ES2954892T3 - Péptidos para facilitar secreción y usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
La invención proporciona una serie de señales peptídicas que, cuando se unen a un polipéptido de interés (POI), garantizan que dicho polipéptido sea secretado con altos rendimientos por una célula huésped tal como Mycoplasma pneumoniae. La invención también proporciona proteínas de fusión marcadas con dichas señales peptídicas, las secuencias de ácido nucleico que las codifican, células huésped que comprenden dichas proteínas de fusión marcadas y una variedad de usos de las proteínas de fusión y las células huésped. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Péptidos para facilitar secreción y usos de los mismos
La presente invención proporciona péptidos que, cuando se fusionan con un polipéptido de interés, dirigen la secreción eficiente del polipéptido de interés fuera de las células bacterianas. La invención tiene múltiples aplicaciones potenciales, en particular, en el área de las terapias bacterianas de última generación.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La expresión de proteína secretora es la expresión de una proteína en una célula hospedadora, donde la proteína se exporta a través de la membrana celular para su liberación en el medio extracelular o se muestra en la superficie celular, anclada a la membrana celular. La expresión de proteína secretora está mediada por un péptido señal en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige la exportación extracelular del polipéptido.
Se conocen proteínas completas de bacterias que comprenden péptidos señal, por ejemplo: proteína 3 del operón Mgp (referencia de Uniprot Q50341), homólogo 2 de lipoproteína MG439 (referencia de Uniprot P75152), lipoproteína MPN_200 (referencia de Uniprot Q50288), homólogo no caracterizado de lipoproteína MG338 (referencia de Uniprot P75296) de Mycoplasma pneumoniae; o la proteína de membrana putativa STAAU TraK de Staphylococcus aureus (referencia de Uniprot Q07713).
Habitualmente, las proteínas recombinantes se producen intracelularmente en hospedadores procariotas. Cuando la proteína se recupera en un procedimiento tal, las células tienen que lisarse lo que conduce a la contaminación de la proteína recombinante con contenido celular. La proteína después debe recuperarse de los extractos de células completas en procedimientos de purificación de múltiples etapas, lo cual requiere mucho tiempo y da como resultado rendimientos bajos. También las proteínas secretadas podrían usarse para la terapia bacteriana donde se dirigen a los receptores eucariotas en las células diana.
La secreción de proteínas recombinantes en el medio es una mejor estrategia porque la purificación de proteínas del medio empleado es más fácil y más compatible con el cultivo continuo.
La expresión de proteínas secretoras tiene otros usos. Los ejemplos de uso para este tipo de expresión de proteínas incluyen el desarrollo de vacunas vivas, mapeo de epítopos, el desarrollo de biosorbentes y biosensores y el cribado de alto rendimiento de bibliotecas de proteínas y péptidos para el descubrimiento de fármacos.
En secreción, las proteínas recombinantes enfrentan el desafío de la translocación a través de la compleja envoltura celular que consiste en dos membranas lipídicas (la interna y la externa) con un compartimento similar a un gel, el periplasma, entre ellas. Se ha demostrado que esto es muy difícil y los métodos usados anteriormente han tenido baja efectividad.
Por otra parte, la biología sintética se basa en la ingeniería de organismos vivos para explotarlos en una miríada de aplicaciones que van desde biosensores y la producción de biocombustibles hasta tratamientos terapéuticos. La industria lleva mucho tiempo usando microorganismos en la producción de muchas proteínas terapéuticas. Sin embargo, el ajuste fino de un microorganismo completo en términos de su genoma mediante un enfoque de biología sintética abre una vía para explotar el propio organismo como terapia o vehículo terapéutico. Una aplicación particularmente interesante es la posibilidad de crear fábricas bacterianas que puedan vivir en tejidos enfermos y producir, mostrar o secretar proteínas terapéuticas in situ.
Para manipular una célula hospedadora tal como una bacteria y convertirla en un vehículo terapéutico, primero hay que tener un conocimiento muy profundo de su genoma, su proteoma y todos sus procesos metabólicos. Actualmente, un cuello de botella principal es la incapacidad de predecir con precisión el comportamiento de las bacterias modificadas por ingeniería genética. Con el fin de minimizar los posibles efectos no deseados en las aplicaciones terapéuticas y con una meta de simplificar un sistema vivo muy complejo, algunas de las bacterias más simples se están estudiando como plataformas de biología sintética.
Las bacterias hospedadoras pueden diseñarse para que sinteticen un polipéptido de interés (POI, por sus siglas en inglés) con aplicaciones terapéuticas. Con la meta de aumentar la exposición superficial al exterior de la célula y/o su secreción al medio exterior, puede implementarse una serie de estrategias. Uno de ellos es el acoplamiento (fusión) en marco del polipéptido de interés con un segundo péptido que promueve una diversidad de procesos de secreción dentro de la célula hospedadora. Algunos péptidos pueden impulsar la visualización de la superficie de POI en la sección extracelular de la membrana celular. En este caso, el POI puede usarse para provocar una respuesta inmunitaria a través de la visualización de una proteína extraña en la maquinaria del sistema inmunitario y, por lo tanto, las bacterias modificadas por ingeniería genética que portan la proteína de fusión pueden usarse como una vacuna. Algunos otros péptidos pueden dirigir la producción y secreción de la proteína de fusión (potenciador de la secreción de POI) al medio externo. En este último caso, las bacterias modificadas por ingeniería genética pueden usarse como un chasis de suministro de tejido de proteínas terapéuticas.
Existe una diversidad de referencias en la técnica anterior que se ocupan de los péptidos útiles para mostrar en la superficie y secretar los polipéptidos pretendidos. Sin embargo, a pesar de lo que se sabe en el campo, hay muchas cuestiones que aún deben abordarse. La secreción satisfactoria de un polipéptido de interés por una célula hospedadora aún está impedido por muchos factores tales como: (a) el acoplamiento del potenciador de la secreción al POI puede alterar el plegamiento y la estructura final de uno o ambos compañeros, con un cambio posterior en sus funciones biológicas; y (b) los rendimientos de exhibición y/o secreción en la superficie son subóptimos en términos de aplicabilidad real para muchas células hospedadoras bacterianas tales como Mycoplasma.
Por tanto, es deseable proporcionar otros potenciadores de la secreción de péptidos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado una serie de péptidos señal de secreción que, cuando se fusionan con un POI, dirigen su secreción eficiente en un hospedador bacteriano, tal como Mycoplasma pneumoniae, y no interfieren con su actividad biológica, como se ve en los datos experimentales a continuación. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que estos péptidos son eficaces para secretar POI con una gama muy amplia de plegamientos de proteínas. Esto revela que los péptidos señal de la invención tienen un amplio espectro de aplicabilidad en términos de secreción de POI.
Debido a este perfil de secreción eficiente, la purificación de POI del medio es más fácil y más compatible con el cultivo continuo.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención es un péptido que comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de las secuencias del grupo que consiste en:
SEQ ID NO: 1
Mpn 142 con secuencia: MKSKLKLKRYLLFLPLLPLGTLSLANTY;
SEQ ID NO: 2
Mpn 645 con secuencia: MKLKLKFLLISLLGSSLLLSACSSAATQ;
SEQ ID NO: 3
Mpn 400 con secuencia: MKLNFKIKDKKTLKRLKKGGFWALGLFGAAINAFSAVL;
SEQ ID NO: 4
Mpn 200 con secuencia: MKFKYGAIVFSGLLGVSAILAACGT;
SEQ ID NO: 5
Mpn 213 con secuencia: MKLSAIISLSVAGTVGTTAWVPTTITLVNK; y
SEQ ID NO: 6
Mpn 489 con secuencia: MGYKLKRWPLVAFTFTGIGLGVVLAACSALN.
Los péptidos de la invención pueden fusionarse en marco directamente con el POI o pueden fusionarse con el POI a través de un enlazador. El enlazador puede tener una serie de propiedades. Por ejemplo, puede ser un sitio de señal de escisión que es el sustrato de las proteasas, de tal manera que la escisión del POI y los péptidos de la invención pueda controlarse bajo ciertas circunstancias (presencia o ausencia de la proteasa capaz de procesar el sitio de escisión) si es necesario.
