CN100346826C - 通过核蛋白在磷酸化位点突变的减弱狂犬病病毒用于抗狂犬病的接种以及在cns中的基因治疗 - Google Patents

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Abstract

提供了一种在一种或者多种病毒蛋白的含有在磷酸化位点的突变的突变病毒，突变引起病毒的活力衰减，而且因此可以生产改进的疫苗组合物。本发明也与疫苗组合物相关，其含有突变的病毒，和用于诱导一种免疫应答的方法，而且保护哺乳动物不受狂犬病病毒的感染。同时在本发明中也包括生产突变病毒和突变病毒蛋白的方法，包括在宿主细胞中，生产或者过量生产突变病毒蛋白的野生型对照疫苗，其与其它病毒蛋白互补以便于生产的突变病毒颗粒得到优化。本发明也包括那些在其中病毒的产生优化的宿主细胞，而且疫苗的组成包括病毒蛋白，单独或者与完整的病毒组合，而且使用相同的方法诱导一种免疫应答的方法或者保护哺乳动物免受感染。本发明也包括适于传送一种基因到人或者动物细胞的载体，以及传送的方法。

Description

通过核蛋白在磷酸化位点突变的减弱狂犬病病毒用于抗狂犬病的接种以及在CNS中的基因治疗
相关申请的对照参考
本申请要求的优先权源于2001年7月20日归档的美国临时申请序列号No.60/331,354，用于所有目的在此引入作为参考。
政府性支持
本工作部分由国家急性和传染性疾病研究院的公共健康服务授权编号AI-33029(Z.F.F.)支持。政府对于本发明拥有一定权利。
发明领域
本发明总体上涉及一种疫苗组合物以及在人和动物中阻止和治疗感染的方法。更特定地，本发明涉及突变的狂犬病病毒，其中的核蛋白在磷酸化发生的氨基酸中发生了突变。本发明也涉及传送该基因进入人或者动物的载体，以及传送基因的方法。
相关技术的描述
在弹状病毒科中，狂犬病病毒是狂犬病病毒属的原型而且疱疹性口炎病毒(VSV)是水泡性病毒属的原型(Wagner和Rose，1996)。基因组RNA用核蛋白(N)包裹，而且该N-RNA复合体，与磷蛋白质(P，也称为NS)以及RNA-依赖的RNA聚合酶(L)一起形成RNP复合体。弹状病毒的该N蛋白，如来自于其它成员的单负病毒目的N蛋白一样，在通过包裹从头合成的病毒基因组RNA的调控病毒RNA的转录以及复制中起到重要作用。尽管狂犬病病毒N和VSV的N在主要的核酸和蛋白质序列中并不具有高度的同源性，但它们确存在保守区域和相似的蛋白质特性。例如狂犬病病毒N蛋白具有四个保守的氨基酸分支与VSV的那些有同源性(Tordo等人，1986)。此外在狂犬病病毒N蛋白与VSV的N蛋白两者具有相似的螺旋结构，其中的α-螺旋从N端开始连续至蛋白的大部分，而且β-转角朝向C-端(Barr等人，1991)。
在狂犬病病毒N蛋白与VSV的N蛋白的一个主要的结构上的不同。狂犬病病毒N是磷酸化的而VSV的N蛋白没有(Sokol和Clark，1973)。磷酸化的部位定位于狂犬病病毒N蛋白的第389位的丝氨酸残基上(Dietzschold等人，1987)。以前的研究表明，狂犬病病毒N的去磷酸化或者丝氨酸389的突变至丙氨酸使其与体外合成的前导RNA的结合增强(Yang等人，1999)。更进一步，磷酸化的丝氨酸突变为丙氨酸导致狂犬病病毒小基因组RNA的病毒转录以及复制的下降(Yang等人，1999)。而且，对于小基因组系统，对于病毒转录和复制必须的病毒蛋白是通过T7聚合酶合成的，而且因此它们的合成并不受狂犬病病毒的调控机制所控制。
狂犬病一般是悲剧性和神秘性的征兆。其显著的临床学上的表现以及往往最终的致死性使得狂犬病的阻止具有很高的优先权。尽管在生物学上已经取得了足够的进展，狂犬病仍然是一种重要的全球性疾病。估计，每年超过70,000人死于该疾病，而且还有数百万人需要后照射治疗(Meslin等人，1994；匿名，1993)。尽管人类是最终死亡的宿主，该疾病在家养动物与野生动物中具有流行性或者地方性(Fu，1997；Rupprecht等人，1995；Smith等人，1995)。在亚洲，非洲，以及拉丁美洲狗仍是最重要的储存器，这些地区是人类狂犬病的主要发生地(Fu，1997)。在那些通过动物免疫控制狗狂犬病的国家，人狂犬病的病例数目相当程度地降低(Smith等人，1995)。然而，在这些国家中，野生动物的狂犬病表现出具有较强的挑战性问题(Rupprecht等人，1995；Smith等人，1995)。狐狸狂犬病在欧洲和北美洲多年来已经成为地方性流行病，尽管在欧洲的很多地方最近通过口服疫苗的方式已经成功地降低甚至消除了狂犬病(Brochier等人，1991)。在美国，在过去的十年中，野生动物狂犬病占所报道的所有狂犬病病例的90％以上(每年超过7,000个)(Rupprecht等人，1995；Smith等人，1995；Krebs等人，2000a；Krebs等人，2000b)而且至少五个主要的野生动物狂犬病储藏库保持同时的流行性(Smith等人，1995)。流行性浣熊狂犬病在沿着东海岸的地区持续发生，而且向西传播至俄亥俄州，西弗吉尼亚，和阿拉巴马(Krebs等人，2000b)。在中部各州和加利福尼亚，臭鼬狂犬病仍然是地方性动物病(Krebs等人，2000b)。在亚里桑那，阿拉斯加和德克萨斯以及在浣熊狂犬病是流行性的东部各州，狐狸狂犬病仍然是偶发地(Krebs等人，2000b)。蝙蝠狂犬病在48个连续的州也广泛分布(Krebs等人，2000b)。目前这些野生动物狂犬病的流行性对人类健康是一种威胁。因此控制狂犬病，保护人类避免狂犬病病毒的感染需要多层面的控制策略，尤其是在暴露之前或者之后对人进行疫苗接种，宠物的定期疫苗接种，和野生动物的疫苗接种。
在暴露后对人进行疫苗接种可以追溯到Pasteur时代，在那个时代他给Joseph Meister注射灭活减毒的制备于神经组织的狂犬病病毒(Pasteur等人，1996)。从此人狂犬病的疫苗接种经过了连续的发展，尤其是Koprowski及其合作者在Wistar研究院开发出了人二倍体细胞培养的疫苗(HDCV)(Wiktor等人，1964)。由于其不含有神经组织，与原先的脑疫苗相比，组织培养疫苗不仅仅安全而且也更加有效。与那些通过神经组织疫苗免疫的相比，通过用HDCV免疫的人早在接种10天后表现出高水平的病毒中和抗体(VNA)滴度，通过神经组织疫苗免疫，其中和抗体的滴度直到免疫30天后并没有达到保护性的水平(Wiktor等人，1964)。目前，很多组织培养疫苗的衍生物类似于HDCV，而且两者均表现出了有效性和好的宽容度。它们包括纯化的鸡胚细胞疫苗(PCEC，Barth等人，1984；Sehgal等人，1993)，纯化的vero细胞狂犬病疫苗(PVRV，Suntharasamai等人，1986)和纯化的鸭胚细胞疫苗(PDRV，Khawplod等人，1995)。对于被狂犬或者可以的狂犬动物咬伤的个体的一种典型的暴露后的治疗包括立即施用多次的注射一种以上提及的组织培养疫苗。根据咬伤的性质和严重性，也推荐个体接受在动物(一般是马制备的)或者优选的在人体中制备的抗狂犬病抗血清(人狂犬病免疫球蛋白，即HRIG)(匿名，2000)。较为不常用的以及在特定的情况下，认为有不明显的人狂犬病暴露的危险的人，如动物控制官员，兽医，以及进行该病毒操作的实验室工作人员，免疫对抗狂犬病，这认为是暴露前免疫接种(匿名，2000)。
尽管组织培养疫苗既安全又有效，但仍然存在问题。由于所有的这些疫苗来自非活性的病毒，需要延长一段时期进行多剂量的治疗来刺激最佳的免疫应答(匿名，2000)。完成这一系列免疫接种的失败可能导致疾病的发展(Shill等人，1987；Lumbiganon等人，1987；匿名，1988)。对含在细胞培养疫苗中的蛋白的变态反应发生的比例大约在6％的接受疫苗促升注射(CDC，1984)。实际上有一些证据表明，大多数严重的相反的反应是针对通过在灭活病毒中使用的β-丙酸内酯变性的人白蛋白的(Warrington等人，1987；Swanson等人，1987；Anderson等人，1987)。更进一步，这些组织培养疫苗的高成本使得其在发展中国家很难有效利用，而这些国家又是最需要的。暴露后治疗的每个病例的费用可能超过2,000到3,000美元(在美国)(Miller，1996)。大多数人狂犬病的病例在发展中国家，那里的疫苗接种者不能承受这样高的费用。因此，在发展中国家经常使用的狂犬病疫苗是来自于动物的神经组织的，通常是产自于家畜或者乳鼠脑中(Fuenzalida疫苗)(Fuenzalida，1972)。腹腔注射一般需要21个剂量的神经组织疫苗，而且这些疫苗可能引起神经性疾病(Trejos等人，1974)。
在美国宠物(猫或者狗)的免疫接种按照国家公共健康兽医国家联合会的动物狂犬病防治和控制提纲的推荐进行(匿名，2000)。通常，宠物在六周大小时进行免疫，并且依赖于所使用的疫苗每年或者每三年再次接受免疫接种(匿名，2000)。绝大多数登记注册的用于宠物的狂犬病疫苗是灭活的狂犬病病毒。最近，一种重组的金丝雀痘病毒表达狂犬病病毒G被允许用于猫的免疫(匿名，2000)。尽管这些疫苗在猫和狗中提供了足够的保护，但是这些疫苗的确引起局部反应(Wilcock等人，1986)。更进一步需要多步免疫来保证一生中足够高的免疫特性(匿名，2000)。用商业疫苗重复进行免疫的狗可能并不能保证其具有足够的滴度，而且只有三分之一的狗表现出VNA的滴度高于1∶5基线水平(Tims等人，2000)。此外，小于3个月的幼犬的免疫不能导致产生保护性的免疫，尽管从母狗中传递的母体的抗体在六周大小时下降到检测不出的水平(Aghomo等人，1990)。从减弱母体抗体的时间到活性免疫的时间中有一段时间间隔，这段期间中幼兽可能不受保护。(Mitmoonpitak等人，1998；Clark等人，1996)。
野生动物的狂犬病在很多国家中都存在，而且越来越成为公共健康的主要威胁。在欧洲和北美在过去的二十年中控制野生动物狂犬病的努力已经朝向口服疫苗的方向发展(Baer，1988)。起初，使用一种毒性衰减的狂犬病病毒柱，Street Alabama Dufferin B19(SAD)，而且当口服施用于狐狸时其并不引起狂犬病(Baer，1988)。在欧洲国家用在鸡头为诱饵的SAD免疫狐狸的场地试验中，结果导致超过60％的狐狸对狂犬病有免疫力而且阻止了疾病扩散到未治疗的区域(Wandeler等人，1998；Schneider等人，1988)。可是，SAD在啮齿动物(Winkler等人，1976)和家畜动物(Esh等人，1982)中仍然可以引起疾病。随后，开发出了一种表达狂犬病病毒G(VRG)的重组的疫苗病毒(Kieny等人，1984)而且发现在实验室条件下其在莞熊和狐狸中是一种有效的口服免疫原(Rupprecht等人，1986；Blancou等人，1986)。以鱼为诱饵进一步测试VRG的试验在野生条件下在动物中进行，而且已经表明VRG是安全的(Brochier等人，1989；Rupprecht等人，1993)。与疫苗相关的发病率或者死亡率以及总的损害或者有害的副作用都与靶和非靶动物种类的免疫接种无关。疫苗在包括保护性的免疫以及场地应用VRG也有效，导致在欧洲的免疫接种地区大规模地消除狐狸狂犬病(Brochier等人，1991)。相似的在美国应用VRG也导致一种山狗狂犬病在德克萨斯的传播阻断(Fearneyhough等人，1998)，以及浣熊狂犬病在其它州的传播阻断(Hanlon等人，1998；Robbins等人，1998；Roscoe等人，1998)。尽管VRG在免疫接种的动物中是安全的而且在刺激靶动物种类的免疫原性中有效，一个涉及一个怀孕妇女最近的事件加强了甚至在野生动物中使用这样的疫苗的风险，尤其是在人口稠密的地区(Rupprecht等人，2001)。当她试图从她的狗的嘴中去拿含有VRG重组病毒的诱饵时该妇女的手指和左前臂被咬。10天之内在腺炎和前臂被咬的部位的两个坏死性损伤周围得了一次加强的局部炎症反应。她继续发展为一般性的红皮病，而且在脱落后最终平息(Rupprecht等人，2001)。这一事件为将来应用VRG作为一种野生动物的狂犬病疫苗提出了疑问。
目前已经清楚在人中和其它动物中使用的疫苗在安全性上，有效性上和成本上有问题。需要更有效的，安全的，和不昂贵的疫苗来控制在动物中的狂犬病和阻止人狂犬病。已经开发和测试了很多新型的疫苗包括DNA疫苗和其它重组疫苗。已经发现表达狂犬病病毒G的DNA载体可以刺激T辅助细胞和产生狂犬病病毒VNA(Xiang等人，1994)。此外，利用这些DNA载体进行的老鼠的免疫保护老鼠和猴子免受随后的致死性狂犬病病毒的攻击感染(Xiang等人，1994；Ray等人，1997；Lodmell等人，1998)。可是通过DNA疫苗诱导的免疫应答一般花费的时间较长，而且与传统的疫苗相比免疫应答的等级较低(Xiang等人，1994；Osorio等人，1999)。重组人腺病毒表达狂犬病病毒G也已经开发出来(Prevec等人，1990；Xiang等人，1996)重组腺病毒疫苗可以诱导VNA和保护免疫的动物(鼠，狗，臭鼬，和狐狸)开抵抗感染的挑战(Tims等人，2000；Prevec等人，1990；Xiang等人，1996；Charlton等人，1992；Wang等人，1997)。在对腺病毒蛋白的免疫应答方面对腺病毒载体有一种关注(Wang等人，1997)。以前存在的抗腺病毒的免疫可以阻止需要表达靶基因的细胞吸收疫苗而且，这样就损坏了对于靶抗原的活性免疫应答。进一步，用表达不同靶抗原的腺病毒载体重新接种疫苗或者接种疫苗可能会不再有效。
活力衰减的病毒疫苗长期以来被认为是在诱导长期的体液的和细胞介导的免疫中更有效，而且通过使用活性改变的病毒疫苗很多的疾病的控制或者根除。全球性的根除小发疹疾病基本上是通过使用一种弱毒性的牛疹病毒疫苗来实现的(Henderson，1980)。脊髓灰质炎基本上在全球性根除因为使用有活力的脊髓灰质炎疫苗的大量的接种疫苗(Sabin等人，1973)。很多的其它的病毒性疾病如，麻疹，流行性腮腺炎，和风疹，以及命名的一些，通过使用活性的改变的病毒疫苗得到控制(Arvin，2000)。这样一种活力改变的狂犬病病毒疫苗在提供长效免疫性方面和降低所需剂量方面可能具有比目前注册的疫苗更好的优点。作为一种结果，成本也将显著下降。然而，这样的活性改变的狂犬病疫苗必须是完全非致病性的，尤其是针对人。最后，起初在八十年代用于野生动物的狂犬病疫苗的SAD狂犬病病毒株(Baer，1988；Wandeler等人，1998；Schneider等人，1988)，通过使用中和单克隆抗体(Mab)的连续选择进一步衰减毒性，结果选择出了株SAG1和SAG2(Le Blois等人，1990；Flamand等人，1993；Schumacher等人，1993；Lafay等人，1994)。应用Mab选择的SAG1和SAG2的基础是早期发现的在Arg 333位的糖蛋白的突变导致了狂犬病病毒毒性的降低(Dietzschold等人，1983；Seif等人，1985)。SAG1病毒在位置333处有一个突变，其中的Arg被赖氨酸取代(Lafay等人，1994)。与SAD株相比较，其在成年鼠中通过脑内接种途径仍然有毒性，当通过肌肉和口服使用时对成年鼠没有毒性(Le Blois等人，1990；Lafay等人，1994)。SAG1病毒在通过口服途径免疫狐狸中与SAD一样有效(Le Blois等人，1990)。为了稳定发非致病病毒，应用另外的Mab来选择一种SAG2病毒(Lafay等人，1994)。SAG2在位置333处具有双突变，从Arg(AGA)变成谷氨酸(GAA)，这样就进一步降低了病毒回复至致病的野生型(wt)的可能性(Schumacher等人，1993；Lafay等人，1994)。SAG2病毒通过任何接种途径对于成年啮齿目动物，狐狸，猫，和狗无致病性(Schumacher等人，1993；Lafay等人，1994)。对狐狸和狗口服接种疫苗导致保护其对抗狂犬病病毒的致命性挑战。在用SAG2免疫狐狸和狗的场地性试验中表明其具有安全性和免疫原性(Masson等人，1996)。然而SAG2在哺乳期动物中通过如接种可以诱导狂犬病(Schumacher等人，1993；Lafay等人，1994)，这提高了幼兽或者免疫遭损动物可能仍会被病毒感染进而发生疾病。
这些选择的在精氨酸333位G突变的病毒在细胞培养中可以很好地进行复制，这表明这些病毒地病毒复制速度没有受到影响(Lafay等人，1994)。然而对于这些病毒感染神经系统的能力的调查表明这些病毒可以进入第一级神经元，但是不能传播至第二级或者第三级神经元，这表明这些突变病毒通过突触连接传播到神经系统的能力下降(Coulon等人，1989)。突触传播是病毒在成年CNS中传播的主要途径(Gosztonyi等人，1993)。在新生期的动物中，突触传播可能不是病毒传播的唯一途径。由于髓磷脂的发育在新生期动物中并不是完全，在新生期动物中狂犬病病毒也可以通过从感染的神经元中出芽进而感染其它未被感染的神经元来从感染的神经元至非感染的神经元，或多或少的象在细胞培养中的情形(Dietzschold等人，1985)。因此，降低病毒的复制速率可能对于开发出非毒性的狂犬病病毒疫苗具有必要性。正如其它的单链，非分段性的RNA病毒，狂犬病病毒的复制和转录受到核蛋白复合体(RNP)中各组分复杂的相互作用所调控。RNP由基因组RNA组成，其被核蛋白(N)与磷蛋白(P)以及RNA-依赖的RNA聚合酶(L)一起包裹(Wunner，1991)。理论上，这些病毒蛋白的突变可能导致一种狂犬病病毒复制速度的下降。随着最近对于负链RNA病毒的反义遗传学技术的发展(Enami等人，1990；Pattnaik等人，1990；Pattnaik等人，1991；Conzelmann等人，1994；Schnell等人，1994)，对于这一组病毒的病毒基因组的操作成为可能(Conzelmann等人，1994；Schnell等人，1994；Lawson等人，1995；Whelan等人，1995)。这一技术的应用已经引起了对于这一组病毒是如何调控其转录和复制有了更好的理解(Enami等人，1990；Pattnaik等人，1990；Pattnaik等人，1991；Conzelmann等人，1994；Schnell等人，1994；Lawson等人，1995；Whelan等人，1995)以及对于在复制循环中(Pattnaik等人，1990)和其致病过程中(Etessami等人，2000)每一个病毒蛋白的功能有了更好的理解。应用这一技术也导致了衰减病毒的毒性而且它们中的一些可能发展成为疫苗(Wertz等人，1998)或者用于基因治疗的载体(Finke等人，1997)。
对于所有的负链RNA病毒，N是从病毒基因组中转录的第一种产物而且在感染的细胞中充分地表达(Wunner，1991)。目前认为N通过包裹新生的基因组RNA对于从RNA转录到复制的转变中起重要作用(Wunner，1991)。N的突变可能潜在性地导致一种衰减的表型。实际上，在病毒基因组中移动核蛋白(N)至其它的位置导致衰减水泡性口炎病毒(VSV)的衰减(Wertz等人，1998)。这是由于N蛋白的表达下降病毒复制受抑制所引起。最近，我们已经构建了突变的狂犬病病毒，其在N的磷酸化位点发生了变化，并且发现病毒的复制速率下降了超过5倍而且病毒的产生下降了超过10,000倍，这表明衰减了突变的狂犬病病毒(Wu等人，2002)。
狂犬病每年引起超过70,000人死亡目前仍然是一种公共健康的威胁。受狂犬病病毒感染的绝大多数人是通过被狂犬病的家畜和野生动物的咬所引起。在家畜和野生动物中控制狂犬病病毒的感染，因此不仅仅是降低了这些动物的死亡率也降低了人类暴露后的危险。对于那些经常处于危险中的人的暴露前疫苗进一步阻止了人的狂犬病，而对已经被狂犬病或者可疑的狂犬病动物咬伤的人用暴露后免疫。在过去的几年中，一种表达狂犬病病毒糖蛋白(VRG)的重组疫苗病毒已经用于在野生动物中控制狂犬病。灭活的狂犬病病毒疫苗用于免疫家养动物，尤其是宠物。纯化的灭活的狂犬病病毒疫苗用于人的暴露前或者暴露后处理。尽管这些疫苗很有效，每年的所需的疫苗接种来保持在宠物中足够的免疫性。例如，需要多剂量的灭活的组织培养疫苗来刺激最佳的免疫应答。进一步而言，目前的组织培养疫苗比较昂贵；这样，大多数需要疫苗的人(在发展中国家)不能负担。因此需要开发更有效的而且可以负的起的狂犬病病毒疫苗。
因此从上述所提到的免疫接种人和动物对抗狂犬病病毒的技术和方法中的缺点这一方面来看，很明显，目前有需要在技术上来找寻一种安全的和低成本的方法。
发明概述
按照本发明，提供一种突变的病毒，其在一种或者多种病毒蛋白的磷酸化位点含有一种突变，这一突变引起病毒衰减，而且因此，可以生产一种改进性能的疫苗组合物。
特别的，提供了一种突变的狂犬病病毒，其中病毒含有一种突变的狂犬病病毒N蛋白，其在389位上具有一个非丝氨酸的氨基酸。此外，突变的病毒可能在N蛋白中或者其它的病毒蛋白，例如，在G糖蛋白中含有一个或者多个突变。
本发明也涉及含有突变病毒的疫苗组合物和诱导免疫应答的方法，以及保护哺乳动物免除狂犬病病毒感染的方法。
在本发明中也包含产生突变病毒和突变病毒蛋白的方法，包括在宿主细胞中产生突变病毒，其产生或者甚至是过量产生突变病毒蛋白的野生型的对应部分，其与其它病毒蛋白互补，这样产生的突变病毒颗粒最优化。本发明也包括那些其中病毒的产生最优化了的宿主细胞。
在本发明中也包括编码突变病毒蛋白的核酸，以及编码这些蛋白一部分或者整个病毒核酸序列的核酸。此外，本发明也包括含有核酸序列的载体，包括表达载体，以及用核酸序列转化的宿主细胞。
本发明也包括由突变核酸编码的病毒蛋白，包括病毒蛋白的疫苗组合物，单独或者与完整病毒的组合，以及利用所述病毒蛋白诱导免疫应答的方法或者保护哺乳动物免受感染的方法，及类似方法。
本发明也包括对完整的突变病毒的抗体以及对突变病毒蛋白的抗体，以及制造和应用其的方法。
本发明也包括适于传送基因至人或者动物细胞的载体，以及传送的方法。
附图简单说明
图1所示的是在微小基因组中N磷酸化作用影响病毒的RNA转录，BSR细胞用重组疫苗病毒vTF7-3感染，然后用pRP，pT7T-L，pSDI-CAT以及pRN(RN)，pRN-SA(SA)，pRN-SG(SG)，pRN-SD(SD)，pRN-SN(SN)，pRN-SE(SE)，或者pRN-SQ(SQ)转染。用其它不含有N表达质粒(-N)的质粒转染的细胞作为对照包括在内。通过使用Quan-T-CAT分析测定CAT活性的值收集细胞。误差棒，标准偏差。
图2显示的是狂犬病病毒N的磷酸化作用影响病毒RNA的转录和复制。如图1所示感染以及转染的BSR细胞被用于Northern印迹杂交或者免疫沉淀。从总RNA中纯化mRNA，而且基因组类似物通过用多克隆抗-N的抗体免疫沉淀RNP来纯化。这些制备的RNA用CAT的cDNA探针杂交。总RNA用有义的寡居探针杂交用于测定转录自表达微小基因组的质粒的反义RNA。在细胞中表达的N蛋白用多克隆抗-N的抗体免疫沉淀。
图3描述的是N浓度对病毒转录的效应。BSR细胞用重组疫苗病毒vTF7-3感染，然后用质粒pRP，pT7T-L，pSDI-CAT以及pRN(RN)，pRN-SA(SA)，pRN-SD(SD)或pRN-SE(SE)一起转染。使用不同浓度的突变N质粒或者N(5，10，15，和20微克)。收集细胞用于CAT分析。
图4描述的是BSR细胞中对于wt和突变的狂犬病病毒的病毒生长曲线。BSR细胞用野生型的病毒(L16)与突变病毒(L16A，L16D，或者L16E)以多重数感染(moi)为1ffu/细胞进行感染，而且在特定的时间中取出等分的病毒而且用它作为病毒的滴度测定。
图5所示的是用狂犬病病毒N或G探针检测病毒转录和基因组RNA。总RNA从用L16，L16A(A)，L16D(D)，或者L16E(E)感染的BSR细胞中制备而且与N探针(左栏)或者G探针(右栏)杂交。也分别显示了mRNAs，基因组RNA和可能的通读(RT)转录本和/或干扰缺陷的(DI)RNA。总RNA也与β肌动蛋白探针(底下栏)杂交。与野生型病毒相关的N和G转录本以及基因组RNA产物的量用密度测定法定量。
图6显示的是N的磷酸化也调节病毒的转录。用L16，L16A(A)，L16D(D)，或者L16E(E)感染BSR细胞；1小时后不用(A)或者用(B)CHX处理；在特定的时间点收集细胞提取总RNA。RNA用N探针杂交。也分别显示了mRNAs，基因组RNA和可能的通读(RT)转录本。总RNA也与β肌动蛋白探针(底栏)杂交。与野生型病毒相关的N转录本的量用密度测定法定量。
图7所示的是在感染的细胞和纯化的病毒粒子中基因组RNA和反基因组RNA之间的比率的量。从感染细胞中的总RNA或者纯化的病毒用有义的探针或者反义的核探针杂交，这些探针通过体外转录制备自pRN。基因组和反基因组RNA通过密度测定法定量。
图8所示的为一个设想的N磷酸化的模型以及其在病毒转录和复制中的功能。N，一旦合成，与P和/或者L相互作用。在这一阶段，N没有磷酸化。有可能通过N与(包裹)基因组RNA相互作用，N通过经历构象变化，暴露磷酸化位点。一旦N进行了磷酸化，在基因组RNA和N之间的电荷排斥力有助于L链接近基因组模板用于病毒RNA转录和复制的起始。
