CN107201348A - 细粒棘球绦虫Sigma‑谷胱甘肽S‑转移酶重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供细粒棘球绦虫Sigma‑谷胱甘肽S‑转移酶重组蛋白，所述细粒棘球绦虫Sigma‑谷胱甘肽S‑转移酶重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。本发明还提供其可溶性表达方法，应用本发明的方法可实现Sigma‑GST的高水平表达，且表达的重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白75%。本发明还提供使用HisPur Cobalt（Clontech）亲和层析从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组Sigma‑GST的蛋白纯化方法，可制备大量高纯度的细粒棘球绦虫Sigma‑GST。将该纯化蛋白作为包被抗原，可制备得到一种用于检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒。

Description

细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白及其可溶性 表达方法和纯化方法
技术领域
本发明涉及一种细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法。
背景技术
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是一种具有多种生理功能的酶，该酶在微生物、植物、昆虫、鸟类及哺乳动物细胞内广泛存在。在哺乳动物体内共发现 8类细胞质 (Alpha , Mu，Pi，Theta，Sigma，Zeta，Kappa，Omega ) GSTs。GST在解毒内源和外源性有毒物质中起着重要作用，GST能催化内源还原性谷胱甘肽（GSH）与各种有害的亲电性底物相结合，增加有害物质的可溶性从而有利于其从细胞内排出，起到解毒的作用，进而保护生物体内的核酸和蛋白质免受亲电基团攻击。同时也参与胞内物质转运、激素的合成和细胞氧化应激损伤的保护。寄生蠕虫的 GST 被认为是对蠕虫感染化学治疗理想的药物靶标。基于以上研究背景，本发明构建了编码细粒棘球绦虫Sigma-GST基因的原核表达质粒，转化入大肠杆菌表达系统，诱导其表达，并进行蛋白纯化，得到了该蛋白，为包虫病治疗药物的研究提供了有效的药物靶点，并有望用于囊型包虫病患者的免疫诊断。
发明内容
本发明通过基因工程技术，提供了一种细粒棘球绦虫Sigma-GST原核表达载体pET30a-Sigma-GST，利用该载体转化大肠杆菌（BL21-DE3）实现了Sigma-GST的高水平可溶性表达。并提供了一种亲和层析纯化方法，纯化出了大量高纯度的新的细粒棘球绦虫Sigma-GST，用于GST生化特性分析、功能的研究及抗包虫药物的研发及囊型包虫病患者的免疫诊断。
本发明的第一个目的是提供细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白，所述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
作为优选，所述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1中第63位-701位碱基。
本发明的第二个目的是提供上述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的可溶性表达，步骤如下：
（1）目的基因Sigma-谷胱甘肽S-转移酶的扩增；
（2）构建Sigma-GST表达质粒：将步骤（1）制备的目的基因Sigma-谷胱甘肽S-转移酶纯化后酶切，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-Sigma-GST；
（3）将步骤（2）制备的质粒pET30a-Sigma-GST转化入E.Coli BL21(DE3)感受态细胞中，将活化表达的菌液加入LB液体培养基中，置于摇床上于37℃，160r/min振荡培养4小时，再加入0.2mmol/L的 IPTG于20℃诱导振荡培养7小时，离心、超声后收集上清。
本发明的第三个目的是提供上述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤如下：
（1）清洗HisTALONTM Gravity Columns 预装柱；
（2）加入结合缓冲液，所述结合缓冲液为：50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0；
（3）加入细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白上清液，
（4）加入漂洗缓冲液，所述漂洗缓冲液的配方为：50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，20mM/L咪唑，pH8.0；
（5）加入1号洗脱液，所述1号洗脱液的配方为：50mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/LNaCl，pH7.4；
（6）加入2号洗脱液，所述2号洗脱液的配方为：100mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4；
（7）加入3号洗脱液，所述3号洗脱液的配方为：200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4；
（8）加入4号洗脱液，所述4号洗脱液的配方为：300mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4；
（9）加入5号洗脱液，所述5号洗脱液的配方为：400mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4；
（10）分别收集4号和5号洗脱液。
作为优选，所述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白上清液与1号洗脱液、2号洗脱液、3号洗脱液、4号洗脱液、5号洗脱液的体积比为2:1:1:1:1:1。
本发明还提供上述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白在制备检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒中的应用。
