HRP20040078A2 - Attenuated rabies virus with nucleoprotein mutation at the phosphorylation site for vaccination against rabies and gene therapy in the cns - Google Patents

Description

Reference na srodne prijave

Ova prijava ima pravo prvenstva od S.A.D privremene patentne prijave br. 60/331,354, podnešene 20. srpnja 2001, koja je ovdje uključena u cijelosti za sve namjene.

Potpora vlade

Predmetni rad je djelomično potpomognut subvencijom Javne zdravstvene službe (Public Health Service grant) AI-33029 (Z.F.F.) od strane National Institute of Allergy and Infectious Diseases (Državni institut za alergijska i infektivna oboljenja). Vlada (S.A.D., op. prev.) može imati određena prava glede predmetnog izuma.

Stanje tehnike

Područje tehnike

Predmetni izum odnosi se općenito na pripravak za cijepljenje i postupke sprječavanja i liječenja infekcije kod ljudi i životinja. Konkretnije, predmetni izum se odnosi na mutantni virus bjesnoće kod kojeg je nukleoprotein mutiran na aminokiselini na kojoj dolazi do fosforilacije. Predmetni izum također se odnosi na vektore za isporuku gena čovjeku ili životinji, te postupke isporuke gena istima.

Opis srodne tehnike

Unutar obitelji Rhabdoviridae, virus bjesnoće je prototip roda Lyssavirus, a virus vezikularnog stomatitisa (VSV) je prototip roda Vesiculovirus (Wagner and Rose, 1996). Genomska RNA je inkapsulirana s nukleoproteinom (N), a taj N-RNA kompleks, zajedno s fosfoproteinom (P, također se naziva NS) i RNA-ovisnom RNA polimerazom (L), tvori RNP kompleks. N protein rhabdovirusā, poput N proteina iz drugih članova u redu mononegavirales, igra ključnu ulogu u regulaciji transkripcije i replikacije viralne RNA putem inkapsulacije de novo sintetizirane viralne genomske RNA. Iako N virusa bjesnoće i N VSV-a nemaju visok stupanj homologije u primarnim nukleotidnim i proteinskim odsječcima, oni imaju konzervirane regije i slične proteinske karakteristike. Na primjer, N protein virusa bjesnoće ima četiri konzervirana aminokiselinska segmenta koji su homologni s onima u VSV-u (Tordo et al., 1986). Povrh toga, slična struktura uzvojnice N prote-ina postoji i kod virusa bjesnoće i VSV-a, pri čemu se α - uzvojnica nastavlja od N-terminusa duž većeg dijela proteina, a β - zavoj prema C-terminusu (Barr et al., 1991).

Postoji, međutim, jedna bitna strukturna razlika između N virusa bjesnoće i N VSV-a. N virusa bjesnoće je fosforiliran, dočim N VSV-a nije (Sokol and Clark, 1973). Fosforilacija se događa na serinskom ostatku na poziciji 389 N virusa bjesnoće (Dietzschold et al., 1987). Prije toga je pokazano kako defosforilacija N virusa bjesnoće ili mutacija serina 389 u alanin rezultira povećanim vezanjem na in vitro-sintetiziranu vodeću RNA (Yang et al., 1999). Osim toga, mutacija fosforiliranog serina u alanin ima za posljedicu smanjenje viralne transkripcije i replikacije minigenomske RNA virusa bjesnoće (Yang et al., 1999). Međutim, u minigenomskom sustavu, virusni proteini potrebni za viralnu transkripciju i replikaciju sintetizirani su putem T7 polimeraze, pa tako njihova sinteza nije pod kontrolom regulatornog aparata virusa bjesnoće.

Bjesnoću je oduvijek pratio prizvuk tragedije i misterije. Njezina dramatična klinička ekspresija i gotovo uvijek fatalan završetak jamče da zaštita od bjesnoće dobiva visok prioritet. Usprkos značajnom napretku u biološkom istraživanju, bjesnoća ostaje značajno globalno oboljenje. Procjenjuje se kako svake godine ima više od 70.000 smrtnih slučajeva kod ljudi, a milijuni drugih traže liječenje nakon izlaganja (Meslin et al., 1994; Anonymous, 1993). Iako su ljudi konačni (dead-end) domaćin, to oboljenje je epizootsko ili enzootsko u domaćih životinja, kao i kod divljih životinja (Fu, 1997; Rupprecht et al., 1995; Smith et al., 1995). Psi su i dalje najvažniji rezervoar u Aziji, Africi i Latinskoj Americi, gdje dolazi do najvećeg broja slučajeva bjesnoće kod ljudi (Fu, 1997). U zemljama gdje se pseća bjesnoća kontrolira putem cijepljenja životinja, broj oboljenja kod ljudi je značajno smanjen (Smith et al., 1995). Međutim, bjesnoća kod divljih životinja u tim zemljama predstavlja veći problem (Rupprecht et al., 1995; Smith et al., 1995). Bjesnoća kod lisica je u Europi i Sjevernoj Americi endemična već dulji niz godina, iako su nedavni napori uporabom peroralnog cijepljenja uspješno smanjili ili uklonili bjesnoću u mnogim dijelovima Europe (Brochier et al., 1991). U Sjedinjenim Američkim Državama, bjesnoća je kod divljih životinja predstavljala više od 90 % svih prijavljenih slučajeva bjesnoće (više od 7,000 svake godine) tijekom proteklog desetljeća (Rupprecht et al., 1995; Smith et al., 1995; Krebs et al., 2000a; Krebs et al., 2000b) i postoji najmanje pet glavnih rezervoara bjesnoće kod divljih životinja koji održavaju paralelne epizootske zaraze (Smith et al., 1995). Epizootska bjesnoća kod rakuna i dalje se javlja u svim državama duž istočne obale, koja se širi na zapad prema Ohiou, Zapadnoj Virginiji i Alabami (Krebs et al., 2000b). Bjesnoća kod skunkova ostaje enzootska u središnjim državama i Kaliforniji (Krebs et al., 2000b). Bjesnoća kod lisica javlja se sporadično u Arizoni, Aljaski i Teksasu, a također i u istočnim državama u kojima je bjesnoća kod rakuna epizootska (Krebs et al., 2000b). Bjesnoća kod šišmiša široko je rasprostranjena posvud u 48 država S.A.D. koje se kopneno dodiruju (Krebs et al., 2000b). Spomenute epizootske zaraze bjesnoće kod divljih životinja predstavljaju opasnost po zdravlje ljudi. Prema tome, kontrola bjesnoće i zaštita ljudi od infekcije virusom bjesnoće zahtijeva višeslojne strategije kontrole, posebice cijepljenje ljudi prije i nakon izlaganja, regularno cijepljenje kućnih ljubimaca i cijepljenje divljih životinja.

Cijepljenje ljudi nakon izlaganja može se pratiti sve do vremena Pasteura, kada je on Josephu Meisteru injicirao atenuirani virus bjesnoće pripravljen iz živčanog tkiva (Pasteur et al., 1996). Od tog vremena, cjepiva protiv bjesnoća kod ljudi stalno su poboljšavana, posebice razvojem cjepiva iz kulture humanih diploidnih stanica (human diploid cell culture vaccine, HDCV) Koprowskog i suradnika na Wistar Institutu (Wiktor et al., 1964). Cjepivo dobiveno iz kulture tkiva je ne samo sigurno u usporedbi sa starim cjepivima iz moždanog tkiva zato što ne sadrži živčana tkiva, već je i učinkovitija. Ljudi koji su imunizirani s HDCV razvili su visoke titre protutijela za neutralizaciju virusa (virus neutralizing antibodies, VNA) već nakon 10 dana od cijepljenja, u usporedbi s ljudima koji su imunizirani s cjepivom iz živčanog tkiva kod kojih titri protutijela za neutralizaciju ne dostižu zaštitnu razinu sve do 30 dana nakon imunizacije (Wiktor et al., 1964). Danas su mnogi derivati cjepiva iz kulture tkiva slični HDCV-u, a istodobno su učinkoviti i dobro se podnose. Oni uključuju pročišćeno cjepivo iz stanica pilećeg zametka (purified chicken embryo cell vaccine, PCEC, Barth et al., 1984; Sehgal et al., 1993), pročišćeno cjepivo protiv bjesnoće iz Vero stanica (purified Vero cell rabies vaccine, PVRV, Suntharasamai et al., 1986), te pročišćeno cjepivo iz stanica pačjeg zametka (purified duck embryo cell vaccine, PDRV, Khawplod et al., 1995). Tipično se liječenje nakon izlaganja osobe koju je ugrizla bijesna životinja ili životinja za koju se sumnja da je bijesna sastoji od brzog davanja višestrukih injekcija jednog od gore spomenutih cjepiva iz kulture tkiva. Ovisno o prirodi i težini ugriza, također se preporuča da ljudi prime antirabični antiserum pripravljen bilo u životinjama (obično konji) bilo, poželjnije, u ljudima (human rabies immune globulins, ili HRIG) (Anonymous, 2000). U rjeđem se broju slučajeva i pod posebnim okolnostima ljudi koji su izloženi riziku neprimijećene bjesnoće, poput osoblja zaduženog za kontrolu životinja, te veterinari i laboratorijsko osoblje koje radi s virusom, imuniziraju protiv bjesnoće, što je poznato kao cijepljenja prije izlaganja (Anonymous, 2000).

Iako su cjepiva iz kulture tkiva sigurna i učinkovita, kod njih postoje izvjesni problemi. Budući da se sva spomenuta cjepiva pripravljaju iz inaktivnih virusa, tijekom duljeg vremenskog perioda potrebne su višestruke doze kako bi se stimulirali optimalni imuni odgovori (Anonymous, 2000). Nedovršavanje cjelovite serije cijepljenja može imati za posljedicu razvoj bolesti (Shill et al., 1987; Lumbiganon et al., 1987; Anonymous, 1988). Alergijske reakcije na proteine koji su sadržani u cjepivima iz stanične kulture pojavljuju se u oko 6 % cjepljenih ljudi koji su primili dodatno cjepivo (CDC, 1984). Doista, postoje podaci kako su najteže negativne reakcije one na humani albumin koji je denaturiran putem β-propiolaktona korištenog za inaktivaciju virusa (Warrington et al., 1987; Swanson et al., 1987; Anderson et al., 1987). Osim toga, visoki troškovi takovih cjepiva iz kultura tkiva otežavaju njihovu učinkovitu uporabu u zemljama u razvoju gdje su ponajviše potrebni. Tretman nakon izlaganja može cijenom prelaziti i $ 2.000 do 3,000 dolara (u S.A.D.) po slučaju (Melter, 1996). Najveći broj slučajeva bjesnoće kod ljudi javlja se u zemljama u razvoju, gdje si primatelji cjepiva ne mogu priuštiti platiti takav iznos. Tako se često rabljeno cjepivo protiv bjesnoće u zemljama u razvoju dobiva iz životinjskog živčanog tkiva, a obično se proizvodi u domaćim životinjama ili u mozgovima miševa koji još sišu (Fuenzalidino cjepivo) (Fuenzalida, 1972). Obično je potrebna 21 doza cjepiva iz živčanog tkiva putem intraperitonealne injekcije, a takovo cjepivo može izazvati neurološka oboljenja (Trejos et al., 1974).

Cijepljenje kućnih ljubimaca (pasa i mačaka) u S.A.D. izvodi se sukladno preporukama iz The Compendium of Animal Rabies Prevention and Control Nacionalne udruge državnih veterinarskih inspektora za javno zdravstvo (National Association of State Public Health Veterinarians, Anonymous, 2000). Obično se kućni ljubimci imuniziraju u dobi od 6 tjedana i ponovno cijepe svake godine ili svake treće godine, ovisno o tipu cjepiva koje se rabi (Anonymous, 2000). Većina licenciranih cjepiva protiv bjesnoće za kućne ljubimce su inaktivni virusi bjesnoće. Odnedavno je rekombinantni pox virus kanarinaca koji eksprimira virus bjesnoće G odobren za imunizaciju mačaka (Anonymous, 2000). Iako spomenuta cjepiva pružaju zadovoljavajuću zaštitu kod pasa i mačaka, ta cjepiva isto tako potiču i lokalne reakcije (Wilcock et al., 1986). Osim toga, potrebne su višestruke imunizacije kako bi se održala dovoljna razina imuniteta tijekom cijelog života (Anonymous, 2000). Psi koje su često imunizira s komercijalnim cjepivima ne moraju uvijek održati primjerene titre, a samo jedna trećina pasa pokazuje VNA titre iznad 1:5 temeljne linije (Tims et al., 2000). Osim toga, cijepljenje štenaca koji su mlađi od 3 mjeseca ne uspijeva inducirati zaštitni imunitet, iako su majčinska protutijela koja su prenešena od kuja pala do razine nezamjetljivog do 6 tjedana starosti (Aghomo et al., 1990). Postoji period od trenutka nestajanja materinskih protutijela do momenta djelatnog imuniteta unutar kojeg mlade životinje nisu nužno zaštićene (Mitmoonpitak et al., 1998; Clark et al., 1996).

Bjesnoća kod divljih životinja postoji u mnogim zemljama i dalje predstavlja važnu ugrozu javnom zdravlju. Mjere za nadzor bjesnoće kod divljih životinja tijekom dva prošla desetljeća i u Europi i Sjevernoj Americi bile su usmjerene na peroralno cijepljenje (Baer, 1988). Ispočetka se rabio atenuirani virus bjesnoće, soj Street Alabama Dufferin B19 (SAD), i on nije uzrokovao bjesnoću kada je peroralno davan lisicama (Baer, 1988). Pokusima s cijepljenjem crvenih lisica u divljini u europskim zemljama sa SAD-om u pilećim glavama kao mamcima postignut je imunitet u više od 60 % lisica i zaustavljeno je širenje bolesti u područja koja nisu tretirana (Wandeler et al., 1998; Schneider et al., 1988). Međutim, SAD i dalje uzrokuje oboljenja kod glodavaca (Winkler et al., 1976), kao i kod domaćih životinja (Esh et al., 1982). Nakon toga je razvijen rekombinantni vaccinia virus koji eksprimira virus bjesnoće G (VRG) (Kieny et al., 1984), za koji je utvrđeno da je učinkovit peroralni imunogen kod rakuna i lisica u laboratorijskim uvjetima (Rupprecht et al., 1986; Blancou et al., 1986). Dodatna testiranja VRG-a u mamcima od ribljeg brašna provedena su na životinjama u prirodi i pokazano je kako je VRG siguran (Brochier et al., 1989; Rupprecht et al., 1993). Cijepljenje kod ciljnih i ne-ciljnih životinjskih vrsta nije povezano s nijednom od sljedećih pojava: s cjepivom-povezana patologija, smrtnost, veće lezije ili pogubne nus-pojave. Takovo cjepivo je također učinkovito za poticanje zaštitnog imuniteta, a primjena VRG-a u prirodi je rezultirala širokom eliminacijom lisičje bjesnoće u cijepljenim područjima Europe (Brochier et al., 1991). Sličnom primjenom VRG-a u S.A.D. postiglo se sprječavanje širenja bjesnoće kod kojota u Teksasu (Fearneyhough et al., 1998), te širenja bjesnoće kod rakuna u drugim državama (Hanlon et al., 1998; Robbins et al., 1998; Roscoe et al., 1998). Iako je VRG siguran kod cijepljenih životinja i učinkovit za stimulaciju imuniteta u ciljnim životinjskim vrstama, nedavni incident s trudnom ženom jasno naglašava rizike uporabe takovih rekombinantnih cjepiva čak i kod divljih životinja, posebice u gusto naseljenim područjima (Rupprecht et al., 2001). Spomenuta žena je zadobila ugriz prsta i lijeve podlaktice kada je iz usta svog psa pokušala ukloniti mamac s VRG rekombinantnim virusom. Unutar 10 dana, kod nje se razvila intenzivna lokalna upalna reakcija oko dvije nekrotične lezije na mjestima ugriza na podlaktici, te adenitis. Potom se razvila opća eritroderma, koja se na kraju povukla nakon ljuštenja (Rupprecht et al., 2001). Taj incident baca sumnju na buduću uporabu VRG-a kao cjepiva protiv bjesnoće kod divljih životinja.

Očito je kako cjepiva koje se trenutno koriste na ljudima i životinjama imaju probleme sa sigurnošću, učinkovitošću i cijenom. Potrebna su učinkovitija, sigurnija i jeftinija cjepiva za kontrolu bjesnoće kod životinja i sprječavanje bjesnoće kod ljudi. Razvijena su i testirana brojna nova cjepiva, uključujući DNA cjepiva i druga rekombinantna cjepiva. Otkriveno je kako DNA vektori koji eksprimiraju G virusa bjesnoće stimuliraju i T pomoćne stanice i proizvodnju VNA virusa bjesnoće (Xiang et al., 1994). Osim toga, imunizacija miševa s tim DNA vektorima zaštitila je miševe i majmune protiv kasnijih induciranih infekcija sa smrtonosnim virusom bjesnoće (Xiang et al., 1994; Ray et al., 1997; Lodmell et al., 1998). Međutim, indukcija imunih odgovora putem DNA cjepiva obično traje duže, a jačina imunog odgovora je manja u usporedbi s konvencionalnim cjepivima (Xiang et al., 1994; Osorio et al., 1999). Također su razvijeni i rekombinantni humani adenovirusi koji eksprimiraju G virusa bjesnoće (Prevec et al., 1990; Xiang et al., 1996). Cjepiva iz rekombinantnih adenovirusa mogu inducirati VNA i zaštititi cijepljene životinje (miševi, psi, skunkovi i lisice) protiv inducirane infekcije (Tims et al., 2000; Prevec et al., 1990; Xiang et al., 1996; Charlton et al., 1992; Wang et al., 1997). Postoji problem s adenovirusnim vektorom kod imunih odgovora koji su usmjereni na adenovirusne proteine (Wang et al., 1997). Već postojeći anti-adenoviralni imunitet može spriječiti apsorpciju cjepiva od strane stanice koja je potrebna za eksprimiranje ciljnog gena i time oštetiti aktivni imuni odgovor na ciljni antigen. Osim toga, ponovno cijepljenje ili cijepljenje s adenoviralnim vektorom koji eksprimira različiti ciljni antigen ne mora više biti učinkovit.

Cjepiva koja sadrže oslabljeni virus već su dulje vremena poznata kao učinkovitija za indukciju dugotrajnog imuniteta povezanog sa stanicom i tjelesnim tekućinama, a mnoge bolesti se nalaze pod nadzorom ili su iskorijenjene uporabom živih modificiranih viralnih cjepiva. Globalno iskorjenjivanje velikih boginja u biti je postignuto uporabom cjepiva s manje virulentnim virusom kravljih boginja (Henderson, 1980). Poliomijelitis je na granici globalnog iskorjenjivanja zbog masovnog cijepljenja sa živim polio cjepivom (Sabin et al., 1973). Mnoga druga virusna oboljenja kao što su ospice, zaušnjaci i rubeola, da spomenemo samo neke od njih, stavljena su pod nadzor cjepivima sa živim modificiranim virusom (Arvin, 2000). Prema tome, cjepivo iz živog modificiranog virusa može imati prednost pred trenutno licenciranim cjepivima time što omogućuje dugotrajni imunitet i smanjuje potrebne doze, što rezultira značajnim smanjenjem troškova. Međutim, takova cjepiva iz živog modificiranog virusa moraju biti u cijelosti avirulentna, posebice za ljude. U tu svrhu, soj SAD virusa bjesnoće, koji se prije, u osamdesetim godinama prošlog stoljeća koristio za cijepljenje divljih životinja (Baer, 1988; Wandeler et al., 1998; Schneider et al., 1988), dodatno je atenuiran naknadnom selekcijom uporabom neutralizirajućih monoklonskih protutijela (Mab), što dovodi do selekcije sojeva SAG1 i SAG2 (Le Blois et al., 1990; Flamand et al., 1993; Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994). Selekcija SAG1 i SAG2 uporabom Mab-ova temelji se na ranijim otkrićima kako mutacija glikoproteina na argininu 333 smanjuje virulentnost virusa bjesnoće (Dietzschold et al., 1983; Seif et al., 1985). SAG1 virus posjeduje jednu mutaciju na poziciji 333, gdje je arginin zamijenjen lizinom (Lafay et al., 1994). U usporedbi sa sojem SAD, koji je kod odraslih miševa još uvijek patogen uporabom intracerebralne (i.c.) rute inokulacije, SAG1 virus je avirulentan kada se daje odraslim miševima putem i.c., intramuskularne (i.m.) i peroralne rute (Le Blois et al., 1990; Lafay et al., 1994). SAG1 virus je jednako učinkovit kao SAD za cijepljenje lisica peroralnom rutom (Le Blois et al., 1990). Kako bi se stabilizirao avirulentni virus, selektiran je SAG2 virus s dodatnim Mab (Lafay et al., 1994). SAG2 nosi dvostruke mutacije na poziciji 333, promjenom iz arginina (AGA) u glutaminsku kiselinu (GAA), čime se dodatno smanjuje mogućnost da se virus povrati u virulentni divlji tip (wild-type, wt) (Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994). SAG2 virus je avirulentan kod odraslih glodavaca, lisica, mačaka i pasa bilo kojom rutom inokulacije (Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994). Peroralnim cijepljenjem lisica i pasa postignuta je zaštita nakon aplikacije smrtonosne doze virusa bjesnoće. Ispitivanja u prirodi SAG2 u svrhu imunizacije lisica i pasa pokazala su njegovu sigurnost i imunogenost (Masson et al., 1996). Međutim, SAG2 može inducirati bjesnoću kod životinja koje još sišu putem i.c. inokulacije (Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994), što povećava mogućnost da se mlađe ili imunokompromitirane životinje još uvijek mogu zaraziti virusom i razviti bolest.

Takovi selektirani mutantni virusi s promjenama na argininu 333 G-a dobro se repliciraju u kulturi stanica, što pokazuje da nema utjecaja na brzinu viralne replikacije tih virusa (Lafay et al., 1994). Međutim, istraživanje sposobnosti tih virusa za invaziju živčanog sustava otkrilo je kako virus može napasti neurone prvog reda, ali se ne uspijeva proširiti u sekundarne ili tercijarne neurone, što upućuje da je sposobnost tih mutantnih virusa za diseminaciju u živčani sustav preko sinaptičkih spojišta smanjena (Coulon et al., 1989). Širenje preko sinapsi (synaptic spreading) glavna je ruta za širenje virusa u CNS-u odraslih jedinki (Gosztonyi et al., 1993). Kod neonatalnih životinja, sinaptičko širenje ne mora biti jedini put za diseminaciju virusa. Budući da razvoj mijelina kod neonatalnih životinja ne mora biti dovršen, virus bjesnoće također se može širiti iz zaraženih u nezaražene neurone kod neonatalnih životinja pupanjem iz zaraženih neurona i inficirati druge nezaražene neurone, više ili manje nalik onome u kulturi stanica (Dietzschold et al., 1985). Prema tome, smanjivanje brzine viralne replikacije moglo bi biti nužno za razvoj cjepiva iz avirulentnih virusa bjesnoće. Kao kod drugih virusa s jednolančanom, nesegmentiranom RNA, transkripcija i replikacija virusa bjesnoće regulirana je složenom interakcijom između komponenata unutar ribonukleoproteinskog kompleksa (RNP). RNP je sačinjen od genomske RNA, koja je inkapsulirana putem nukleoproteina (N), zajedno s fosfoproteinom (P) i RNA-ovisnom RNA polimerazom (L) (Wunner, 1991). Teoretski, mutacija tih viralnih proteina može imati za posljedicu sniženu brzinu replikacije kod virusa bjesnoća. Uz recentni razvoj tehnologije reverzne genetike za minus-lančane RNA viruse (Enami et al., 1990; Pattnaik et al., 1990; Pattnaik et al., 1991; Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994), omogućena je manipulacija viralnog genoma za tu skupinu virusa (Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994; Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995). Primjenom te tehnologije postignuto je bolje razumijevanje načina kojim ta skupina virusa regulira svoju transkripciju i replikaciju (Enami et al., 1990; Pattnaik et al., 1990; Pattnaik et al., 1991; Conzelmann et al., 1994; Schnell et al., 1994; Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995), kako svaki od viralnih proteina djeluje u replikacijskom ciklusu (Pattnaik., 1990), te njihove patogenosti (Etessami et al., 2000). Primjenom rečene tehnologije također je postignuta atenuacija tih virusa, a neki od njih mogli su biti razvijeni kao cjepiva (Wertz et al., 1998) ili vektori za gensku terapiju (Finke et al., 1997).

N je prvi produkt koji se transkribira iz viralnog genoma i obilno se eksprimira u zaraženim stanicama kod svih minus-lančanih RNA virusa (Wunner, 1991). Pretpostavlja se kako N ima ključnu ulogu u tranziciji iz RNA transkripcije u replikaciju putem inkapsuliranja u novonastalu genomsku RNA (Wunner, 1991). Mutacija N bi potencijalno mogla voditi do atenuiranog fenotipa. Doista, premještanje nukleoproteina (N) na druga mjesta na viralnom genomu dovelo je do atenuacije virusa vezikularnog stomatitisa (VSV) (Wertz et al., 1998). Uzrok tomu je inhibicija viralne replikacije zbog smanjenog eksprimiranja N proteina. Nedavno smo konstruirali mutantni virus bjesnoće s promjenama na mjestu fosforilacije N-a i otkrili kako je brzina viralne replikacija smanjena više od pet puta, a proizvodnja virusa smanjena više od 10,000 puta, što ukazuje na atenuaciju mutantnog virusa bjesnoće (Wu et al., 2002).

Bjesnoća i dalje predstavlja ugrozu javnom zdravlju zato što svake godine uzrokuje više od 70,000 smrtnih slučajeva kod ljudi. Ljudi se inficiraju virusom bjesnoće uglavnom preko ugriza bijesnih domaćih i divljih životinja. Iz tog razloga nadzor infekcije virusom bjesnoće kod domaćih i divljih životinja ne samo da smanjuje smrtnost kod rečenih životinja, već također smanjuje i rizik izlaganja ljudi. Preventivno cijepljenje prije izlaganja ljudi koji su stalno izloženi riziku dodatno sprječava bjesnoću kod ljudi, kao i imunizacija nakon izlaganja ljudi koje su ugrizle bijesne životinje ili životinje za koje se sumnja da su bijesne. U proteklih nekoliko godina, rekombinantni vaccinia virus koji eksprimira glikoprotein virusa bjesnoće (rabies virus glycoprotein, VRG) koristi se za nadzor bjesnoće u divljih životinja. Cjepiva od inaktivnog virusa bjesnoće koriste se za imunizaciju domaćih životinja, posebice kućnih ljubimaca. Cjepiva iz pročišćenog i inaktivnog virusa bjesnoće koriste se za ljude u uvjetima prije ili nakon izlaganja. Iako su takva cjepiva učinkovita, potrebno je cijepljenje svake godine kako bi se održao primjeren imunitet u domaćih životinja. Kod ljudi, potrebne su višestruke doze cjepiva iz inaktivne kulture tkiva kako bi se potaknuli optimalni imuni odgovori. Osim toga, trenutno dostupna cjepiva iz kulture tkiva su skupa, pa će većini ljudi kojima je cijepljenje potrebito (u zemljama u razvoju) ona biti nedostupna. Prema tome, postoji potreba za razvojem učinkovitijih i jeftinijih cjepiva protiv virusa bjesnoće.

