変異体Nを発現しているプラスミドによりトランスフェクトされた細胞における転写と複製の低下は、合成されたNのレベルが異なっていることに依るという可能性を排除するために、トランスフェクトされた細胞を[35S]メチオニンによってラベルし、RIPA緩衝液で溶解した。ラベルされたNを抗N抗体によって免疫沈降してSDS-PAGEで解析した。図３に示す様に、異なったNコンストラクトによってトランスフェクトされた細胞における、免疫沈降されたNまたは変異体Nの量は類似していた。N変異体が本当にリン酸化されていないことを確認するために、トランスフェクトされた細胞を[35P]リン酸によって標識化した。RIPA緩衝液で溶解した後に、標識化したNを抗N抗体によって免疫沈降し、SDS-PAGEによって解析した。野生型Nのみがリン酸化され、一方変異体N蛋白質は全てリン酸化されなかった（図３）。
（変異体狂犬病ウイルスの構築および選択）
ミニゲノムシステムにおいて、ウイルスの転写と複製に必要なウイルス蛋白質はT7ポリメラーゼによって合成されるために、その合成は狂犬病ウイルス制御機構によって制御されはいなかった。そのために、完全に感染性を有するウイルスにおいて、狂犬病ウイルスNのリン酸化がウイルス転写および複製に及ぼす効果を測定する必要があった。このために、全長の感染性を有するクローンに、Nの389番目のセリンをアラニン（L16A）、アスパラギン酸（L16D）、又はグルタミン酸（L16E）とする変異を導入した（Schnell et al., 1994）。L16A、L16DとL16Eは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 ブルーバード大学、マナッサス、VA 20110-2209, USAに、それぞれ寄託番号ATCC PTA-3541、PTA-3542およびPTA-3543して、2001年6月20日に寄託されたものである。これらのクローンでBSR細胞をトランスフェクトした後に、野生型ウイルスL16のみならず、変異体ウイルスL16DとL16Eも得られた。しかし、細胞中でL16AはBSR得られなかった。そこで、L16Aを選択するのにBSR T7/5細胞（Buchholz et al., 1999）を使用したところ、L16Aを得るのに成功した。RT-PCRと直接的な配列決定により、これらの変異体ウイルスは望みの変異を含んでいることが確認された。野生型ウイルス（L16）のRNAは389番目の位置においてセリンのコドン（UCU）を保持し、一方、L16A、L16DとL16Eウイルス由来のゲノムRNAでは、セリン（UCU）が、アラニン（GCU）、アスパラギン酸（GAU）及びグルタミン酸（GAA）にそれぞれ置換されていた。変異体ウイルスがリン酸化されていないNを発現することを確認するために、それぞれのウイルスに感染したBSR細胞を、[35S]メチオニン又は[32P]リン酸のいずれかで標識化し、免疫沈降し、PAGEで解析した。ミニゲノムシステムにおける場合には、各々のウイルスに感染したBSR細胞中に[35S]メチオニンで標識化したNが検出され、一方、[32P]リン酸で標識化したNはL16に感染したBSR細胞中にのみ検出された（データ示さず）。それは、389番目の位置のセリンが変異すると、完全に感染性を有するウイルスの中で、Nのリン酸化が喪失したことを示唆するものである。
変異体狂犬病ウイルスは野生型ウイルスよりも複製が遅い。最初に、BSR細胞中37℃で生育したところ、野生型狂犬病ウイルス（L16）、変異体ウイルスL16DおよびL16Eは高い力価（107 ffu/ml以上）となったが、L16Aの生育は良くなかった（104 ffu/ml以下の力価）。この困難さを克服するために、変異体VSV（Wertz et al., 1998）において述べられたのと同じようにしてL16AをBSR細胞中31℃で増殖させると、L16Aは生育して高い力価（105 ffu/ml以上）となった。野生株のみならず変異体狂犬病ウイルスの生育曲線を、それぞれのウイルスによって細胞あたり1 ffuでBSR細胞に感染させることにより検討した。図４に示される様に、野生型ウイルス（L16）は定常的に変異体ウイルスより生育が良く、ウイルス生成のピーク時（60時間）には109 ffu/ml以上の力価に達した。この時に変異体ウイルス、特にL16Aの生育速度は後方に遅延した。その収率はたった105 ffu/細胞であり、野生型ウイルスよりも少なくとも4対数単位（10,000倍）低かった。これらのデータは、Nのリン酸化は、おそらくは狂犬病ウイルスの転写と複製を制御するか調節することにより、ウイルス生成を促進することを示唆している。
十分に感染性がある狂犬病ウイルスにおいて、Nリン酸化はウイルスの転写と複製の両者を調節する。図４に示された成長曲線のデータは、リン酸化されないNの変異体ウイルス、特に変異体ウイルスL16Aの生育は大きく低下することを示している。これはウイルスの転写又は複製、あるいはそれら両者の阻害から生じているのかもしれない。ウイルスの転写及び複製の両者が変異体の感染性狂犬病ウイルスにおいて阻害されているかを調べるために、野生型ウイルスL16のみならず、変異体ウイルスL16A、L16DまたはL16Eにより、BSR細胞を1 moiで感染させた。感染して40時間後に全RNAを単離し、N（Fu et al., 1991）又は糖蛋白質（G）cDNA（Fu et al., 1993）の両者から作製したプローブを用いて、ノザンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。これらのプローブはゲノムRNA（12kb）由来のN又はG転写産物（1.4kb又は1.8kb）を区別することができた。図５に描いた様に、各プローブはゲノムRNAとN又はG転写産物を検出した。加えて、読み過ごし（RT）転写産物及び／又は欠陥干渉（DI）RNAも検出された。N又はG転写産物のすぐ上のバンドは、G又はNプローブのいずれかとハイブリダイズした時には、RT転写産物を表すのかもしれない。ゲノムRNAのすぐ下のバンドは、Gプローブとハイブリダイズした時には、RT転写産物（G又はL）あるいはDI RNAを表すのかもしれない。L16Aウイルスについては、ウイルスゲノムRNAと転写産物の量はそれぞれ、野生型ウイルスの10-12%と21-28%であった。L16Dウイルスについては、ウイルスゲノムRNAと転写産物の量は、野生型ウイルスのそれぞれ41-45%と60-65%であった。L16Eウイルスについて、ウイルスゲノムRNAと転写産物の量は野生型ウイルスの100%であった。一般的に、L16AウイルスとL16Dウイルスに感染した細胞におけるウイルス複製の阻害は（10-12%と41-45%）、転写阻害（21-28%と60-65%）よりも大きかった。これらの観察は、ミニゲノムシステムより得られたデータと併せると、Nがリン酸化されないとウイルス複製が低下する結果となることを示している。ミニゲノムシステムにおいてウイルスの複製はウイルスの転写には依存していない。なぜならば、Nの転写はT7ポリメラーゼの制御下にあり、リン酸化されていないNのレベルは野生型Nと同じ程度であるからである。それでもNがリン酸化していない時にはゲノムRNAの量は低下し（図２）、それはウイルス複製が最大になるにはNのリン酸化が必要であることを示している。
Nのリン酸化がウイルスの転写に影響しないことを更に検討するために、感染した細胞におけるデノボ蛋白質合成をCHXで阻害することにより、転写過程を複製過程から切り離す実験を行った。BSR細胞をそれぞれのウイルスにより、細胞あたり3FFUのMOIで感染させ、培養培地にCHXを添加して感染して1時間後に最終濃度が150μg/mlとし、蛋白合成を完全に阻害した(3)。CHX処理を行わない感染細胞をコントロールとして含めた。感染して6, 12と24時間後に細胞を回収し、狂犬病ウイルスNプローブによるノザンブロットハイブリダイゼーションを行うためにRNAを抽出した。各ウイルスについてゲノムRNAの量は時間の関数として増加したので（図６Ａ）、CHXなしで全てのウイルスは複製した。各ウイルスにおけるウイルスの転写と複製の効率は、各時点において図５に示されたものと類似していた。各時点において、ゲノムRNAの量はどのウイルスについても増加しなかったので（図６Ｂ）、CHXを培養培地に添加することによりウイルスの複製は抑制された。更に、CHX処理されたBSR細胞において、狂犬病ウイルスN蛋白質の合成は阻害された（データ示さず）。しかし、同じ期間の間で各ウイルスについての転写産物の量は増加した。各ウイルスの転写産物を各時点において野生型L16の量に対して定量したところ、L16A、L16DとL16Eの転写効率はそれぞれ、野生型L16の転写効率の8から12%、53から65%、91から100%であった。これらの結果は明らかに、SからEに変異したNを除き、リン酸化されないNもウイルス複製を阻害することを示している。
リン酸化されないNは、ゲノムRNAと非ゲノム（antigenomic）RNAの間の比率を変えなかった。リン酸化されないNはリン酸化されたNよりも、リーダーRNAにより強く結合した（Yang et al., 1999）。そこで、ゲノムRNAよりも非ゲノムRNAをより多くカプシド化することにより、Nリン酸化がウイルスの転写と複製において重要な役割を果たしている可能性がありそうである。これは、リン酸化されないNは非ゲノムRNAにより強く結合するために（Yang et al., 1999）、ウイルス複製における第一段階は結果物のマイナス鎖ゲノムRNAの合成を低下させ、それによって、ゲノムRNAと非ゲノムRNAの比を変えるのかもしれない。この仮説を試験するために、野生型又は変異型ウイルスのそれぞれにより感染させたBSR細胞から抽出した全RNAを、pRN鋳型から作製したセンス（T7ポリメラーゼによって転写された）またはアンチセンス（SP6ポリメラーゼによって転写された）リボプローブによる、ノザンブロットハイブリダイゼーションにかけた。それぞれのウイルスによって感染したBSR細胞から精製したビリオンからもRNAを調製した。野生型と変異型ウイルスに感染した細胞におけるゲノムRNAと非ゲノムRNAの比は、ほぼ類似していた（３：１）（図７）。精製されたビリオン中に見出されたこれらのウイルスの比も、それぞれのウイルスにおいて類似していた（１６：１から１９：１）。これらのデータは、ゲノムRNAのカプシド化とパッケージングが、非ゲノムRNAよりも優先的に起こることに、Nリン酸化はおそらく影響しないことを示唆している。
Nのリン酸化セリンが変異した時に狂犬病ウイルスの転写と複製が低下することが、ミニゲノムシステムと感染性ウイルスの両者において示された。Nがリン酸化されない時には、リン酸化されたNの時と比較して、転写と複製の速度は10倍も低下した。これらの変異体におけるウイルスの収率は、特にリン酸化セリンがアラニンに変異した時には、10,000倍も低下した。これらのデータは、狂犬病ウイルスNのリン酸化は、それが絶対に必要ではないにせよ、狂犬病ウイルスの転写と複製の調節に重要であることを示唆している。更にこれらのデータを解釈すると、ウイルスの転写と複製における狂犬病ウイルスNのリン酸化の影響は、セリンの構造とリン酸部分の正味負電荷の組み合わせに依ることが示唆される。狂犬病ウイルスNのリン酸化セリンを中性アミノ酸であるアラニンとグリシンに変異すると、ウイルスの転写と複製は10倍も低下した。代わりにリン酸化セリンをアスパラギン酸とグルタミン酸を変異させたたきには、アスパラギン酸とグルタミン酸は両者とも酸性側鎖を含み、かつ生理的pHで負に荷電しているが、ウイルスの転写と複製の活性はリン酸化されたNの60%と80%以上も維持された。しかしSがNまたはQに変異した時には（それらは両者ともDとEに類似した構造を有しているが、負電荷を欠いている）、ウイルスの転写活性は少なくとも1/3に低下したが、なおもSからA、あるいはSからGへ変異して得られる活性よりは高かった。更に、変異体ウイルスL16Aは37℃よりも31℃において良く生育するという事実は、その変異体ウイルスが温度感受性を有していることを示唆している。これらの結果は、ウイルスの転写と複製においてアミノ酸の構造とリン酸部分の正味負電荷の両者が重要であることを示唆している。
狂犬病ウイルスNは、VSVにおけるその対応物と同様に、デノボで合成したウイルスゲノムRNAをカプシド化することにより、ウイルスRNAの転写と複製の制御において重要な役割を果たす（Wagner and Rose, 1996; Wertz et al., 1987; Wunner, 1991, 23, 25, 27）。VSV Nではなく狂犬病ウイルスNがリン酸化されるという事実は、狂犬病ウイルスRNAの転写と複製においてリン酸化が如何に関与しているかという疑問を提起するものである（Wunner, 1991）。Yangらの1999年の文献とその中に示された研究は、完全に感染性を有するウイルスのみならず、ミニゲノムのウイルスの転写と複製はの両者とも、Nがリン酸化されてない時には阻害されることを示唆した。リン酸化されないNのコンストラクトでトランスフェクトされた細胞におけるウイルスの転写産物とゲノム類似物の量は両者とも、リン酸化されたNでトランスフェクトされた細胞より低かった。同様に、リン酸化されないNを発現している変異体ウイルスに感染した細胞におけるウイルス転写産物とゲノムRNAの量の両者は、野生型ウイルスに感染した細胞よりも低かった。アッセイにおいてNの発現レベルに差は検出されなかったので、ミニゲノムシステムにおいてウイルスの転写と複製の低下が観察されたが、それはトランスフェクトされた細胞における変異体N蛋白質の発現の差によるものではなかった。