图9所示的是完整的狂犬病核酸序列。(L16(nt 1235-1237)，TCT编码在N蛋白的丝氨酸用粗体注明而且加了下划线。)图9A表明的是野生型的L16序列(SEQ ID NO：55)。图9B表明的是L16A的序列(SEQID NO：56)，其中在N序列中丝氨酸被丙氨酸替代。图9C表明的是L16Q的序列(SEQ ID NO：57)，其中在N序列中丝氨酸被谷氨酸替代。图9D显示的是L16QG333序列(SEQ ID NO：58)，其中在N蛋白上丝氨酸已经被谷氨酸在nt 1235-1237替代[TCT到CAA](下划线，粗体标注)而且在nt 4370-4372精氨酸已经被谷氨酸替代[AGA到GAA](下划线，粗体标注)。
图10所示的是狂犬病病毒G蛋白的核酸序列。图10A(SEQ ID NO：59)所示的Arg333为下划线。图10B(SEQ ID NO：60)显示的Glu已经在位置333替换了Arg。
图11表明狂犬病病毒N蛋白的核酸序列。图11A表明的是野生型序列(SEQ ID NO：61)，其中磷酸化的丝氨酸加注下划线。图11B(SEQID NO：62)表明的是丝氨酸到Ala的突变(加注下划线)。图11C(SEQID NO：63)表明的是丝氨酸到Gly的突变(加注下划线)。图11D(SEQID NO：64)表明的是丝氨酸到Glu的突变(加注下划线)。
发明详述
本发明涉及用于人或者动物的有效以及可负担的病毒疫苗，也涉及制作疫苗的方法，以及涉及使用疫苗诱导免疫应答的方法，优选的，在动物和人中的一种保护性的免疫应答。适合的病毒包括，但不限于，麻疹，呼吸合胞体病毒(RSV)，埃博拉病毒和流感病毒，仙台病毒，以及牛痘RSV。
特别地，本发明涉及无毒的活的病毒疫苗，包括突变病毒其中在N核蛋白的磷酸化已经被破坏。适合的病毒包括，但不限于麻疹，呼吸合胞体病毒(RSV)，埃博拉病毒和流感病毒，其中在N蛋白都发生了磷酸化。磷酸化作用的破坏可以通过任意合适的方法，包括通过插入，缺失或优选地通过替代改变磷酸化位点。此外，磷酸化作用可以通过N蛋白其它部分的改变而破坏，如在N蛋白的另一个位点的一个一致序列。优选地，N蛋白在389位上的氨基酸不是丝氨酸，优选一种中性氨基酸，而且更优选地，丙氨酸。优选地，突变的狂犬病病毒被图8中的一个序列所编码，突变的狂犬病病毒N蛋白被图9中的一个序列所编码，和/或突变的狂犬病病毒G蛋白被图10中的一个序列所编码。
为了影响N蛋白结合RNA，结合于磷酸部分，或者自身结合，N蛋白可以进行突变。N核蛋白结合性质的调节影响病毒的重要功能，如复制。
在一个优选的具体例子中，本发明涉及一个无毒的活的狂犬病病毒疫苗，其中包含突变病毒，其中在N核蛋白的磷酸化作用已经通过插入，缺失，取代或者其它合适的方法破坏。优选地，病毒的病毒复制速率下降(通过突变核蛋白N或者通过在狂犬病基因组中重排基因)。在优选的具体例子中，N核蛋白的389位的丝氨酸被丙氨酸，甘氨酸，谷氨酰氨，谷氨酸，天冬氨酸或者天冬酰氨取代。
在一个优选的具体例子中，病毒传播到神经系统的能力也下降(通过突变糖蛋白G)，优选地在G糖蛋白的第333位置。
突变的病毒也可能优选地在N和G蛋白中具有超过一种变化，这样回复至野生型(WT)表现型的机会下降。
可以应用磷酸化位点保守的狂犬病病毒的任何株。在目前所有已知的狂犬病病毒株N蛋白的磷酸化位点都是保守的。
此外，本发明的突变病毒可以含有一个另一类型病毒的G糖蛋白，为了在身体中导向病毒的趋向性，因此本发明的病毒很可能在基因治疗中有用，用于对人或者动物施用治疗性的或者免疫原性的蛋白。
特别地，狂犬病病毒G糖蛋白引起对CNS细胞的趋向性，而且因此适合于治疗CNS疾病如癌症，包括但不限于，成神经细胞瘤，以及神经变性疾病包括，但不限于，Alzheimer病，帕金森病，亨廷顿疾病。同样地，人免疫缺陷病毒(HIV)G蛋白引起对T细胞的趋向性，而且因此适于治疗在基因传输中T一细胞介导的紊乱，包括不同的癌症，以及影响T细胞的疾病，包括HIV。
水泡性口炎病毒(VSV)G糖蛋白是泛嗜性病毒，且因此可用于施用于不同的细胞类型。RSV的G糖蛋白引起对上皮细胞的趋向性，而且因此适于导向肺部来治疗相关的疾病，包括，但不限于，囊性纤维化。
本发明也涉及使用突变病毒诱导免疫应答的方法，而且优选地，在人或者动物中的一种保护性的免疫应答。
在本发明中也包括产生突变病毒的宿主细胞，以及产生这些病毒的方法。优选地，宿主细胞是产生一种野生型狂犬病病毒N蛋白的哺乳动物宿主细胞，优选地是一种仓鼠细胞，更优选的是BHK细胞，而且最优选的是保藏在美国菌种保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，美国。保藏号为ATCC PTA-3544，于2001年7月20日。
在G和N上的突变或这些基因的重新定位导致病毒毒力衰减到一定的程度而不再在任何年龄和任何感染方式的动物中引起疾病；甚至其可以诱发提供对于发病性狂犬病病毒有抵抗作用的蛋白的免疫应答。这依赖于最近的研究，该研究表明如下。1)在N的389位的磷酸化的丝氨酸突变为ala降低了病毒的复制速率达五倍以上而且降低了病毒的产生达10,000倍。2)在G的333位残基的突变显著地使得狂犬病病毒的毒性与致病性下降。3)在如水泡性口炎病毒(VSV)的相关病毒中的基因重排导致病毒衰减而且增强了其免疫应答。在G与N突变的或者基因重排的狂犬病病毒衰减的毒力比目前可用的衰减的狂犬病病毒(在新生动物中仍能诱发狂犬病)的毒力进一步衰减。进一步衰减的狂犬病病毒其在任何年龄的，以及通过任何接种方式在实验动物中不能诱发疾病，而且仍然保持免疫原性，可以开发成对于人和动物的改性活性狂犬病疫苗。
可选择的，本发明的疫苗可以在没有完整的病毒情况下，含有分离的突变N蛋白。由于N的磷酸化突变体聚集的程度大于野生型的对应部分，与含有野生型N的组合物相比其可以增加佐剂效应。
本发明的疫苗组合物可以含有一种佐剂，包括，但不限于，肝炎B的表面抗原(HbsAg)或者狂犬病病毒G蛋白。疫苗可以使用任药理学上可以接受的载剂或者载体来制备，包括汉克斯基本盐溶液(HBSS)或者磷酸缓冲液(PBS)。疫苗组合物可以通过任何方式施用，包括真皮内的，肌肉内的，优选的皮下，以及口服，经由皮肤(表皮磨蚀)或者经由鼻内。
根据本发明，可以应用本领域内传统的分子生物学，微生物学，免疫学，以及重组DNA技术。这样的技术在参考文献中有详细说明。参见如，Sambrook等人，“分子克隆：实验操作指南”(第3版，2001)；“分子生物学现代实验方法”I-III卷[Ausubel，R.M.，编著(1999，两月更新)]；“细胞生物学：实验室手册”I-III卷[J.E.Celis，编著(1994)]；“免疫学现代实验方法”I-IV卷[Coligan，J.E.，编著(1999，两月更新)]；“寡聚核苷酸的合成”(M.J.Gait编著1984)；“核酸杂交”[B.D.Hames和S.J.Higgins编著(1985)]；“转录和翻译”[B.D.Hames和S.J.Higgins编著(1984)]；“动物细胞培养，第4版”[R.I.Freshney，编著(2000)]；“细胞固定化和酶”[IRL出版，(1986)]；B.Perbal，“分子克隆实验指南”(1988)；使用抗体：实验手册：简易实验方法No.I，Harlow，编著和Lane，David(冷泉港出版，1998)；应用抗体：实验手册，Harlow，编著和Lane，David(冷泉港出版，1999)。
因此，如果在此文出现，下面的术语具有以下的定义。
“复制子”是任何的遗传成员(如质粒，染色体，病毒)其功能是在体内DNA自主复制的单位；例如可以在自身的控制下复制。
“载体”是一个复制子，如质粒，噬菌体或者COS质粒，可以结合到另一段DNA片段上来引起该片段的复制。
“DNA分子”是指以单链形式，或者一种双链螺旋形式的脱氧核糖核苷酸(腺苷酸，鸟苷酸，胸腺核苷酸，或者胞苷酸)的多聚物形式，该术语仅仅指该分子的一级和二级结构，而且并不限于任何特定的三级结构形式。因此该术语包括双链DNA，和其他的事物，线形DNA分子(如，限制性片段)，病毒，质粒。和染色体。在讨论特定的双链DNA分子的结构时，在此描述的序列按照正常的惯例只列出DNA中的不转录链(如，与mRNA在序列上同源的链)的5′到3′方向。
“复制起点”是指那些参与DNA合成的序列。
DNA“编码序列”是指一个双链DNA序列其在放置于适合的调控序列的控制下在体内转录并翻译为多肽。编码序列的边界决定于在5′(氨基)端的起始密码子以及在3′(羧基)端的翻译中止密码子。一段编码序列可以包括，但不限于，原核序列，从真核mRNA的cDNA序列，来源于真核(如，哺乳动物)的基因组DNA，以及合成的DNA序列。多聚A的信号和转录终止序列一般位于编码序列的3′端。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子，增强子，多聚A信号，终止子，及类似物，其作用于在宿主细胞中编码序列的表达。
“启动子”是指DNA调控区，其在细胞内可以结合RNA聚合酶并且起始向下游编码序列的转录(3′端)。为了定义本发明，启动子序列的界限位于其3′端为转录起始位点并且向上延伸(5′方向)包括最小数量的碱基或者必要的组件用于在背景以上可检测到的水平起始转录。在启动子序列中将会有转录起始位点(一般通过核酸酶S1作图确定)，以及蛋白结合区(一致序列)其作用为结合RNA聚合酶。真核启动子常常，但并不总是，含有“TATA”盒以及“CAT”盒、原核启动子除了含有-10和-35一致序列外还含有SD序列。
“表达控制序列”是一段控制和调节另外的DNA序列转录和翻译的DNA序列。编码序列是当RNA聚合酶在细胞中转录该编码序列为mRNA时在转录和翻译的控制序列的“控制下”，然后该编码序列翻译为编码序列编码的蛋白质。
“信号序列”可以包括在编码序列前。这一序列编码一段信号肽，多肽的N端，其与宿主细胞联系来定向传导多肽到细胞的表面或者分泌多肽到细胞外的培养基中，而且该信号肽在从蛋白离开宿主细胞前被宿主细胞切除。信号序列在与原核和真核的相联系的不同种类的蛋白质中均有发现。
术语“寡聚核苷酸”，正如在此的应用是指本发明所用的探针，定义为包括两个或者更多个核苷酸的分子，优选地超过三个。其确定的大小将依赖于很多因素，按序排列，依赖于其功能和这些寡聚核苷酸的应用。
在此使用的术语“引物”是指一段寡聚核苷酸，或者其来源于天然的纯化的限制酶切或者来源于合成产生，当置于引物延伸产物的合成的条件下其可以作为合成的起始的点来诱导合成，该引物延伸产物与一条核酸链互补，条件例如是，存在核苷酸和一种诱导试剂如一种DNA聚合酶以及合适的温度和pH值。引物可以是单链的也可以是双链的而且必须是在诱导剂存在的条件下具有足够的长度来引发所需延伸产物的合成。引物的确定长度依赖于很多的因素，包括温度，引物的来源以及使用的方法。例如，用于诊断，依赖于靶序列的复杂性，寡聚核苷酸一般含有15-25个或者更多的核苷酸，尽管其可以含有较少的核苷酸。
在此的引物是选自“实质上”互补作用于特定靶DNA序列的不同的链。这意味着引物必须具有足够的互补性，与其相对应的链杂交。因此引物的序列并不一定需要反应模板的确切序列。例如，一段非互补的核苷酸片段可以结合于引物的5′端，引物序列的剩余部分与链互补。可选择地，如果引物序列与杂交链的序列有足够的互补性非互补的碱基或者较长的序列可以散布于引物中，因此形成的模板用于合成延伸的产物。
正如在此所应用的，术语“限制性内切酶”和“限制性酶”是指细菌的酶，它们中的每一个在特异的核苷酸序列或者在其附近切割双链DNA。
当这样的DNA引入细胞中，用外源或者异源DNA“转化”细胞。转化DNA可以或者不整合(共价连接)于形成细胞基因组的染色体DNA。在原核生物中，酵母，和哺乳动物细胞例如，转化DNA可以保持在附加体成分如质粒。而对于真核细胞，一种稳定的转化的细胞是一个，其中的转化DNA已经整合到染色体中以至于其以子细胞通过染色体复制来遗传。这一稳定性通过真核细胞建立细胞系或者包括群体的含有转化DNA的子细胞克隆的能力表现出来。“克隆”是来源于单一细胞或者通过共同的祖先有丝分裂来源的群体。“细胞系”是初级细胞的克隆，初级细胞可以在体外稳定生长很多代。
当至少大约75％(优选地至少大约80％，和最优选地至少大约90％或者95％)的核苷酸与特定长度的DNA序列匹配，两个DNA序列是“实质上同源”。实质上同源的序列可以通过使用标准的软件在序列数据库中进行比较来确定，或者在Southern杂交实验确定，例如，在特定的系统中定义的严谨条件。确定合适的杂交条件是本领域已知的。参见如，Maniatis等，见上文；DNA克隆，I和II卷，见上文；核酸杂交，见上文。
本领域已知的以下的密码子可以互换使用来编码每一个特定的氨基酸：
苯丙氨酸(Phe或者F)UUU或者UUC
亮氨酸(Leu或者L)UUA或者UUG或者CUU或者CUC或者CUA或者CUG
异亮氨酸(Ile或者I)AUU或者AUC或者AUA
甲硫氨酸(Met或者M)AUG
缬氨酸(Val或者V)GUU或者GUC或者GUA或者GUG
丝氨酸(Ser或者S)UCU或者UCC或者UCA或者UCG或者AGU或者AGC
脯氨酸(Pro或者P)CCU或者CCC或者CCA或者CCG
苏氨酸(Thr或者T)ACU或者ACC或者ACA或者ACG
丙氨酸(Ala或者A)GCU或者GCG或者GCA或者GCG
酪氨酸(Tyr或者Y)UAU或者UAC
组氨酸(His或者H)CAU或者CAC
谷氨酰氨(Gln或者Q)CAA或者CAG
天冬酰胺(Asn或者N)AAU或者AAC
赖氨酸(Lys或者K)AAA或者AAG
天冬氨酸(Asp或者D)GAU或者GAC
谷氨酸(Glu或者E)GAA或者GAG
半胱氨酸(Cys或者C)UGU或者UGC
精氨酸(Arg或者R)CGU或者CGC或者CGA或者CGG或者AGA或者AGG
甘氨酸(Gly或者G)GGU或者GGC或者GGA或者GGG
色氨酸(Trp或者W)UGG
终止密码子UAA(赭石)或者UAG(琥珀)UGA(乳白石)
应当理解以上特异的密码子是对于RNA序列。DNA相应的密码子是用T代替了U。
在不同的病毒蛋白中可以产生突变，这样一个特定的密码子变化为编码一种不同的氨基酸的密码子。这样的突变可以通过进行可能的最少的核苷酸变化来简单地进行。可以以一种非保守的方式(例如，通过变化具有特定大小或者性质的一组氨基酸的密码子至一种属于另一类的氨基酸)在得到的蛋白中改变氨基酸或者以一种保守的方式(例如，通过变化具有特定大小或者性质的一组氨基酸的密码子至一种属于同一类的氨基酸)进行这类取代突变。这样的保守的变化一般导致得到的蛋白在结构和功能上较小的突变。一种非保守性的变化更趋向于改变得到蛋白的结构，活性或者功能，例如在N核蛋白磷酸化的缺陷诱导的变化。可能更优选的，在某些情况下，在病毒的蛋白中影响超过一种变化，以至于降低回复至野生型的可能性。
以下是不同种类氨基酸的例子：
具有非极性侧链R的氨基酸
丙氨酸
缬氨酸
亮氨酸
异亮氨酸
脯氨酸
苯丙氨酸
色氨酸
甲硫氨酸
具有不带电荷的极性侧链R的氨基酸
甘氨酸
丝氨酸
苏氨酸
半胱氨酸
酪氨酸
天冬酰胺
谷氨酰胺
具有带电荷的极性侧链R的氨基酸(在pH6.0下带负电)
天冬氨酸
谷氨酸
碱性氨基酸(在pH6.0下带正电)
赖氨酸
精氨酸
组氨酸(在pH6.0)
具有苯基的另一种分类的那些氨基酸：
苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
按照分子量的另一种分类(例如侧链基团R的大小)：
甘氨酸    75
丙氨酸    89
丝氨酸    105
脯氨酸    115
缬氨酸    117
苏氨酸    119
半胱氨酸  121
亮氨酸    131
异亮氨酸  131
天冬酰氨  132
天冬氨酸  133
谷氨酰氨  146
赖氨酸    146
谷氨酸    147
甲硫氨酸  149
组氨酸(在pH6.0) 155
苯丙氨酸 165
精氨酸   174
酪氨酸   181
色氨酸   204
特定优选的取代为：
-赖氨酸取代精氨酸反之亦然这样正电可以保持；
-谷氨酸取代天冬氨酸反之亦然这样负电可以保持；
-丝氨酸取代苏氨酸这样自由羟基可以保持；而且
-谷氨酰氨取代天冬酰氨这样自由NH2可以保持。
氨基酸取代物也可以引入来取代具有特定优选特性的一种氨基酸。例如，一种半胱氨酸可以引入至特定的位点用于与另一个Cys形成二硫桥。组氨酸可以引入作为特定的“催化”位点(例如，组氨酸可以作为一种酸或者碱而且这是在生物化学催化剂中最为常用的氨基酸)。由于其特定的平面结构，可以引入脯氨酸，这可以在蛋白质的结构中引入β转角结构。
当至少大约70％的氨基酸残基(优选地至少大约80％，最优选的至少大约90％或者95％)相同，那么两个氨基酸序列“实质上同源”或者表示保守性的替代。
DNA结构的“异源”区是在较大的DNA分子中可辨别的一段DNA片段，并没有发现其在天然的大分子有关系。这样，当异源区域编码一个哺乳动物基因，该基因的两侧序列往往并不是在其来源生物中的基因组中的基因组DNA的两侧的序列。异源编码序列的另一个例子是其编码序列自身在天然情况下并不存在的结构(如，一段cDNA其在基因组的编码序列含有内含子，或者合成的序列具有天然基因不同的密码子)。等位基因的变异或者天然发生的突变事件并不产生在此定义的DNA异源区域。
“抗体”是任意的免疫球蛋白，包括抗体和抗体片段，其结合于特异的抗原表位。该术语包括多克隆，单克隆，或者嵌合抗体，最终的提及参见美国专利Nos.4,816,397和4,816,567中的描述。
“抗体结合位点”是一种抗体分子的结构部分，该抗体包括特异结合抗原的重链和轻链可变区以及高变区。
在此应用的不同语法形式的短语“抗体分子”可以认为是完整的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的具有免疫活性的部分。
示例性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子，实质上完整的免疫球蛋白分子以及一种免疫球蛋白分子的那些部分，其中含有抗体决定簇，包括那些在本领域称为Fab，Fab′，F(ab′)2和F(v)的那些部分，该部分优选地用于在此描述的治疗方法。
抗体分子的Fab和F(ab′)2部分的制备分别通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白裂解实质上完整的抗体分子的反应通过本领域已知的方法制备。参见例如，授予Theofilopolous等的美国专利号4,342,566。Fab′抗体分子部分也是熟知的而且从F(ab′)2部分通过使用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，然后通过用如碘乙酰胺的碱试剂处理得到的蛋白硫醇来制备。在此优选的是，抗体含有完整的抗体分子。
短语“单克隆抗体”在不同的语法形式中是指一种具有一种可以与特定的抗原免疫反应的抗体结合位点的抗体。这样的单克隆抗体一般表现出一种对任何与其起免疫反应的抗原单一的结合亲和性。一个单克隆抗体因此可以含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，每一个对不同的抗原具有免疫特异性；如，二特异性(嵌合)单克隆抗体。
短语“药理上可以接受的”是指分子实体和组合物具有生理容许性而且在施用于人后一般并不产生过敏或者相类似的反应，如，肠胃紧张不适，头晕等等。
在此应用的短语“足以保护动物免除感染”是指有效地阻止，以及优选地降低至少大约30％，更优选地至少大约50％，最优选地至少大约90％，由该疾病引起的一般的病理学中至少一个特征发生临床上显著变化的量。
临床上，狂犬病病人的第一个特征可能是非特异性的流行性感冒类似的特征，如不适，发烧，或者头痛。在暴露(被咬)的部位感觉不适或者感觉异常，几天后进一步出现脑的失常，焦躁，精神错乱，激动，进一步至谵妄，说胡话，不正常的行为举止，幻觉，和失眠。
狂犬病感染的细胞病理学由脑炎和脊髓炎来定义，包括在外周血管通过整个中枢神经系统过滤淋巴细胞，多核白细胞，以及浆细胞。在包括海马锥体形细胞核小脑的浦肯野细胞，而且在皮质和中枢神经系统的其它区域包括脊神经节中的神经细胞中可能存在细胞质的嗜曙红细胞包含体(内格里小体)。
当一段表达控制序列控制和调节该DNA序列的转录以及翻译时。一段DNA序列“可操作地连接于”一段表达控制序列。术语“可操作地连接”包括在被表达的DNA序列前具有一段适当的起始信号(例如，ATG)而且保证正确的阅读框架在表达控制序列的控制下来保证DNA序列的表达而且产生DNA序列编码的所需的产物。如果待插入重组DNA分子的一个基因并不含有一个适合的起始信号。这样的一个起始信号可以插入到基因的前面。
术语“严谨杂交条件”是指盐和温度条件实际上等同于在杂交和洗脱时的条件为5x SSC和65℃。然而，本领域普通技术人员认为这样的“严谨杂交条件”依赖于特定的条件包括在缓冲液中钠与镁的浓度，核苷酸序列长度和浓度，不配对碱基的百分比，甲酰胺的百分比，等等。在确定“严谨杂交条件”中也很重要的是是否两个序列杂交为RNA-RNA，DNA-DNA，或者RNA-DNA。这样严谨的杂交条件对于本领域普通技术人员按照已知的公式很容易确定，其中的杂交条件一般为在预计或者确定的Tm下10-20℃，如果需要同时在较高严谨度的条件下洗脱。
本发明进一步考虑到在实践本发明的治疗方法中应用的治疗性组合物。主要的治疗性组合物包括，混合物，一种药理学中可接受的赋形剂(载剂)以及一种或者多种突变的狂犬病病毒，一种突变的狂犬病表达多肽或者其片段，正如在此所述的活性成分。在一个优选的具体例子中，该组合物包括一种可以诱导免疫应答的抗原，而且优选的是一种对抗狂犬病的保护性免疫应答。
制备含有多肽，类似物或者活性片段作为活性成分的治疗性组合物对本领域普通技术人员是熟知的。一般地，这样的组分制成可以注射的，既可以是液态溶液，也可以是悬浮液，而且也可以制成适用于溶液状态的，或者在注射前是悬浮液状态的液态形式，然后将固态物悬浮或者溶解其中。制备也可以通过乳化处理制备。活性治疗成分经常与赋形剂混合，该赋形剂是药理学上可以接受的而且与活性成分相容。合适的赋形剂是例如，水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，或者类似物以及其组合。此外，如果需要，该组分可以含有最少量的辅助物质如湿润或者乳化试剂，pH缓冲液试剂其可以增加活性成分的有效性。
一种病毒，多肽，或者片段其中可制备成治疗性和/或者免疫原性组合物如中性化的药理学上可以接受的盐形式。药理学上可以接受的盐包括酸加成的盐(由多肽或者抗体分子的自由氨基形成)以及与无机酸形成的盐，无机酸如，盐酸或者磷酸，或者如乙酸，草酸，酒石酸，苯乙醇酸，及类似物的有机酸。从自由羧基形成的盐也可以来自于无机碱如，钠，钾，铵，钙，或者铁氢氧化物，而且这样的有机碱如异丙胺，三甲基胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因，及类似物。
治疗性的和/或免疫原的病毒，多肽，或者含有片段的组分传统上例如以一个单位剂量来施用。当用于参考本发明的治疗性组合物时，术语“单位剂量”是指适用于人的单位剂量的生理学上严谨的单位，每一个单位含有一个预先确定量的活性物质，计算的该量值可以在与所需的稀释剂中如，载剂，或者载体中产生所需的治疗性的和/或免疫原性效应。
该组合物施用的方式与剂量配方具有相容性，并且施用的量为治疗或免疫有效的量。施用的量主要依赖于待治疗患者的情况，患者利用活性成分免疫系统的能力，以及所需的表达水平。所需施用活性成分的精确含量依赖于有经验诊断者的判断而且对于每一个个体有特殊性。然而，对于多肽的施用合适的剂量范围从大约0.1到大约20，优选的从大约0.5到大约10，而且更优选的从一到几个，毫克活性物质患者个体每公斤体重每天而且依赖于施药的途径。对于施用病毒，合适的剂量可以从105感染单位(i.u.)到107i.u.。对于起始施用者和后续的施药者的适合的方案也有所不同，但是一般的，起始的施用者在重复的剂量施用后与下一轮的注射和其它的施用前要等7天的时间间隔。
治疗性组合物可以进一步包括一种或者多种以下的活性成分：一种抗生素，一种类固醇化合物。
本发明的另一个特征是DNA序列的表达可操作地插入到在此所述的病毒中。正如本领域已经知道的DNA序列可以通过在一种合适的表达载体并且应用表达载体转化到合适的宿主细胞中可操作地连接于表达调控序列后进行表达。
这样的可操作地连接本发明的DNA序列于一种表达控制序列，当然，包括，如果已经不是DNA序列的一部分，提供起始密码子，ATG，在该DNA序列的上游在正确的阅读框架中。
