CN108660128A

CN108660128A - 一种紫花苜蓿萜烯合成酶、其编码基因、载体、多克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN108660128A
Application number: CN201810487758.0A
Authority: CN
Inventors: 孙洋; 柏立新; 赵静; 姜义平; 肖留斌; 谭永安; 邱晨
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN108660128B

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿萜烯合成酶、其多克隆抗体及其制备方法和应用。本发明将通过原核表达纯化技术，体外重组表达萜烯合成酶MsTPS蛋白，继而将重组蛋白应用于新西兰大白兔后制备了多克隆抗体，并利用ELISA法确定该多克隆抗体效价后，发明人采用Western blot法确定该多克隆抗体能特异性识别MsTPS重组蛋白可产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效的Western blot方法，可特异性地从紫花苜蓿叶片内检测出MsTPS蛋白。应用本发明，可为萜烯合成酶MsTPS蛋白在紫花苜蓿植株内组织分布、植株外重组表达以及该类蛋白的蛋白表达量快速检测等分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。

Description

一种紫花苜蓿萜烯合成酶、其编码基因、载体、多克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿萜烯合成酶、其编码基因、载体、多克隆抗体及其应用。

背景技术

紫花苜蓿Medicago sativa(Rosales:Leguminosae)属蔷薇目豆科，素有“牧草之王”的美称，是世界上应用最广、经济价值最高和栽培面积最大的一种优质蛋白饲料作物。在田间，紫花苜蓿更是多种农作物重要害虫，如苜蓿夜蛾、蚜虫、蓟马、盲蝽、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、马铃薯叶蝉、草地蝗虫、红蜘蛛、三叶草象鼻虫、小夜蛾、粘虫等的嗜好寄主，并对这些害虫具有强烈的引诱作用。

植物的挥发物是植食性害虫识别、定位寄主植物的重要信号物质，其种类众多、功能强大。在寄主植物挥发物众多种类之中，萜烯类挥发物是重要的一类参与植物-害虫-害虫天敌互作的种类，而萜烯合酶(terpene synthase，TPS)便是植物合成代谢萜烯类化合物的关键合成酶。因此，在植物体内克隆TPS基因，研究其基因所编码的蛋白表达特征与害虫发生的关系，对于明晰TPS介导的萜类信号物质在植物-害虫互作过程中的作用具有重要意义。本申请在温室大棚实验明确了6-8周紫花苜蓿可以显著诱集苜蓿夜蛾(相比3-5周幼苗期对照)，并在6-8周的紫花苜蓿叶片中成功克隆了一种TPS基因的全长序列MsTPS，揭示了此基因的代谢产物可能是紫花苜蓿引诱苜蓿夜蛾的重要物质。然而，在植物体内实际行使功能的不是酶基因而是酶蛋白。因此，急需灵敏度高，特异性好的蛋白检测技术来分析紫花苜蓿MsTPS酶蛋白的表达量，从而明确MsTPS的蛋白表达与害虫发生的相关性，进而探索诱集寄主紫花苜蓿害虫的新型防控技术。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种紫花苜蓿萜烯合成酶。

本发明还要解决的技术问题是提供了用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的制备方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体及其制备方法。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。SEQ ID NO：1为紫花苜蓿萜烯合成酶的完整的基因序列。

本发明内容还包括一种紫花苜蓿萜烯合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，上述的用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

其中，上述的重组表达载体，将所述的基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达紫花苜蓿萜烯合成酶的重组表达载体。

其中，上述大肠杆菌表达载体为pCzn1。

本发明内容还包括一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

其中，上述大肠杆菌为Arctic Express。

本发明内容还包括一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)、紫花苜蓿萜烯合成酶基因的开放阅读框cDNA双链的PCR扩增；

2)、紫花苜蓿萜烯合成酶基因的原核表达载体构建；

3)、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的表达及蛋白电泳验证；

4)、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的变性与复性；

5)、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的分离、纯化即得到紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白并进行蛋白电泳验证。

本发明内容还包括一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体，将得到的紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白免疫新西兰大白兔后制得。

本发明内容还包括一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)、将紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白免疫新西兰白兔；

2)、抗原亲和纯化法获得针对紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体；

3)、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体效价的ELLSA检测。

本发明内容还包括一种紫花苜蓿MsTPS蛋白多克隆抗体的表达量特异性Westernblot检测方法，包括以下步骤：

1)、取温室六周培养紫花苜蓿提取的总蛋白及体外重组表达纯化的MsTPS蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、洗膜、封闭。

2)、用封闭液稀释一抗(本发明制作的MsTPS蛋白多克隆抗体)，膜在一抗稀释液中反应，洗膜，封闭液稀释羊抗兔的酶标二抗，膜在二抗中反应，化学发光显影。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：发明人首次通过克隆获得了编码紫花苜蓿萜烯合成酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，发明人首次成功克隆了编码紫花苜蓿萜烯合成酶基因，并构建了pCzn1-MsTPS表达载体，通过Arctic Express菌体外诱导表达大量MsTPS重组蛋白；将原核表达纯化的MsTPS重组蛋白应用于免疫新西兰大白兔后制备了多克隆抗体，在通过利用ELISA法确定了该多克隆抗体的效价后，发明人采用Western blot法发现该多克隆抗体能特异性识别原核表达纯化的MsTPS重组蛋白，可产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效、高灵敏度和准确的Western blot方法，可特异性地从紫花苜蓿叶片内检测出MsTPS蛋白。