S obzirom na gore spomenute nedostatke postupaka cijepljenja ljudi i životinja protiv virusa bjesnoće u stanju tehnike, očito je da i dalje postoji potreba za sigurnim i ekonomičnim postupkom u predmetnom području.

Kratak opis izuma

U skladu s predmetnim izumom, omogućen je mutantni virus koji sadrži mutaciju na mjestu za fosforilaciju na jednom ili više proteina virusa, koja mutacija uzrokuje atenuaciju virusa, čime se može proizvesti poboljšano cjepivo.

Posebice je omogućen mutantni virus bjesnoće, pri čemu rečeni virus sadrži N protein mutantnog virusa bjesnoće koji ima aminokiselinu koja nije serin na poziciji 389. Osim toga, mutantni virus može sadržavati jednu ili više mutacija unutar N proteina, ili na nekom drugom viralnom proteinu, na primjer, u G glikoproteinu.

Predmetni izum također se odnosi na pripravke za cijepljenje koji sadrže mutantni virus, kao i postupke za induciranje imunog odgovora, te zaštite sisavaca od infekcije izazvane virusom bjesnoće.

Također su u predmetni izum uključeni postupci proizvodnje mutantnog virusa i mutantnih viralnih proteina, uključujući proizvodnju mutantnog virusa u stanicu domaćina koja proizvodi ili čak prekomjerno proizvodi divlji tip analog mutantnog viralnog proteina, koji nadopunjava druge viralne proteine tako da je proizvodnja mutantne viralne čestice optimizirana. Predmetni izum također uključuje one stanice domaćine kod kojih je viralna proizvodnja optimizirana.

Također su u predmetnom izumu uključene nukleinske kiseline koje kodiraju protein(e) mutantnog(ih) virusa, te nukleinske kiseline koje kodiraju dio ili čitav viralni odsječak nukleinske kiseline. Osim toga, predmetni izum uključuje vektore koji sadržavaju odsječke nukleinske kiseline, uključujući vektore za eksprimiranje, te stanice domaćine koje su transformirane putem odsječaka nukleinske kiseline.

Predmetni izum također uključuje viralne proteine kodirane mutantnim nukleinskim kiselinama, pripravke za cijepljenje koji uključuju viralne proteine, same ili u kombinaciji s intaktnim virusom, te postupke induciranja imunog odgovora ili zaštite sisavca od infekcije, uporabom istih.

Predmetni izum također uključuje protutijela za intaktni mutantni virus i mutantne viralne proteine, te postupke za izradu i uporabu istih.

Također su u predmetni izum uključeni vektori prikladni za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, kao i postupci za isporuku istih.

Kratak opis slika

Slika 1 pokazuje da N fosforilacija utječe na transkripciju viralne RNA u minigenomu. BSR stanice su zaražene s rekombinantnim vaccinia virusom vTF7-3 i potom transfektirane s plazmidom pRP, pT7T-L, pSDI-CAT zajedno s pRN (RN), pRN-SA (SA), pRN-SG (SG), pRN-SD (SD), pRN-SN (SN), pRN-SE (SE) ili pRN-SQ (SQ). Stanice transfektirane s drugim plazmidima, ali bez N koji eksprimira plazmid (-N) uključene su kao kontrola. Stanice se prikupe u svrhu mjerenja CAT aktivnosti putem Quan-T-CAT testa. Histogrami, standardne devijacije.

Slika 2 pokazuje da N fosforilacija virusa bjesnoće utječe i na transkripciju i replikaciju viralne RNA. BSR stanice zaražene i transfektirane kako je opisano u Slici 1 se prikupe u svrhu Northern blot hibridizacije ili imunoprecipitacije. Glasnička RNA se pročisti iz ukupne RNA, a genomski analozi se pročiste iz imunoprecipitiranog RNP s poliklonskim protu-N protutijelima. Takovi RNA preparati se hibridiziraju s CAT cDNA probom. Ukupna RNA se hibridizira sa sense oligo sondom da bi se izmjerio nivo transkripcije minus-sense RNA iz minigenoma eksprimiranog plazmidom. N protein koji je eksprimiran u stanicama je imunoprecipitiran s poliklonskim protu-N protutijelima.

Slika 3 prikazuje učinke koncentracija N na viralnu transkripciju. BSR stanice su zaražene s rekombinantnim vaccinia virusom vTF7-3 i potom transfektirane s plazmidima pRP, pT7T-L, pSDI-CAT zajedno s pRN, pRN-SA (SA), pRN-SD (SD), ili pRN-SE (SE). Koriste se različite koncentracije (5, 10, 15 i 20 μg) N ili mutantni N plazmida. Stanice se prikupe za CAT test.

Slika 4 prikazuje krivulje rasta virusa za wt (wild type, divlji tip) i mutantne viruse bjesnoće u BSR stanicama. BSR stanice su zaražene s wt virusom (L16) i mutantnim virusima (L16A, L16D ili L16E) s moi (multiplicity of infections, moi) od 1 ffu/stanici, a alikvoti virusa se uklone na navedenim vremenskim točkama i podvrgnu titraciji virusa.

Slika 5 prikazuje detekciju viralnih transkripata i genomske RNA s N, odnosno G sondom virusa bjesnoće. Ukupna RNA se pripravlja iz BSR stanica koje su zaražene s L16, L16A (A), L16D (D) ili L16E (E) i hibridizira se s N sondom (lijevi panel) ili G sondom (desni panel). Također su prikazani i odnosni mRNA-i, genomska RNA i eventualni readthrough (RT) transkripti i/ili loše transkribirani i transformirani transkripti (defective-interfering, DI) RNA. Ukupna RNA također se hibridizira s β aktin sondom (donji panel). Količina N i G transkripta, te genomski RNA produkti u odnosu na onu kod wt virusa kvantificirani su densitometrijom.

Slika 6 pokazuje da N fosforilacija također modulira viralnu transkripciju. BSR stanice su zaražene s L16, L16A (A), L16D (D) ili L16E (E); tretirane nakon 1 sat bez (A) ili sa (B) CHX; te prikupljene u navedenim vremenskim točkama u svrhu izolacije ukupne RNA. RNA se hibridizira s N sondom. Također su prikazani: odnosne mRNA, genomska RNA i mogući RT transkripti. Ukupna RNA se također hibridizira sa β aktin sondom (dolje). Količine N transkripata u odnosu na onaj kod wt virusa kvantificirane su densitometrijom.

Slika 7 prikazuje kvantifikaciju omjera između genomske RNA i anti-genomske RNA u zaraženim stanicama i pročišćenim virionima. Ukupne RNA iz zaraženih stanica ili pročišćenih viriona hibridizirani su ili sa sense probom ili s antisense riboprobama koje su pripravljene iz pRN putem in vitro transkripcije. Razine genomske i antigenomske RNA određene su densitometrijom.

Slika 8 prikazuje predloženi model N fosforilacije i njezinu funkciju kod viralne transkripcije i replikacije. N, nakon što je sintetiziran, uzajamno djeluje sa P i/ili L. U toj fazi, N nije fosforiliran. Moguće je da interakcija između nukleoproteina N s (inkapsuliranom) genomskom RNA dovodi do konformacijske promjene proteina, kojim se mjesto izlaže fosforilaciji. Jednom kada je N fosforiliran, odbojnost naboja između genomskog RNA i N pomaže L-u pridobiti dostup u genom domaćina za iniciranje viralne RNA transkripcije i replikacije.

Slika 9 prikazuje kompletni odsječak nukleinske kiseline bjesnoće. (L16 (nt 1235 - 1237), TCT koji kodira serin na N proteinu označen je masno i podvučen.) Slika 9A prikazuje L16 odsječak divljeg tipa (SEQ ID NO:55). Slika 9B prikazuje L16A odsječak (SEQ ID NO:56), kod kojeg je serin zamijenjen alaninom na N odsječku. Slika 9C prikazuje L16Q odsječak (SEQ ID NO:57), kod kojeg je serin zamijenjen glutaminom na N odsječku. Slika 9D prikazuje L16QG333 odsječak (SEQ ID NO:58), kod kojeg je serin zamijenjen s glutaminom na N proteinu na nt 1235 - 1237 [TCT u CAA] (podvučeno i označeno masnim), a arginin zamijenjen s glutaminskom kiselinom na nt 4370 - 4372 [AGA u GAA] (potcrtano, označeno masnim i kurzivom).

Slika 10 prikazuje odsječak nukleinske kiseline G proteina virusa bjesnoće. Slika 10A (SEQ ID NO:59) prikazuje Arg 333 koji je potcrtan. Slika 10B (SEQ ID NO:60) prikazuje Glu koji je zamijenio Arg na poziciji 333.

Slika 11 prikazuje odsječak nukleinske kiseline virusa N proteina virusa bjesnoće. Slika 11A prikazuje odsječak divljeg tipa (SEQ ID NO:61), kod kojeg je fosforilirani serin potcrtan. Slika 11B (SEQ ID NO:62) prikazuje mutaciju Serina u alanin (potcrtano). Slika 11C (SEQ ID NO:63) prikazuje mutaciju Serina u Glicin (potcrtano). Slika 11D (SEQ ID NO:64) prikazuje mutaciju Serina u Glutamin (potcrtano).

Detaljan opis izuma

Predmetni izum se odnosi na učinkovita i ekonomična cjepiva protiv virusa za ljude kao i za životinje, na postupke izrade istih, te postupke uporabe istih za induciranje imuno odgovora, poželjno protektivnog imuno odgovora kod životinja i ljudi. Prikladni virusi uključuju, ali nisu ograničeni na, ospice, respiratorni sincicijski virus (Respiratory Syncytial virus, RSV), virus ebole i virus gripe, Sendai virus i goveđi RSV.

Posebice se predmetni izum odnosi na cjepiva iz avirulentih živih virusa koja sadrže mutantni virus kod kojeg je fosforilacija na N nukleoproteinu bila prekinuta. Prikladni virusi uključuju, ali nisu ograničeni na, ospice, respiratorni sincicijski virus (Respiratory Syncytial virus, RSV), virus ebole i virus gripe, koji su svi fosforilirani na N proteinu. Fosforilacija se prekida bilo kojim prikladnim načinom, uključujući alteraciju mjesta fosforilacije putem umetanja, delecije ili, poželjno, putem supstitucije. Osim toga, fosforilacija se može prekinuti promjenama u drugim dijelovima N proteina, poput kodirajućeg odsječka na drugom mjestu u N proteinu. Poželjno, N protein ima aminokiselinu koja nije serin na poziciji 389, poželjno je neutralnu aminokiselinu, a još poželjnije, alanin. Poželjno, mutantni virus bjesnoće je kodiran jednim od odsječaka iz Slike 8, N protein mutantnog virusa bjesnoće je kodiran jednim od odsječaka iz Slike 9 i/ili G protein mutantnog virusa bjesnoće je kodiran jednim od odsječaka iz Slike 10.

N protein može biti mutiran tako da utječe na vezanje N proteina na RNA, na fosfatnu polovicu ili na sebe samog. Takova modulacija svojstava vezanja N nukleoproteina utječe na vitalne funkcije virusa, poput replikacije.

U poželjnom utjelovljenju, predmetni izum je usmjeren na cjepiva od avirulentnog živog virusa bjesnoće koje sadrže mutantni virus kod kojeg je fosforilacija na N nukleoproteinu bila prekinuta, umetanjem, delecijom, supstitucijom ili drugim prikladnim načinom. Poželjno, virus ima sniženu brzinu viralne replikacije (putem mutacije nukleoproteina N ili premještanjem gena unutar genoma virusa bjesnoće). U poželjnom utjelovljenju serin na poziciji 389 N nukleoproteina je supstituiran s alaninom, glicinom, glutaminom, glutaminskom kiselinom, asparaginskom kiselinom ili asparaginom.

U poželjnom utjelovljenju, virusi također imaju smanjenu sposobnost širenja u živčanom sustavu (mutacijom glikoproteina G), poželjno na poziciji 333 glikoproteina G.

Poželjno, mutantni virusi također mogu imati više od jedne promjene na bilo kojem od proteina N ili G, ili na oba, tako da su smanjeni izgledi za reverziju u fenotip divljeg tipa (WT).

Može se koristiti bilo koji soj virusa bjesnoće kod kojeg je sačuvano mjesto za fosforilaciju. Mjesto za fosforilaciju na N proteinu svih dosad poznatih virusa bjesnoće je konzervirano.

Osim toga, mutantni virus prema predmetnom izumu može sadržavati glikoprotein G iz drugog tipa virusa, kako bi se usmjerio tropizam virusa unutar tijela. Prema tome, virusi prema predmetnom izumu također su korisni u genskoj terapiji, za isporuku terapijskih ili imunogenih proteina čovjeku i životinji kod kojih se primjenjuju.

Posebice G glikoprotein virusa bjesnoće uzrokuje tropizam stanica CNS-a, što ga čini prikladnim za liječenje oboljenja središnjeg živčanog sustava (CNS) poput karcinoma, uključujući, ali bez ograničenja na, neuroblastom, te neurodegenerativnih oboljenja uključujući, ali bez ograničenja na, Alzheimerovu bolest, Parkinsonovu bolest, Huntingtonovu bolest. Slično tomu, protein G virusa humane imunodeficijencije (HIV) uzrokuje tropizam T stanica, što ga čini prikladnim za liječenje poremećaja povezanih s T-stanicama isporukom gena u iste, uključujući različite karcinome i oboljenja koja utječu na T-stanice, uključujući HIV.

G glikoprotein virusa vezikularnog stomatitisa (VSV) je pantropijski, pa se prema tome može rabiti za primjenu na više tipova stanica. Glikoprotein G RSV-a uzrokuje tropizam epitela, što ga čini prikladnim za usmjeravanje na pluća i liječenje poremećaja pluća, uključujući, ali bez ograničenja na, cističnu fibrozu.

Predmetni izum također se odnosi na postupke uporabe mutantnog virusa za induciranje imunog odgovora, i poželjno, zaštitnog imunog odgovora kod čovjeka ili životinje.

U predmetni su izum također uključene stanice domaćini za proizvodnju mutantnog virusa, kao i postupci za proizvodnju istih. Poželjno, stanica domaćin je stanica domaćin sisavca koja proizvodi N protein divljeg tipa virusa bjesnoće, poželjno stanica hrčka, poželjnije BHK stanica, a najpoželjnije, stanica domaćin koja je deponirana kod The American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, pod brojem ATCC PTA-3544, 20. srpnja 2001.

Mutacija i na G i na N ili premještanje tih gena dovodi do atenuacije virusa u tolikoj mjeri da virus više ne uzrokuje oboljenje kod životinja ni u kojoj dobi nikakvom rutom zaraze; ipak, (virus) može inducirati imune odgovore koji pružaju zaštitu prilikom inducirane infekcije virulentnom dozom virusa bjesnoće. To se temelji na nedavnim istraživanjima koja pokazuju sljedeće. 1) Mutacija fosforiliranog serina na 389 N-a u alanin smanjila je brzinu viralne replikacije više od pet puta, te proizvodnju virusa za više od 10,000 puta. 2) Mutacija G-a na ostatku 333 dramatično je smanjila virulentnost i patogenost virusa bjesnoće. 3) Razmještanje gena kod srodnog virusa, virusa vezikularnog stomatitisa (VSV), imalo je za posljedicu atenuaciju i poboljšavanje imunih odgovora. Virusi bjesnoće s mutacijama i na G i na N ili s razmještenim genima dodatno su atenuirani u usporedbi s trenutno dostupnim atenuiranim virusima bjesnoće (koji još uvijek induciraju bjesnoću kod neonatalnih životinja). Dodatno atenuirani virusi bjesnoće koji ne mogu inducirati oboljenja kod pokusnih životinja bilo koje dobi i bilo kojom rutom zaraze, a ipak ostaju imunogeni, mogu biti razvijeni u modificirana živa cjepiva protiv bjesnoće za ljude i životinje.

Alternativno, cjepivo prema predmetnom izumu može sadržavati izolirani mutantni N protein, bez intaktnog virusa. Kako se N fosforilirajući mutant nakuplja u većoj količini od svog analoga divljeg tipa, isti može imati pojačane pomoćne učinke u usporedbi sa pripravcima koji sadrže divlji tip N.

Pripravci za cjepivo prema predmetnom izumu mogu sadržavati adjuvans, uključujući, ali bez ograničenja na, hepatitis B površinski antigen (HbsAg) ili G protein virusa bjesnoće. Cjepivo se može pripraviti uporabom bilo kojeg farmaceutski prihvatljivog nosača ili vehikula, uključujući Hanksovu bazičnu otopinu soli (HBSS) ili fosfatnu puferiranu fiziološku otopinu (PBS). Pripravci za cjepivo mogu se davati bilo kojom poznatom rutom, uključujući intradermalnu, intramuskularnu i subkutanu, koje su poželjnije, kao i peroralnu, preko kože (epidermalna abrazija) ili intranazalno.

Sukladno predmetnom izumu, mogu se rabiti konvencionalne tehnike iz područja molekularne biologije, mikrobiologije, imunologije i tehnike rekombinantne DNA, koje su uključene u stanje tehnike. Takove tehnike u cijelosti su objašnjene u literaturi. Vidi, primjerice, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3rd edition, 2001); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I - III [Ausubel, R. M., ed. (1999, ažurirano svaka dva mjeseca)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I - III [J. E. Celis, ed. (1994)]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I - IV [Coligan, J. E., ed. (1999, ažurirano svaka dva mjeseca)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Culture of Animal Cells, 4th edition" [R. I. Freshney, ed. (2000)]; "Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1988); Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Harlow, Ed and Lane, David (Cold Spring Harbor Press, 1998); Using Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow, Ed and Lane, David (Cold Spring Harbor Press, 1999).

Sukladno tome, ako se pojavljuju u tekstu što slijedi, sljedeći termini bit će definirani kako slijedi dolje.

"Replikon" je bilo koji genetski element (npr. plazmid, kromosom, virus) koji djeluje kao autonomna jedinica DNA replikacije in vivo, tj., sposoban replicirati se pod svojim vlastitim nadzorom.

"Vektor" je replikon, poput plazmida, faga ili kosmida, na koji može biti vezan drugi DNA segment tako da uzrokuje replikaciju tog vezanog segmenta.

"DNA molekul" se odnosi na polimerni oblik deoksiribonukleotida (adenin, gvanin, timin ili citozin) bilo u njihovom jednolančanom obliku, bilo u obliku dvostruke uzvojnice. Taj termin odnosi se samo na primarnu i sekundarnu strukturu molekula, a ne ograničava je ni na kakve konkretne tercijarne oblike. Tako ovaj termin uključuje DNA s dvostrukim lancima koje se, inter alia, nalaze u lineranim DNA molekulima (npr. fragmenti nakon restrikcije), virusima, plazmidima i kromosomima. Kod opisa strukture konkretnih dvolančanih DNA molekula, odsječci se ovdje mogu opisati sukladno uobičajenoj konvenciji tako da se navodi samo odsječak u smjeru 5' do 3' duž netranskribiranog lanca DNA (tj., lanca koji ima odsječak homologan s mRNA).

"Podrijetlo replikacije" odnosi se na one odsječke DNA koji sudjeluju u sintezi DNA.

"Odsječak za kodiranje” DNA je dvolančani odsječak DNA koji je transkribiran i translatiran u polipeptid in vivo kada se postavi pod nadzor odgovarajućih regulatornih odsječaka. Granice odsječka za kodiranje određene su start kodonom na 5' (amino) terminusu i translacijskim stop kodonom na 3' (karboksil) terminusu. Odsječak za kodiranje može uključivati, ali nije ograničen na, prokariotske odsječke, cDNA iz eukariotske mRNA, genomske DNA odsječke iz eukariotske DNA (npr. sisavaca), pa čak i sintetske DNA odsječke. Signal za poliadenilaciju i odsječak za prestanak transkripcije obično će se nalaziti na 3' u odnosu na odsječak za kodiranje.

Odsječci za nadzor transkripcije i translacije su DNA regulatorni odsječci, poput promotora, pojačivača, signala za poliadenilaciju, terminatora i slično, koji omogućuju eksprimiranje odsječka za kodiranje u stanici domaćinu.

"Promotor odsječak " je DNA regulatorno područje koje može vezati RNA polimerazu u stanici i inicirati transkripciju nizvodnog (smjer 3') odsječka za kodiranje. Za potrebe definiranja predmetnog izuma, promotorni odsječak je vezan na svom 3' kraju preko mjesta za iniciranje transkripcije i proteže se uzvodno (smjer 5') i uključuje minimalni broj baza ili elemenata koji su potrebni za iniciranje transkripcije na razinama koje su detektabilne iznad pozadine. Unutar promotornog odsječka nalazi se mjesto početka transkripcije (koje je prikladno definirano s mjestom za nukleazu S1), kao i domene za vezanje proteina (konsenzus odsječci) koji su odgovorni za vezanje RNA polimeraze. Eukariotski promotori će često, ali ne i uvijek, sadržavati "TATA" motive i "CAT" motive. Prokariotski promotori sadrže Shine-Dalgarno odsječke uz -10 i -35 konsenzus odsječke.

"Odsječak za nadzor eksprimiranja" je DNA odsječak koji nadzire i regulira transkripciju i translaciju drugog DNA odsječka. Odsječak za kodiranje je "pod nadzorom" odsječaka za nadzor transkripcije i translacije u stanici kada RNA polimeraza transkribira odsječak za kodiranje u mRNA, koji se potom translatira u protein koji je kodiran odsječkom za kodiranje.

"Signalni odsječak" može biti umetnut prije odsječka za kodiranje. Taj odsječak kodira signalni peptid, N-terminal do polipeptida, koji priopćuje stanici domaćinu da usmjeri polipeptid ka površini stanice ili izluči polipeptid u medij, a stanica domaćin odreže taj signalni peptid prije no što protein napusti stanicu. Signalni odsječci mogu biti povezani s čitavim nizom proteina podrijetlom iz prokariota i eukariota.

Termin "oligonukleotid", kako se ovdje rabi vezano za sonde iz predmetnog izuma, definira se kao molekul koji se sastoji od dva ili više ribonukleotida, poželjno je više od tri. Njegova točna veličina ovisit će o mnogim čimbenicima koji, sa svoje strane, ovise o konačnoj funkciji i uporabi tog oligonukleotida.

Termin "primer (klica)", kako se ovdje rabi, odnosi se na neki oligonukleotid, bez obzira da li se pojavljue u prirodi, kao u pročišćenim restrikcijskim digestijama, ili je proizveden sintetski, koji je sposoban djelovati kao točka iniciranja sinteze kada se postavi u uvjete u kojima se inducira sinteza produkta umnožavanja klice, koji je komplementaran lancu nukleinske kiseline, tj., u nazočnosti nukleotida i sredstva za induciranje, poput DNA polimeraze, na prikladnoj temperaturi i pH. Klica može biti ili jednolančana ili dvolančana i mora biti dostatno dugačka kako bi potaknula sintezu željenog PCR-umnoženog produkta u nazočnosti sredstva za induciranje. Točna duljina klice ovisit će o mnogim čimbenicima, uključujući temperaturu, podrijetlo klice, te postupak koji se rabi. Na primjer, za dijagnostičke primjene, ovisno o složenosti ciljnog odsječka, oligonukleotidna klica tipično sadrži 15 - 25 ili više nukleotida, iako može sadržavati i manji broj nukleotida.

Klice koje se ovdje navode odabrane su tako da budu "supstancijalno" komplementarne različitim lancima konkretnog ciljnog DNA odsječka. To znači da klice moraju biti dovoljno komplementarne da se hibridiziraju sa svojim odnosnim lancima.

Prema tome, početni odsječak mRNA ne treba odražavati točan odsječak iz kalupa. Na primjer, ne-komplementarni nukleotidni fragment može se vezati na 5' kraj klice, a ostatak početnog odsječka je komplementaran lancu. Alternativno, ne-komplementarne baze ili dulji odsječci mogu biti razbacani u klici, uz uvjet da početni odsječak posjeduje dostatnu komplementarnost s odsječkom lanca kako bi se s njim hibridizirao i tako tvorio kalup za sintezu umnoženog produkta.

Kako se ovdje rabe, termini "restrikcijske endonukleaze" i "restrikcijski enzimi" se odnose na bakterijske enzime, a svaki od njih presijeca dvolančanu DNA točno na ili blizu specifičnog nukleotidnog odsječka.

Stanica je "transformirana" egzogenim ili heterolognim DNA kada se takova DNA unese u stanicu. Transformacijska DNA može, ali ne mora biti integrirana (kovalentno vezana) u kromosomsku DNA koja sačinjava genom stanice. Kod prokariota, kvasca i stanica sisavaca, na primjer, transformacijska DNA može se održati na elementu koji sadrži neovisni mehanizam replikacije, poput plazmida. U odnosu na eukariotske stanice, stabilno transformirana stanica je ona kod koje je transformacijska DNA integrirana u kromosom tako da je nasljeđuju stanice kćeri putem kromosomske replikacije. Ta se postojanost pokazuje sposobnošću eukariotske stanice da ustanovi stanične linije ili klonove koji se sastoje od populacije stanica kćeri koje sadrže transformacijsku DNA. "Klon" je populacija stanica koja je izvedena iz jedne stanice ili zajedničkog pretka putem mitoze. "Stanična linija" je klon primarne stanice koji ima sposobnost stabilnog rasta in vitro tijekom više generacija.

Dva DNA odsječka su "supstancijalno homologna" kada se najmanje oko 75% (poželjno najmanje oko 80 %, a najpoželjnije najmanje oko 90 ili 95 %) nukleotida poklapa duž definirane duljine DNA odsječaka. Odsječci koji su supstancijalno homologni mogu se identificirati usporedbom odsječaka uporabom standardnih računalnih programa dostupnih u bankama za pohranu odsječaka, ili u Southern hybridization pokusu pod, primjerice, strogim uvjetima kako je definirano za taj konkretni sustav. Definiranje prikladnih uvjeta hibridizacije je poznato u stanju tehnike. Vidi, npr. Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

U stanju tehnike je dobro poznato kako su sljedeći kodoni međusobno zamjenjivi za kodiranje svake specifične aminokiseline:

Fenilalanin (Phe ili F) UUU ili UUC

Leucin (Leu ili L) UUA ili UUG ili CUU ili CUC ili CUA ili CUG

Izoleucin (Ile ili I) AUU ili AUC ili AUA

Metionin (Met ili M) AUG

Valin (Val ili V) GUU ili GUC ili GUA ili GUG

Serin (Ser ili S) UCU ili UCC ili UCA ili UCG ili AGU ili AGC

Prolin (Pro ili P) CCU ili CCC ili CCA ili CCG

Treonin (Thr ili T) ACU ili ACC ili ACA ili ACG

Alanin (Ala ili A) GCU ili GCG ili GCA ili GCG

Tirozin (Tyr ili Y) UAU ili UAC

Histidin (His ili H) CAU ili CAC

Glutamin (Gln ili Q) CAA ili CAG

Asparagin (Asn ili N) AAU ili AAC

Lizin (Lys ili K) AAA ili AAG

Asparaginska kiselina (Asp ili D) GAU ili GAC

Glutaminska kiselina (Glu ili E) GAA ili GAG

Cistein (Cys ili C) UGU ili UGC

Arginin (Arg ili R) CGU ili CGC ili CGA ili CGG ili AGA ili AGG

Glicin (Gly ili G) GGU ili GGC ili GGA ili GGG

Triptofan (Trp ili W) UGG

Završni kodon UAA (oker) ili UAG (žuto) ili UGA (opal)

Podrazumijeva se kako se gore navedeni kodoni odnose na RNA odsječke. Analogni kodoni za DNA imaju T umjesto U.