Como se muestra a continuación, el péptido de la invención puede fusionarse con un POI particular para secretarlo eficientemente en una bacteria particular. Como se ilustra a continuación (véase la sección de ejemplos y las Figuras 1 a 3), cuando un POI está dotado de una cierta actividad biológica, la proteína de fusión resultante (POI+péptido de la invención) también es activa. Esto es indicativo de que el péptido del primer aspecto de la invención no afecta negativamente a la actividad del POI.
Por tanto, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende un polipéptido de interés (POI) y al menos un péptido como se define en el primer aspecto de la invención, en donde el polipéptido de interés es heterólogo al al menos un péptido.
Un tercer aspecto de la presente invención es un polinucleótido que codifica el péptido del primer aspecto de la invención o la proteína de fusión del segundo aspecto de la invención.
Una vez que se genera el polinucleótido que codifica el péptido del primer aspecto o la proteína de fusión del segundo aspecto, se integra en un vector adecuado, que después se integra en una célula hospedadora para expresar y
secretar la proteína de fusión deseada. Por lo tanto, un cuarto aspecto de la invención es un vector que comprende el polinucleótido del tercer aspecto de la invención.
Un quinto aspecto de la invención es una célula hospedadora que comprende el vector del cuarto aspecto de la invención.
Además, como se ilustra en los datos experimentales y los ejemplos, una vez generada la proteína de fusión, la bacteria es capaz de secretar eficientemente el POI activo.
La célula hospedadora modificada de la presente invención, que se ha diseñado para expresar la proteína de fusión POI+péptido señal de la invención, puede usarse eficazmente como una fábrica bacteriana, que puede vivir en tejidos enfermos y producir y secretar el POI activo in situ. Para esta aplicación terapéutica in situ, la célula hospedadora debe seleccionarse entre aquellas reconocidas como seguras y no tóxicas para seres humanos y animales no humanos. Alternativamente, la célula puede diseñarse para que sea segura y no tóxica. Esta aplicación terapéutica es posible en los casos donde el POI es un péptido terapéutico y la fábrica bacteriana se usa como una fábrica de la proteína terapéutica.
Si la célula hospedadora está modificada por ingeniería genética para ser segura y no tóxica, puede administrarse en sí misma en el tratamiento de enfermedades. La célula hospedadora puede diseñarse para que sea capaz de colonizar y, si se desea, reproducirse de forma segura en un determinado tejido, propagándose en él y secretando la proteína de fusión terapéutica.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica o veterinaria que comprende la proteína de fusión como se define en el segundo aspecto de la invención o la célula hospedadora como se define en el quinto aspecto de la invención, siendo la célula hospedadora segura y no tóxica para seres humanos o animales no humanos, junto con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
En un séptimo aspecto la presente invención proporciona el uso del péptido del primer aspecto de la invención como péptido de secreción de un polipéptido de interés (POI).
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión como se define en el segundo aspecto de la invención o una célula hospedadora como se define en el quinto aspecto de la invención, siendo la célula hospedadora segura y no tóxica para el ser humano o animales no humanos, para su uso en terapia.
En un noveno aspecto, la invención proporciona un método para la expresión de proteínas secretoras de una proteína de fusión como se define en el segundo aspecto de la invención, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una célula hospedadora de acuerdo con el quinto aspecto de la invención; e (b) inducir la expresión de la proteína de fusión.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 Representa la secreción de p53 por diferentes M. pneumoniae modificados (a= Mpn-142-p53, b= Mpn-645-p53, c= Mpn-400-p53, d= Mpn-459-p53, e= Mpn-332-p53, f= Mpn-200-p53, g= Mpn-506-p53, h= Mpn-489-p53) en Medio McCoy. Eje X= tiempo después de la inoculación (t) expresado en horas; Y= concentración de p53 (μg/ml). Las cantidades se determinaron usando un ensayo tipo Roche p53 pan ELISA sandwich.
La FIG. 2 Representa una representación de barras que muestra el ensayo de actividad de alginato liasa en medio sobrenadante completo de cultivos que secretan alginato liasa (cepa M129). Todos los cultivos se normalizaron al mismo recuento de inoculación en el día 0 (barra "a") y durante los siguientes 5 días se tomaron muestras de los medios (barra "b" = muestra tomada el día 1, barra "c" = muestra tomada el día 2 y barra "d" = muestra tomada el día 5). El ensayo se basa en la degradación del alginato polimérico a fragmentos de azúcar más cortos.
La FIG.3_(A) representa la cantidad de A1AT secretada (ng/ml) por diferentes cepas de M. pneumoniae (especificadas en el eje X) cultivadas en medio mínimo (barra gris) o medio Hayflick completo (barra negra); (B) muestra un ensayo de actividad de elastasa de neutrófilos (eje Y, en ufr) usando un cultivo de sobrenadante de medios mínimos concentrados de las cepas MP TS y MP142: A = Medio control, B= Sobrenadantes concentrados de M. pneumoniae, C = Tampón de reacción solamente, (1)= NE (8 nM), (2)= NE+A1AT, (3)= MP-TS, (4)= MP142; (c) muestra una absorbancia de actividad de elastasa de neutrófilos (N.E.A.A.) usando A1AT purificada de la cepa MP142 y A1AT purificada de E. Coli (Acrys). Las barras rayadas y las barras llenas representan diferentes réplicas biológicas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención describe un péptido que comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
En el contexto de la invención, la expresión "péptido señal", también denominado "potenciador de la secreción", es un péptido corto (de 5 a 30 aminoácidos de largo) que se fusiona con el POI y permite la secreción de un POI particular al medio extracelular.
En una realización del primer aspecto de la invención, el péptido comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
El "porcentaje de homología" entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos debe entenderse como el porcentaje de posiciones en la secuencia idénticas o reemplazadas por otros aminoácidos con cadenas laterales de características similares (es decir, polares, apolares, con grupos amino, con grupos -SH) u otros nucleótidos, de acuerdo con las clasificaciones ampliamente aceptadas conocidas por un experto en el campo. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos debe entenderse como el porcentaje de las posiciones de la secuencia con aminoácidos o nucleótidos idénticos. El porcentaje de homología y de identidad entre secuencias puede calcularse mediante "alineación de secuencias". La alineación de secuencias puede ser local o global. En el sentido de la presente invención, el porcentaje de homología y de identidad se calculará, preferentemente, sobre una alineación global, entre la secuencia completa o un fragmento activo completo de la secuencia. Las alineaciones globales son más útiles cuando las secuencias son similares y tienen aproximadamente el mismo tamaño (longitud). Hay varios algoritmos disponibles en el estado de la técnica para realizar estas alineaciones globales. También hay herramientas bioinformáticas que usan dichos algoritmos para obtener el porcentaje de identidad y homología entre secuencias. Como un ejemplo, la alineación global entre secuencias puede realizarse por medio del conocido software GGSEARCH o GLSEARCH.
La invención también describe un péptido que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
En otra realización del primer aspecto de la invención, el péptido es uno que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
En la invención también se describe el % de homología de al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100. En otra realización más, el % de identidad es de al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.
En una realización, el péptido consiste en una secuencia que es una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
En otra realización del primer aspecto de la invención, el péptido comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2; o SEQ ID NO: 3. Ventajosamente, estos péptidos son los que dan los resultados más eficientes en términos de secreción del POI activo, como se muestra en los datos experimentales que se encuentran a continuación. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende al menos un POI junto con un péptido como se define en el primer aspecto de la invención.
La expresión "proteína de fusión" como se usa en el presente documento es el resultado del acoplamiento en marco de un polipéptido de interés (POI) a través de su extremo N- o C-terminal a un péptido del primer aspecto de la invención.