应用本发明，可为萜烯合成酶类酶蛋白在紫花苜蓿叶片内的组织分布以及该蛋白的快速检测和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。本发明为进一步系统研究紫花苜蓿与其诱集的害虫之间化学通讯的分子机制提供了坚实的研究基础。

附图说明

图1：MsTPS基因开放阅读框克隆电泳图；泳道1：为2000bp的DNA maker；泳道2：MsTPS基因开放阅读框靶标1719bp克隆条带；

图2：MsTPS基因开放阅读框构建表达载体pCzn1后的酶切验证电泳图；泳道1：MsTPS基因开放阅读框构建表达载体pCzn1后利用Nde Ⅰ与Xba Ⅰ的酶切图谱，其中1719bp的条带为目的基因的开放阅读框条带；泳道2：为5000bp的DNA maker；

图3pCzn1-MsTPS利用IPTG诱导表达经10％SDS-PAGE分析电泳图；泳道M：为蛋白maker；泳道1：未经诱导菌株的总蛋白；泳道2：经过诱导菌株的总蛋白；泳道3：经0.5mMIPTG在11℃诱导靶标载体表达的总蛋白上清液；泳道4：经0.5mM IPTG在11℃诱导靶标载体表达的总蛋白包涵体；

图4：MsTPS蛋白诱导表达，纯化后经10％SDS-PAGE电泳分析图谱；泳道M：为蛋白maker；泳道1：未纯化的总蛋白样品；泳道2：纯化后的洗脱液；泳道3：纯化后的MsTPS靶标蛋白；

图5：MsTPS蛋白特异性抗体纯化、电泳分离后，考马斯亮蓝染色图谱；

图6：利用MsTPS蛋白特异性抗体Western杂交图谱；M：为200kd蛋白maker；泳道1：培养六周紫花苜蓿叶片组织内MsTPS蛋白Western杂交图谱；泳道2：培养八周紫花苜蓿叶片组织内MsTPS蛋白Western杂交图谱；泳道3：体外重组表达MsTPS蛋白Western杂交图谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1：MsTPS全长基因开放阅读框cDNA的获得及表达载体构建

利用比较转录组测序技术分析3-5周及6-8周紫花苜蓿叶片内各种基因的表达情况(完成于北京诺禾致源科技股份有限公司)，获得6-8周紫花苜蓿相比3-5周对照特异性表达的802bp TPS的cDNA片段序列。采用TRIzol法提取绿盲蝽总RNA，选择电泳图谱良好并且OD260/OD280值在1.8-2.0之间的总RNA样品合并进行mRNA的纯化，反转录合成第一链cDNA，PCR反应体系为：0.5μg总RNA，0.5μl Oligo-dT18，2μl 5×反应缓冲液，2μl 10mM dNTP，40URNasin，200U SuperscriptⅡ，加ddH₂O至10μl；PCR反应参数为：42℃30min，75℃30min，4℃5min。根据紫花苜蓿已测出MsTPS基因序列设计适用于PCR扩增的引物MsTPS-1-F(5′-CATGAGACCGCACTTCACTT-3′)及MsTPS-1-R(5′-AACTCTCCCACGTCTTTCGA-3′)，获得802bpMsTPS基因序列，该序列参见序列表中的SEQ ID NO：4所示，PCR反应体系为：2.5μl 10×反应缓冲液，2μl 25mM Mg²⁺，2μl 10mM dNTP，0.5μl Taq plus DNA聚合酶(5U/μl，购于南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P201-d1)，1μl 10μM上游引物MsTPS-1-F，1μl 10μM下游引物MsTPS-1-R，cDNA模板1μl，加ddH₂O至25μl；PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，40个循环；72℃继续延伸10min；在根据获得的MsTPS基因的序列设计RACE引物MsTPS-race-5′R1(5′-TAGGATCCGTGAGGCATCCCAATGACC-3′)、MsTPS-race-5′R2(5′-TGAACAGAGTTAACTCATCTAGAGTCCCA-3′)，MsTPS-race-5′F1(5′-CAACAAGGTCACTTTGTTCCCGCAGAGG-3′)、MsTPS-race-5′F2(5′-GCCTCGCATCTAAACCTGGCAGGGGAA-3′)，扩增方法具体参见Clontech公司的cDNA末端的快速扩增(RACE)试剂盒的方法进行，PCR反应参数为：94℃30s，70℃180s，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃180s，5个循环；94℃30s，68℃30s,72℃180s，72℃继续延伸10min。电泳结果显示PCR扩增拼接后，利用MsTPS开放阅读框已知序列设计PCR扩增引物MsTPS-2-F(5′-ATGGCACTGCATTTGCA-3′)及MsTPS-2-R(5′-TTAAAAAACTTTATCATAAAGCAAG-3′)，获得MsTPS基因开放阅读框cDNA序列(参见序列表SEQ ID NO：3所示)，PCR反应体系为：2.5μl 10×反应缓冲液，2μl 25mM Mg²⁺，2μl 10mM dNTP，0.5μl Taq plus DNA聚合酶(5U/μl，购于南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P201-d1)，1μl 10μM上游引物MsTPS-2-F，1μl 10μM下游引物MsTPS-2-R，cDNA模板1μl，加ddH₂O至25μl；PCR反应参数为：95℃5min；95℃30s，52.0℃30s，72℃120s，40个循环；72℃继续延伸10min，得到与预期大小1719bp相符的条带，并将PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的DNA(图1)。将PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的DNA，测序验证并采用TA克隆法与原核表达载体pCzn1进行连接(MsTPS蛋白体外重组表达载体pCzn1购置于南京钟鼎生物技术有限公司)，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞(感受态细胞购于Takara公司)，挑选单菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液提取载体进行酶切验证正确(图2)及序列测定正确的进行下一步MsTPS蛋白体外重组表达。

