JP2005065596A - 増殖能欠損狂犬病ウイルス - Google Patents

Abstract

【課題】 非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスの増殖能欠損ウイルス、その製造方法、及びそのウイルスベクター、ワクチン等の用途を提供すること。
【解決手段】 狂犬病ウイルスをｃＤＮＡプラスミドより作製する方法（ｃＤＮＡプラスミドからの狂犬病ウイルスの回収）を用いて、Ｐ遺伝子欠損狂犬病ウイルスを作製することにより、ウイルス増殖能を欠損した狂犬病ウイルスを作製することがでる。該ウイルスは、特殊な細胞（狂犬病ウイルスＰタンパク質を発現している細胞）にのみ感染可能で、増殖することから、安全なワクチンとして使用することができ、かつ、ウイルスベクターとして利用することができる。また、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んで、医薬デリバリー用組成物として利用することができる。

Description

本発明は、非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスの増殖能欠損ウイルス、その製造方法、及びその利用に関する。

狂犬病ウイルスは、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科リッサウイルス（Lyssavirus）属に属し、そのゲノムは非分節、マイナス鎖ＲＮＡで、５つの構造タンパク質：Ｎ（nucleoprotein）、Ｐ（phosphoprotein）、Ｍ（matrix protein）、Ｇ（glycoprotein）及びＬ（large protein）をコードしている。ウイルスＲＮＡポリメラーゼはＬ及びＰタンパク質からなる。Ｌタンパク質はウイルスＲＮＡポリメラーゼの主要な触媒サブユニットであり、Ｐタンパク質は非触媒サブユニットとして機能することが知られている（J. Virol., 72: 1925-1930, 1998; Virology, 214: 522-530, 1995）。Ｐタンパク質はリン酸化の程度の違いによってヌクレオカプシドとの親和性が異なり、それによって転写及び複製活性が調節されていると考えられている（Virology, 200:590-597, 1994; J.Virol., 75: 9613-9622, 2001; Microbiol.Immunol., 42: 761-771, 1998）。最近、Ｐ蛋白の更なる機能として細胞質ダイニン・ライトチェーン（ＬＣ８）との相互作用が示され、狂犬病ウイルスの逆行性軸索輸送への関与が示唆されている（J.Virol., 74: 10217-10222, 2000; J. Virol., 74: 10212-10216, 2000）。更に、その結合が狂犬病ウイルスの病原性に影響を与えることも調べられている。

マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおける逆遺伝学（reverse genetics）の開発によって、ゲノムの構成を操作することが可能になってきた（EMBO Ｊ. 13: 4195-4203, 1994）。ウイルス蛋白の機能解明、又は弱毒生ワクチンやウイルスベクターの開発を目的として、いくつかのマイナス鎖ＲＮＡウイルスで逆遺伝学の手法が応用されてきている（Annu. Rev. Genet., 32: 123-162, 1998; J.Gen.Virol., 83: 2635-2662, 2002）。外来遺伝子を発現するワクチンとして、例えばＨＩＶ−１のＧａｇやＥｎｖ或いはインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を発現する狂犬病ウイルスや水泡性口内炎ウイルスベクターが開発され、その高い効果が示されている（J.Virol., 76: 7506-7517, 2002; J.Virol., 77: 237-244, 2003; J.Virol., 76: 8900-8907, 2002; J. Virol., 73: 3723-3732, 1999）。また、水泡性口内炎ウイルの遺伝子順序を入れ替えることで弱毒生ワクチンを作製するという新しいアプローチを試みたものもある（J.Virol.,74: 7895-7902, 2000; J.Virol., 75: 6107-6114, 2001）。

逆遺伝学による遺伝子欠損ウイルスの作製は、インフルエンザＡウイルスのＭ２やＮＳ遺伝子、センダイウイルスのＦ遺伝子欠損で報告されており、これらはウイルスベクターあるいは弱毒生ワクチンとしての有用性が示されている（J.Virol., 74: 6564-6569, 2000; J.Virol., 75: 5656-5662, 2001; Virology, 299: 266-270, 2002; J.Virol., 76: 767-773, 2002）。狂犬病ウイルスの遺伝子欠損ウイルスはConzelmannの研究室で作製されている。ＧやＭ遺伝子欠損ウイルスが作製され、ウイルス粒子の構成物や出芽に関する特性を明らかにするために用いられた（Cell, 84: 941-951, 1996; J.Virol., 73: 242-250, 1999）。このウイルスの生ワクチンとしての応用に関してはまだ報告されていない。

狂犬病ウイルスをベクターとして用いることも既に周知のところである。狂犬病ウイルスは、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスであり、ラブドウイルス科リッサウイルス属に属するが、モノネガウイルスの完全長ｃＤＮＡからウイルスを回収する方法は、狂犬病ウイルスを用いてSchnellらにより１９９４年に初めて開発された（EMBO J. 13, 4195-4203, 1994）。この狂犬病ウイルスｃＤＮＡ発現系は、欧州のワクチン株であるＳＡＤ Ｂ１９株（Virology 175, 485-499, 1990）を用いて開発された。この方法は、狂犬病ウイルスの詳細な分子生物学的解析及びワクチン・ベクター開発などの研究を可能にした（特開平８−１６８３８１号公報）。
特開平８−１６８３８１号公報。 J. Virol., 72: 1925-1930, 1998。 Virology, 214: 522-530, 1995。 Virology, 200: 590-597, 1994。 J.Virol., 75: 9613-9622, 2001。 Microbiol.Immunol., 42: 761-771, 1998。 J. Virol., 74: 10217-10222, 2000。 J. Virol., 74: 10212-10216, 2000。 EMBO Ｊ. 13: 4195-4203, 1994。 Annu. Rev. Genet., 32: 123-162, 1998。 J. Gen. Virol., 83: 2635-2662, 2002。 J. Virol., 76: 7506-7517, 2002。 J. Virol., 77: 237-244, 2003。 J. Virol., 76: 8900-8907, 2002。 J. Virol., 73: 3723-3732, 1999。 J. Virol., 74: 7895-7902, 2000。 J. Virol., 75: 6107-6114, 2001。 J. Virol., 74: 6564-6569, 2000。 J.Virol., 75: 5656-5662, 2001。 Virology, 299: 266-270, 2002。 J. Virol., 76: 767-773, 2002 Cell,84: 941-951, 1996。 J. Virol., 73: 242-250, 1999。 Virology 175, 485-499, 1990。