在表达编码本发明病毒蛋白的DNA序列中可以应用大范围不同的宿主/表达载体的组合。可用的表达载体，例如，可以包括染色体，非染色体和合成的DNA序列的片段。合适的载体包括SV40的衍生物，以及已知的细菌质粒，如，大肠杆菌质粒col E1，pCR1，pBR322，pMB9以及它们的衍生物，质粒如RP4，噬菌体DNAS，例如，噬菌体λ的很多衍生载体，如，NM989，以及其它噬菌体DNA，如，M13以及丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2μ质粒及其衍生质粒；用于真核细胞的质粒载体，如用于昆虫(杆状病毒)和哺乳动物细胞的质粒；来源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体，例如质粒已经通过引入噬菌体DNA或者其它的表达控制序列进行了改变，等等。
在这些载体中表达本发明的DNA序列时可以应用宽范围的任何不同表达控制序列-这些序列控制可操作性地与之相联DNA序列的表达。这些可以应用的表达控制序列包括，例如，SV40，CMV，牛痘苗，多瘤或者腺病毒，lac系统，trp系统，TAC系统，TRC系统，LTR系统的早期或者晚期启动子，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域，fd衣壳蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶的启动子或者其它的糖分解的酶，酸性磷酸酶的启动子(如，Pho5)，酵母α配对因子的启动子，以及其它已知的控制原核或者真核细胞及其病毒基因表达的控制序列，以及它们不同的组合。
表达本发明中编码病毒蛋白的DNA序列可用很大范围的宿主细胞。这些宿主可以包括已经很了解的真核和原核宿主，如大肠杆菌各菌株，假单胞菌，芽胞杆菌属，链霉菌属，真菌如酵母，以及动物细胞，如CHO，R1.1，B-W以及L-M细胞，非洲绿猴肾细胞(如COS 1，COS 7，BSC1，BSC40，和BMT10)，昆虫细胞(如，Sf9)，BHK细胞，以及人细胞和组织培养中的植物细胞。
应当认识到，并不是所有的载体，表达控制序列和宿主对于表达本发明的DNA序列在功能上都是相同的。而且在同一个表达系统不是所有的宿主的功能都是相同的。然而一个本领域普通技术人员可以选择合适的载体，表达控制序列，以及宿主而不需要不适当的实验来进行所需要的表达同时不需要背离本发明的范围。例如，在选择载体时必须考虑到宿主因为载体必须在宿主中起作用。必须也考虑载体的拷贝数，控制拷贝数的能力，以及由载体编码的任何其它蛋白的表达，如抗生素标记。
在选择表达控制序列时，一般考虑使用不同的载体。这些包括，例如，系统的相对强度，其控制能力，以及其与待表达的特定DNA序列或者基因的相容性，尤其是关于潜在的二级结构。选择合适的突变病毒载体应当考虑到，如，它们的复制能力，以及待表达的该DNA序列或者突变表达编码的产物对宿主的毒性。
考虑了这些以及其它的因素，本领域普通技术人员将可以构建不同的载体/表达控制序列/宿主的组合，这些将用于表达本发明的DNA序列。
进一步设想，其它的突变病毒蛋白可以从本发明的核苷酸序列中制备。可以产生类似物，如片段，例如，通过胃蛋白酶消化病毒的多肽物质。其它的类似物，如突变蛋白质，可以通过对编码病毒蛋白的序列进行定点突变的方法产生。可以通过已知的体内和/或体外的分析来鉴定突变体表现的免疫原性和保护活性。
正如以上所述，编码病毒或者病毒蛋白的DNA序列可以通过合成的方法制备而不是克隆的方法。完成的核酸序列从标准方法制备的重叠的寡聚核苷酸装配而且装配成一个完整的编码序列。参见，如，Edge，Nature，292：756(1981)；Nambair等人，Science，223：1299(1984)；Jay，等人，J.Biol.Chem.，259：6311(1984)。
合成的DNA序列使得将要表达病毒蛋白突变体或者“突变蛋白”基因的构建简化。可选择的，DNA编码的突变蛋白可以通过对天然的病毒基因或者cDNAs进行定点突变来制备，而且突变蛋白可以使用传统的多肽合成来直接制备。
对于位点特异性地装配非天然氨基酸至蛋白的一般的方法在Christopher J.Noren，Spencer J.Anthony-Cahill，Michael C.Griffith，PeterG.Schultz，Science，244：182-188(1989年4月)中有叙述。这一方法可以用来产生非天然氨基酸的类似物。
为了更完全地说明本发明优选的具体实施方式列出了以下的实施例。然而这些实施例决不能解释为对本发明范围的限制。
实施例1
狂犬病病毒N优先地包裹基因组RNA。狂犬病病毒N，正如来自负链RNA病毒地其它的N，通过包裹重新合成的基因组RNA在调控病毒的转录与复制方面起重要作用(Yang等人，1998)。为了查明狂犬病病毒N的功能，在杆状病毒系统表达狂犬病病毒N，而且通过亲和层析提纯N至接近纯化(Fu等人，1991)。当使用纯化的N包裹RNA时，发现N结合于所有待侧的RNA转录本(Yang等人，1998)。这些包括狂犬病病毒正链前导RNA(L-70)，狂犬病病毒N的mRNA的5′端(N-70)，以及一段对照的非病毒RNA(bluescript RNA，B-70)。然而，重组的N与狂犬病病毒前导RNA之间的相互作用比重组的N与N的mRNA的相互作用强至少3倍而且比重组的N与对照RNA的相互作用强10倍，这表明N优选地包裹正链前导RNA。
实施例2
狂犬病病毒N的磷酸化调控病毒的转录和复制。狂犬病病毒的N是磷酸化的(Sokol等人，1973)而且其磷酸化位点已经确定在位置389的丝氨酸处(Dietzschold等人，1987)。因为通过包裹重新合成的基因组RNA在调控病毒的转录与复制方面起重要作用(Wunner，1991)，N的磷酸化可能影响病毒的转录与复制。为了确定是否N的磷酸化对于病毒的转录与复制起调控作用，应用Conzelmann和Schnell(Conzelmann等人，1994)描述的反义遗传学系统来病毒狂犬病病毒的微小基因组和直接测定N磷酸化对于病毒RNA的转录与复制的影响。微小基因组直接用T7聚合酶从质粒pSDI-CAT中表达。当在细胞中表达时，微小RNA从狂犬病病毒基因组的3′端含有68个核苷酸并且从5′端含有169个核苷酸，其两侧为CAT编码序列(Conzelmann等人，1994)。质粒pSDI-CAT，与pRP，pT7T-L，pT7T-G，pT7T-M，以及pRN或者pRN-S389A一起转染至BHK细胞，而且在转染后48小时收集细胞。使用标准的CAT分析测定细胞内的提取物的CAT活性。在用pRN转染的细胞中可以测定到强的CAT活性，当野生型的N被突变的N替换时(丝氨酸变为Ala)时，只检测到大约20％的CAT活性，表明N磷酸化的缺陷导致病毒转录的下降。然而，当野生型N和突变体N共同存在时，检测到大约80％的CAT活性，表明未进行磷酸化的N并不是一个显性负调控子(Yang等人，1999，附录1)。
为了确定是否N的磷酸化也影响病毒的复制，进行了细胞传代实验，收集起初的转染上清，并且用于感染用pRP，pT7T-L，和pRN或者pRN-S389A转染的新的BHK细胞。48小时以后收集细胞用于测定CAT分析。当在起初的转染和随后的传代实验中使用野生型的N，可以检测到最高的CAT活性(100％)。当在起初的转染中使用野生型的N而在随后的传代实验中使用突变的N，可以检测43％的CAT活性；表明，N的磷酸化的确影响了微小基因组的转录。当在起初的转染中使用突变的N而在随后的传代实验中使用野生型的N，可以检测61％的CAT活性，表明，尽管效率较低，突变的N在起初的转染中支持微小基因组的复制。然而，在起初的转染和随后的传代实验中使用突变型的N，只检测到13％的CAT活性，表明N磷酸化的缺陷导致病毒RNA转录和复制的下降(Yang等人，1999，附录1)。
实施例3
在389位的丝氨酸突变为丙氨酸，天冬氨酸或者谷氨酸，检测了这些突变体以及完整的感染性病毒在微小基因组中对于狂犬病病毒的质粒与复制的影响。对于丝氨酸突变为其它的每一个氨基酸导致合成非磷酸化的N从而降低了在微小基因组中病毒的转录与复制。从S到A与S到D的突变也导致在全长的感染性病毒在病毒的转录与复制的下降生长曲线的研究表明S到A突变(L16A)的突变体病毒的产生是10,000倍低于野生型病毒(L16)。用狂犬病病毒基因探针的Northern印迹杂交表明，当N没有磷酸化时，病毒转录和复制的速率在突变体病毒中下降了10倍。从微小基因组系统和全长的感染性病毒得到的数据的解释说明狂犬病病毒N的磷酸化对于复制是必须的。进一步涉及环己亚胺处理感染细胞的研究表明，当N没有磷酸化时，病毒的转录也下降。总的看来，这些结果提供了确切的证据N磷酸化在狂犬病病毒的转录和复制的过程中起重要作用。
细胞，病毒，质粒，以及抗体。BSR(BHK细胞的克隆)和BSRT7/5(稳定表达T7聚合酶的BSR细胞，[Buchholz等人，1999])生长于Dubecco基本培养基中并且用上述质粒感染(Yang等人，1999)。表达细菌T7RNA聚合酶(vTF7-3)的重组牛痘病毒如(Fuerst等人，1986)所述制备。用于表达完整的感染性病毒(pSAD-L16)，狂犬病病毒微小基因组(pSDI-CAT)，狂犬病病毒L(pT7T-L)，糖蛋白(pT7T-G)，以及基质蛋白(pT7T-M)(Buchholz等人，1999；Conzelmann等人，1987；Schnell等人，1984)的质粒从Dr.K.Conzelmann中得到。表达N(pRN)和P(pRP)的质粒以前构建(Fu等人，1994)。抗狂犬病病毒N的多克隆抗血清如以前描述的方法在兔子中制备(Fu等人，1991)。
定点突变使用Weiner等人(1994)的方法通过进行定点突变使狂犬病病毒N的389位丝氨酸突变为A，G，D，N，E，或者Q。合成了如表1所列的六对引物，而且引物设计为含有一个或者两个核苷酸的变化导致了丝氨酸密码子的突变。应用pRN(Fu等人，1994)作为模板使用三对引物的每一对进行PCR反应。PCR产物随后使用DpnI酶消化，该酶在GmeATC处消化甲基化与半甲基化的DNA，因此消化pRN的DNA模板。未被消化的PCR产物(没有甲基化)用于转化感受态XL-1 Blue细胞。用核酸测序来确定质粒中的突变。
表1在狂犬病病毒N中用于在位置389中引入从丝氨酸到丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸突变的引物。(粗体表示突变密码子)
引物ID  引物序列  氨基酸变化为
SA5(SEQ ID NO：1) 5’GATGATGGAACTGTCAACGCTGACGACGAGG3’  丙氨酸
SA3(SEQ ID NO：2)   5’GTAGTCCTCGTCGTCAGCGTTGACAGTTCC3’
SG5(SEQ ID NO：3)   5’GATGATGGAACTGTCAACGGTGACGAQCGAGG3’   甘氨酸
SG3(SEQ ID NO：4)   5’GTAGTCCTCGTCGTCACCGTTGACAGTTCC3’
SD5(SEQ ID NO：5)   5’GATGATGGAACTGTCAACGATGACGACGAGG3’   天冬氨酸
SD3(SEQ ID NO：6)   5’GTAGTCCTCGTCGTCATCGTTGACAGTTCC3’
SN5(SEQ ID NO：7)   5’GATGATGGAACTGTCAACAATGACGACGAGG3’   天冬酰胺
SN3(SEQ ID NO：8)   5’GTAGTCCTCGTCGTCATTGTTGACAGTTCC3’
SE5(SEQ ID NO：9)   5’GATGATGGAACTGTCAACGAAGACGACGAGG3’   谷氨酸
SE3(SEQ ID NO：10)   5’GTAGTCCTCGTCGTCTTCGTTGACAGTTCC3’
SQ5(SEQ ID NO：11)   5’GATGATGGAACTGTCAACCAAGACGACGACGAGG3’   谷酰胺
SQ3(SEQ ID NO：12)   5’GTAGTCCTCGTCGTCTTGGTTGACAGTTCC3’
为了将狂犬病病毒N中的突变引入到感染的克隆中，将完全感染性克隆(pSAD-L16)[狂犬病病毒基因组的核苷酸序列482-4041(Conzelmann等人，1990)]中含有N的丝氨酸密码子的一个SphI片段克隆至pGEM-3Z的SphI位点。得到的质粒用于模板来构建如上所述的pRN的突变。在替代后的载体中，389位的丝氨酸突变为丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸。在序列分析确证以后，每一个突变的SphI片段克隆回至pSAD-L16。得到三个具有预期突变和正确插入方向的克隆并且分别命名为pSAD-L16A，pSAD-L16D，和pSAD-L16E。
转染。用前述的方法(Yang等人，1999)用质粒转染BSR细胞。简要地为，用重组牛痘病毒(vTF7-3)以感染系数(moi)为每个细胞5个斑形成单位(pfu)感染BSR细胞。感染后1小时，细胞用混合质粒不同的组合通过Lipofectamine(生物技术，Rockville，MD)转染。在指定的时间点收集转染的细胞用于进一步的分析。
氯霉素乙酰转移酶(CAT)分析。使用Quan-T-CAT分析(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)按照制造商的使用手册测定CAT活性。裂解转染的细胞，而且上清与生物素标记的氯霉素以及[3H]标记的乙酰辅酶A一起温育。然后向反应中加入链霉素包被的玻璃珠，当去除游离的放射性物质后，沉淀重新悬浮于闪烁液中用于闪烁计数仪定量分析。CAT的活性表示为每分钟的计数次数。用每一个突变的N蛋白转染的细胞的相对CAT活性以用野生型N转染细胞的CAT活性作为100％来计算。
蛋白的放射性标记和免疫沉淀。转染的或者感染的BSR细胞既可以用以前所描述的(Yang等人，1999)[35S]标记的甲硫氨酸或者[32P]标记的磷酸来标记(Amersham Pharmacia Biotech)。收集细胞并且用抗-N的抗体免疫沉淀，然后在12％的聚丙烯酰胺/10％SDS凝胶电泳并且放射自显影。
Northern和Western印迹。转染或者感染的BSR细胞，或者纯化的病毒用于Northern和/或者Western印迹。对于Northern印迹，用Trizon去垢剂(生物技术)裂解BSR细胞，按照制造商的详细说明制备总RNA。使用mRNA分离试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)从总RNA中纯化多聚A的mRNA。RNA制备物在含有50％(v/v)甲酰胺的10mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中，于65C中变性15分钟，然后在含有1.1M的甲醛和10mM的磷酸钠中进行1.1％的琼脂糖凝胶电泳。然后转移RNA并使其共价固定于尼龙膜上用于与CAT，狂犬病病毒基因，或者b-肌动蛋白探针的杂交。用密度测量仪定量RNA的条带。对于Western印迹，用RIPA缓冲液裂解BSR细胞，蛋白直接通过SDS-PAGE分离。当转移到硝酸纤维素膜上以后，用兔抗-N的多克隆抗体如(Fu等人，1991)所述检测狂犬病病毒N。
突变狂犬病病毒的选择。既可以使用vTF7-3感染的BSR细胞(Fuerst等人，1986)，也可以在BSR T7/5细胞(Buchholz等人，1999；Schnell等人，2000)中进行突变病毒的选择。简要地，BSR细胞用vTF7-3在moi为1时感染。1小时以后，细胞用10mg的pRN，2.5mg的pRP，1.5mg的pT7T-L，以及10mg的pSAD-L16，pSAD-L16A，pSAD-L16D，或pSAD-L16E转染。在温育48小时以后，细胞用培养基重新悬浮并且进行三次反复冻融来释放细胞结合的病毒。牛痘病毒通过如以前所描述的(Schnell等人，1994)离心和随后的通过0.2m的滤器(Millipore)过滤去除。可选择地，BSR T7/5细胞用10mg的pSAD-16或者pSAD-1-16A，同时用10mg的pTIT-N，2.5mg的pTIT-P，以及2.5mg的TIT-L转染，如所述(Schnell等人，2000)。为了确定突变病毒含有所需要的突变，从被这样的病毒的每一个感染的BSR细胞中提取总RNA，然后使用如前所述的引物(Smith等人，1991)(SEQ IDNOS：13-14)10g(5′CTACAATGGATGCC-GAC3′)以及304(5′TTGACGAAGATCTTGCTCAT3′)进行对N基因的PCR扩增。这些引物可以从基因组RNA中扩增完整的N编码序列。扩增的片段直接使用引物(SEQ ID NO：15)113(5′GTAGGATGCTATATGGG3′)(Smith等人，1991)，其可以直接进入到N基因突变的区域。含有S到A，S到D，S到E突变的突变病毒分别命名为L16A，L16D，以及L16E。
病毒生长曲线。生长于六孔板的BSR细胞用用野生型或者突变型狂犬病病毒以1ffu/细胞的moi进行感染。在37℃温育一个小时以后，去除病毒接种物并且细胞用PBS清洗来去掉未被吸收的病毒。细胞重新用新鲜的培养基重新补足，而且在感染后的6，12，24，36，48，60，和72小时后去除100ml的培养基上清。各个病毒成分如前所述(Fu等人，1996)重复一次在BSR细胞中测定滴度。
用CHK处理感染的细胞。环己亚胺(CHX)购自Sigma(St.Louis，Mo.)而且以终浓度150微克/毫升加入到用狂犬病病毒感染的细胞中，如前所述(3)感染1个小时。在感染后6，12，和24小时后收集细胞并且提取RNA用于Northern印迹杂交。
N磷酸化对于病毒转录和复制的影响很可能至少是部分由于磷酸组分所带的净负电荷所引起。以前，表明狂犬病病毒N的磷酸化在病毒的转录和复制的过程中起重要作用(Yang等人，1999)。磷酸丝氨酸突变到Ala导致了狂犬病病毒微小染色体转录与复制的下降。为了确定狂犬病病毒N磷酸化对于病毒的转录和复制的作用是否是由于磷酸组分的净的负电荷或者S结构或者两者都有所引起的，在N的在389位的磷酸化的丝氨酸突变为A，G，D，N，E，和Q。BSR细胞用重组的牛痘病毒vTF7-3感染后用表达狂犬病病毒微小基因组(pSDI-CAT)，狂犬病病毒L(pT7T-L)，以及狂犬病病毒P(pRP)，与表达狂犬病N或者突变的N(pRN，pRN-SA，pRN-SG，pRN-SD，pRN-SN，pRN-SE，或者pRN-SQ)一起转染，如以前所述(Conzelmann和Schnell，1994；Yang等人，1999)。在温育48小时以后，收集BSR细胞，使用Quan-T-CAT分析仪测定CAT的活性。CAT的相对活性，其是在用每一个突变N的质粒转染的细胞中微小基因组转录的测定该值的计算以在用野生型N转染的细胞中的活性为100％来进行计算。该结果总结于图1。在用pRN-SG，pRN-SA，pRN-SN，pRN-SD，pRN-SQ，和pRN-SE分别转染的细胞中，它们相对于野生型N的CAT活性分别为6，9，28，40，46，以及62％。在所有缺乏一个N表达的质粒的其它质粒转染的细胞中，相对的CAT活性小于2％(没有显示数据)。这些结果表明N的磷酸化对于病毒转录或者复制或者二者均有的效应，很有可能至少是部分由磷酸基团的净的负电荷以及丝氨酸残基的结构引起。
增加和降低N表达质粒的浓度并不能补偿N磷酸化对于病毒转录和复制的效应。在研究VSV P蛋白的磷酸化效应中，Spadafora等人，(1996)观察到在低浓度的情况下，未磷酸化的P对于病毒的转录的支持活性较弱。为了确定N浓度对于突变的N蛋白来完成最佳化的狂犬病病毒微小基因组最佳化的转录和复制的能力有任何效应，应用不同浓度(5，10，15和20mg)的表达N或者突变N(pRN-SA，pRN-SD，pRN-SE)的质粒进行转染，而且收集细胞用于CAT分析。如图2所示，10mg每一个突变的N表达质粒以及15mg的野生型N(pRN)导致最优化的CAT活性。较大或者较少的量导致CAT活性轻微地下降(20％)，这表明对于野生型N或者突变型N，增加或者减少N的浓度对于病毒的转录并没有大的作用。为了确定对应于N表达质粒的加入量的N表达水平，用RIPA缓冲液裂解转染的细胞，并且将细胞裂解物进行SDS-PAGE分析，然后使用多克隆的抗-N的抗体进行Western印迹(Fu等人，1994)。正如图2下面所示，对于每一个野生型或者突变的N蛋白的表达的N的量与加入的N表达质粒的量成正比例。
狂犬病病毒N的磷酸化影响了狂犬病病毒微小基因组的转录和复制。在以前的研究(Yang等人，1999)和以上所述的研究中，只有用测定的CAT活性来测量病毒的转录和复制。为了进一步确定N的磷酸化是否影响病毒的转录或者复制，或者两者都有，在转染的细胞中进行Northern印迹杂交来测定转录产物以及基因组类似物。为了测定病毒的转录，从转染细胞中制备总RNA，而且从总RNA中纯化多聚A的mRNA。为了测定病毒的复制，用蒸馏水抽提转染的细胞，而且用多克隆抗-N的抗体免疫沉淀RNP复合体。该复合体用Trizon试剂处理来得到基因组类似物。RNA制备物与从CAT的cDNA通过切口翻译用[a-32P]-dCTP标记的CAT探针杂交。正如图3所示，当N未磷酸化时，CAT转录本的量以及基因组RNA类似物的量下降了。转录和复制活性的范围按照从野生型N，从S到E的突变，从S到D的突变，从S到A的突变的顺序从高到低。从用pRN-SA，pRN-SD，或者pRN-SE转染的细胞的CAT转录本的量分别为野生型N(pRN)的17，63，和85％。这些相对应的相对的CAT活性列于图1。再用pRN-SA，pRN-SD，或者pRN-SE转染的细胞的基因组的类似物的量分别为细胞表达野生型N(pRN)的量的12，55，和95％，这一切表明在微小基因组系统中病毒转录本和基因组类似物的合成受到N的磷酸化的影响。
为了排除在用突变的N-表达质粒转染的细胞中降低的病毒的转录和复制是由于不同水平的N的合成所引起的，转染的细胞用[35S]甲硫氨酸标记，并且用RIPA缓冲液裂解。标记的N用抗-N的抗体免疫沉淀并且用SDS-PAGE分析。如图3所示，在转染的细胞中用不同的N结构物免疫沉淀相似量的N或者突变体N。为了确证N突变体确实未磷酸化，转染细胞用[32P]的磷酸标记，当用RIPA缓冲液裂解后，标记的N用抗-N的抗体免疫沉淀而且通过SDS-PAGE分析。只有野生型的N是磷酸化的，其中所有的突变体N蛋白没有磷酸化(图3)。
突变体狂犬病病毒的构建和筛选。在微小基因组系统，用于病毒转染和复制中必须的病毒蛋白由T7聚合酶合成。而且其合成并不受狂犬病病毒的调控机制所控制。因此，有必要在完全感染的病毒中确定狂犬病病毒N的磷酸化对于病毒转录和复制的效应。为了这一目的，在N的第389位的丝氨酸突变为丙氨酸(L16A)，天冬氨酸(L16D)，或者谷氨酸(L16E)，这些突变体引入到全长的感染性克隆中(Schnell等人，1994)。(L16A，L16D和L16E保藏在美国菌种保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，美国，保藏号分别为ATCC PTA-3541，PTA-3542和PTA-3543，于2001年7月20日。在这些克隆转染至BSR细胞后，得到野生型病毒L16和突变型病毒L16D，和L16E。然而L16A并不能在BSR细胞中拯救。因此用BSR T7/5细胞(Buchholz等人，1999)来选择L16A而且L16A成功地得到拯救。RT-PCR以及直接的序列测定确证了这些突变病毒含有所需的突变。野生型病毒(L16)的基因组RNA在389位上仍然保持丝氨酸的密码子(UCU)，同时从L16A，L16D，和L16E病毒的基因组RNA分别具有丝氨酸(UCU)被丙氨酸(GCU)，天冬氨酸(GAU)和谷氨酸(GAA)取代。为了确定突变的病毒体表达非磷酸化的N，通过用[35S]甲硫氨酸或者[32P]磷酸标记的这些病毒的每一个感染BSR细胞而且随后进行免疫沉淀和PAGE分析。当在微小基因组系统中，在这些病毒中的每一个感染的BSR细胞中检测到[35S]甲硫氨酸标记的N，同时只是在用L16感染的BSR细胞中检测到[32P]磷酸标记的N(数据未列出)，这表明在389位的丝氨酸的突变在完全的感染性病毒中没有进行N的磷酸化。
突变体的狂犬病病毒的复制慢于野生型病毒。起初，野生型狂犬病病毒(L16)，突变病毒L16D，以及L16E在37℃时在BSR细胞中生长到高滴度(＞107ffu/ml)，但是L16A长的较差(滴度＜104ffu/ml)。为了克服这一困难，在31℃下，在BSR细胞中，L16A增殖制备突变的VSV(Wertz等人，1998)，同时L16A长至较高的滴度(＞105FU/ml)。野生型以及突变狂犬病病毒的生长曲线通过用每一个这样的病毒以moi为每个细胞1ffu来感染BSR细胞来测定。如图4所示，野生型病毒(L16)的生长一直豪语突变体病毒，而且在病毒产量的峰值(60小时)滴度达到超过109pfu/ml。在这一时期，突变病毒的生长速率滞后，尤其是对于L16A。其产量只是105pfu/细胞，至少低于野生型病毒4个对数单位(10,000倍)。这些数据表明N的磷酸化促进了病毒的产生，很可能通过调节和调控病毒的转录和复制。