La expresión "polipéptido de interés" o simplemente POI, como se usa en el presente documento, es un polipéptido que el usuario de la invención desea que una célula hospedadora secrete en forma soluble al medio. Normalmente, el POI es una proteína que el usuario quiere tener secretada, mientras que el péptido señal de la proteína de fusión ayuda en el proceso de secreción. Normalmente, el POI también es heterólogo al péptido señal al que está fusionado, lo que significa que el POI no se origina de la misma especie que el péptido señal.
En una realización del segundo aspecto de la invención, la proteína de fusión comprende de 1 a 12 POIs. En otra realización del segundo aspecto de la invención, la proteína de fusión comprende de 1 a 5 POIs. En otra realización más del segundo aspecto de la invención, la proteína de fusión comprende 1 POI.
En una realización del segundo aspecto de la invención, POI tiene un efecto terapéutico de tal manera que, cuando se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz a un paciente que padece una enfermedad, tiene un efecto beneficioso sobre la salud y el bienestar del paciente, ya sea curar la enfermedad, ralentizar el progreso de la enfermedad; hacer que la enfermedad retroceda; aliviar uno o más síntomas de la enfermedad; prevenir la aparición de una enfermedad o trastorno; retrasar la recurrencia de la enfermedad o trastorno; o proteger contra la aparición de
la enfermedad.
Algunos ejemplos ilustrativos no limitantes de POI terapéuticos son agentes antiproliferativos, agentes antiinflamatorios, agentes antineoplásicos, agentes antimitóticos, agentes antiplaquetarios, agentes anticoagulantes, agentes antifebrina, agentes antitrombina, agentes citostáticos, antibióticos, agentes angiogénicos, hormonas y antígenos. Alternativamente, el POI puede ser un polipéptido no terapéutico, tal como una enzima con un interés industrial particular (tal como en procesos de fermentación, catálisis, etc.).
En otra realización el POI es p53, Alginato liasa A1-III o a1-antitripsina.
En otra realización del segundo aspecto de la invención, el extremo N-terminal del POI se une al péptido del primer aspecto de la invención a través de un enlazador peptídico. Este enlazador (o "espaciador") hace que sea más probable que el POI y el péptido señal se plieguen de forma independiente y se comporten como se esperaba; es decir, incorporando un enlazador se garantiza que el POI conserva su función. Además, este enlazador puede ser un sitio de señal de escisión que es el sustrato de las proteasas, de tal manera que la escisión del POI y los péptidos de la invención pueda controlarse bajo ciertas circunstancias (presencia o ausencia de la proteasa capaz de procesar el sitio de escisión) si es necesario.
Los términos y expresiones "enlazador peptídico" y "enlazador" se usan indistintamente y debe entenderse como cualquier secuencia de aminoácidos que comprende de 1 a 100 aminoácidos, dicha secuencia no afectando negativamente ni a la actividad del POI ni a la función del péptido señal como herramienta de exhibición o secreción. La invención también describe que en el segundo aspecto de la invención, el péptido comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
En otra realización del segundo aspecto de la invención, el péptido comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ iD NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
La invención también describe que en el segundo aspecto de la invención el péptido es uno que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
En otra realización del segundo aspecto de la invención, el péptido es uno que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
En otra realización del segundo aspecto de la invención, el péptido consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6. En otra realización del segundo aspecto de la invención, el péptido del primer aspecto de la invención se selecciona del grupo que consiste en: secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un péptido como se define en el primer aspecto de la invención o una proteína de fusión como se define en el segundo aspecto de la invención. Existen técnicas bien conocidas en el estado de la técnica para la obtención del polinucleótido a partir de una secuencia de aminoácidos. Al realizar una secuenciación tal, es de particular relevancia la célula en donde tendrá lugar la expresión. Como es bien sabido, el código genético está degenerado, por lo que puede haber más de un polinucleótido que codifique la misma secuencia de aminoácidos. El uso de codones varía según la célula hospedadora en términos de eficiencia de expresión. En principio, el polinucleótido puede optimizarse para aumentar la expresión dependiendo de la célula hospedadora. Como se explica a continuación, el polinucleótido que codifica la secuencia peptídica SEQ ID NO:1 se ha optimizado para la expresión en M. pneumoniae.
En una realización del tercer aspecto de la invención, el péptido del primer aspecto de la invención está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 11:
SEQ ID NO: 7
AT GAAGTCCAAGTT G AAACT CAAACGCT ATTT ACT CTTT CTCCCCTT GTT ACC ACT
CGGT ACCTT GAGTTT AGCT AACACTT AC
SEQ ID NO: 8
AT GAAATCGAAGCT AAAGTT AAAACGTT ATTT ACT GTTTTT ACCACTTTT ACCGCT
AGGGACGTT GTCACT AGCCAACACCT AC
SEQ ID NO: 9
AT GAAACT G AAACTT AAATTTCT ATT AATTT CT CTTTT AGGTT CT AGTTT GTT GTT A
AGCGCTTGTTCTTCAGCAGCTACTCAA
SEQ ID NO: 10
AT GAAATTT AAGT ATGGTGCCATT GTTTT CAGT GGTCTTTT AGG AGT CT CTGCCA
TTTTAGCTGCTTGTGGTACA
SEQ ID NO: 11
ATGAAGCTTAGTGCTATTATCTCCCTATCAGTCGCTGGTACTGTGGGAACAACTG
CGGTGGT AGT ACCT ACAACT AT AACGCTT GT AAAT AAG
En otra realización del tercer aspecto de la invención, el péptido del primer aspecto de la invención está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 7 a SEQ ID NO: 11.
La presente invención también describe que en el tercer aspecto de la invención, el péptido del primer aspecto de la invención está codificado por un polinucleótido que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90% de homología con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 7 a s Eq ID NO: 11.
En otra realización del tercer aspecto de la invención, el péptido del primer aspecto de la invención está codificado por un polinucleótido que consiste en una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO. 7 a SEQ ID NO: 11. En otra realización, el péptido está codificado por un polinucleótido que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 11.
En otra realización, el polinucleótido del tercer aspecto de la invención está unido operativamente a un promotor. La expresión "unido operativamente a un promotor" como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia del promotor y la secuencia que codifica una proteína de fusión de la invención. Este enlace funcional se realiza mediante la fusión de una secuencia de ADN correspondiente a cualquier promotor de Mycoplasma pneumoniae, o un promotor de otra bacteria compatible con M. pneumoniae, o un promotor diseñado capaz de conducir la expresión en M. pneumoniae, con la secuencia de ADN de la proteína de fusión (péptido de secreción+POl) como es evidente para cualquier experto en la materia. En principio, la distancia entre el comienzo de la transcripción después del promotor y el codón de metionina inicial de la señal de secreción debe ser menos de 100 bases y preferentemente menos de 50 bases. La secuencia promotora inicia y media la transcripción del ADN correspondiente a la secuencia codificante de la proteína de fusión.
La selección del promotor se hace en vista de la célula hospedadora particular y también en vista de las diferentes variables implicadas en la producción de la proteína deseada, tales como expresión inducible o constitutiva, por ejemplo. El experto en la materia, usando el conocimiento general, es capaz de seleccionar el promotor más apropiado. En otra realización, el polinucleótido del tercer aspecto de la invención está unido operativamente a un promotor, estando localizado el promotor normalmente en dirección 5' del codón de inicio de la transcripción.
En aún otra realización, el polinucleótido del tercer aspecto de la invención está unido operativamente a un promotor EfTu. Como se muestra a continuación, los resultados experimentales han revelado que el promotor EfTu brinda una alta eficiencia de expresión cuando la célula hospedadora es M. pneumoniae.
La secuencia del promotor EfTu está disponible en varias bases de datos, La secuencia usada en la presente invención es SEQ ID NO: 12:
G AAGACCTTTT GTGCT AACGCCAGTTT GGCAAATCAAGTT CT GATTTT GCAATT A TTTT GCT CCAT AT GAATT ACACTACTCCAAGAATT AT AAGCCTCTCTACAGCTTT A TCT CAAACTT AT GT AAAATT AG AGACGT AATT CAAACAC
En aún otra realización, el polinucleótido del tercer aspecto de la invención está unido operativamente al promotor EfTu, que está en dirección 5' del codón de inicio de la transcripción.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido del tercer aspecto de la invención que codifica la proteína de fusión.
