CN111732636A

CN111732636A - 一种鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111732636A
Application number: CN202010630779.0A
Authority: CN
Inventors: 王雪平; 张孝俊; 梁秀丽
Original assignee: Anyang Institute of Technology
Current assignee: Anyang Institute of Technology
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-10-02

Abstract

本发明属于蛋白质工程领域，特别是指一种鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon及其制备方法和应用。构建了鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon的原核表达质粒，之后将该质粒转化入TOP10克隆菌株进行原核表达并纯化并进一步将纯化的蛋白作为包被抗原建立试剂盒。Hexon重组蛋白编码中和抗原表位，发明人选取了鸭腺病毒1型病毒具有代表性的流行株Hexon蛋白保守性部分的碱基序列组成进行分析，选取保守性部分中具有抗原优势表位的部分，通过人工合成的方式得到目的片段。人工合成并表达后的Hexon重组蛋白准确率高，保证了蛋白的中和活性，更利于运用在抗体检测技术的开发。

Description

一种鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，特别是指一种鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon及其制备方法和应用。

背景技术

鸭腺病毒1型病毒（Duck adenovirus type 1,DAV1）是包括产蛋下降综合症病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)或类似EDSV 的一类腺病毒，为腺病毒科胸腺病毒属(Atadenovirus)的成员。以AV127株为代表的EDSV 的基因组全序列分析确认已完成。其代表病毒为EDSV,是产蛋下降综合征的病原体,由其引起的产蛋下降综合征在1976年由荷兰学者Van Eck首次报道，是一种急性传染病,其特点是在饲养正常的情况下，鸡群产蛋量达到高峰时,产蛋量急剧下降，软壳蛋和畸形蛋增加,褐色蛋蛋壳颜色变浅，可使鸡群产蛋率下降, 因此已成为世界范围内引起鸡产蛋损失的主要原因之一，因此已成为世界范围内引起鸡产蛋损失的主要原因之一，严重限制了我国养禽业的发展。

目前DAV1在全世界范围内均存在分布，给许多国家的养禽业带来了严重的经济损失，ELLSA检测抗体时具有简便、快捷、敏感、特异等优点，在生产领域得到广泛的应用，但目前的试剂盒主要以全病毒作为包被抗原，纯化病毒粒子的过程复杂，且存在散毒的风险，不适宜大批鸡群抗体水平的监测和流行病学调查等一系列推广和应用困难的问题。

鉴于DAV1对于养禽业危害的严重性，利用可靠快速的血清诊断技术对家禽进行血清学诊断是有效防控的基础。因此建立一种血清学诊断方法对DAV1进行准确的诊断的试剂盒，对该病的防治具有重要意义。

发明内容

本发明提出一种鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon及其制备方法和应用，构建了鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon的原核表达质粒，之后将该质粒转化入TOP10 克隆菌株进行原核表达并纯化并进一步将纯化的蛋白作为包被抗原建立试剂盒。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon，所述重组蛋白Hexon的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon的制备方法，步骤如下：

（1）合成EDSV基因，并将EDSV基因连接至pCzn1 载体的 Nde I 和 Xba I 之间，获得重组质粒pCzn1-EDSV；

（2）将步骤（1）中测序正确的重组质粒pCzn1-EDSV转化至大肠杆菌Arctic Express，加入IPTG 诱导pCzn1- EDSV载体融合蛋白过夜表达；

（3）收集经步骤（2）处理的培养液中的细菌，经重悬、破碎后，离心收集沉淀，通过Ni 柱亲和纯化最终获得上述鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon。

所述EDSV基因的序列如SEQ ID No.2所示。

上述的重组蛋白Hexon在制备检测鸭腺病毒1型抗体的间接ELISA试剂盒中的应用，所述间接ELISA试剂盒包括表达蛋白ELISA酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、酶标二抗稀释液、缓冲液、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

所述表达蛋白ELISA酶标板以重组蛋白Hexon作为包被抗原，每孔包被0.5μg所述重组蛋白Hexon，阳性对照为抗鸭腺病毒1型的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清。

所述稀释液或洗涤液均为含0.05％Tween-20的PBST，终止液为2M的H₂SO₄溶液，显色液为100mL TMB显色液。

本发明具有以下有益效果：

1、Hexon重组蛋白编码中和抗原表位，发明人选取了鸭腺病毒1型病毒具有代表性的流行株Hexon蛋白保守性部分的碱基序列组成进行分析，选取保守性部分中具有抗原优势表位的部分，通过人工合成的方式得到目的片段。