在完全感染性的狂犬病病毒中，N磷酸化调节了病毒的转录以及复制在图4所列的生长曲线数据表明具有未磷酸化的N的突变病毒的生长，尤其是突变病毒L16A，严重下降。这可能是由于病毒转录和复制的抑制，或者二者均有。为了研究清楚病毒的转录和复制是否在突变的感染性狂犬病病毒中都受到抑制，用野生型病毒L16和突变病毒l16A，L16D，或者L16E以1个moi来感染BSR细胞。感染后40个小时分离的总RNA使用制备自N(Fu等人，1991)或者糖蛋白G的cDNA(Fu等人，1993)为探针进行Northern印迹杂交。这些探针可以在基因组RNA(12kb)中分辩N或者G的转录本(1.4kb和1.8kb)。正如图5所示，每一个探针检测基因组RNA和N或者G的转录本。此外，也检测通读(RT)转录本和/或者干涉缺陷(DI)RNA。当与G或者N探针杂交时，稍微高出N或者G转录本的条带可能代表RT转录本。当与G探针杂交时，稍微低于基因组RNA的条带可能代表RT转录本(G或者L)或者干涉缺陷的RNA。对于L16A病毒，病毒基因组RNA和转录本的量分别为野生型病毒的10-12％和21-28％。对于L16D病毒，病毒基因组RNA和转录本的量分别为野生型病毒的41-45％和60-65％。对于L16E病毒，病毒基因组RNA和转录本的量为野生型病毒的100％。一般的，在用L16A和L16D病毒感染的细胞中，病毒复制的抑制(10-12％以及41-54％)比病毒转录的抑制(21-28％和60-65％)更为严重。这些观察与从微小基因组系统得到的数据一起，表明未磷酸化的N导致病毒复制的下降。在微小基因组系统，由于N的转录在T7聚合酶的控制下，病毒的复制并不依赖于病毒的转录，而且未磷酸化N的水平类似于野生型N的水平。然而当N未磷酸化的时候基因组RNA的量下降(图2)，这表明对于最适的病毒复制需要N磷酸化。
为了进一步确定N的磷酸化是否也影响病毒的转录，通过在感染的细胞中用CHX抑制蛋白质的重新合成来使得转录过程与翻译过程解偶联。BSR细胞通过使用每一种病毒在MOI为每个细胞中3FFU感染。在感染后1小时，加入CHX至培养基中至终浓度为150μg/ml来完全抑制蛋白质的合成(3)。用未被CHX处理的感染的细胞作为对照。在感染后6，12，和24小时，收集细胞，并且抽提RNA以狂犬病病毒N为探针用于Northern印迹杂交。当没有CHX时，对于每一个病毒由于基因组RNA的量随着时间函数增加，所以每一个病毒均复制(图.6A)对于每一个时间点每一个病毒的转录和复制的效率相似参见图.5。当加入CHX到培养基中，由于对于任何病毒基因组RNA的量在每一个时间点上并没有增加，病毒的复制受到抑制(图6B)。此外狂犬病病毒N蛋白的合成在用CHX处理的BSR细胞受到抑制(数据未列出)。在相同的时间间隔中，每一个病毒的转录量增加。对每一个病毒在每一个时间点的转录本相对于野生型L16的定量，表明对于L16A，L16D，和L16E的转录效率相对于野生型病毒L16分别为8到12％，53％到65％，以及91到100％。该结果确切地表明未被磷酸化的N，除了具有从S到E的突变的N，也抑制病毒的转录。
未磷酸化的N并不改变基因组RNA和反基因组RNA之间的比例。未磷酸化的N与前导RNA的结合强于磷酸化的N(Yang等人，1999)。因此有可能是N的磷酸化在病毒的转录和复制中通过包裹反义RNA比基因组RNA更强而起作用的。这是由于未磷酸化的N，与反义的基因组RNA结合的较强(Yang等人，1999)，在病毒复制的第一步中，可能降低了子代中负链基因组RNA的合成，这样就改变了基因组RNA与反基因组RNA的比率。为了验证这一假设从用每一个野生型或者突变体病毒感染的BSR细胞中提取总RNA使用从pRN模板制备的有义的(通过T7聚合酶转录)或者反义(通过SP6聚合酶转录)的核酸探针进行Northern印迹杂交。RNA也通过也要从用每个病毒感染的BSR细胞春花的病毒中制备RNA。对于在野生型和突变型的病毒感染的细胞中，基因组RNA与反基因组RNA的比例大约为(3∶1)(图7)。对于每一种病毒，这些病毒纯化的病毒粒子中的比例也大约是(16∶1到19∶1)。这些数据表明N的磷酸化很可能并不影响对于基因组RNA的包裹和包被优先于对反基因组RNA的包裹和包被。
当N的磷酸化的丝氨酸突变，狂犬病病毒的转录和复制并不下降这些在微小基因组系统和感染的病毒中已经表明。当N未磷酸化时，与磷酸化的N相比转录和复制的速率下降了十倍对于这些突变病毒，病毒的产量下降了大约10,000倍，尤其是当磷酸化的丝氨酸突变为丙氨酸时。这些数据表明狂犬病病毒N的磷酸化尽管并不是绝对必须的但是对于狂犬病病毒转录和复制的调节是非常重要的。更进一步，对于数据的解释说明也表明狂犬病病毒N的磷酸化对于病毒转录和复制的效应归因于丝氨酸的结构以及其磷酸组分的净的负电荷的组合。狂犬病病毒N的磷酸化丝氨酸突变为中性氨基酸丙氨酸和谷氨酰胺降低了病毒的转录和复制约10倍。可选择地，磷酸化的丝氨酸突变为天冬酰胺或者谷氨酸，两者均含有酸性测链并且在生理pH下带有负电，可以恢复病毒的复制和转录活性超过磷酸化的N的超过60％和80％。然而当S突变为N或者Q，两者具有类似D和E的结构，但是缺乏负电荷，病毒的转录活性至少下降三分之一但是仍高于那些从S突变为A或者S突变为E的突变的结果。此外，突变病毒在31℃的生长状况好于在37C的事实表明，突变病毒是温度敏感型。这些结果表明，氨基酸结构和磷酸基团净的负电荷对于病毒的转录和复制非常重要。
狂犬病病毒N，与VSV的对应部分类似，通过包裹病毒重新合成的基因组RNA在调节病毒RNA的转录和复制中起到关键作用(Wagner和Rose，1996；Wertz等人，1987；Wunner，1991，23，25，27)。是狂犬病病毒N，而不是VSV的N，的磷酸化，提出了一个问题就是磷酸化是如何涉及到狂犬病病毒RNA的转录和复制的(Wunner，1991)。Yang等人，1999，而且在此所列的研究表明对于微小基因组和完全感染的病毒的转录和复制当N没有磷酸化时受到抑制。在未磷酸化的N构建物转染的细胞中，病毒转录本以及基因组RNA低于用野生型病毒感染的细胞中的量。在微小基因组系统中，所观察的病毒转录和复制的下降在转染的细胞中突变N蛋白表达的差异，因为在分析中所检测的N的表达水平没有差异。
本研究也强调是否的N的磷酸化影响病毒的转录和复制，或者两者均有。一种可能的情况可能是N的磷酸化影响了病毒的转录，复制或者二者均有。在微小基因组中和感染性病毒中定量病毒的转录和基因组的复制的研究表明当N没有磷酸化时病毒的转录与基因组RNA(或者类似物)的水平下降(图2和图5)。然而这些数据并不是一定说明未磷酸化的N抑制病毒的转录和复制因为在感染的细胞中(Wagner和Rose，1996)。中固有的复杂性。病毒基因组复制的下降导致较少的模板参与转录，而且很可能将要降低病毒mRNA的积累。在另一方面，转录的下降降低了N的储存，而且最终导致复制的下降。虽然如此，人们可以从微小基因组系统得到的数据下出结论，磷酸化的N支持病毒的复制。尽管事实上，在微小基因组系统中，由于N的转录是在T7聚合酶的控制下，病毒的复制并不依赖于病毒的转录，在微小基因组系统中(参见图2)当N没有磷酸化时病毒的复制下降。实际上，免疫沉淀表明未磷酸化N的水平类似于在微小基因组系统中野生型的N。
为了进一步阐述是否N的磷酸化而且N的磷酸化如何也影响病毒的转录，我们通过用CHX处理感染的细胞来抑制蛋白质的合成来使得病毒的转录与病毒的复制解偶联。病毒的复制依赖于新合成的病毒的N蛋白而转录不需要(25)。在这些条件下，病毒的复制下降而转录则没有(图6)，这就允许我们评估N的磷酸化对于依赖于病毒的复制的病毒转录的效应。该数据表明N的磷酸化也调节病毒的转录，因为当N没有磷酸化时，尤其是1磷酸化的S突变为N的时候，病毒的转录也被抑制将近90％。这样数据显示N的磷酸化支持病毒的复制和转录。
正如在所有的单链反义RNA病毒，在狂犬病病毒中，RNP复合体是具有感染性的单位(Wunner，1991)。在RNP复合体中各组分间复杂的相互作用引起了狂犬病病毒转录和复制的结果(Wagner和Rose，1996；Wertz等人，1987)。以前的研究表明，去磷酸化的纯化的狂犬病病毒N更易于包裹前导RNA而不是磷酸化的N(Yang等人，1999)狂犬病病毒N在389位的丝氨酸突变为Ala也导致了比对于野生型的N结合前导RNA的增加。N的磷酸化既影响了病毒的转录也影响了病毒的复制。有可能是未磷酸化的N与RNA的结合可能阻止L接近基因组RNA来起始病毒的转录和复制。尽管在转录和复制过程中N仍然通过磷酸骨架结合于基因组RNA(Emerson，1982)，模板相联系的N必须暂时解折叠以便L可以与模板RNA相结合(Bannerjee和Chattopadhyay，1990)。N的磷酸化可能唤醒N与基因组RNA的相互作用，从而使得L可以接近并且结合于RNA模板上来起始转录和复制，该假设受到在微小基因组系统和感染性病毒的数据的支持。当磷酸化的丝氨酸突变为中性氨基酸A或者G，病毒的转录和复制下降最多。当磷酸化的丝氨酸突变为带负电的天冬酰胺或者谷氨酸，转录和复制的活性恢复到野生型N水平的60％到90％。在用突变病毒L16E(丝氨酸突变为谷氨胺酰胺)感染的细胞中转录和复制产物的量基本上与用野生型病毒L16感染的细胞的量相等。尽管在用L16E感染的细胞中病毒的产生实际上略微低于在用L16感染的细胞中产生的量。由于基因组RNA是转录和复制的模板(Wagner和Rose，1996)，可以设想磷酸化的N将有利于转录和复制的起始。
因为N的磷酸化影响其包裹前导RNA的效率(Yang等人，1999)，有可能N的磷酸化导致包裹比基因组RNA更多的反基因组RNA(Wunner，1991)。未磷酸化的N通过与反基因组RNA强的结合，在病毒复制的第一步，可能降低基因组RNA的合成再用野生型病毒感染或者任何一种突变病毒感染的细胞中，基因组RNA和反基因组RNA的比例保持不变(大约3∶1)。在从所以病毒中纯化的病毒粒子中基因组和反基因组RNA的比例也相似(大约为20∶1)。测定的基因组RNA对反基因组RNA的比例不同于以前所报道的(50∶1)(Finke和Conzelmann，1997)。差异可能归因于在两者研究中的方法和定量。在目前的实验中RNA的测定通过密度仪，而在以前RNA的定量通过磷成像定量。然而在此报道的数据表明N的磷酸化并不影响基因组或者反基因组RNA的包裹。
最近，Kawai等人，(1999)报道只是在核包裹物中检测到磷酸化的N，其中N是在游离的N pool中(大多数以N-P复合体存在)并且是未磷酸化的。基于在此的研究和数据，用设想以下的模型来解释狂犬病病毒N是如何磷酸化的以及狂犬病病毒N的磷酸化如何调节病毒的转录和复制(图8)。很可能由于其构象，N在游离的N或者在N-P异源复合体中没有被磷酸化。很可能磷酸化位点在这一阶段处于包埋状态。在包裹基因组RNA以前N并不处于磷酸化状态是有利的，因为未磷酸化的N比磷酸化的N对于基因组RNA有较高的亲和力(Yang等人，1999)。基因组RNA与N-P复合体的相互作用(包裹)可能诱导N的构象变化，这使得N与激酶相互作用，或者暴露389位的丝氨酸进行磷酸化，或者两者均有。N的按次序的磷酸化可能影响N和基因组RNA的相互作用。在磷酸化以后，在带有负电的磷酸和带有负电的RNA之间的电荷排斥作用可能唤醒N与RNA的相互作用。这可能使得L进一步接近而且结合于基因组RNA，因此起始了病毒RNA的转录和复制。支持这一模型的证据来自两个研究结果。未磷酸化的N结合于基因组RNA强于磷酸化的N的结合(Yang等人，1999)，以及磷酸化的位点(残基389)接近于所推定的RNA结合区域(残基289到352)(？Kouznetzoff等人，1992)。未磷酸化的N，由于结合RNA较强，可能阻止L接近基因组模板。随后，病毒RNA转录和复制的效率下降。
实施例4
利用在N和G的突变而且确定它们的致病性和免疫原性构建非致病的狂犬病病毒。
磷酸化的丝氨酸的突变，尤其是突变为Ala，在狂犬病病毒微小基因组和感染性病毒中抑制病毒的转录和复制(Wu等人，2001；Yang等人，1999)。对于突变病毒(L16A)病毒的产量比野生型病毒低至少4个log单位(Wu等人，2001)。所有这些数据表明在N上的突变可以抑制病毒的复制而且因此可以衰减病毒的毒性。以前已经报道，在G上的突变，尤其是在333位精氨酸，导致狂犬病病毒毒性的衰减(Dietzschold等人，1983)。具有在333位精氨酸G突变的衰减毒性的狂犬病病毒已经降低了在CNS中从起初的感染的神经元传播到第二级或者第三级神经元的能力(Coulon等人，1989)。然而，在细胞培养的这些突变病毒的复制速率与野生型病毒并没有什么不同，这表明在333位的G的突变并不能导致病毒复制速率的下降(Laqfay等人，1994)。这可以解释为什么这样的突变病毒在新生的动物中经由大脑内接种直接仍能引起狂犬病(Schumacher等人，1993；Lafay等人，1994)。在N和G上的突变将导致狂犬病病毒毒性进一步的衰减到不再在任何年龄的动物中以任何接种方式致病的程度。这是因为这样的突变病毒不仅仅降低浸染神经系统的能力而且复制的速率也下降了。因此非致病的狂犬病病毒可以选择自在N和G蛋白构建的突变而且由之确定其致病性和免疫原性。
通过在G和N上的突变构建和选择非致病性狂犬病病毒：应用在N的磷酸化位点的突变构建的狂犬病病毒(L16A，L15D，和L16E)(Wu等人，2001)。因为L16D和L16E的复制速率接近于野生型病毒L16，应用两种引物(SEQ ID NOS：16-17)(5’ATGCTCACTACAAGTGAAACTTGAATCAG3’和5’GGAGGATCTCATTCCAAGTTTCACTTGTAG3’)如以前所描述的(Wu等人，2001)，通过定点突变的方法，将333位G的突变引入到L16和L16A。这些引物得到精氨酸残基(AGA)突变为谷氨酸(GAA)。正如以前报道的对于SAG2，改变了两个核苷酸，这样就降低了G回复成其致病基因型的可能性(Schumacher等人，1993；Lafay等人，1994)。含有精氨酸密码子G的来自于野生型(pSAD-L16)的完全感染性克隆一个片段(狂犬病病毒基因组的核苷酸序列3854-8273)(Schnell等人，1994)用XhoI酶切并且克隆到pGEM-3Z中同样的位点。得到的质粒使用Weiner等人(Weiner等人，1994)的方法以及以上所示的引物用于构建突变的模板。在位置333的精氨酸在代理质粒中突变为谷氨酸。当序列分析来确证该突变以后，突变的XhoI片段在XhoI位点克隆回至pSAD-L16和pSAD-L16A。具有预想的突变和正确方向的突变克隆分别命名为pSAD-L16G333和pSAD-L16AG333。
为了选择在G和N处突变的突变克隆，用10μg的pTIT-N，2.5μg的pTIT-P，2.5μg的pTIT-L与10μg的pSAD-L16G333或者pSAD-L16AG333一起如以前所述转染BSR T7/5细胞(Wu等人，2001；Schnell等人，2000)。在上清转至新鲜的BSR细胞之前，用新鲜的培养基重新悬浮细胞并且继续培养3天。感染后两天，使用抗-狂犬病病毒N的课堂结合FITC检测病毒。正染的细胞表明为感染性病毒的正确拯救。病毒增殖用于进一步的分析。这两个选择的病毒命名为L16G333和L16AG333。
为了进一步分析突变病毒，通过用这些病毒的每一个以moi为1感染BSR细胞来确定生长曲线，包括L16和L16A用于比较。在吸收1个小时以后，去处病毒接种物并且细胞用PBS洗三次。然后加入新鲜的培养基在6，12，18，24，36，60，和72小时p.i.从培养基中等量取出培养基，然后如前述用于病毒滴度测试(Wu等人，2001)。重复该实验三次，而且比较每一个病毒的平均的滴度。为了确定是否这些突变病毒具有下降的病毒复制速率，BSR细胞在moi为1时感染并且在培养40小时后收集细胞利用(Wu等人，2001)所述的方法进行总RNA的提取。在RNA制备中病毒的基因组RNA以及转录物利用制备自N(Fu等人，1991)和G的cDNA(Fu等人，1993)为探针用Northern印迹杂交分析。RNA的定量通过对RNA条带用密度仪或者磷成像进行。可选择的，用这些病毒感染的BSR细胞可以使用对于VSV描述的在代谢中当年有放线菌素D(5μg/ml)存在的条件下，用[3H]尿嘧啶(33uCi/ml)标记4小时(Wertz等人，1998)。然后收集细胞用于RNA提取。RNA通过凝胶电泳分析，和密度仪定量。从每一个转录本和基因组RNA的密度计算摩尔比。
病毒生长曲线的研究表明L16G333生长于细胞培养基中滴度到L16的滴度由于以前的研究表明，在333位具有G突变的衰减毒性的狂犬病病毒在细胞培养中于野生型病毒一样(Lafay等人，1994)。同样地，L16AG333在细胞培养中生长至与突变病毒L16A具有一样的滴度(Wu等人，2001)而且其产量为比野生型病毒低至少4个log单位。Northern印迹杂交和[3H]尿嘧啶标记表明，当与以前所观察的L16和L16G333相比，对于L16A和L16AG333，病毒的复制速率下降至少5倍。这表明在磷酸化位点突变的N使得狂犬病病毒的复制能力下降。
实施例5
确定在G和N中突变的狂犬病病毒的致病性。为了确定这些突变病毒的致病性，选择了两个年龄组的鼠(新生鼠和5到6周大小的鼠)。衰减毒性的SAD病毒(L16)可以在5到6周大小的鼠中致病(Winkler等人，1976)，而且SAG-2(具有在G上的突变，与L16G333类似)可以通过大脑内的接种在新生鼠中引起疾病(Schumacher等人，1993)。测试了包括野生型L16和突变病毒L16A，L16G333，和L16AG333的四个病毒。对于每一个病毒测定了三个不同的剂量水平(105，106，和107ffu)。对于这一实验总共需要12组5到6周年龄的ICR鼠(每一组十个，来自Harlan)。另外包括对照组。用10μl含有所需剂量通过如接种感染动物。对于对照组，鼠中通过常规途径注射10μl盐水。每天观察动物两次共观察20天临床上的狂犬病症状如，ruf fur，共济失调。与瘫痪。垂死的鼠以及在实验最后的鼠通过吸入CO2安乐致死。记录每一组的死亡率，并且通过使用标准的T测验或者X2测验进行统计学分析。
为了测试这些病毒在新生动物中的致病率，本实验一共需要12窝ICR鼠(每一个怀孕鼠一般一次产下8-11只鼠，来自Harlan)。每一窝用一种病毒的一个剂量来感染。包括另外的一窝作为对照。新生鼠在一天大时用10μl体积的含有每一种病毒的所需剂量进行接种。对于对照组，新生鼠按照常规注射10μl盐水。每天观察动物两次共观察20天死亡的，生存的鼠在实验结束时，通过吸入CO2安乐致死，记录每一窝的死亡率，并且通过使用标准的T测验或者X2测验进行统计学分析。
正如以前所示，野生型(wt)病毒L16在5-6周的鼠和新生鼠中诱发狂犬病(Winkler等人，1976)。感染的5-6周的老鼠在接种后5-6天表现出临床症状而且在接种后的6-8天变的垂死。在接种后4-5天感染的新生鼠表现出严重的临床症状或者死亡。正如对于SAG2所述(Schumacher等人，1993)，L16G333，该病毒具有在G的333位精氨酸的突变，但是在N的磷酸化位点没有突变，其在5-6周年龄的老动物中并不引起疾病。然而在新生鼠中引起临床症状。
施用L16的动物的脑从这些动物中去处用于病毒分离与基因型分析。病毒的滴度如前所述在有病的动物中进行(Fu等人，1996)。对于基因型分析，从脑中制备总RNA并且使用如上所述(Smith等人，1991)的引物(SEQ ID NOS：13-14)10g((5’CTACAATGGATGCCGAC3’)以及304(5’TTGACGAAGATCTTGCTCAT3’)进行RT-PCR分析。这些引物可以在基因组RNA中扩增出完整的N编码区。扩增的片段直接使用如上所述(Smith等人，1991)的引物113(SEQ ID NO：15)(5’GTAGGATGCTATATGGG3’)进行序列测定。该引物直接进入到N基因的突变区域。如果突变病毒的滴度类似于野生型病毒，而且序列分析表明在N上的丝氨酸的突变回复，这表明该病毒回复了。在这种情况下，丝氨酸突变位甘氨酸或者谷氨酰胺，这样改变了丝氨酸密码子的两个或者所有三个核苷酸，使得其不易进行回复。
如果在N的磷酸化位点突变的狂犬病病毒(L16A)在任何一组动物中不引起致病，这表明单独复制率的降低也可以导致狂犬病病毒毒力的衰减到在新生动物中不再致病。这样的突变病毒的毒力足够的衰减而且可以发展成活的狂犬病病毒疫苗。
具有在G的333位精氨酸以及N的磷酸化位点的突变的病毒(L16AG333)，通过在任何年龄的动物中，包括新生动物中感染，将不诱发任何疾病。这样，在G和N的突变使得狂犬病病毒不致病，因为这样的突变病毒不仅仅已经降低了在神经系统传播的能力(Coulon等人，1989)而且其复制速率也下降了(Wu等人，2002)。在接种的动物中这样的病毒刺激一种活性免疫应答(见下面)，它们是开发无毒的活狂犬病病毒疫苗理想的候选者。
实施例6
确定突变狂犬病病毒的免疫原性。为了确定具有在G和N突变的狂犬病病毒(L16AG333)的免疫原性，选择成年鼠。为了对比，包括L16，L16A，L16G333。对于每一个病毒测试了三个剂量(105，106，和107ffu)而且这有助于确定可以刺激保护性免疫的病毒的最小剂量。在三个接种方式中的每一个应用每一种的病毒剂量，它们是肌肉内(i.m.)，真皮内的(i.d.)，和皮下的(s.c.)。在本实验中需要总共36组ICR鼠(每一组10个)，包括另外的一组作为对照。动物用50μl体积含有所需病毒在所需剂量通过肌肉内，真皮内，或者皮下进行免疫。对照组的鼠并不免疫接种。在免疫后1，2，3，4周取鼠中的血测定VNA。在最后一次取血以后，如(Fu等人，1991)所述，在鼠的后腿用10MIMLD50(50％致死量)的CVS-24病毒进行诱发试验。每天观察动物两次神经学上的症状的发育以及死亡共进行20天。记录致死率并且对每一组动物进行统计学分析。
为了测定抗-狂犬病病毒中和抗体，如(Hable，1996；Briggs等人，1996)所述应用快速荧光聚焦抑制测试(RFFIT)。简要地，稀释血清并且与大约50TCID50的CVS-11狂犬病病毒突变体温育90分钟。加入BHK细胞并且进行温育24小时。固定细胞并且用FITC标记的抗狂犬病抗体(Centocor)温育。计数病毒感染的细胞以及使用Reed和Muench的方法计算抗体的滴度(Reed等人，1938)。应用二级梯分析相互作用(Littell等人，1996)的偏差的统计学分析，在所有组的鼠中比较VNA的发展。
野生型病毒L16以及所用的突变的狂犬病病毒通过这些免疫的双亲途径可以诱导免疫应答。这些病毒中没有一个在成年鼠中通过免疫的外周途径引起疾病，如以前所显示的对于野生型病毒L16(Finke等人，2000)。在用L16G333免疫的鼠中VNA的滴度发展的可能高于那些用在G和N上有突变的病毒免疫的鼠，因为这些病毒具有下降的复制速率。这样对于具有在N的磷酸化位点的突变的L16A和L16AG333可能需要比野生型病毒(L16)或者在G的333位精氨酸的单突变的病毒(L16G333)更高的剂量来诱发保护性的免疫。也有可能是由这些G和N突变体病毒诱发的VNA应答类似于由L16G333引起的，尽管这一病毒可能在体外细胞培养中的复制好于在N和G均突变的病毒。那些在细胞培养中生长较好的病毒可能在体内环境下没有优势，因为这些病毒在体内传播的能力下降(Coulon等人，1989)。如果在G和N上具有突变的病毒(L16AG333)诱导出与L16G333可类比的VNA滴度而且100％保护免疫的动物对抗致病的狂犬病病毒，然而其在通过i.c.感染新生动物中(见上)不可以诱导出任何疾病，进一步测试这一病毒作为对于靶动物种类如浣熊，狗，甚至是人通过不同途径的免疫不致病的狂犬病病毒疫苗。
由于复制速率的下降，突变的狂犬病病毒L16A(含有从丝氨酸到丙氨酸Ala的突变)生长缓慢，而且其产量比野生型的狂犬病病毒L16低4个log单位(Wu等人，2002)。这一病毒在31℃的增殖提高了病毒的产量，但是该病毒的产量仍低于野生型病毒。为了克服这一困难，建立了一种稳定表达磷酸化N的细胞系用于在N的磷酸化位点突变的病毒的增殖。这是依赖于以前的观察未磷酸化的N不是一种显性-负的调控子而且其对于病毒转录和复制的抑制功能可以通过磷酸化的N的反式互补作用克服(Yang等人，1999)。为了建立稳定表达磷酸化N的细胞系，用XbaI和PstI消化质粒pRN得到狂犬病病毒N的编码区序列(Yang等人，1998)。片段用Klenow酶平端化并且克隆至pcDNA3(Invitrogen)的EcoRV位点。通过测序验证得到的质粒和插入方向，然后用正确的质粒(pcDNA3-N)转染BHK细胞。在砖染后48小时，收集细胞。进行有限的稀释偶联N表达的检测来选择出稳定砖染的细胞。收集的细胞在96孔板中进行系列稀释，并且加入含有50μg/ml的G418的选择性培养基。细胞进一步温育1周，表达N的细胞通过FITC-结合抗-狂犬病病毒N的抗体(Centoco)来鉴定。表达N的细胞(BHK-N)进一步克隆而且用于N突变狂犬病病毒的增殖。在这些细胞中的N表达水平按照从时间到时间来监测。一旦建立稳定表达N的细胞系(BHK-N)，包括L16A，L16AG333突变的狂犬病病毒，在BHK-N细胞中增殖。如果得到的病毒滴度是107ffu/ml或者更高，这表明BHK-N细胞对于突变病毒的复制至高的滴度提供足够多的磷酸化的N。