Mutacije se u različitim viralnim proteinima mogu izvesti tako da se određeni kodon promijeni u kodon koji kodira različitu aminokiselinu. Takova mutacija može se lako postići najmanjim mogućim brojem promjena nukleotida. Supstitucijska mutacija te vrste može se izvesti tako da se aminokiselina promijeni u završni protein na nekonzervativni način (tj., promjenom kodona iz aminokiseline koja pripada skupini aminokiselina koje imaju određenu veličinu ili svojstvo aminokiselina koje pripadaju drugoj skupini) ili na konzervativni način (tj., promjenom kodona iz aminokiseline koja pripada skupini aminokiselina koje imaju određenu veličinu ili svojstvo aminokiselina koje pripadaju istoj skupini). Rečena konzervativna promjena općenito vodi do manjih promjena u strukturi i funkciji dobivenog proteina. Ne-konzervativna promjena će vjerojatno u većoj mjeri promijeniti strukturu, aktivnost ili funkciju dobivenog proteina, poput primjerice promjena potaknutih nedostatkom fosforilacije na N nukleoproteinu. U nekim slučajevima poželjno je izvesti više od jedne promjene u viralnom proteinu kako bi se smanjila mogućnost višeznačne promjene fenotipa divljeg tipa.

Slijedi jedan primjer različitih skupina aminokiselina:

Aminokiseline s nepolarnim R skupinama

Alanin

Valin

Leucin

Izoleucin

Prolin

Fenilalanin

Triptofan

Metionin

Aminokiseline s R polarnim skupinama bez naboja

Glicin

Serin

Treonin

Cistein

Tirozin

Asparagin

Glutamin

Aminokiseline s polarnim R skupinama koje imaju naboj (negativno nabijene na ph 6.0)

Asparaginska kiselina

Glutaminska kiselina

Bazične aminokiseline (pozitivno nabijene na pH 6.0)

Lizin

Arginin

Histidin (na pH 6.0)

Sljedeća skupina mogu biti aminokiseline s fenilnim skupinama:

Fenilalanin

Triptofan

Tirozin

Sljedeća skupina može biti prema molekulskoj težini (tj., veličini R skupine):

Glicin 75

Alanin 89

Serin 105

Prolin 115

Valin 117

Treonin 119

Cistein 121

Leucin 131

Izoleucin 131

Asparagin 132

Asparaginska kiselina 133

Glutamin 146

Lizin 146

Glutaminska kiselina 147

Metionin 149

Histidin (na pH 6.0) 155

Fenilalanin 165

Arginin 174

Tirozin 181

Triptofan 204

Posebice poželjne supstitucije su:

- Lys za Arg i obratno, tako da se može održati pozitivni naboj;

- Glu za Asp i obratno, tako da se može održati negativni naboj;

- Ser za Thr, tako da se može održati slobodni -OH; i

- Gin za Asn, tako da se može održati slobodni NH2.

Također se mogu izvesti supstitucije aminokiselina kako bi se supstituirala neka aminokiselina s posebice poželjnim svojstvom. Na primjer, u Cys se može uvesti potencijalno mjesto za disulfidne mostove s drugim Cys. His se može uvesti kao posebice "katalitičko" mjesto (tj. His može djelovati kao kiselina ili baza, i najčešća je aminokiselina u biokemijskoj katalizi). Pro se može uvesti zbog svoje izražene planarne strukture, koja inducira Æ-zaokrete u strukturi proteina.

Dva aminokiselinska odsječka su "supstancijalno homologni" kada je najmanje oko 70 % aminokiselinskih ostataka (poželjno najmanje oko 80 %, a najpoželjnije najmanje oko 90 ili 95 %) identično, ili predstavljaju konzervativne supstitucije.

"Heterologno" područje DNA konstrukta je utvrdivi segment DNA unutar većeg DNA molekula koji se u prirodi ne nalazi povezan s većim molekulom. Prema tome, kada heterologno područje kodira gen sisavca, uz taj gen obično će se nalaziti DNA koja ne prati genomski DNA sisavaca u genomu izvornog organizma. Sljedeći primjer heterolognog odsječka za kodiranje je konstrukt kod kojeg se sam odsječak za kodiranje ne nalazi u prirodi (npr. cDNA kod koje genomski odsječak za kodiranje sadrži introne, ili sintetske odsječke koji imaju kodone koji su različiti od nativnog gena). Varijacije alela ili prirodne mutacije ne uzrokuju heterologna područja DNA kako se ovdje definiraju.

"Protutijelo" je bilo koji imunoglobulin, uključujući protutijela i fragmente istih, koji veže specifični epitop. Taj termin ubuhvaća poliklonska, monoklonska i kimerična protutijela, a potonja su podrobnije opisana u S.A.D. Patentima Br. 4,816,397 i 4,816,567.

"Mjesto prepoznavanja protutijela " je onaj strukturni dio molekula protutijela koje se sastoji od različitih teških i lakih lanaca te hipervarijabilnih regija na koje se specifično veže antigen.

Termin "molekul protutijela" u različitim gramatičkim oblicima kako se ovdje rabi podrazumijeva i intaktni molekul imunoglobulina i imunološki djelatni dio molekula imunoglobulina.

Primjerični molekuli protutijela su intaktni molekuli imunoglobulina, supstancijalno intaktni molekuli imunoglobulina i oni dijelovi molekula imuno-globulina koji sadrže paratop, uključujući one dijelove koji su u predmetnom području poznati kao Fab, Fab', F(ab')2 i F(v), koji dijelovi su poželjni za uporabu u terapijskim postupcima koji su ovdje opisani.

Fab i F(ab')2 dijelovi molekula protutijela pripravljaju se proteolitskom reakcijom papaina i pepsina, na supstancijalno intaktnim molekulima protutijela postupcima koji su dobro poznati. Vidi, na primjer, S.A.D. Patent Br. 4,342,566 Theofilopolousa et al. Fab' dijelovi molekula protutijela također su dobro poznati i proizvode se iz F(ab')2 dijelova, nakon čega slijedi redukcija disulfidnih veza koje povezuju dva dijela teških lanaca, kao što je slučaj kod merkaptoetanola, a potom slijedi alkilacija dobivenog proteina merkaptana s reagensom poput jodoacetamida. Ovdje je poželjno protutijelo koje sadrži intaktne molekule protutijela.

Termin "monoklonsko protutijelo" u različitim gramatičkim oblicima odnosi se na protutijelo koje posjeduje samo jednu vrstu mjesta za kombiniranje protutijela koje ima sposobnost imunoreagirati s konkretnim antigenom. Monoklonsko protutijelo time tipično posjeduje jednostruki afinitet za vezivanje za bilo koji antigen s kojim imunoreagira. Monoklonsko protutijelo prema tome može sadržavati molekul protutijela koji ima veći broj mjesta za kombiniranje protutijela, a svako je imunospecifično za različiti antigen; npr. bispecifično (kimerično) monoklonsko protutijelo.

Termin "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na molekularne entitete i pripravke koji su fiziološki prihvatljivi i obično ne uzrokuju alergijsku ili sličnu nepoželjnu reakciju, poput primjerice želučanih smetnji, vrtoglavice i slično, kada se primjenjuju na čovjeka.

Termin "dostatan za zaštitu životinje od infekcije" ovdje se rabi tako da označava količinu koja je dostatna za sprječavanje, a poželjno je smanjenje, od najmanje oko 30 posto, poželjnije od najmanje 50 posto, a najpoželjnije od najmanje 90 posto, klinički značajne promjene barem jednog od obilježja patologije koju bolest obično uzrokuje.

Klinički, prvi simptomi bjesnoće kod ljudi mogu biti nespecifični znakovi nalik gripi, poput slabosti, vrućice ili glavobolje. Također se može osjećati neugoda ili parestezija na mjestu izlaganja (ugriza), koja će za nekoliko dana uznapredovati do simptoma cerebralne disfunkcije, anksioznosti, zbunjenosti, uzbuđenosti i zatim do delirija, abnormalnog ponašanja, halucinacija i nesanice.

Patologiju stanice kod zaraze bjesnoćom definira encefalitis i mijelitis, a uključuje i perivaskularnu infiltraciju s limfocitima, polimorfonuklearnim leukocitima i stanicama plazme po čitavom CNS-u. Također se u stanicama neurona mogu nalaziti citoplazmatska eozinofilna inkluzijska tjelešca (Negri tjelešca), uključujući piramidalne stanice hipokampusa i Purkinje stanice malog mozga, te u neuronima korteksa i drugih dijelova CNS-a, uključujući spinalne ganglije.

DNA odsječak je "operativno vezan" na odsječak za nadzor eksprimiranja kada odsječak za nadzor eksprimiranja nadzire i regulira transkripciju i translaciju tog DNA odsječka. Termin "operativno vezan" podrazumijeva primjereni start signal (npr. ATG) na početku DNA odsječka koji treba biti eksprimiran, te održavanje točnog okvira za čitanje čime se dopušta eksprimiranje odsječka DNA pod nadzorom odsječka za nadzor eksprimiranja i proizvodnja traženog produkta koji je kodiran DNA odsječkom. Ako gen koji se želi umetnuti u rekombinantni DNA molekul ne sadrži prikladni početni signal, takav se početni signal može umetnuti ispred gena.

Termin "striktni uvjeti hibridizacije" odnosi se na uvjete slanosti i temperature koji su supstancijalno ekvivalentni 5 x SSC i 65 °C i za hibridizaciju i za pranje membrana. Međutim, stručnjak u predmetnom području će znati da takovi "striktni uvjeti hibridizacije" ovise o konkretnim uvjetima, uključujući koncentraciju natrija i magnezija u puferu, duljini i koncentraciji nukleotidnog odsječka, postotku nepodudaranja, postotku formamida i tomu slično. Također je važno kod određivanja "striktnih uvjeta hibridizacije" da li su dva odsječka koja se hibridiziraju RNA-RNA, DNA-DNA ili RNA-DNA. Takove stroge uvjete hibridizacije lako može odrediti stručnjak u predmetnom području sukladno dobro poznatim formulama, kada se hibridizacija odvija tipično 10 - 20°C ispod predviđene ili određene Tm s pranjem u otopinama više ionske jakosti, ukoliko je to poželjno.

Predmetni izum nadalje uključuje terapijske pripravke koji su korisni za izvođenje terapijskih postupaka prema predmetnom izumu. Predmetni terapijski pripravak uključuje, u smjesi, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens (nosač) i jedan ili više mutantnih virusa bjesnoće, polipeptid mutantnog virusa bjesnoće ili fragment istog, koji je ovdje opisan kao djelatni sastojak. U poželjnom utjelovljenju, pripravak sadrži antigen koji je sposoban inducirati imuni odgovor, poželjno zaštitni imuni odgovor protiv bjesnoće.

Spravljanje terapijskih pripravaka koji sadrže polipeptide, analoge ili djelatne fragmente kao aktivne sastojke dobro je poznato u stanju tehnike.

Tipično se takovi pripravci spravljaju u obliku za injektiranje, bilo kao tekuće otopine bilo kao suspenzije, međutim, također se mogu spraviti i kruti oblici koji su prikladni za otapanje, ili suspendiranje, u tekućini prije injektiranja. Pripravak se također može emulzificirati. Djelatni se terapijski sastojak često miješa s ekscipijensima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni s djelatnim sastojkom. Prikladni ekscipijensi su, primjerice, voda, fiziološka otopina, dekstroza, glicerol, etanol i tomu slično, te kombinacije istih. Osim toga, ako je potrebno, pripravak može sadržavati manje količine pomoćnih tvari poput sredstava za navlaživanje ili emulzifikaciju, pH sredstva za puferiranje koja poboljšavaju učinkovitost djelatnog sastojka.

Virus, polipeptid ili fragment istih može se formulirati u terapijski i/ili imunogeni pripravak u obliku neutraliziranih farmaceutski prihvatljivih soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju adicijske soli kiselina (koje se tvore sa slobodnim amino skupinama polipeptida ili molekula protutijela), koje se tvore s neorganskim kiselinama poput, primjerice, klorovodične ili fosforne kiseline, ili s organskim kiselinama poput, primjerice, octene, oksalne, vinske, bademove i tomu slično. Soli koje se tvore od slobodnih karboksilnih skupina također mogu biti izvedene iz neorganskih baza poput, primjerice, natrijevog, kalijevog, amonijevog, kalcijevog ili željeznog hidroksida, te organskih baza poput, primjerice, izopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina i tomu slično.

Terapijski i/ili imunogeni pripravci koji sadrže virus, polipeptide ili fragmente uobičajeno se daju kao pojedinačna doza. Termin "pojedinačna doza" kada se rabi u vezi s terapijskim pripravkom prema predmetnom izumu odnosi se na fizički odjelite jedinice koje su prikladne za pojedinačno doziranje za ljude, a svaka jedinica sadrži prethodno utvrđenu količinu djelatne tvari koja je izračunata kako bi se proizveo željeni terapijski i/ili imunogeni učinak zajedno sa potrebnim razrjeđivačem, tj. nosačem ili vehikulom.

Pripravci se daju na način koji je kompatibilan sa načinom doziranja, te u terapijski ili imunogeno učinkovitim količinama.

Količina koju treba primijeniti ovisi o subjektu koji se liječi, sposobnosti subjektova imuno sustava da upotrijebi djelatni sastojak, te stupnju poželjnog eksprimiranja. Potrebne precizne količine djelatnog sastojka za primjenu ovise o procjeni liječnika i različite su za svakog pojedinca. Međutim, kod davanja polipeptida, prikladne doze mogu biti u rasponu od oko 0,1 do 20, poželjno oko 0,5 do oko 10, i još poželjnije jedan do nekoliko, miligrama djelatnog sastojka po kilogramu tjelesne težine pojedinca dnevno te ovise o ruti primjene. Kod viralne primjene, prikladne doze mogu biti od 105 zaraznih jedinica (infectious units, i.u.) do 107 i.u. Prikladni režimi za inicijalnu primjenu i dodatno cjepivo također variraju, ali ih određuje inicijalna primjena, nakon čega slijede ponovljene doze u sedmodnevnim intervalima putem injekcije ili drugim načinima primjene.

Terapijski pripravci mogu dodatno uključivati jedan ili više sljedećih djelatnih sastojaka: antibiotik, steroid.

Drugo obilježje predmetnog izuma je eksprimiranje DNA odsječaka koji su operativno umetnuti u viruse koji su ovdje opisani. Kao što je dobro poznato u stanju tehnike, DNA odsječci mogu biti eksprimirani operativnim povezivanjem istih na odsječak za nadzor eksprimiranja u prikladnom vektoru za eksprimiranje i uporabom tog vektora za eksprimiranje kako bi se transformirao prikladni domaćin.

Takovo operativno povezivanje DNA odsječka prema predmetnom izumu na odsječak za nadzor eksprimiranja, naravno, uključuje, ako već nije dijelom DNA odsječka, opskrbu kodonom za iniciranje, ATG, u točnom okviru za čitanje uzvodno od DNA odsječka.

U svrhu eksprimiranja DNA odsječaka koji kodiraju viralne proteine prema predmetnom izumu može se rabiti široka lepeza kombinacija domaćin/vektor. Korisni vektori za eksprimiranje, na primjer, mogu se sastojati od segmenata kromosomskih, ne-kromosomskih i sintetskih DNA odsječaka. Prikladni vektori uključuju derivate SV40 i poznate bakterijske plazmide, npr. E. coli plazmidi col El, pCR1, pBR322, pMB9 i njihovi derivati, plazmidi poput RP4; DNA faga, npr. brojni derivati faga λ, npr. NM989 i druge DNA faga, npr. M13 i filamentozni jednolančani DNA fag; plazmidi kvasca poput 2μ plazmida ili derivata istog; vektori koji su korisni za eukariotske stanice, poput vektora koji su korisni za insekte (baculovirus) ili stanice sisavaca; vektori koji su derivirani iz kombinacija DNA plazmida i faga, poput plazmida koji su bili modificirani tako da koriste DNA faga ili druge odsječke koji kodiraju regulatore eksprimiranja i tomu slično.

Bilo koji od mnogobrojnih vrsta odsječaka za nadzor eksprimiranja - odsje-čaka koji nadziru eksprimiranje DNA odsječaka koji su na nju operativno vezani - mogu se rabiti u rečenim vektorima za eksprimiranje DNA odsječaka prema predmetnom izumu. Takovi korisni odsječci za nadzor eksprimiranja uključuju, na primjer, rane ili kasne promotore SV40, CMV, vaccinia, polioma ili adenovirus, lac sustav, trp sustav, TAC sustav, TRC sustav, LTR sustav, glavna operatorska i promotorska područja faga λ, kontrolne regije za fd protein vanjskog omotača faga, promotor 3-fosfoglicerat kinaze ili drugih glikolitskih enzima, promotore kisele fosfataze (npr. Pho5), promotore α-čimbenika parenja kod kvasca, te druge odsječke za koje je poznato da eksprimiraju gene prokariotskih ili eukariotskih stanica ili njihovi virusi i različite kombinacije istih.

Mnoštvo stanica domaćina također su korisne za eksprimiranje DNA odsječaka koji kodiraju viralne proteine prema predmetnom izumu. Takovi domaćini mogu uključivati dobro poznate eukariotske i prokariotske domaćine, poput sojeva E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, gljiva poput raznih vrsta kvasca, te stanice životinja, poput CHO, R1.1, B-W i L-M stanice, stanica bubrega afričkog zelenog majmuna (npr. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 i BMT10), stanica kukaca (npr. Sf9), BHK stanica, te humanih stanica i stanica biljaka u kulturi tkiva.

Podrazumijeva se kako svi vektori, odsječci za nadzor eksprimiranja i domaćini neće funkcionirati jednako dobro za eksprimiranje DNA odsječaka prema predmetnom izumu, niti će svi domaćini funkcionirati jednako dobro u istom sustavu za eksprimiranje. Međutim, stručnjak u predmetnom području znat će, bez nepotrebnog eksperimentiranja, odabarati primjerene vektore, odsječke za nadzor eksprimiranja, te domaćine, radi postizanja poželjnog eksprimiranja bez odstupanja od opsega predmetnog izuma. Na primjer, kod odabira vektora, mora se uključiti i domaćin zato što vektor u njemu mora djelovati. Također treba uzeti u obzir broj kopija vektora, sposobnost kontrole rečenog broja kopija, te eksprimiranje bilo kojeg drugog proteina kojeg taj vektor kodira, poput primjerice antibiotičkih obilježivača.

Kod odabira odsječka za nadzor eksprimiranja, obično će se razmotriti čitav niz čimbenika. Ti čimbenici uključuju, na primjer, relativnu snagu sustava, mogućnost njegovog nadzora, te njegovu kompatibilnost s konkretnim DNA odsječkom ili genom koji treba biti eksprimiran, posebice u odnosu na potencijalne sekundarne strukture. Prikladni mutantni viralni vektori bit će odabrani uzimajući u obzir, npr. njihovu sposobnost replikacije, kao i toksičnost za domaćina produkta kojeg kodiraju DNA odsječci koji trebaju biti eksprimirani, ili mutantni virus.

Uzimajući u obzir te i druge čimbenike, stručnjak u predmetnom području će znati konstruirati niz kombinacija vektor/odsječak za nadzor eksprimiranja/domaćin koje će eksprimirati DNA odsječke prema predmetnom izumu.

Također se podrazumijeva kako se drugi mutantni viralni proteini mogu pripraviti od nukleotidnih odsječaka prema predmetnom izumu. Analozi, kao što su fragmenti, mogu se proizvesti, primjerice putem digestije pepsinom viralnog polipeptidnog materijala. Drugi analozi, poput muteina, mogu se proizvesti putem standardne ciljane mutageneze odsječaka koji kodiraju viralne proteine. Mutanti koji pokazuju imunogeno ili zaštitno djelovanje mogu se identificirati poznatim in vivo i/ili in vitro testovima.

Kako je spomenuto gore, DNA odsječak koji kodira virus ili viralne proteine može se pripraviti sinteski umjesto kloniranjem. Čitav odsječak je složen od preslagivanja i lijepljenja istovjetnih oligonukleotidnih slijedova pripravljenih standardnim postupcima i sastavljenih u cjelovit odsječak za kodiranje. Vidi, npr. Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

Sintetski DNA odsječci omogućuju praktičnu konstrukciju gena koji će eksprimirati mutante viralnih proteina ili "muteine". Alternativno, muteini koji kodiraju DNA mogu se dobiti ciljanom mutagenezom nativnih viralnih gena ili cDNA-ova, a muteini se mogu proizvesti izravno uporabom konvencionalne sinteze polipeptida.

Opći postupak za umetanje ciljanih neprirodnih aminokiselina u proteine opisano je u Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (April 1989). Taj se postupak može koristiti za proizvodnju analoga s neprirodnim aminokiselinama.

Sljedeći su primjeri navedeni radi podrobnije ilustracije poželjnih utjelovljenja predmetnog izuma. Međutim, ni u kom slučaju ne treba smatrati kako rečeni primjeri ograničavaju širi opseg predmetnog izuma.

PRIMJER 1

Virus bjesnoće N preferencijalno inkapsulira genomski RNA. N virusa bjesnoće, poput drugih N minus-lančanih RNA virusa, igra važnu ulogu u regulaciji viralne transkripcije i replikacije putem inkapsulacije de novo sintetizirane genomske RNA (Yang et al., 1998). Kako bi se istražila funkcija N virusa bjesnoće, N virusa bjesnoće je eksprimiran u sustav bakulovirusa te je N pročišćen do gotovo potpune homogenosti putem afinitetne kromatografije (Fu et al., 1991). Kada je pročišćeni N upotrijebljen za inkapsulaciju RNA, otkriveno je kako se N veže na sve testirane RNA transkripte (Yang et al., 1998). Oni uključuju pozitivno-lančanu vodeću RNA virusa bjesnoće (L-70), 5' kraj mRNA virusa bjesnoće N (N-70), te kontrolnu neviralnu RNA (bluescript RNA, B-70). Međutim, međusobno djelovanje između rekombinantnog N i vodeće RNA virusa bjesnoće bilo je najmanje tri puta veće od onog između rekombinantnog N i N mRNA, te 10 puta veće od onog između rekombinantnog N i kontrolne RNA, što upućuje kako N preferira inkapsuliranu pozitivno-lančanu vodeću RNA.

PRIMJER 2

Fosforilacija N virusa bjesnoće modulira viralnu transkripciju i replikaciju. N virusa bjesnoće je fosforiliran (Sokol et al., 1973) i njegovo mjesto za fosforilaciju identificirano je kao serin na poziciji 389 (Dietzschold et al., 1987). Budući da N igra važnu ulogu u regulaciji viralne transkripcije i replikacije putem inkapsulacije de novo sintetizirane genomske RNA (Wunner, 1991), fosforilacija N može utjecati na viralnu transkripciju i replikaciju. Kako bi se utvrdilo da li fosforilacija N ima regulatornu ulogu kod viralne transkripcije i replikacije, sustav reverzne genetike koji su opisali Conzelmann i Schnell (Conzelmann et al., 1994) korišten je za eksprimiranje minigenoma virusa bjesnoće i izravno testiranje učinaka N fosforilacije na transkripciju i replikaciju viralne RNA. Minigenom je eksprimiran iz plazmida pSDI-CAT usmjerenog T7 polimerazom. Kada je eksprimiran u stanice, minigenomski RNA sadrži 68 nukleotida sa kraja 3' i 169 nukleotida sa 5' kraja genoma virusa bjesnoće, a CAT odsječci za kodiranje se nalaze između (Conzelmann et al., 1994). Plazmid pSDI-CAT, zajedno s pRP, pT7T-L, pT7T-G, pT7T-M i pRN ili pRN-S389A, transfektiran je u BHK stanice, a stanice se prikupe 48 sati nakon transfekcije. CAT aktivnost je izmjerena iz staničnog ekstrakta uporabom standardnog CAT testa. Snažna CAT aktivnost otkrivena je u stanicama koje su transfektirane s pRN. Kada je wt (divlji tip, wild-type) N zamijenjen s mutiranim N (serin u alanin), otkriveno je samo oko 20 % CAT aktivnosti, što upućuje da odsutnost N fosforilacije dovodi do smanjivanja viralne transkripcije. Međutim, kada su nazočni i wt N i mutantni N, otkriveno je oko 80 % CAT aktivnosti, što pokazuje da nefosforilirani N nije dominantni negativni regulator (Yang et al., 1999, Appendix 1).

Kako bi se utvrdilo da li N fosforilacija također utječe na viralnu replikaciju, izvedeni su pokusi precjepljivanja. Supernatant iz inicijalne transfekcije se prikupi i koristi za infekciju svježih BHK stanica koje su transfektirane s pRP, pT7T-L i pRN ili pRN-S389A. Stanice se prikupe nakon 48 sati za mjerenje CAT aktivnosti. Najviša je CAT aktivnost (100 %) otkrivena kada je wt N korišten i za inicijalnu transfekciju i za sljedeći pokus precjepljivanja. Kada je wt N korišten za inicijalnu transfekciju, a mutirani N u pokusu precjepljivanja, otkrivena je 43 %-tna CAT aktivnost, što pokazuje da fosforilacija N doista utječe na transkripciju minigenoma. Kada je korišten mutirani N za inicijalnu transfekciju, a wt N u pokusu precjepljivanja, otkrivena je 61 %-tna CAT aktivnost, što pokazuje da je mutantni N podržavao replikaciju minigenoma kod inicijalne transfekcije, iako uz nižu učin-kovitost. Međutim, otkrivena je samo 13 %-tna CAT aktivnost kada je korišten mutantni N i za inicijalnu transfekciju i za pokus precjepljivanja, što upućuje da odsutnost N fosforilacije dovodi do smanjenja viralne RNA transkripcije i replikacije (Yang et al., 1999; Appendix 1).

PRIMJER 3

Serin na poziciji 389 je mutiran u alanin, asparaginsku kiselinu ili glutaminsku kiselinu, a ispitani su učinci tih mutacija na transkripciju i replikaciju virusa bjesnoće u minigenomu, kao i na cjelovite zarazne viruse. Mutacija serina u bilo koju drugu aminokiselinu dovodi do sinteze nefosforiliranog N i smanjenja viralne transkripcije i replikacije u minigenomu. Mutacije od S u A i S u D također su dovele do smanjenja i viralne transkripcije i replikacije kod zaraznih virusa pune duljine. Studije krivulja rasta upućuju kako je proizvodnja mutantnog virusa s mutacijom S-u-A (L16A) bila i do 10,000 puta manja od virusa divljeg tipa (L16). Northern blot hibridizacija sa sondama virusa bjesnoće otkrila je kako su brzine viralne transkripcije i replikacije smanjene čak do 10 puta kod mutantnih virusa kada N nije bio fosforiliran. Interperetacija podataka iz sustava minigenoma i zaraznih virusa pune duljine upućuje kako je fosforilacija N virusa bjesnoće nužna za replikaciju. Dodatne studije koje uključuju tretman zaraženih stanica cikloheksimidom otkrila su kako je viralna transkripcija također smanjena kada N nije bio fosforiliran. Uzeti zajedno, ti rezultati definitivno potvrđuju kako N fosforilacija ima važnu ulogu u procesu transkripcije i replikacije virusa bjesnoće.