本研究は、Nのリン酸化がウイルスの転写、複製、あるいは両者に影響するかという問題にも取り組むものである。一つのあり得る筋書きは、Nのリン酸化はウイルスの転写、複製、あるいは両者に影響するというものであろう。ミニゲノムシステムと感染性を有するウイルスにおいて、ウイルス転写産物とゲノムRNAの定量化をしたところ、Nがリン酸化されていない時には、ウイルス転写産物とゲノムRNA（または類似物）レベルの両者が低下していることが示された（図２と図５）。しかしこれらのデータは、感染細胞におけるウイルスの転写と複製に内在する複雑さのために、リン酸化されていないNはウイルスの転写と複製の両者を阻害することを必ずしも意味するものではない（Wagner and Rose, 1996）。ウイルスゲノム複製が低下すると転写のための鋳型が少なくなる結果となり、そして、これがウイルスmRNAの蓄積を減少させるという可能性がありそうである。一方、転写の低下はNのプールを減少させ、結局は複製が減少することになる。それにもかかわらず、ミニゲノムシステムにおいて得られたデータから、リン酸化されたNはウイルスの複製を促すと結論することができる。ミニゲノムシステム中においてNがリン酸化されない時にはウイルスの複製は低下するが（図２を見よ）、その事実にかかわらず、ミニゲノムシステム中においては、Nの転写はT7ポリメラーゼの制御下にあるために、ウイルスの複製はウイルスの転写に依存していなかった。実際にミニゲノムシステム中において、非リン酸化Nのレベルは野生型のNに類似していることが免疫沈降により示された。
ウイルスの転写はNのリン酸化に影響するのか、そしていかにして影響するのかを更に示すために、感染した細胞をCHXで処理して蛋白質の合成を阻害することにより、ウイルスの転写を複製から切り離した。ウイルスの複製はウイルスN蛋白質のデノボ合成に依存しているが、転写はそうではない(25)。これらの条件下でウイルスの複製は低下したが、転写はそうではなく（図６）、ウイルスの転写に対するNリン酸化の影響はウイルスの複製には依存しないと評価することができる。このデータは、Nのリン酸化もウイルスの転写を調節することを示すものである。なぜならば、Nがリン酸化された時、特にSがAに変異した時にはウイルスの転写はほとんど90％阻害されるからである。そこでこのデータは、Nリン酸化はウイルスの転写と複製の両者を促すことを示している。
全ての一本鎖マイナス鎖方向RNAウイルスと同様に、狂犬病ウイルスにおいて、RNP複合体は感染単位である（Wunner, 1991）。RNP複合体中の成分間の複雑な相互作用によりウイルスの転写と複製がもたらされる（Wagner and Rose, 1996; Weitz et al., 1987）。先に、精製された狂犬病ウイルスNを脱リン酸化すると、リン酸化されたNよりも、リーダーRNAのカプシド化が促されることが示された（Yang et al., 1999）。狂犬病ウイルスNの389番目のセリンをアラニンへ変異させることも、野生型Nと比較してリーダーRNAへの結合が増加する結果となった。Nリン酸化はウイルスの転写と複製の両者に影響を及ぼした。そこでリン酸化されていないNがRNAに強固に結合すると、LがゲノムRNAに接近してウイルスの転写と複製を開始することが阻止される可能性がある。リン酸骨格を通じての転写と複製の間において、ゲノムRNAはNと結合したままであるが（Emerson, 1982）、鋳型と結合したNは一時的に折りたたみをほぐされなければならず、それによってLは鋳型RNAと接触できるようになる（Bannerjee and Chattopadhyay, 1990）。Nのリン酸化はNとゲノムRNAの間の相互作用を弱め、それによって、LはRNA鋳型に接近して結合し、転写と複製を開始することを可能とする。この仮説はミニゲノムシステムと感染性ウイルスの両者において支持される。リン酸化セリンを中性アミノ酸であるAとGに変異すると、ウイルスの転写と複製は最も低下する。リン酸化されたセリンが負に荷電したアスパラギン酸またはグルタミン酸に変異すると、転写および複製の活性は、野生型Nのレベルの60から90%以上に保たれる。変異体ウイルスL16E（セリンがグルタミン酸に変えられた）に感染した細胞における転写産物と複製の量は、野生型ウイルスL16に感染した細胞における量と本質的に同等であった。L16Eに感染した細胞におけるウイルスの産生は、L16に感染した細胞における産生よりもやや少なかったがこれは起こった。ゲノムRNAは転写と複製の両者における鋳型であるが（Wagner and Rose, 1996）、リン酸化されたNは転写と複製の両者を促進するであろうというのはあり得ることである。
Nのリン酸化はリーダーRNAのカプシド化効率に影響するために（Yang et al., 1999）、Nのリン酸化が、ゲノムRNAよりも非ゲノムRNAをよりカプシド化するということはあり得ることである（Wunner, 1991）。リン酸化されていないNは、ウイルス複製の第一段階である非ゲノムRNAへの強固な結合が起こることにより、ゲノムRNAの合成を低下させるかもしれない。ゲノムRNAと非ゲノムRNAの間の比は、野生型ウイルス又は変異型ウイルスの中の一つにより感染した細胞において、一定のまま（およそ３：１）であった。全てのウイルスに由来する精製ビリオンの中で、ゲノムと非ゲノムRNAの間の比も類似していた（およそ２０：１）。非ゲノムRNAに対するゲノムRNAの測定された比は過去に報告されたもの（５０：１）から全く異なっていた（Finke and Conzelmannm, 1997）。その乖離は２つの研究において使用された方法と評価法によるものかもしれない。本実験においてデンシトメトリーによってRNAを定量したが、一方過去に報告された研究においてはリン酸イメージングによってRNAを定量している。それにも関わらずこの中で報告されたデータは、Nリン酸化はゲノム又は非ゲノムRNAのいずれにも影響しないことを示している。
近年Kawai（1999）らは、リン酸化されたNは核カプシド中にのみ検出され、一方遊離のNプール（大部分はN-P複合体で）中のNはリン酸化されていないことを報告した。その研究とこの中に示したデータに基づいて下記のモデルが提唱され、それは狂犬病ウイルスNがいかにリン酸化され、狂犬病ウイルスNのリン酸化いかにウイルスの転写と複製を制御するかの説明となるものである（図８）。遊離のNまたはN-P異種複合体において、おそらく立体配座のためにNはリン酸化されていない。この段階でリン酸化部位が覆い隠されている可能性がある。リン酸化されていないNはリン酸化されたNと比較してゲノムRNAに対する親和性が高い（Yang et al., 1999）ために、ゲノムRNAがカプシド化される前にリン酸化されないことはNにとって有利である。ゲノムRNAとN-P複合体の相互作用（カプシド化）はNの立体配座の変化を誘導するかもしれず、それによってNはキナーゼと相互作用することがが可能となり、または389番目のセリンが曝されてリン酸化を受け、あるいはそれら両者が起こる。代わりに、Nのリン酸化はNとゲノムRNAの間の相互作用に影響を及ぼす。リン酸化に続いて、負に荷電したリン酸化セリンと負に荷電したRNAの間の電荷反発力は、NとRNAの間の相互作用を弱めるかもしれない。これによりLは接近してゲノムRNAと結合できるようになるかもしれず、それによってウイルスRNAの転写と複製が開始する。このモデルを支持する証拠は２つの研究から来る。リン酸化したNより、リン酸化していないNはゲノムRNAとより強固に結合し（Yang et al., 1999）、リン酸化部位（389番目の残基）は推定上のRNA結合領域（289番目から352番目の残基）に近接する（Kouznetzoff et al., 1992）。リン酸化されていないNはRNAとより密接に結合するので、Lがゲノム鋳型に接近することを防ぐことができる。結果としてウイルスRNAの転写と複製の効率が低下する。
（NとGの両者を変異させた無毒の狂犬病ウイルスの構築と、その毒性と免疫原性の測定）
リン酸化セリンの変異（特にアラニンへの変異）は、狂犬病ウイルスのウイルスミニゲノムシステム中において、感染性ウイルスにつき、ウイルス複製と転写の両者を阻害した（Wu et al., 2001; Yang et al., 1999）。該変異体ウイルス（L16A）におけるウイルス収率は野生型ウイルスよりも、少なくとも4対数単位低かった（Wu et al., 2001）。これらのデータは全て、Nの変異はウイルスの複製を阻害することができ、それによって該ウイルスを弱めることを示している。過去にGにおける変異（特に333番目の位置のアミノ酸であるアルギニン）は、狂犬病ウイルスを弱毒化する結果となることが報告されている（Zietzschold et al., 1983）。Gの333番目のアルギニンが変異した弱毒化した狂犬病ウイルスにおいて、一次感染したニューロンから中枢神経系における二次又は三次ニューロンへ伝播する能力が低下している（Coulon et al., 1989）。しかし、細胞培養におけるこれらの変異体ウイルスが複製する速度は野生型ウイルスと異なっておらず、Gの333番目の位置における変異はウイルス複製の速度を低下させる結果とはならないことを示唆している（Lafay et al., 1994）。これにより、そのような変異体ウイルスがなお、直接的な脳内接種を介して新生動物に狂犬病を引き起こすことができる理由が説明されるかもしれない（Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994）。NとGの両者を変異させると狂犬病ウイルスは更に弱毒化し、そのウイルスはもはや、如何なる年齢の動物に如何なる経路で接種しても、病気を引き起こすことはできない程である。これは、そのような変異体ウイルスが神経系に侵入する能力が低下しているであろうという理由のみならず、複製の速度も低下しているからである。そこで、NとGの蛋白質の両者において変異を構築することにより非毒性狂犬病ウイルスを選択し、それらの毒性と免疫原性を測定できるかもしれない。
（GとNの両者を変異させることによる無毒狂犬病ウイルスの構築と選択）
Nのリン酸化部位を変異させた狂犬病ウイルス（L16A, L16DおよびL16E）が構築された（Wu et al., 2001）。L16DとL16Eの複製速度は野生型ウイルスL16と類似しているから、Gの変異がL16とL16Aの333番目に導入され、該変異は、2つのプライマー（配列番号：１６−１７）（5’ATGCTCACTACAAGTGAAACTTGGAATCAG3’及び5’GGAGGATCTCATTCCAAGTTTCACTTGTAG3’）を使用することにより、過去に述べた様な部位特異的な変異により行われた。これらのプライマーはアルギニン残基（AGA）をグルタミン酸（GAA）に変異させる結果となった。過去にSAG2について報告された様に、２つのヌクレオチドを変化させると、Gがその毒性型に回帰する可能性が低下した（Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994）。野生型（pSAD-L16）（Schnell et al., 1994）の完全な感染性を有するクローンに由来するGのアルギニンコドンを含む断片（狂犬病ウイルスゲノムのヌクレオチド配列3854-8273）（Conzelmann et al., 1990）をXhoIにより切断し、pGEM-3Zの同じ部位にクローン化した。Weinerら（Weiner et al., 1994）の方法と上記のプライマーを使用することにより、得られたプラスミドを変異を構築するための鋳型として使用した。代理ベクター中で333番目の位置のアルギニンはグルタミン酸に変異した。変異を確認するための配列解析を行った後、変異したXhoI断片はpSAD-L16とpSAD-L16AのXhoI部位にクローン化されて戻されるであろう。期待した変異と正しい方向性を有する変異体クローンをそれぞれ、pSAD-L16G333とpSAD-L16AG333と名付けた。
GとNの両者に変異を有する変異体ウイルスを選択するために、10μgのpSAD-L16G333またはpSAD-L16AG333と共に、10μgのpTIT-N, 2.5μgのpTIT-P, 2.5μgのpTIT-LによってBSR T7/5細胞を、既に述べられた様にトランスフェクトした（Wu et al., 2001; Schnell et al., 2000）。細胞に新鮮な培地を供給し、上清を新鮮なBSR細胞に移す前に更に3日間培養した。感染の2日後に、FITCと結合させた抗狂犬病ウイルスN抗体を用いてウイルスを検出した。細胞の染色が陽性であることは、感染性のウイルスを取り出すのに成功したことを示す。更に解析するためにウイルスを増殖させた。これら2つの選択されたウイルスをそれぞれ、L16G333とL16AG333と名付けた。
変異体ウイルスを更に解析するために、BSR細胞を各々のウイルスによって1moiで感染させることにより成長曲線を測定した。比較のためにL16とL16Aを含めた。1時間吸着させた後にウイルス接種材料を除去し、PBSで細胞を3回洗浄した。その後新鮮培地が添加する。感染してから6, 12, 18, 24, 36, 60と72時間後、培養培地から等量を採って既報（Wu et al., 2001）の従ってウイルスの力価測定に使用した。この実験を３回繰り返し、各ウイルスの平均力価を用いて比較した。これらの変異体ウイルスのウイルス複製速度が低下しているかどうか測定をするために、BSR細胞を1moiで感染させて感染の40時間後に回収し、既報（Wu et al., 2001）の方法を用いて全RNAを単離した。ウイルスゲノムRNAとRNA調製物中の転写産物を、N（Fu et al., 1991）とG cDNA（Fu et al., 1993）の両者から作製したプローブを用いたノザンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。RNAの定量をデンシトメトリー又はRNAバンドのホスホイメージングによって行った。代わりにこれらのウイルスによって感染させたBSR細胞を、VSVについて述べられた様にして（Wertz et al., 1998）、アクチノマイシンD（5μg/ml）の存在下で4時間、[3H]ウリジン（33μCi/ml）を用いて代謝により標識した。そして細胞を回収してRNA抽出を行った。そのRNAをゲル電気泳動によって解析してデンシトメトリーで定量化した。各転写産物とゲノムRNAの濃度からモル比を計算する。