尽管复制速率下降，以及在神经系统传播的能力下降使得L16AG333对于发展为无毒的狂犬病病毒疫苗是一种理想的候选者，在L16A和L16AG333上N的突变从丝氨酸(UCU)到Ala(GCU)只是改变了丝氨酸密码子的一个核苷酸。经常有可能丙氨酸残基可能突变回丝氨酸而且病毒回复成L16基因型，尤其是复制速率严重下降的情况下。尽管L16A已经在细胞培养中传代超过十代，并不发生回复。为了避免回复，丝氨酸(TCT)突变为甘氨酸(GGT)或者谷氨酰胺(CAA)，这样就改变了在丝氨酸密码子的两个或者三个核苷酸，使得回复发生率较低。甘氨酸是一个中性氨基酸而且具有与丙氨酸类似的结构。谷氨酰胺具有与谷氨酸相类似的结构但是不带负电荷。磷酸化的丝氨酸突变为甘氨酸或者谷氨酰胺可能具有与从丝氨酸到丙氨酸突变对于病毒的复制和转录类似的效应(Wu等人，2001)。这些突变按照Wuet al.，2001所述容易操作。
实施例7
通过在狂犬病病毒基因组中重新定位狂犬病病毒N基因而且确定它们的毒性和免疫原性构建无毒的狂犬病病毒。对于相关病毒VSV的研究表明在VSV基因组的的N的重排导致VSV毒力的衰减(Wertz等人，1998)。在那个研究中，N基因在VSV基因组中从基因组的第一个位置重新定位于第二个，第三个，或者第四个位置。N的重新定位导致N的表达有步骤地下降，随后有病毒复制地下降。N的转位也导致在动物中病毒毒力有步骤地衰减。尽管所有用野生型VSV以剂量300pfu通过肌肉感染的老鼠死亡，但是没有用同样剂量的N4感染的老鼠发展出疾病(N基因在基因组中重新定位在第四的位置)。N基因在狂犬病病毒的基因组中重新定位可能也导致病毒毒力的衰减。这样，通过在狂犬病病毒N基因组中重新定位狂犬病病毒N基因到第二个，第三个，或者第四个位置来构建一个无毒的狂犬病病毒。重新定位N的狂犬病病毒，如果毒力衰减的足够，具有比在磷酸化位点N-突变病毒更有优势，因为在N重新定位病毒中的变化应该是不可回复的(Wertz等人，1998)。尽管N基因的重新定位导致VSV毒力的衰减，当接种较高的剂量时，N4仍能够在鼠中引起疾病或者致死(Wertz等人，1998)。在333位精氨酸的G的突变也装配到N重新定位的病毒中，来进一步衰减狂犬病病毒的毒性。
通过重新定位N基因来构建无毒的狂犬病病毒。为了在狂犬病病毒基因组中重新定位N基因，构建了两个质粒。质粒pSAD-L16G333用XhoI消化，其中从质粒中去除了大约4.5kb的片段(狂犬病病毒基因组中3854-8273)(Conzelmann等人，1990)。由于已经含有在G的333位精氨酸的突变，所以选择质粒pSAD-L16G333。从pSAD-L16G333中去除XhoI片段由于片段的大小变小因此有助于随后的突变。当消化后并且回收两个片段(10.5kb和4.5kb)，大片段自连形成质粒pSAD-L16G333XhoI，其中含有N，P，M，以及部分G和L基因。该质粒也含有在N和P之间，P和M之间，M和G之间的基因间序列。这样，用于重新定位N基因于第二和第三位置，其是位于P和M之间和M和G之间。小片段克隆至pGEM-3Z载体的XhoI位点而且命名为pGEM-XhoI。该质粒含有G-L的基因间接头，而且用于重新定位N到在G与L之间的第四位置。
为了构建具有重排N的重组病毒，在第一位置的N通过使用PfuTurbo Hotstar DNA聚合酶(Lundberg等人，1991)(Stratagene)从质粒pSAD-L16G333XhoI中去除。合成两个引物(SEQ ID NOS：18-19)(5’ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3’和5’CATTTTTGCTTTGCAATTGACAATGTC3’)而且用于PCR反应。这两个引物将扩增出来9kb的片段，导致从N转录本的一开始N基因的缺失，包括在5端的不翻译区域，编码区，在3端不翻译的区，以及在N和P之间的基因间隔区。PfyTurbo Hotstart DNA聚合酶在扩增的片段中产生平末端(Lundberg等人，1991)这样可以引起自连。连接好的质粒在突变接头处测序来进行确证在P的mRNA的前导序列和开始序列没有假的突变。得到的质粒命名为pSAD-PMG，而且将用于构建重排的N克隆。由于PfuTurbo Hotstart DNA聚合酶可以从载体DNA中扩增大至15kb的序列(Stratagene)，由于pSAD-L16G333XhoI只有10kb大小因此不会有问题。
由于每一个狂犬病病毒转录本起始于AACA，在每一个基因接头处产生唯一的HpaI限制酶位点(GTTAAC)用于克隆N基因。为了在基因组中克隆N基因至第二位置，紧接着基因间序列之后，在P和M基因之间第一次产生了唯一的HpaI位点。这是使用Weiner等人的方法通过定点突变来完成的(Weiner等人，1994)。合成两个引物(SEQ IDNOS：20-21)(5’TCAACATGAAAAAAACAGTTAACACCACT3’和5’AGGGGTGTTAACTGTTTTTTTCATGTTGA3’)并且在用于在pSAD-PMG上的P和M基因之间构建唯一的HpaI位点。突变通过序列分析确证，而且质粒命名为pSAD-PHMG。然后应用PfuTurbo HotstartDNA聚合酶使用引物SEQ ID NOS：22-23)5’ACACCCCTACAATGGATGCCG3’和5’GTTTTTTTCATGATGGATATACAC3’从转录本的开始到基因间的序列整个N基因被扩增。然后克隆至pSAD-PHMG的HpaI位点。当通过序列分析确证后选择正确插入方向的质粒。引入HpaI位点，尽管并不改变插入N的转录本的起始，改变基因间的序列。这样基因间的序列被保留。该过程是通过使用引物SEQ ID NOS：24-25)(5’ATGGAAAAAAACAGGCAACTG3’和5’AGTTGCCTGTTTTTTTCCATG3’)的定点突变引起。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pSAD-PNMG。最后，从pGEM-XhoI切出一个XhoI片段并且克隆至pSAD-PNMG的XhoI位点，得到一个具有N基因克隆到第二位置的全长的狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-N2，而且含有确切的除了在狂犬病病毒基因组中位于P和M基因间的N基因的狂犬病病毒全长序列。
为了克隆N基因至基因组中的第三位置，在基因间隔区序列后，在M和G基因之间产生唯一的HpaI位点。这是通过使用引物SEQ IDNOS：26-27)5’GATGTGAAAAAAACTGTTAACATCCCTC3’和5’AGGGATGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3’的定点突变进行，其导致在在pSAD-PMG上的M和G基因之间构建唯一的HpaI位点。突变通过序列分析确证，而且质粒命名为pSAD-PMHG。然后如上所述扩增整个N基因，然后将其克隆至pSAD-PMHG的HpaI位点。当通过序列分析确证后，选择具有正确插入方向的质粒。HpaI位点的引入改变了基因间序列的一个核苷酸。这样基因间序列通过使用引物SEQ IDNOS：28-29)(5’TGAAAAAAACTATTAACATCCCTC3’和5’AGGGATGTTAATAGTTTTTTTCAC3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pSAD-PMNG。然后，将XhoI片段克隆至pSAD-PMNG中得到具有将N基因克隆至第三位置的全长的狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-N3。
为了克隆N基因至基因组中的第四位置，在G+Y基因间隔区序列后(Conzelmann等人，1990)，在G和L基因之间产生唯一的HpaI位点。该突变引入至基因至pGEM-XhoI，因为该质粒含有G和L基因间的基因间序列。这是通过使用引物SEQ ID NOS：30-31)(5’CAGAAGAACAACTGTTAACACTTCTC3’和5’AGAAGTGTTAACAGTTGTTCTTCTG3’)的定点突变进行，其导致在在pGEM-XhoI上的G和L基因之间构建唯一的HpaI位点。突变通过序列分析确证，而且质粒命名为pGEM-GHL。然后如上所述扩增整个N基因，然后将其克隆至pSAD-GHL的HpaI位点。当通过序列分析确证后，选择具有正确插入方向的质粒。HpaI位点的引入改变了基因间序列的两个核苷酸。这样基因间序列通过使用引物SEQ ID NOS：32-33)(5’AACAACTGGCAACACTTCTC3’和5’AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-GNL。然后，将含有G，N，和L的XhoI片段切出，克隆至pSAD-PMG的XhoI位点，得到具有将N基因克隆至第四位置的全长的狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-N4，而且其含有除了在狂犬病病毒基因组中位于G和L基因之间的N基因确切的狂犬病病毒全长序列。
为了选择具有N基因重新定位的这些病毒，这些含有全长病毒基因组的质粒分别单独与pTIT-N，pTIT-P，和TIT-L，如上所述转染到BSR T7/5细胞中(Wu等人，2001；Schnell等人，2000)。细胞用新鲜培养基悬浮，并且在将上清转移到BSR细胞之前另外培养3天。在感染后两天，用抗-狂犬病病毒N的抗体结合FITC检测病毒。正染的细胞表明感染性病毒成功拯救。这些病毒命名为L16N2G333，L16N3G333以及L16N4G333。这些病毒在BHK细胞中或者BHK-N细胞中增殖用于进一步的分析。
为了进一步分析这些重排的病毒，通过用每一种病毒在moi为1时感染BSR细胞来确定这些病毒的生长曲线。包括L16G333作为对照。在1小时吸收以后，2去除病毒接种物，而且用PBS洗细胞三次。然后加入新鲜培养基。在p.i.后6，12，18，24，36，60，和72小时从细胞培养基中等量取样，如所述用于病毒滴度测定(Wu等人，2001)。这一实验重复3次，而且对于每一个病毒的平均滴度用于比较。为了确定是否这些N-重新定位的病毒的病毒复制速率下降，用L16G333或者每一种N重新定位的病毒在moi为1时感染BSR细胞，而且在感染后40个小时应用前述方法(Wu等人，2001)收集细胞用于总RNA的分离。通过使用制备自N(Fu等人，1991)和G的cDNA(Fu等人，1993)为探针，利用Northern印迹杂交来分析RNA制备物的病毒基因组RNA和转录本。RNA的定量通过密度仪和磷成像对RNA条带分析进行。可选择的，如(Wertz等人，1998)所述的，用这些病毒感染的BSR细胞在存在放线菌素D(5μg/ml)的情况下，通过代谢用[3H]尿嘧啶(33uCi/ml)标记4小时进行标记。然后收集细胞用于RNA提取。RNA通过凝胶电泳分析并且通过密度仪定量。在这些病毒中确定和比较五个转录本和基因组RNA的摩尔比。
病毒生长曲线的研究表明，对于这些病毒，病毒的产量的顺序为L16G333，L16N2G333，L16N3G333，L16N4G333。在VSV的N的重新定位的研究中，发现对于N4病毒当与野生型VSV比较时病毒的产量下降了4个log单位(Wertz等人，1998)。对于L16N4G333病毒当与L16G333比较时病毒的产量下降了4个log单位。Northern印迹杂交和[3H]尿嘧啶标记的结果表明，对于N-重排病毒，当与L16G333相比，与最低的L16N4G333相比，病毒复制的速率(基因组RNA)下降。进一步，依赖于在病毒基因组N的相对位置，五种病毒的转录本的摩尔比例改变了。对于L16G333，转录本量的顺序为N＞P＞M＞G＞L；对于L16N2G333，P＞N＞M＞G＞L；对于L16N3G333，P＞M＞N＞G＞L；对于L16N4G333，P＞M＞G＞N＞L。这些数据一起表明通过在狂犬病病毒的基因组中，重排N，狂犬病病毒的复制速率下降，这可能导致N重排的病毒的毒力衰减。因为G在333位精氨酸的突变装配于这些N重排病毒中，这些N重排病毒中不仅仅复制速率下降，而且浸染神经系统的能力也下降。N-重排的狂犬病病毒，如果毒力足够地衰减，由于在N-重排病毒中的变化应当是不可回复的，所以在磷酸化位点上比N-突变的病毒更有优势(Wertz等人，1998)，其中在磷酸化位点的点突变(Wu等人，2002)可能回复到其致病性的基因型。如果这些N重排病毒的任何一个在通过i.c.接种中(参见下面)新生鼠中不再引起疾病，就有潜力发展成一种非致病的狂犬病病毒疫苗。
N-重排狂犬病病毒致病性的确定。为了确定N-重排狂犬病病毒的致病性，选择了两个年龄组的鼠(新生鼠和5到6周大小的鼠)。为了比较，包括L16G333。L16G333通过大脑内接种可以在新生鼠中诱发狂犬病，但是在老鼠中不诱发(Schumacher等人，1993)。测试了包括L16G333，L16N2G333，L16N3G333，和L16N4G333四个病毒。对于每一个病毒测定了三个不同的剂量水平(105，106，和107ffu)。对于这一实验总共需要12组5到6周年龄的ICR鼠(每一组十个，来自Harlan)。另外包括对照组。用10μl含有所需剂量通过i.c.接种感染动物。对于对照组，鼠中通过常规途径注射10μl盐水。每天观察动物两次共观察20天临床上的狂犬病症状如，ruff fur，共济失调。与瘫痪。垂死的鼠以及在实验最后的鼠通过吸入CO2安乐致死。记录每一组的死亡率，并且通过使用标准的T测验或者X2测验进行统计学分析。
为了测试这些病毒在新生动物中的致病率，本实验一共需要12窝ICR鼠。每一窝用一种病毒来感染。包括另外的一窝作为对照。新生鼠在一天大时用10μl体积的含有每一种病毒的所需剂量进行接种。对于对照组，新生鼠按照常规注射10μl盐水。每天观察动物两次共观察20天死亡的鼠，活着的鼠在实验结束时，通过吸入CO2安乐致死，记录每一窝的死亡率，并且通过使用标准的T测验或者X2测验进行统计学分析。
L16G333在5到6周龄的鼠中并不诱发疾病，对于N重排的鼠致病性的顺序为L16G333＞L16N2G333＞L16N3G333＞L16N4G333。由于这些病毒具有在G333位的精氨酸的突变，它们不能在5到6周的鼠中引起疾病，但是可以在新生鼠中致病。由于对于VSV的研究表明，对于N4病毒的复制速率严重降低(Wertz等人，1998)。对于L16N4G333的复制率也可能严重下降。由于L16N4G333在G的333位的精氨酸也有突变，其不仅复制速率降低，而且传播到CNS的能力也下降了。这样可能在新生鼠中不致病。如果这是事实，L16-N4G333将会开发成无毒的活狂犬病病毒疫苗。L16N2G333和L16N3G333也可能是在新生鼠中不致病，这样它们也可能开发成不致病的狂犬病病毒疫苗。
确定N重排狂犬病病毒的免疫原性。
为了确定这些N重排狂犬病病毒的免疫原性，选择成年鼠，测定包括L16G333，L16N2G333，L16N3G333和L16N4G333四种病毒。对于每一个病毒测试了三个剂量(105，106，和107ffu)而且这有助于确定可以刺激保护性免疫的病毒最小剂量。在三个接种方式中的每一个应用每一种的病毒剂量，它们是肌肉内(i.m.)，真皮内的(I.d.)，和皮下的(s.c.)。在本实验中需要总共36组ICR鼠(每一组10个)，包括另外的一组作为对照。动物用50μl体积含有所需病毒在所需剂量通过肌肉内，真皮内，或者皮下进行免疫。对照组的鼠并不免疫接种。在免疫后1，2，3，4周取鼠中的血测定VNA(Hable，1996；Briggs等人，1996)。在最后一次取血以后，如(Fu等人，1991)所述，在鼠的后腿用10MIMLD50(50％致死量)的CVS-24病毒进行诱发试验。每天观察动物两次神经学上的症状的发育以及死亡共进行20天。记录致死率并且对每一组动物进行统计学分析。
所有的N-重排狂犬病病毒通过这些免疫的双亲途径可以诱导免疫应答。这些病毒中没有一个在成年鼠中通过免疫的外周途径引起疾病。在用L16G333免疫的鼠中VNA发展的滴度可能高于那些用N-重排病毒免疫的鼠。由于复制速率的不同，VNA的水平可能的顺序为L16G333＞L16N2G333＞L16N3G333＞L16N4G333。有可能由这些N-重排病毒诱导的VNA水平相似。用这些病毒的任何一个的免疫导致保护一种风险。可以诱导如L16G333可比较的VNA而且提供100％的保护的病毒却不能在新生动物中致病，而且在体外的细胞培养中生长的最好，是选自在靶动物如浣熊，狗，甚至是人的进一步测试。
至于在N的磷酸化位点突变的病毒，由于对于VSV所报道的降低的复制速率，N-重排病毒可能在细胞培养中生长的不好(Wertz等人，1998)。这些病毒生长在稳定表达磷酸化N的BHK-N细胞中。由于复制速率的下降归因于在感染的细胞中N水平的下降(Wertz等人，1998)，对于这些N-重排病毒在BHK-N细胞中补充的N增加了病毒的产量。
由于在P的末端，P和M之间的基因间区域，到M转录本开始的区域与从M的末端，M和G基因之间的区域，以及到G转录本起始的区域，具有序列相似性，在质粒pSAD-PMG上在P-M和M-G接头处插入唯一的HpaI位点可能困难。因此PCR反应的退火温度发生了变化，筛选多个克隆，选择了唯一的所需的突变用于进一步的克隆。
正如对于VSV所报导的，N4是一个在VSV基因组中的第四位置突变的病毒，当接种较高的剂量时仍能在鼠中引起疾病和死亡(Wertz等人，1998)。如果具有重新定位的N的狂犬病病毒仍具有残余的毒性，在N的磷酸化位点的丝氨酸突变为Ala来进一步衰减N-重排的病毒。如果因为这些病毒的复制速率严重下降，由N-重排病毒诱导的免疫应答较低，利用增加G的表达来构建病毒，G是诱发保护性病毒中和抗体的唯一抗原(Cox等人，1977)。这通过在狂犬病病毒基因组中进行基因再重排来完成。
实施例8
通过在狂犬病病毒基因组中重排基因来构建无毒的狂犬病病毒而且确定这些再重排狂犬病病毒的致病性和免疫原性。除了在VSV基因组中N基因的重新定位，在VSV基因组中的基因再重排也导致VSV表型的变化(Ball等人，1999)。尽管再重排的VSV中的一些与野生型病毒相比，得到具有更致病的特性其它的再重排的VSV表现出在细胞培养中复制速率的下降以及在动物中致病性的下降(Ball等人，1999)。最重要的，从第四位置移动G到第一位置不仅仅导致病毒毒力的衰减，而且也引起在动物中免疫应答的增加和增强(Flanagan等人，2000)。这样，通过在狂犬病病毒基因组中再重排狂犬病病毒基因，尤其是通过移动G从第四位到第一位以及再重排P，M和G基因来构建无毒的狂犬病病毒。此外，在G中的333位精氨酸装配到每一个中，而且每一个再重排的病毒进一步衰减狂犬病病毒的毒力。
在病毒基因组中再重排狂犬病病毒基因构建无毒的狂犬病病毒为了在kqbbd基因组中再重排基因，按照以上描述的用于重新定位N基因的程序进行。为了构建G在第一位置的狂犬病病毒，使用质粒pGEM-GHL和pSAD-L16G333XhoI。首先，从质粒pSAD-L16G333XhoI中去除N，P，和M基因。合成两个引物(SEQ ID NOS：34和19)(5’ACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3’和5’CATTTTTGCTTTGCAATTGACAATGTC3’)而且通过使用PfuTurboHotstar DNA聚合酶(Lundberg等人，1991)(Stratagene)用于PCR反应。这两个引物将扩增出来7.3kb的片段，得到从N转录本的起始到M和G基因间的序列缺失了N，P，和M基因。PfuTurbo Hotstart DNA聚合酶在扩增的片段中产生平末端(Lundberg等人，1991)这样可以引起自连。连接好的质粒在突变接头处测序来进行确证在G的mRNA的前导序列和开始序列没有假的突变。得到的质粒命名为pSAD-L16G，构建了G在第一位置，同时N在第二位置(G1N2)，第三(G1N3)，或者第四位置(GlN4)的三个狂犬病病毒克隆。为了构建G1N2克隆，从N转录本开始到M的基因间序列(3.2kb)的N，P，和M基因从质粒pSAD-L16G333XhoI通过使用PfuTurbo Hotstar DNA聚合酶，用引物(SEQ ID NOS：22和35)(5’ACACCCCTACAATGGATGCCG3’和5’ATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3’)扩增。扩增的片段克隆至pGEN-GHL的HpaI位点。当通过序列分析确证后，选择具有正确插入方向的质粒。然后基因间序列通过使用引物SEQ ID NOS：36-37)(5’AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3’和5’GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCT3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-GNMPL。最后，从pGEM-GNMPL来的XhoI片段克隆至pSAD-G中，产生具有G基因在第一位置的全长狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-L16G1N2G333。
为了构建G1N3克隆从P转录本开始到M的基因间序列(3.2kb)的P，N，和M基因从质粒pSAD-PNMG如特定的目标2构建，通过使用PfuTurbo Hotstar DNA聚合酶，用引物(SEQ ID NOS：38-39)(5’ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3’和5’ATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3’)扩增。扩增的片段克隆至pGEN-GHL的HpaI位点。也按照具体的目标2构建。当通过序列分析确证后，选择具有正确插入方向的质粒。然后基因间序列通过使用引物SEQ ID NOS：40和37)(5’AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3’和5’GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCT3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-GPNML。最后，从pGEM-GPNML来的XhoI片段克隆至pSAD-G中，产生具有G基因在第一位置，N基因在第三位置的全长狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-L16G1N3G333。
为了构建G1N4克隆，从P转录本开始到N的基因间序列(3.2kb)的P，M，和N基因从质粒pSAD-PMNG构建，通过使用PfuTurbo HotstarDNA聚合酶，用引物(SEQ ID NOS：38和23)(5’ACACCCCTCCTTTCGAACCATCCC3’和5’GTTTTTTTCATGATGGATATACAC3’)扩增。扩增的片段克隆至pGEN-GHL的HpaI位点。当通过序列分析确证后，选择具有正确插入方向的质粒。然后基因间序列通过使用引物SEQ ID NOS：36-37)(5’AGAAAGAACAACTGGCAACACCCCT3’和5’GGGGTGTTGCCAGTTGTTCTTTCTG3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-GPMNL。最后，从pGEM-GPMNL来的XhoI片段克隆至pSAD-G中，产生具有G基因在第一位置，N基因在第四位置的全长狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-L16G1N4G333。