Stanice, virus, plazmidi i protutijela. BSR (klon BHK) i BSR T7/5 (BSR stanice koje stabilno eksprimiraju T7 polimeraze, [Buchholz et al., 1999]) uzgojeni su u Dubeccovom minimal essential medium i transfektirane s plazmidima, kako je prethodno opisano (Yang et al., 1999). Rekombinantni vaccinia virus koji eksprimira bakterijsku T7 RNA polimerazu (vTF7-3) pripravljen je kako je opisano (Fuerst et al., 1986). Plazmidi koji su korišteni za eksprimiranje potpuno infektivnog virusa (pSAD-L16), minigenoma virusa bjesnoće (pSDI-CAT), virusa bjesnoće L (pT7T-L), glikoproteina (pT7T-G) i matriks proteina (pT7T-M) (Buchholz et al., 1999; Conzelmann et al., 1987; Schnell et al., 1984) dobiveni su od Dr. K. Conzelmanna. Plazmidi za eksprimiranje N (pRN) i P (pRP) konstruirani su prije (Fu et al., 1994). Poliklonski antiserum protiv virusa bjesnoće N pripravljen je u kunićima, kako je prethodno opisano (Fu et al., 1991).

Ciljana mutageneza. Mutacija serina 389 N virusa bjesnoće u A, G, D, N, E ili Q izvodi se ciljanom mutagenezom, uporabom postupka prema Weiner et al. (1994). Šest parova klica je sintetizirano kako je sažeto prikazano u Tablici 1, a koncipirane su tako da sadrže jednu ili dvije nukleotidne promjene koje su dovele do mutacija kodona serina. PCR je izveden na svakom od tri para klica uporabom pRN (Fu et al., 1994) kao kalupa. PCR produkti su bili podvrgnuti digestiji s DpnI, koji cijepa metiliranu i hemimetiliranu DNA na GmeATC mjestu, to jest samo nemutiranu roditeljsku pRN DNA. Preostalim nemetiliranim produktima PCR transformirane su kompetentne XL-1 Blue stanice. Mutacije u plazmidima potvrđene su sekvenciranjem nukleotida.

Tablica 1. Klice koje su rabljene za izvođenje mutacije od serina na poziciji 389 u alanin, asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu na virusu bjesnoće N. (Masno otisnuta slova predstavljaju mutirani kodon)

[image]

Kako bi se mutacije na virusu bjesnoće N unijele u infektivnog klona, SphI fragment koji sadrži serinski kodon N potpunog infektivnog klona (pSAD-L16) (nukleotidni odsječci 482 - 4041 genoma virusa bjesnoće [Conzelmann et al., 1990]) kloniran je u SphI mjesto na pGEM-3Z. Dobiveni plazmid se rabi kao kalup za konstrukciju mutacije kako je opisano gore za pRN. Serin na poziciji 389 je mutiran u alanin, asparaginsku kiselinu ili glutaminsku kiselinu u surogatnom vektoru. Nakon potvrde analizom odsječka, svaki se od mutiranih SphI fragmenata klonira natrag do pSAD-L16. Dobivena su tri mutirana klona s očekivanim mutacijama i pravilnom orijentacijom i nazvani su pSAD-L16A, pSAD-L16D i pSAD-L16E.

Transfekcija. Transfekcija BSR stanica s plazmidima izvedena je kako je prethodno opisano (Yang et al., 1999). Ukratko, BSR stanice su zaražene s rekombinantnim vaccinia virusom (vTF7-3) s multiplicity of infection (moi) od 5 plaque-forming units (pfu) po stanici. Jedan sat nakon infekcije, stanice su transfektirane s različitim kombinacijama pomiješanih plazmida uporabom Lipofectamina (Life Technologies, Rockville, MD). Transfektirane stanice se prikupe u točno određeno vrijeme za daljnu analizu.

Test s kloremfenikol aktil transferazom (CAT). CAT aktivnosti izmjerene su Quan-T-CAT pokusom (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) sukladno proizvođačevom protokolu. Transfektirane stanice se liziraju, a supernatanti se inkubiraju s biotiniliranim kloramfenikolom i [3H] acetil koenzimom A. Potom se u reakciju dodaju zrnca obložena streptavidinom. Nakon što se uklone slobodni radioaktivni materijali, peleti se ponovno suspendiraju u tekućini za scintilaciju za kvantifikaciju putem scintilacijske spektrometrije. CAT aktivnosti se izražavaju kao zbroj po minuti. Relativne CAT aktivnosti u stanicama koje su transfektirane sa svakim od mutiranih N proteina izračunate su putem CAT aktivnosti u stanicama koje su transfektirane sa wt N kao 100 %.

Radiooznačavanje i imunoprecipitacija proteina. Transfektirane ili zaražene BSR stanice označene su ili sa [35S] metioninskom ili [32P] fosfornom kiselinom (Amersham Pharmacia Biotech), kako je prethodno opisano (Yang et al., 1999). Stanice se prikupe i podvrgnu imunoprecipitaciji s protu-N protutijelima, a potom slijedi elektroforeza na 12 % poliakrilamid/10 % SDS gelu i autoradiografija.

Northern i Western blotting. Transfektirane ili zaražene BSR stanice, ili pročišćeni virusi podvrgnuti su Northern i/ili Western blottingu. Za Northern blotting, BSR stanice su lizirane s Trizon reagensom (Life Technologies), a ukupna RNA se pripravi sukladno proizvođačkim specifikacijama. Poli A+ mRNA se pročisti iz ukupne RNA uporabom mRNA pribora za izolaciju (Roche, Indianapolis, IN). RNA pripravci se 15 minuta denaturiraju s 10 mM natrij fosfatnog pufera (pH 7.4), koji sadrži 50 % (v/v) formamida na 65°C i elektroforeziraju na 1,1 % agarnom gelu koji sadrži 1,1 M formaldehida i 10 mM natrijevog fosfata. RNA se potom transferira i kovalentno fiksira na najlonsku membranu za hibridizaciju s CAT, genom virusa bjesnoće ili β-aktin sondama. Kvantifikacija RNA vrpci izvedena je densitometrijom. Za Western blots, BSR stanice su lizirane s RIPA puferom, a proteini su izravno razdvojeni putem SDS-PAGE. Nakon transfera u nitroceluloznu membranu, virus bjesnoće N je otkriven putem kunićjih protu-N poliklonskih protutijela, kako je opisano (Fu et al., 1991).

Odabir mutantnih virusa bjesnoće. Odabir mutantnih virusa se vrši bilo u BSR stanicama zaraženim s vTF7-3 (Fuerst et al., 1986), bilo u BSR T7/5 stanicama (Buchholz et al., 1999; Schnell et al., 2000). Ukratko, BSR stanice su zaražene s vTF7-3 s moi od 1. Nakon jedan sat, stanice su transfektirane s 10 mg pRN, 2,5 mg pRP, 1,5 mg pT7T-L i 10 mg pSAD-L16, pSAD-L16A, pSAD-L16D ili pSAD-L16E. Nakon inkubacije od 48 sati, stanice se ponovno suspendiraju s medijem i podvrgnu trima ciklusima smrzavanja i odmrzavanja kako bi se oslobodio virus povezan sa stanicom. Vaccinia virus je uklonjen centrifugiranjem i potom filtracijom kroz 0,2 m filterski sklop (Millipore), kako je prethodno opisano (Schnell et al., 1994). Alternativno, BSR T7/5 stanice su transfektirane s 10 mg pSAD-16 ili pSAD-L16A, zajedno s 10 mg pTIT-N, 2,5 mg pTIT-P i 2,5 mg TIT-L, kako je opisano (Schnell et al., 2000). Kako bi se potvrdilo da mutantni virusi sadrže poželjne mutacije, ukupna RNA je ekstrahirana iz BSR stanica koje su zaražene sa svakim od tih virusa i podvrgnute PCR amplifikaciji za N gen uporabom klica (SEQ ID NOS: 13-14) 10g (5'CTACAATGGATGCC-GAC3') i 304 (5'TTGACGAAGATCTTGCTCAT3'), kako je prethodno opisano (Smith et al., 1991). Te klice mogu amplificirati čitav N odsječak za kodiranje genomske RNA. Amplificirani fragment je izravno sekvenciran uporabom klice (SEQ ID NO: 15) 113 (5'GTAGGATGCTATATGGG3') (Smith et al., 1991), koji neposredno prethodi području mutacije na N genu. Mutantni virusi koji nose mutacije S u A, S u D i S u E označeni su L16A, L16D, odnosno L16E.

Krivulja rasta virusa. BSR stanice koje su uzgajane u pločicama sa šest jamica zaražene su sa wt ili mutantnim virusima bjesnoće s moi od 1 ffu/stanici. Nakon inkubacije pri 37 °C u trajanju od 1 sat, virusni inokulati su uklonjeni i stanice isprane s PBS-om radi uklanjanja bilo kojeg neapsorbiranog virusa. Stanicama se dodaje svježa hranjiva podloga, po 100 ml supernatanta se ukloni na 6, 12, 24, 36, 48, 60 i 72 sata nakon infekcije. Alikvoti virusa titriraju se u dvostruko u BSR stanicama, kako je prethodno opisano (Fu et al., 1996).

Tretman zaraženih stanica s CHX-om. Cikloheksimid (CHX) je kupljen od tvrtke Sigma (St. Louis, Mo.) i dodan u stanice zaražene virusom bjesnoće u konačnoj koncentraciji od 150 μg/ml 1 sat nakon infekcije, kako je prethodno opisano (3). Na 6, 12 i 24 h nakon infekcije, stanice se prikupe i RNA se ekstrahira za Northern blot hibridizaciju.

Učinci N fosforilacije na viralnu transkripciju i replikaciju vjerojatno su barem djelomično uzrokovani čistim negativnim nabojem fosfatne polovice. Prije je već pokazano kako fosforilacija N virusa bjesnoće igra važnu ulogu u procesu viralne transkripcije i replikacije (Yang et al., 1999). Mutacija fosfoserina u alanin dovodi do smanjene transkripcije i replikacije minigenoma virusa bjesnoće. Kako bi se odredilo da li su učinci fosforilacije N virusa bjesnoće na viralnu transkripciju i replikaciju uzrokovani čistim negativnim nabojem fosfatne polovice ili strukturom S, ili oboma, fosforilirani serin na poziciji 389 N mutiran je u A, G, D, N, E i Q. BSR stanice su zaražene rekombinantnim vaccinia virusom vTF7-3, potom slijedi transfekcija s plazmidima koji eksprimiraju minigenom virusa bjesnoće (pSDI-CAT), virusom bjesnoće L (pT7T-L) i virusom bjesnoće P (pRP), zajedno s plazmidima koji eksprimiraju N virusa bjesnoće ili mutantni N (pRN, pRN-SA, pRN-SG, pRN-SD, pRN-SN, pRN-SE ili pRN-SQ), kako je prethodno opisano (Conzelmann and Schnell, 1994; Yang et al., 1999). Nakon inkubacije od 48 h, BSR stanice se prikupe, a CAT aktivnosti se izmjere uporabom Quan-T-CAT testa. Relativne CAT aktivnosti, koje su mjera transkripcije minigenoma u stanicama koje su transfektirane sa svakim od mutiranih N plazmida, izračunate su uporabom CAT aktivnosti u stanicama koje su transfektirane s wt N kao 100 %. Rezultati su rezimirani u Slici 1. CAT aktivnosti povezane sa wt N iznosile su 6, 9, 28, 40, 46 i 62%, u stanicama koje su transfektirane s pRN-SG, pRN-SA, pRN-SN, pRN-SD, pRN-SQ, odnosno pRN-SE. Kod stanica koje su transfektirane sa svim drugim plazmidima, ali bez plazmida koji eksprimira N, relativna CAT aktivnost iznosila je manje od 2 % (podaci nisu prikazani). Ti rezultati upućuju kako su učinci N fosforilacije na viralnu transkripciju ili replikaciju, ili obje, vjerojatno barem djelomično uzrokovani čistim negativnim nabojem fosfatne polovice i strukturom serinskog ostatka.

Povećavanje ili smanjivanje koncentracije plazmida koji eksprimira N ne može kompenzirati učinke N fosforilacije na viralnu transkripciju i replikaciju. Kod proučavanja učinaka fosforilacije VSV P proteina, Spadafora et al. (1996) uočili su kako je nefosforilirani P bio bitno manje aktivan kao pomagač viralne transkripcije pri niskim koncentracijama. Kako bi se utvrdilo da li koncentracija N ima ikakav učinak na sposobnost mutantnih N proteina da postignu optimalnu transkripciju i replikaciju minigenoma virusa bjesnoće, korištene su različite koncentracije (5, 10, 15 i 20 mg) plazmida koji eksprimiraju N ili mutantni N (pRN-SA, pRN-SD, ili pRN-SE) za transfekciju, a stanice se prikupe za CAT test. Kako je prikazano na Slici 2, 10 mg svakog mutantnog plazmida koji eksprimira N i 15 mg wt N (pRN) dovelo je do optimalnih CAT aktivnosti. Veća ili manja količina dovela je do neznatno nižih CAT aktivnosti (20 %), što upućuje kako povećavanje ili smanjivanje koncentracije N ne utječe bitno na viralnu transkripciju bilo kod wt N, bilo kod mutantnog N. Kako bi se osiguralo da razine eksprimiranog N korespondiraju s količinom dodanih plazmida koji eksprimiraju N, transfektirane stanice se liziraju s RIPA puferom, lizati stanica se podvrgnu analizi putem SDS-PAGE, a potom slijedi Western blotting uporabom poliklonskih protu-N protutijela (Fu et al., 1994). Kako je prikazano na dnu Slike 2, količina N koji je eksprimiran za wt, odnosno mutantne N proteine proporcionalan je koncentraciji dodanih plazmida koji eksprimiraju N.

Fosforilacija N virusa bjesnoće djeluje i na transkripciju i na replikaciju minigenoma virusa bjesnoće. U nedavnom istraživanju (Yang et al., 1999) i gore opisanom istraživanju, testirane su samo CAT aktivnosti kako bi se izmjerila viralna transkripcija i replikacija. Kako bi dodatno potvrdili da li fosforilacija N utječe na viralnu transkripciju ili replikaciju, ili oboje, izvršena je Northern blot hibridizacija kako bi se izmjerili transkripti i genomski analozi u transfektiranim stanicama. Za mjerenje viralne transkripcije, pripravljena je ukupna RNA iz transfektiranih stanica, a poliA + mRNA je pročišćen iz ukupne RNA. Za mjerenje viralne replikacije, transfektirane stanice su ekstrahirane s destiliranom H2O, a RNP kompleks je imunoprecipitiran s poliklonskim protu-N protutijelima. Kompleks je podvrgnut tretmanu s Trizon reagensom kako bi se dobili genomski analozi. RNA pripravci su hibridizirani sa CAT probom koja je označena s [a-32P]-dCTP nick translacijom iz CAT cDNA. Kako je prikazano na Slici 3, količine CAT transkripata i genomskih RNA analoga su smanjene kada je N nefosforiliran. Djelatnosti transkripcije i replikacije bile su u rasponu od visoke do niske za sljedeći poredak: wt N, N s mutacijom S u E, S u D i S u A. Količine CAT transkripata u stanicama koje su transfektirane s pRN-SA, pRN-SD ili pRN-SE iznosile su 17, 63 i 85 % od wt N (pRN). Te vrijednosti dobro korespondiraju s odnosnim CAT aktivnostima koje su prikazane na Slici 1. Količine genomskih analoga u stanicama koje su transfektirane s pRN-SA, pRN-SD ili pRN-SE iznosile su 12, 55 i 95 % količine u stanicama koje eksprimiraju wt N (pRN), što pokazuje kako je sinteza bilo viralnih transkripata bilo genomskih analoga u minigenomskom sustavu pod utjecajem fosforilacije N.

Kako bi isključili mogućnost da je smanjena transkripcija i replikacija u stanicama koje su transfektirane s mutantnim plazmidima koji eksprimiraju N uzrokovana različitim razinama sintetiziranog N, transfektirane stanice su označene s [35S]metioninom i lizirane s RIPA puferom. Označeni N je imunoprecipitiran s protu-N protutijelima i analiziran putem SDS-PAGE. Kako je prikazano na Slici 3, slične količine N ili mutantnog N su imunoprecipitirane u stanicama koje su transfektirane s različitim N konstruktima. Kako bi potvrdili da su N mutanti doista nefosforilirani, transfektirane stanice su označene s [32P]fosfornom kiselinom. Nakon liziranja s RIPA puferom, označeni N je imunoprecipitiran s protu-N protutijelima i analiziran putem SDS-PAGE. Samo wt N je bio fosforiliran, a svi drugi mutantni N proteini nisu (Slika 3).

Konstrukcija i selekcija mutantnih virusa bjesnoće. U minigenomskom sustavu, viralni proteini koji su nužni za viralnu transkripciju i replikaciju sintetizirani su T7 polimerazom, pa tako njihova sinteza nije bila pod nadzorom regulatornog aparata virusa bjesnoće. Prema tome, nužno je odrediti učinke N fosforilacije virusa bjesnoće na viralnu transkripciju i replikaciju kod potpunog zaraznog virusa. U tu svrhu, mutacije serina 389 na N u alanin (L16A), asparaginsku kiselinu (L16D) ili glutaminsku kiselinu (L16E) su unešene u infektivni klon pune duljine (Schnell et al., 1994). (L16A, L16D i L16E su pohranjene u The American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, pod rednim brojevima ATCC PTA-3541, PTA-3542 i PTA-3543, 20. srpnja 2001. Nakon transfekcija tih klonova u BSR stanice, dobiveni su wt virus L16, kao i mutantni virusi L16D i L16E. Međutim, transformacija s L16A BSR stanica nije bila efikasna. Sukladno tome, BSR T7/5 stanice (Buchholz et al., 1999) su korištene za odabir L16A te je L16A uspješno sačuvan. RT-PCR i izravno sekvenciranje potvrdili su kako ti mutantni virusi sadrže poželjne mutacije. Genomska RNA wt virusa (L16) je zadržala kodon za serin (UCU) na poziciji 389, dočim genomske RNA iz virusa L16A, L16D i L16E imaju serin (UCU) koji je supstituiran s alaninom (GCU), asparaginskom kiselinom (GAU) i glutaminskom kiselinom (GAA). Kako bi potvrdili da mutantni virusi eksprimiraju nefosforilirani N, BSR stanice koje su zaražene sa svakim virusom označene su ili s [35S]metioninom ili s [32P]fosfornom kiselinom i podvrgnute imunoprecipitaciji i PAGE analizi. Kao i kod minigenomskog sustava, N označen [35S]metioninom je otkriven u BSR stanicama koje su zaražene sa svakim virusom, a N označen [32P]fosfornom kiselinom je otkriven samo u BSR stanicama koje su zaražene s L16 (podaci nisu prikazani), što upućuje da mutacija serina na poziciji 389 ukida fosforilaciju N u potpuno infektivnom virusu.

Mutantni virusi bjesnoće repliciraju se polaganije od wt virusa. Na početku su se wt virus bjesnoće (L16), mutantni virusi L16D i L16E množili do visokih titara (>107 ffu/ml) u BSR stanicma na 37°C, ali se L16A slabo razvijao (titri < 104 ffu/ml). Kako bi svladali tu poteškoću, L16A je uzgajan u BSR stanicama na 31°C, kako je opisano za mutantni VSV (Wertz et al., 1998) i množio se do viših titara (> 105 FU/ml). Krivulje rasta za wt, kao i za mutantne viruse bjesnoće ispitane su infektiranjem BSR stanica sa svakim virusom na moi od 1 ffu po stanici. Kako je prikazano na Slici 4, wt virus (L16) se konzistentno množio brže od mutantnih virusa i dostigao je titre više od 109 pfu/ml na vrhuncu proizvodnje virusa (60 sati). U tom momentu, brzina rasta mutantnih virusa je zaostajala, posebice za L16A. Njihov prinos iznosio je samo 105 pfu/stanici, najmanje 4 reda veličine (10,000 puta) niže od onog za wt virus. Ti podaci pokazuju kako fosforilacija N potiče proizvodnju virusa, vjerojatno putem regulacije ili modulacije transkripcije i replikacije virusa bjesnoće.

Fosforilacija N modulira i viralnu transkripciju i viralnu replikaciju kod potpuno infektivnog virusa bjesnoće. Podaci iz krivulje rasta prikazani na Slici 4. pokazuju da je rast mutantnih virusa s nefosforiliranim N, posebice mutantnog virusa L16A, bio oštro smanjen. To može biti posljedica inhibicije viralne transkripcije ili replikacije, ili obje. Kako bi istražili da li su i viralna transkripcija i viralna replikacija inhibirane kod mutantnih zaraznih virusa bjesnoće, BSR stanice su zaražene wt virusom L16 s moi od 1, kao i mutantnim virusima L16A, L16D ili L16E. Ukupna RNA, koja je izdvojena 40 sati p.i., analizirana je Northern blot hibridizacijom uporabom sondi koje su izrađene i od cDNA N (Fu et al., 1991) i od cDNA glikoproteina (G) (Fu et al., 1993). Te probe mogu razlikovati N ili G transkripte (1,4 kb i 1,8 kb) od genomske RNA (12 kb). Kako je pokazano na Slici 5, svaka proba otkrila je transkripte i genomske RNA i N ili G. Osim toga, također su detektirani i readthrough (RT) transkripti i/ili defective-interfering transkripti (DI) RNA. Vrpce neposredno iznad N ili G transkripata, kada su hibridizirani bilo sa G bilo sa N probama, mogu predstavljati RT transkripte. Vrpca neposredno ispod genomske RNA, kada se hibridizira sa G probom, može predstavljati RT transkript (G ili L) ili DI RNA. Kod L16A virusa, količina viralne genomske RNA i transkripata iznosila je 10 - 12 %, odnosno 21 - 28 % wt virusa. Kod L16D virusa, količina viralne genomske RNA i transkripata iznosila je 41 - 45 %, odnosno 60 - 65 % wt virusa. Kod L16E virusa, količina viralne genomske RNA i transkripata iznosila je 100 % wt virusa. Općenito, inhibicija viralne replikacije (10 - 12 % i 41 - 54 %) bila je stroža od (inhibicije) transkripcije (21 - 28 % i 60 - 65 %) u stanicama koje su zaražene s L16A i L16D virusima. Ti podaci, zajedno s podacima koji su dobiveni iz minigenomskog sustava, upućuju da nefosforilirani N dovodi do smanjenja viralne replikacije. U minigenomskom sustavu viralna replikacija ne ovisi o viralnoj transkripciji budući da je N transkripcija bila pod nadzorom T7 polimeraze, a razina nefosforiliranog N bila je slična onoj kod wt N. Ipak, količine genomske RNA su smanjene kada N nije fosforiliran (Slika 2), što pokazuje kako je fosforilacija N potrebna za optimalnu viralnu replikaciju.

Kako bi dodatno utvrdili da li fosforilacija N također utječe na viralnu transkripciju, izvršeni su pokusi u svrhu razdvajanja procesa transkripcije od procesa replikacije inhibicijom de novo sinteze proteina u zaraženim stanicama s CHX. BSR stanice su zaražene sa svakim od virusa na moi od 3 FFU po stanici, a 1 sat nakon infekcije CHX je dodan u hranjivu podlogu u konačnoj koncentraciji od 150 μg/ml kako bi se u potpunosti inhibirala sinteza proteina (3). Zaražene stanice bez tretmana s CHX-om uključene su kao kontrola. Na 6, 12 i 24 sati nakon infekcije, stanice se prikupe i RNA se ekstrahira za Northern blot hibridizaciju s probom N virusa bjesnoće. Bez CHX-a, svi virusi su se replicirali budući da se količina genomske RNA povećala za svaki od virusa kao funkcija vremena (Slika 6A). Učinkovitost viralne transkripcije i replikacije za svaki od virusa bila je slična onima prikazanim na Slici 5 za svaku vremensku točku. Dodavanjem CHX-a u hranjivu podlogu, replikacija virusa je inhibirana budući da se količina genomske RNA nije povećala niti za jedan virus na svakoj vremenskoj točki (Slika 6B). Osim toga, sinteza N proteina virusa bjesnoće bile je inhibirana u BSR stanicama koje su tretirane s CHX-om (podaci nisu prikazani). Međutim, količina transkripata za svaki od virusa se povećala tijekom jednakog vremenskog perioda. Kvantifikacija transkripata za svaku vremensku točku za svaki pojedinačni virus u odnosu na količinu kod wt L16 upućuje kako je učinkovitost transkripcije za L16A, L16D i L16E iznosila 8 do 12 %, 53 do 65%, odnosno 91 do 100 % (količine) za wt virus L16. Rezultati nedvojbeno pokazuju kako nefosforilirani N, uz iznimku N s mutacijama iz S u E, također inhibira viralnu transkripciju.

Nefosforilirani N nije promijenio omjer između genomske RNA i antigenomske RNA. Nefosforilirani N se snažnije vezao na vodeću RNA od fosforiliranog N (Yang et al., 1999). Prema tome, postoji mogućnost da fosforilacija N ima ulogu u viralnoj transkripciji i replikaciji putem inkapsulacije veće količine antigenomske RNA od genomske RNA. Razlog tomu je da nefosforilirani N, zbog svojeg snažnijeg vezanja na antigenomsku RNA (Yang et al., 1999), prvom koraku u viralnoj replikaciji, može smanjiti sintezu minus-lančane genomske RNA kod potomstva, čime se mijenja omjer genomske prema antigenomskoj RNA. Kako bi testirali tu hipotezu, ukupna RNA ekstrahirana iz BSR stanica zaraženih svakim od wt ili mutantnih virusa podvrgnuta je Northern blot hibridizaciji sa RNA klicama sense (transkripcija sa T7 polimerazom) ili antisense (transkripcija sa SP6 polimerazom) pripravljenim na osnovu pRN kalupa. RNA je također pripravljena iz viriona koji su pročišćeni iz BSR stanica zaraženih sa svakim od rečenih virusa. Omjer genomske RNA i antigenomske RNA u zaraženim stanicama kod wt i mutantnih virusa bio je približno sličan (3:1) (Slika 7). Omjeri tih virusa koji su nađeni u pročišćenim virionima također su bili slični (16:1 do 19:1) za svaki od rečenih virusa. Ti podaci upućuju kako N fosforilacija vjerojatno ne utječe na preferencijalnu inkapsulaciju i pakiranje genomske RNA u odnosu na antigenomski RNA.