La incorporación del polinucleótido del tercer aspecto de la invención en el vector se realiza mediante cualquiera de los protocolos de rutina conocidos por cualquier experto en el campo de la biología molecular.
En una realización del cuarto aspecto de la invención, el vector es del tipo minitransposón Tn4001 (Chopra-Dewasthali, R., et al. "First steps towards the genetic manipulation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis using the transposon Tn4001mod" Int. J. Med. Microb. 2005, vol. 294, pp. 447-453)
En una realización del cuarto aspecto de la invención, el vector es del mini-Tn4001PsPuro (número de registro de GenBank FJ872396).
La presente invención también describe que en el cuarto aspecto de la invención, el vector es de tipo minitransposón Tn4001PsPuro y el polinucleótido es uno que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con una secuencia del grupo que consiste en: SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO: 11 y (b) una secuencia que codifica el POI. En otra realización del cuarto aspecto de la invención, el vector es del mismo tipo que el citado anteriormente y el polinucleótido es uno que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia del grupo que consiste en: SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO: 11 y (b) una secuencia que codifica el POI.
La presente invención también describe que en el cuarto aspecto de la invención, el vector es del tipo minitransposón Tn4001PsPuro y el polinucleótido es uno que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con una secuencia del grupo que consiste en: SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO: 11, (b) una secuencia que codifica el o los POI; y (c) promotor EfTu ubicado en dirección 5' del codón de inicio de la transcripción. En otra realización del cuarto aspecto de la invención, el vector es del mismo tipo que el citado anteriormente y el polinucleótido es uno que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia del grupo que consiste en: SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO: 11, (b) una secuencia que codifica el o los POI; y (c) promotor EfTu ubicado en dirección 5' del codón de inicio de la transcripción.
La presente invención también describe que en el cuarto aspecto de la invención, el vector es de tipo minitransposón Tn4001PsPuro y el polinucleótido es uno que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con una secuencia del grupo que consiste en: SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO: 11 y (b) una secuencia que codifica el POI. En otra realización del cuarto aspecto de la invención, el vector es del tipo minitransposón Tn4001PsPuro y el polinucleótido es uno que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia del grupo que consiste en: SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO: 11 y (b) una secuencia que codifica el POI.
La presente invención también describe que en el cuarto aspecto de la invención, el vector es de tipo minitransposón Tn4001PsPuro y el polinucleótido es uno que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con una secuencia del grupo que consiste en: SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO: 11, (b) una secuencia que codifica el o los POI; y (c) promotor EfTu ubicado en dirección 5' del codón de inicio de la transcripción. En otra realización del cuarto aspecto de la invención, el vector es del tipo minitransposón Tn4001PsPuro y el polinucleótido es uno que comprende (a) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia del grupo que consiste en: SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO: 11, (b) una secuencia que codifica el o los POI; y (c) promotor EfTu ubicado en dirección 5' del codón de inicio de la transcripción.
En otra realización del cuarto aspecto de la invención, el vector comprende otros elementos reguladores para mejorar la expresión de la proteína de fusión, tales como sitios de unión a ribosomas, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, sitios de inicio de la traducción, coexpresión de otros polipéptidos que pueden usarse para la posterior selección de clones (genes informadores). El vector puede, por ejemplo, construirse de tal manera que permita la producción controlada de la proteína de fusión en circunstancias específicas, tal como, por ejemplo, la presencia o ausencia de un inductor.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende la proteína de fusión del
segundo aspecto de la invención o el vector del cuarto aspecto de la invención.
La expresión "célula hospedadora", como se usa en el presente documento, es una célula procariota que se ha modificado genéticamente para que exprese la proteína de fusión de la invención. En una realización particular, la "célula hospedadora" es una célula procariota en la cual se han introducido uno o más vectores o secuencias de ácido nucleico aisladas y purificadas de la invención. Se entiende que se refiere no solo a la célula objeto en particular, sino también a la progenie o posible progenie de dicha célula. Dado que en generaciones sucesivas pueden producirse algunas modificaciones debido a mutaciones o a influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, ser idéntica a la célula original, pero sigue estando incluida dentro del alcance de la expresión como se usa en el presente documento.
La célula hospedadora de la invención puede usarse como una "fábrica" del POI de interés, cultivándose in vitro en condiciones adecuadas (las condiciones dependerán de la célula específica). En esta realización, la célula se cultiva en un medio apropiado en condiciones adecuadas y comenzará la expresión de la proteína de fusión, es decir, el POI fusionado con el péptido. Gracias al péptido señal de la invención, el POI se exportará eficientemente a través de la membrana.
Alternativamente, si la célula hospedadora seleccionada está destinada a administrarse a un ser humano o a un animal no humano como herramienta terapéutica de tal manera que se produce un POI in situ, y es insegura o tóxica, la célula hospedadora seleccionada tiene que modificarse antes de su transformación con el vector de la presente invención para desarrollar una célula hospedadora segura y no tóxica.
En un aspecto adicional la presente invención proporciona una composición farmacéutica o veterinaria.
El término "farmacéutica o veterinariamente aceptable" se refiere a excipientes o vehículos que se usarán en tecnología farmacéutica o veterinaria, para preparar composiciones para uso médico, ya sea en seres humanos o animales. Cada uno de los componentes tiene que ser aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, debiendo ser compatible con los demás ingredientes de la composición farmacéutica o veterinaria. Tiene que ser también para su uso en contacto con tejidos u órganos humanos o animales sin dar lugar a una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o efectos secundarios.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a la cantidad de un compuesto o una célula hospedadora que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar en cierta medida, uno o más de los síntomas de la enfermedad que se aborda. La dosis particular administrada de acuerdo con la presente invención se determinará, por supuesto, según las circunstancias particulares del caso, incluyendo la célula hospedadora administrada, la proteína de fusión que produce, la vía de administración, la afección particular a tratar y consideraciones similares.
La proteína de fusión del segundo aspecto de la invención puede usarse, por ejemplo, para una diversidad de aplicaciones terapéuticas. Si el POI es un antígeno de proteína extraña, la proteína de fusión puede usarse para provocar una respuesta inmunitaria contra ella, siempre que la presencia de la señal peptídica (potenciador de la secreción) no altere su estructura y su función. Alternativamente, si el POI es una proteína terapéutica conocida por tener un efecto beneficioso, la proteína de fusión puede usarse en el tratamiento de enfermedades.
En una realización particular, la célula hospedadora es una célula hospedadora bacteriana. En otra realización, la célula hospedadora es una bacteria infecciosa. En otra realización particular del quinto aspecto de la invención, la célula hospedadora bacteriana pertenece al género Mycoplasma. En otra realización particular del quinto aspecto de la invención, la célula hospedadora bacteriana es Mycoplasma pneumoniae. En otra realización, es una célula hospedadora segura y no tóxica, ya sea de tipo silvestre o modificada por ingeniería genética. En otra realización, es una célula hospedadora modificada por ingeniería genética segura y no tóxica. En otra realización, es una célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética segura y no tóxica.
M. pneumoniae es un punto de partida ideal para diseñar una célula mínima para su uso como un chasis de terapia bacteriana. Tiene un genoma pequeño (860 kb) y ampliamente anotado y una rica colección de datos genómicos funcionales que describen su transcriptoma, metiloma, proteoma y metaboloma. También está disponible un modelo de equilibrio de flujo que describe su metabolismo. Además, está estrechamente relacionada con M. genitalium y M. mycoides cuyos genomas se han sintetizado químicamente, trasplantado y modelado integralmente. Adicionalmente, M. pneumoniae es muy adecuado para la terapia bacteriana porque es un patógeno pulmonar humano débil, se divide muy lentamente (8-20 h), hay cepas no patógenas, no tiene una envuelta de liposacárido (LPS) y se trata fácilmente con antibióticos disponibles en el mercado.