含有MsTPS蛋白开放阅读框的原核表达载体pCzn1构建及检测方法为：测序正确的MsTPS蛋白开放阅读框胶回收纯化产物与pCzn1在T4 DNA连接酶催化下连接。T4 DNA连接酶连接体系为：pCzn1载体5.0μl，MsTPS蛋白开放阅读框胶回收纯化产物5.0μl，T4 DNA连接酶1.0μl(Takara公司，350U/μl)，10×Buffer缓冲液2.0μl，用ddH₂O补足至20μl，16℃反应12-16h；酶切验证体系为：2种限制性内切酶Nde Ⅰ和Xba Ⅰ各1.0μl，10×Buffer T缓冲液2.0μl，含有MsTPS蛋白开放阅读框的pCzn1质粒6.0μl，用ddH₂O补足至20μl，37℃水浴3h。连接成功后的表达载体pCzn1质粒经DNA测序验证，验证成功的质粒DNA序列翻译后如下：

MsTPS蛋白开放阅读框连接到表达载体后，由于pCzn1自带HIS-Tag标签，MsTPS体外重组蛋白便加上以上标签。

体外重组蛋白序列如下，单下划线区域为HIS-Tag区域

MNHKVHHHHHHMALHLQSCLSSLKPQIVPTIAQLSQNFNNLKLDSLHIANKWSINVEEERRSALIKQHRDLSSNNNHSEKLEVVKHELRNVGENSLKGLYMIDAMQRLNIDYHFEEEIESFLRRQYVASACGGSNHHNLHETALHFRLLRQQGHFVPAEVFNKFTNKDEKFDPKLGENINGMIDLFEASHLNLAGEDILDEAGKFSRKILKEKMAQFDFHEAKFVRRTLEYPFHKNLPMFTARNFYGHLYSTNAWFGSMKEVAKMDFSLLQGLHHQEIVQISKWWRELGLANELPYARNQPLKWYMWSLGCLTDPTLSEERIELTKPISLIYIIDDIFDIYGTLDELTLFTEVVSRWDIDTDMEQLPNYMKTCFRVLYDLTNELSSKIYKKHGWDPKDSLRKTWESLCKAFLVEAKWFGSGKLPNAEEYLKNGIVSSGVHIVLVHIFFLLGKGLTKENVHTMDTTLSIISAPATILRLWDDLGNAEDENQQGNDGSYVKCLMMDQPEYYCTRRRATDEVMNKISNAWKSLNQECLFDTHFHKAFTKVSLNLARMVPLMYSYDDKHSLPGLEGYVHSLLYDKVF*

结论：MsTPS基因1719碱基的ORF框被完全成功连接到原核表达载体pCzn1中；MsTPS体外重组蛋白理论分子量为66.48kDa，加上HIS-Tag标签后重组蛋白理论分子量为67.99kDa，连接后的载体简称为pCzn1-MsTPS。

实施例2：pCzn1-MsTPS载体转化大肠杆菌及IPTG诱导表达

MsTPS蛋白体外表达的大肠杆菌Arctic Express购置于南京钟鼎生物技术有限公司。

转化：将pCzn1-MsTPS质粒10μl加入100μl感受态Arctic Express菌中，置冰上20min；42℃热激90s，迅速置冰中5min，加入600μl LB培养液；37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。

IPTG诱导pCzn1-MsTPS载体融合蛋白的表达：挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Amp的3ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；次日按1：100接种于50μg/mlAmp的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5mM，11℃220rpm振摇诱导12h融合蛋白表达；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，加适量TE溶液(pH8.0)，震荡悬浮后加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃5min，SDS-PAGE电泳检测考马斯亮蓝染色分析(图3)。

结论：经0.5mM IPTG在11℃诱导12h后，MsTPS基因可在pCzn1载体中被诱导高效表达，主要以包涵体形式存在，上清表达量相对低。MsTPS体外重组蛋白加上HIS-Tag标签的重组蛋白分子量约为66.20kDa。

实施例3：重组蛋白包涵体的变性、复性与纯化

变性复性：将诱导表达后的培养菌液6000g低温离心10min，加入20ml RIPA裂解液(强)裂解液试剂盒中RIPA裂解液(含有1mmol/L的PMSF，购于碧云天生物技术有限公司)重悬菌体沉淀，超声破碎(功率400W，工作4s，间歇8s，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液于4℃在10000g条件下离心20min，收集沉淀。使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mM Tris，5mMDTT，8M尿素pH8.0)溶解包涵体，4度放置过夜，继而在室温15000rpm条件下离心15min；向上一步溶液滴加20mM Tris-HCL 5mM EDTA Buffer PH 7.8缓冲液，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于PBS pH 7.4溶液中透析过夜。