Da su i transkripcija i replikacija virusa bjesnoće smanjeni kada je fosforilirani N serin mutiran, pokazano je i u minigenomskom sustavu i kod zaraznog virusa. Kada je N nefosforiliran, brzine transkripcije i replikacije su smanjene i do 10 puta u usporedbi s fosforiliranim N. Viralna produktivnost kod rečenih mutantnih virusa smanjena je i do 10,000 puta, posebice kada je fosforilirani serin mutiran u alanin. Ti podaci upućuju kako je fosforilacija N virusa bjesnoće, iako nije apsolutno nužna, važna za modulaciju transkripcije i replikacije virusa bjesnoće. Osim toga, interpretacija podataka također pokazuje kako su učinci fosforilacije N virusa bjesnoće na viralnu transkripciju i replikaciju posljedica kombiniranja strukture serina i čistog negativnog naboja fosfatne polovice. Mutacija fosforiliranog serina N virusa bjesnoće u neutralne aminokiseline alanin i glicin smanjile su viralnu transkripciju i replikaciju i do 10-erostruko. Alternativno, mutacija fosfoserina u asparaginsku kiselinu ili glutaminsku kiselinu, a obje sadrže kiselinske postranjske lance koji su negativno nabijeni pri fiziološkim pH, povratila je aktivnosti viralne transkripcije i replikacije na više od 60 % i 80 % razine kod fosforiliranog N. Međutim, kada je S mutiran u N ili Q, a oba imaju strukture koje su slične onima kod D i E, ali im nedostaje negativni naboj, aktivnosti viralne transkripcije smanjene su za najmanje jednu trećinu, ali su još uvijek više od onih koje su posljedica mutacija iz S u A ili S u G. Osim toga, činjenica da je mutantni virus L16A rastao brže na 31°C nego na 37°C upućuje na temperaturnu osjetljivost mutantnog virusa. Ti rezultati upućuju kako su i struktura aminokiseline i čisti negativni naboj fosfatne polovice važni za viralnu transkripciju i replikaciju.

N virusa bjesnoće, poput svog analoga u VSV, igra bitnu ulogu u regulaciji viralne RNA transkripcije i replikacije putem inkapsulacije de novo sintetizirane viralne genomske RNA (Wagner and Rose, 1996; Wertz et al., 1987; Wunner, 1991, 23, 25, 27). Činjenica da je N virusa bjesnoće, ali ne i N VSV-a, fosforiliran potaknula je pitanja o načinima na koje je fosforilacija povezana s regulacijom transkripcije i replikacije RNA virusa bjesnoće (Wunner, 1991). Yang et al., 1999, te studije koje su ovdje prikazane upućuju kako su i viralna transkripcija i replikacija minigenoma, kao i potpunog zaraznog virusa bile inhibirane kada N nije fosforiliran. Količine bilo viralnih transkripata bilo genomskih analoga bile su niže u stanicama koje su transfektirane s nefosforiliranim N konstruktima nego u stanicama koje su transfektirane s fosforiliranim N. Slično tomu, količine bilo viralnih transkripata, bilo genomske RNA bile su niže u stanicama zaraženim mutantnim virusima koji eksprimiraju nefosforilirani N nego u stanicama koje su zaražene wt virusom. U minigenomskom sustavu, uočeno smanjenje viralne transkripcije i replikacije nije uzrokovano razlikama u eksprimiranje mutantnog N proteina u transfektirane stanice, budući da u pokusima nisu otkrivene nikakve razlike u razinama eksprimiranja N.

Ovo istraživanje također se bavi pitanjem da li fosforilacija N utječe na viralnu transkripciju, replikaciju ili obje. Jedan mogući scenario bio bi da fosforilacija N utječe na viralnu transkripciju, replikaciju ili obje. Kvantifikacija viralnih transkripata i genomske RNA u minigenomu i zaraznom virusu upućuje kako su razine viralnih transkripata kao i razine genomske RNA (ili analoga) smanjene kada N nije bio fosforiliran (Slike 2 i 5). Međutim, ti podaci nužno ne znače da nefosforilirani N inhibira i viralnu transkripciju i replikaciju zbog inherentne složenosti viralne transkripcije i replikacije u zaraženim stanicama (Wagner and Rose, 1996). Smanjenje replikacije viralnog genoma dovodi do manjeg broja kalupa za transkripciju, što će najvjerojatnije smanjiti akumulaciju viralne mRNA. S druge strane, smanjenje transkripcije smanjuje količinu N proteina i na kraju dovodi do smanjenja replikacije. Bez obzira na to, iz podataka dobivenih iz minigenomskog sustava može se zaključiti kako fosforilirani N potiče viralnu replikaciju. Viralna replikacija se smanjuje kada N nije fosforiliran u minigenomskom sustavu (vidi Sliku 2), usprkos činjenici kako viralna replikacija, u minigenomskom sustavu, nije ovisna o viralnoj transkripciji budući da je N transkripcija pod nadzorom T7 polimeraze. Doista, imunoprecipitacija pokazuje kako je razina nefosforiliranog N bila slična onoj kod wt N u minigenomskom sustavu.

Kako bi dodatno pokazali da li i kako N fosforilacija utječe na viralnu transkripciju, odvojili smo viralnu transkripciju od viralne replikacije inhibiranjem sinteze proteina tretiranjem zaražene stanice s CHX-om. Viralna replikacija je ovisna o de novo sintezi viralnog N proteina, a transkripcija nije (25). Pod tim uvjetima, viralna replikacija je smanjena, ali transkripcija nije (Slika 6), čime je omogućena procjena učinaka N fosforilacije na viralnu transkripciju neovisno o viralnoj replikaciji. Podaci pokazuju kako fosforilacija N također modulira viralnu transkripciju budući da je viralna transkripcija inhibirana gotovo 90 % kada N nije fosforiliran, posebice kada je fosforilirani S mutiran u A. Prema tome, podaci pokazuju kako fosforilacija N potiče viralnu transkripciju i replikaciju.

Kao kod svih jednolančanih minus-sense RNA virusa, kod virusa bjesnoće RNP kompleks je infektivna jedinica (Wunner, 1991). Složeno međusobno djelovanje između komponenti unutar RNP kompleksa uzrokuje transkripciju i replikaciju virusa bjesnoće (Wagner and Rose, 1996; Wertz et al., 1987). Prethodno je pokazano kako se defosforilacijom pročišćenog N virusa bjesnoće inkapsulira više vodeće RNA od fosforiliranog N (Yang et al., 1999). Mutacija serina na poziciji 389 N virusa bjesnoće u alanin također je dovela do povećanog vezanja na vodeća RNA u usporedbi s onim za wt N. Fosforilacija N utječe i na viralnu transkripciju i na viralnu replikaciju. Stoga je moguće da snažno vezanje nefosforiliranog N u RNA može spriječiti da L dobije dostup genomskoj RNA kako bi inicirao viralnu transkripciju i replikaciju. Iako N ostaje vezan na genomsku RNA tijekom procesa transkripcije i replikacije preko fosfatnih veza (Emerson, 1982), N protein povezan s kalupom mora se nakratko odmotati i odvezati od genomske RNA kako bi protein L pristupio RNA kalupu (Bannerjee and Chattopadhyay, 1990). Fosforilacija N može oslabjeti interakciju između N i genomske RNA, pa time omogućava da protein L dobije dostup do i veže RNA kalup, čime se iniciraju transkripcija i replikacija. Tu hipotezu podupiru podaci iz minigenomskog sustava, kao i iz zaraznog virusa. Kada je fosforilirani serin mutiran u neutralne aminokiseline A i G, tada su viralna transkripcija i replikacija najviše smanjene. Kada je fosforilirani serin mutiran u negativno-nabijenu asparaginsku kiselinu ili glutaminsku kiselinu, aktivnosti transkripcije i replikacije su ponovno uspostavljene na više od 60 do 90 % razine aktivnosti u wt N. Količina produkata transkripcije i replikacije u stanicama koje su zaražene mutantnim virusom L16E (serin promijenjen u glutaminsku kiselinu) u biti je ekvivalentna onoj u stanicama koje su zaražene s wt virusom L16. Do toga dolazi iako je proizvodnja virusa u stanicama koje su zaražene s L16E bila neznatno niža no u stanicama koje su zaražene s L16. Budući da je genomska RNA kalup i za transkripciju i za replikaciju (Wagner and Rose, 1996), moguće je zamisliti kako bi fosforilirani N olakšao inicijaciju i transkripcije i replikacije.

Budući da fosforilacija N utječe na učinkovitost inkapsulacije vodeće RNA (Yang et al., 1999), moguće je da N fosforilacija dovodi do inkapsulacije veće količine antigenomske nego genomske RNA (Wunner, 1991). Nefosforilirani N, time što se snažno veže na antigenomski RNA, što je prvi korak u viralnoj replikaciji, može smanjiti sintezu genomske RNA. Omjer između genomske RNA i antigenomske RNA ostao je konstantan u stanicama (otprilike 3:1) koje su zaražene s wt virusom ili s jednim od mutantnih virusa. Omjeri između genomske i antigenomske RNA u pročišćenim virionima iz svih virusa također su bili slični (otprilike 20:1). Izmjereni omjer genomske RNA prema antigenomskoj RNA bio je različiti od onoga (50:1) koji je prethodno objavljen (Finke and Conzelmann, 1997). Razlike mogu biti posljedica postupaka i kvantifikacije koji su korišteni u ova dva istraživanja. U predmetnim pokusima RNA se kvantificira densitometrijom, a u prethodno objavljenom istraži-vanju RNA se kvantificira fosfornim oslikavanjem. Bez obzira na to, podaci koji su navedeni ovdje upućuju kako N fosforilacija ne utječe na inkapsulaciju ni genomske niti antigenomske RNA.

Nedavno su Kawai et al. (1999) objavili kako se fosforilirani N nalazi samo u nukleokapsidu, a N u slobodnim N proteinima (uglavnom u N-P kompleksu) nije fosforiliran. Na temelju tog istraživanja i podataka koji su prikazani ovdje, predložen je sljedeći model za objašnjenje načina fosforilacije N virusa bjesnoće i načina kako fosforilacija N virusa bjesnoće modulira viralnu transkripciju i replikaciju (Slika 8). N nije fosforiliran u slobodnom N ili u N-P heterokompleksu, moguće je zbog konformacije. Postoji mogućnost da je mjesto za fosforilaciju u ovoj fazi “zakopano”. Poželjno je da N ne bude fosforiliran prije inkapsulacije genomske RNA budući da nefosforilirani N ima višu sklonost za genomsku RNA od fosforiliranog N (Yang et al., 1999). Interakcija (inkapsulacija) genomske RNA s N-P kompleksom može inducirati konformacijske promjene N, što omogućuje interakciju N s kinazom, ili izložiti serin 389 za fosforilaciju, ili oboje. Fosforilacija N, sa svoje strane, može utjecati na međusobno djelovanje između N i genomske RNA. Nakon fosforilacije, međusobno odbijanje naboja između negativeno nabijenog fosfoserina i negativno nabijene RNA može oslabjeti međusobno djelovanje između N i RNA. To bi moglo osposobiti L da stekne dostup i da se veže na genomsku RNA, a time i inicira transkripciju i replikaciju viralne RNA. Dokazi u prilog ovom modelu dolaze iz dva istraživanja. Nefosforilirani N se veže na genomsku RNA snažnije no fosforilirani N (Yang et al., 1999), a mjesto za fosforilaciju (ostatak 389) je blizu moguće domene za vezivanje RNA (ostatci 289 do 352) (Kouznetzoff et al., 1992). Nefosforilirani N, zbog čvršćeg vezanja s RNA, mogao bi spriječiti pristup L proteina genomskom kalupu. Prema tome, učinkovitost transkripcije i replikacije viralne RNA je smanjena.

PRIMJER 4

Konstrukcija avirulentnog virusa bjesnoće s mutacijima i na N i na G te određivanje njihove virulentnosti i imunogenosti.

Mutacija fosforiliranog serina, posebice u alanin, inhibirala je i viralnu transkripciju i viralnu replikaciju u minigenomu virusa bjesnoće i kod zaraznog virusa (Wu et al., 2001; Yang et al., 1999). Prinos virusa za taj mutantni virus (L16A) bio je najmanje 4 reda veličine niži od onog kod wt virusa (Wu et al., 2001). Svi ti podaci upućuju kako mutacija na N može inhibirati viralnu replikaciju i time atenuirati virus. U prethodno objavljenim radovima se navodi kako mutacija na G, posebice aminokiseline arginina na poziciji 333, dovodi do atenuacije virusa bjesnoće (Dietzschold et al., 1983). Atenuirani virusi bjesnoće s mutacijama na argininu 333 G smanjili su sposobnost širenja od primarno zaraženih neurona u sekundarne ili tercijarne neurone u CNS-u (Coulon et al., 1989). Međutim, brzina replikacije tih mutantnih virusa u kulturi stanica nije bila različita od one u wt virusa, što upućuje kako mutacija G na poziciji 333 ne dovodi do smanjene brzine viralne replikacije (Lafay et al., 1994). Time se može objasniti zašto takovi mutantni virusi još uvijek mogu uzrokovati bjesnoću kod neonatalnih životinja putem izravne intracerebralne inokulacije (Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994). Mutacija i N i G dovest će do daljnje atenuacije virusa bjesnoće u toj mjeri da virus više neće moći uzrokovati oboljenje kod životinja bilo koje dobi bilo kojom rutom inokulacije. Razlog tomu je da takovi mutantni virusi neće imati samo smanjenu sposobnost napadanja živčanog sustava, već će također imati i smanjenu brzinu replikacije. Prema tome, avirulentni virusi bjesnoće mogu se odabrati konstruiranjem mutacije i na N i na G proteinu, te za određivanje njihove virulentnosti i imunogenosti.

Konstrukcija i odabir avirulentnih virusa bjesnoće putem mutacije i na G i na N: Konstruirani su virusi bjesnoće (L16A, L16D i L16E) s mutacijom na mjestu za fosforilaciju N (Wu et al., 2001). Kako je brzina replikacije L16D i L16E slična onoj kod wt virusa L16, mutacija G se unosi na 333 u L16 i L16A putem ciljane mutageneze, kako je prethodno opisano (Wu et al., 2001) uporabom dviej klice (SEQ ID NOS: 16-17) (5'ATGCTCACTACAAGTGAAACTTGGAATCAG3' i 5'GGAGGATCTCATTCCAAGTTTCACTTGTAG3'). Ti primeri dovode do mutacije argininskog ostatka (AGA) u glutaminsku kiselinu (GAA). Kako je već objavljeno za SAG2, promijenjena su dva nukleotida, što smanjuje mogućnost da se G povrati u svoj virulentni genotip (Schumacher et al., 1993; Lafay et al., 1994). Fragment (nukleotidni odsječci 3854 - 8273 genoma virusa bjesnoće) (Conzelmann et al., 1990) koji sadrže argininski kodon G iz potpunog zaraznog klona wt (pSAD-L16) (Schnell et al., 1994) prereže se sa XhoI i klonira u pGEM-3Z na istom mjestu. Dobiveni plazmid se koristi kao kalup za konstrukciju mutacije, uporabom postupka prema Weiner i suradnika (Weiner et al., 1994) i gore prikazanih klica. Arginin na poziciji 333 mutiran je u glutaminsku kiselinu u surogatnom vektoru. Nakon analize odsječka kako bi se potvrdila mutacija, mutirani XhoI fragmenti bit će klonirani natrag na pSAD-L16 i pSAD-L16A na XhoI mjestu. Mutantni klonovi s očekivanim mutacijama i pravilnom orijentacijom nazivaju se pSAD-L16G333, odnosno pSAD-L16AG333.

Kako bi se odabrali mutantni virusi s mutacijama i na G i na N, BSR T7/5 stanice su transfektirane s 10 μg pTIT-N, 2,5 μg pTIT-P, 2,5 μg TIT-L, zajedno s 10 μg pSAD-L16G333 ili pSAD-L16AG333, kako je opisano (Wu et al., 2001; Schnell et al., 2000). Stanice se dopune sa svježim medijem i uzgajaju sljedeća tri dana prije no što je supernatant prenešen u svježe BSR stanice. Dva dana nakon infekcije, virusi se detektiraju uporabom anti-virusnih N antitijela spregnutih s FITC. Pozitivno obojenje stanica upućivat će na uspješno oslobađanje infektivnog virusa. Virus se uzgaja u svrhu daljnje analize. Ta dva odabrana virusa bit će nazvana L16G333, odnosno L16AG333.

Za daljnju analizu mutantnih virusa, određene su krivulje rasta putem zaraze BSR stanica sa svakim od virusa na moi 1. Za usporedbu su uključeni L16 i L16A. Nakon jednosatne adsorpcije, virusni inokulum se ukloni, a stanice se isperu tri puta s PBS-om. Potom se doda svježi medij. Alikvoti su uzeti iz medija kulture na 6, 12, 18, 24, 36, 60 i 72 sata p.i. i koriste se za titraciju virusa kako je opisano (Wu et al., 2001). Taj se pokus ponovi tri puta, a za usporedbu se uzima prosječni titar za svaki virus. Kako bi se odredilo da li ti mutantni virusi imaju sniženu brzinu viralne replikacije, BSR stanice se zaraze na moi 1 i prikupe točno 40 sati p.i. u svrhu izolacije ukupne RNA, uporabom postupaka koji su opisani (Wu et al., 2001). Viralna genomska RNA i transkripti u RNA pripravcima se analiziraju Northern blot hibridizacijom uporabom sondi koje su izrađene i iz N (Fu et al., 1991) i iz G cDNA (Fu et al., 1993). Kvanitifikacija RNA se vrši densitometrijom ili fosfo-oslikavanjem RNA vrpci. Alternativno, BSR stanice zaražene tim virusima označavaju se metabolički s [3H]uridinom (33 μCi/ml) tijekom 4 sata u nazočnosti aktinomicina D (5 μg/ml), kako je opisano za VSV (Wertz et al., 1998). Stanice se potom prikupe za ekstrakciju RNA. RNA se analizira gel elektroforezom i kvantificira densitometrijom. Molarni omjeri se izračunaju iz gustoće svakog transkripta i genomske RNA.

Studije krivulja rasta virusa pokazuju da L16G333 raste u kulturi stanica do istih visokih titara kao i L16 zato što su prethodne studije pokazale da se atenuirani virus bjesnoće s G mutacijom na 333 množio jednako dobro kao i wt virus u kulturi stanica (Lafay et al., 1994). Na isti način, L16AG333 se množi u kulturi stanica do istih titara kao i mutantni virus L16A (Wu et al., 2001), a njegov prinos bit će najmanje 4 reda veličine niže od onoga kod wt virusa. Northern blot hibridizacija i [3H]uridin označavanje pokazuju kako je brzina viralne replikacije smanjena najmanje pet puta za L16A i L16AG333 u usporedbi s L16 i L16G333, kako je već uočeno (Wu et al., 2001). To pokazuje da mutacija N na mjestu za fosforilaciju smanjuje sposobnost replikacije virusa bjesnoće.

PRIMJER 5

Određivanje virulentnosti virusa bjesnoće s mutacijama i na G i na N. Kako bi se odredila virulentnost rečenih mutantnih virusa, odabrani su miševi iz dvije dobne skupine (novorođeni miševi i miševi u dobi od 5 do 6 tjedana). Atenuirani SAD virus (LI6) može inducirati oboljenje kod miševa starih 5 do 6 tjedana (Winkler et al., 1976), a SAG-2 (s mutacijom na G, slično kao kod L16G333) može inducirati oboljenje kod novorođenih miševa (Schumacher et al., 1993) intracerebralnom inokulacijom. Testirana su 4 virusa, uključujući wt L16 i mutantne viruse L16A, L16G333 i L16AG333. Testirane su tri doze (105, 106 i 107 ffu) za svaki virus. Za rečeni pokus potrebno je ukupno 12 skupina ICR miševa (po deset u svakoj skupini, od Harlan-a) u dobi od 5 do 6 tjedana. Kao kontrola je uključena i dodatna skupina. Životinje će biti zaražene s 10 μl u kojima je sadržana potrebna doza putem i.c. inokulacije. U kontrolnoj skupini, miševima će se injektirati 10 μl fiziološke otopine i.c. rutom. Životinje će biti nadzirane dvaput na dan tijekom 20 dana na znake kliničke bjesnoće, poput primjerice nakostriješene dlake, ataksije i paralize. Miševi na umoru i miševi na kraju pokusa bit će eutanazirani inhalacijom CO2. Zabilježit će se postotak smrtnosti za svaku od skupina i statistički analizirati uporabom student T testa ili X2 testa.

Kako bi se testirala virulentnost rečenih virusa kod novorođenih životinja, za pokus je potrebno ukupno 12 legla ICR miševa (svaka bređa mišica obično okoti 8 do 11 mladunaca u jednom leglu, od tvrtke Harlan). Svako leglo se zarazi jednom dozom jednog virusa. Dodatni okot se uključi kao kontrola. Novorođeni miševi u dobi od jedan dan zaraženi su s 10 μl volumena koji sadrži poželjne doze za svaki virus putem i.c. inokulacije. U kontrolnoj skupini, novorođenim miševima se injektira 10 μl fiziološke otopine i.c. rutom. Životinje se nadziru dvaput na dan tijekom 20 dana na uginule jedinke iz istog legla. Preživjeli miševi se na kraju pokusa eutanaziraju inhalacijom CO2. Zabilježi se postotak smrtnosti za svako leglo i statistički analizira uporabom student T testa ili X2 testa.

Virus divljeg tipa (wt) L16 inducira bjesnoću kod miševa starih 5 - 6 tjedana i kod novorođenih miševa, kako je prethodno pokazano (Winkler et al., 1976). Zaražene životinje u dobi od 5 - 6 tjedana pokazuju kliničke znakove na dan 5 do 6 p.i. i postaju smrtno iscrpljeni na dan 6 do 8 p.i. Zaraženi novorođeni miševi pokazuju snažne kliničke znakove ili umiru na dan 4 do 5 p.i. Kako je opisano za SAG2 (Schumacher et al., 1993), L16G333, virus koji nosi mutaciju na argininu 333 G, ali nema mutaciju na mjestu za fosforilaciju N, neće inducirati nikakvo oboljenje kod životinja starih od 5 - 6 tjedana. Međutim, on može inducirati kliničke znakove kod novorođenih životinja.

Uklonjeni su mozgovi životinjama kojima je dan L16 u svrhu izolacije virusa i utvrđivanja genotipa. Virusni titri se odrede kod bolesnih životinja, kako je prethodno opisano (Fu et al., 1996). U svrhu utvrđivanja genotipa, pripravi se ukupni RNA iz spomenutih mozgova i koristi za RT-PCR uporabom klica (SEQ ID NOS:13-14) 10g (5'CTACAATGGATGCCGAC3') i 304 (5’TTGACGAAGATCTTGCTCAT3'), kako je opisano (Smith et al., 1991). Te klice mogu amplificirati potpuni N odsječak za kodiranje iz genomske RNA. Amplificirani fragment se izravno sekvencira uporabom klice 113 (SEQ ID NO: 15) (5'GTAGGATGCTATATGGG3') (Smith et al., 1991), koji neposredno prethodi području mutacija na N genu. Ako su titri za mutantni virus slični onom kod wt virusa i analiza odsječka ukazuje na reverziju mutiranog serina na N, to znači da je virus revertirao. U tom slučaju, serin se mutira u glicin ili glutamin, koji mijenja dva ili sva tri nukleotida kodona serina, što umanjuje vjerojatnost reverzije.

Ako virus bjesnoće (L16A) s mutacijom na mjestu za fosforilaciju N ne inducira nikakvo oboljenje u bilo kojoj od skupina životinja, to pokazuje kako samo smanjenje brzine replikacije također može dovesti do atenuacije virusa bjesnoće u toj mjeri da oni više ne mogu uzrokovati oboljenje kod novorođenih životinja. Takovi mutantni virusi su dovoljno atenuirani, te se razvijaju kao živa cjepiva protiv virusa bjesnoće.

Virus (L16AG333) koji nosi mutacije i na argininu 333 G i na mjestu za fosforilaciju N, neće inducirati nikakvo oboljenje putem i.c. zaraze kod životinja bilo koje dobi, uključujući novorođene životinje. Prema tome, mutacija i na G i na N mijenja virus bjesnoće u avirulentan, budući da takav mutirani virus nema samo smanjenu sposobnost širenja po živčanom sustavu (Coulon et al., 1989), već također ima smanjenu brzinu replikacije (Wu et al., 2002). Ako takovi virusi potiču aktivni imuni odgovor kod zaraženih životinja (vidi dolje), oni su idealni kandidati za razvijanje avirulentnih živih cjepiva protiv virusa bjesnoće.

PRIMJER 6

Određivanje imunogenosti mutantnih virusa bjesnoće. Kako bi se odredila imunogenost virusa bjesnoće (L16AG333) s mutacijama i na G i na N, odabrani su odrasli miševi. Za usporedbu su uključeni L16, L16A, L16G333. Testirane su tri doze (105, 106 i 107 ffu) za svaki virus i time će se odrediti minimalna doza virusa koja može potaknuti zaštitni imunitet.

Svaka doza virusa se rabi za svaku od tri rute inokulacije, to jest, intramuskularnu (i.m.), intradermalnu (i.d.) i subkutanu (s.c.). Za pokus je potrebno ukupno 36 skupina ICR miševa (deset u svakoj skupini). Dodatna skupina je uključena kao kontrola. Životinje se imuniziraju s 50 μl volumena koji sadrži traženi virus u traženim dozama putem i.m., i.d. ili s.c. Miševi u kontrolnim skupinama se ostave necijepljeni. Miševima je uzimana krv za mjerenje VNA nakon 1, 2, 3 i 4 tjedna po imunizaciji. Nakon zadnjeg uzorkovanja krvi, miševima je dana u stražnju nogu i.m. doza od 10 MIMLD50 (50 % smrotnosne i.m. doze za miševe) CVS-24 virusa, kako je opisano (Fu et al., 1991). Životinje se nadziru dvaput na dan na razvoj neuroloških simptoma i ugibanje tijekom 20 dana. Bilježi se postotak smrtnosti i statistički analizira za svaku skupinu životinja.

Za mjerenje antirabijes neutralizirajućih protutijela koristi se brzi fluorescentni postupak za inhibiciju (rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT), kako je opisano (Hable, 1996; Briggs et al., 1996). Ukratko, serum se razrijedi i inkubira sa otprilike 50 TCID50 podvrste CVS-11 virusa bjesnoće tijekom 90 min. Dodaju se BHK stanice i puste se inkubirati sljedeća 24 sata. Stanice se fiksiraju i inkubiraju s FITC-označenim protutijelima (Centocor). Virusom zaražene stanice se pobroje i titri protutijela se izračunaju uporabom postupka prema Reed i Muench (Reed et al., 1938). Usporedi se razvoj VNA između svih skupina miševa statističkom analizom uporabom dvosmjerne analize varijacije s interakcijama (Littell et al., 1996).