ウイルス成長曲線の研究により、L16G333は細胞培養中でL16と同じ高さの力価で生育することが示された。なぜならば過去の研究により、細胞培養中において、野生型ウイルスのみならず、333番目においてGが変異している弱毒化狂犬病ウイルスも生育することが示されているからである（Lafay et al., 1994）。同様にL16AG333は細胞培養中において変異体ウイルスL16Aと同じ力価に生育し（Wu et al., 2001）、その収量は野生型ウイルスの少なくとも4対数単位低いであろう。ノザンブロットハイブリダイゼーションと[3H]ウリジン標識化により、L16及びL16G333と比較すると、L16A及びL16AG333におけるウイルス複製速度は、過去に観察された（Wu et al., 2001）様に、少なくとも5倍低下していることを示唆された。これはリン酸化部位におけるNの変異は狂犬病ウイルスの複製能を低下させることを示唆している。
（GとNの両者に変異を有する狂犬病ウイルスの毒性の測定）
これらの変異体ウイルスの毒性を測定するために、2つの年齢群（新生児の動物と5から6週齢のマウス）のマウスを選択した。弱毒化SADウイルス（L16）は、5から6週齢のマウスにおいて病気を誘発し（Winkler et al., 1976）、SAG-2（L16G333と同様にGに変異を有する）は脳内接種により新生児のマウス（Schumacher et al., 1993）に病気を誘発した。野生型L16と変異体ウイルスL16A, L16G333とL16AG333を含めて、試験するべき4種のウイルスがある。各ウイルスについて3つの用量（105, 106と107ffu）を試験した。本実験において全12群の5から6週齢のICRマウス（各群10匹、Harlan由来）が必要とされた。他の群をコントロールとして含めた。望みの用量を含んでいる10μlを用いて脳内接種をすることにより動物の感染を行った。コントロール群においては脳内経路で10μlの生理食塩水をマウスに注射した。20日間の間、ラフ・ファー（ruff fur）、運動失調、麻痺などの狂犬病の臨床的な徴候について動物を毎日2回観察した。瀕死のマウスと実験が終了したマウスを炭酸ガス吸入により安楽死させた。各群の致死率を記録してスチューデントT検定又はX2試験を用いて統計学的に解析した。
新生児の動物におけるこれらウイルスの毒性を試験するために、この実験において全部で12腹の同腹ICRマウス（各妊娠マウスは通常8から11匹の同腹の子を有する、Harlan由来）を必要とした。それぞれの同腹の子を１種類のウイルスの１用量に感染させた。コントロールとして別の同腹の子を含めた。１日齢の新生児の動物を、各ウイルスを望みの用量で含んでいる10μlにより脳内接種で感染を行った。コントロール群においては、新生児のマウスに脳内経路で10μlの生理食塩水を注射した。死亡した同腹の子がいるか、動物を20日間の間毎日2回観察した。実験終了時に生き残ったマウスを炭酸ガス吸入により安楽死させた。各々の同腹の子の致死率を記録し、スチューデントT検定又はX2試験を用いて統計学的に解析した。
既に述べた様に野生型（wt）ウイルスL16は、5-6週齢のマウスと新生児のマウスに狂犬病を引き起こす（Winkler et al., 1976）。感染した5-6週齢のマウスは感染後5から6日で臨床的な徴候を示し、感染後6から8日で瀕死となった。感染した新生児のマウスは感染後4から5日で重篤な臨床的な徴候を示すか、あるいは死亡した。SAG2について述べられた様に（Schumacher et al., 1993）、L16G333はGの333番目のアルギニンに変異を有するが、Nのリン酸化部位においては変異を有さず、該ウイルスは5-6週齢の動物において何かの病気を引き起こすことはなかった。しかし新生児の動物においては臨床的な徴候を引き起こすかもしれない。
L16が投与された動物の脳をこれらの動物から採取し、ウイルスの単離と遺伝子型の特定を行った。病気の動物におけるウイルスの力価を、過去に述べられた様に（Fu et al., 1996）測定した。遺伝子型を特定するために脳から全RNAを調製し、プライマー（配列番号13-14）10g（5’CTACAATGGATGCCGAC3’）と304（5’TTGACGAAGATCTTGCTCAT3’）を用いて述べられた（Smith et al., 1991）様にRT-PCRを行うために使用した。これらのプライマーはゲノムRNAから完全なNコード配列を増幅することができる。プライマー113（配列番号15）（5’GTAGGATGCTATATGGG3’）（Smith et al., 1991）を用いて、N遺伝子において変異の範囲のすぐ上流にある増幅断片の配列を直接的に決定した。もし変異体ウイルスの力価が野生型ウイルスと類似しており、配列解析によりNにおける変異したセリンが復帰していることが示されたならば、これはウイルスが復帰していることを示すものである。この場合にはセリンはグリシン又はグルタミンに変異しているが、セリンコドンの2つまたは3つの全てのヌクレオチドを変化させており、そのために復帰は起こり難い。
もし、Nのリン酸化部位に変異を有する狂犬病ウイルス（L16A）がいずれの動物群においても病気を引き起こさないならば、これは、複製の速度の低下のみで狂犬病ウイルスを、もはや新生児の動物において病気を引き起こすことができない程までに弱毒化することができる事を示している。そのような変異体ウイルスを十分に弱毒化すると、生狂犬病ウイルスワクチンとして開発することができる。
Gの333番目のアルギニンとNのリン酸化部位に変異を有するウイルス（L16AG333）は、新生児の動物を含む如何なる年齢の動物において脳内感染を行っても、如何なる病気も引き起こさないであろう。そこでGとNの両者に変異を行うことにより狂犬病ウイルスは、無毒となる。その様に変異したウイルスは神経系で伝播する能力が低下している（Coulon et al., 1989）のみならず、複製速度も低下している（Wu et al., 2002）からである。もし接種された動物においてその様なウイルスが活性免疫反応を刺激するならば（下を見よ）、それらは無毒な生の狂犬病ウイルスワクチンを開発するための理想的な候補者となるであろう。
（変異体狂犬病ウイルスの免疫原性の測定）
GとNの両者に変異を有する狂犬病ウイルス（L16AG333）の免疫原性を評価するために成熟したマウスを選択した。比較するためにL16, L16A, L16G333を含めた。各ウイルスについて3つの用量（105, 106と107ffu）を試験し、これによってウイルスが防御免疫を刺激できる最小用量が決定される。3つの接種経路、即ち筋肉内（i.m.）、皮内（i.d.）、皮下（s.c.）の経路について各ウイルス用量を使用した。この実験には全部で36群のICRマウス（各群10匹）を必要とした。他の群をコントロールとして含めた。望みの用量のウイルスを含む50μlで動物を、筋肉内（i.m.）、皮内（i.d.）または皮下（s.c）で免疫した。コントロール群のマウスはワクチン接種しないままとした。免疫して1, 2, 3および4週間後にマウスを出血させてウイルス中和抗体（VNA）を測定した。最後の出血の後に、マウスの後肢に10 MIMLD50（i.m.の50%致死量）のCVS-24ウイルスを、述べられた（Fu et al., 1991）ように筋肉内（i.m.）投与した。神経症状の進展と死亡について、20日間の間動物を毎日2回観察した。各群の動物について致死率を記録し、統計学的に解析した。
抗狂犬病ウイルス中和抗体を測定するために、迅速蛍光焦点阻害試験（RFFIT）を既に述べられた（Hable, 1996; Briggs et al.,1996）ように行った。簡単には血清を希釈し、狂犬病ウイルスのCVS-11変異体のおよそ50 TCID50を90分間インキュベートした。BHK細胞を添加し24時間インキュベートした。細胞を固定化してFITC標識した抗狂犬病抗体（Centocor）とインキュベートした。ウイルス感染した細胞を計測し、ReedとMuenchらの方法（Reed et al., 1938）を用いて抗体力価を計算した。相互関係を有する分散の2方向解析を用いた統計学的な解析により、全群のマウスの間でウイルス中和抗体（VNA）の発達を比較した。
野生型ウイルスL16と全ての変異体狂犬病ウイルスは、これらのパレンタルな（parental）免疫経路によって免疫反応を引き起こすことが可能であった。過去に野生型ウイルスL16について示された（Finke et al., 2000）ように、表層的な免疫経路によって成熟したマウスにおいて、これらのウイルスはいずれも病気を起こすことはないであろう。L16G333によって免疫されたマウスにおいて発達したウイルス中和抗体（VNA）の力価は、GとNの両者において変異したウイルスよりも高いかもしれない。これらのウイルスは複製速度が低下しているからである。そこで、L16AとL16AG333においてはより高い用量が必要とされるかもしれない。L16AとL16AG333はNのリン酸化部位に変異を有し、野生型ウイルス（L16）またはGの333番目のアルギニンにのみ変異を有しているウイルス（L16G333）よりも防御免疫を誘導する。これらのGとN変異体ウイルスによって誘導されたウイルス中和抗体（VNA）の反応は、L16G333によって誘導されたものと類似していることもあり得るが、インビトロの細胞培養におけるこのウイルスの複製は、GとNの両者に変異を有するウイルスよりも良いかもしれない。これらのウイルスは細胞培養において良く生育するが、これらのウイルスはインビボにおいて伝播する能力が低下しているために、インビボの状況では利点を有さないかもしれない（Coulon et al., 1989）。GとNの両者において変異を有するウイルス（L16AG333）はL16G333に匹敵するウイルス中和抗体（VNA）力価を誘導し、毒性の狂犬病ウイルスによる感染から免疫された動物を100%防御し、それがなおも脳内（i.c.）感染（上記を見よ）により、新生児の動物において病気を引き起こさないならば、このウイルスについて更に、無毒の狂犬病ウイルスワクチンとして、アライグマ、イヌなどの標的動物種、又はヒトにおいてですら異なった経路による免疫化について試験を行う。
複製速度が低下しているため、変異体ウイルスL16A（セリンからアラニンへの変異を有する）は非常にゆっくりと生育し、その収量は野生型狂犬病ウイルスL16よりも4対数単位低い（Wu et al., 2002）。このウイルスを31℃で増殖させるとウイルスの生成が増加したが、そのウイルス収量はなおも野生型ウイルスよりも低い。この問題を克服するためにリン酸化されたNを安定して発現している細胞株を確立し、Nのリン酸化部位が変異しているウイルスを増殖させた。これは、リン酸化されていないNはドミナントネガティブな調節装置ではなく、それがウイルスの転写と複製に阻害的に機能することはリン酸化されたNをトランス補充することにより克服できるという、過去の観察に基づいている（Yang et al., 1999）。リン酸化したNを安定して発現している細胞株を確立するために、狂犬病ウイルスNをコードしている配列を、XbaIとPstIを用いてpRNから消化した（Yang et al., 1998）。その断片はクレノウによって平滑断端とされ、EcoRV部位においてpcDNA3（インビトロゲン）中にクローン化された。得られたプラスミドを配列決定して方向の確認を行い、そして正しいプラスミド（pcDNA3-N）をBHK細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトして48時間後に細胞を回収した。Nの発現の検出と組み合わせて限界希釈を行って安定にトランスフェクトされた細胞を選択した。回収した細胞を96穴プレート中で10倍連続希釈し、50μl/mlのG-418を含んでいる選択培地を添加した。細胞を1週間更にインキュベートし、FITCが結合した抗狂犬病ウイルスN抗体（Centoco）によってNを発現している細胞を同定した。Nを発現している細胞（BHK-N）を更にクローン化し、N変異体狂犬病ウイルスの増殖に使用した。その時々にこれらの細胞におけるNの発現レベルを検出した。Nを安定に発現している細胞株（BHK-N）が一旦確立されたならば、L16A, L16AG333を含む変異体狂犬病ウイルスをBHK-N中で増殖させた。107ffu/mlまたはそれ以上のウイルス力価が得られたならば、それは、BHK-N細胞は変異体ウイルスが高い力価で複製するのに十分なリン酸化Nを提供するであろうことを示している。
複製の速度が低下し、神経系中で伝播する能力も低下しているとはいえ、L16AG333は無毒の狂犬病ウイルスワクチンを開発するための理想的な候補であり、L16AとL16AG333においてNのセリン（UCU）がアラニン（GCU）に変異すると、セリンコドンの一つのヌクレオチドしか変化していない。アラニン残基がセリンに戻る変異が起こり、ウイルスがL16の遺伝子型に復帰することは、特に大きく低下した複製速度の下においてはいつでもあり得ることである。細胞培養においてL16Aが10回以上継代しても、復帰が起こることはなかった。復帰を防ぐために、セリン（TCT）をグリシン（GGT）またはグルタミン（CAA）に変異し、それはセリンコドンの2つあるいは3つの全てのヌクレオチドを変化させるものであるので復帰は起こりにくくなる。グリシンは中性アミノ酸であり、アラニンと類似した構造を有している。グルタミンはグルタミン酸と同じ構造を有しているが、負電荷は有していない。リン酸化セリンをグリシンまたはグルタミンのいずれかに変異させることは、ウイルスの転写と複製において、セリンをアラニンに変異させるのと同様の効果を有している（Wu et al., 2001）。これらの変異はWuらが2001年に述べた方法によって容易に行うことができる。