融合蛋白的Ni柱亲和纯化：利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDABinding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线(相关试剂购置于南京钟鼎生物技术有限公司)；用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜，进而开展12％SDS-PAGE分析，结果如图4所示。

结论：获得高质量纯化后的MsTPS重组蛋白，纯化后的蛋白电泳仅呈现一条主带，其分子量约为66.20kDa。

实施例4：动物免疫、多克隆抗体的纯化与鉴定

动物免疫：以实施例3中纯化后的MsTPS重组蛋白进行BCA蛋白浓度测定后，免疫2只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，免疫4-5次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对MsTPS的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。

抗体纯化：

1.取出与MsTPS抗体相对应的抗原(MsTPS体外原核重组表达后的纯化蛋白)免疫亲和柱，用10倍胶体积的PBS过柱，平衡亲和柱；

2.将需纯化的MsTPS样品上样，流出液重复上样一次(样品是抗血清时，离心去除红细胞，10000rpm离心4min，取上清直接上样)，做好相应上样记录，收集流出液，放置4℃待检测；

3.上样结束后用10倍胶体积的PBS再次平衡亲和柱，洗出未与胶结合的杂蛋白，该过程中亲和柱流出端接紫外检测仪，至紫外吸收仪A值稳定，调节紫外检测仪上的T为100，0.5A为0；

4.先用pH5.0的洗脱Buffer预洗脱非特异性结合的抗体，此时紫外检测仪示数一般不会有显著变化，可不收集抗体(若示数有明显升高，此时需要收集抗体，以便后期进行检测)，待紫外仪示数稳定后用pH1.5的洗脱液进行洗脱。当紫外仪示数升高时，收集抗体(此时收集的抗体为特异性抗体)。纯化后的抗体如果没有立即透析，则需将收集抗体的EP管放置在冰浴中，并事先加入一定量的中和Buffer以中和洗出的抗体，约2ml抗体加100μl中和Buffer，若是立即透析纯化的抗体可省去以上步骤；

5.洗脱时记录洗脱最高峰的值，洗脱结束后用20倍胶体积PBS平衡亲和柱；

6.洗脱的抗体用至少200倍抗体体积的PBS进行透析，4℃透析过夜，换液2-3次；

注：磷酸化的抗体，在血清上样过磷酸化亲和柱，洗脱的抗体过夜透析、测浓度后再过非磷酸化亲和柱，流出液为磷酸化抗体，洗脱的抗体为非磷酸化抗体。

7.取出透析后的抗体并检测抗体浓度，做好相应记录；

8.向纯化后的抗体加入20％NaN₃母液，比例为1000：1，使NaN₃终浓度为0.02％。将抗体放-20℃保存。留约50μg抗体样品，进行纯度鉴定、ELISA、Western等鉴定。

抗体鉴定：通过ELISA检测纯化抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定，并通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察抗体的纯度(图5)。

抗体鉴定具体操作如下：

1.根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记；

2.包被：用PBS包被液将MsTPS蛋白抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100μl，4℃冰箱过夜。

包被抗原：MsTPS蛋白；包被浓度：5μg/ml，100μl/孔；

包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)。

3.封闭：包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。

取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

4.一抗反应：纯化抗体按1/500，2倍稀释，每孔100μl，37℃恒温箱1h。

5.二抗反应：取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：羊抗兔-HRP【HRP Goat Anti-Rat IgG(H+L)，购买于南京钟鼎生物技术有限公司，货号ABP122】，1/5000。37℃恒温箱1小时。

6.显色：取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。

7.终止反应：每孔加入100μl 1M HCL溶液终止反应。即刻在酶标仪450nm上读数，将OD值大于设定阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

本次免疫、纯化的MsTPS蛋白抗体效价大于512K，具体结果如下：

包被抗原：MsTPS蛋白；包被浓度：5μg/ml，100μl/孔；

包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)；

二抗：羊抗兔-HRP，1/5000；抗体浓度：0.75mg/ml；

体积：4.0ml；缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)。

抗体间接ELISA结果如下：

起始稀释度:1:500；效价即样品OD/空白OD>＝2.1的最高稀释度

8.纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，可见抗体纯化后纯度在90％以上，如图5。

结论：获得高质量的MsTPS蛋白特异性抗体，其效价大于512,000，抗体的浓度0.75mg/ml，抗体纯化后纯度在90％以上。

实施例5：紫花苜蓿组织中MsTPS蛋白表达量Western-blot检测

紫花苜蓿培养：紫花苜蓿种子提供于江苏省农科院明达种子有限公司，光照培养箱培养六周、八周，提取蛋白开展Western杂交实验，苜蓿培养条件为温度(25±4)℃，相对湿度70％±5％，光周期L∶D＝14∶10。