WT virus L16 i svi mutantni virusi bjesnoće sposobni su inducirati imune odgovore spomenutim parentalnim rutama imunizacije. Niti jedan od tih virusa neće uzrokovati oboljenje kod odraslih miševa perifernom rutom imunizacije, kako je prethodno dokazano za wt virus L16 (Finke et al., 2000). VNA titri koji su se razvili kod miševa imunizacijom s L16G333 mogu biti viši od onih s virusima koji imaju mutacije i na G i na N, zato što ti virusi imaju smanjenu brzinu replikacije. Iz tog razloga mogu biti potrebne veće doze L16A i L16AG333, koji nose mutaciju na mjestu za fosforilaciju N, za induciranje zaštitnog imuniteta nego kod wt virusa (L16) ili virusa koji nose samo mutaciju na argininu 333 G (L16G333). Također je moguće da su VNA odgovori koje su inducirali rečeni G i N mutantni virusi slični onima koje inducira L16G333, iako se taj virus može bolje replicirati u in vitro kulturi stanica od virusa s mutacijama i na G i na N. Virusi koji bolje rastu u kulturi stanica ne moraju imati prednost u in vivo situaciji zato što ti virusi imaju smanjenu sposobnost širenja in vivo (Coulon et al., 1989). Ako virus (L16AG333) s mutacijama i na G i na N inducira usporedive VNA titre kao L16G333 i štiti 100 % imuniziranih životinja protiv inducirane infekcije s virulentnim virusom bjesnoće, a pri tom neće inducirati nikakvo oboljenje kod novorođenih životinja putem i.c. zaraze (vidi gore), taj se virus dalje testira kao avirulentno cjepivo protiv virusa bjesnoće cjepiva na ciljnim životinjskim vrstama poput rakuna, pasa ili čak ljudi različitim rutama imunizacije.

Zbog snižene brzine replikacije, mutantni se virus bjesnoće L16A (koji nosi mutaciju serina u alanin) množi vrlo polagano, a njegov prinos je 4 reda veličine niži od onog kod wt virusa L16 (Wu et al., 2002). Množenjem tog virusa na 31 °C povećana je proizvodnja virusa, ali je virusni prinos i dalje bio niži od onog kod wt virusa. Kako bi se riješila ta poteškoća, stvorena je linija stanica koja stabilno eksprimira fosforilirani N radi razmnožavanja virusa s mutacijom na mjestu za fosforilaciju N. Osnova za to je prethodno uočena činjenica da nefosforilirani N nije dominanti negativni regulator, a njegovo inhibitorno djelovanje na viralnu transkripciju i replikaciju može se nadoknaditi s dodatkom fosforiliranog N proteina (Yang et al., 1999). Kako bi se stvorila linija stanica koja stabilno eksprimira fosforilirani N, odsječak za kodiranje virusa bjesnoće N se digestira iz pRN s XbaI i PstI (Yang et al., 1998). Fragment se na kraju ravno odreže s Klenow enzimom i klonira u pcDNA3 (Invitrogen) na EcoRV mjestu. Dobiveni plazmid se sekvencira za potvrdu pravilne orijentacije, a potom se ispravan plazmid (pcDNA3-N) transfektira u BHK stanice. Stanice se prikupe 48 sati nakon transfekcije. Vrši se ograničeno razrjeđivanje spregnuto s detekcijom N eksprimiranja radi odabira stabilno transfektiranih stanica. Prikupljene stanice se serijski razrijede 10 puta u pločici s 96 jamica, te se doda selektivni medij koji sadrži 50 μg/ml G-418. Stanice se dodatno inkubiraju tjedan dana, a stanice koje eksprimiraju N se identificiraju putem anti-virusnih N antitijela spregnutih s FITC (Centoco). Stanice koje eksprimiraju N (BHK-N) dodatno se kloniraju i rabe za razmnožavanje N mutantih virusa bjesnoće. Razina eksprimiranja N u tim stanicama se povremeno nadzire. Jednom kada se uspostavi stabilna linija stanica za eksprimiranje N (BHK-N), mutantni virusi bjesnoće, uključujući L16A, L16AG333, se propagiraju u BHK-N stanicama. Ako se dobije virusni titar od 107 ffu/ml ili više, to znači kako će BHK-N stanice priskrbiti mutantnim virusima dovoljno fosforiliranog N za replikaciju do visokih titara.

Iako smanjena brzina replikacije i smanjena sposobnost širenja u živčanom sustavu čini L16AG333 idealnim kandidatom za razvoj avirulentnih cjepiva protiv virusa bjesnoće, mutacija na N iz serina (UCU) u alanin (GCU) na L16A i L16AG333 je promijenila samo jedan nukleotid kodona serina. Uvijek postoji mogućnost da bi alaninski ostatak mogao mutirati natrag u serin, a virus revertirati u L16 genotip, posebice kod snažno smanjene brzine replikacije. Iako je L16A prenošen u kulturu stanica više od deset puta, nije došlo do nikakve reverzije. Kako bi se spriječila reverzija, serin (TCT) je mutiran u glicin (GGT) ili glutamin (CAA), čime se mijenjaju bilo dva, bilo sva tri nukleotida u kodonu serina, što povećava mogućnost reverzije. Glicin je neutralna aminokiselina i ima sličnu strukturu kao alanin. Glutamin ima istu strukturu kao glutaminska kiselina, ali bez negativnog naboja. Mutacija fosforiliranog serina bilo u glicin, bilo u glutamin može imati isti učinak na viralnu transkripciju i replikaciju kao i mutacija iz serina u alanin (Wu et al., 2001). Te se mutacije vrše na jednostavan način, kako je opisano u Wu et al., 2001.

PRIMJER 7

Konstrukcija avirulentnog virusa bjesnoće premještanjem N gena virusa bjesnoće duž virusnog genoma i određivanje njihove virulentnosti i imunogenosti. Istraživanja sa srodnim virusom, VSV, pokazala su kako premještanje N unutar genoma VSV dovodi do atenuacije VSV (Wertz et al., 1998). U tom istraživanju, N gen je premješten sa prve pozicije genoma na drugu, treću ili četvrtu poziciju na VSV genomu. Premještanje N je dovelo do stupnjevanog smanjenja eksprimiranja N, posljedično do smanjenja viralne replikacije. Translokacija N također je dovela do stupnjevane atenuacije virusa u životinja. Iako su svi miševi koji su bili zaraženi intranazalno s wt VSV dozom od 300 pfu uginuli, niti jedan od miševa zaraženih s istom dozom N4 (N gen je premješten na četvrtu poziciju na genomu) nije razvio oboljenje. Premještanje N gena duž genoma virusa bjesnoće također može dovesti do atenuacije virusa bjesnoće. Prema tome, avirulentni virus bjesnoće se konstruira premještanjem N gena virusa bjesnoće na drugu, treću ili četvrtu poziciju unutar genoma virusa bjesnoće. Virusi bjesnoće s premještenim N, ako su u dovoljnoj mjeri atenuirani, imaju prednost u odnosu na N-mutantne viruse na mjestu za fosforilaciju zato što su promjene kod virusa s premještenim N ireverzibilne (Wertz et al., 1998). Iako je premještanje gena N dovelo do atenuacije VSV, N4 je i dalje uzrokovao oboljenje i uginuće kod miševa kada je inokulirana veća doza (Wertz et al., 1998). G mutacija na argininu 333 također je uključena u viruse s premještenim N kako bi se dodatno atenuirao virus bjesnoće.

Konstruiranje avirulentnog virusa bjesnoće premještanjem N gena. U svrhu premještanja N gena unutar genoma virusa bjesnoće, konstruirana su dva plazmida. Plazmid pSAD-L16G333 se digestira s XhoI, čime se iz plazmida uklanja fragment od oko 4,5 kb (3854 - 8273 genoma virusa bjesnoće) (Conzelmann et al., 1990). Odabran je pSAD-L16G333 zato što taj plazmid već nosi mutaciju arginina 333 na G. Uklanjanje XhoI fragmenta iz pSAD-L16G333 pomaže naknadnu mutagenezu zbog manje veličine. Nakon digestije i izolacije dva fragmenta (10,5 kb i 4,5 kb), veliki fragment se sam na sebe ligirao, čime tvori plazmid pSAD-L16G333XhoI, koji sadrži N, P, M i djelomične G i L gene. Taj plazmid također sadrži međugenske odsječke između N i P, između P i M, te između M i G. Dakle, on se koristi za premještanje N na drugu i treću poziciju, koja je između P i M i između M i G. Mali fragmenti se kloniraju u pGEM-3Z vektor na mjestu XhoI i označavaju pGEM-XhoI. Taj plazmid sadrži G - L međugensko spojište i koristi se za premještanje N na četvrtu poziciju između G i L.

Kako bi konstruirali rekombinantne viruse s premještenim N, N na prvoj poziciji se briše iz plazmida pSAD-L16G333XhoI uporabom PfuTurbo Hotstart DNA polimeraze (Lundberg et al., 1991) (Stratagene). Sintetiziraju se dvije klice(SEQ ID NOS: 18-19) (5'ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3' i 5'CATTTTTGCTTTGCAATTGACAA TGTC3') i rabe u PCR reakciji. Te dvije klice će amplificirati fragment od 9 kb, što dovodi do delecije N gena iz samog početka N transkripta, uključujući netranslatirano područje na 5 kraju, područje za kodiranje, netranslatirano područje na 3 kraju, te međugenski odsječak između N i P. PfuTurbo Hotstart DNA polimeraza stvara ravne krajeve (Lundberg et al., 1991) u amplificiranim fragmentima, pa prema tome može biti i ligirana na sebe. Ligirani plazmidi se sekvenciraju na spojištu mutacije kako bi se osiguralo da ne dođe do nasumičnih mutacija u vodećem odsječku i početnom odsječku P-a mRNA. Dobiveni plazmid se označava pSAD-PMG i koristit će se za konstrukciju klonova sa premještenim N. Budući da PfuTurbo Hotstart DNA polimeraza može amplificirati do 15 kb-nog odsječka iz vektora DNA (Stratagene), ne javlja se nikakav problem budući da je veličina plazmida pSAD-L16G333XhoI samo oko 10 kb.

Budući da svaki transkript virusa bjesnoće počinje sa AACA, na svakom mjestu između dva gena za kloniranje N gena stvoreno je jedinstveno HpaI mjesto restrikcijske (GTTAAC). Kako bi klonirali N gene na drugu poziciju duž genoma, prvo je stvoreno jedinstveno HpaI mjesto između P i M gena, odmah nakon međugenskog odsječka. To se postiže ciljanom mutagenezom uporabom postupaka prema Weiner et al. (Weiner et al., 1994). Sintetizirane su dvije klice (SEQ ID NOS:20-21) (5TCAACATGAAAAAAACAGTTAACACCACT3’ i 5'AGGGGTGTTAACTGTTTTTTTCAT GTTGA3' i rabe se za konstrukciju jedinstvenog HpaI mjesta između P i M gena na pSAD-PMG. Mutacija se potvrđuje analizom odsječka, a plazmid se naziva pSAD-PHMG. Potom se čitav N gen, od početka transkripta do međugenskog odsječka, amplificira uporabom PfuTurbo Hotstart DNA polimeraze s klicama (SEQ ID NOS:22-23) 5'ACACCCCTACAATGGATGCCG3' i 5’’GTTTTTTTCATGATGGATATACAC3 i potom klonira u HpaI mjesto pSAD-PHMG. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Uvođenje HpaI mjesta, iako ne mijenja inicijaciju umetnutog N transkripta, mijenja međugenski odsječak. Prema tome, međugenski se odsječak mora ponovno rekonstruirati. To se vrši ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS: 24-25) 5'ATGGAAAAAAACAGGCAACTG3' i 5'AGTTGCCTGTTTTTTTCCATG3'. Nakon potvrde analizom odsječka, odabere se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i naziva pSAD-PNMG. Napokon, XhoI fragment se odreže od pGEM-XhoI i klonira u XhoI mjesto na pSAD-PNMG kako bi se dobio klon virusa bjesnoće pune veličine s N genom kloniranim na drugu poziciju. Taj plazmid se označava pSAD-N2, i sadrži pravi odsječak pune duljine virusa bjesnoće, osim što je N gen smješten između P i M gena na genomu virusa bjesnoće.

Kako bi klonirali N gen na treću poziciju na genomu, između M i G gena stvoreno je jedinstveno HpaI mjesto, neposredno nakon međugenskog odsječka. To se postiže ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS:26-27) 5'GATGTGAAAAAAACTGTTAACATCCCTC3' i 5'AGGGATGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3', čime se izvodi konstrukcija jedinstvenog HpaI mjesta između M i G gena na pSAD-PMG. Mutacija se potvrđuje analizom odsječka, a plazmid se označava pSAD-PMHG. Potom se čitav N gen, koji je amplificiran na gore opisani način, klonira na HpaI mjesto pSAD-PMHG. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Uvođenje HpaI mjesta mijenja jedan nukleotid u međugenskom odsječku. Prema tome, međugenski odsječak se rekonstruira ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS:28-29) 5TGAAAAAAACTATTAACATCCCTC3' i 5'AGGGATG TTAATAGTTTTTTTCAC3'. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i označava pSAD-PMNG. Ponovno će XhoI fragment biti kloniran u pSAD-PMNG kako bi se dobio klon virusa bjesnoće pune duljine s N genom koji je kloniran na treću poziciju. Taj se plazmid naziva pSAD-N3.

Kako bi klonirali N gen na četvrtoj poziciji na genomu, napravljeno je jedinstveno HpaI mjesto između G i L gena, neposredno nakon međugenskog odsječka G + Y (Conzelmann et al., 1990). Ta se mutacija uvodi u gen na plazmidu pGEM-XhoI budući da taj plazmid sadrži međugenski odsječak između G i L gena. Ta operacije se izvodi ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS: 30-31) 5'CAGAAGAACAACTGTTAACACTTCTC3' i 5'AGAAGT GTTAACAGTTGTTCTTCTG3', što dovodi do izgradnje jedinstvenog HpaI mjesta između G i L gena na pGEM-XhoI. Mutacija se potvrđuje analizom odsječka, a plazmid se označava pGEM-GHL. Potom se čitav N gen, koji je amplificiran na gore opisani način, klonira na HpaI mjesto pSAD-GHL. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Uvođenjem HpaI mjesta mijenjaju se dva nukleotida u međugenskom odsječku. Dakle, među-genski odsječak se rekonstruira ciljanom mutagenezom uporabom sljedećih klica (SEQ ID NOS:32-33) (5'AACAACTGGCAACACTTCTC3' i 5'AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3'.

Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i označava pGEM-GNL. XhoI fragment koji sadrži G, N i L se odreže i klonira u XhoI mjesta pSAD-PMG kako bi se dobio klon virusa bjesnoće pune duljine s N genom koji je kloniran na četvrtu poziciju. Taj plazmid se naziva pSAD-N4 i sadrži pravi odsječak pune duljine virusa bjesnoće, osim što je N gen smješten između G i L gena na genomu virusa bjesnoće.

Kako bi se odabrali rečeni virusi s premještenim N genima, plazmidi koji sadrže viralni genom pune duljine su pojedinačno transfektirani u BSR T7/5 stanice, zajedno s pTIT-N, pTIT-P i TIT-L, kako je opisano (Wu et al., 2001; Schnell et al., 2000). Stanicama se dodaje svježi medij i uzgajaju se sljedeća 3 dana, a potom se supernatant prenese u svježe BSR stanice. Dva dana nakon infekcije, virus se detektira uporabom anti-virusnih N protutijela spregnutih s FITC. Pozitivno obojenje stanica će značiti uspješno izdvajanje infektivnog virusa. Ti virusi se označavaju L16N2G333, L16N3G333 i L16N4G333. Virus se razmnožava za daljnju analizu u BHK stanicama, odnosno u BHK-N stanicama.

Za daljnu analizu virusa na kojima je izvršeno premještanje, krivulje rasta virusa se utvrđuju inficiranjem BSR stanica sa svakim od virusa na moi 1. L16G333 je uključen za usporedbu. Nakon jednosatne adsorpcije, virusni inokulum se ukloni i stanice se isperu tri puta s PBS-om. Potom se dodaje svježi medij. Alikvoti se uklone iz medija kulture svakih 6, 12, 18, 24, 36, 60 i 72 sata p.i. i koriste za titraciju virusa, kako je opisano (Wu et al., 2001). Taj pokus se ponavlja tri puta, a za usporedbu se koristi prosječni titar za svaki virus. Kako bi utvrdili da li virus s premještenim N imaju smanjenu brzinu viralne replikacije, BSR stanice su zaražene s L16G333 ili sa svakim od virusa s premještenim N na moi 1 i prikupljene 40 sati p.i. u svrhu izdvajanja ukupne RNA, uporabom opisanih postupaka (Wu et al., 2001). Viralna genomska RNA i transkripti u RNA pripravcima analiziraju se Northern blot hibridizacijom uporabom sondi koje su izrađene i iz N (Fu et al., 1991) i iz G cDNA (Fu et al., 1993). Kvantifikacija RNA se vrši densitometrijom ili fosfo-oslikavanjem RNA vrpci. Alternativno, BSR stanice zaražene rečenim virusima se označavaju metabolički s [3H]uridinom (33 μCi/ml) 4 sata u nazočnosti aktinomicina D (5 μg/ml), kako je opisano za VSV (Wertz et al., 1998). Stanice se potom prikupe za ekstrakciju RNA. RNA se analizira gel elektro-forezom i kvantificira densitometrijom. Utvrdi se i usporedi molarni omjer između pet transkripata i genomske RNA kod rečenih virusa.

Studije krivulja rasta virusa pokazuju kako je virusni prinos za spomenute viruse po sljedećem redoslijedu: L16G333, L16N2G333, L16N3G333 i L16N4G333. U studiji premještanja N kod VSV, utvrđeno je kako se virusni prinos smanjio i do 4 reda veličine kod N4 virusa u usporedbi s wt VSV (Wertz et al., 1998). Virusni prinos kod L16N4G333 je smanjen i do 4 reda veličine u usporedbi s onim kod L16G333. Northern blot hibridizacija i [3H]uridin označavanje upućuju kako je brzina viralne replikacije (genomska RNA) smanjena kod virusa s premještenim N u usporedbi s L16G333, a kod L16N4G333 je najniža. Osim toga, molarni omjer između pet viralnih transkripata je promijenjen, ovisno o relativnoj poziciji N na viralnom genomu. Kod L16G333, količine transkripata su u sljedećem poretku N>P>M>G>L; L16N2G333, P>N>M>G>L; L16N3G333, P>M>N>G>L; te L16N4G333, P>M>G>N>L. Ti podaci zajedno pokazuju kako se premještanjem N po genomu virusa bjesnoće brzina replikacije virusa bjesnoće smanjuje, što može dovesti do atenuacije virusa s premještenim N. Kako je mutacija G na argininu 333 uključena u rečene viruse s premještenim N, takovi virusi s premještenim N neće imati samo smanjenu brzinu replikacije, već će također imati i smanjenu sposobnost napadanja živčanog sustava. Virusi bjesnoće s premještenim N, ako su u dovoljnoj mjeri atenuirani, imaju prednost nad N-mutantnim virusima na mjestu za fosforilaciju zato što su promjene izvedene na virusima s premještenim N ireverzibilne (Wertz et al., 1998), dočim se točkasta mutacija na mjestu za fosforilaciju (Wu et al., 2002) može povratiti u svoj virulentni genotip. Ako bilo koji od rečenih virusa s premještenim N više ne izaziva oboljenja kod novorođenih miševa putem i.c. inokulacije (vidi dolje), isti će imati potencijal za razvoj kao avirulentno cjepivo protiv virusa bjesnoće.

Utvrđivanje virulentnosti virusa bjesnoće s premještenim N. Kako bi odredili virulentnost virusa bjesnoće s premještenim N, odabrani su miševi iz dvije dobne skupine (novorođeni miševi i miševi u dobi od 5 do 6 tjedana). Za usporedbu je uključen L16G333. L16G333 može inducirati oboljenje kod novorođenih miševa, ali ne i kod starijih miševa (Schumacher et al., 1993) putem intracerebralne inokulacije. Četiri su virusa određena za testiranja, uključujući L16G333, L16-N2G333, L16-N3G333, L16-N4G333. Testirane su tri doze (105, 106 i 107 ffu) za svaki virus. Za rečeni eksperiment je potrebno ukupno 12 skupina ICR miševa (deset u svakoj skupini) u dobi od 5 do 6 tjedana. Dodatna skupina je uključena kao kontrola. Životinje su zaražene s volumenom od 10 μl koji sadrži poželjnu dozu putem i.c. inokulacije. U kontrolnoj skupini, miševima se injektira 10 μl fiziološke otopine i.c. rutom. Životinje se nadziru dvaput na dan tijekom 20 dana na znakove kliničke bjesnoće poput nakostriješene dlake, ataksije i paralize. Miševi na umoru i miševi na kraju pokusa bit će eutanazirani inhalacijom CO2. Zabilježit će se postotak smrtnosti za svaku od skupina i statistički analizirati uporabom student T testa ili X2 testa.

Kako bi se testirala virulentnost tih virusa kod novorođenih životinja, za pokus je potrebno ukupno 12 legla ICR miševa. Svako leglo se zarazi jednim virusom. Dodatno leglo se uključi kao kontrola. Novorođeni miševi u dobi od jednog dana se zaraze s 10 μl volumena koji sadrži potrebne doze mutantnih virusa putem i.c. inokulacije. U kontrolnoj skupini, novorođenim miševima se injektira 10 μl fiziološke otopine i.c. rutom. Životinje se nadziru dvaput na dan tijekom 20 dana za uginule jedinke iz istog legla. Preživjeli miševi na kraju pokusa se eutanaziraju inhalacijom CO2. Zabilježi se postotak smrtnosti za svako leglo i statistički analizira uporabom student T testa ili X2 testa.

L16G333 ne inducira oboljenje kod životinja u dobi od 5 do 6 tjedana. Kod virusa s premještenim N, poredak po virulentnosti je L16G333 > L16N2G333 > L16N3G333 > L16N4G333. Kako ti virusi nose mutaciju na argininu 333 G-a, oni ne bi trebali uzrokovati nikakvo oboljenje kod miševa u dobi od 5 do 6 tjedana, ali mogu uzrokovati oboljenje kod novorođenih životinja. Kako studije na VSV-u upućuju da je brzina replikacije kod N4 virusa bila snažno smanjena (Wertz et al., 1998), brzina replikacije kod L16N4G333 također se može dramatično smanjiti. Budući da L16-N4G333 također nosi mutaciju na argininu 333 G-a, isti neće imati samo smanjenu brzinu replikacije, već će također imati i smanjenu sposobnost širenja u CNS. Dakle, ne mora uzrokovati nikakvo oboljenje kod novorođenih životinja. Ako je to doista slučaj, L16-N4G333 će imati potencijal da bude razvijen kao avirulentno cjepivo protiv virusa bjesnoće. L16N2G333 i L16N3G333 također mogu biti avirulenti kod novorođenih životinja, stoga se oni također mogu razvijati kao avirulentna cjepiva protiv virusa bjesnoće.

Utvrđivanje imunogenosti virusa bjesnoće s premještenim N. Kako bi odredili imunogenost virusa s premještenim N, odabrani su odrasli miševi. Četiri su virusa određena za testiranja, uključujući L16G333, L16N2G333, L16N3G333 i L16N4G333. Testirane su tri doze (105, 106 i 107 ffu) za svaki virus i time će se odrediti minimalna doza virusa koja može potaknuti zaštitni imunitet. Svaka od doza virusa se rabi u svakoj od tri rute inokulacije, to jest, i.m., i.d. i s.c. Za rečeni eksperiment je potrebno ukupno 36 skupina odraslih ICR miševa (deset u svakoj skupini). Dodatna skupina bit će uključena kao kontrola. Životinje su imunizirane s 50 μl volumena koji sadrži traženi virus u poželjnoj dozi putem i.m., i.d. ili s.c. Miševi u kontrolnoj skupini se ostave necijepljeni. Miševima je uzimana krv za mjerenja VNA (Hable, 1996; Briggs et al., 1996) nakon 1, 2, 3 i 4 tjedna po imunizaciji. Nakon posljednjeg uzorkovanja krvi, miševima je dana u stražnju nogu i.m. doza od 10 MIMLD50 (50% smrtonosne i.m. doze za miševe) CVS-24 virusa, kako je opisano (Fu et al., 1991). Životinje se nadziru dvaput na dan na razvoj neuroloških simptoma i ugibanje tijekom 20 dana. Bilježi se postotak smrtnosti i statistički analizira za svaku skupinu životinja.

Svi virusi bjesnoće s premještenim N sposobni su inducirati imune odgovore rečenim parentalnim rutama imunizacije. Niti jedan od tih virusa ne uzrokuje oboljenje kod odraslih miševa perifernim rutama imunizacije. VNA titri koji su se razvili u miševa imunizacijom s L16G333 mogu biti viši od onih koji su imunizirani s virusima s premještenim N. Zbog razlika u brzini replikacije, razine VNA mogu imati sljedeći poredak L16G333 > L16N2G333 > L16N3G333 > L16N4G333. Moguće je da razine VNA koje su inducirane rečenim virusima s premještenim N budu slične. Imunizacija s bilo kojim od tih virusa dovodi do zaštite protiv infekcije. Virus koji može inducirati usporedivu VNA kao L16G333 i omogućiti 100 %-tnu zaštitu, ali ne inducira oboljenje kod novorođenih životinja i najbolje raste u in vitro kulturi stanica, odabire se za daljnje testiranje na ciljnim životinjskim vrstama poput rakuna, pasa ili čak ljudi.

Za razliku od virusa s mutacijom na mjestu za fosforilaciju N, virus s premještenim N ne mora dobro rasti u kulturi stanica zbog smanjene brzine replikacije, kako je objavljeno za VSV (Wertz et al., 1998). Ti virusi se uzgajaju u BHK-N stanicama koje stabilno eksprimiraju fosforilirani N. Kako je smanjena brzina replikacije posljedica smanjene razine N u zaraženim stanicama (Wertz et al., 1998), nadopunom N u BHK-N stanice povećava se virusni prinos kod virusa s premještenim N.

Zbog sličnosti između odsječka koji se prostire od kraja P, međugenskog područja između P i M, do početka M transkripta i onog koji se prostire od kraja M, međugenskog područja između M i G, te početka G transkripta, umetanje jedinstvenog HpaI mjesta može predstavljati teškoću na P-M i M-G spojištima na pSAD-PMG. Stoga se temperatura očvršćavanja u PCR reakciji mijenja, probira se veliki broj klonova, a samo se poželjne mutacije odabiru za daljnje kloniranje.

Kako je objavljeno za VSV, N4, mutantni virus kod kojeg je N na četvrtoj poziciji na VSV genomu, još uvijek može uzrokovati oboljenje i uginuće miševa kada se inokulira veća doza (Wertz et al., 1998). Ako virus bjesnoće s premještenim N još uvijek može posjedovati ostatnu virulenciju, serin se mutira u alanin na mjestu za fosforilaciju N kako bi se dodatno atenuirao virus s premještenim N. Ako su imuni odgovori koje induciraju virusi s premještenim N niski budući je brzina replikacije tih virusa snažno smanjena, konstruiraju se virusi s pojačanim eksprimiranjem G, koji je jedini antigen koji inducira zaštitna protutijela za neutralizaciju virusa (Cox et al., 1977). To se postiže razmještanjem (reshuffle) gena unutar genoma virusa bjesnoće.