Como se ha indicado anteriormente, la proteína de fusión del segundo aspecto conserva la función del POI. Cuando el POI es un polipéptido terapéutico, la proteína de fusión o incluso la célula hospedadora del quinto aspecto de la invención pueden usarse en terapia. La célula hospedadora del quinto aspecto de la invención puede formularse de manera que mejore su administración en diferentes tejidos.
En una realización particular del séptimo aspecto de la invención, la proteína de fusión o la célula hospedadora se usan en el tratamiento de enfermedades pulmonares.
Las dos realizaciones anteriores pueden reformularse en un método de tratamiento de una enfermedad que comprende la administración de la proteína de fusión del segundo aspecto de la invención o la célula hospedadora del quinto aspecto de la invención en una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto que lo necesite y a un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar que comprende la administración de la proteína de fusión del segundo aspecto de la invención o la célula hospedadora del quinto aspecto de la invención en una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto que lo necesite, respectivamente.
Adicionalmente, las bacterias transformadas también podrían usarse para la dispersión de biopelículas bacterianas. Como es bien sabido, las bacterias son capaces de adherirse a las superficies con la ayuda de una biopelícula. Esto es, producen y secretan una serie de sustancias poliméricas extracelulares (básicamente proteínas y polisacáridos) que forman una matriz que les permite colonizar sustratos tanto orgánicos como inorgánicos. Esta matriz no sólo sirve como un medio de fijación, sino que también actúa como una barrera que a menudo convierte a las bacterias en resistentes a los antibióticos. Puede concebirse que las células hospedadoras de la presente invención podrían encontrar usos tanto terapéuticos como no terapéuticos relacionados con la destrucción de biopelículas bacterianas. Los péptidos de la presente invención pueden fusionarse con una serie de enzimas hidrolizantes capaces de descomponer la matriz de polisacáridos. Estas proteínas de fusión pueden encontrar aplicaciones tanto terapéuticas como no terapéuticas. Por tanto, también es parte de la invención:
(i) la célula hospedadora del quinto aspecto para su uso en la degradación de una biopelícula bacteriana. Esto se aplica, por ejemplo, a la fibrosis quística o cualquier otra enfermedad pulmonar que implique la formación de biopelículas.
(ii) el uso de la célula hospedadora del quinto aspecto de la invención para la degradación de biopelículas bacterianas (por ejemplo, para limpiar dispositivos médicos como catéteres donde podrían encontrarse biopelículas).
A lo largo de toda la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y variaciones de la palabra, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Adicionalmente, la palabra "comprende" y sus variaciones engloban la expresión "que consiste en". Los objetos, las ventajas y las características adicionales de la invención serán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse poniendo en práctica la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención. Adicionalmente, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.
EJEMPLOS
A) Material y métodos
Para producir y secretar proteínas terapéuticas, los inventores analizaron el secretoma de M. pneumoniae. Después, usaron este conocimiento para construir una serie de vectores para producir y secretar proteínas terapéuticas recombinantes en M. pneumoniae. Los medios de M. pneumoniae normales son ricos en proteínas que interfieren con el análisis de EM. Por lo tanto, los inventores usaron los medios mínimos de M. pneumoniae como medios de crecimiento básicos para su experimento (Yus, E. et al. "Impact dof genome reduction on bacterial metabolism and its regulation", Science 2009, vol. 326, p. 1263-1268) y reemplazaron la seroalbúmina bovina (BSA, por sus siglas en inglés) como vehículo lipídico por (2-hidroxi)propil-p-ciclodextrina (Hyprop).
Después de hacer crecer las células de M. pneumoniae durante 24 h y 72 h se recogió el medio sobrenadante y se obtuvieron las relaciones de las concentraciones de proteína intracelular y extracelular mediante marcado con dimetilo y análisis de espectroscopia de masas. En promedio, los inventores obtuvieron relaciones para 281 de 688 proteínas de M. pneumoniae por experimento.
Las proteínas con las proporciones extracelulares e intracelulares más altas se analizaron más a fondo mediante el algoritmo Signal P 3.0. Basándose en las señales de secreción predichas, los inventores diseñaron 11 vectores que comprenden un promotor y una señal de secreción fusionados con las proteínas terapéuticas. Como control negativo los inventores fusionaron los 50 restos N-terminales de una proteína citosólica (Mpn332) con las proteínas terapéuticas. Como promotor los inventores eligieron el promotor correspondiente a la secuencia codificante de la señal de secreción o si formaba parte de un operón con un promotor distal, los inventores lo pusieron bajo el control del promotor EfTu. Una lista detallada de todas las construcciones hechas, indicando el péptido señal y los promotores pueden encontrarse en las Tablas 1-3 que se encuentran a continuación para Alginato liasa, p53 y A1AT.
Tabla 1
Tabla 2
Tabla 3
Las tablas también indican si se predice que las señales de secreción pertenecen a lipoproteínas ancladas a la membrana (SμlI) o proteínas secretadas mediadas por sec (Sμl).
Los inventores clonaron las tres proteínas terapéuticas fusionadas con el péptido de secreción y el respectivo promotor en un vector miniTn4001-Puro-1 (número de registro de GenBank: KC816623). Las construcciones se ensamblaron y se ampliaron en E. coli antes de la transformación en M. pneumoniae. Los inventores determinaron los niveles de la proteína secretada mediante un ensayo de actividad para las construcciones de alginato liasa o mediante mediciones ELISA para A1AT y p53. En todos los casos, las construcciones bajo el control del promotor EfTu mostraron el nivel más alto de proteína secretada, mientras que no se detectó señal para el control negativo.
Los inventores diseñaron una batería de secuencias que, cuando se fusionan con proteínas heterólogas, dan como resultado su expresión y secreción eficientes. Para validar las secuencias de vectores, los inventores seleccionaron tres proteínas diferentes que tienen posibles aplicaciones terapéuticas y diferentes propiedades bioquímicas y de plegamiento: una enzima ejemplificada por poli M Alginato liasa A1-III (alginasa), una proteína oligomérica: p53 (que se pliega como un tetrámero) y una proteína con un pliegue difícil: Diantitripsina (A1AT).
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
Para construir vectores de ADN y construcciones de secreción se usaron diferentes cepas de E. coli. Principalmente Top10 (Life technologies), Stbl4 (Life technologies) o células cortadoras de copia (Epicentre). Las células se cultivaron a 30 °C-37 °C en medio LB o 2xTY con 100 ug/ml de Ampicilina para la selección.
La cepa M. pneumoniae M129 se cultivó en matraces T150 a 37 °C en medio Hayflick modificado como se describió anteriormente (Yus, E., et al. ibid). Cuando se seleccionó la resistencia a puromicina, se usaron 3 μg/ml. Para los estudios de proteómica de las proteínas secretadas, las células se cultivaron en medios mínimos modificados. Para hacer que los medios mínimos fueran compatibles con el análisis de EM, el vehículo lipídico BSA se intercambió por Hidroxipropil ciclodextrina 5 mM de peso molecular estimado de 1396 Da (Sigma H107).
Determinación experimental del secretoma
M. pneumoniae generalmente se cultiva en medio Hayflick modificado, un medio rico que contiene muchas proteínas del suero de caballo añadido. Las proteínas muy abundantes de los medios enriquecidos cubren la señal de las proteínas secretadas poco abundantes, lo que las hace inadecuadas para el análisis espectrométrico de masas (EM). Por tanto, inventores usaron el medio mínimo de M. pneumoniae como medio de crecimiento para nuestro experimento (Yus et al., ibid.). Este medio mínimo aún contiene albúmina de suero bovino (BSA) como vehículo lipídico en grandes cantidades. Los inventores reemplazaron BSA por (2-hidroxi)propil-p-ciclodextrina 5 mM (Hyprop) (Sigma H107 Número CAS 128446-35-5) (Greenberg-Ofrath et al., "Cyclodextrins as carriers of cholesterol and fatty acids in cultivation of mycoplasmas" Appl. Environ. Microbiol. 1993, vol. 59, p. 547-551) y así podría obtener un medio libre de proteínas compatible con el análisis EM posterior.