2、与传统Hexon蛋白抗原优势表位截短表达相比较，人工合成并表达后的Hexon重组蛋白准确率高，保证了蛋白的中和活性，更利于运用在抗体检测技术的开发。另一方面我们采用了PCZN1载体+Arctic express 体系，自带His 标签，低温诱导表达，该表达体系具有成本低，表达量大特点。成功表达出的Hexon重组蛋白，经变复性的方式，Western Blot检测反应原性强。基于Hexon蛋白作为包被抗原建立的间接ELLSA方法具有很好的特异性。对临床样品检测结果表明本方法可以作为鸭腺病毒1型抗体检测的一种方法有利于在基层广大农户中推广使用。本发明的检测方法还具有可同时进行大量样品的检测以及检测快速、便捷的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1的酶切分析鉴定原核表达质粒pCzn1-Hexon的准确性结果图。

图2为本发明实施例1的SDS-PAGE分析鉴定重组蛋白Hexon表达菌经IPTG诱导表达结果图。

图3为本发明实施例1的SDS-PAGE分析鉴定Ni 柱亲和纯化诱导表达结果图。

图4为本发明实施例1的Western blot 验证结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、Hexon蛋白序列的扩增及原核表达质粒pCzn1-Hexon的构建：

采用全基因合成重组Hexon蛋白基因，所述Hexon重组蛋白的氨基酸序列表为SEQ.ID.No.1，所述重组Hexon蛋白基因的核苷酸序列表为SEQ.ID.No.2,通过限制性酶切位点Nde I和Xba I将重组Hexon蛋白基因插入到pCzn1表达载体中，在200μL的离心管中分别加入重组pCzn1-Hexon质粒 3μL、内切酶1 0.25μL、内切酶2 0.25μL、10×Buffer 1.0 μL充分混匀，置于温度为16℃的低温连接仪中进行连接反应30min，得到连接产物，将连接产物通过限制性酶切位点Nde I和Xba I进行双酶切和测序确认最终表达载体的准确性，得到原核表达质粒pCzn1-Hexon。图1为酶切鉴定原核表达质粒pCzn1-Hexon的结果图，图中M为5000bp DNA Marker；泳道1为酶切前质粒；泳道2为酶切后质粒，由图1可知，重组Hexon蛋白基因片段与预期分子量相符，经测序后，表明重组Hexon蛋白表达载体构建成功。

2、连接产物的转化：

将1μL质粒加入100μL感受态细菌中，吹打混匀，在冰块上静置30min，后在42℃恒温水浴锅内热击90s，迅速置冰中6min后，加入500-800μL的无抗性的LB液体培养基，在温度为37℃、转速为200rmp/min摇床中活化60min，然后在转速为500rmp/min进行离心，离心后全部涂布于含 50 μg/mL Amp 的 LB 平板，37℃倒置培养过夜。

3、IPTG 诱导 pCzn1- Hexon载体融合蛋白的表达

挑取转化平板上的单克隆接种于含 50 μg/mL Amp 的 3mL LB 培养液的试管中，37℃220 rpm 振摇过夜；次日按 1：100 接种于 50 μg/mL Amp 的30 mL LB 培养液中，37℃220 rpm 振摇至菌体 OD600为 0.6-0.8 (约2h)；取出 1mL 培养物，10000g 室温离心2min，弃上清，用 100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入 IPTG 至终浓度为 0.5 m M，37℃ 220 rpm 振摇 4h，诱导融合蛋白表达；取出 1 mL 培养物，10000g室温离心 2min，弃上清，用 100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物 4000g，离心10 min，弃上清，用 PBS 重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬；进行 12%SDS-PAGE 检测分析，考马斯亮蓝染色显带，结果发现目标蛋白主要存在于沉淀中，上清中的表达较少如图2所示，图中M为 Protein Marker；泳道1为未诱导表达；泳道2为诱导表达；泳道3为利用37℃ 0.5m IPTG诱导上清表达；泳道4为利用37度0.5m IPTG诱导沉淀表达。

4、融合蛋白的 Ni 柱亲和纯化及结果分析

利用低压层析系统，包涵体溶液以 0.5 mL/min 流速上样至 Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B 亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer 以0.5 mL/min 流速冲洗，至流出液 OD280 值到达基线；用 Ni-IDA Washing-Buffer(20 m M Tris-HCl，20 m M 咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液 OD280 值到达基线；用 Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM 咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用 PBS（PH7.4）进行透析过夜；进行 10% SDS-PAGE 分析，在相对分子质量约67 KDa处，可见1条特异的蛋白条带，其大小与预期一致，且主要以包涵体的形式存在，结果如图3 所示，图中M为Protein Marker；泳道1为未纯化目的蛋白；泳道2为收集的flow through目的蛋白；泳道3为洗脱后的目的蛋白。