PRIMJER 8

Konstrukcija avirulentnog virusa bjesnoće razmještanjem gena unutar genoma virusa bjesnoće i utvrđivanje virulentnosti i imunogenosti takovih virusa bjesnoće s razmještenim genima. Osim premještanja (relocation) N gena duž VSV genoma, razmještanje (reshuffling) gena unutar VSV genoma također je dovelo do fenotipskih promjena VSV-a (Ball et al., 1999). Iako su neki od VSV-ova s razmještenim genima (reshuffled VSV) pridobili još virulentnija obilježja u usporedbi s wt virusom, drugi VSV-i s razmještenim genima pokazali su smanjenu brzinu replikacije u kulturi stanica i smanjenu virulentnost kod životinja (Ball et al., 1999). Kao najvažnije, premještanje G s četvrte pozicije na prvu poziciju ne samo da je dovelo do atenuacije virusa, već je također uzrokovalo ubrzane i pojačane imune odgovore kod životinja (Flanagan et al., 2000). Prema tome, avirulentni virus bjesnoće se konstruira razmještanjem gena virusa bjesnoće unutar genoma virusa bjesnoće, posebice premještanjem G s četvrte pozicije na prvu poziciju i razmještanjem gena P, M i G. Osim toga, G mutacija na argininu 333 je uključena u svaki pojedini virus s razmještenim genima i tako dodatno atenuira virus bjesnoće.

Konstrukcija avirulentnog virusa bjesnoće razmještanjem gena virusa bjesnoće unutar viralnog genoma. Kako bi se izvršilo razmještanje gena unutar genoma virusa bjesnoće, slijedi se procedura koja je korištena za premještanje N gena, kako je opisano. Za konstruiranje virusa bjesnoće kod kojih je G na prvoj poziciji, koriste se plazmidi pGEM-GHL i pSAD-L16G333XhoI. Prvo se geni N, P i M brišu sa plazmida pSAD-L16G333XhoI. Sintetizirane su dvije klice (SEQ ID NOS:34 i 19) (5'ACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3' i 5'CATTTTTGCTTTGCAATTGACAATGTC3’), koja se koriste u PCR reakciji uporabom PfuTurbo Hotstart DNA polimeraze (Lundberg et al., 1991) (Stratagene). Te dvije klice amplificiraju fragment od 7,3 kb, što dovodi do brisanja gena N, P i M od samog početka N transkripta do međugenskog odsječka između M i G. PfuTurbo Hotstart DNA polimeraza stvara ravne krajeve (Lundberg et al., 1991) u amplificiranim fragmentima i stoga su ligirani sami na sebe. Ligirani plazmidi se sekvenciraju na spojištu mutacije kako bi se osiguralo da nema nikakvih nasumičnih mutacija u vodećem odsječku i početnom odsječku G mRNA. Dobiveni plazmid se naziva pSAD-L16G. Konstruirana su tri klona virusa bjesnoće s G-om na prvoj poziciji u kombinaciji s N na drugoj (G1N2), trećoj (G1N3) ili četvrtoj poziciji (G1N4). Kako bi izgradili G1N2 klon, N, P i M geni od početka N transkripta do međugenskog odsječka M (3,2 kb) amplificirani su od pSAD-L16G333XhoI uporabom PfuTurbo DNA polimeraze s klicama (SEQ ID NOS:22 i 35) 5'ACACCCCTACAATGGATGCCG3' i 5'ATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3'. Amplificirani fragment se klonira u HpaI mjesto pGEM-GHL. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Potom se međugenski odsječak rekonstruira ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS: 36-37) (5’AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3' i

5'GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3'. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i označava pGEM-GNMPL. Na kraju, XhoI fragment iz pGEM-GNMPL se klonira u pSAD-G, čime se dobiva klon virusa bjesnoće pune duljine s G genom kloniranim na prvoj poziciji. Taj se plazmid naziva pSAD-L16G1N2G333.

Kako bi izgradili G1N3 klon, P, N i M geni s početka P transkripta do međugenskog odsječka M (3,2 kb) amplificirani su od pSAD-PNMG, kako je izvršeno u specifičnoj primjeni 2, uporabom Pfu DNA polimeraze s klicama (SEQ ID NOS:38-39) 5'ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3' i 5'ATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3'. Amplificirani fragment se klonira u HpaI mjesto pGEM-GHL, također kako je izvršeno u specifičnoj primjeni 2. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s točnom orijentacijom. Potom se međugenski odsječak rekonstruira ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS:40 i 37) (5'AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3’ i

5'GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3'. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i označava pGEM-GPNML. Na kraju se XhoI fragment pGEM-GPNML klonira u pSAD-G, čime se dobiva klon virusa bjesnoće pune duljine kod kojeg je G gen kloniran na prvoj poziciji, a N na trećoj poziciji. Taj plazmid se naziva pSAD-L16G1N3G333.

Kako bi izgradili G1N4 klon, geni P, M i N su amplificirani od početka P transkripta do međugenskog odsječka N (3,2 kb) iz pSAD-PMNG uporabom PfuTurbo DNA polimeraze s klicama (SEQ ID NOS: 38 i 23) 5'ACACCCCTCCT TTCGAACCATCCC3' i 5'GTTTTTTTCATGATGGATATACAC3' i kloniraju u HpaI mjesto pGEM-GHL. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Potom se međugenski odsječak rekonstruira ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS:36-37) (5’AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3' i 5'GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3'). Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i označava pGEM-GPMNL. Na kraju se XhoI fragment pGEM-GPMNL klonira u pSAD-G, čime se dobiva klon virusa bjesnoće pune duljine kod kojeg je G gen kloniran na prvoj poziciji, a N na četvrtoj poziciji. Taj plazmid se naziva pSAD-L16G1N4G333.

Osim wt virusa (P-M-G), postoji pet mogućih kombinacija (P-G-M, M-P-G, M-G-P, G-M-P i G-P-M) za razmještanje P, M i G gena unutar genoma virusa bjesnoće. Za izgradnju M-P-G, M-G-P i P-G-M koriste se plazmidi pGEM-XhoI i pSAD-L16G333XhoI. Prvo se P gen briše iz plazmida pSAD-L16G333XhoI. Sintetiziraju se dvije klice (SEQ ID NOS:41-42) (5'ACACCACTGATAAAATGAACCTCC3' i 5'GTTTTTTTCATGATGGATATAGAG3' i koriste se u PCR reakciji uporabom PfuTurbo Hotstart DNA polimeraze (Stratagene). Te dvije klice amplificiraju 9,5 kb fragment, što dovodi do brisanja P gena od samog početka P transkripta do međugenskog odsječka između P i M. PfuTurbo Hotstart DNA polimeraza stvara ravne krajeve (Lundberg et al., 1991) u amplificiranim fragmentima, pa prema tome mogu biti ligirani sami na sebe. Ligirani plazmidi se sekvenciraju na spojištu mutacije kako bi potvrdili da nema nikavih nasumičnih mutacija na 3 netranslatiranom odsječku N, međugenskom odsječku N, te početnom odsječku M mRNA. Dobiveni plazmid se naziva pSAD-NMG.

Kako bi razmjestili gene u redoslijedu N-M-P-G-L, napravi se jedinstveno HpaI mjesto restrikcije (GTTAAC) na pSAD-NMG na spojištu gena između M i G. To se izvodi ciljanom mutagenezom uporabom klica ((SEQ ID NOS:26-27) 5'GATGTGAAAAAAACTGTTAACATCCCTC3' i 5'AGGGATGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3’, kako je opisano za premještanje N gena. Mutacija se potvrđuje analizom odsječka, a plazmid se označava pSAD-NMHG. Na kraju se čitav P gen, od početka transkripta do međugenskog odsječka, amplificira uporabom PfuTurbo DNA polimeraze s klicama (SEQ ID NOS:18 i 43) 5'ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3' i 5'CCTGT TTTTTTCATGTTGACTTTGGG3' i klonira u HpaI mjesto pSAD-PMHG. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Potom se međugenski odsječak rekonstruira ciljanom mutagenezom uporabom sljedećih klica (SEQ ID NOS:24-25) (5'ATGGAAAAAAACAGGCAACTG3' i 5'AGTTGCCTGTTTTTTTCCATG3'). Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i označava pSAD-NMPG. Na kraju se XhoI fragment pGEM-XhoI klonira u pSAD-NMPG, čime se dobiva klon virusa bjesnoće pune duljine kod kojeg je P gen kloniran između gena M i G. Taj se plazmid naziva pSAD-L16MPG.

Kako bi razmjestili gene u redoslijedu N-M-G-P-L, čitav P gen, koji je amplificiran na gore opisani način, klonira se u jedinstveno HpaI mjesto pGEM-GHL. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Potom se međugenski odsječak rekonstruira ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS:32-33) 5' AACAACTGGCAACACTTCTC3' i 5' AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3'. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i označava pGEM-GPL. XhoI fragment pGEM-GPL se odreže i klonira u XhoI mjesta pSAD-NMG, čime se dobiva klon virusa bjesnoće pune duljine kod kojeg je P gen kloniran između gena G i L. Taj se plazmid naziva pSAD-L16MGP.

Kako bi razmjestili gene u redoslijedu N-P-G-M-L, M gen se briše iz klona pSAD-L16G333XhoI. Sintetizirane su dvije klice (SEQ ID NOS:44 i 43) (5'ACATCCCTCAAAGACTCAAGGS’ i 5'CCTGTTTTTTTCATGTTGACTTTGG3'), koji se koriste u PCR reakciji uporabom PfuTurbo Hotstart DNA polimeraze (Lundberg et al., 1991) (Stratagene). Te će dvije klice amplificirati 9,5 kb fragment, što rezultira brisanjem M gena sa samog početka M transkripta do međugenskog odsječka između M i G. PfuTurbo Hotstart DNA polimeraza stvara ravne krajeve (Lundberg et al., 1991) u amplificiranim fragmentima i tako se PCR fragment može vezati sam na sebe. Ligirani plazmidi se sekvenciraju na spojištu mutacije kako bi potvrdili da nema nikakve nasumične mutacije na 3 nekodirajućem odsječku P, međugenskom odsječku i početnom odsječku za G mRNA. Dobiveni plazmid se naziva pSAD-NPG. Čitav M gen se amplificira uporabom klica (SEQ ID NOS: 45-46) 5'AACACCACTGATAAAATGAACCTCC3' i 5'AATAGTTTTTT TCACATCCAAGAGG3' i klonira u jedinstveno HpaI mjesto pGEM-GHL. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Potom se međugenski odsječak rekonstruira ciljanom mutagenezom uporabom klica (SEQ ID NOS:32-33) 5'AACAACTGGCAACACTTCTC3' i 5'AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3'. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s popravljenim međugenskim odsječkom i označava pGEM-GML. XhoI fragment pGEM-GML se odreže i klonira u XhoI mjesta pSAD-NPG, čime se dobiva klon virusa bjesnoće pune duljine kod kojeg je M gen kloniran između gena G i L. Taj plazmid se naziva pSAD-PGM.

Za konstrukciju G-M-P i G-P-M koriste se plazmidi pGEM-GML i pSAD-L16G333XhoI. Prvo se geni P i M izbrišu iz klona pSAD-L16G333XhoI. Sintetizirane su klice (SEQ ID NOS:34 i 42) 5'ACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3' i 5'GTTTTTTTCATGATGGATATAGAG3', koji se koriste u PCR reakciji uporabom PfuTurbo Hotstart DNA polimeraze (Lundberg et al., 1991) (Stratagene). Ta dva primera će amplificirati 8,5 kb fragment, što rezultira brisanjem gena P i M od samog početka P transkripta do međugenskog odsječka između M i G. PfuTurbo Hotstart DNA polimeraze stvara ravne krajeve (Lundberg et al., 1991), a amplificirani fragmenti mogu se vezanti sami na sebe. Ligirani plazmidi se sekvenciraju na spojištu mutacije kako bi se osiguralo da nema nikakvih nasumičnih mutacija na 3 kraju N odsječka, međugenskom odsječku i početnom odsječku G mRNA. Dobiveni plazmid se naziva pSAD-NG.

Kako bi razmjestili gene u redoslijedu N-G-M-P-L, tvori se jedinstveno HpaI mjesto između gena M i L na pGEM-GML. Sintetizirane su dvije klice (SEQ ID NOS:47-48) (5'GATGTGAAAAAAACTGTTAACACTTCTC3' i 5' AGAAGTGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3'), koji se koriste za PCR uporabom pfu DNA polimeraze. Mutacija se potvrđuje analizom odsječka, a plazmid se označava pGEM-GMHL. Potom se čitav P gen, koji je amplificiran na gore opisani način, klonira u HpaI mjesto pGEM-GMHL. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Potom se rekonstruira odsječak s klicama (SEQ ID NOS: 49-50) 5' GATGTGAAAA AAACTATTAACACCC3' i 5' GGTGTTAATAGTTTTTTTCACATCC3'. Nakon potvrde analizom odsječka, plazmid s pravilnom orijentacijom se označava pGEM-GMPL. XhoI fragment se izreže iz pGEM-GMPL i klonira u XhoI mjesto pSAD- NG, čime se dobiva klon virusa bjesnoće pune duljine gena kojeg imaju sljedeći redoslijed: N-G-M-P-L. Taj se plazmid označava pSAD-L16GMP.

Kako bi razmjestili gene u redoslijedu N-G-P-M-L, stvara se jedinstveno HpaI mjesto između gena G i M na pGEM-GML. Sintetiziraju se dvije klice (SEQ ID NOS:51-52) (5'AGAAGAACAACTGTTAACACCACTG3’ i 5'AGTGGT GTTAACAGTTGTTCTTCTG3') i koriste za PCR. Mutacija se potvrđuje analizom odsječka, a plazmid se označava pGEM-GHML. Potom se čitav P gen, koji je amplificiran na gore opisani način, klonira u HpaI mjesto pGEM-GHML. Nakon potvrde analizom odsječka, odabire se plazmid s pravilnom orijentacijom. Potom se međugenski odsječak mora rekonstruirati ciljanom mutagenezom, uporabom klica (SEQ ID NOS:53-54): 5'AGAAGAACAACT AAGAACACCACTG3' i 5'AGTGGTGTTCTTAGTTGTTCTTCTG3'. Nakon potvrde analizom odsječka, plazmid s pravilnom orijentacijom se označava pGEM-GPML. XhoI fragment se na kraju izreže iz pGEM-GPML i klonira u XhoI mjesto pSAD-NG, čime se dobiva klon virusa bjesnoće pune duljine s genima u redoslijedu N-G-P-M-L. Taj plazmid se označava pSAD-L16GPM.

Kako bi odabrali viruse bjesnoće s razmještenim genima, plazmidi s razmještenim genima se pojedinačno transfektiraju u BSR T7/5 stanice, zajedno s pTIT-N, pTIT-P i TIT-L, kako je opisano (Schnell et al., 2000). Stanicama se dodaje svježi medij i uzgajaju se dodatna tri dana, potom se supernatant prenese u svježe BSR stanice. Dva dana nakon infekcije, virus se otkriva uporabom anti-virus N protutijela spregnutih s FITC. Pozitivno obojenje stanica upućivat će na uspješno oslobađanje infektivnog virusa. Ti virusi se označavaju L16G1N2G333, L16G1N3G333, L16G1N4G333, L16GMPG333, L16MGPG333, L16PGMG333, L16GPMG333 i L16MPGG333. Virus se množi za daljnju analizu u BHK stanicama, odnosno u BHK-N stanicama.

Za dodatnu analizu virusa s razmještenim genima, utvrđuju se krivulje rasta tih virusa infektiranjem BSR stanica sa svakim od virusa na moi 1. L16G333 su uključene za usporedbu. Nakon jednosatne adsorpcije, virusni inokulum se ukloni i stanice isperu tri puta s PBS-om. Potom se doda svježi medij. Alikvoti se uklone iz medija kulture svakih 6, 12, 18, 24, 36, 60 i 72 sata p.i. i koriste za titraciju virusa kako je opisano (Wu et al., 2001). Taj se pokus ponovi tri puta, a za usporedbu se koristi prosječni titar za svaki virus. Kako bi utvrdili da li virusi s razmještenim genima imaju smanjenu brzinu viralne replikacije, BSR stanice se zaraze na moi 1 ffu/stanica i prikupe 40 sati p.i. u svrhu izdvajanja ukupne RNA, uporabom opisanog postupka (Wu et al., 2001). Viralna genomska RNA i transkripti u RNA pripravcima se analiziraju Northern blot hibridizacijom uporabom proba napravljenih i od N (Fu et al., 1991) i od G cDNA (Fu et al., 1993). Kvantifikacija RNA se izvodi densito-metrijom ili fosfo-oslikavanjem RNA vrpci. Alternativno, BSR stanice zaražene tim virusima se označavaju metabolički s [3H]uridinom (33 μCi/ml) 4 sata u nazočnosti aktinomicina D (5 μg/ml), kako je opisano za VSV (Wertz et al., 1998). Stanice se potom prikupe za RNA ekstrakciju. RNA se analizira gel elektroforezom i kvantificira densitometrijom. Molarni omjer između pet transkripata i genomske RNA se utvrdi densitometrijom i usporedi između spomenutih virusa.

Izgrađeni su i odabrani mutantni virusi bjesnoća kod kojih je gen G pomaknut na prvu poziciju. Osim toga, ti virusi također nose mutaciju na argininu 333 G. Redoslijed gena kod spomenutih mutiranih virusa se potvrdi putem RT-PCR. Studije krivulja rasta virusa pokazuju kako virusni prinos ima sljedeći redoslijed L16G333, L16G1N2G333, L16G1N3G333 i L16G1N4G333. Slično tomu, Northern blot hibridizacija i označavanje [3H]uridinom upućuje kako je brzina viralne replikacije (genomske RNA) najviša kod L16G333, a zatim slijede L16G1N2G333, L16G1N3G333 i L16G1N4G333. Osim toga, molarni omjer između pet viralnih transkripata je promijenjen, ovisno o relativnoj poziciji tih gena duž viralnog genoma. Kod L16G333, brojnost transkripata ima sljedeći redoslijed: N>P>M>G>L; L16G1N2G333, G>N>P>M>L; L16G1N3G333, G>P>N>M>L, te L16G1N4G333, G>P>M>N>L. Kako je mutacija G na argininu 333 uključena u viruse s razmještenim genima, ti virusi imaju ne samo smanjenu brzinu replikacije, već također i smanjenu sposobnost napadanja živčanog sustava.

Također su konstruirani i odabrani mutantni virusi bjesnoće s razmještenim genima P, M i G unutar genoma virusa bjesnoće. Osim toga, takovi virusi s razmještenim genima također nose mutaciju G na argininu 333. Redoslijed gena kod tih mutiranih virusa se potvrđuje putem RT-PCR. Ako su rezultati za VSV s razmještenim genima nekakva naznaka (Ball et al., 1999), studije krivulja rasta virusa pokazuju kako je virusni prinos za neke od tih virusa (L16MPGG333, L16MGPG333 i L16PGMG333) viši od onog kod L16G333. Virusni prinos za druge viruse s razmještenim genima (L16GPMG333 i L16GMPG333) je niži od onog za L16G333.

Slično tomu, Northern blot hibridizacija i označavanje [3H]uridinom pokazuje da je brzina viralne replikacije (genomska RNA) povećana kod L16MPGG333, L16MGPG333, i L16PMGG333, dočim je brzina viralne replikacije (genomska RNA) smanjena kod L16GPMG333 i L16GMPG333 u usporedbi s L16G333. Osim toga, molarni omjer između pet viralnih transkripata je promijenjen, ovisno o relativnoj poziciji tih gena duž genoma virusa. Kod L16G333, količina transkripata ima sljedeći redoslijed N>P>M>G>L; L16MPGG333, N>M>P>G>L; L16MGPG333, N>M>G>P>L; L16PMGG333, N>P>M>G>L; L16GPMG333, N>G>P>M>L; te L16GMPG333, N>G>M>P>L. Kako je mutacija G na argininu 333 uključena u viruse s razmještenim genima, ti virusi imaju ne samo smanjenu brzinu replikacije, već također i smanjenu sposobnost napadanja živčanog sustava.

Utvrđivanje virulentnosti virusa bjesnoće s razmještenim genima. Za određivanje virulentnosti virusa s razmještenim genima, odabrani su miševi iz dvije dobne skupine (novorođeni miševi i miševi u dobi od 5 do 6 tjedana). Testirano je 9 virusa, uključujući L16G333, L16G1N2G333, L16G1N3G333, L16G1N4G333, L16-PGMG333, L16-GPMG333, L16-GMPG333, L16-MGPG333 i L16-MPGG333. Za svaki virus testirane su tri doze (105, 106 i 107 ffu). Za ovaj pokus potrebno je ukupno 27 skupina ICR miševa (deset u svakoj skupini) u dobi od 5 do 6 tjedana. Dodatna skupina uključena je kao kontrola. Životinje su zaražene s 10 μl koji sadrži potrebnu dozu putem i.c. inokulacije. U kontrolnoj skupini, miševima se injektira 10 μl fiziološke otopine i.c. rutom. Životinje se nadziru dvaput na dan tijekom 20 dana na znakove kliničke bjesnoće, poput nakostriješene dlake, ataksije i paralize. Smrtno iscrpljeni miševi i miševi na kraju pokusa se eutanaziraju inhalacijom CO2. Zabilježi se postotak smrtnosti za svaku skupinu i statistički analizira uporabom student T testa ili X2 testa.

Za pokus testiranja virulentnosti spomenutih virusa kod novorođenih životinja potrebno je ukupno 27 legla ICR miševa. Svako je leglo zaraženo sa svim dozama jednog virusa. Dodatno leglo je uključeno kao kontrola. Novorođeni miševi stari jedan dan zaraženi su s volumenom 10 μl koji sadrži tražene doze mutantnih virusa putem i.c. inokulacije. Kod kontrolne skupine, novorođenim miševima se injektira 10 μl fiziološke otopine i.c. rutom. Životinje se pregledavaju dvaput na dan tijekom 20 dana radi uginulih jedinki iz istog okota. Preživjeli miševi se na kraju pokusa eutanaziraju inhalacijom CO2. Zabilježi se postotak smrtnosti za svaku skupinu i statistički analizira uporabom student T testa ili X2 testa.

L16G333 ne inducira nikakvo oboljenje kod životinja u dobi od 5 do 6 tjedana. Međutim, on može inducirati kliničke znakove kod novorođenih životinja. Infekcije virusima kod kojih je G pomaknut na prvu poziciju, tj., L16G1N2G333, L16G1N3G333 i L16G1N4G333, ne inducira oboljenja kod 5 do 6 tjedana starih miševa budući da ti svi virusi imaju arginin 333 koji je mutiran u glutaminsku kiselinu. Ball i suradnici (Ball et al., 1999) su objavili da patogenost VSV-a sa razmještenim P, M i G nije u korelaciji s brzinom replikacije u kulturi stanica. Samo se oni virusi koji su manje virulentni od L16G333 dalje testiraju na antigenost i imunogenost.

Utvrđivanje imunogenosti virusa bjesnoće s razmještenim genima. Za utvrđivanje imunogenosti virusa s razmještenim genima odaberu se odrasli miševi. Testira se 9 virusa, L16G333, L16G1N2G333, L16G1N4G333L, L16-PGMG333, L16-GPMG333, L16-GMPG333, L16-MGPG333 i L16-MPGG333. Za svaki virus se testiraju tri doze (105, 106 i 107 ffu) i time se određuje minimalna doza virusa koja može stimulirati zaštitni imunitet. Ponovno se koriste tri rute inokulacije, to jest, i.m., i.d. i s.c. Za taj se pokus koristi ukupno 81 skupina ICR miševa (deset u svakoj skupini). Dodatna skupina uključena je kao kontrola. Životinje se imuniziraju s volumenom 50 μl koji sadrži traženi virus u traženoj dozi, putem i.m., i.d. ili s.c. Miševi u kontrolnim skupinama ostave se necijepljeni. Miševima je uzimana krv u svrhu mjerenja VNA (Hable, 1996; Briggs et al., 1996) 1, 2, 3 i 4 tjedna nakon imunizacije. Razvoj VNA se uspoređuje između svih skupina miševa statističkom analizom uporabom dvosmjerne analize varijacije s interakcijama (Littell et al., 1996). 4 tjedna nakon imunizacija, miševima je dana u stražnju nogu i.m. doza od 10 MIMLD50 (50% i.m. smrtonosne doze za miševe) CVS-24 virusa, kako je opisano (Fu et al., 1991). Životinje se nadziru dvaput na dan na razvoj neuroloških simptoma i uginuća tijekom 20 dana. Životinje se nadziru dvaput na dan, bilježi se stopa smrtnosti i statistički analizira za svaku skupinu životinja.

Svi mutantni virusi bjesnoće sposobni su inducirati imune odgovore rečenim parenteralnim rutama imunizacije. Niti jedan od tih virusa ne uzrokuje oboljenje kod odraslih miševa periferalnom rutom imunizacije. Miševi imunizirani s virusima koji imaju G na prvoj poziciji mogu razviti brže i jače VNA odgovore od miševa koji su imunizirani s L16G333 i virusima s razmještenim genima kod kojih je G na drugim pozicijama. To je vrlo bitno za liječenje nakon izlaganja zato što je brz imuni odgovor nužan za neutralizaciju pristižućih virusa kako bi se spriječile zaraze CNS-a. Virusi s razmještenim genima koji induciraju usporedive ili više VNA titre od L16G333 i štite 100 % imuniziranih životinja protiv inducirane infekcije virulentnim virusom bjesnoće, a ipak neće inducirati nikakvo oboljenje kod novorođenih životinja putem i.e. infekcije (vidi gore), testiraju se dalje kao avirulentna cjepiva protiv virusa bjesnoće na ciljnim životinjskim vrstama, poput rakuna, pasa ili čak ljudi različitim rutama imunizacije.

Ispitivani su učinci mutiranja fosforiliranog serina (S) u alanin (A), glicin (G), asparaginsku kiselinu (D), asparagin (N), glutaminsku kiselinu (E) i glutamin (Q) na N mutantima istraživanjem viralne transkripcije i replikacije u minigenomu, kao i u oslobođenom virusu. Rezultati tih studija pokazuju da su i viralna transkripcija i viralna replikacija smanjene kada N nije fosforiliran, pa prema toma N fosforilacija ima važnu ulogu u modulaciji i transkripcije i replikacije virusa bjesnoće. Osim toga, ti rezultati pokazuju da su učinci N fosforilacije na viralnu transkripciju i replikaciju posljedica kombinacije čistog negativnog naboja fosfatne polovice i strukture serinskog ostatka.

Iako je predmetni izum ovdje opisan i ilustriran referencama na različite specifične tvari, procedure i primjere, podrazumijeva se kako predmetni izum nije ograničen na konkretne kombinacije tvari, te procedure koje su za tu namjenu odabrane. Podrazumijevaju se brojne varijacije takovih detalja, što će stručnjaci u predmetnom području znati.

Slijedi popis dokumenata koji se odnose na gornji opis, a posebice na procedure pokusa i rasprave. Podrazumijeva se kako su ti dokumenti referencom uključeni u cijelosti.

Aghomo, H.O., Oduye, O.O., Rupprecht, C.E. 1990. The serological response of young dogs to the Flury LEP strain of rabies virus vaccine. Vet. Res. Commun. 14:415-425.

Anderson, M.C., Baer, H., Frazier, D.J., Quinnan, G.V. 1987. The role of specific IgE and beta-propiolactone in reactions resulting from booster doses of human diploid cell rabies vaccine. J. Allergy Clin. Immunol. 80:861.

Anonymous 2000. Compendium of Animal Rabies Prevention and Control, 2000. MMWR 49:19-30.