除了野生型病毒(P-M-G)，一共有五种可能的组合(P-G-M，M-P-G，M-G-P，G-M-P，和G-P-M)用于在狂犬病病毒基因组中再重排P，M，G基因。为了构建M-P-G，M-G-P和P-G-M，使用质粒pGEM-XhoI和pSAD-L16G333XhoI。首先，从质粒pSAD-L16G333XhoI中去除P基因。合成两个引物(SEQ ID NOS：41-42)(5’ACACCACTGATAAAATGAACCTCC3’和5’GTTTTTTTCATGATGGATATAGAG3’)而且通过使用PfuTurboHotstar DNA聚合酶(Lundberg等人，1991)(Stratagene)用于PCR反应。这两个引物将扩增出来9.5kb的片段，得到从P转录本的起始到P和M基因间的序列缺失了P基因。PfuTurbo Hotstart DNA聚合酶在扩增的片段中产生平末端(Lundberg等人，1991)这样可以引起自连。连接好的质粒在突变接头处测序来进行确证在N的3端不翻译序列，N的基因间序列，以及M的mRNA的起始序列没有假的突变。得到的质粒命名为pSAD-NMG。
为了再重排基因为顺序N-M-P-G-L，在质粒pSAD-NMG的在M和G的基因结合处产生一个HpaI的限制酶位点(GTTAC)。这通过使用引物如通过N基因的重新定位所述(SEQ ID NOS：26-27)(5’GATGTGAAAAAAACTGTTAACATCCCTC3’和5’AGGGATGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3’)的定点突变进行。突变通过序列分析确证后，质粒命名为pSAD-NMHG。最后，整个P基因，从转录本的起始到基因间的序列，通过使用引物(SEQ ID NOS：18和43)5’ACACCCCTCCTTTCGAACCATCC3’和5’CCTGTTTTTTTCATGTTGACTTTGGG3’用PfuTurbo DNA聚合酶扩增，而且克隆至pSAD-PMHG的HpaI位点。当通过序列分析确证后，选择具有正确插入方向的质粒。然后基因间序列通过使用如下的引物(SEQ ID NOS：24-25)(5’ATGGAAAAAAACAGGCAACTG3’和5’AGTTGCCTGTTTTTTTCCATG3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-NMPG。最后，从pGEM-XhoI来的XhoI片段克隆至pSAD-NMPG中，产生具有P基因位于M和G基因之间的全长狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-L16MPG。
为了再重排基因为顺序N-M-G-P-L，如上所述，扩增完整的P基因，并将其克隆到质粒pGEM-GHL唯一的HpaI位点。通过序列分析确证，选择正确插入方向的质粒。然后基因间序列通过使用如下的引物(SEQ ID NOS：32-33)(5’AACAACTGGCAACACTTCTC3’和5’AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-GPL。最后，从pGEM-GPL切出的XhoI片段克隆至pSAD-NMG的XhoI位点中，产生具有P基因位于G和L基因之间的全长狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-L16MGP。
为了再重排基因为顺序N-P-G-M-L，M基因从克隆pSAD-L16G333XhoI中去除。合成两个引物(SEQ ID NOS：44和43)
(5’ACATCCCTCAAAGACTCAAGG3’和5’CCTGTTTTTTTCATGTTGACTTTGG3’)而且通过使用PfuTurboHotstar DNA聚合酶(Lundberg等人，1991)(Stratagene)用于PCR反应。这两个引物将扩增出来9.5kb的片段，得到从M转录本的起始到M和G基因间的序列缺失了M基因。PfuTurbo Hotstart DNA聚合酶在扩增的片段中产生平末端(Lundberg等人，1991)这样可以引起自连。连接好的质粒在突变接头处测序来进行确证在P的3端非编码区，基因间序列，以及G的mRNA的起始序列没有假的突变。得到的质粒命名为pSAD-NPG。完整的M基因的扩增使用引物(SEQ IDNOS：45-46)(5’AACACCACTGATAAAATGAACCTCC3’和5’AATAGTTTTTTTCACATCCAAGAGG3’)，并将其克隆到质粒pGEM-GHL唯一的HpaI位点。通过序列分析确证，选择正确插入方向的质粒。然后基因间序列通过使用如下的引物(SEQ ID NOS：32-33)(5’AACAACTGGCAACACTTCTC3’和5’AGAAGTGTTGCCAGTTGTTC3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-GML。最后，从pGEM-GML切出的XhoI片段克隆至pSAD-NPG的XhoI位点中，产生具有M基因位于G和L基因之间的全长狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-PGM。
为了构建G-M-P和G-P-M，使用质粒pGEM-GML和pSAD-L16G333XhoI。首先，P基因和M基因从克隆pSAD-L16G333XhoI中去除。合成两个引物(SEQ ID NOS：34和42)
(5’ACATCCCTCAAAAGACTCAAGG3’和5’GTTTTTTTCATGATGGATATAGAG3’)而且通过使用PfuTurboHotstar DNA聚合酶(Lundberg等人，1991)(Stratagene)用于PCR反应。这两个引物将扩增出来8.5kb的片段，得到从P转录本的起始到M和G基因间的序列缺失了P基因和M基因。PfuTurbo Hotstart DNA聚合酶在扩增的片段中产生平末端(Lundberg等人，1991)这样可以引起自连。连接好的质粒在突变接头处测序来进行确证在N序列的3端，基因间序列，以及G的mRNA的起始序列没有假的突变。得到的质粒命名为pSAD-NG。
为了再重排基因至顺序N-G-M-P-L，在pGEM-GML的基因M和L之间产生一个唯一的HpaI位点。合成两个引物(SEQ ID NOS：47-48)(5’GATGTGAAAAAAACTGTTAACACTTCTC3’和5AGAAGTGTTAACAGTTTTTTTCACATCC3’)而且通过使用PfuDNA聚合酶进行PCR反应，突变通过序列分析确证而且质粒命名为pGEM-GMHL。然后整个P基因如上所述扩增克隆至pGEM-GMHL的HpaI位点。在通过序列分析确证后，选择具有正确插入方向的质粒。然后基因间序列通过使用引物SEQ ID NOS：49-50)(5’GATGTGAAAAAAACTATTAACACCC3’和5’GGTGTTAATAGTTTTTTTCACATCC3’)保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-GMPL。最后，从pGEM-GMPL来的XhoI片段克隆至pSAD-NG的XhoI位点中，产生具有N-G-M-P-L顺序基因的全长狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-L16GMP。
为了再重排基因至顺序N-G-P-M-L，在pGEM-GML的基因G和M之间产生一个唯一的HpaI位点。合成两个引物(SEQ ID NOS：51-52)(5’AGAAGAACAACTGTTAACACCACTG3’和5’AGTGGTGTTAACAGTTGTTCTTCTG3’)进行PCR反应，突变通过序列分析确证而且质粒命名为pGEM-GHML。然后整个P基因如上所述扩增克隆至pGEM-GHML的HpaI位点。在通过序列分析确证后，选择具有正确插入方向的质粒。然后基因间序列通过使用引物SEQ IDNOS：53-54)(5’AGAAGAACAACTAAGAACACCACTG3’和5’AGTGGTGTTCTTAGTTGTTCTTCTG3’)的定点突变保持。当通过序列分析确证后，选择具有正确基因间序列的质粒，并且命名为pGEM-GPML。最后，从pGEM-GPML来的XhoI片段克隆至pSAD-NG的XhoI位点中，产生具有N-G-P-M-L顺序基因的全长狂犬病病毒克隆。该质粒命名为pSAD-L16GPM。
为了选择具有再重排的狂犬病病毒，这些含有再重排基因的质粒分别单独与pTIT-N，pTIT-P，和TIT-L，如上所述转染到BSR T7/5细胞中(Schnell等人，2000)。细胞用新鲜培养基悬浮，并且在将上清转移到BSR细胞之前另外培养3天。在感染后两天，用抗-狂犬病病毒N的抗体结合FITC检测病毒。正染的细胞表明感染性病毒成功拯救。这些病毒分别命名为L16G1N2G333，L16G1N3G333以及L16G1N4G333，L16GMPG333，L16MGPG333，L16PGMG333，L16GPMG333，和L16MPGG333。这些病毒在BHK细胞中或者BHK-N细胞中增殖用于进一步的分析。
为了进一步分析这些再重排的病毒，通过用每一种病毒在moi为1时感染BSR细胞来确定这些病毒的生长曲线。包括L16G333作为对照。在1小时吸收以后，去除病毒接种物，而且用PBS洗细胞三次。然后加入新鲜培养基。在p.i.后6，12，18，24，36，60，和72小时从细胞培养基中等量取样，如所述用于病毒滴度测定(Wu等人，2001)。这一实验重复3次，而且对于每一个病毒的平均滴度用于比较。为了确定是否这些N-再重排病毒的病毒复制速率下降，病毒在moi为1ffu/细胞时感染BSR细胞，而且在感染后40个小时应用前述方法(Wu等人，2001)收集细胞用于总RNA的分离。通过使用制备自N(Fu等人，1991)和G的cDNA(Fu等人，1993)为探针，利用Northern印迹杂交来分析RNA制备物的病毒基因组RNA和转录本。RNA的定量通过密度仪和磷成像对RNA条带分析进行。可选择的，如(Wertz等人，1998)所述的，用这些病毒感染的BSR细胞在存在放线菌素D(5μg/ml)的情况下，通过代谢用[3H]尿嘧啶(33uCi/ml)标记4小时进行标记。然后收集细胞用于RNA提取。RNA通过凝胶电泳分析并且通过密度仪定量。在这些病毒中确定和比较五个转录本和基因组RNA的摩尔比。
构建和选择了G基因移到第一位的突变的狂犬病病毒。此外，这些病毒也具有G上的再333位精氨酸的突变。在突变病毒中的基因顺序通过RT-PCR确证。病毒生长曲线的研究表明，对于这些病毒，病毒的产量的顺序为L16G333，L16G1N2G333，L16G1N3G333以及L16G1N4G333。同样地，Northern印迹杂交和[3H]尿嘧啶标记的结果表明，病毒复制速率最高的是L16G333，随后是L16G1N2G333，L16G1N3G333，和L16G1N4G333。进一步，依赖于在病毒基因组这些基因的相对位置，五种病毒的转录本的摩尔比例改变了。对于L16G333，转录本量的顺序为N＞P＞M＞G＞L；对于L16G1N2G333，G＞N＞P＞M＞L；对于L16G1N3G333，G＞P＞N＞M＞L；对于L16G1N4G333，G＞P＞M＞N＞L。因为G在333位精氨酸的突变装配于这些再重排的病毒中，这些病毒不仅仅复制速率下降，而且浸染神经系统的能力也下降。
也构建和选择了在狂犬病病毒基因组中再重排的P，M，和G基因。此外，这些再重排的病毒也具有G上的再333位精氨酸的突变。在突变病毒中的基因顺序通过RT-PCR确证。如果再重排的VSV的结果是一种指示(Ball等人，1999)，病毒生长曲线的研究表明，对于这些病毒(L16MPGG333，L16MGPG333以及L16PGMG333)，病毒的产量高于L16G333。对于另外的再重排病毒(L16GPMG333和L16GMPG333)的产量低于L16G333。同样地，Northern印迹杂交和[3H]尿嘧啶标记的结果表明，病毒复制速率与L16G333相比对于L16MPGG333，L16MGPG333，L16PMGG333是增加，同时病毒的复制速率对于L16GPMG333，L16GMPG333是下降了。进一步，依赖于在病毒基因组这些基因的相对位置，五种病毒的转录本的摩尔比例改变了。对于L16G333，转录本量的顺序为N＞P＞M＞G＞L；对于L16MPGG333，N＞M＞P＞G＞L；对于L16MGPG333，N＞M＞G＞P＞L；对于L16PMGG333，N＞P＞M＞G＞L；对于L16GPMG333，N＞G＞P＞M＞L；以及L16GMPG333，N＞G＞M＞P＞L。因为G在333位精氨酸的突变装配于这些再重排的病毒中，这些病毒不仅仅复制速率下降，而且浸染神经系统的能力也下降。
确定这些再重排狂犬病病毒的致病性。为了确定这些再重排狂犬病病毒的致病性，选择了两个年龄组的鼠(新生鼠和5到6周大小的鼠)。测试了包括L16G333，L16G1N2G333，L16G1N3G333，和L16G1N4G333，L16PGMG333，L16GPMG333，L16GMPG333，L16MGPG333以及L16MPGG333九个病毒。对于每一个病毒测定了三个不同的剂量水平(105，106，和107ffu)。对于这一实验总共需要27组5到6周龄的ICR鼠(每一组十个，来自Harlan)。另外包括一个对照组。用10μl含有所需剂量通过i.c.接种感染动物。对于对照组，鼠中通过常规途径注射10μl盐水。每天观察动物两次共观察20天临床上的狂犬病症状如，ruff fur，共济失调。与瘫痪。垂死的鼠以及在实验最后的鼠通过吸入CO2安乐致死。记录每一组的死亡率，并且通过使用标准的T测验或者X2测验进行统计学分析。
为了测试这些病毒在新生动物中的致病率，本实验一共需要27窝ICR鼠。每一窝用一种病毒的一个剂量来感染。包括另外的一窝作为对照。新生鼠在一天大时用10μl体积的含有每一种病毒的所需剂量进行接种。对于对照组，新生鼠按照常规注射10μl盐水。每天观察动物两次共观察20天死亡的鼠，活着的鼠在实验结束时，通过吸入CO2安乐致死，记录每一窝的死亡率，并且通过使用标准的T测验或者X2测验进行统计学分析。
L16G333在5到6周龄的鼠中并不诱发疾病。可是在新生动物中诱发临床症状。由G移动到第一位置的病毒感染后，如L16G1N2G333，L16G1N3G333，和L16G1N4G333，由于所有这些病毒具有在G333位的精氨酸突变为谷氨酸，它们不能在5到6周的鼠中引起疾病。Ball等人(Ball等人，1999)报导，P，M，和G再重排的VSV的致病性并不与在细胞培养中的复制速率相关。只有那些比L16G333致病性低的那些病毒进行抗原性和免疫原性的测定。
确定这些再重排狂犬病病毒的免疫原性。
为了确定这些再重排病毒的免疫原性，选择成年鼠。测定了包括L16G333，L16G1N2G333，L16G1N3G333，和L16G1N4G333，L16PGMG333，L16GPMG333，L16GMPG333，L16MGPG333以及L16MPGG333九个病毒。对于每一个病毒测试了三个剂量(105，106，和107ffu)而且这将确定可以刺激保护性免疫的病毒最小剂量。在三个接种方式中的每一个应用每一种的病毒剂量，它们是肌肉内(i.m.)，真皮内的(I.d.)，和皮下的(s.c.)。在本实验中需要总共81组ICR鼠(每一组10个)，包括另外的一组作为对照。动物用50μl体积含有所需病毒在所需剂量通过肌肉内，真皮内，或者皮下进行免疫。对照组的鼠并不进行免疫接种。在免疫后1，2，3，4周取鼠中的血测定VNA(Hable，1996；Briggs等人，1996)。在所有组的鼠中，通过两相的相互作用的方差的统计分析比较VNA的发展情况(Littell等人，1996)。在免疫4周以后，如(Fu等人，1991)所述，在鼠的后腿用10MIMLD50(50％致死量)的CVS-24病毒进行诱发试验。每天观察动物两次神经学上症状的发育以及死亡共进行20天。记录致死率并且对每一组动物进行统计学分析。
所有的突变的狂犬病病毒通过这些免疫的双亲途径可以诱导免疫应答。这些病毒中没有一个在成年鼠中通过免疫的外周途径引起疾病。用那些G在第一位置病毒免疫的鼠比那些用L16G333免疫的鼠以及那些G在其它位置的再重排突变病毒中诱发出更快的和更高的VNA应答。因为快的免疫应答有必要来中和入侵的病毒以阻止感染CNS。再重排的病毒可以诱导与L16G333可比较的或者更高的VNA滴度，并且100％地保护免疫的动物对抗致病性狂犬病病毒，然而其还再新生动物通过i.c.感染(参见上面)中不能诱发任何疾病，通过不同的免疫途径在靶动物中如浣熊，狗，或者甚至是人，作为一种不致病的狂犬病病毒疫苗作进一步的测定。通过在微小基因组中以及在拯救的病毒中检测病毒的转录和复制来检查在磷酸化的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，天冬氨酸(D)，天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)以及谷氨酰胺(Q)的N的突变体的效应这些研究的结果揭示了当N没有磷酸化的时候，病毒的转录和复制下降，而且这样的N磷酸化在调节狂犬病病毒的转录和复制中起重要作用。更进一步，这些结果表明N的磷酸化对病毒的转录和复制的效果是由于磷酸组分所带的净的负电荷以及丝氨酸残基的结构。同时本方明在此通过引用参考不同的特定的材料，程序和实施例已经进行了描述和说明，应当认为本发明并不限制于特定的材料，组合的材料以及用于该目的选择的程序。这些细节的大量的变化对于那些本领域普通技术人员方便根据自身的要求进行选择。
以下是以上所揭示的与以上说明以及特定地对于实验程序和讨论相关的文件清单，这些文件在此一并完整地作为参考文献列出。
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                               序列表
<110>傅振芳
<120>通过核蛋白在磷酸化位点突变的减弱狂犬病病毒用于抗狂犬病的接种以及在CNS中的基因治疗
<130>033304-001
<160>64
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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gtttttttca tgatggatat agag                                          24
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agaagaacaa ctaagaacac cactg                                         25
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
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<210>55
<211>11928
<212>DNA
<213>狂犬病病毒
<400>55
acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa   60
cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt  120
gaagcctgag attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa  180
aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt  240
gtcaggcatg agcgccgcca aacttaatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc  300
aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa ttgtgattgc  360
acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga  420
agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca  480
tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa  540
cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc  600
ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg  660
gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat  720
tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc  780
aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat  840
actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca  900
ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa  960
atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020
ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080
aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140
aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 1200
tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttttcagg 1260
tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320
gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380
attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440
tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500
aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560
cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620
ggctcatctc caaggggaac ccatagaggt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680
tcacctggat gatggaaaat cgcccaacca tggtgagata gccaaggtgg gagaaggcaa 1740
gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800
cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860
gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920
tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980
gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040
aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggctacc aatgaagagg atgatctatc 2100
agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160
ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220
tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280
actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340
gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400
ttgctaaccg aacctctccc ctcagtccct ctagacaata aaatccgaga tgtcccaaag 2460
tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa cctcctacgt aagatagtga 2520
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<210>56
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<212>DNA
<213>狂犬病病毒
<400>56
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<210>57
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<213>狂犬病病毒
<400>57
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cctgaagatc acctcccctt ggggggttct ttttgaaaaa cctgggttca atagtcctcc 4980
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aatgtcatgg aatctaagat tgtattttgt catcactgaa aaactcttgg ccaactacat 7140
cttgccactt tttgacgcgc tgactatgac agacaacctg aacaaggtgt ttaaaaagct 72O0
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cctggactat gaaaagtgga acaaccatca aagattagag tcaacagagg atgtattttc 7320
tgtcctagat caagtgtttg gattgaagag agtgttttct agaacacacg agttttttca 7380
aaaggcctgg atctattatt cagacagatc agacctcatc gggttacggg aggatcaaat 7440
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aggcttacgg cagaagggct ggagtctagt cagcttattg atgatagata gagaatctca 7560
aatcaggaac acaagaacca aaatactagc tcaaggagac aaccaggttt tatgtccgac 7620
atacatgttg tcgccagggc tatctcaaga ggggctcctc tatgaattgg agagaatatc 7680
aaggaatgca ctttcgatat acagagccgt cgaggaaggg gcatctaagc tagggctgat 7740
catcaagaaa gaagagacca tgtgtagtta tgacttcctc atctatggaa aaaccccttt 7800
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tctgagcgct gaaggggaga gctttctcct agccatgtca aggataatct atctagatcc 8100
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<210>59
<211>523
<212>PRT
<213>狂犬病病毒
<400>59
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe ProIle Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
            20                 25                  30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
        35                  40                  45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu
    50                  55                  60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
                85                  90                  95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
            100                 105                 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu
        115                 120                 125
Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val Lys
    130                 135                 140
Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp Leu
145                 150                 155                 160
Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly Lys
                165                 170                 175
Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp
            180                 185                 190
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys Asp
        195                 200                 205
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu Thr
    210                 215                 220
Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala
225                 230                 235                 240
Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly
                245                 250                 255
Thr Trp Val Ser Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro
            260                 265                 270
Asp Lys Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His
        275                 280                 285
Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala
    290                 295                 300
Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser
305                 310                 315                 320
His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe
                325                 330                 335
Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr
            340                 345                 350
Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly Arg
        355                 360                 365
Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly
    370                 375                 380
Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln
385                 390                 395                 400
Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His Pro
                405                 410                 415
Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu Asp
            420                 425                 430
Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly Val
        435                 440                 445
Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly
    450                 455                 460
Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg
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Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly
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Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp
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<210>60
<211>523
<212>PRT
<213>狂犬病病毒
<400>60
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
            20                  25                  30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
        35                  40                  45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu
    50                  55                  60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
                85                  90                  95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
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Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu
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Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val Lys
    130                 135                 140
Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp Leu
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Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly Lys
                165                 170                 175
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            180                 185                 190
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys Asp
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Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly
    370                 375                 380
Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln
385                 390                 395                 400
Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His Pro
                405                 410                 415
Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu Asp
            420                 425                 430
Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly Val
        435                 440                 445
Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly
    450                 455                 460
Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg
465                 470                 475                 480
Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly
               485                 490                 495
Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp
            500                 505                 510
Glu Ser His LysSer Gly Gly Glu Thr Arg Leu
        515                520
<210>61
<211>450
<212>PRT
<213>狂犬病病毒
<400>61
Met Asp Ala Asp Lys Ile Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser
 1               5                  10                  15
Leu Lys Pro Glu Ile Ile Val Asp Gln Tyr Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala
            20                  25                  30
Ile Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys Ile Thr Leu Gly Lys Ala Pro Asp
        35                  40                  45
Leu Asn Lys Ala Tyr Lys Ser Val Leu Ser Gly Met Ser Ala Ala Lys
    50                  55                  60
Leu Asn Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe
65                  70                  75                  80
Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Val Ile
                85                  90                  95
Ala Arg Lys Gly Asp Lys Ile Thr Pro Gly Ser Leu Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu
        115                 120                 125
Thr Arg Asp Pro Thr Val Pro Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu
    130                 135                 140
Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Asn Thr Gly Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala
                165                 170                 175
Pro Phe Val Lys Ile Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys
            180                 185                 190
Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly
        195                 200                 205
Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile
    210                 215                 220
Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Leu Val
225                 230                 235                 240
Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala
                245                 250                 255
Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met
            260                 265                 270
Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His
        275                 280                 285
Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala
    290                 295                 300
Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly
305                 310                 315                 320
Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His
                325                 330                 335
Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys
            340                 345                 350
Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu
        355                 360                 365
Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp
    370                 375                 380
Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg
385                 390                 395                 400
Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu
                405                 410                 415
Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln
            420                 425                 430
Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Ser
        435                 440                 445
Asp Ser
    450
<210>62
<211>450
<212>PRT
<213>狂犬病病毒
<400>62