本発明の課題は、非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスの増殖能欠損ウイルス、その製造方法、及びそのウイルスベクター、ワクチン等の用途を提供することにある。

本発明者は、非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスの構造タンパク質について研究する中で、狂犬病ウイルスをｃＤＮＡプラスミドより作製する方法（ｃＤＮＡプラスミドからの狂犬病ウイルスの回収）を用いて、Ｐ遺伝子欠損狂犬病ウイルスを作製することにより、ウイルス増殖能を欠損した狂犬病ウイルスを作製することができ、該ウイルスが安全なワクチンとして使用することができ、かつ、ウイルスベクターとして利用することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスの全長ゲノムｃＤＮＡからＰ遺伝子を取り除いたｃＤＮＡプラスミドを作製し、これをＰタンパク質を発現している細胞に感染させると、Ｐ遺伝子を欠損した狂犬病ウイルスを産生することができる。この狂犬病ウイルスはウイルスの複製に必要なＰ遺伝子を持たないため、細胞への一回の感染は行うが、以後の感染の拡大はない。しかしながら、この欠損ウイルスをＰタンパク質を発現している細胞に感染させると、細胞からのＰタンパク質がウイルスの増殖を補い、感染が拡大していく。この系を利用して作製したＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスは、特殊な細胞（狂犬病ウイルスＰタンパク質を発現している細胞）にのみ感染可能で、増殖することから、安全な生ワクチンとしての利用に適切な材料となり得る。

更に、Ｐ遺伝子欠損狂犬病ウイルスに外来遺伝子を導入することにより、ウイルスベクターとしての利用が可能となる。本発明のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスは、免疫刺激性サイトカイン遺伝子、アポトーシス遺伝子又は野外狂犬病ウイルスＧ遺伝子等の遺伝子を組み込んで、そのワクチン効果を増強させることができ、更に、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を細胞に導入するためのウイルスベクターとして用いることができる。また、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んで、医薬デリバリー用組成物として利用することができる。

具体的には、本発明は、非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスからＰタンパク質発現遺伝子機能を欠損させた増殖能欠損狂犬病ウイルス（請求項１）や、Ｐタンパク質発現遺伝子機能の欠損が、Ｐタンパク質遺伝子の一部又は全部の欠損によるものであることを特徴とする請求項１記載の増殖能欠損狂犬病ウイルス（請求項２）や、非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスがＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株であることを特徴とする請求項１又は２記載の増殖能欠損狂犬病ウイルス（請求項３）や、狂犬病ウイルスの完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドからＰ遺伝子の一部又は全部を欠損させたＰ遺伝子欠損ｃＤＮＡプラスミド（請求項４）や、狂犬病ウイルスの完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドからのＰ遺伝子の一部又は全部の欠損が、該完全長ゲノムｃＤＮＡからの、配列表の配列番号１記載の塩基配列の一部又は全部の欠損であることを特徴とする請求項４記載のＰ遺伝子欠損ｃＤＮＡプラスミド（請求項５）や、狂犬病ウイルスの完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドが、狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株の完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドであることを特徴とする請求項４又は５記載のＰ遺伝子欠損ｃＤＮＡプラスミド（請求項６）
からなる。

また本発明は、請求項４〜６のいずれか記載のＰ遺伝子欠損ｃＤＮＡプラスミドを、Ｐタンパク質を発現している細胞に感染させ、増殖することを特徴とするＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスの製造方法（請求項７）や、Ｐタンパク質を発現している細胞が、Ｐ遺伝子を含むベクターを導入した細胞であることを特徴とする請求項７記載のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスの製造方法（請求項８）や、Ｐ遺伝子を含むベクターを導入した細胞が、Ｐ遺伝子を含むプラスミドを、Ａ／Ｊマウス由来の神経芽腫ＮＡ細胞又はシリアンハムスター由来のＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした細胞であることを特徴とする請求項７記載のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスの製造方法（請求項９）からなる。

さらに本発明は、請求項１〜３のいずれか記載のＰタンパク質発現遺伝子機能を欠損した狂犬病ウイルスからなることを特徴とするワクチン（請求項１０）や、Ｐタンパク質発現遺伝子機能を欠損した狂犬病ウイルスに、ワクチン効果を増強させる遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１０記載のワクチン（請求項１１）や、ワクチン効果を増強させる遺伝子が、免疫刺激性サイトカイン遺伝子、アポトーシス遺伝子又は野外狂犬病ウイルスＧ遺伝子であることを特徴とする請求項１１記載のワクチン（請求項１２）や、請求項１〜３のいずれか記載のＰタンパク質発現遺伝子を欠損した狂犬病ウイルスからなることを特徴とするウイルスベクター（請求項１３）や、請求項１３記載のウイルスベクターに外来遺伝子を組込んだ外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターを、Ｐタンパク質を発現している細胞にトランスフェクトさせ、外来遺伝子組換え狂犬病ウイルスを作製することを特徴とする外来遺伝子の発現方法（請求項１４）や、請求項１４記載の外来遺伝子組換え狂犬病ウイルスを、Ｐ遺伝子を発現している細胞に感染させ、発現することを特徴とする外来遺伝子の発現方法（請求項１５）や、外来遺伝子が、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１４又は１５記載の外来遺伝子の発現方法（請求項１６）や、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ請求項１３記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと、医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び賦形剤から選択される１又は２以上の補助剤からなる医薬デリバリー用組成物（請求項１７）からなる。