（狂犬病ウイルスN遺伝子をウイルスゲノムに沿って移動させることによる無毒な狂犬病ウイルスの構築、及びそれらの毒性と免疫原性の測定）
関連したウイルスであるVSVの研究により、VSVゲノム中でNを再配置するとVSVが弱毒化するという結果が示された（Wertz et al., 1998）。この研究において、N遺伝子をゲノムの第１の位置から、VSVゲノム上の第２、第３または第４の位置に移動した。Nが移動するとNの発現は段階的に低下する結果となり、よってウイルスの複製が低下した。Nの転座は動物においてウイルスを段階的に弱毒化するという結果ともなった。経鼻的に300pfuの用量で野生型VSVに感染したマウスは全て死亡したが、同じ用量のN4（N遺伝子がゲノムに沿って第４の位置に移動している）に感染したマウスはいずれも病気を発症しなかった。狂犬病ウイルスのゲノムに沿ってN遺伝子を移動すると、狂犬病ウイルスは弱毒化するかもしれない。そこで狂犬病ウイルスN遺伝子を、狂犬病ウイルスゲノムに沿って第２、第３または第４の位置に移動させることにより、無毒の狂犬病ウイルスを構築する。そのNが移動した狂犬病ウイルスがもし十分に弱毒化しているならば、リン酸化部位で変異したN変異体ウイルスに対して利点を有するであろう。なぜならば、Nが移動したウイルスにおける変異は非可逆的であるからである（Wertz et al., 1998）。N遺伝子の移動はVSVを弱毒化する結果となるが、接種する用量が高くなるとN4は依然として病気と死亡を引き起こした（Wertz et al., 1998）。333番目のアルギニンにおけるGの変異もNを移動させたウイルス中に導入すると狂犬病ウイルスは更に弱毒化した。
（N遺伝子を移動させることによる無毒狂犬病ウイルスの構築）
狂犬病ウイルスのゲノム内でN遺伝子を移動させるために２つのプラスミドを構築した。プラスミドpSAD-L16G333をXhoIで消化し、それによって約4.5kbの断片をプラスミドから除去した（狂犬病ウイルスゲノムの3854-8273）（Conzelmann et al., 1990）。pSAD-L16G333プラスミドはGの333番目のアルギニンに既に変異を有するので、そのプラスミドを選択した。サイズが小さくなるので、pSAD-L16G333からXhoI断片を除去すると更に突然変異を生成することの助けとなった。２つの断片（10.5kbと4.5kb）を消化して回収した後に大きな断片を自己結合し、プラスミドpSAD-L16G333XhoIを形成し、それにはN, P, MとGとL遺伝子の一部が含まれている。このプラスミドはNからPの間、PからMの間、およびMからGの間の遺伝子間配列も含んでいる。そこでそれを使用して、PからMの間とMからGの間にある第２と第３の位置にNを移動させた。小さな断片をXhoIの位置でpGEM-3Zベクター中にクローン化し、pGEM-XhoIと名付けた。このプラスミドはG-L遺伝子間連結部を有し、NをGとLの間にある第４の位置に移動させるために使用した。
Nの位置を変化させた組み換えウイルスを構築するために、PfuTurbo Hotstart DNAポリメラーゼを用いて、プラスミドpSAD-L16G333XhoIから第１の位置にあるNを除去した（Lundberg et al., 1991）（ストラタジーン）。２つのプライマー（配列番号18-19）を合成し（5'ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3'と5'CATTTTTGCTTTGCAATTGACAATGTC3'）、PCR反応において使用した。これら２つのプライマーは9kbの断片を増幅し、N転写産物のまさに最初から始まって、5末端の非翻訳領域、コード領域、3末端の非翻訳領域、およびNとPの間の遺伝子間配列を含めて、N遺伝子を欠損させるという結果となる。PfuTurbo Hotstart DNAポリメラーゼは、増幅された断片の中で平滑末端を作製し（Lundberg et al., 1991）、そのために自己連結することができる。連結されたプラスミドの変異連結部を配列決定し、リーダー配列とP mRNA中に偽の変異がないことを確認した。得られたプラスミドをpSAD-PMGと名付け、位置が変更されたNクローンを構築するために使用した。PfuTurbo Hotstart DNAポリメラーゼはベクターDNA（ストラタジーン）から15kbの配列まで増幅可能であり、プラスミドpSAD-L16G333XhoIの大きさは約10kbしかないので何の問題もない。
全ての狂犬病ウイルス転写産物はAACAから始まるので、N遺伝子をクローニングするために各々の遺伝子連結部に特異なHpaI制限部位（GTTAAC）を作製した。ゲノムに沿って第２の位置にN遺伝子をクローン化するために、PとM遺伝子の間、遺伝子間配列のすぐ後に、特異なHpaI部位を最初に作製した。Weinerらの部位特異的な変異生成法（Weiner et al., 1994）を用いてこれを行った。２つのプライマー（配列番号20-21）を合成し（5'TCAACATGAAAAAAACAGTTAACACCACT3'と5'AGGGGTGTTAACTGTTTTTTTCATGTTGA3'）、pSAD-PMGのPとM遺伝子の間に特異なHpaI部位を構築するために使用した。配列解析によって変異を確認し、プラスミドをpSAD-PHMGと名付けた。そこで、PfuTurbo Hotstart DNAポリメラーゼを用いて、プライマー（配列番号22-23；5'ACACCCCTACAATGGATGCCG3'と5'GTTTTTTTCATGATGGATATACAC3'）により転写産物の開始点から遺伝子間配列までN遺伝子全体を増幅し、pSAD-PHMGのHpaI部位へクローニングした。配列解析によって確認した後、方向性が正しいプラスミドを選択した。HpaI部位の導入は挿入されたN転写産物の開始を変えないものの、遺伝子間配列は変化させる。そこで、遺伝子間配列を元に戻さなければならない。これはプライマー（配列番号24-25；5'ATGGAAAAAAACAGGCAACTG3'と5'AGTTGCCTGTTTTTTTCCATG3'）を用いた部位特異的な変異によって行われた。配列解析によって確認した後、正しい遺伝子間配列を有するプラスミドを選択し、pSAD-PNMGと名付けた。最後にpGEM-XhoIからXhoI断片を切断し、pSAD-PNMGのXhoI部位中へクローン化し、第２の位置にN遺伝子クローンを有する全長の狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-N2と命名し、N遺伝子が狂犬病ウイルスゲノムに沿ってPとM遺伝子の間に位置していることを除き、正確な狂犬病ウイルスの全長配列を含んでいた。
N遺伝子をゲノムに沿って第３の位置にクローン化するために、MとG遺伝子の間、遺伝子間配列のすぐ後ろに特異なHpaI部位を作製した。これはプライマー（配列番号26-27；5'GATGTGAAAAAAACTGTTAACATCCCTC3'と5'AGGGATGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3'）を用いた部位特異的な変異によって行われ、それによって、pSAD-PMGのMとG遺伝子の間に特異なHpaI部位が構築されるに至った。その変異を配列解析によって確認し、プラスミドをpSAD-PMHGと名付けた。そして上記の様にして増幅された全N遺伝子をpSAD-PMHGのHpaI部位へクローン化した。配列解析によって確認した後に、方向性が正しいプラスミドを選択した。HpaI部位を導入すると遺伝子間配列中で一つのヌクレオチドが変化した。そこで、プライマー（配列番号28-29；5'TGAAAAAAACTATTAACATCCCTC3'と5'AGGGATGTTAATAGTTTTTTTCAC3'）を用いた部位特異的な遺伝子変異によって遺伝子間配列を回復させた。配列解析によって確認された後、正しい遺伝子間配列を有するプラスミドを選択し、pSAD-PMNGと名付けた。再びXhoI断片をpSAD-PMNGにクローン化し、N遺伝子が第３の位置にクローン化された全長狂犬病ウイルスクローンを作製する。このプラスミドはpSAD-N3と名付けられた。
ゲノムの中の第４の位置にN遺伝子をクローン化するために、G+Yの遺伝子間配列のすぐ後ろ、GとL遺伝子の間に特異なHpaI部位を作製した（Conzelmann et al., 1990）。この変異はプラスミドpGEM-XhoI上の遺伝子中に導入された。なぜならば、このプラスミドはGとL遺伝子の間の遺伝子間配列を含んでいるからである。これはプライマー（配列番号30-31；5'CAGAAGAACAACTGTTAACACTTCTC3'と5'AGAAGTGTTAACAGTTGTTCTTCTG3'）を用いた部位特異的な変異によって行われ、それにより、pGEM-XhoIのGとL遺伝子の間に特異なHpaI部位を構築するに至った。この変異を配列解析によって確認し、そのプラスミドをpGEM-GHLと名付けた。上記で述べた様にしてN遺伝子全体を増幅し、pSAD-GHLのHpaI部位へクローン化した。配列解析によって確認した後、正しい方向性のプラスミドを選択した。HpaI部位を導入すると、遺伝子間配列中の２つのヌクレオチドが変化した。そこで、遺伝子間配列を下記のプライマー（配列番号32-33；5'AACAACTGGCAACACTTCTC3'と5'AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3'）を用いた部位特異的な遺伝子変異によって回復させた。配列解析によって確認した後、正しい遺伝子間配列を有するプラスミドを選択し、pGEM-GNLと名付けた。G, NとLを含んでいるXhoI断片を切断し、pSAD-PMGのXhoI部位にクローン化し、N遺伝子が第４位置にある全長の狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-N4と名付けたが、それは、N遺伝子が狂犬病ウイルスゲノムに沿ってGとL遺伝子の間に位置する以外には、正しい狂犬病ウイルス全長配列を含むであろう。
N遺伝子が移動したこれらのウイルスを選択するために、全長ウイルスゲノムを含むこれらのプラスミドを、既に述べた様に（Wu et al., 2001; Schnell et al., 2000）、pTIT-N, pTIT-PとpTIT-Lと共に個々にBSR T7/5細胞中へトランスフェクトした。細胞に新鮮培地を補充し、上清を新鮮なBSR細胞に移す前に更に３週間培養した。感染して２日後、FITCと結合させた抗狂犬病ウイルスN抗体を用いてウイルスを検出した。細胞が陽性に染色されると、感染性を有するウイルスを得るのに成功したことを示唆する。これらのウイルスを、L16N2G333, L16N3G333およびL16N4G333と名付けた。このウイルスを増殖させ、BHK細胞またはBHK-N細胞のいずれかの中で更に解析した。
これらの位置の変更が起こったウイルスを更に解析するために、各々のウイルスによってBSR細胞を1のmoiで感染させることにより、これらのウイルスの増殖曲線を測定した。比較のためにL16G333を含めた。１時間吸着させた後にウイルス接種材料を除去し、細胞をPBSで３回洗浄した。そして新鮮培地を添加する。感染してから6、12、18、24、36、60と72時間後に一定量を採り、述べられた様にウイルス力価測定に使用した（Wu et al., 2001）。この実験を３回繰り返し、各ウイルスの平均力価を用いて比較した。Nが移動したウイルスにおいてウイルス複製速度が低下しているか比較するために、BSR細胞をL16G333またはNの移動が起こった各々のウイルスにより1のmoiで感染させ、既に述べられた方法を用いて（Wu et al., 2001）、全RNAを単離するために感染してから40時間後に回収した。RNA調製物中のウイルスのゲノムRNAと転写産物を、N（Fu et al., 1991）とG（Fu et al., 1993）のcDNAの両者から作られたプローブを使用し、ノザンブロットハイブリダイゼーションによって解析した。RNAバンドのデンシトメトリーまたはホスホイメージングによってRNAの定量を行った。代わりに、これらのウイルスによって感染したBSR細胞を、VSVについて既に述べられた様に（Wertz et al., 1998）、アクチノマイシンD（5μl/ml）の存在下で[3H]ウリジン（33μCi/ml）を用いて代謝により標識化した。RNA抽出のために細胞を回収した。ゲル電気泳動によってRNAを解析してデンシトメトリーによって定量化した。５つの転写産物とゲノムRNAの間でモル比を測定し、これらのウイルス間で比較した。
ウイルス成長曲線の研究により、これらのウイルスの収量はL16G333、L16N2G333、L16N3G333とL16N4G333の順番であることが示された。VSV Nを移動させた研究では、野生型VSVウイルスと比較した時に、N4ウイルスではウイルス収量は4対数単位も低下することが見出された（Wertz et al., 1998）。L16G333と比較した時には、L16N4G333のウイルス収量は4対数単位も低下した。ノザンブロットハイブリダイゼーションと[3H]ウリジン標識化により、L16G333と比較した時には、Nに移動があるウイルスにおけるウイルス複製（ゲノムRNA）の速度は低下し、L16N4G333は最も低いことが示された。更に、5つのウイルス転写産物の間でモル比は変化し、その変化はウイルスゲノムに沿った相対的な位置に依存していた。L16G333について転写産物の量はN>P>M>G>Lであり、L16N2G333についてはP>N>M>G>Lであり、L16N3G333についてはP>M>N>G>Lであり、L16N4G333についてはP>M>G>N>Lであった。これらのデータは共に、狂犬病ウイルスゲノムの中でNを移動させることにより狂犬病ウイルスの複製速度は低下し、それはNに移動があるウイルスが弱毒化する結果となることを示している。これらのNが移動したウイルスにおいてGの333番目のアルギニンに変異が導入されているため、これらのNが移動したウイルスは複製速度が低下しているのみならず、神経系へ侵入する能力も低下しているであろう。Nが移動した狂犬病ウイルスは、もし十分に弱毒化したならば、Nに移動があるウイルスにおいて作製された変化は非可逆的であるはずであるので、N変異体ウイルスに対して利点を有するであろう（Wertz et al., 1998）。それに対して、リン酸化部位における点変異（Wu et al., 2002）では毒性の遺伝子型へ復帰するかもしれない。これらのNに移動があるウイルスのいずれかが、もはや脳内（i.c.）接種（下を見よ）で新生マウスにおいて病気を引き起こさないならば、それは無毒の狂犬病ウイルスワクチンとしての潜在性を有するであろう。