Western杂交样品使用100g六周、八周紫花苜蓿所提取的蛋白样品，总蛋白提取使用南京钟鼎生物技术有限公司的总蛋白提取试剂盒。总蛋白的浓度测定参考Bicinchoninic acid(BCA)法，并稍加改进。Western杂交流程根据Sun等人(2014)的实验方法(Cell stress and chaperones,2014,19(5):725-739)。蛋白样品在10％的SDS凝胶中电泳分离，在Tris-HCl缓冲液，100mA的电流中转膜3h，将蛋白质转移到NC膜上。NC膜在含有5％的脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中37℃封闭1h。本发明中纯化的MsTPS蛋白抗体1∶1000稀释，37℃孵育NC膜1h，TBS-T缓冲液洗3次，每次5min。羊抗兔的酶标二抗1∶5000稀释【HRP GoatAnti-Rat IgG(H+L)，购买于南京钟鼎生物技术有限公司，货号ABP122】，37℃孵育NC膜1h，TBS-T缓冲液洗3次，每次5min。最后通过化学发光试剂盒(GE Healthcare)进行显色，结果见图6。

结论：MsTPS蛋白特异性抗体可以用于Western杂交分析不同时期紫花苜蓿组织中MsTPS蛋白的表达情况，其在六周、八周紫花苜蓿叶片组织中只杂交出一条明亮主带，表明MsTPS抗体在紫花苜蓿组织中可以特异性结合MsTPS蛋白。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种紫花苜蓿萜烯合成酶、其编码基因、载体、多克隆抗体及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2117

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿萜烯合成酶(Medicago sativa terpene synthases)

<400> 1

gattgattca ttcatctata tctatatata gaatctgtga ccactacttg acttacgtat 60

attcattcct ttgccatggc actgcatttg caatcatgcc tttcctcttt gaaacctcaa 120

atcgtcccaa caattgcaca actttctcaa aactttaata atctcaagct tgattctctt 180

cacattgcta acaagtggag cattaatgtt gaagaagaaa ggcgtagtgc actcataaaa 240

caacatagag atctcagcag caataataat cattctgaga aacttgaggt ggttaagcat 300

gaacttagaa acgttggtga aaattcactc aaaggtttgt atatgattga tgccatgcag 360

cgcctaaata ttgattacca ctttgaagaa gaaattgaat cattcctaag aagacaatat 420

gtcgctagtg cttgtggtgg aagtaatcat cataatcttc atgagaccgc acttcacttc 480

aggctattaa gacaacaagg tcactttgtt cccgcagagg tgtttaacaa gttcactaac 540

aaggatgaaa agtttgatcc aaaactaggt gaaaatatca atggaatgat agatttattt 600

gaagcctcgc atctaaacct ggcaggggaa gacatacttg atgaagctgg aaaatttagc 660

aggaagatcc ttaaggaaaa aatggcacaa tttgattttc acgaagctaa gtttgtaagg 720

agaaccttag agtatccttt tcacaaaaat ttgccaatgt tcacagctag aaatttctat 780

ggtcatttat atagcacaaa tgcatggttt ggttctatga aagaagttgc gaaaatggat 840

ttcagtttgc tgcaaggctt acaccatcag gagattgttc aaatttcaaa atggtggaga 900

gaacttggtt tagctaatga attaccatat gctagaaacc agccccttaa atggtacatg 960

tggtcattgg gatgcctcac ggatcctact ttatctgagg aaagaattga gctcacaaaa 1020

ccaatatctt taatctacat aattgatgac atttttgata tttatgggac tctagatgag 1080

ttaactctgt tcactgaagt tgtttctaga tgggatattg acacagatat ggagcaacta 1140

ccaaattaca tgaaaacatg tttcagggtc ctctatgatc taacaaatga actaagctcc 1200

aaaatatata agaagcatgg gtgggaccct aaagactctc ttcgaaagac gtgggagagt 1260

ttgtgcaaag cctttctagt tgaagcaaaa tggtttggtt cagggaagtt gccaaatgct 1320

gaagaatact taaagaatgg gatagtaagc tctggagtgc atattgtgct ggttcacatt 1380

ttctttcttt tgggtaaagg attaactaag gaaaatgttc atacaatgga cacaacccta 1440

tccattattt ccgcccctgc cacaattctt cgactttggg atgatttagg aaacgcagag 1500

gacgaaaatc aacaaggaaa tgatggatca tacgtgaagt gtctaatgat ggaccaaccg 1560

gagtattatt gtacaagaag aagagcaaca gacgaggtta tgaataaaat atccaatgca 1620

tggaaaagcc tcaaccaaga gtgtctcttt gatacccatt tccataaagc attcacaaag 1680

gtctcactca atcttgcaag gatggtacca ttgatgtata gttatgatga taagcactcc 1740

cttcctgggc tagagggtta tgtccattcc ttgctttatg ataaagtttt ttgatttgta 1800

gccaaaatta ttaatcccaa tacccattag ccaatatgaa ggaataactc aataggggat 1860

tcttcttcaa aaaaaaactc aataggggat caataattta ttttgctaag caggtttggg 1920

tatcagttgt ggtggttaaa tccactaata tgtttgggta tcggctagct ctgttttgtt 1980

gttccttatt ggactgattg tatgtttagt agtctttttg gcacgccttg tgctgaaggg 2040

attgctgtgg ttttgttaat ataatatatt ttgccctgtt aaaaaaaatt attttgctaa 2100

tcatattgat aaataag 2117

<210> 2

<211> 572

<212> PRT

<213> 紫花苜蓿萜烯合成酶(Medicago sativa terpene synthases)

<400> 2

Met Ala Leu His Leu Gln Ser Cys Leu Ser Ser Leu Lys Pro Gln Ile

1 5 10 15

Val Pro Thr Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asn Phe Asn Asn Leu Lys Leu