本発明は、Ｐ遺伝子欠損狂犬病ウイルス及びその製造法を提供する。すなわち、狂犬病ウイルスの全長ゲノムｃＤＮＡからＰ遺伝子を取り除いたｃＤＮＡプラスミドを作製し、Ｐタンパク質を発現している細胞に感染させ、Ｐ遺伝子を欠損した狂犬病ウイルス粒子を産生する。Ｐ遺伝子は、ウイルスの複製（増殖）に必要なＰタンパク質の遺伝子であるため、Ｐ遺伝子欠損ウイルスは、細胞には感染するがその感染細胞内でウイルスの複製（増殖）は起こらない。人工的に細胞にＰ遺伝子を導入し、Ｐタンパク質を発現すれば該細胞においてはウイルス粒子の複製が起こる。この系を用いたＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスは、特別な細胞でのみ増殖するため、安全な生ワクチンとなる。更に、外来遺伝子を導入することにより、ウイルスベクターとして利用することが可能である。更に、本発明のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスは、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ医薬デリバリー用組成物として利用することができる。

本発明は、非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスからＰタンパク質発現遺伝子機能を欠損させた増殖能欠損狂犬病ウイルスからなる。狂犬病ウイルスは、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科リッサウイルス（Lyssavirus）属に属し、そのゲノムは非分節、マイナス鎖ＲＮＡで、５つの構造タンパク質：Ｎ（nucleoprotein）、Ｐ（phosphoprotein）、Ｍ（matrix protein）、Ｇ（glycoprotein）及びＬ（large protein）をコードしていることで知られている（Field Virology, 3^rd., vol.1, p1137-1159, 1996; Field Virology,3^rd., vol.1, p1121-1135, 1996）。Ｐ遺伝子欠損狂犬病ウイルスを製造するには、狂犬病ウイルスの全長ゲノムｃＤＮＡからＰ遺伝子を取り除いたｃＤＮＡプラスミドを作製し、該プラスミドをＰタンパク質を発現している細胞に感染させ、複製する。

すなわち、概略的には次のようにして大量に増殖させる。
１．狂犬病ウイルスの完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドからＰ遺伝子領域を取り除いた、Ｐ遺伝子欠損ゲノムのｃＤＮＡプラスミドを作製する。
２．狂犬病ウイルスｃＤＮＡプラスミド発現系を利用してＰ遺伝子欠損ウイルスを作製する。
３．Ｐタンパク質定常発現領域にＰ遺伝子欠損ウイルスを感染させることにより、Ｐ遺伝子欠損ウイルスを多量に増殖させる。

狂犬病ウイルスの完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドとしては、狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株の完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドを挙げることができる。

組み換え型ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株全長ｃＤＮＡの配列は、アクセッションナンバーAB085828としてGen Bankデータベースに登録されており、該配列情報を検索することができる。全長ｃＤＮＡベクター（pHEP-3.0）の構築については、既に論文に掲載されている（J. Virol. Methods 107: 229-236, 2003）。狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株の完全長ゲノムｃＤＮＡベクターにおいて、Ｐタンパク質をコードする遺伝子の配列を配列表の配列番号１に示す。また、Ｐタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。全長ｃＤＮＡ配列から、Ｐタンパク質をコードする遺伝子配列を除去するには、公知の遺伝子操作技術を用いて行うことができる。

Ｐタンパク質をコードする遺伝子配列全長を除去するためには、例えば、制限酵素ＡｖｒII及びＢｌｐＩで切断した全長ｃＤＮＡベクター（pHEP-3.0）に、別途、Ｎ遺伝子のＡｖｒIIサイト周辺のプライマー及びＮ遺伝子の終止コドン下流にＢｌｐＩサイトを導入できるプライマーを用いて増幅し、調製したＰＣＲ断片を組込んで行うことができる。また、Ｐ遺伝子欠損ウイルスを作製するために、完全長ゲノムｃＤＮＡ配列から、Ｐタンパク質をコードする全遺伝子配列を除去する方法に代えて、該Ｐタンパク質をコードする遺伝子配列の一部を欠失させて、Ｐタンパク質発現遺伝子の遺伝子機能を欠損させることにより行うこともできる。

全長ｃＤＮＡ配列から、Ｐタンパク質をコードする遺伝子配列を欠失させた狂犬病ウイルスｃＤＮＡプラスミドを、Ｐタンパク質を定常発現する細胞に導入させる（トランスフェクト）ことにより、Ｐ遺伝子欠損ウイルスを多量に増殖させ、回収することができる。すなわち、Ｐ遺伝子は、ウイルスの複製（増殖）に必要なＰタンパク質の遺伝子であり、Ｐ遺伝子欠損ウイルスは、細胞には感染するがその感染細胞内でウイルスの複製（増殖）は起こらない。したがって、人工的にＰ遺伝子を導入し、Ｐタンパク質を発現している細胞においてのみウイルス粒子の複製が可能となる。Ｐタンパク質を発現する細胞としては、例えば、Ａ／Ｊマウス由来の神経芽腫細胞であるＮＡ細胞、或いはシリアンハムスターの腎臓由来のＢＨＫ−２１細胞に、Ｐ遺伝子を含むｐＨ−Ｐプラスミドをトランスフェクションした、ＮＡ−Ｐ細胞及びＢＨＫ−Ｐ細胞（J. Virol. Methods 107: 229-236, 2003）を用いることができる。

本発明のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスは、安全な生ワクチンとして用いることができる。すなわち、本発明のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスは、ウイルスの複製に必要なＰ遺伝子を持たないため、細胞への一回の感染は行うが、以後の感染の拡大はないと考えられる。しかしながら、この欠損ウイルスをＰタンパク質を発現している細胞に感染させると、細胞からのＰタンパク質がウイルスの増殖を補い、感染が拡大していく。この系を利用して、Ｐ遺伝子欠損狂犬病ウイルスは特殊な細胞（狂犬病ウイルスＰタンパク質を発現している細胞）にのみ感染可能で、増殖することから、安全な生ワクチンとして使用することができる。本発明のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスをワクチンとして用いる場合には、該Ｐ遺伝子欠損狂犬病ウイルスに免疫刺激性サイトカイン遺伝子、アポトーシス遺伝子又は野外狂犬病ウイルスＧ遺伝子のようなワクチン効果を増強させる遺伝子を導入して、そのワクチン効果を増強させることができる。