（Nに移動があるウイルスの毒性の測定）
Nに移動がある狂犬病ウイルスの毒性を測定するために、2つの年齢の群（新生児の動物と5から6週齢のマウス）を選択した。比較のためにL16G333を含めた。L16G333は脳内接種で新生マウスに病気を誘発するが、年長のマウスではそうではない（Schumacher et al., 1993）。試験するべきウイルスは、L16G333、L16-N2G333、L16-N3G333、L16-N4G333を含めて4つである。各ウイルスについて3つの用量（105, 106と107ffu）を試験した。この実験のために、5から6週齢のICRマウス（各群10匹）を全部で12群必要とした。コントロールとして別の群を含めた。脳内接種により、望む用量を含む10μlで動物を感染させた。コントロール群として10μlの生理食塩水をマウスに脳内経路によって注射した。20日間の間、ラフ・ファー（ruff fur）、運動失調、麻痺などの狂犬病の臨床的な徴候について動物を毎日2回観察した。瀕死のマウスと実験が終了したマウスを炭酸ガス吸入により安楽死させた。各群の致死率を記録し、スチューデントT検定又はX2試験を用いて統計学的に解析した。
新生児の動物におけるこれらウイルスの毒性を試験するために、この実験において全部で12腹の同腹ICRマウスを必要とした。それぞれの同腹の子を１つのウイルスに感染させた。コントロールとして別の同腹の子を含めた。１日齢の新生児の動物を、各ウイルスを望みの用量で含んでいる10μlを用いて脳内接種により感染させた。コントロール群においては新生児のマウスに脳内経路で10μlの生理食塩水を注射した。死亡した同腹の子がいるか、動物を20日間の間毎日2回観察した。実験終了時に生き残ったマウスは炭酸ガス吸入により安楽死させた。各群の致死率を記録してスチューデントT検定又はX2試験を用いて統計学的に解析した。各同腹の子の致死率を記録し、スチューデントT検定又はX2試験を用いて統計学的に解析した。
L16G333は5から6週齢のマウスでは病気を引き起こさなかった。Nに移動があるウイルスにおいて、毒性の順序はL16G333>L16N2G333>L16N3G333>L16N46G333の順番であった。これらのウイルスはGの333番目のアルギニンに変異を有するために、それらは5から6週齢マウスに病気を引き起こすはずはないが、新生児の動物においては引き起こす可能性がある。VSVによる研究において、N4ウイルスの複製速度は大きく低化することが示され（Wertz et al., 1998）、L16-N46G333の複製速度も劇的に変わるかもしれない。L16-N46G333もGの333番目のアルギニンに変異を有するが、その複製速度が低下しているのみならず、神経系内において伝播する能力も低下しているであろう。そこで、それは新生児の動物において病気を引き起こすかもしれない。もしこれがそのケースであるならば、L16-N4G333は無毒の狂犬病ウイルスワクチンとして開発される潜在性を有するであろう。L16N2G333とL16N3G333も新生児の動物において無毒であるが、そのために、それらを無毒の狂犬病ウイルスワクチンとして開発することもできるであろう。
（Nに移動がある狂犬病ウイルスの免疫原性の測定）
これらのNに移動があるウイルスの免疫原性を測定するために、成熟したマウスを選択した。試験するべきウイルスは、L16G333、L16N2G333、L16N3G333、L16N4G333を含めて4つである。各ウイルスについて3つの用量（105, 106と107ffu）を試験し、防御免疫を刺激するウイルスの最小用量を測定した。3つの接種経路、即ち筋肉内（i.m.）、皮内（i.d.）、皮下（s.c.）の経路について各ウイルス用量を使用した。この実験には全部で36群のICRマウス（各群10匹）を必要とした。他の群をコントロールとして含めた。望みの用量のウイルスを含む50μlにより動物を、i.m.、i.d.またはs.c.により免疫した。コントロール群のマウスはワクチン接種しないままとした。マウスを出血させ、免疫して1, 2, 3および4週間後にVNA（Hable, 1996; Briggs et al., 1996）を測定した。最後の出血の後、述べられた（Fu et al., 1991）ようにして、マウスの後肢に10 MIMLD50（i.m.の50%マウス致死量）CVS-24ウイルスを筋肉内（i.m.）投与した。20日間の間、神経症状の進展と死亡について動物を毎日2回観察した。各群の動物について致死率を記録し、統計学的に解析した。
Nに移動がある狂犬病ウイルスは全てこれらのパレンタルな（parental）免疫経路によって免疫反応を引き起こすことが可能であった。これらのウイルスはいずれも、表層的な免疫経路によっては、成熟したマウスにおいては病気を引き起こさないであろう。L16G333によって免疫されたマウスにおいて発展したウイルス中和抗体（VNA）力価は、Nに移動があるウイルスによって免疫された場合よりも高いかもしれない。複製速度が異なるために、VNAのレベルはL16G333>L16N2G333>L16N3G333>L16N4G333の順番であるかもしれない。これらのNに移動があるウイルスによって誘導されたウイルス中和抗体（VNA）は類似しているかもしれない。これらウイルスのうちのいずれかによって免疫することは、感染に対する防御に至るかもしれない。L16G333と同等のウイルス中和抗体（VNA）を誘導し100％の防御を与えるが、新生児の動物において病気を誘導せず、インビトロ細胞培養において最も良く生育するウイルスが選択され、アライグマ、イヌなどの標的動物種又はヒトにおいてさえ更に試験を行う。
Nのリン酸化部位に変異があるウイルスについて言えば、VSVについて報告されている（Wertz et al., 1998）ように、Nに移動があるウイルスは複製速度が低下しているので細胞培養において良く生育しないかもしれない。これらのウイルスは、リン酸化されたNを安定して発現しているBHK-N細胞中で生育する。複製速度の低下は感染した細胞中でNのレベルが減少していることによるために（Wertz et al., 1998）、BHK-N細胞中でNを補給するとこれらNに移動があるウイルスのウイルス収量が増加する。
Pの末端から、PとMの間の遺伝子間配列、M転写産物の始まりまでに渡る配列と、Mの末端、MとGの間の遺伝子間配列、G転写産物の始まりまでに渡る配列が類似しているために、pSAD-PMGのP-MとM-G連結部に特異なHpaI部位を挿入することは困難であるかもしれない。そこで、PCR反応におけるアニーリング温度を変化させ、多くのクローンをスクリーニングし、更にクローニングするために望む変異のみを選択した。
VSVについて報告された様に、N4は、VSVゲノムに沿ってNが第４の位置にある変異体ウイルスであるが、高い用量を接種した時にはマウスにおいてなお病気と死亡を引き起こす(Wertz et al., 1998)。位置が移動したNを有する狂犬病ウイルスが依然として残存毒性を有するならば、Nのリン酸化部位においてセリンをアラニンに変異させ、移動したNを有するウイルスを更に弱毒化する。もし、Nに移動を有するウイルスによって誘導された免疫反応が低く、それがそれらのウイルスにおいて複製速度が大きく低下しているためであるならば、防御的なウイルス中和抗体を誘導する唯一の抗原であるGの発現が増加したウイルスを構築する（Cox et al., 1977）。これは、狂犬病ウイルスゲノム中で遺伝子を入れ替えることにより達成される。
（狂犬病ウイルスゲノム中で遺伝子を入れ替えることによる非毒性狂犬病ウイルスの構築、及びこれらの入れ替えを行った狂犬病ウイルスの毒性と免疫原性の測定）
VSVゲノムに沿ってN遺伝子を移動させるのに加えて、VSVゲノムの中で遺伝子の入れ替えを行うことによってもVSVの遺伝子型は変異した（Ball., 1999）。入れ替えられたVSVのいくつかは野生型と比較してより毒性がより強かったが、他の入れ替えられたVSVは細胞培養において増殖が低下し、動物における毒性も低下していた（Ball., 1999）。最も重要なことには、Gを第４の位置から第１の位置に移動させると、ウイルスが弱毒化するのみならず、動物において免疫反応の加速と促進が起こった（Flanagan et al., 2000）。そこで、狂犬病ウイルスゲノム中の狂犬病ウイルスの遺伝子を入れ替えることにより、特にGを第４の位置から第１の位置に移動してP, MとG遺伝子を入れ替えることにより、無毒の狂犬病ウイルスが構築された。加えて、入れ替えが行われたすべての各ウイルス中に333番目のアルギニンにおける変異が導入され、狂犬病ウイルスは更に弱毒化した。
（ウイルスゲノム中で狂犬病ウイルスを入れ替えることによる無毒な狂犬病ウイルスの構築）
狂犬病ウイルスゲノム中で遺伝子を入れ替えるために、N遺伝子の移動に使用した方法は以下の様である。第１の位置にGを有する狂犬病ウイルスを構築するために、プラスミドpGEM-GHLとpSAD-L16G333XhoIを使用した。最初にプラスミドpSAD-L16G333XhoIから、N, PとM遺伝子を除去した。二つのプライマー（配列番号34と19：5'ACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3'と5'CATTTTTGCTTTGCAATTGAC AATGTC3'）を合成し、Pfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼを用いたPCR反応において使用した（Lundberg et al., 1991）（ストラタジーン）。これらの２つのプライマーは7.3kbの断片を増幅し、N転写産物のまさに始めからMとGの間の遺伝子間配列まで、N, PとM遺伝子が欠損する結果となった。増幅された断片中でPfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼは平滑末端（Lundberg et al., 1991）を作製し、そのために自己連結する。変異連結部において連結されたプラスミドの配列を決定し、G mRNAのリーダー配列と開始配列において偽の変異がないことを確認した。得られたプラスミドをpSAD-L16Gと名付けた。Gが第１の位置にあると共に、Nが第２の位置（G1N2）、第３の位置（G1N3）、または第４の位置（G1N4）にあるという３つの狂犬病ウイルスクローンを構築した。G1N2クローンを構築するために、N転写産物の始めからMの遺伝子間配列（3.2kb）までを、pSAD-L16G333XhoIからPfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼを用いて、プライマ−（配列番号22と35；5'ACACCCCTACAATGGATGCCG3'と5'ATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3'）により増幅した。増幅された断片を、pGEM-GHLのHpaI部位へクローン化した。配列解析によって確認した後、正しい方向性を有しているプラスミドを選択した。そして遺伝子間配列をプライマー（配列番号36-37；5'AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3'と5'GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3'）を使用した部位特異的な遺伝子変異により回復させた。配列解析によって確認した後、正しい遺伝子間配列を有するプラスミドを選択し、pGEM-GNMPLと名付けた。最後にpGEM-GNMPL由来のXhoI断片をpSAD-G中にクローン化し、G遺伝子が第１の位置にクローン化された全長の狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-L16G1N2G333と名付けた。
G1N3クローンを構築するためにP転写産物の始めからMの遺伝子間配列（3.2kb）まで、P,NおよびM遺伝子を、特異的な照準2において構築したように、Pfu DNAポリメラーゼを用いてプライマー（配列番号38-39：5'ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3'と5'ATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3'）によってpSAD-PNMGから増幅した。また特異的な照準2において構築したように、増幅した断片をpGEM-GHLのHpaI部位にクローン化した。配列解析によって確認した後に方向性が正しいプラスミドを選択した。そして、遺伝子間配列を、プライマー（配列番号40と37：5'AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3'と5'GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3'）を用いた部位特異的変異生成により、遺伝子間配列を復帰させた。配列解析によって確認した後、訂正された遺伝子間配列を有するプラスミドを選択してpGEM-GPNMLと名付けた。最後にpGEM-GPNML由来のXhoI断片をpSAD-Gへクローン化し、G遺伝子が第１の位置に、Nが第３の位置にクローン化された全長狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-L16G1N3G333と名付けた。