本发明还提供一种检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒中包被抗原为权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白。
作为优选，所述包被抗原用pH 9.6 的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释至终浓度 6 μg/ml。
作为优选，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为含有5%脱脂奶粉的TBST，所述百分比的单位为g/ml。
作为优选，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为过氧化物酶标记的羊抗人IgG。
本发明公布了一种新的细粒棘球绦虫Sigma-GST基因序列及其编码的蛋白质序列，并应用分子克隆技术构建细粒棘球绦虫Sigma-GST的原核表达载体pET30a-Sigma-GST，然后将上述原核表达载体pET30a-Sigma-GST转化大肠杆菌（BL21-DE3），在较低温度、较低诱导剂浓度及较短诱导时间条件下诱导该菌，可实现Sigma-GST的高效可溶性表达：用0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）于20℃诱导振荡培养E.Coli BL21(DE3)-pET30a-Sigma-GST 7小时，重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白的75%；最后用HisPur Cobalt（Clontech）亲和层析纯化蛋白，纯化蛋白的操作简单，成本低，极易重复使用，在使用4号洗脱液（300mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl）2ml和5号洗脱液（400mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl）2ml时可得到一种高纯度的细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶。
本发明所制备的重组蛋白可以用于囊型包虫病患者的免疫诊断，其作为免疫抗原能够被囊型包虫病患者血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测符合率高达95％。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为细粒棘球绦虫Sigma-GST基因PCR扩增；其中，M，MarkerⅢ；1，细粒棘球绦虫pBluescript ⅡSK Sigma-GST重组质粒DNA 提取结果；2，Sigma-GST PCR扩增产物；
图2为细粒棘球绦虫Sigma-GST在不同诱导条件下的原核表达；
图3为细粒棘球绦虫Sigma-GST在最佳诱导条件下的原核表达；
图4为细粒棘球绦虫Sigma-GST HisPur Cobalt亲和层析纯化。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1细粒棘球绦虫Sigma-GST基因序列及其编码的蛋白质序列
细粒棘球绦虫Sigma-GST全长813个核苷酸，最大的开放阅读框（ORF）位于第63-701位，含639bp，起始密码子为atg，终止密码子为taa，编码212个氨基酸，其核苷酸序列及ORF编码的氨基酸序列分别见序列表中SEQ ID No.1和2。
核苷酸序列
编码的氨基酸序列
实施例2 细粒棘球绦虫Sigma-GST的原核表达载体pET30a-Sigma-GST的克隆构建
细粒棘球绦虫Sigma-GST的原核表达载体pET30a- Sigma-GST可以按照下述方法进行构建；也可以先提取细粒棘球绦虫RNA，再转录成cDNA，以其为模板进行克隆构建；提取RNA和转录的方法为本领域的常规方法。
1、目的基因Sigma-GST的扩增
以细粒棘球绦虫pBluescript ⅡSK Sigma-GST（细粒棘球绦虫pBluescript ⅡSKSigma-GST从海南医学院寄生虫学教研室获得，社会公众也可从该教研室获得）为模板,根据细粒棘球绦虫Sigma-GST基因序列设计如下两对引物：上游引物序列为：GCGAATTCATGGATCTACAAC，
下游引物序列为：CCAAGCTTTTAGAAATCGG，
扩增Sigma-GST基因最大的开放阅读框（ORF）中的基因序列（即63-701位基因序列），PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，69℃复性30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min；扩增产物电泳结果见图1。
2、构建Sigma-GST表达质粒
PCR产物经纯化后，扩增得到片段被EcoRⅠ和Hind III酶切并纯化后，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-Sigma-GST，经测序鉴定，Sigma-GST的序列信息与目标基因序列一致：核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1中第63-701位，编码212个氨基酸，编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
实施例3细粒棘球绦虫Sigma- GST的原核表达
在不同诱导条件下，重组蛋白的可溶性表达量有所不同，以下为最佳诱导方法：
制备E.Coli BL21(DE3)感受态细胞，将实施例2制备得到的质粒pET30a-Sigma-GST转化入E.Coli BL21(DE3)中，将活化表达Sigma-GST的E．coli BL21(DE3)菌液1ml，移入500mL LB液体培养基中，置于摇床上于37℃，160r/min振荡培养4小时，再加入IPTG（0.2mmol/L）于20℃，120r/min诱导振荡培养7小时；4℃12000rpm离心10min收集细菌；超声破碎细菌，功率240W，超声5S，间歇5S，20min后提取上清，并进行SDS-PAGE电泳，可见蛋白在上清液中表达量很高，呈可溶性表达（见图2），可溶性蛋白表达量高，占大肠杆菌可溶性总蛋白75%。
为了寻找到最佳诱导条件，申请人进行了大量实验，图2为细粒棘球绦虫Sigma-GST在不同诱导条件下的原核表达。
其中，A图中，M：Marker；1-5泳道分别为：BL21（DE3）-pET30a-Sigma-GST于 37℃，IPTG浓度分别为1、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L，诱导12小时后上清液的电泳图；