また、本発明のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスは、外来遺伝子を組込んで外来遺伝子発現用の組換えウイルス発現ベクターとして用いることができる。該ウイルス発現ベクターを用いて外来遺伝子を発現するためには、外来遺伝子を組込んだウイルス発現ｃＤＮＡプラスミドを、Ｐタンパク質を発現している細胞にトランンスフェクトさせ、該外来遺伝子を組込んだ組換えウイルスを作製し、Ｐ遺伝子を発現している細胞に感染させ、発現することにより行うことができる。外来遺伝子としては、特に制限はないが、例えば、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子等を挙げることができる。

更に、本発明のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスベクターは、外来遺伝子の標的細胞での発現に用いることができる。本発明のウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することにより、外来遺伝子を標的細胞で発現することができる。したがって、本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んで、薬理活性を有するペプチド（医薬）のデリバリーシステムとして用いることができる。そのようなデリバリーシステム用の組成物としては、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ、外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤等を適宜配合して、医薬デリバリー用組成物として用いることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［材料と方法］
（細胞及びウイルス）
Ａ／Ｊマウス由来の神経芽腫細胞であるＮＡ細胞は１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地中で３７℃で培養した。ＢＨＫ−２１細胞は１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地中で３７℃で培養した。Ｐタンパク質発現細胞系を確立するため、Ｐ遺伝子を含むｐＨ−ＰプラスミドをＮＡ及びＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした。これらの細胞は数週間、Zeocine耐性によって選択された。耐性細胞をクローニングし、Ｐタンパク質の発現を抗Ｐタンパク質抗体による免疫蛍光染色によって確認した。得られたＰタンパク質発現細胞は、ＮＡ−Ｐ及びＢＨＫ−Ｐ細胞と呼ぶ。

（狂犬病ウイルスＰタンパク質単一特異性抗血清の精製）
ＣＶＳ−１１株のＰタンパク質をコードするｃＤＮＡをバクテリア発現ベクターであるpQE-9に導入した。原核細胞性のヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ付き組換えＰタンパク質を発現させ、精製した。精製したＰタンパク質はフロインドの完全アジュバントに乳化させ、メスのニホンシロウサギに皮下接種した。フロインドの不完全アジュバントと混和したｒＰタンパク質を３回のブースター免疫した後、ウサギの血液から免疫血清を採取し、狂犬病ウイルスタンパク質との免疫ブロット解析によって評価した。

（完全長ｃＤＮＡからＰ遺伝子を欠損させたプラスミドの構築）
組換え型ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株全長ｃＤＮＡの配列はGen Bankデータベースに登録してある（アクセッションナンバー：AB085828）。全長ｃＤＮＡベクターpHEP-3.0の構築については他の論文に掲載されている。簡単に述べると、全長ｃＤＮＡ配列を２タイプのリボザイムｃＤＮＡで挟み、正確な５'及び３'末端を持つ全長ＲＮＡ転写物が得られるようにし、その転写はＣＭＶプロモーターによって調節されるように構築した。Ｐ遺伝子欠損ｃＤＮＡを構築するため、Ｎ遺伝子のAvr IIサイト周辺のプライマー、Ｈ−Ａｖｒ５：5'- TATAACcctaggGAAAGCCC -3'（Avr IIサイトを小文字で示す：配列番号３）及びＮ遺伝子の終止コドン下流にBlp Iサイトを導入できるプライマー、Ｎstop−Ｂｌｐ３：5'- GTCgcttagcTCCTTATGAGTCACTCG -3'（Blp Iサイトを小文字で示す：配列番号４)でＰＣＲ断片を増幅した。Ｐタンパク質コード領域を除去するため、このＰＣＲ断片をAvr II及びBlp Iで切断したpHEP-3.0に組み込んだ。得られたプラスミドはp3.1-defPとした（図１Ａ）。

（狂犬病ウイルスの回収）
組換えウイルスは以前に述べた方法で回収した。トランスフェクション細胞としてＰタンパク質を供給できるＢＨＫ−Ｐ細胞を用いた。ＢＨＫ−Ｐ細胞は１０％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭで、６ｗｅｌｌプレートに８０％コンフルエントになるよう一晩培養した。トランスフェクションする前に培養液を新鮮なものに取り換え、p3.1-delP ２．０μｇ、pH-N ０．５μｇ、pH-P ０．２５μｇ、pH-L ０．１μｇ、pH-G ０．１５μｇをTransIT LT-1を用いてトランスフェクションした。Ｇタンパク質をコードするpH-Gのトランスフェクションはウイルス回収に必須ではないが、Ｇ蛋白の供給は時にウイルス産生効率を改善する。１６から２４時間後に細胞を洗い、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭで２〜５日間培養した。培養液を新たにＢＨＫ−Ｐ細胞に加え、３４℃で３日間培養した。その培養上清を回収し、その後の実験に用いるウイルスストックとして力価を測定した。回収されたp3.1-defPのウイルスは、Ｐ遺伝子欠損ウイルス（ｄｅｆ−Ｐウイルス）とした。

（免疫蛍光染色及びウイルスの力価の測定）
回収ウイルスの存在は、ＦＩＴＣ−抗狂犬病Ｎタンパク質抗体を用いた免疫蛍光アッセイによってＢＨＫ−Ｐ細胞で行った。ウイルス液を１０倍階段希釈で単層培養、９６ｗｅｌｌのＢＨＫ−Ｐに添加し３４℃で感作させた。４８時間後に８０％アセトンで細胞を固定し、ＦＩＴＣ−抗狂犬病Ｎタンパク質抗体で染色した。蛍光顕微鏡下でフォーカスを数え、ＦＦＵ／ｍｌを算出した。力価測定は全て３組で行い平均値を力価とした。

（ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの増幅）
ウイルスゲノムのＰ遺伝子欠損を確認するため、ｄｅｆ−Ｐウイルス感染細胞内のゲノム鎖ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅した。感染細胞からISOGENで全ＲＮＡを抽出した。ＲＴ反応はＮ遺伝子終止コドン上流に位置する狂犬病ウイルス特異的プライマーＮＳ５−１を用いてAMV-RTaseで４２℃ １時間行った。ＲＴ産物は、EX TaqとＮＳ５−１及びＮＳ３−１（Ｍ遺伝子スターとコドンの下流に位置する）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ＥｔＢｒ染色で検出した。ＰＣＲ断片の予想サイズは、ｒＨＥＰが１１６６ｂｐ、ｄｅｆ−Ｐが２３４ｂｐである。

ｄｅｆ−Ｐ感染ＢＨＫ及びＢＨＫ−Ｐ細胞内でのウイルス転写産物量決定のため、感染細胞内のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅した。ウイルス感染細胞から全ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマーでＲＴ反応を行った後、狂犬病ウイルスＮ、Ｐ、Ｇ遺伝子及びインターナルコントロールとしてＧ３ＰＤＨ遺伝子をＮ５−ａ／Ｎ３−ａ、ＨＰ−start5／ＨＰ−Bpu3、Ｃ５−ａ／Ｃ３−ａ及びＧ３ＰＤＨ sense／Ｇ３ＰＤＨ antisenseプライマーを用いて、それぞれ６８４、８８２、８１６及び３８４ｂｐを増幅した。

（乳のみマウスにおける病原性の解析）
ＩＣＲ乳のみマウスに、各希釈のウイルス液２０μｌを脳内接種した。感染後２週間経過を観察した。

（免疫及びワクチン防御効果）
ワクチン防御効果は、ＮＩＨ標準試験に従って行った。６週令のメスのＩＣＲマウスに１０倍階段希釈で、０．５ｍｌの組換えウイルス液を１週間間隔で２回腹腔内接種した。ワクチンのコントロールとして、日本の精製ニワトリ胚細胞培養狂犬病ワクチン（ＰＣＥＣＶ）を１０倍希釈で接種した。最初の接種から２週間後にＣＶＳ株を３０μｌ、５０ＬＤ₅₀で脳内接種し、臨床兆候の経過を２週間観察した。ＣＶＳ株接種の１日前に、免疫マウスの眼窩静脈叢から血液を採取し、血清中の中和抗体価を測定した。

（ウイルス中和抗体価（ＶＮＡ）の測定）
ワクチンウイルス接種後に、各マウスから５０μｌ／匹を超えないよう眼窩採血した。１０倍希釈した各血清を４倍階段希釈でのＲＦＦＩＴ法によって、中和抗体価（virus-neutralizing antibody：ＶＮＡ）を測定した。攻撃ウイルス（ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株）を５０％中和する最も高い希釈倍率の逆数を中和抗体価とし、ＷＨＯの抗狂犬病標準抗体を用いて、ＩＵに換算した。それぞれ６匹のマウスの抗体価から幾何平均値を算出した。

［結果］
（Ｐ遺伝子欠損プラスミドの構築とＰ遺伝子欠損ウイルスの回収）
リバースジェネティックス（reverse genetics）によるＰ遺伝子欠損ウイルス粒子作製のため、Ｐ遺伝子を完全に欠くｃＤＮＡプラスミドを構築した。Ｐタンパク質コード領域を図１のＡに示すようにＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ全長ｃＤＮＡプラスミド（ｐＨＥＰ−３．０）から取り除いた。作製したＰ遺伝子欠損プラスミド（p3.1-defP）をウイルスＲＮＡの転写と複製をサポートするヘルパー・プラスミドと共にトランスフェクションした。基本的には１）p3.1-defP、pH-N、pH-p、pH-LをＢＨＫ細胞に、２）p3.1-defP、pH-N、pH-Lを、Ｐタンパク質を構成的に発現しているＢＨＫ−Ｐ細胞（図２Ｄ）にトランスフェクションすることで、Ｐ遺伝子欠損ウイルス粒子（ｄｅｆ−Ｐウイルス）を産生することができる。しかしながら、どちらの実験も回収効率はきわめて低かった。

そこで材料と方法で述べたように、p3.1-defPをpH-N、pH-L、pH-PそしてpH-Gと共に、ＢＨＫ−Ｐ細胞にトランスフェクションした。この条件においてｄｅｆ−Ｐウイルスの産生は非常に効率的であった。Ｐタンパク質が量的に充分供給されることがｄｅｆ−Ｐウイルスの増幅を促進した。このトランスフェクションの培養上清をＢＨＫ−Ｐ又はＮＡ−Ｐ細胞に移すことでさらなる増殖が可能となる（図１Ｂ）。この時のＢＨＫ−Ｐ細胞培養中のｄｅｆ−Ｐウイルス感染価は１０⁶ＦＦＵ／ｍｌ以上に達した。このｄｅｆ−Ｐウイルス感染細胞の免疫蛍光法による顕微鏡像を図３に示した。ｄｅｆ−Ｐウイルス感染ＮＡ−Ｐ、ＢＨＫ−Ｐ細胞はウイルスＮタンパク質を豊富に発現しており、このことはｄｅｆ−ＰウイルスがＰ発現細胞内でよく複製していることを示している（図３Ａ、Ｄ）。一方、ｄｅｆ−Ｐウイルス感染ＮＡ及びＢＨＫ細胞でのＮ蛋白の発現は僅かであった（図３Ｂ、Ｅ）。Ｐタンパク質の発現はこのｄｅｆ−Ｐウイルスの増殖に必須である。一次転写のみは、ウイルスＲＮＰ内に含まれて持ち込まれたウイルスポリメラーゼによって行われる。二次転写とゲノムの複製は新たに合成されるＰタンパク質を欠くためにほとんど起こらないと考えられる（データは以下に示す）。