Para producir los presentes sobrenadantes, los inventores cultivaron M129 ts en medios normales durante 3 días. Antes de dividir los cultivos se lavaron dos veces con PBS mientras estaban unidos y dos veces después de raspar. Después los inventores lo dividieron 1:10 en un matraz de 150 cm2 que contenía 40 ml de medio Hyprop. Los inventores comenzaron en cada repetición del experimento con dos matraces, uno para cada punto de tiempo. Se permitió que las células se adhirieran durante 24 h y las células adheridas se lavaron dos veces de nuevo con PBS para retirar todas las cantidades traza del suero de caballo. Después los inventores dejaron que las células crecieran otras 72 h antes de retirar el sobrenadante y recolectar las células del primer matraz. Las células adheridas se resuspendieron exactamente en la misma cantidad de medio Hyprop que el sobrenadante retirado. En el otro matraz, solo se retiró el sobrenadante y las células adheridas se lavaron dos veces con PBS antes de añadir 35 ml de medio fresco. Después de 24 h este matraz se recogieron como el primero.
La suspensión celular siempre se procesó de forma idéntica y en paralelo a los sobrenadantes para evitar cualquier sesgo del procedimiento experimental sobre el resultado. Las muestras se precipitaron con acetona al 60 % (producto Sigma n.° 179124) y ácido tricloroacético (TCA) al 10 % (producto Sigma n.° T9159) como concentración final. La mezcla se centrifugó durante 1 h a 35000 g (4 °C). Se descartó el sobrenadante y los sedimentos se resuspendieron en 1,5 ml de TCA/acetona y se centrifugaron durante 2 h a 16000 g (4 °C). Se retiró el sobrenadante y el sedimento se secó por completo en un aspirador rápido antes de volver a disolverse en un tampón urea 8 M y NaHCO3100 mM usando un sistema bioruptor. Las cantidades totales de proteína en las muestras se determinaron usando el ensayo BCA (producto Pierce n.° 23225). A continuación, la instalación de Proteómica del UPF-CRG normalizó, digirió y marcó las muestras. Los inventores usaron el marcaje con dimetilo para marcar las diferentes muestras. Se usaron tres Marcadores pesado, medio y ligero. Cantidades iguales de las muestras mezcladas y analizadas por nano CL/EM/EM para obtener proporciones de concentraciones de proteína intracelular a extracelular como se describió anteriormente (Boersema et al., "Multiplex peptide stable isotope dimethyl labelling for quantitative proteomics" Nat. Protoc. 2009, vol. 4, pp. 484-494). Los inventores calcularon el valor de p de una distribución bimodal mediante métodos convencionales. Los inventores eligieron un valor p conservador de 0,001 como umbral para definir una proteína como secretada.
Métodos de biología molecular
Todas las construcciones se clonaron en el vector mini-Tn4001-Puro (número de registro de GenBank: KC816623).
En primer lugar, los inventores generaron un conjunto de vectores que contenían las señales de secreción y los promotores. Todos los fragmentos que comprenden diferentes señales de secreción y promotores se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genómico de M. pneumoniae. Para las señales de secreción que portan su propio promotor, los inventores introdujeron los sitios PstI y EcoRI para la clonación de restricción durante la PCR y clonaron el fragmento mediante ligación rápida. En los casos en que la señal de secreción no tenía promotor propio y se usaba el promotor EfTu, los inventores generaron las construcciones mediante el método de ensamblaje isotérmico. Los salientes colgantes de 20 pb necesarios para el ensamblaje se introdujeron mediante PCR. Las secuencias detalladas de los cebadores usados se enumeran en la Tabla 4, encontrada a continuación:
Tabla 4.
Los vectores resultantes derivados del vector mini-Tn4001-Puro se linealizaron usando las enzimas de restricción EcoRI (NEB R0101) y Pstl-Hf (NEB R3140) y posteriormente se desfosforilaron usando fosfatasa antártica (NEB M0289). Las diferentes proteínas terapéuticas se sintetizaron y se clonaron en los vectores digeridos con EcoRI y Pstl-Hf.
Mpn142 Opt (diseño y clonación)
La señal de secreción de Mpn142 (primeros 93 pb de codificación) se pidió a DNA 2.0, la empresa cambió la elección del codón para reducir la estructura secundaria en la región de la señal de secreción. Después los inventores clonaron esta secuencia como fusión con las proteínas diana. Para la clonación, los inventores usaron la clonación Gibson y eliminaron el sitio de restricción Pstl usado anteriormente.
Varias publicaciones mostraron que la estructura secundaria en el extremo 5' de un ARNm influye en la eficiencia transcripcional. Recientemente, se ha demostrado que este efecto se enfatiza en el ARNm sin un sitio RBS claramente definido. La mayoría de los transcritos de M. pneumoniae carecen de un sitio RBS y todas las construcciones para la producción y secreción de alginato liasa se diseñaron sin un sitio RBS. Por lo tanto los inventores plantearon la hipótesis de que una reducción de la estructura secundaria del ARNm en la señal de secreción podría mejorar la eficiencia de la traducción.
Expresión y evaluación de la actividad en diferentes proteínas.
Ensayo de actividad de elastasa de neutrófilos.
Los inventores midieron la actividad de A1AT indirectamente a través de la inhibición de la elastasa de neutrófilos. La actividad de la elastasa de neutrófilos se midió mediante un ensayo colorimétrico o basado en fluorescencia. Para esto, se usó el sustrato disponible en el mercado N-Metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilida (producto Sigma n.° M4765) o la escisión de un sustrato de fluorescencia inactivado N-Metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-AMC (producto de Merck millipore n.° 324740). El tampón de reacción es Tris 0,1 M pH 7,5. En el ensayo colorimétrico se siguió la
liberación de 4-nitroanilina libre a 400 nm y en el ensayo de fluorescencia se usó una excitación de 370 nm y se registró la emisión a 445 nm.
Enriquecimiento de A1AT para mediciones de actividad de elastasa de neutrófilos.
Para medir el sobrenadante de medios mínimos concentrados, los inventores primero mejoraron la condición de cultivo para reducir al mínimo el remanente de caballo A1AT originado en el precultivo. Los inventores cultivaron un precultivo en medio completo de Hayflick, el medio se retiró y las células se lavaron dos veces con PBS. Después, las células se rasparon y se dividieron 1:10 en medio mínimo. El medio mínimo se aspiró y se reemplazó por medio nuevo después de 24 horas. El cultivo se hizo crecer durante 48 y después se recogió el sobrenadante. Para medir la actividad de A1AT en medios concentrados, se redujeron 200 μl de sobrenadante a un volumen de 20 μl usando un dispositivo de ultrafiltración Amicon con un corte de 30 kDa y luego se analizó la actividad de A1AT.
Para enriquecer A1AT mediante cromatografía de afinidad, los inventores usaron Strep-Tagll fusionado con A1AT. Los inventores recolectaron el sobrenadante de una placa de cultivo de 300 cm2 con células cultivadas en medio Hayflick completo. El medio se pasó por una columna StrepTrap HP de 1 ml (producto n.° 28-9075-46 de GE Healthcare). A continuación, la columna se lavó con 6 volúmenes de columna de tampón de lavado (Tris 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM) y posteriormente se eluyó con tampón de lavado suplementado con destiobiotina 2,5 mM. La concentración de A1AT se determinó por ELISA.
Cuantificación de P53 y A1AT por ELISA
Los inventores usaron kits disponibles en el mercado para la cuantificación de A1AT humana (Producto USCN N.°: SEB697Hu) y un p53 pan ELISA (Producto Roche N.°: 11828789001). Para el ensayo, los inventores siguieron las instrucciones del fabricante.