20 25 30

Asp Ser Leu His Ile Ala Asn Lys Trp Ser Ile Asn Val Glu Glu Glu

35 40 45

Arg Arg Ser Ala Leu Ile Lys Gln His Arg Asp Leu Ser Ser Asn Asn

50 55 60

Asn His Ser Glu Lys Leu Glu Val Val Lys His Glu Leu Arg Asn Val

65 70 75 80

Gly Glu Asn Ser Leu Lys Gly Leu Tyr Met Ile Asp Ala Met Gln Arg

85 90 95

Leu Asn Ile Asp Tyr His Phe Glu Glu Glu Ile Glu Ser Phe Leu Arg

100 105 110

Arg Gln Tyr Val Ala Ser Ala Cys Gly Gly Ser Asn His His Asn Leu

115 120 125

His Glu Thr Ala Leu His Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln Gly His Phe

130 135 140

Val Pro Ala Glu Val Phe Asn Lys Phe Thr Asn Lys Asp Glu Lys Phe

145 150 155 160

Asp Pro Lys Leu Gly Glu Asn Ile Asn Gly Met Ile Asp Leu Phe Glu

165 170 175

Ala Ser His Leu Asn Leu Ala Gly Glu Asp Ile Leu Asp Glu Ala Gly

180 185 190

Lys Phe Ser Arg Lys Ile Leu Lys Glu Lys Met Ala Gln Phe Asp Phe

195 200 205

His Glu Ala Lys Phe Val Arg Arg Thr Leu Glu Tyr Pro Phe His Lys

210 215 220

Asn Leu Pro Met Phe Thr Ala Arg Asn Phe Tyr Gly His Leu Tyr Ser

225 230 235 240

Thr Asn Ala Trp Phe Gly Ser Met Lys Glu Val Ala Lys Met Asp Phe

245 250 255

Ser Leu Leu Gln Gly Leu His His Gln Glu Ile Val Gln Ile Ser Lys

260 265 270

Trp Trp Arg Glu Leu Gly Leu Ala Asn Glu Leu Pro Tyr Ala Arg Asn

275 280 285

Gln Pro Leu Lys Trp Tyr Met Trp Ser Leu Gly Cys Leu Thr Asp Pro

290 295 300

Thr Leu Ser Glu Glu Arg Ile Glu Leu Thr Lys Pro Ile Ser Leu Ile

305 310 315 320

Tyr Ile Ile Asp Asp Ile Phe Asp Ile Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu

325 330 335

Thr Leu Phe Thr Glu Val Val Ser Arg Trp Asp Ile Asp Thr Asp Met

340 345 350

Glu Gln Leu Pro Asn Tyr Met Lys Thr Cys Phe Arg Val Leu Tyr Asp

355 360 365

Leu Thr Asn Glu Leu Ser Ser Lys Ile Tyr Lys Lys His Gly Trp Asp

370 375 380

Pro Lys Asp Ser Leu Arg Lys Thr Trp Glu Ser Leu Cys Lys Ala Phe

385 390 395 400

Leu Val Glu Ala Lys Trp Phe Gly Ser Gly Lys Leu Pro Asn Ala Glu

405 410 415

Glu Tyr Leu Lys Asn Gly Ile Val Ser Ser Gly Val His Ile Val Leu

420 425 430

Val His Ile Phe Phe Leu Leu Gly Lys Gly Leu Thr Lys Glu Asn Val

435 440 445

His Thr Met Asp Thr Thr Leu Ser Ile Ile Ser Ala Pro Ala Thr Ile

450 455 460

Leu Arg Leu Trp Asp Asp Leu Gly Asn Ala Glu Asp Glu Asn Gln Gln

465 470 475 480

Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Val Lys Cys Leu Met Met Asp Gln Pro Glu

485 490 495

Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Arg Ala Thr Asp Glu Val Met Asn Lys Ile

500 505 510

Ser Asn Ala Trp Lys Ser Leu Asn Gln Glu Cys Leu Phe Asp Thr His

515 520 525

Phe His Lys Ala Phe Thr Lys Val Ser Leu Asn Leu Ala Arg Met Val

530 535 540

Pro Leu Met Tyr Ser Tyr Asp Asp Lys His Ser Leu Pro Gly Leu Glu

545 550 555 560

Gly Tyr Val His Ser Leu Leu Tyr Asp Lys Val Phe

565 570

<210> 3

<211> 1719

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿萜烯合成酶(Medicago sativa terpene synthases)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1719)

<400> 3

atg gca ctg cat ttg caa tca tgc ctt tcc tct ttg aaa cct caa atc 48

Met Ala Leu His Leu Gln Ser Cys Leu Ser Ser Leu Lys Pro Gln Ile

1 5 10 15

gtc cca aca att gca caa ctt tct caa aac ttt aat aat ctc aag ctt 96

Val Pro Thr Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asn Phe Asn Asn Leu Lys Leu