B图中，M：Marker；1-4泳道分别为：BL21（DE3）-pET30a-Sigma-GST于 25℃，IPTG浓度分别为0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L，诱导12小时后上清液的电泳图；5-6泳道分别为：BL21（DE3）-pET30a-Sigma-GST于 20℃，IPTG浓度为0.2mmol/L，分别诱导12,10小时后上清液的电泳图。
由图2可见，在诱导温度为37℃，IPTG浓度分别为1、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L，诱导12小时后，在上清液中有可溶性表达的Sigma-GST，但是表达量很小。
将诱导温度降至25℃，IPTG浓度分别为0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L，诱导12小时后，可见上清液中可溶性表达的Sigma-GST的量较37℃诱导时有所增加。
进一步降低诱导温度至20℃，IPTG浓度为0.2mmol/L，分别诱导12,10小时后，可使上清液中Sigma-GST的表达量进一步增加，且诱导10小时比诱导12小时表达量更多。进一步缩短诱导时间至7小时，可使上清液中Sigma-GST表达量更多，最后优化表达条件为20℃，IPTG浓度为0.2mmol/L，诱导7小时，可使Sigma-GST呈高效可溶性表达，占大肠杆菌可溶性总蛋白75%（见图3），故将此条件作为Sigma-GST原核诱导表达的最优条件。
图3为细粒棘球绦虫Sigma-GST在最佳诱导条件下的原核表达。其中，M：蛋白Marker；1，BL21（DE3）空菌诱导后上清；2，BL21（DE3）-pET30a- Sigma -GST上清原样。
实施例4 细粒棘球绦虫Sigma-GST的亲和层析纯化
应用HisPur Cobalt（Clontech）纯化系统纯化目的蛋白。HisTALONTM GravityColumns预装柱购自日本Clontech公司，型号为：635655。
在滴加各种物质时，滴加速度为1滴/10秒。
不同的纯化方法得到的重组蛋白的纯化效果不同，需要对纯化方法进行优化。以下为部分优化过程：
加入20ml超纯水于HisPur Cobalt预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；加入20ml Tris-结合缓冲液（20mM/L Tris，500mM/L NaCl，20mM/L咪唑，pH8.0）,使其缓慢的流过柱内填充的介质；上样，加入4ml通过超声破碎E.Coli BL21(DE3)- pET30a-Sigma-GST提取的上清液,轻轻摇晃悬浮起介质，将该亲和柱置于摇床上，室温下轻轻振摇5分钟后控制流速使上清液缓慢流过柱内介质；加入40ml Tris-结合缓冲液（20mM/L Tris，500mM/LNaCl，20mM/L咪唑，pH8.0）,控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入50mM/L 咪唑-tris洗脱液（50mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/L NaCl，pH8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入100mM/L 咪唑-tris洗脱液（100mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/L NaCl，pH8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入200mM/L 咪唑-tris洗脱液（200mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/L NaCl，pH8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入300mM/L 咪唑-tris洗脱液（300mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/L NaCl，pH8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入400mM/L 咪唑-tris洗脱液（400mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/L NaCl，pH8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集。将收集的洗脱液分别进行SDS-PAGE分析，检查蛋白的纯化程度，见图4中的A图。
图4为细粒棘球绦虫Sigma-GST HisPur Cobalt亲和层析纯化结果。
其中，在A图中，M：Marker；1，50mM/L 咪唑-tris洗脱液；2，100mM/L 咪唑-tris洗脱液；3，200mM/L 咪唑-tris洗脱液；4，300mM/L 咪唑-tris洗脱液；5，400mM/L 咪唑-tris洗脱液。
由图4中的A图可见：用50mM/L 咪唑-tris洗脱液并未将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，分别用100mM/L 、200mM/L、300mM/L、400mM/L咪唑-tris洗脱液能够将目的蛋白洗脱下来，但是蛋白纯度不高，杂蛋白含量很高，故进一步优化蛋白纯化条件，使用以下方法进行纯化。
加入20ml超纯水于HisPur Cobalt预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；加入结合缓冲液（50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0）20ml；上样，加入4ml通过超声破碎E.Coli BL21(DE3)- pET30a-Sigma-GST提取的上清液，轻轻摇晃悬浮起介质，将该亲和柱置于摇床上轻轻振摇5分钟后，控制流速使上清液缓慢流过柱内介质；加入40ml漂洗缓冲液（50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，20mM/L咪唑，pH8.0），控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入1号洗脱液（50mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质；加入2号洗脱液（100mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质；加入3号洗脱液（200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质；加入4号洗脱液（300mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5ml EP管收集该洗脱液；加入5号洗脱液（400mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5ml EP管收集该洗脱液。将收集的4号和5号洗脱液分别进行SDS-PAGE分析，检查蛋白的纯化程度，最终得到纯度很高的Sigma-GST，该蛋白分子量约为23.43KD。SDS-PAGE结果见图4中的B图。