Ensayo de alginato liasa
Para medir la actividad de alginato liasa en medio completo se usó el ensayo desarrollado por Kitamikado, M., et al. "Method designed to detect alginate-degrading bacteria" Appl. Environ. Microbiol. 1990, vol, 56, pp. 2939-2940). Brevemente, se añade un 0,1 % de sustrato de alginato al medio y con las células. En diversos momentos se colocan 0,2 ml del sobrenadante del medio en un tubo de ensayo y 2,0 ml de una solución de albúmina ácida (3,26 g de acetato sódico, 4,56 ml de ácido acético glacial, 1,0 g de albúmina bovina fracción V se llenan hasta 11 con agua y se ajusta el pH a 3,75 con HCl). En presencia de alginato polimérico se forma un precipitado blanco. Después se transfiere una pequeña alícuota de la mezcla a una placa y se mide la absorbancia.
Los inventores probaron diferentes longitudes de onda para la relación señal/ruido y descubrieron que 300 nm era la más sensible, mientras que todo hasta 660 nm dio buenas lecturas confiables.
B) Resultados
En general, los resultados presentados aquí son la prueba de concepto de que M. pneumoniae puede usarse como un sistema de suministro para expresar y secretar proteínas activas con una diversidad de aplicaciones, incluyendo aquellas relacionados con la terapia.
Muestran que es posible modificar por ingeniería genética M. pneumoniae para producir y secretar proteínas terapéuticas. Los inventores pudieron producir y detectar en el sobrenadante 3 proteínas diferentes, dos de las cuales son de origen humano (p53/A1AT) y de las cuales solo dos son normalmente secretadas (alginato liasa/A1AT). Los inventores pudieron demostrar que el presente vector de secreción funcionaba de forma fiable con la misma construcción y obtenía los mayores rendimientos para las tres proteínas. Además, los presentes inventores pudieron demostrar que dos de las tres proteínas están correctamente plegadas y activas después de la secreción.
Análisis cuantitativo de las proteínas secretadas por M. pneumoniae.
Los inventores diseñaron 11 vectores que comprenden un promotor y una señal de secreción fusionados con las tres proteínas terapéuticas (A1AT, p53, alginasa). Como un control negativo, los inventores fusionaron un fragmento de la misma longitud correspondiente al extremo N de una proteína citosólica (Mpn332) con las tres proteínas.
Análisis cuantitativo de p53 secretada por M. pneumoniae
Después de transformar las células de M. pneumoniae con cada una de las construcciones de p53 modificadas por ingeniería genética, la secreción de p53 se verificó mediante el uso de un pan ELISA tipo sándwich de p53 (Roche). Para evaluar la dinámica de la acumulación de p53 en el sobrenadante, las concentraciones absolutas de p53 en los medios se midieron en varios momentos después de la inoculación. Los inventores caracterizaron la secreción de proteínas tanto en medio Hayflick modificado (Medio completo) como McCoy, que se usan comúnmente para el cultivo de células de mamíferos. Los resultados de la secreción en medio McCoy se resumen en la FIG. 1. Las construcciones Mpn-142 y Mpn-645 bajo el control del promotor Eftu mostraron la mayor concentración de p53 en el medio sobrenadante. Curiosamente, la concentración de p53 en el sobrenadante para la mayoría de las construcciones alcanzó su punto máximo a las 48 h cuando las células entran en la fase estacionaria y después volvió a caer lentamente. Esto podría indicar una regulación de la secreción o la expresión génica que está relacionada con el cambio de las fases de crecimiento exponencial a estacionaria. También, un equilibrio entre la secreción y la
descomposición extracelular por parte de las proteasas podría explicar este resultado.
Análisis cuantitativo y funcional de la alginato liasa A1-III secretada por M. pneumoniae
Los inventores analizaron además la secreción y la actividad de la alginato liasa en M. pneumoniae. Primero, el gen se clonó en nuestras construcciones de secreción y después se transformó en M. pneumoniae. Para evaluar la eficacia de la secreción, los inventores usaron un ensayo para la actividad de alginato liasa. Al igual que con las construcciones de p53, las dos construcciones con la alginato liasa bajo el control del promotor EfTu y con las señales de secreción de Mpn-142 y Mpn-645 se comportaron mejor (FIG. 2). Ambos mostraron degradación del alginato en los medios ya en el día 1. Mientras que la mayoría de las construcciones no mostraron signos de degradación del alginato incluso después de 5 días de incubación. Las construcciones con las señales de secreción de Mpn-200 y Mpn-400 que están ambos bajo su respectivo promotor mostraron degradación de alginato en el día 2 y el constructo con la señal de secreción de Mpn-489 y su respectivo promotor mostraron degradación solo en el día 5 después de la inoculación. El control negativo que está fusionado con los 50 aminoácidos N-terminales de la proteína citosólica Mpn-332 no mostró signos de degradación. No se observaron diferencias en la tasa de crecimiento de diferentes cepas de M. pneumoniae en comparación con ts, lo que indica que la actividad del promotor es un factor determinante para la producción y secreción de alginato liasa.
Con el fin de probar si este sistema podría implementarse en una cepa menos inmunogénica, los presentes inventores probaron si las construcciones de secreción también funcionan en una cepa no adherente. Esta cepa carece de parte de la maquinaria de adherencia y deslizamiento, principales factores de virulencia y patogenicidad. Los resultados obtenidos en la cepa no adherente coincidieron con los resultados obtenidos en la cepa M129 ts, lo que implica que los mismos vectores de secreción pueden usarse en la cepa no patógena.
Para mejorar los niveles de producción de proteínas, los inventores diseñaron una nueva señal de secreción Mpn-142 (Mpn-142(Opt) (que corresponde a SEQ ID NO:7) con una estructura secundaria minimizada en el 5' del ARNm. La construcción todavía estaba bajo el control del promotor EfTu pero los codones para la señal de secreción se cambiaron de la secuencia ts siguiendo las recomendaciones de la compañía DNA 2.0. Los inventores habían observado anteriormente que M. pneumoniae crece mejor en medio Hayflick (completo) que en el medio mínimo modificado de los presentes inventores usados para caracterizar el secretoma. Para cuantificar las cantidades máximas de alginato liasa producidas por las diferentes cepas, los inventores establecieron así un ensayo cuantitativo compatible con medios completos basados en el ensayo cualitativo usado anteriormente (Kitamikado et al., ibid). La actividad absoluta de alginato liasa de los medios de 2 cepas se determinó en diferentes momentos. Los niveles de actividad más altos se observaron para la cepa Mpn-142 (Opt). En el medio de la cepa M. pneumoniae transformada con Mpn-142 (Opt), los inventores midieron una actividad correspondiente a ~0,1 Unidades de alginato liasa. Esto corresponde a ~0,01 mg/ml de alginato liasa (Sigma A1603) que los presentes inventores usaron como patrón en su ensayo cuantitativo.
Los inventores finalmente probaron los sobrenadantes de las cepas Mpn-142 (Opt) y Mpn-142 en un ensayo de biopelícula de P. aeruginosa. Los inventores no observaron actividad antibiopelícula mientras que un control positivo de medio que contenía la misma cantidad de actividad de alginato liasa, de una alginato liasa comercial (Sigma A1603) mostró actividad antibiopelícula.