このｄｅｆ−ＰウイルスゲノムのＰ遺伝子欠損を確認するため、ｄｅｆ−Ｐウイルス感染ＢＨＫ−Ｐ細胞から全ＲＮＡを分離した。ゲノムセンスＲＮＡのＰ遺伝子領域周辺領域をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した（図４）。予想される通り、ｒＨＥＰウイルス感染細胞からは１１６６ｂｐ、ｄｅｆ−Ｐウイルス感染細胞からは２３４ｂｐのＰＣＲ断片が得られた。また、シークエンス解析からもｄｅｆ−ＰウイルスゲノムがＰ遺伝子を欠き、ｃＤＮＡプラスミドp3.1-defPに由来することが示された。

（Ｐタンパク質発現細胞におけるＰ遺伝子欠損ウイルスの増殖）
ＢＨＫ−Ｐ細胞におけるｄｅｆ−Ｐウイルスの増殖を図５に示した。ＢＨＫ−Ｐ細胞において、Ｎタンパク質の発現は感染１日後から明らかに検出された。感染フォーカス数は増加し、また、隣接細胞へのウイルス伝播が見られた。一方、感染ＢＨＫ細胞では、感染３日後にのみ、僅かなＮタンパク質の発現が見られた（図５Ｆ）。次に、ＢＨＫ−Ｐ、ＢＨＫ両細胞におけるｄｅｆ−Ｐウイルスの増殖動態を解析した（図６）。細胞にＭＯＩ＝１０で感染させ、培養上清を２４時間ごとに感染４日目まで回収した。産生ウイルスの感染価は培養上清の階段希釈液を、ＢＨＫ−Ｐ細胞の単層培養に感染させ、フォーカス数によって決定した。ＢＨＫ−ＰとＢＨＫ細胞において、親株であるｒＨＥＰウイルスはよく増殖し、そのタイターは１０⁸ＦＦＵ／ｍｌ以上に達した。ＢＨＫ−Ｐ細胞におけるｄｅｆ−Ｐウイルスの増殖はｒＨＥＰウイルスのそれに比べて、僅かに遅いものの、最終的に感染６日目には１０⁸ＦＦＵ／ｍｌに達した。宿主細胞によるＰタンパク質の発現量は、ウイルスポリメラーゼが最高速度での増殖を遂行するためには不十分であるように思われる。

培養上清中にはほとんど子孫ウイルスは放出されないが、図３Ｂ、Ｅと図５Ｆに示すように、Ｐタンパク質非発現細胞であるＮＡ及びＢＨＫ細胞におけるＮ蛋白の発現は僅かではあるが確実に検出される。すなわち、ｄｅｆ−ＰウイルスはＰタンパク質非発現細胞においても、少量のウイルスタンパク質を発現していることを示している。

ｄｅｆ−Ｐウイルス感染ＢＨＫ細胞におけるウイルス転写産物の存在を、メッセンジャー・センスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅することによって確認した（図８）。ｄｅｆ−Ｐウイルス感染Ｐタンパク質発現細胞では、Ｎ、Ｐ、Ｇ遺伝子の転写産物が豊富に検出できた。Ｐ遺伝子の転写産物は、宿主細胞に組み込まれたＰ遺伝子由来の転写産物である（図８、レーン６）。これに対して、ｄｅｆ−Ｐウイルス感染ＢＨＫ細胞において、Ｎ及びＧ遺伝子の転写産物はＢＨＫ−Ｐ細胞と比較して少ないが、明らかに検出される。予想通りに、Ｐ遺伝子の転写産物は検出されなかった（図８、レーン２）。このことは添加したｄｅｆ−Ｐウイルス粒子中のＲＮＡポリメラーゼ複合体は、新たなＰ蛋白の合成がなくても１次転写を遂行することが可能であることを示している。

ＢＨＫ−Ｐ細胞でのｄｅｆ−Ｐウイルスの一段増殖は僅かに遅いものの、その感染細胞は明白な細胞損傷や細胞死を引き起こすことなく、数回の継代が可能である。ｄｅｆ−Ｐウイルス感染ＢＨＫ−Ｐ細胞は、週に２回継代し、１ヵ月以上維持された。各継代ごとの培養上清中の産生ウイルスを測定した。継代５代目まで、１０⁷ＦＦＵ／ｍｌ以上のウイルスが持続感染細胞培養から放出されていた。その後、ウイルス産生は徐々に減少した（図７）。

（Ｐ遺伝子欠損ウイルスの病原性）
ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株は最も弱毒化した狂犬病ウイルス株の１つであり、成熟マウスでは脳内接種でも死なず、乳のみマウスに対してのみ致死的である。ｄｅｆ−Ｐウイルスは親株のＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙと同様にどんな感受性細胞にも感染できるが、Ｐタンパク質発現細胞以外では感染性の子孫ウイルスを産生できない。従って、ｄｅｆ−Ｐウイルスは完全な非病原性ウイルスであると考えられる。そこで、ｄｅｆ−Ｐウイルスの乳のみマウスに対する病原性を検討した（図９）。ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株２×１０³ＦＦＵ／ｍｌの脳内接種は１００％の致死率を示したが、ｄｅｆ−Ｐウイルスは２×１０⁴ＦＦＵ／ｍｌの接種においてもマウスを殺すことなく、また、なんの臨床症状も示さなかった。

（ウイルス中和抗体反応とＰ遺伝子欠損ウイルス接種後の防御反応）
ｄｅｆ−Ｐウイルスは完全な非病原性であるが、感染細胞内ではＰタンパク質の供給がなくともウイルスタンパク質の発現が確実に起こっている。そこで、ｄｅｆ−Ｐウイルスのワクチンとしての効果をＮＩＨテストによって検討した。図１０Ａは、ｄｅｆ−Ｐウイルスとその親ウイルスであるｒＨＥＰウイルスを腹腔内接種で免疫した時の致死量の攻撃ウイルスに対しての生存率を示している。ｄｅｆ−Ｐウイルス、１０⁶ＦＦＵ接種群は致死量のＣＶＳ株ウイルスチャレンジに対して完全な防御効果を示した。ウイルス中和抗体（ＶＮＡ）は狂犬病からの防御において、主要な役割を担っていることから、上記実験免疫マウスの中和抗体価を測定した（図１０Ｂ）。

