CN114984189A - 一种白细胞介素16蛋白的新用途 - Google Patents

一种白细胞介素16蛋白的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白细胞介素16蛋白的新用途，即其在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用，所述白细胞介素16蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明解决现有技术中对狂犬病毒感染的治疗效果不佳等问题，高效表达得到的重组大肠杆菌表达的小鼠白介素16在细胞和动物体内能够抑制狂犬病毒的增殖，为保护机体免受狂犬病毒的伤害提供了一种新的途径。

Description

一种白细胞介素16蛋白的新用途
技术领域
本发明属于生物技术基因工程领域；具体涉及一种白细胞介素16蛋白在制备抗狂犬病毒感染药物中的新用途。
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒感染神经系统引起的一种人畜共患的传染病，一旦出现临床症状，死亡率几乎可达到100%，其传播是通过快速突触转送发生的，可由已感染的家畜或野生动物，通过咬伤或抓伤经由唾液传播至人。由于目前未存在有效的针对狂犬病的暴露后治疗方法，使得每年有不少人死于狂犬病，因此，开发针对狂犬病毒的治疗方法尤为重要。
目前针对狂犬病的治疗主要包括密尔沃基疗法以及狂犬病毒免疫球蛋白（RIG）与广谱抗病毒药物联合疗法。密尔沃基疗法是以氯胺酮进行诱导昏迷，之后给予抗病毒药物利巴韦林和金刚烷胺辅助治疗，最后给予患者镇静剂咪达唑仑和防止脑痉挛的苯巴比妥镇静。虽然密尔沃基疗法救活了一名15岁患狂犬病的女孩，但是后续鲜少有人被治疗成功。与此同时，咪达唑仑、氯胺酮和利巴韦林等药物被证实具有免疫抑制等副作用，因此，最新的在线临床治疗中已不建议使用密尔沃基疗法。由于狂犬病毒免疫球蛋白（RIG）与广谱抗病毒药物联合疗法存在供应不足、成本较高、批次不同影响稳定性等缺点，人们逐渐将焦点放在了单克隆抗体上，单克隆抗体具有特异性高，适用于大规模生产并且可以避免血液传播等优点，越来越成为抗病毒治疗上的有效生物制剂，但单克隆抗体产品要获得批准伦理上仍然充满挑战。综上所述，目前使用的狂犬病的治疗方法在攻毒动物模型以及临床运用中并未表现出良好的保护性，急需开发针对狂犬病的治疗方法。
发明内容
本发明提供了一种白细胞介素16的新用途，即其在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用，用于解决现有技术中对狂犬病毒感染的治疗效果不佳等问题，白细胞介素16蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
为实现本发明目的采用如下技术方案：
1、用Trizol法提取小鼠脾脏的总RNA，以RNA为模板进行RT-PCR得到cDNA；
2、以cDNA为模版，根据小鼠（Mus musculus）IL-16蛋白的基因编码序列（序列号：AF006001.1）设计带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物扩增，获得小鼠IL-16基因；
3、将步骤2所得基因构建到pET-28a载体上，获得能够完整表达小鼠IL-16蛋白的质粒；
4、将步骤3所得质粒转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中，挑取阳性单克隆，测序验证；
5、将步骤4所得的阳性单克隆进行扩大培养，经IPTG诱导纯化即得小鼠白细胞介素16（IL-16）蛋白；
所述纯化具体为采用Ni-NTA亲和层析介质进行纯化，用平衡缓冲液pH 8.0 Lysisbuffer平衡，随后将用0.45μm滤膜过滤后的上清液上样至平衡好的亲和柱，并控制流速为0.5mL/min；上样完毕后用洗涤缓冲液去除杂蛋白；随后用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到Mus musculus IL-16蛋白；
6、检测步骤5所得蛋白与狂犬病毒（RABV）的相互作用
将IL-16重组蛋白与RABV-CVS病毒进行免疫共沉淀得到的复合物用Trizol 法提取其总RNA，以RNA为模板进行RT-PCR得到cDNA，以逆转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增RABV-CVS的N、M以及G基因，观察是否扩增出条带。
7、检测步骤5所得蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的效果；
所述小鼠IL-16蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的应用具体为：IL-16蛋白与病毒共同孵育组、先加入IL-16蛋白到细胞中培养2 h后再加病毒孵育组、先用病毒感染细胞2 h后再加入IL-16蛋白组以及只加入病毒组，比较各组的病毒滴度；
8、检测步骤5所得蛋白的动物体内抗狂犬病毒感染的效果；
所述小鼠IL-16蛋白动物体内抗狂犬病毒感染的应用具体为：先通过腹腔或者滴鼻方式对小鼠进行IL-16蛋白给药，确定该蛋白对小鼠无伤害；然后选取体重约为20g的雄性Balb/c小鼠12只，分为CVS攻毒对照组、PBS组、CVS攻毒24 h后腹腔给药组、CVS攻毒24 h后滴鼻给药组，观察小鼠的生存状况。