Anonymous 1993. World survey of rabies 27. Veterinary Public Health Unit, WHO, Geneva, Switzerland.

Anonymous 1988. Rabies vaccine failures [editorial], Lancet 1:917.

Arvin, A.M.2000. Measles vaccines – a positive step toward eradicating a negative strand. Nat Med. 6:744-745.

Baer, G.M. 1988. Oral rabies vaccination: an overview. Rev. Infect. Dis. 10:S644-S647.

Ball, L.A., Pringle, C.R., Flanagan, B., Perepelitsa, V.P., Wertz, G.W. 1999. Phenotypic consequences of rearranging the P, M, and G genes of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 73:4705-12.

Banerjee, A. K, i D. Chattopadhyay. 1990. Strucutre and function of the RNA polymerase of vesicular stomatitis virus. Adv Virus Res. 38:99-124.

Barr, J., C. R. Chambers, C. R. Pringle, and A. J. Easton. 1991. Sequence of the major nucleocapsid protein gene of pneumonia virus of mice: Sequence comparisons suggest structural homology between nucleocapsid proteins of pneumoviruses, paramyxoviruses, rhabdoviruses and filoviruses. J. Gen. Virol. 72:677-685.

Barth, R., Gruschkan, H., Bijok, U., Hilfenhaus, J., Hinz, J., Milcke, L., Moser, H., Jaeger, O., Ronneberger, H., Weinmann, E. 1984. A new inactivated tissue culture rabies vaccine for use in man. Evaluation of PCEC-vaccine by laboratory tests. J. Biol. Stand. 12:29-64.

Blancou, J., Kieny, M.P., Lathe, R., Lecocq, J.P., Pastoret, P.P., Soulebot, J.P., Desmettre, P. 1986. Oral vaccination of the fox against rabies using a live recombinant vaccinia virus. Nature. 322:373-375.

Boudinot, P., S. Salhi, M. Blanco and A. Benmansour. 2001. Viral haemorrhagic septicaemia virus induces vig-2, a new intereron-responsive gene in rainbow trout. Fish Shellfish Immunol. 11:383-397.

Briggs, D.J., Dreesen, D.W., Morgan, P., Chin, J.E., Seedle, C.D., Cryz, L., Gluck, R., Cryz, S.J. 1996. Safety and immunogenicity of Lyssavac Berna human diploid cell rabies vaccine in healthy adults. Vaccine 14,1361-1365.

Brochier, B., Kieny, M.P., Costy, P., Coppens, P., Bauduin, B., Lecocq, J.P., Languet, B., Chappuis, G., Desmettre, P., Afiademanyo, K., et al. 1991. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature; 354: 520-522.

Brochier, B., Languet, B., Blancou, J., Languet, B., Artois, M., Kieny, M.P., Lecocq, J.P., Costy, P., Desmettre, P., Chappuis, G., et al. 1989. Use of recombinant vaccinia-rabies virus for oral vaccination of wildlife against rabies: innocuity to several non-target bait consuming species. J Wildl Dis. 25:540-547.

Buchholz, U.J., Finke, S., Conzelmann, K.K. 1999. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader reagion acts as a functional BRSV genome promoter. J Virol. 73:251-259.

Centers for Disease Control. 1984. Systemic allergic reactions following immunization with human diploid cell rabies vaccine. MMWR 33:12.

Charlton, K.M., Artois, M., Prevec, L., Campbell, J.B., Casey, G.A., Wandeler, A.I., Armstrong, J. 1992. Oral rabies vaccination of skunks and foxes with a recombinant human adenovirus vaccine. Arch. Virol. 123:169-179.

Clark, K.A., Wilson, P.J. 1996. Postexposure rabies prophylaxis and preexposure rabies vaccination failure in domestic animals. J. Am. Vet. Med. Assoc. 208:1827-1830.

Conzelmann, K.-L., Schnell, M. 1994. Rescue of synthetic genomic RNA analogs of rabies virus by plasmid-encoded proteins. J. Virol. 68:713-719.

Conzelmann, K-L., Cox, J., Schneider, L.G., Theil, H-J. 1990. Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD B19. J. Virol. 175:484-499.

Coulon, P., Derbin, C., Kucera, P., Lafay, F., Prehaud, C., Flamand, A. 1989. Invasion of the peripheral nervous systems of adult mice by the CVS strain of rabies virus and its avirulent derivative AvOl. J Virol. 63:3550-3554.

Cox, J.H., Dietzschold, B., Schneider, L.G. 1977. Rabies virus glycoprotein. II. Biological and serological characterization. Infect Immun. 16:754-759.

Dietzschold, B., Wunner, W.H., Wiktor, T.J., Lopes, A.D., Lafon, M., Smith, C.L., Koprowski, H. 1983. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:70-74.

Dietzschold, B., Wiktor, T.J., Trojanowski, J.Q., Macfarlan, R.I., Wunner, W.H., Torres-Anjel, M.J., Koprowski, H. 1985. Differences in cell-to-cell spread of pathogenic and apathogenic rabies virus in vivo and in vitro. J Virol. 56:12-18.

Dietzschold, B., Lafon, M., Wang, H., Otvos, L., Celis, E., Wunner, W.H., Koprowski, H. 1987. Localization and immunological characterization of antigenic domains of rabies virus internal N and NS proteins. Virus Res. 8:103-125.

Duteil, X.1986. New purified Vero-cell vaccine prevents rabies in patients bitten by rabid animals. Lancet. 2:129-31.

Emerson, S. U. 1982. Reconstitution studies detect a single polymerase entry site on the vesicular stomatitis virus genome. Cell. 31:635-642.

Enami, M., Luytjes, W., Krystal, M., Palese, P. 1990. Introduction of site-specific mutations into the genome of influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:3802-3805.

Esh, J.B., Cunningham, J.G., Wiktor, T.J. 1982. Vaccine-induced rabies in four cats. J. Am. Vet. Med. Assoc. 180:1336-1339.

Etessami, R., Conzelmann, K.K/, Fadai-Ghotbi, B., Natelson, B., Tsiang, H.,Ceccaldi, P.E. 2000. Spread and pathogenic characteristics of a G-deficient rabies virus recombinant: an in vitro and in vivo study. J Gen Virol. 81:2147-53.

Fearneyhough, M.G., Wilson, P.J., Clark, K.A., Smith, D.R., Johnston, D.H., Hicks, B.N., Moore, G.M.1998. Results of an oral rabies vaccination program for coyotes. J. Am. Vet. Med. Assoc. 212:498-502.

Finke, S., Conzelmann, K.-K. 1997. Ambisense gene expression from recombinant rabies virus: random packaging of positive- and negative-strand ribonucleoprotein complexes into rabies virions. J. Virol. 71:7281-7288.

Finke, S., Cox, J.H., Conzelmann, K.K. 2000. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. J Virol. 74:7261-9.

Flamand, A., Coulon, P., Lafay, F., Tuffereau, C. 1993. Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine. Trends. Microbiol. 1:317-320.

Flamand, A., J. F. Delagneau, i F. Bussereau. 1978. An RNA polymerase activity in purified rabies virions. J. Gen. Virol. 40:233-238.

Flanagan, E.B., Ball, L.A., Wertz, G.W. 2000. Moving the glycoprotein gene of vesicular stomatitis virus to promoter-proximal positions accelerates and enhances the protective immune response. J. Virol. 74:7895-7902.

Fu, Z.F. 1997. Rabies and rabies research: past, present and future. Vaccine. 15: S20-S24.

Fu, Z.F., Dietzschold, B., Schumacher, C.L., Wunner, W.H., Ertl, H.C.J., Koprowski, H. 1991. Rabies virus nucleoprotein expressed in and purified from insect cells is efficacious as a vaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2001-2005.

Fu, Z.F., Wickstrom, E., Jiang, M., Corisdeo, S., Yang, J., Dietzschold, B., Koprowski, H. 1996. Inhibition of rabies virus infection by an oligodeoxynucleotide complementary to rabies virus genomic RNA. Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 6:87-93.

Fu, Z.F., R. Rupprecht, B. Dietzschold, P. Saikumar, H. S. Niu, I. Babka, W. H. Wunner, and H. Koprowski 1993. Oral vaccination of raccoons (Procyon lotor) with baculovirus-expressed rabies virus glycoprotein. Vaccine, 11:925-928.

Fu, Z. F., Y. M. Zheng, W. H. Wunner, H. Koprowski, and B. Dietzschold. 1994. Both the N- and C-terminal domains of the nominal phosphoprotein of rabies virus are involved in binding to the nucleoprotein. Virology , 200:590-597.

Fuenzalida, E. 1972. Human pre-exposure rabies immunization with suckling mouse brain vaccine. Bull World Health Organ. 46:561-563.

Fuerst, T. R., E. G. Niles, F. W. Studier, and B. Moss. 1986. Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8122-8126.

Gosztonyi, G., Dietzschold, B., Kao, M., Rupprecht, C.E., Ludwig, H,, Koprowski, H. 1993. Rabies and borna disease. A comparative pathogenetic study of two neurovirulent agents. Lab. Invest. 68:285-295.

Hable, K. 1996. Hable test for potency. In: Laboratory techniques in rabies. 4th edition. Meslin, F.X., Kaplan, M.M. and Koprowski, H (ed). World Health Organization. Geneva, pp.369-72.

Hanlon, C.A., Niezgoda, M., Hamir, A.N., Schumacher, C., Koprowski, H., Rupprecht, C.E. 1998. First North American field release of a vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus. J. Wildl. Dis., 34:228-239.

Henderson, D.A. 1980. Smallpox eradication. Public Health Rep. 95:422-426.

Kawai, A. 1977. Transcriptase activity associated with rabies virion. J. Virol., 24:826-835.

Kawai, A., H. Toriumi, T. S. Tochikura, T. Takahashi, Y. Honda, and K. Morimoto. 1999. Nucleocapsid formation and/or subsequent conformational change of rabies virus nucleoprotein (N) is a prerequisite step for acquiring the phosphatase-sensitive epitope of monoclonal antibody 5-2-26. Virology, 263:395-407.

Khawplod, P., Glueck, R., Wilde, H., Tantawichien, T., Chomchey, P., Thipkong, P., Benjavongkulchai, M., Sumboonanondha, A., Prakongsri, S., Siakasem, A. et al. 1995 Immunogenicity of purified duck embryo rabies vaccine (Lyssavac-N) with use of the WHO-approved intradermal postexposure regimen. Clin. Infect. Dis., 20:646-651.

Kieny, M.P., Lathe, R., Drillen, R., Spehner, D., Skory, S., Schmitt, D., Wiktor, T., Koprowski, H., Lecocq, J.P. 1984. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature, 312:163-166.

Kouznetzoff, A., M. Buckle, and N. Tordo. 1998. Identification of a region of the rabies virus N protein involved in direct binding to the viral RNA. J. Gen. Virol., 79:1005-1013.

Krebs, J.W., Smith, J.S., Rupprecht, C.E., Childs, J.E. 2000. Mammalian reservoirs and epidemiology of rabies diagnosed in human beings in the United States, 1981-1998. Ann N Y Acad Sci., 916:345-53.

Krebs, J.W., Rupprecht, C.E., Childs, J.E. 2000. Rabies surveillance in the United States during 1999. J Am Vet Med Assoc., 217:1799-811.

Lafay, P., Benejean, J., Tuffereau, C., Flamand, A., Coulon, P. 1994. Vaccination against rabies: construction and characterization of SAG-2, a double avirulent derivative of SADBern. Vaccine, 12:317-320.

Lawson, N.D., Stillman, E.A., Whitt, M.A., Rose, J.K. 1995. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Sci. USA, 92:4477-4481.

Le Blois, H., Tuffereau, C., Blancou, J., Artois, M., Aubert, A., Flamand, A. 1990. Oral immunization of foxes with avirulent rabies virus mutants. Vet. Microbiol., 23:159-166.

Littell, R.C., Milliken, G.A., Stroud, W.W. and Wolfinger, R.D. 1996. SAS system for mixed models. SAS Institute Inc. Cary, North Carolina.

Lodmell, D.L., Ray, N.B., Parnell, M.J., Ewalt, L.C., Hanlon, C.A., Shaddock, J.H., Sanderlin, D.S., Rupprecht, C.E. 1998. DNA immunization protects nonhuman primates against rabies virus. Nat Med., 4:949-952.

Lumbiganon, P., Bunyahotra, V., Pairojkul, C. 1987. Human rabies despite treatment with rabies immune globulin and human diploid cell rabies vaccine - Thailand. MMWR 36:759-.

Lundberg, K.S., Shoemaker, D.D., Adams, M.W., Short, J.M., Sorge, J.A., Mathur, E.J. 1991. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene, 108:1-6.

Masson, E., Cliquet, F., Aubert, M., Barrat, J., Aubert, A., Artois, M., Schumacher, C.L. 1996. Safety study of the SAG2 rabies virus mutant in several non-target species with a view to its future use for the immunization of foxes in Europe. Vaccine, 14:1506-1510.

Melter, M.I. 1996. Assessing the cost and benefits of an oral vaccine for raccoon rabies: a possible model. Emerging Infect. Dis., 2:343-349.

Meslin, F.X., Fishbein, D.B., Matter, H.C. 1994. Rationale and prospects for rabies elimination in developing countries. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 187:1-26.

Mitmoonpitak, C., Tepsumethanon, V., Wilde, H. 1998. Rabies in Thailand. Epidemiol. Infect., 120:165-169.

Osorio, TJ., Tomlinson, C.C., Frank, R.S., Haanes, E.J., Rushlow, K., Haynes, J.R., Stinchcomb, D.T. 1999. Immunization of dogs and cats with a DNA vaccine against rabies virus. Vaccine, 17:1109-1116.

Pasteur L., Illo J.1996. Pasteur and rabies: an interview of 1882. Med Hist., 40:373-7.

Pattnaik, A.K., Wertz, G.W. 1990. Replication and amplification of defective interfering particle RNAs of vesicular stomatitis virus in cells expressing viral proteins from vectors containing cloned cDNAs. J. Virol., 64:2948-2957.

Pattnaik, A.K., Wertz, G.W. 1991. Cells that express all five proteins of vesicular stomatitis virus from cloned cDNAs support replication, assembly, and budding of defective interfering particles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1379-1383.

Prevec, L., Campbell, J.B., Christie, B.S., Belbeck, L., Graham, F.L. 1990. A recombinant human adenovirus vaccine against rabies. J. Infect. Dis., 161:27-30.

Ray, N.B., Ewalt, L.C., Lodmell, D.L. 1997. Nanogram quantities of plasmid DNA encoding the rabies virus glycoprotein protect mice against lethal rabies virus infection. Vaccine, 15:892-895.

Reed, E.J., Muench, H. 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg., 27:493-497.

Robbins, A.H., Borden, M.D., Windmiller, B.S., Niezgoda, M., Marcus, L.C., O'Brien, S.M., Kreindel, S.M., McGuill, M.W., DeMaria, A. Jr, Rupprecht, C.E.,

Rowell, S. 1998. Prevention of the spread of rabies to wildlife by oral vaccination of raccoons in Massachusetts. J. Am. Vet. Med. Assoc., 213:1407-1412.

Roscoe, D.E., Holste, W.C., Sorhage, F.E., Campbell, C., Niezgoda, M., Buchannan, R., Diehl, D., Niu, H.S., Rupprecht, C.E. 1998. Efficacy of an oral vaccinia-rabies glycoprotein recombinant vaccine in controlling epidemic raccoon rabies in New Jersey. J. Wildl. Dis., 34:752-763.

Rupprecht, C.E., Blass, L., Smith, K., Orciari, L.A., Niezgoda, M., Whitfield, S.G., Gibbons, R.V., Guerra, M., Hanlon, C.A. 2001. Human infection due to recombinant vaccinia-rabies glycoprotein virus. N Engl J Med. 345:582-6.

Rupprecht, C.E., Smith, J.S., Fekadu, M., Childs, J.E. 1995. The ascension of wildlife rabies: a cause for public health concern or intervention? Emerg Infect Dis. 1:107-14.

Rupprecht, C.E., Wiktor, T.J., Johnston, D.H., Hamir, A.N., Dietzschold, B., Wunner, W.H., Glickman, L.T., Koprowski, H. 1986. Oral immunization and protection of raccoons (Procyon lotor) with a vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus vaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7949-7950.

Rupprecht, C.E., Hanlon, A.N., Hamir, A., Koprowski, H. 1993. Oral wildlife rabies vaccination: development of a recombinant virus vaccine. Trans. 57th N.A. Wildl. Natl. Res. Conf., pp. 439-452.

Sabin, A.B., Boulger, L.R. 1973. History of the Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strain. J. Bio. Stand., 1:15-19.

Schneider, L.G., Cox, J.H., Muller, W.W. and Hohnsbeen, K-P. 1988. Current oral rabies vaccination in Europe: an interim balance. Rev. Infect. Dis., 10:S654-S659.

Schnell, M. J., H. D. Foley, C. A. Siler, J. P. McGettigan, B. Dietzschold, and R. J. Pomerantz. 2000. Recombinant rabies virus as potentil live-viral vaccines for HIV-1. Proc Natl Acad Sci USA., 97:3544-3549.

Schnell, M.J., T. Mebatsion, and K.-K. Conzelmann. 1994. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J., 13:4195-4203.

Schumacher, C.L., Coulon, P., Lafay, P., Benejean, J., Aubert, M.F., Barrat, J., Aubert, A., Flamand, A. 1993. SAG-2 oral rabies vaccine. Onderstepoort J. Vet. Res., 60:459-462.

Sehgal, S., Bhattacharya, D., Bhardwaj, M.1993. Ten year longitudinal study of efficacy and safety of purified chick embryo cell vaccine for pre- and post-exposure prophylaxis of rabies in Indian population. J Commun Dis., 27:36-43.

Seif, I., Coulon, P., Rollin, P.E., Flamand, A. 1985. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. J. Virol., 53:926-934.

Shill, M., Baynes, R.S., Miller, S.D. 1987. Fatal rabies encephalitis despite appropriate post-exposure prophylaxis. N Engl J Med 1987, 316:1257-1258.

Smith, J.S., Orciari, L.A., Yager, P.A. 1995. Molecular epidemiology of rabies in the United States. Sem. Virol., 6:387-400.

Smith, J.S., Fishbein, D.B., Rupprecht, C.E., Clark, K.1991. Unexplained rabies in three immigrants in the United States. A virologic investigation. N. Engl. J. Med., 324:205-11.

Sokol, F., Clark, H.F. 1973. Phosphoproteins, structural components of rhabdoviruses. Virol., 52:246-263.

Spadafora, D., D. M. Canter, R. L. Jackson, and J. Perrault. 1996. Constitutive phosphorylation of the vesicular stomatitis virus P protein modulates polymerase complex formation but is not essential for transcription or replication. J. Virol., 70:4538-4548.

Suntharasamai, P., Warrell, M.J., Warrell, D.A., Viravan, C., Looareesuwan, S., Supanaranond, W., Chanthavanich, P., Supapochana, A., Tepsumethanon, W., Pouradier-Swanson, M.C., Rosanoff, E., Gurwith, M., Deitch, M., Schnurrenberger, P.O., Reed, C.E. 1987. IgE and IgG antibodies to beta-propiolactone and human serum albumin associated with urticarial reactions to rabies vaccine. J. Met. Dis., 155:909.

Tuns, T., Briggs, D.J., Davis, R.D., Moore, S.M., Xiang, Z., Ertl, H.C., Fu, Z.F. 2000. Adult dogs receiving a rabies booster dose with a recombinant adenovirus expressing rabies virus glycoprotein develop high titers of neutralizing antibodies. Vaccine, 18:2804-7.

Tordo, N., O. Poch, A. Ermine, and G. Keith. 1986. Primary structure of leader RNA and nucleoprotein genes of rabies genome: Segmented homology with VSV. Nucleic Acid Res., 14:2671-2683.

Trejos, A., Lewis, V., Fuenzalida, E., Larghi, O.P. 1974. Laboratory investigations of neuroparalytic accidents associated with suckling mouse brain rabies vaccine. I. -- Encephalitogenicity and virological studies. Ann Immunol (Paris)., 125:917-24.

Wagner, R. R, and J. K. Rose. 1996. Rhabdoviridae: The viruses and their replication. In B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, and S. E. Straus (ed.), Fields Virology, 3rd edition, pp. 1121-1136. Lippincott-Reven, Philadelphia, PA.

Wandeler AI, Capt S, Kappeler A, Hauser R. 1998. Oral immunization of wildlife against rabies: concept and first field experiments. Rev. Infect. Dis., 10:S649-S653.

Wang, Y., Xiang, Z., Pasquini, S., Ertl, H.C. 1997. The use of an E1-deleted, replication-defective adenovirus recombinant expressing the rabies virus glycoprotein for early vaccination of mice against rabies virus. J Virol., 71:3677-3683.

Warrington, R.J., Martens, C.J., Rubin, M., Rutherford, W.J., Aoki, F.Y. 1987. Immunologic studies in subjects with a serum sickness-like illness after immunization with human diploid cell rabies vaccine. J. Allergy Clin. Immunol., 79:605.

Weiner, M. P., G. L. Costa, W. Schoettlin, J. Cline, E. Mathur, and J. C. Bauer 1994. Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chain reaction. Gene, 151:119-123.

Wertz, G.W., N. L. Davies, and J. Patton. 1987. The role of proteins in vesicular stomatitis virus RNA replication. In R.R. Wagner (ed.), The Rhabdoviruses, pp. 271-296. Plenum Press, New York.

Wertz, G.W., V. P. Perepelitsa, and L.A. Ball. 1998. Gene rearrangement attenuates expression and lethality of a nonsegmented negative strand RNA virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3501-3506.

Whelan, S.P.J., Ball, L.A., Barr, J.N., Wertz, G.T. 1995. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:8388-8392.

Wiktor, T.J., Fernandes, M.V. and Koprowski, H. 1964. Cultivation of rabies virus in human diploid cell strain WI-38. J. Immunol., 93:353-366.

Wilcock, B.P., Yager, J.A. 1986. Focal cutaneous vasculitis and alopecia at sites of rabies vaccination in dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc., 188:1174-1177.

Winkler, W.G., Shaddock, J.H., Williams, L.W. 1976. Oral rabies vaccine: evaluation of its infectivity in three species of rodents. Am J Epidemiol., 104:294-298.

Wu, X., Gong, X., Foley, H.D., Schnell, M.J., Fu, Z.F. 2002. Both viral transcription and replication are reduced when the rabies virus nucleoprotein is not phosphorylated. J. Virol. 76:4153-4161.

Wunner, W.H. 1991. The chemical composition and molecular structure of rabies viruses. In: Natural History of Rabies, 2nd Ed., (G.M. Baer, ed.). CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, pp. 31-67.

Xiang, Z,Q., Spitalnik, S., Tran, M., Wunner, W.H., Cheng, J., Ertl, H.C. 1994. Vaccination with a plazmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus. Virology, 199:132-140.

Xiang, Z.Q., Yang, Y., Wilson, J.M., Ertl, H.C. 1996. A replication-defective human adenovirus recombinant serves as a highly efficacious vaccine carrier. Virology, 219:220-227.

Yang, J.; Hooper, B.C.; Wunner, W.H.; Koprowski, H.; Dietzschold, B.; Fu, Z.F. 1998. The specificity of rabies virus RNA encapsidation by nucleoprotein. Virology, 242:107-117.

Yang, J.; Koprowski, H.; Dietzschold, B.; Fu, Z.F. 1999. Phosphorylation of rabies virus nucleoprotein regulates viral RNA transcription and replication by modulating leader RNA encapsidation. J. Virol., 73:1661-1664.

Claims (62)

1. Mutantni virus bjesnoće koji sadrži N protein virusa bjesnoće, naznačen time, da rečeni N protein nije fosforiliran.

2. Mutantni virus bjesnoće koji sadrži N protein mutantnog virusa bjesnoće, naznačen time, da rečeni N protein sadrži aminokiselinu koja nije serin na poziciji 389.

3. Mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 2, naznačen time, da je aminokiselina na poziciji 389 neutralna aminokiselina.

4. Mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 2, naznačen time, da je aminokiselina na poziciji 389 alanin, glicin, glutamin, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina ili asparagin.

5. Mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 4, naznačen time, da je aminokiselina na poziciji 389 alanin.

6. Mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 2, naznačen time, da je rečeni N protein mutantnog virusa bjesnoće kodiran sa SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 ili SEQ ID NO:64.

7. Mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 6, naznačen time, da je rečeni N protein mutantnog virusa bjesnoće kodiran sa SEQ ID NO:62.

8. Mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da dodatno sadrži mutantni G glikoprotein.

9. Mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 8, naznačen time, da rečeni G glikoprotein sadrži aminokiselinu koja nije arginin na poziciji 333.

10. Mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 9, naznačen time, da rečeni G glikoprotein sadrži Glu na poziciji 333.

11. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

12. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

13. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 3 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

14. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 6 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

16. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 7 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

17. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 8 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

18. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

19. Pripravak za cijepljenje, naznačen time, da sadrži mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 10 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

20. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 11 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

21. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 12 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

22. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 13 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

23. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 14 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

24. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 15 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

25. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 16 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

26. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 17 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

27. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 18 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

28. Postupak induciranja imunog odgovora na virus bjesnoće u sisavca, naznačen time, da uključuje primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 19 koja je sposobna inducirati rečeni imuni odgovor.

29. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće, naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 11 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

30. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće, naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 12 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

31. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće, naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 13 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

32. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće, naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 14 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

33. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće, naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 15 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

34. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće, naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 16 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

35. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 17 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

36. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 18 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

37. Postupak zaštite sisavca od bjesnoće naznačen time, da sadrži primjenu na rečenog sisavca takove količine pripravka za cijepljenje prema Patentnom zahtjevu 19 koja je sposobna zaštititi rečenog sisavca od infekcije virusom bjesnoće.

38. Stanica domaćin za proizvodnju mutantnog virusa bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da sadrži stanicu sisavca domaćina koja proizvodi N protein virusa bjesnoće divljeg tipa.

39. Stanica domaćin prema Patentnom zahtjevu 30, naznačena time, da je rečena stanica domaćin stanica hrčka.

40. Stanica domaćin prema Patentnom zahtjevu 31, naznačena time, da je rečena stanica domaćin BHK stanica .

41. Stanica domaćin prema Patentnom zahtjevu 32, naznačena time, da je rečena stanica domaćin pohranjena pod rednim brojem ATCC PTA-3544.

42. Postupak za proizvodnju mutantnog virusa bjesnoće, naznačen time, da sadrži uzgoj rečenog mutantnog virusa bjesnoće u stanici domaćinu prema Patentnom zahtjevu 38.

43. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 1.

44. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 2.

45. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 3.

46. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 4.

47. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 5.

48. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 6.

49. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 7.

50. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 8.

51. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 9.

52. Vektor za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da se gen koji treba isporučiti operativno umeće u mutantni virus bjesnoće prema Patentnom zahtjevu 10.

53. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 43.

54. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 44.

55. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 45.

56. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 46.

57. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 47.

58. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 48.

59. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 49.

60. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 50.

61. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 51.

62. Postupak za isporuku gena u stanicu čovjeka ili životinje, naznačen time, da sadrži primjenu na čovjeka ili životinju vektora prema Patentnom zahtjevu 52.