Se ha descrito que la DNAsa mejora la descomposición de las biopelículas de P. aeruginosa. En base a este estudio, los inventores investigaron si el sobrenadante del medio M. pneumoniae M129 contiene actividad DNasa que ya podría proporcionar esta función. Con este fin, los inventores midieron la degradación del ADN del fago lambda en el medio de un cultivo M129 TS. Después de 1 h de incubación a 37 °C, la mayor parte del ADN se digirió, lo que indica una fuerte actividad de DNasa en el sobrenadante de M. pneumoniae M129 ts. Solo se observaron signos menores de degradación en la reacción de control correspondiente a los medios que no habían estado en contacto con las células. Análisis cuantitativo de A1AT secretada por M. pneumoniae
Para probar la actividad de AA1T secretada por M. pneumoniae, los primeros inventores midieron el nivel de expresión de proteína en el sobrenadante para cada cepa usando un kit ELISA de USCN. Como se muestra en la FIG. 3a a, la secreción de AAT es mejor usando medio completo. Se obtienen los mejores niveles de secreción, como en los casos anteriores, de las cepas Mpn-142 y Mpn-645 con un rendimiento de 250 ng/ml y 130 ng/ml respectivamente usando el medio completo y 152 ng/ml y 20 ng/ml usando el medio mínimo después de 73 h de cultivo. Al igual que con p53, los inventores observaron que la concentración de proteína en el sobrenadante alcanzó su punto máximo después de 2-3 días y luego disminuyó (FIG. 3a). Los inventores probaron si la degradación de la proteína secretada por una proteasa extracelular es el mecanismo que causa este pico. Por tanto, los inventores enriquecieron el sobrenadante de un cultivo de una M. pneumoniae ts cultivado en medio Hayflick mínimo o completo con A1AT 300 nM y lo incubaron durante 96 h. Los inventores midieron el efecto inhibidor sobre la elastasa de neutrófilos en diferentes momentos. Todas las muestras mostraron una inhibición máxima constante que indica que no hubo una degradación significativa en el sobrenadante a lo largo del tiempo. Los inventores realizaron una prueba similar con BSA en el sobrenadante y tampoco pudieron observar ningún efecto proteolítico en un gel SDS.
Después los inventores analizaron si la A1AT secretada era funcional. Desafortunadamente, el medio Hayflick
completo que produce las concentraciones más altas de proteínas también contiene un alto nivel de A1AT de caballo. Esta A1AT de caballo interfiere con los ensayos funcionales de elastasa de neutrófilos mientras no aparece en las mediciones de ELISA. Las cantidades de A1AT secretadas en el medio mínimo están por debajo de la concentración mínima necesaria para el ensayo funcional de 10 a 30 nM (500 ng/ml - 1500 ng/ml) (FIG. 3A). Para alcanzar la concentración de 10 a 30 nM de AAT en el sobrenadante del cultivo Mpn-142, los inventores concentraron las muestras de medios mínimos usando ultrafiltración con un dispositivo ultra-30K (Amicon). Como se muestra en la FIG. 3b El sobrenadante concentrado mostró una inhibición completa de la actividad NE en comparación con el sobrenadante concentrado TS. Sin embargo, los inventores observaron una disminución de la actividad de NE en el medio mínimo solo en comparación con nuestra reacción de control en tampón que solo sugiere una inhibición inespecífica de la actividad de NE después de la reducción de volumen.
Para verificar aún más la actividad de AAT secretada por M. pneumoniae, se realizó un proceso de purificación. Los inventores usaron un Strep Tag II que se introdujo en el extremo C de la proteína junto con una columna Strep Tactin para enriquecer la proteína. La unión de la proteína a la columna fue débil muy probablemente debido a la baja concentración de A1AT en el medio en comparación con la Kd del Strep Tag II. Ni los menos inventores pudieron enriquecer y purificar significativamente la A1AT del medio completo. Los inventores probaron después la proteína purificada en una prueba de actividad de elastasa de neutrófilos y pudieron demostrar que la A1AT producida por M. pneumoniae es tan activa como la A1AT producida por E. coli (FIG. 3c).
Después de transformar las células de M. pneumoniae con cada una de las construcciones de p53, A1AT y alginasa modificadas por ingeniería genética, los inventores verificaron la secreción en el sobrenadante en Hayflick modificado (medio completo) en diferentes momentos usando diferentes análisis. En el caso de la secreción de p53 se verificó mediante el uso de un ELISA tipo sándwich de p53 (Roche). En el caso de la alginasa, los inventores comprobaron la actividad enzimática (degradación del alginato) en el sobrenadante. Finalmente, para A1AT, los inventores también comprobaron la expresión en medio mínimo debido a la abundancia de A1AT de caballo en el medio.
En los tres casos, se encontraron resultados similares (FIG. 1 -FIG. 3) con las construcciones Mpn-142 y Mpn-645 bajo el control del promotor EfTu mostrando la mayor concentración en los medios sobrenadantes. No se observaron diferencias en la tasa de crecimiento de diferentes cepas de M. pneumoniae en comparación con TS, lo que indica que la actividad del promotor es un factor determinante para la producción y secreción de las proteínas. Estos resultados indican que las señales de secreción de P. pneumoniae seleccionadas funcionaron de manera similar con proteínas muy diferentes y que: las enzimas, las proteínas oligoméricas o los plegamientos difíciles pueden producirse y liberarse al medio de manera eficaz. Para la mayoría de las construcciones y casos, la concentración en el sobrenadante en medio rico alcanzó su punto máximo a las 48 h y después volvió a caer lentamente. Esto podría indicar una regulación de la secreción o la expresión génica que está relacionada con el cambio de las fases de crecimiento exponencial a estacionaria. También, un equilibrio entre la secreción y la descomposición extracelular por parte de las proteasas podría explicar este resultado.
Prueba de otras cepas y mejora de la producción.
Para probar si el sistema de secreción podría implementarse en una cepa no patógena, los inventores probaron si las construcciones de alginasa también podrían funcionar en una cepa no adherente. Esta cepa carece de parte de la maquinaria de adherencia y deslizamiento, que son los principales factores de virulencia y patogenicidad. Los resultados obtenidos en la cepa no adherente coincidieron con los resultados obtenidos en la cepa M129 lo que implica que los mismos vectores de secreción pueden usarse en cepas no patógenas.
Para mejorar los niveles de producción de proteínas, los inventores diseñaron una nueva señal de secreción Mpn-142 (Mpn-142(Opt) con una estructura secundaria minimizada en el 5' del ARNm. La construcción todavía estaba bajo el control del promotor EfTu pero los codones para la señal de secreción se cambiaron de la secuencia ts. Para cuantificar las cantidades máximas de alginato liasa producidas por las diferentes cepas, se estableció un ensayo cuantitativo compatible con medio completo basado en un ensayo cualitativo usado previamente. La actividad absoluta de alginato liasa de los medios de las cepas MPN142 y MPN142 (Opt) se determinó en diferentes momentos. Los niveles de actividad más altos se observaron para la cepa Mpn-142 (Opt) en el medio de la cepa de M. pneumoniae transformada con Mpn-142 (Opt). Los inventores midieron una actividad correspondiente a ~0,1 Unidades de alginato liasa. Esto corresponde a ~0,01 mg/ml de alginato liasa (Sigma A1603) que se usó como patrón en el ensayo cuantitativo. REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD
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Kitamikado, M., et al. "Method designed to detect alginate-degrading bacteria" Appl. Environ. Microbiol. 1990, vol, 56, pp. 2939-2940
Claims (15)
1. Un péptido que comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una de las secuencias del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y SEQ ID NO: 6.
2. El péptido de la reivindicación 1 que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2; o SEQ ID NO: 3.
3. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de interés y al menos un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el polipéptido de interés es heterólogo al al menos un péptido.
4. La proteína de fusión de la reivindicación 3, en donde la proteína de fusión comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
5. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en donde el polipéptido de interés se selecciona del grupo que consiste en p53, Alginato liasa A1-III y a1-antitripsina.
6. Un polinucleótido que codifica el péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5.
7. El polinucleótido de la reivindicación 6 unido operativamente a un promotor.
8. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7.
9. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 8.
10. La célula hospedadora de la reivindicación 9, en donde la célula es una célula bacteriana.
11. La célula hospedadora de la reivindicación 10, en donde la célula hospedadora bacteriana es Mycoplasma pneumoniae.
12. Una composición farmacéutica o veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3-5 o la célula hospedadora como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que es una célula segura y no tóxica, junto con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
13. Uso del péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 como un péptido de secreción de un polipéptido de interés.
14. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5 o la célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 para su uso en terapia.
15. La proteína de fusión o la célula hospedadora de la reivindicación 14 para su uso en el tratamiento de enfermedades pulmonares.
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