20 25 30

gat tct ctt cac att gct aac aag tgg agc att aat gtt gaa gaa gaa 144

Asp Ser Leu His Ile Ala Asn Lys Trp Ser Ile Asn Val Glu Glu Glu

35 40 45

agg cgt agt gca ctc ata aaa caa cat aga gat ctc agc agc aat aat 192

Arg Arg Ser Ala Leu Ile Lys Gln His Arg Asp Leu Ser Ser Asn Asn

50 55 60

aat cat tct gag aaa ctt gag gtg gtt aag cat gaa ctt aga aac gtt 240

Asn His Ser Glu Lys Leu Glu Val Val Lys His Glu Leu Arg Asn Val

65 70 75 80

ggt gaa aat tca ctc aaa ggt ttg tat atg att gat gcc atg cag cgc 288

Gly Glu Asn Ser Leu Lys Gly Leu Tyr Met Ile Asp Ala Met Gln Arg

85 90 95

cta aat att gat tac cac ttt gaa gaa gaa att gaa tca ttc cta aga 336

Leu Asn Ile Asp Tyr His Phe Glu Glu Glu Ile Glu Ser Phe Leu Arg

100 105 110

aga caa tat gtc gct agt gct tgt ggt gga agt aat cat cat aat ctt 384

Arg Gln Tyr Val Ala Ser Ala Cys Gly Gly Ser Asn His His Asn Leu

115 120 125

cat gag acc gca ctt cac ttc agg cta tta aga caa caa ggt cac ttt 432

His Glu Thr Ala Leu His Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln Gly His Phe

130 135 140

gtt ccc gca gag gtg ttt aac aag ttc act aac aag gat gaa aag ttt 480

Val Pro Ala Glu Val Phe Asn Lys Phe Thr Asn Lys Asp Glu Lys Phe

145 150 155 160

gat cca aaa cta ggt gaa aat atc aat gga atg ata gat tta ttt gaa 528

Asp Pro Lys Leu Gly Glu Asn Ile Asn Gly Met Ile Asp Leu Phe Glu

165 170 175

gcc tcg cat cta aac ctg gca ggg gaa gac ata ctt gat gaa gct gga 576

Ala Ser His Leu Asn Leu Ala Gly Glu Asp Ile Leu Asp Glu Ala Gly

180 185 190

aaa ttt agc agg aag atc ctt aag gaa aaa atg gca caa ttt gat ttt 624

Lys Phe Ser Arg Lys Ile Leu Lys Glu Lys Met Ala Gln Phe Asp Phe

195 200 205

cac gaa gct aag ttt gta agg aga acc tta gag tat cct ttt cac aaa 672

His Glu Ala Lys Phe Val Arg Arg Thr Leu Glu Tyr Pro Phe His Lys

210 215 220

aat ttg cca atg ttc aca gct aga aat ttc tat ggt cat tta tat agc 720

Asn Leu Pro Met Phe Thr Ala Arg Asn Phe Tyr Gly His Leu Tyr Ser

225 230 235 240

aca aat gca tgg ttt ggt tct atg aaa gaa gtt gcg aaa atg gat ttc 768

Thr Asn Ala Trp Phe Gly Ser Met Lys Glu Val Ala Lys Met Asp Phe

245 250 255

agt ttg ctg caa ggc tta cac cat cag gag att gtt caa att tca aaa 816

Ser Leu Leu Gln Gly Leu His His Gln Glu Ile Val Gln Ile Ser Lys

260 265 270

tgg tgg aga gaa ctt ggt tta gct aat gaa tta cca tat gct aga aac 864

Trp Trp Arg Glu Leu Gly Leu Ala Asn Glu Leu Pro Tyr Ala Arg Asn

275 280 285

cag ccc ctt aaa tgg tac atg tgg tca ttg gga tgc ctc acg gat cct 912

Gln Pro Leu Lys Trp Tyr Met Trp Ser Leu Gly Cys Leu Thr Asp Pro

290 295 300

act tta tct gag gaa aga att gag ctc aca aaa cca ata tct tta atc 960

Thr Leu Ser Glu Glu Arg Ile Glu Leu Thr Lys Pro Ile Ser Leu Ile

305 310 315 320

tac ata att gat gac att ttt gat att tat ggg act cta gat gag tta 1008

Tyr Ile Ile Asp Asp Ile Phe Asp Ile Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu

325 330 335

act ctg ttc act gaa gtt gtt tct aga tgg gat att gac aca gat atg 1056

Thr Leu Phe Thr Glu Val Val Ser Arg Trp Asp Ile Asp Thr Asp Met

340 345 350

gag caa cta cca aat tac atg aaa aca tgt ttc agg gtc ctc tat gat 1104

Glu Gln Leu Pro Asn Tyr Met Lys Thr Cys Phe Arg Val Leu Tyr Asp

355 360 365

cta aca aat gaa cta agc tcc aaa ata tat aag aag cat ggg tgg gac 1152

Leu Thr Asn Glu Leu Ser Ser Lys Ile Tyr Lys Lys His Gly Trp Asp

370 375 380

cct aaa gac tct ctt cga aag acg tgg gag agt ttg tgc aaa gcc ttt 1200

Pro Lys Asp Ser Leu Arg Lys Thr Trp Glu Ser Leu Cys Lys Ala Phe

385 390 395 400

cta gtt gaa gca aaa tgg ttt ggt tca ggg aag ttg cca aat gct gaa 1248

Leu Val Glu Ala Lys Trp Phe Gly Ser Gly Lys Leu Pro Asn Ala Glu

405 410 415

gaa tac tta aag aat ggg ata gta agc tct gga gtg cat att gtg ctg 1296

Glu Tyr Leu Lys Asn Gly Ile Val Ser Ser Gly Val His Ile Val Leu

420 425 430

gtt cac att ttc ttt ctt ttg ggt aaa gga tta act aag gaa aat gtt 1344

Val His Ile Phe Phe Leu Leu Gly Lys Gly Leu Thr Lys Glu Asn Val

435 440 445

cat aca atg gac aca acc cta tcc att att tcc gcc cct gcc aca att 1392

His Thr Met Asp Thr Thr Leu Ser Ile Ile Ser Ala Pro Ala Thr Ile

450 455 460

ctt cga ctt tgg gat gat tta gga aac gca gag gac gaa aat caa caa 1440

Leu Arg Leu Trp Asp Asp Leu Gly Asn Ala Glu Asp Glu Asn Gln Gln

465 470 475 480

gga aat gat gga tca tac gtg aag tgt cta atg atg gac caa ccg gag 1488

Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Val Lys Cys Leu Met Met Asp Gln Pro Glu

485 490 495

tat tat tgt aca aga aga aga gca aca gac gag gtt atg aat aaa ata 1536

Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Arg Ala Thr Asp Glu Val Met Asn Lys Ile

500 505 510

tcc aat gca tgg aaa agc ctc aac caa gag tgt ctc ttt gat acc cat 1584

Ser Asn Ala Trp Lys Ser Leu Asn Gln Glu Cys Leu Phe Asp Thr His

515 520 525

ttc cat aaa gca ttc aca aag gtc tca ctc aat ctt gca agg atg gta 1632

Phe His Lys Ala Phe Thr Lys Val Ser Leu Asn Leu Ala Arg Met Val

530 535 540

cca ttg atg tat agt tat gat gat aag cac tcc ctt cct ggg cta gag 1680

Pro Leu Met Tyr Ser Tyr Asp Asp Lys His Ser Leu Pro Gly Leu Glu

545 550 555 560

ggt tat gtc cat tcc ttg ctt tat gat aaa gtt ttt tga 1719

Gly Tyr Val His Ser Leu Leu Tyr Asp Lys Val Phe

565 570

<210> 4

<211> 802

<212> DNA

<213> MsTPS基因片段(Medicago sativa terpene synthases)

<400> 4

catgagaccg cacttcactt caggctatta agacaacaag gtcactttgt tcccgcagag 60

gtgtttaaca agttcactaa caaggatgaa aagtttgatc caaaactagg tgaaaatatc 120

aatggaatga tagatttatt tgaagcctcg catctaaacc tggcagggga agacatactt 180

gatgaagctg gaaaatttag caggaagatc cttaaggaaa aaatggcaca atttgatttt 240

cacgaagcta agtttgtaag gagaacctta gagtatcctt ttcacaaaaa tttgccaatg 300

ttcacagcta gaaatttcta tggtcattta tatagcacaa atgcatggtt tggttctatg 360

aaagaagttg cgaaaatgga tttcagtttg ctgcaaggct tacaccatca ggagattgtt 420

caaatttcaa aatggtggag agaacttggt ttagctaatg aattaccata tgctagaaac 480

cagcccctta aatggtacat gtggtcattg ggatgcctca cggatcctac tttatctgag 540

gaaagaattg agctcacaaa accaatatct ttaatctaca taattgatga catttttgat 600

atttatggga ctctagatga gttaactctg ttcactgaag ttgtttctag atgggatatt 660

gacacagata tggagcaact accaaattac atgaaaacat gtttcagggt cctctatgat 720

ctaacaaatg aactaagctc caaaatatat aagaagcatg ggtgggaccc taaagactct 780

cttcgaaaga cgtgggagag tt 802

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列MsTPS-1-F(Artificial Sequence)

<400> 5

catgagaccg cacttcactt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列MsTPS-1-R(Artificial Sequence)

<400> 6

aactctccca cgtctttcga 20

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列MsTPS-race-5′R1(Artificial Sequence)

<400> 7

taggatccgt gaggcatccc aatgacc 27

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> MsTPS-race-5′R2(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaacagagt taactcatct agagtccca 29

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> MsTPS-race-5′F1(Artificial Sequence)

<400> 9

caacaaggtc actttgttcc cgcagagg 28

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> MsTPS-race-5′F2(Artificial Sequence)

<400> 10

gcctcgcatc taaacctggc aggggaa 27

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> MsTPS-2-F(Artificial Sequence)

<400> 11

atggcactgc atttgca 17

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> MsTPS-2-R(Artificial Sequence)

<400> 12

ttaaaaaact ttatcataaa gcaag 25

Claims

1.一种用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种紫花苜蓿萜烯合成酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求1所述的用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，将权利要求1所述的基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达紫花苜蓿萜烯合成酶的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pCzn1。

6.一种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

7.根据权利要求6所述的转基因重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为Arctic Express。

8.权利要求2所述一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、紫花苜蓿萜烯合成酶基因的开放阅读框cDNA双链的PCR扩增；

2）、紫花苜蓿萜烯合成酶基因的原核表达载体构建；

3）、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的表达；

4）、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的变性与复性；

5）、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的分离、纯化即得到紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白。

9.一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体，其特征在于，将权利要求6得到的紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白免疫新西兰大白兔后制得。

10.权利要求9所述的一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、将紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白免疫新西兰白兔；

2）、抗原亲和纯化法获得针对紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体；

3）、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体效价的ELLSA检测。