Met Asp Ala Asp Lys Ile Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Lys Pro Glu Ile Ile Val Asp Gln Tyr Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala
            20                  25                  30
Ile Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys Ile Thr Leu Gly Lys Ala Pro Asp
        35                  40                  45
Leu Asn Lys Ala Tyr Lys Ser Val Leu Ser Gly Met Ser Ala Ala Lys
    50                  55                  60
Leu Asn Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe
65                  70                  75                  80
Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Val Ile
                85                  90                  95
Ala Arg Lys Gly Asp Lys Ile Thr Pro Gly Ser Leu Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu
        115                 120                  125
Thr Arg Asp Pro Thr Val Pro Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu
    130                 135                 140
Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Asn Thr Gly Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala
                165                 170                 175
Pro Phe Val Lys Ile Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys
            180                 185                 190
Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly
        195                 200                 205
Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile
    210                 215                 220
Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Leu Val
225                 230                 235                 240
Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala
                245                 250                 255
Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met
            260                 265                 270
Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His
        275                 280                 285
Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala
    290                 295                 300
Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly
305                 310                 315                 320
Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His
                325                 330                 335
Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys
            340                 345                 350
Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu
        355                 360                 365
Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp
    370                 375                 380
Gly Thr Val Asn Ala Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg
385                 390                 395                 400
Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu
                405                 410                 415
Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln
            420                 425                 430
Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Ser
        435                 440                 445
Asp Ser
    450
<210>63
<211>450
<212>PRT
<213>狂犬病病毒
<400>63
Met Asp Ala Asp Lys Ile Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Lys Pro Glu Ile Ile Val Asp Gln Tyr Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala
            20                  25                  30
Ile Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys Ile Thr Leu Gly Lys Ala Pro Asp
        35                  40                  45
Leu Asn Lys Ala Tyr Lys Ser Val Leu Ser Gly Met Ser Ala Ala Lys
    50                  55                  60
Leu Asn Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe
65                  70                  75                  80
Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Val Ile
                85                  90                  95
Ala Arg Lys Gly Asp Lys Ile Thr Pro Gly Ser Leu Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu
        115                 120                 125
Thr Arg Asp Pro Thr Val Pro Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu
    130                 135                 140
Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Asn Thr Gly Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala
                165                 170                 175
Pro Phe Val Lys Ile Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys
            180                 185                 190
Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly
        195                 200                 205
Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile
    210                 215                 220
Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Leu Val
225                 230                 235                 240
Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala
                245                 250                 255
Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met
            260                 265                 270
Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His
        275                 280                 285
Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala
    290                 295                 300
Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly
305                 310                 315                 320
Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His
                325                 330                 335
Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys
            340                 345                 350
Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu
        355                 360                 365
Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp
    370                 375                 380
Gly Thr Val Asn Gly Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg
385                 390                 395                 400
Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu
                405                 410                 415
Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln
            420                 425                 430
Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Ser
        435                 440                 445
Asp Ser
    450
<210>64
<211>450
<212>PRT
<213>狂犬病病毒
<400>64
Met Asp Ala Asp Lys Ile Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser
 1               5                  10                  15
Leu Lys Pro Glu Ile Ile Val Asp Gln Tyr Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala
            20                  25                  30
Ile Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys Ile Thr Leu Gly Lys Ala Pro Asp
        35                  40                  45
Leu Asn Lys Ala Tyr Lys Ser Val Leu Ser Gly Met Ser Ala Ala Lys
    50                  55                  60
Leu Asn Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe
65                  70                  75                  80
Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Val Ile
                85                  90                  95
Ala Arg Lys Gly Asp Lys Ile Thr Pro Gly Ser Leu Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu
        115                 120                 125
Thr Arg Asp Pro Thr Val Pro Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu
    130                 135                 140
Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Asn Thr Gly Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala
                165                 170                 175
Pro Phe Val Lys Ile Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys
            180                 185                 190
Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly
        195                 200                 205
Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile
    210                 215                 220
Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Leu Val
225                 230                 235                 240
Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala
                245                 250                 255
Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met
            260                 265                 270
Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His
        275                 280                 285
Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala
    290                 295                 300
Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly
305                 310                 315                 320
Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His
                325                 330                 335
Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys
            340                 345                 350
Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu
        355                 360                 365
Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp
    370                 375                 380
Gly Thr Val Asn Gln Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg
385                 390                 395                 400
Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu
                405                 410                 415
Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln
            420                 425                 430
Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Ser
        435                 440                 445
Asp Ser
    450

Claims (20)

1.一种包括狂犬病病毒N蛋白的突变的狂犬病病毒，其中所述的N蛋白没有磷酸化。
2.如权利要求1所述的突变的狂犬病病毒，其中所述的N蛋白包括在389位不是丝氨酸的氨基酸。
3.如权利要求2所述的突变的狂犬病病毒，其中在389位的氨基酸是一种中性氨基酸。
4.如权利要求2所述的突变的狂犬病病毒，其中在389位的氨基酸是丙氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，天冬氨酸或者天冬酰胺。
5.如权利要求4所述的突变的狂犬病病毒，其中在389位的氨基酸是丙氨酸。
6.如权利要求2所述的突变的狂犬病病毒，其中所述的突变的狂犬病病毒N蛋白由SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63或者SEQ ID NO：64编码。
7.如权利要求6所述的突变的狂犬病病毒，其中所述的突变的狂犬病病毒N蛋白由SEQ ID NO：62编码。
8.如权利要求1所述的突变的狂犬病病毒，进一步包括一种突变的G糖蛋白。
9.如权利要求8所述的突变的狂犬病病毒，其中所述的G糖蛋白包括在333位不是精氨酸的氨基酸。
10.如权利要求9所述的突变的狂犬病病毒，其中所述的G糖蛋白包括在333位的谷氨酰胺。
11.一种包括如权利要求1-3和5-10中任何一项所述的突变的狂犬病病毒以及一种药学上可以接受的载剂的疫苗组合物。
12.如权利要求11的疫苗组合物在制备在哺乳动物中诱发对狂犬病病毒免疫应答的药物中的应用。
13.如权利要求11的疫苗组合物在制备保护哺乳动物免受狂犬病的药物中的应用。
14.一种产生如权利要求1所述的突变的狂犬病病毒的宿主细胞，包括一种产生一种野生型狂犬病病毒N蛋白的哺乳动物宿主细胞。
15.如权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是仓鼠细胞。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是BHK细胞。
17.如权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞以保藏号ATCC PTA-3544保藏。
18.一种用于产生突变的狂犬病病毒的方法，包括在如权利要求14的宿主细胞中生长所述的突变的狂犬病病毒。
19.一种用于传送一种基因至人或者动物细胞的载体，包括可操作地插入到如权利要求1-10中任何一项所述的狂犬病病毒中的待传送基因。
20.如权利要求19的载体在制备用于传送一种基因至人或者动物细胞的药物中的应用。
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