G1N4クローンを構築するために、P転写産物の始めからNの遺伝子間配列（3.2kb）まで、P,NおよびM遺伝子を、Pfu Turbo DNAポリメラーゼを用いてプライマー（配列番号38と23：5'ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3'と5'GTTTTTTTCATGATGGATATACAC3'）によってpSAD-PMNGから増幅し、pGEM-GHLのHpaI部位にクローン化した。配列解析によって確認した後、方向性が正しいプラスミドを選択した。そして、遺伝子間配列をプライマー（配列番号36-37：5'AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3'と5'GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3'）を用いた部位特異的変異生成により、遺伝子間配列を復帰させた。配列解析によって確認した後、訂正された遺伝子間配列を有するプラスミドを選択し、pGEM-GPMNLと名付けた。最後にpGEM-GPMNL由来のXhoI断片をpSAD-Gへクローン化し、G遺伝子が第１の位置に、Nが第４の位置にクローン化された全長狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-L16G1N4G333と名付けた。
野生型ウイルス（P-M-G）に加えて、狂犬病ウイルスゲノムの中でP,MとG遺伝子を入れ替えるために、5つの組み合わせ（P-G-M, M-P-G, M-G-P, G-M-PとG-P-M）が可能である。M-P-G, M-G-PとP-G-Mを構築するために、プラスミドpGEM-XhoIとpSAD-L16G333XhoIを使用した。最初にプラスミドpSAD-L16G333XhoIからP遺伝子を除去する。2つのプライマー（配列番号41-42：5'ACACCACTGATAAAATGAACCTCC3'と5'GTTTTTTTCATGATGGATATAGAG3'）を合成し、Pfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼ（ストラタジーン）を用いたPCR反応で使用した。これらの２つのプライマーは9.5kbの断片を増幅し、P転写産物のまさに始めからPとMの間の遺伝子間配列まで、P遺伝子が欠損する結果となった。Pfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼは増幅された断片中で平滑末端（Lundberg et al., 1991）を作り、そのために自己結合する。変異接合部において結合したプラスミドの配列を決定し、Nの3非翻訳配列、Nの遺伝子間配列、およびMのmRNAの開始配列中に偽の変異を有さないことを確認した。得られたプラスミドをpSAD-NMGと名付けた。
N-M-P-G-Lの順番に遺伝子を入れ替えるために、pSAD-NMG上のMとGの間の遺伝子接合部において特異なHpaI制限部位（GTTAAC）を作った。これは、N遺伝子の移動について述べたのと同様にして、プライマー（配列番号26-27：5'GATGTGAAAAAAACTGTTAACATCCCTC3'と5'AGGGATGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3'）を使用した部位特異的変異生成により行われた。この変異を配列解析によって確認しプラスミドをpSAD-NMHGと名付けた。最後に全P遺伝子を、遺伝子間配列の転写産物の始めから、Pfu Turbo DNAポリメラーゼを用いてプライマー（配列番号18と43：5'ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3'と5'CCTGTTTTTTTCATGTTGACTTTGGG3'）により増幅し、pSAD-NMHGのHpaI部位にクローン化した。配列解析によって確認した後、方向性が正しいプラスミドを選択した。下記のプライマー（配列番号24-25：5'ATGGAAAAAAACAGGCAACTG3'と5'AGTTGCCTGTTTTTTTCCATG3'）を使用した部位特異的変異生成により遺伝子間配列を復帰させた。配列解析によって確認した後、遺伝子間配列が訂正されたプラスミドを選択し、pSAD-NMPGと名付けた。最後にpGEM-XhoI由来のXhoI断片をpSAD-NMPGへクローン化し、P遺伝子がMとG遺伝子の間にクローン化された全長狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-L16MPGと名付けた。
N-M-G-P-Lの順番に遺伝子を入れ替えるために、上記において述べたように増幅された全P遺伝子を、pGEM-GHLの特異なHpaI部位へクローン化した。配列決定によって確認した後に方向性が正しいプラスミドを選択した。そして遺伝子間配列を、プライマー（配列番号32-33：5' AACAACTGGCAACACTTCTC3'と5'AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3'）を用いた部位特異的変異生成によって回復させた。配列解析によって確認した後、訂正された遺伝子間配列を有するプラスミドを選択し、pGEM-GPLと名付けた。pGEM-GPL由来のXhoI断片を切断し、pSAD-NMGのXhoI部位へクローン化し、P遺伝子がGとL遺伝子の間にクローン化された全長狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-L16MGPと名付けた。
N-P-G-M-Lの順番に遺伝子を入れ替えるために、クローンpSAD-L16G333XhoIからM遺伝子を削除した。二つのプライマー（配列番号44と43：5'ACATCCCTCAAAGACTCAAGG3'と5'CCTGTTTTTTTCATGTTGACTTTGG3'）を合成し、Pfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼ（Lundberg et al., 1991）（ストラタジーン）を用いてPCR反応を行った。これら２つのプライマーは9.5kbの断片を増幅し、M転写産物のまさに最初からMとGの間の遺伝子間配列まで、M遺伝子が欠損するという結果となった。Pfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼは増幅された断片中で平滑末端を作製し（Lundberg et al., 1991）、そのためにPCR断片は自己結合できる。変異連結部において結合したプラスミドの配列を決定し、Pの3非コード配列、遺伝子間配列、およびGのmRNAの開始配列中に偽の変異を有さないことを確認した。得られたプラスミドをpSAD-NPGと名付けた。全M遺伝子をプライマー（配列番号45-46：5'AACACCACTGATAAAATGAACCTCC3'と5'AATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3'）を用いて増幅し、pGEM-GHLの特異なHpaI部位へクローン化した。配列解析によって確認した後、方向性が正しいプラスミドを選択した。そして、プライマー（配列番号32-33：5'AACAACTGGCAACACTTCTC3'と5'AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3'）を用いた部位特異的変異生成によって遺伝子間配列を復帰させた。配列決定によって確認した後、訂正された遺伝子間配列を有するプラスミドを選択し、pGEM-GMLと名付けた。pGEM-GML由来のXhoI断片を切断し、pSAD-NPGのXhoI部位へクローン化し、M遺伝子がGとL遺伝子間にクローン化された全長狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-PGMと名付けた。
G-M-PとG-P-Mを構築するために、プラスミドpGEM-GMLとpSAD-L16G333XhoIを使用した。最初にクローンpSAD-L16G333XhoIからPとM遺伝子を除去した。プライマー（配列番号34と42：5'ACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3' と5'GTTTTTTTCATGATGGATATAGAG3'）を合成し、Pfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼ（Lundberg et al., 1991）（ストラタジーン）を用いたPCR反応において使用した。これら２つのプライマーは8.5kb断片を増幅し、P転写産物のまさに始めからMとGの間の遺伝子間配列までPとM遺伝子が欠損するという結果となった。Pfu Turbo Hotstart DNAポリメラーゼは平滑末端を作製し（Lundberg et al., 1991）、増幅された断片は自己結合することができる。変異連結部において結合したプラスミドの配列を決定し、N配列の3末端、遺伝子間配列、およびGのmRNAの出発配列において偽の変異がないことを確認した。得られたプラスミドをpSAD-NGと名付けた。
N-G-M-P-Lの順番に遺伝子を入れ替えるために、pGEM-GML上のMとL遺伝子の間に特異なHpaI部位を作製した。二つのプライマー（配列番号47-48）を合成し（5'GATGTGAAAAAAACTGTTAACACTTCTC3'と5'AGAAGTGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3'）、Pfu DNAポリメラーゼを用いたPCRに使用した。配列解析によって変異を確認し、そのプラスミドをpGEM-GMHLと名付けた。そして前記で述べたようにして増幅した全P遺伝子をpGEM-GMHLのHpaI部位にクローン化した。配列解析によって確認した後、方向性が正しいプラスミドを選択した。そして、プライマー（配列番号49-50：5'GATGTGAAAAAAACTATTAACACCC3'と5'GGTGTTAATAGTTTTTTTCACATCC3'）によって遺伝子間配列を復帰させた。配列解析によって確認した後、方向性が正しいプラスミドをpGEM-GMPLと名付けた。pGEM-GMPLからXhoI断片を切断してpSAD-NGのXhoI部位へクローン化し、遺伝子の順序がN-G-M-P-Lである全長狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-L16GMPと名付けた。
N-G-P-M-Lの順番に遺伝子を入れ替えるために、pGEM-GML上のGとM遺伝子の間に特異なHpaI部位を作製した。二つのプライマー（配列番号51-52）を合成し（5'AGAAGAACAACTGTTAACACCACTG3'と5'AGTGGTGTTAACAGTTGTTCTTCTG3'）、PCRに使用した。配列決定によって変異を確認し、そのプラスミドをpGEM-GHMLと名付けた。そして前記で述べたようにして増幅した全P遺伝子を、pGEM-GHMLのHpaI部位にクローン化した。配列解析によって確認した後、方向性が正しいプラスミドを選択した。そしてプライマー（配列番号53-54：5'AGAAGAACAACTAAGAACACCACTG3'と5'AGTGGTGTTCTTAGTTGTTCTTCTG 3'）を用いた部位特異的変異生成によって遺伝子間配列を回復しなければならなかった。配列解析によって確認した後、方向性が正しいプラスミドをpGEM-GPMLと名付けた。最終的にpGEM-GPMLからXhoI断片を切断し、pSAD-NGのXhoI部位へクローン化し、遺伝子の順序がN-G-P-M-Lである全長狂犬病ウイルスクローンを作製した。このプラスミドをpSAD-L16GPMと名付けた。
入れ替えが行われた狂犬病ウイルスを選択するために、述べられたように（Schnell et al., 2000）、遺伝子が入れ替えられたこれらのプラスミドを個々に、pTIT-N, pTIT-PとTIT-Lと共にBSR T7/5細胞にトランスフェクトした。細胞に新鮮な培地を供給し、上清を新鮮なBSR細胞に移す前に更に3日間培養した。感染して2日後、FITCと結合した抗狂犬病ウイルスN抗体によってウイルスを検出した。細胞の染色が陽性であることは、感染性を有するウイルスを得ることに成功したことを示している。これらのウイルスをそれぞれL16G1N2G333, L16G1N3G333, L16G1N4G333, L16GMPG333, L16MGPG333, L16PGMG333, L16GPMG333とL16MPGG333と名付けた。そのウイルスを増殖させ、BHK細胞またはBHK-N細胞のいずれかにおいて更に解析を行った。