本发明的有益效果是：
1、本发明中采用分子克隆的方法构建质粒，能够保证质粒的正确性；
2、本发明的方法产量大，可达到200mg/100mL小鼠IL-16蛋白，且所得蛋白安全可靠具有生物活性，对小鼠无明显的副作用；
3、本发明高效表达得到的重组大肠杆菌表达的白介素16在细胞和动物体内能够抑制狂犬病毒的增殖，为保护机体免受狂犬病毒的伤害提供了一种新的途径，因此本发明为白介素16在狂犬病治疗方面的应用提供了新的方法和思路。
附图说明
图1为本发明所获IL-16蛋白基因的电泳检测结果图；
图2为本发明构建质粒的菌液PCR电泳检测结果图；
图3为本发明IL-16蛋白纯化的SDS-PAGE分析结果图；
图4为本发明所获IL-16蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的效果图；
图5 为本发明所获IL-16蛋白在动物体内抗狂犬病毒感染的效果图；
图6 为本发明所获IL-16蛋白与狂犬病毒相互作用验证的免疫PCR结果图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1、重组IL-16蛋白的制备
1、IL-16基因的获取
（1）从NCBI数据库中检索Mus musculus IL-16蛋白的基因编码序列，用primer5设计IL-16基因的引物，同时引入EcoRI、XhoI酶切位点(下划线部分)以及它们所对应的保护碱基；引物是在北京硕擎生物科技有限公司合成的，引物序列具体如下：
Forward primer：5'- CGGAATTCTCCGCAGCCTCAGCTTCAGC-3'，
Reverse primer：5'- CCGCTCGAGCTATGAGTCTGCAGAAGCTG -3'；
（2）用Trizol法提取小鼠脾脏的总RNA，按照天根生物科技有限公司的TRNzolUniversal（DP424）试剂的说明书进行操作，提取出来的RNA放到-80℃冰箱中保存备用；
（3）采用康为世纪逆转录试剂盒（CW2569M）对步骤（2）中提取的小鼠脾脏总RNA进行RT-PCR得到cDNA，实验步骤按试剂盒使用说明进行；
（4）步骤（3）中的cDNA用于鼠源IL-16基因的扩增
表1 目的基因扩增体系
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
PCR反应程序为：95℃变性3 min；其中35个循环包括95℃变性15 s，61℃退火15s，72℃延伸60 s；最终72℃延伸5 min；16℃终止反应。
PCR反应结束后，在2% Agarose Gel Electrophoresis上鉴定PCR产物，并根据说明书使用庄盟小容量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（ZP202）切割和回收目标基因大小的条带，结果见图1，从图中可以看出在250～500bp之间出现了一条特异条带，与目的基因IL-16的理论值357bp一致，序列见SEQ ID NO:1所示。
2、重组表达载体的构建及转化
（1）pET-28a质粒及基因的双酶切
从-80℃冰箱中取出冻存的转化pET-28a的大肠杆菌，蘸取少量菌液于LB（卡那霉素）固体培养基上划线，37℃培养14 h；挑取一个单克隆菌落于LB（卡那霉素）液体培养基中培养至对数生长期，取部分菌液使用天根质粒小提试剂盒（DP103）按照说明书上的操作步骤进行质粒的提取。
将提取出来的pET-28a质粒和目的基因配制如下表的双酶切反应体系，在37℃下反应5 h进行双酶切；
表2 pET-28a质粒及基因双酶切反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE004
双酶切结束后得到的产物用2% Agarose Gel Electrophoresis鉴定，根据说明书使用庄盟小容量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（ZP202）切割和回收目标基因大小的条带，回收后得到的DNA，用微量分光光度计测定浓度。
（2）重组表达载体的构建及转化
使用T4 DNA Ligase连接双酶切纯化后的载体和目的基因片段，按照下表体系添加试剂，16℃连接反应8 h；
表3 IL-16 蛋白原核表达载体构建体系
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
将反应结束后得到的连接产物转化至DH5α感受态细胞中，具体步骤为：
1）将感受态细胞从-80℃冰箱取出放冰上20 min；
2）将连接产物用移液枪缓慢加入到感受态细胞中混匀，在冰上反应30 min；
3）42℃水浴锅中放置60s，轻拿轻放，再与冰上放置2min，加入1mL的LB培养基；
4）37℃、200rpm摇菌1h后，使用离心机3000rpm离心5min弃掉900μL上清；
5）将剩余的液体吹打混匀后涂布于LB（卡那霉素）固体培养基平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养14 h。
（3）pET-28a-IL-16重组表达载体的菌液PCR鉴定