その結果ＶＮＡ価はウイルス摂取濃度依存的に誘導されることが示された。１０⁶ＦＦＵの接種では、中和抗体平均力価がｄｅｆ−Ｐウイルス免疫群で１２．３ ＩＵ、ｒＨＥＰウイルス接種群で２．０ ＩＵであり、ｄｅｆ−ＰウイルスがｒＨＥＰウイルスより有意に高く中和抗体を誘導することが分かった。結果としてｄｅｆ−Ｐウイルスの方が、よりよい感染防御効果が見られた。これらのデータから、ｄｅｆ−Ｐウイルスは１０⁶ＦＦＵのウイルス量で、感染防御に充分なＶＮＡと防御免疫を誘導することが示された。

［考察］
改良型リバース・ジェネティックシステムとＰタンパク質定常発現細胞を併用することで、Ｐ遺伝子欠損ウイルス（ｄｅｆ−Ｐ）の産生と増殖に成功した。このシステムは、細胞のＲＮＡポリメラーゼIIによって、トランスフェクトしたｃＤＮＡの初期転写が制御されているため、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの供給を必要としない。この系を用いることで、いかなる細胞でもｃＤＮＡからの狂犬病ウイルス回収が可能となった。本研究では、遺伝子欠損ウイルスを作製するため、ゲノムｃＤＮＡとヘルパー・プラスミド（ウイルスの転写と複製を行うプラスミド）をトランスフェクションする細胞として、Ｐタンパク質発現細胞を用いた。

Ｐタンパク質発現細胞を利用した回収系によって、Ｐ遺伝子欠損ウイルスを高効率で得ることが出来た。ウイルスゲノムはＰ遺伝子を欠くが、ウイルス粒子はＰタンパク質を含有する正常なヌクレオカプシド構造を有しており、Ｐタンパク質発現細胞内ではよく複製し、また、Ｐタンパク質非発現細胞内でも初期転写活性を有している。ｄｅｆ−Ｐウイルスの増殖速度は遅いが、これはおそらくＰタンパク質の供給が不十分であるためと考えられる。しかし、ｄｅｆ−Ｐウイルス感染細胞は、維持培養でき、数回の継代の間、子孫ウイルスを産生しつづけた。更なる改良によってこの量的な問題は解決可能である。あるいは、Ｐタンパク質を高発現させる他の発現ベクターを用いることで、Ｐ蛋白の充分な供給が可能である。

ｄｅｆ−Ｐウイルスは、Ｐタンパク質が供給されるという限られた環境で増殖可能である。しかし、ｄｅｆ−Ｐウイルスは親株であるＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙが感染可能な全ての感受性細胞に感染できる。Ｐタンパク質の新たな合成なしに、ビリオン結合ポリメラーゼ複合体は感染細胞内でウイルスｍＲＮＡを転写できる（図８）。Ｐタンパク質非発現細胞では、Ｎ蛋白の大量な合成に引き続くウイルスＲＮＡのＮタンパク質による被嚢は起こらない。従って、ウイルスゲノムＲＮＡの複製はないものと予想され、実際、感染性子孫ウイルスの放出はほとんど見られなかった（図６Ｂ）。しかし、わずかなウイルスゲノム複製の可能性は完全に否定されたわけではない。Ｐ遺伝子欠損ウイルスはウイルスＲＮＡポリメラーゼの機能とヌクレオカプシドの構造を調べる有益なツールとなる。

ｄｅｆ−Ｐウイルスはマウスに対して完全に非病原性であり、また、充分な防御免疫を誘導する。いかなる動物においても接種による病原性の発現はないものと予想され、また、遺伝子突然変異による病原性の復帰も完全に否定される。１０⁶ＦＦＵのｄｅｆ−Ｐウイルスでの２回の腹腔内接種による免疫で完全にマウスを防御できた。その血清は親株であるｒＨＥＰやワクチン標品の血清より有意に高い中和抗体価を保持していた。筋肉内接種においてもｄｅｆ−Ｐウイルスはより高い中和抗体価を誘導した（データは示さない）。ＷＨＯは狂犬病防御のために中和抗体価０．５ ＩＵ以上の値を推奨している。１０⁵ＦＦＵのウイルス量において、ｒＨＥＰを接種した場合６サンプル中６血清、ｄｅｆ−Ｐを接種した場合６サンプル中４血清が十分な抗体価をもっていたが、防御効果は５０％以下であった（図１０）。

この低い防御効果はBarthらにより示唆されているＮＩＨ法によるヘテロジェナスチャレンジによるものと考えられる。ホモロガスチャレンジが行われていれば、より高い防御効果が得られる可能性がある。接種経路によるｄｅｆ−Ｐワクチン接種の有効性をみるため、別な接種経路による中和抗体価産生と防御効果を調べる実験を行った。ウイルスの増殖が経口ワクチンの防御効果を発揮する上で必要不可欠であり、ｄｅｆ−Ｐウイルスが経口ワクチンとして効果的であることが期待できる。

不活化ワクチンでは細胞障害性Ｔ細胞反応を誘導できないが、ｄｅｆ−Ｐウイルスでは液性免疫反応に加えて細胞障害性Ｔ細胞反応も誘起できるものと期待される。また、ｄｅｆ−Ｐウイルスワクチンは抗原発現の持続による、長期的な防御免疫の誘導も期待できる。免疫反応の強さは、発現される抗原量によると考えられている。ｄｅｆ−Ｐウイルスワクチンの効果を増強させるために、ｄｅｆ−Ｐウイルスを操作するいくつかの方法が考えられる。免疫刺激性サイトカイン遺伝子の導入（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）は、パラインフルエンザウイルスワクチンやＤＮＡワクチンで報告されているように、効果的である。

前アポトーシス遺伝子（チトクロームｃ等）やもうひとつ糖タンパク質遺伝子を導入することも有望な候補と考えられる。他の遺伝子を導入できるように、付加的な転写ユニットをＰ遺伝子の代わりに組み込んだプラスミドの作製もすでに行っている。狂犬病流行地で循環している、野外狂犬病ウイルスのＧ遺伝子挿入も有用な戦略である。新規のｄｅｆ−Ｐウイルスは、生ワクチン及び遺伝子治療の有益なツールである。