これらの入れ替えが行われたウイルスを更に解析するために、BSR細胞を各ウイルスによって1のmoiで感染させることにより、これらのウイルスの成長曲線を測定した。比較のためにL16G333を含めた。吸着して1時間後にウイルスの接種材料を除去し、細胞をPBSで3回洗浄した。そして新鮮な培地を添加する。感染して6, 12, 18, 24, 36, 60と72時間後、培養培地から一定量を採取し、述べられたようにウイルス力価測定に使用した（Wu et al., 2001）。この実験を3回繰り返し、各ウイルスについての平均力価を使用して比較した。これらの入れ替えが行われたウイルスにおいてウイルス複製速度が低下しているかを測定するために、BSR細胞を1 ffu/細胞のmoiで感染させ、感染して40時間後に回収し、述べられた方法を用いて全RNAを単離した（Wu et al 2001）。RNA調製物中のウイルスのゲノムRNAと転写産物の両者を、Nから作られたプローブ（Fu et al.,1991）とGのcDNA（Fu et al.,1993）を用いたノザンブロットハイブリダイゼーションによって解析した。RNAバンドのデンシトメトリーまたはホスホイメージングにより、RNAの定量を行った。代わりにこれらのウイルスによって感染したBSR細胞を、VSVについて述べたように（Wertz et al., 1998）、アクチノマイシンDの存在下（5μCi/ml）で[3H]ウリジン（33μCi/ml）を用いて代謝によって4時間標識した。そして細胞を回収し、RNA抽出を行った。ゲル電気泳動によってRNAを解析し、デンシトメトリーによって定量化した。5つの転写産物の間のモル比とゲノムRNAをデンシトメトリーによって測定し、5つのウイルス間で比較した。
G遺伝子が第１の位置へ移動した変異体狂犬病ウイルスを構築して選択した。加えてこれらのウイルスは、Gの333番目のアルギニンにも変異を有していた。これらの変異体ウイルスにおける遺伝子の順序をRT-PCRによって確認した。ウイルス成長曲線の研究により、ウイルスの収量はL16G333, L16G1N2G333, L16G1N3G333とL16G1N4G333の順番であることが示された。同様にノザンブロットハイブリダイゼーションと[3H]ウリジン標識により、ウイルス複製の速度（ゲノムRNA）はL16G333において最も高く、続いてL16G1N2G333, L16G1N3G333とL16G1N4G333であることが示された。更に、5つのウイルス転写産物の間のモル比は、ウイルスゲノムに沿ったこれらの遺伝子の相対的な位置に依存して変化した。転写産物の量は、L16G333についてはN>P>M>G>L、L16G1N2G333についてはG>N>P>M>L、L16G1N3G333についてはG>P>N>M>L、L16G1N4G333についてはG>P>M>N>Lの順序であった。これらの入れ替えられたウイルス中には333番目のアルギニンにおけるGの変異が導入されているから、これらのウイルスは複製速度が低下しているのみならず、神経系に侵入する能力も低下している。
狂犬病ウイルスゲノム中でP, MとG遺伝子の入れ替えが行われた変異体狂犬病ウイルスも構築され、選択された。加えてこれらの入れ替えが行われたウイルスも333番目のアルギニンにおいてGの変異を有していた。これらの変異体ウイルスにおける遺伝子順序をRT-PCRで確認した。もし組み替えられたVSVの結果が指標となるならば（Ball et al., 1999）、ウイルス成長曲線の研究によりこれらのいくつかのウイルス（L16MPGG333, L16MGPG333とL16PGMG333）の収量は、L16G333の収量より高いことが示された。他の入れ替えが行われたウイルス（L16GPMG333とL16GMPG333）におけるウイルス収量は、L16G333の収量より低かった。同様にノザンブロットハイブリダイゼーションと[3H]ウリジン標識化により、L16G333と比較して、L16MPGG333, L16MGPG333とL16PMGG333におけるウイルスの複製速度（ゲノムRNA）は増加し、一方、L16GPMG333とL16GMPG333におけるウイルスの複製速度（ゲノムRNA）は低下することが示された。更に、5つのウイルス転写産物の間のモル比は、ウイルスゲノムに沿ったこれらの遺伝子の相対位置に依存して変化した。転写産物の量はL16G333においてはN>P>M>G>Lの順番であり、L16MPGG333についてはN>M>P>G>Lであり、L16MGPG333についてはN>M>G>P>Lであり、L16PMGG333についてはN>P>M>G>Lであり、L16GPMG333についてはN>G>P>M>Lであり、L16GMPG333についてはN>G>M>P>Lである。これらの入れ替えが行われたウイルスには333番目のアルギニンにおけるGの変異が導入されているから、これらのウイルスは複製速度が低下しているのみならず神経系へ侵入する能力も低下している。
（これらの入れ替えが行われた狂犬病ウイルスの毒性の測定）
これらの入れ替えが行われたウイルスの毒性を測定するために、2つの年齢の群（新生児の動物と5から6週齢）のマウスを選択した。9つのウイルスを試験し、それにはL16G333、L16G1N2G333, L16G1N3G333, L16G1N4G333, L16-PGMG333, L16-GPMG333, L16-GMPG33, L16-MGPG333とL16-MPGG333が含まれる。各ウイルスについて3つの用量（105, 106と107 ffu）を試験した。この実験には、5から6週齢のICRマウスを27群（各群10匹）必要とした。他の群をコントロールとして含めた。望みの用量を含む10μlを脳内（i.c.）接種することにより動物を感染させた。コントロール群について、脳内（i.c.）経路により10μlの生理食塩水をマウスに注射した。20日間の間、ラフ・ファー（ruff fur）運動失調、麻痺などの狂犬病の臨床的な徴候について動物を毎日2回観察した。瀕死のマウスと実験が終了したマウスを炭酸ガス吸入により安楽死させた。各群の致死率を記録し、スチューデントT検定又はX2試験を用いて統計学的に解析した。
新生児の動物におけるこれらのウイルスの毒性を試験するために、この実験において全部で27腹の同腹ICRマウスを必要とした。それぞれの同腹の子を一種類のウイルスの各用量で感染させた。コントロールとして別の同腹の子を含めた。１日齢の新生児の動物を、各ウイルスを望みの用量で含んでいる10μlを用いた脳内接種により感染させた。コントロール群においては、新生児のマウスに脳内経路で10μlの生理食塩水を注射した。死亡した同腹の子がいるか、動物を20日間の間毎日2回観察した。実験終了時に生き残ったマウスを炭酸ガス吸入により安楽死させた。各同腹の子の致死率を記録し、スチューデントT検定又はX2試験を用いて統計学的に解析した。
L16G333は5から6週齢の動物においては病気を引き起こさなかった。しかし、新生児の動物においては病気の徴候を引き起こすかもしれない。Gが第１の位置に移動したウイルス、すなわちL16G1N2G333, L16G1N3G333とL16G1N4G333による感染は、これらのウイルスは全て333番目のアルギニンがグルタミン酸に変異しているため、5から6週齢の動物においては病気を引き起こさなかった。Ballら（Ball et al., 1999）は、P,MとGの入れ替えが行われたVSVの病原性は、細胞培養における複製速度と対応していないと報告している。これらのウイルスでL16G333より毒性が低いものだけを、抗原性と免疫原性のために更に試験した。
（組み替えが行われたこれら狂犬病ウイルスの免疫原性の測定）
組み替えが行われたこれら狂犬病ウイルスの免疫原性を測定するために、成熟したネズミを選択した。9つのウイルスを試験し、それにはL16G333、L16G1N2G333, L16G1N4G333L, L16-PGMG333, L16-GPMG333, L16-GMPG33, L16-MGPG333とL16-MPGG333が含まれる。各ウイルスについて3つの用量（105, 106と107 ffu）を試験し、これによって防御免疫を刺激することができる最小用量のウイルスを測定する。再び、筋肉内（i.m.）、皮内（i.d.）、皮下（s.c.）の３つの経路を使用して接種した。この実験には、全81群（各群10匹）のICRマウスを必要とした。他の群をコントロールとして含めた。筋肉内、皮内または皮下により望みの用量のウイルスを含む50μlで動物を免疫した。コントロール群のマウスはワクチン接種しないままにした。免疫して1、2、3と4週間後に、マウスを出血させてウイルス中和抗体（VNA）を測定した（Hable, 1996; Briggs et al., 1996）。ウイルス中和抗体（VNA）の発達を全ての群のマウスの間で、相互作用を有する分散の2方向解析を用いた統計学的な解析（Littell et al.,1996）により比較した。免疫を行って4日後、述べられたように（Fu et al.,1991）、マウスの後肢に10 MIMLD50（筋肉内投与の50％致死量）のCVS-24ウイルスを投与した。神経的な症状の進行について、20日間の間動物を毎日2回観察した。動物を毎日2回観察し、致死率を記録して各群の動物について統計学的な解析を行った。
全ての変異体狂犬病ウイルスはこれらのパレンタルな（parental）免疫経路によって免疫反応を引き起こすことが可能であった。これらのウイルスはいずれも表層的な免疫化経路によって成熟したマウスに病気を引き起こすことはなかった。Gが第１の位置にあるこれらのウイルスによって免疫したマウスは、L16G333およびGが他の位置に入れ替えられたウイルスによって免疫されたマウスよりも、ウイルス中和抗体（VNA）反応がより早く、より高く進展するかもしれない。中枢神経系の感染を防御するために、入ってきたウイルスを中和には迅速な免疫反応が必要であるから、これは感染後処理にとって非常に重要かもしれない。入れ替えが行われたウイルスが、ウイルス中和抗体（VNA）力価をL16G333に匹敵する程に、あるいはそれ以上に誘導し、有毒な狂犬病ウイルスの感染から免疫された動物を100％保護し、なおも脳内投与（i.c.、上記を見よ）で新生児の動物において何の病気も引き起こさないならば、そのウイルスは、アライグマ、イヌのような標的動物種において、又はヒトにおいてさえも、異なった免疫経路により無毒な狂犬病ウイルスワクチンとして試験されるであろう。
リン酸化セリン（S）を、アラニン（A）、グリシン（G）、アスパラギン酸（D）、アスパラギン（N）、グルタミン酸（E）、およびグルタミン（Q）に変異させたN変異体の効果を、得られたウイルスのみならず、ミニゲノムにおけるウイルス転写と複製を試験することにより検討した。これらの検討結果は、Nがリン酸化されないときにはウイルスの転写と複製は両者とも低下し、それは、狂犬病ウイルスの転写と複製の調節においてNリン酸化が重要な役割を果たしていることを示している。更にこれらの結果は、ウイルスの転写と複製におけるNがリン酸化の効果は、リン部分の正味の負電荷とセリン残基の構造の組み合わせに依ることを示している。
この中で本発明を種々の特異的な材料、方法および実施例を参照することにより記載し、かつ述べてきたが、本発明は材料における特定の材料の組み合わせ、そしてその目的のために選択された手法に限定されるものではないことを理解するべきである。そのような細部な多くの改変が含有されるが、それは当業者によって認められるものであろう。
下記は上記の開示、および、特に実験方法と議論に関連する文献のリストである。この文献全体が参考文献として取り入れられたものと考慮されるべきである。
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図１は、Nリン酸化がミニゲノム中でウイルスのRNA転写に影響することを示す図である。BSR細胞を組み換えワクチニアウイルスvTF7-3によって感染させ、そして、pRN(RN), pRN-SA(SA), pRN-SG(SG), pRN-SD(SD), pRN-SN(SN), pRN-SE(SE)またはpRN-SQ(SQ)と共に、プラスミドpRP, pT7T-L, pSDI-CATによってトランスフェクトした。Nを発現していない他のプラスミド（-N）によってトランスフェクトた細胞を、コントロールとして含めた。Quan-T-CATアッセイによってCAT活性を測定するために細胞を回収した。エラーバー、標準偏差。 図２は、狂犬病ウイルスNリン酸化はウイルスRNA転写と複製の両者に影響することを示す。図１に述べられたように、感染及びトランスフェクトを行ったBSR細胞を、ノザンブロットハイブリダイゼーションと免疫沈降のために回収した。メッセージRNAを全RNAから精製し、ポリクローナル抗N抗体によって免疫沈降したRNPからゲノムアナログを精製した。これらのRNA沈降物をCATcDNAプローブとハイブリダイズさせた。ミニゲノムを発現しているプラスミドから転写されたネガティブセンスRNAを測定するために、全RNAをセンスオリゴプローブとハイブリダイズさせた。細胞中で発現しているNタンパク質をポリクローナル抗N抗体によって免疫沈降した。 図３は、ウイルス転写産物に対するN濃度の影響を表す。BSR細胞を組み換えワクチニアウイルスvTF7-3によって感染させ、そしてpRN, pRN-SA(SA), pRN-SD(SD)またはpRN-SE(SE)と共に、プラスミドpRP, pT7T-L, pSDI-CATによってトランスフェクトした。種々の濃度（5, 10, 15と20μg）のNまたは変異体Nプラスミドを使用した。CATアッセイのために細胞を回収した。 図４は、BSR細胞中における野生型と変異体狂犬病ウイルスの成長曲線を表す。1 ffu/細胞の感染多重度（moi）で、野生型ウイルス（L16）及び変異体ウイルス（L16A, L16DまたはL16E）によりBSR細胞を感染させ、等量のウイルスを定められた時点において移してウイルスの力価測定にかけた。 図５は、狂犬病ウイルスNまたはGプローブのいずれかによるウイルス転写産物とゲノムRNAの検出を示す。L16A（A）, L16D（D）またはL16E（E）によって感染させたBSR細胞から調製した全RNAを、Nプローブ（左パネル）とGプローブ（右パネル）とハイブリダイズさせた。各々のmRNA、ゲノムRNA、および可能な読み過ごし（RT）転写産物及び／又は欠陥干渉（DI）RNAも示した。全RNAもβアクチンプローブとハイブリダイズさせた（下パネル）。野生型ウイルスとの関連におけるNとG転写産物とRNA産物の量を、デンシトメトリーによって定量した。 図６は、Nリン酸化もウイルス転写を制御することを示す。BSR細胞をL16A（A）, L16D（D）またはL16E（E）によって感染させ；1時間後にCHXなし（A）又はあり（B）のいずれかで処理し；全RNA単離のために定められた時点で回収した。