在图4的B图中，M：Marker ；1，BL21（DE3）-pET30a-Sigma-GST上清原样；2，蛋白上样过柱后流穿液；3，收集的漂洗液；4，Sigma-GST 1号洗脱液；5，Sigma-GST 2号洗脱液；6，Sigma-GST 3号洗脱液；7，Sigma-GST 4号洗脱液；8，Sigma-GST 5号洗脱液。
由图4中的B图可知：4号和5号洗脱液的纯化效果较好，纯度高。
实施例5 检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒
检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒包括以下组分：
1、包被抗原：以实施例4得到的纯化的重组蛋白为包被抗原，用pH 9.6 的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组蛋白至终浓度 6 μg/ml；
2、封闭液：5 g脱脂奶粉溶于100 ml TBST中；
3、阴性对照：健康人血清，1:200稀释；
4、酶标二抗：过氧化物酶标记的羊抗人IgG，1:10000稀释；
5、TMB显色液；
6、终止液：2 mol/L浓硫酸。
实施例6 细粒棘球绦虫Sigma-GST的ELISA检测
以纯化后的重组蛋白为抗原，对 20份感染棘球蚴病人血清样品和 20份健康人血清样品进行间接ELISA检测。具体方法如下：
用pH 9.6 的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组蛋白至终浓度 6 μg/ml，每孔 200μ l包被96孔酶标板，4 ℃过夜；甩去孔中液体，以 pH 7.4 的PBST 洗板3 次( 5 min/次)后每孔加入200 μ l封闭液（5 g脱脂奶粉溶于100 ml TBST中），37 ℃封闭1小时。PBST 洗板3 次( 5 min/次)，每孔100 μ l分别加入细粒棘球蚴病患者和健康人血清（1∶ 200 稀释），37 ℃温育1小时； PBST 洗板3次，每孔100 μ l加入过氧化物酶标记的羊抗人 IgG（1：10000稀释），37 ℃温育1小时；PBST 洗板3次，每孔100 μ l加入TMB显色液，37 ℃避光反应 30 分钟，每孔50μ l加入2 mol/L 浓硫酸终止反应，测定吸光度（）值。以健康人血清的均值2倍加标准差为阳性判断值。ELISA检测结果如表1所示，本发明的试剂盒对细粒棘球蚴病患者血清的诊断敏感性为95%（19/20），对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。
表1 细粒棘球绦虫Sigma-GST ELISA检测结果
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 813
<212> DNA
<213> 细粒棘球绦虫Sigma-GST
<400> 1
ccggggcaca aaagtagcat atactagttg caccatcttc gagacagatt agcaccacca 60
gcatggatct acaacttaaa caggccaaat taagactgct ttacttcaac attcgtggtc 120
gcgcagagtt gattcgactg gtgctgaatg ccgcggagaa ggacttccag gatgtgcgtg 180
taagtagcac cgagtggccc tcactgaagg cccagatgcc cttcaaccag ctacctgtgc 240
tggaagtcac cacgccgagg ggtgagaaag ttatgctcac ggagagcatg gccatcgctc 300
gtctgctggc gcgcaccttc ggcctctaca gtgatgacgc tgcagaagtc tatctaattg 360
agcgaatgaa ctctcttaca agttccctct tggaggaaat ctacgccctg ggcttgaaga 420
aggtcgacag ttttaaaaaa ttggttgaag cagagcacgt gcacgaatac atggacgcaa 480
ttgagatggc cctgaaagag cgaaagaaca cattcaccgc gggacctcag gtcaccttag 540
ccgacctcca agtgatagtt ctaatcgaca cgatggacaa atttcttgcg aacacgaaac 600
acgactgcaa ggacgaactg gacaaaatca aggaaaacgt tatgaaggca aagcctggcg 660
tcgccagata cctgcgttca cgcccactta ccgatttcta atgtcaaacc cttacatttt 720
cggcgttatt gttaggattt ttagtttcta tggtatttaa aatgaagttg gtgccacgaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaacatg tcggccgcct cgg 813
<210> 2
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工蛋白
<400> 2
Met Asp Leu Gln Leu Lys Gln Ala Lys Leu Arg Leu Leu Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ile Arg Gly Arg Ala Glu Leu Ile Arg Leu Val Leu Asn Ala Ala Glu
20 25 30
Lys Asp Phe Gln Asp Val Arg Val Ser Ser Thr Glu Trp Pro Ser Leu
35 40 45
Lys Ala Gln Met Pro Phe Asn Gln Leu Pro Val Leu Glu Val Thr Thr