待步骤（2）菌斑长至合适大小时，在LB平板随机挑取5个单菌落置于LB（氨苄霉素）液体培养基中，200rpm、37℃培养5h至菌液变得浑浊。在无菌操作台中，以菌液为模板进行菌液PCR鉴定，PCR的体系如下所示，引物同实施例1；
表4菌液PCR鉴定体系
Figure DEST_PATH_IMAGE008
PCR反应程序为：95℃变性3 min；其中35个循环包括95℃变性15 s，61℃退火15s，72℃延伸60 s；最终72℃延伸5 min；16℃终止反应；反应结束后，将菌液PCR产物用2%Agarose Gel Electrophoresis进行检测，挑选出PCR结果为阳性的单克隆菌落，送至北京硕擎生物科技有限公司进行DNA测序。
结果见图2，可以看出，菌液PCR得到与IL-16蛋白基因大小一致的片段；测序结果经过NCBI以及手工对比后显示，发现载体里插入的片段与目的基因100%相似，插入的序列无突变，表明重组质粒pET-28a-IL-16成功构建。
3、重组IL-16蛋白的诱导表达及纯化
（1）pET-28a-IL-16重组载体在大肠杆菌中的表达
取少量冻存的pET-28a-IL-16-Rosetta(DE3)菌液划线到LB（卡那霉素）固体平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养。待菌斑长至合适大小时，随机挑取几个单克隆于1mL LB（卡那霉素）液体培养基中37℃、200rpm培养5h，转移至300mL含20μg/mL 卡那抗性 LB 液体培养基中37˚C、200 rpm培养；当菌液的OD 600 在0.4-0.6之间时，向液体培养基中加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L，26℃、120rpm/min诱导表达12h，收集菌液，同时设诱导前的菌体为对照，使用SDS-PAGE去验证。
（2）重组IL-16蛋白的纯化
将诱导结束后的菌液10000rpm离心10min，弃掉上清，收集沉淀并用30mL PBS悬浮菌体；将得到的溶液置于冰上，使用超声波破碎仪进行破碎至液体变得清澈，4℃、8000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，使用金斯瑞生物科技的Ni-NTA亲和层析介质对上清进行纯化，按照其说明书的步骤纯化，纯化后得到的蛋白使用SDS-PAGE进行检测。
结果见图3，重组表达质粒pET-28a-IL-16成功转入Rosetta（DE3）后，经过扩大培养与IPTG诱导目的蛋白的表达；对于诱导前后的菌液进行SDS-PAGE检测，重组表达菌在IPTG诱导下，大量表达相对分子量为14 kDa的目的蛋白（图3泳道2），未进行诱导菌体内只产生了少量的目的蛋白，并且主要是可溶性表达的IL-16重组蛋白；用Ni-NTA亲和层析介质纯化出来的蛋白，条带比较单一，且条带大小与预期相符。
实验例2：IL-16蛋白的抗狂犬病毒效果及作用机制评价
1、IL-16重组蛋白的体外抗RABV活性验证
从细胞培养箱中取出一瓶N2a细胞，弃掉细胞培养上清，用PBS洗一遍，再加入1mL胰蛋白酶，室温下静置消化1min，把胰蛋白酶吸出，用适量的10% DMEM完全培养基将细胞悬浮起来并均匀铺板于24孔板中，在37℃、5% CO2培养至密度60%-70%左右；实验分为三组，一组是先加入IL-16重组蛋白到细胞中反应2h后再加入RABV-CVS，另一组是IL-16重组蛋白与RABV-CVS共同孵育2h后再加入到细胞中，最后一组是先加入RABV-CVS到细胞中感染 2h后再加入IL-16重组蛋白，对照设置为只加病毒，每组做三个重复；每个孔里的IL-16重组蛋白的量1μg，RABV-CVS的MOI为0.1。
N2a细胞被病毒感染48h后 ，将每个孔里的细胞培养上清用无菌的1.5mL离心管中收集起来，收集起来的细胞培养上清用TCID50实验去验证纯化出来的蛋白是否有抗RABV生物活性。
结果见图4，IL-16重组蛋白与病毒共同孵育组、先加入IL-16重组蛋白到细胞中培养2 h后再被病毒孵育组以及先病毒感染细胞2 h后再加入IL-16重组蛋白组与只加入病毒组相比，病毒滴度都有所下降，其中病毒与IL-16重组蛋白共同孵育组的病毒滴度下降最为明显，说明IL-16蛋白抑制狂犬病毒增殖。
2、IL-16重组蛋白的体内抗RABV生物活性验证
先通过腹腔或者滴鼻方式对小鼠进行IL-16蛋白给药，确定该蛋白对小鼠无副作用。然后选取体重约为20g的雄性Balb/c小鼠12只，分为四组；这四组分别为CVS对照组、PBS组、攻毒24 h后腹腔给药组、攻毒24 h后滴鼻给药组。小鼠以250μg/（kg×d）的IL-16重组蛋白剂量治疗7天，攻毒方式为滴鼻攻毒，同时每天观察小鼠状态及存活情况。
结果见图5，从图中可以看出，PBS缓冲液对小鼠生存率无任何影响，并且给药的小鼠生存时间均所延长，攻毒24 h后滴鼻给药组有一只老鼠死亡，其余老鼠都存活下来，说明IL-16蛋白在体内可以抑制狂犬病毒增殖。
3、IL-16蛋白的抗狂犬病作用机制
1）取2个1.5mL离心管，每个离心管中加入2μg纯化后的IL-16重组蛋白，然后向一个管中加入20μL RABV-CVS病毒液（105 TCID50/0.1mL），另一个管中加入20μL正常N2a细胞的培养上清，吹打混匀，4℃缓慢摇晃孵育2h；
2）取20μL protein A/G PLUS-Agarose，用1mL PBS缓冲液洗涤3次，每次4℃、3000rpm离心1min；