RNAをNプローブとハイブリダイズさせた。各々のmRNA、ゲノムRNA、および可能な読み過ごし（RT）転写産物も示した。全RNAもβアクチンプローブとハイブリダイズさせた（下）。野生型ウイルスとの関連におけるN転写産物の量をデンシトメトリーによって定量した。 図７は、感染した細胞及び精製したビリオン中の、ゲノムRNAとアンチゲノムRNAの間の比率を定量したものを示す。感染した細胞または精製したビリオン由来の全RNAを、インビトロ転写によってpRNから調製したセンスプローブまたはアンチセンスリボプローブのいずれかとハイブリダイズさせた。ゲノムとアンチゲノムRNAのレベルをデンシトメトリーで測定した。 図８は、Nリン酸化の提唱されたモデルと、ウイルスの転写と複製におけるその機能を示す。Nは一度合成されると、P及び／又はLと相互作用する。この段階においてNはリン酸化されていない。Nと（カプシド化の）ゲノムRNAとの相互作用を通じてNの立体配座は変化し、それによってリン酸化部位が暴露される。一度Nがリン酸化されると、ゲノムRNAとNの間の電荷反発力は、ウイルスRNAの転写と複製の開始が起こるためにLがゲノム鋳型に接近することの助けとなる。 図９は、完全な狂犬病核酸配列を示す。（L16(塩基番号1235-1237)、Nタンパク質上でセリンをコードしているTCTを太字と下線で示した。）図９Ａは野生型L16配列（配列番号55）を示す。図９ＢはL16A配列（配列番号56）を示し、N配列上のセリンはアラニンに置換されている。図９ＣはL16Q配列（配列番号57）を示し、N配列上のセリンはグルタミンに置換されている。図９ＤはL16QG333配列（配列番号58）を示し、Nタンパク質上の塩基番号1235-1237においてセリンはグルタミンに置換され［TCTからCAA］（下線と太字で示す）、塩基番号4370-4372においてアルギニンはグルタミン酸に置換されている［AGAからGAA］（下線、太字、イタリック体で示す）。 図１０は、狂犬病ウイルスGタンパク質の核酸配列を示す。図１０Ａ（配列番号59）において333番目のアルギニンを下線で示す。図１０Ｂ（配列番号60）は、333番目の位置のアルギニンがグルタミン酸に置換されていることを示す。 図１１は、狂犬病ウイルスNタンパク質の核酸配列を示す。図１１Ａは野生型配列（配列番号61）を示し、リン酸化されたセリンを下線で示す。図１１Ｂ（配列番号62）はセリンからアラニンへの変異を示し（下線）、図１１Ｃ（配列番号63）はセリンからグリシンへの変異を示し（下線）、図１１Ｄ（配列番号64）はセリンからグルタミンへの変異を示す（下線）。
【配列表】
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Claims (62)

  1. Nタンパク質がリン酸化されていない狂犬病ウイルスNタンパク質を含む、変異体狂犬病ウイルス。
  2. Nタンパク質が389番目の位置にセリン以外のアミノ酸を有している、当該狂犬病ウイルスNタンパク質を含む変異体狂犬病ウイルス。
  3. 前記389番目の位置のアミノ酸が中性アミノ酸である、請求項２記載の変異体狂犬病ウイルス。
  4. 前記389番目の位置のアミノ酸がアラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアスパラギンである、請求項２記載の変異体狂犬病ウイルス。
  5. 前記389番目の位置のアミノ酸がアラニンである、請求項４記載の変異体狂犬病ウイルス。
  6. 前記狂犬病ウイルスNタンパク質が配列表の配列番号62、配列表の配列番号63または配列表の配列番号64によってコード化されている、請求項２記載の変異体狂犬病ウイルス。
  7. 前記狂犬病ウイルスNタンパク質が配列表の配列番号62によってコード化されている、請求項６記載の変異体狂犬病ウイルス。
  8. 変異体G糖タンパク質を更に含む、請求項１記載の変異体狂犬病ウイルス。
  9. 前記G糖タンパク質が333番目の位置にアルギニン以外のアミノ酸を有している、請求項８記載の変異体狂犬病ウイルス。
  10. 前記G糖タンパク質が333番目の位置にグルタミン酸（Glu）を有している、請求項９記載の変異体狂犬病ウイルス。
  11. 請求項１記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  12. 請求項２記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  13. 請求項３記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  14. 請求項５記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  15. 請求項６記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  16. 請求項７記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  17. 請求項８記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  18. 請求項９記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  19. 請求項１０記載の変異体狂犬病ウイルス及び薬学的に受容可能な担体からなる、ワクチン組成物。
  20. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１１記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  21. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１２記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  22. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１３記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  23. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１４記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  24. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１５記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  25. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１６記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  26. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１７記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  27. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１８記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  28. 免疫反応を引き起こすのに有効な量の請求項１９記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物において狂犬病ウイルスに対する免疫反応を引き起こす方法。
  29. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１１記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  30. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１２記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  31. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１３記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  32. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１４記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  33. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１５記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  34. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１６記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  35. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１７記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  36. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１８記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  37. 哺乳動物を狂犬病ウイルスによる感染から防御するのに有効な量の請求項１９記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物を狂犬病から防御する方法。
  38. 野生型狂犬病ウイルスNタンパク質を生産する哺乳動物宿主細胞からなる、請求項１記載の変異体狂犬病ウイルスを作製するための宿主細胞。
  39. 前記宿主細胞はハムスター細胞である、請求項３０記載の宿主細胞。
  40. 前記宿主細胞はBHK細胞である、請求項３１記載の宿主細胞。
  41. 前記宿主細胞が寄託番号ATCC PTA-3544として寄託されたものである、請求項３２記載の宿主細胞。
  42. 変異体狂犬病ウイルスを請求項３８記載の宿主細胞において生育させることからなる、変異体狂犬病ウイルスの作製方法。
  43. 請求項1記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  44. 請求項２記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  45. 請求項３記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  46. 請求項４記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  47. 請求項５記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  48. 請求項６記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  49. 請求項７記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  50. 請求項８記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  51. 請求項９記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  52. 請求項1０記載の変異体狂犬病ウイルス中に送達されるべき遺伝子が機能を発現するように挿入されている、ヒト又は動物の細胞に遺伝子を送達するためのベクター。
  53. 請求項４３記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  54. 請求項４４記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  55. 請求項４５記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  56. 請求項４６記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  57. 請求項４７記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  58. 請求項４８記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  59. 請求項４９記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  60. 請求項５０記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  61. 請求項５１記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
  62. 請求項５２記載のベクターをヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の細胞に遺伝子を送達する方法。
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