50 55 60
Pro Arg Gly Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Ser Met Ala Ile Ala Arg
65 70 75 80
Leu Leu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Tyr Ser Asp Asp Ala Ala Glu Val
85 90 95
Tyr Leu Ile Glu Arg Met Asn Ser Leu Thr Ser Ser Leu Leu Glu Glu
100 105 110
Ile Tyr Ala Leu Gly Leu Lys Lys Val Asp Ser Phe Lys Lys Leu Val
115 120 125
Glu Ala Glu His Val His Glu Tyr Met Asp Ala Ile Glu Met Ala Leu
130 135 140
Lys Glu Arg Lys Asn Thr Phe Thr Ala Gly Pro Gln Val Thr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Leu Gln Val Ile Val Leu Ile Asp Thr Met Asp Lys Phe Leu Ala
165 170 175
Asn Thr Lys His Asp Cys Lys Asp Glu Leu Asp Lys Ile Lys Glu Asn
180 185 190
Val Met Lys Ala Lys Pro Gly Val Ala Arg Tyr Leu Arg Ser Arg Pro
195 200 205
Leu Thr Asp Phe
210

Claims (10)

1.细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白，其特征在于：所述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
2.根据权利要求1所述的细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白，其特征在于：所述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表SEQID No.1中第63位-701位碱基。
3.权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的可溶性表达，其特征在于：步骤如下：
（1）目的基因Sigma-谷胱甘肽S-转移酶的扩增；
（2）构建Sigma-GST表达质粒：将步骤（1）制备的目的基因Sigma-谷胱甘肽S-转移酶纯化后酶切，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-Sigma-GST；
（3）将步骤（2）制备的质粒pET30a-Sigma-GST转化入E.Coli BL21(DE3)感受态细胞中，将活化表达的菌液加入LB液体培养基中，置于摇床上于37℃，160r/min振荡培养4小时，再加入0.2mmol/L的 IPTG于20℃诱导振荡培养7小时，离心、超声后收集上清。
4.权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤如下：
（1）清洗HisTALONTM Gravity Columns 预装柱；
（2）加入结合缓冲液，所述结合缓冲液为：50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，pH8.0；
（3）加入细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白上清液，
（4）加入漂洗缓冲液，所述漂洗缓冲液的配方为：50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，20mM/L咪唑，pH8.0；
（5）加入1号洗脱液，所述1号洗脱液的配方为：50mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/LNaCl，pH7.4；
（6）加入2号洗脱液，所述2号洗脱液的配方为：100mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/LNaCl，pH7.4；
（7）加入3号洗脱液，所述3号洗脱液的配方为：200mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/LNaCl，pH7.4；
（8）加入4号洗脱液，所述4号洗脱液的配方为：300mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/LNaCl，pH7.4；
（9）加入5号洗脱液，所述5号洗脱液的配方为：400mM /L咪唑，50mM/L NaH2PO4，300mM/LNaCl，pH7.4；
（10）分别收集4号和5号洗脱液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白上清液与1号洗脱液、2号洗脱液、3号洗脱液、4号洗脱液、5号洗脱液的体积比为2:1:1:1:1:1。
6.权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白在制备检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒中的应用。
7.一种检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA试剂盒中包被抗原为权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫Sigma-谷胱甘肽S-转移酶重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述包被抗原用pH 9.6 的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释至终浓度 6 μg/ml。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为含有5%脱脂奶粉的TBST，所述百分比的单位为g/ml。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为过氧化物酶标记的羊抗人IgG。
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