3）将预处理过的20μL protein A/G PLUS-Agarose加入到病毒与重组蛋白共同孵育的离心管中，4℃缓慢摇晃孵育过夜；
4）反应结束后，4℃、3000rpm离心1min，弃掉上清，用1mL PBS缓冲液洗涤4次，每次4℃、3000rpm离心1min；
5）用Trizol 法提取上一步清洗后的琼脂糖珠的总RNA，提取出来的RNA采用康为世纪逆转录试剂盒（CW2569M）进行RT-PCR得到cDNA；
6）步骤（5）中的cDNA用于RABV-CVS的N、M以及G基因的扩增，引物见表5，PCR的体系见表6；
表5 RABV-CVS的N、M以及G基因扩增的引物
Figure DEST_PATH_IMAGE010
表6 RABV-CVS的N、M以及G基因扩增体系
Figure DEST_PATH_IMAGE012
按照上表所述方案配置好PCR体系后，95℃变性3 min；其中35个循环包括95℃变性15 s，50℃退火15 s，72℃延伸30 s；最终72℃延伸5 min；16℃终止反应；反应结束后，将菌液PCR产物用2% Agarose Gel Electrophoresis进行检测。
结果见图6，PCR扩增出来的RABV-CVS的N、M以及G基因的条带大小与预期大小（100～200 bp）符合，说明通过与狂犬病毒粒子的直接相互作用是IL-16重组蛋白发挥抗RABV疗效的作用机制之一。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种白细胞介素16蛋白的新用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
tccgcagcct cagcttcagc agccagtgac atttctgtag aatctaagga ggccactgtc 60
tgcacagtga cactggagaa gacctctgca gggctgggct tcagcctgga gggaggaaag 120
ggctccctgc atggtgacaa gcctcttacc ataaacagga ttttcaaagg ggacagaaca 180
ggggagatgg tgcagccagg ggatgagatc ttgcagctcg ctggcactgc tgtgcaaggt 240
cttacccggt ttgaagcctg gaatgtcatc aaggcattgc ctgatggacc tgtcactata 300
gtcatcagaa ggaccagcct ccagtgcaag cagacaacag cttctgcaga ctcatag 357
<210> 2
<211> 101
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Met Thr Ile Val Thr Gly Pro Ser Gly Asn Ala Leu Met Thr Phe Gln
1 5 10 15
Ala Ser Asn Arg Val Arg Pro Cys Thr Ala Val Pro Ala Ser Cys Lys
20 25 30
Ile Ser Ser Pro Gly Cys Thr Ile Ser Pro Val Leu Ser Pro Leu Lys
35 40 45
Ile Leu Phe Met Val Arg Gly Leu Ser Pro Cys Arg Glu Pro Phe Pro
50 55 60
Pro Ser Arg Leu Lys Pro Ser Pro Ala Glu Val Phe Ser Ser Val Thr
65 70 75 80
Val Gln Thr Val Ala Ser Leu Asp Ser Thr Glu Met Ser Leu Ala Ala
85 90 95
Glu Ala Glu Ala Ala
100
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
cggaattctc cgcagcctca gcttcagc 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
ccgctcgagc tatgagtctg cagaagctg 29
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
atctttagtc ggtctcc 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
tgtcattagg gtatggtgtt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
gacgatgacc tgtggcttcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
ccatttgggc tacacgcttt 20

Claims (2)

1.一种白细胞介素16蛋白在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：白细胞介素16蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
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