本発明の実施例における、Ｐ遺伝子欠損プラスミドの構築と回収を示す図である。なお、Ａは、Ｐ遺伝子欠損プラスミドの構築過程を示した模式図であり、Ｂは、Ｐ遺伝子欠損プラスミドの回収を示す図である。 本発明の実施例における、Ｐタンパク質発現細胞を示す図である。 本発明の実施例における、Ｐタンパク質発現細胞でのＰ遺伝子欠損ウイルスの増殖を示す図である。 本発明の実施例における、Ｐ遺伝子欠損ウイルスのゲノムにおいてＰ遺伝子が欠損していることを示す図である。なお、Ａは、Ｐ遺伝子欠損ウイルスのゲノムを示す模式図（ｄｅｌ−Ｐ）であり、Ｂは、Ｐ遺伝子欠損ウイルスのゲノムをアガロース電気泳動で確認したことを示す図である。 本発明の実施例における、ＢＨＫ−Ｐ細胞でのＰ遺伝子欠損ウイルスの増殖を示す図である。 本発明の実施例における、Ｐ遺伝子欠損ウイルスの増殖曲線を示す図である。なお、Ａは、ＢＨＫ−Ｐ細胞、Ｂは、ＢＨＫ細胞における結果をそれぞれ示す。また、▲は、ｒＨＥＰ、●は、ｄｅｌ−Ｐを示す。 本発明の実施例における、ウイルス価に対するＰ遺伝子欠損ウイルス感染細胞の継代の影響を示す図である。 本発明の実施例における、ウイルス転写産物をアガロース電気泳動で確認したことを示す図である。 本発明の実施例における、Ｐ遺伝子欠損ウイルスの病原性を示す図である。なお、●：ＨＥＰ ２×１０³ＦＦＵ、▲：ＨＥＰ ２×１０²ＦＦＵ、○：ｄｅｌ−Ｐ ２×１０⁴ＦＦＵ、△：ｄｅｌ−Ｐ ２×１０³ＦＦＵをそれぞれ示す。 本発明の実施例における、ｄｅｆ−Ｐウイルス、又はｒＨＥＰウイルスで免疫したマウスを用いた実験結果を示す図である。なお、Ａは、ｄｅｆ−Ｐウイルス、又はｒＨＥＰウイルスで免疫したマウスの生存率を、Ｂは、それらのマウスの中和抗体価を測定した結果を示す図である。

Claims (17)

1. 非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスからＰタンパク質発現遺伝子機能を欠損させた増殖能欠損狂犬病ウイルス。
2. Ｐタンパク質発現遺伝子機能の欠損が、Ｐタンパク質遺伝子の一部又は全部の欠損によるものであることを特徴とする請求項１記載の増殖能欠損狂犬病ウイルス。
3. 非分節マイナス鎖ＲＮＡをゲノムにもつ狂犬病ウイルスがＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株であることを特徴とする請求項１又は２記載の増殖能欠損狂犬病ウイルス。
4. 狂犬病ウイルスの完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドからＰ遺伝子の一部又は全部を欠損させたＰ遺伝子欠損ｃＤＮＡプラスミド。
5. 狂犬病ウイルスの完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドからのＰ遺伝子の一部又は全部の欠損が、該完全長ゲノムｃＤＮＡからの、配列表の配列番号１記載の塩基配列の一部又は全部の欠損であることを特徴とする請求項４記載のＰ遺伝子欠損ｃＤＮＡプラスミド。
6. 狂犬病ウイルスの完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドが、狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株の完全長ゲノムｃＤＮＡプラスミドであることを特徴とする請求項４又は５記載のＰ遺伝子欠損ｃＤＮＡプラスミド。
7. 請求項４〜６のいずれか記載のＰ遺伝子欠損ｃＤＮＡプラスミドを、Ｐタンパク質を発現している細胞に感染させ、増殖することを特徴とするＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスの製造方法。
8. Ｐタンパク質を発現している細胞が、Ｐ遺伝子を含むベクターを導入した細胞であることを特徴とする請求項７記載のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスの製造方法。
9. Ｐ遺伝子を含むベクターを導入した細胞が、Ｐ遺伝子を含むプラスミドを、Ａ／Ｊマウス由来の神経芽腫ＮＡ細胞又はシリアンハムスター由来のＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした細胞であることを特徴とする請求項７記載のＰ遺伝子欠損狂犬病ウイルスの製造方法。
10. 請求項１〜３のいずれか記載のＰタンパク質発現遺伝子機能を欠損した狂犬病ウイルスからなることを特徴とするワクチン。
11. Ｐタンパク質発現遺伝子機能を欠損した狂犬病ウイルスに、ワクチン効果を増強させる遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１０記載のワクチン。
12. ワクチン効果を増強させる遺伝子が、免疫刺激性サイトカイン遺伝子、アポトーシス遺伝子又は野外狂犬病ウイルスＧ遺伝子であることを特徴とする請求項１１記載のワクチン。
13. 請求項１〜３のいずれか記載のＰタンパク質発現遺伝子を欠損した狂犬病ウイルスからなることを特徴とするウイルスベクター。
14. 請求項１３記載のウイルスベクターに外来遺伝子を組込んだ外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターを、Ｐタンパク質を発現している細胞にトランスフェクトさせ、外来遺伝子組換え狂犬病ウイルスを作製することを特徴とする外来遺伝子の発現方法。
15. 請求項１４記載の外来遺伝子組換え狂犬病ウイルスを、Ｐ遺伝子を発現している細胞に感染させ、発現することを特徴とする外来遺伝子の発現方法。
16. 外来遺伝子が、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１４又は１５記載の外来遺伝子の発現方法。
17. 外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ請求項１３記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと、医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び賦形剤から選択される１又は２以上の補助剤からなる医薬デリバリー用組成物。
    
    

Images