5、免疫印迹试验验证结果图

结果如图4 所示对纯化后的重组蛋白Hexon免疫印迹试验（Western blot）验证，纯化后的抗体均能与EDSV表达的病毒蛋白发生特异性反应，说明本次所制备的一抗具有较好反应活性。图中M为SDS-PAGE蛋白Protein Marker，泳道1为Hexon重组的蛋白，结果可见在预期大小处可见明显条带，证明纯化后的重组蛋白Hexon具有良好的反应原性。

实施例2

本实施例为实施例1所述的重组蛋白Hexon的应用，所述重组蛋白Hexon用于检测鸭腺病毒1型抗体的间接ELISA试剂盒，所述间接ELISA试剂盒包括表达蛋白ELISA酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、酶标二抗稀释液、缓冲液、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液和终止液，所述包被酶标板以重组蛋白Hexon作为包被抗原。

1、酶标二抗的制备：将兔抗鸭IgG(北京百奥莱博科技有限公司生产)用HRP藕联物稳定/稀释剂I(湖州英创生物科技有限公司生产)进行稀释100倍而获得。

2、包被酶标二抗稀释液、缓冲液、封闭液、样品稀释液、洗涤液的配制：

酶标二抗稀释液为含有pH7.2-7.4的0.01M的磷酸缓冲盐溶液b，所述磷酸缓冲盐溶b中鸡血清的质量分数为5％；

包被缓冲液为pH为9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液的配制方法为：取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g，加灭菌的双蒸水800mL溶解，调pH至9.6后，加灭菌的双蒸水至1000m L；

封闭液为pH为7.2-7.4的0.01M的磷酸缓冲盐溶液a，所述磷酸缓冲盐溶液a中鸡血清的质量分数为5％、酪蛋白的质量分数为0.25％；

样品稀释液为pH为7.2-7.4的0.01M的磷酸缓冲盐溶液d，所述磷酸缓冲盐溶液d中鸡血清白蛋白的质量分数为0.1％、蔗糖的质量分数为2％。

3、显色液及终止液的配制：

显色液包括显色液A和显色液B；显色液A的制备方法为：将200mg四甲基联苯胺溶于100m L的无水乙醇中，双蒸水定容至1000m L；显色液B的制备方法为：称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，加入0.75％过氧化氢尿素溶液6.4m L，双蒸水定容至1000m L，调节p H值为4.5-5.0；终止液为2M的H₂SO₄溶液。

4、ELISA反应条件的确定:

最佳包被浓度最佳样品稀释倍数的确定：采用方阵法，分别将抗原(重组蛋白Hexon)按(1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/ mL、32μg/ mL、64μg/ mL进行倍比稀释，依次包被于酶标板中，每个梯度重复4孔，每孔100μL，4℃包被；将阴性对照血清和阳性血清均分别进行1：25、1：50、1：100和1：200倍的样品稀释液稀释，进行间接ELISA。根据P/N值(阳性样品OD值/阴性样品OD值)，最终确定最佳抗原包被量为4μg/mL，100μL/孔，样品的最佳稀释倍数为1：50。对最佳包被条件、最佳封闭液及封闭条件、血清孵育时间、酶标二抗稀释度、酶标二抗作用时间以及底物显色时间等作了逐一优化，最终确定本实施例的鸭腺病毒1型抗体的间接ELISA的最佳反应条件为：最佳包被抗原量为4μg/mL，100μL/孔，4℃包被16h，37℃封闭2h；待检血清稀释50倍，37℃孵育0.5h；酶标二抗抗稀释度为1：10000，37℃反应0.5h；底物显色条件为TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物室温避光显色10min。

5、间接ELISA阴阳性临界值的确定

在间接ELISA的最佳条件下，使用来自无感染鸭腺病毒1型的46份阴性血清样品来确定间接ELISA的临界值(Cut-Off)，其计算方法为46份阴性血清OD450平均值加上三倍标准偏差(S.D.)，当检测样本OD450nm值大于且等于Cut- off值则判定为阳性，反之则判定为阴性。

依据临界值计算公式(Cut-Off＝阴性样本OD450平均值+3×S.D.)，计算出由Hexon建立的间接ELISA方法的临界值为0.425。由此可得出，当利用Hexon建立的间接ELISA方法检测鸭血清样品时，当OD450值≥0.534时即被确定为鸭腺病毒1型抗体阳性；反之，当OD450值＜0.534时即被确定为鸭腺病毒1型抗体阴性。

6、间接ELISA检测方法的批内和批间重复性

选取8份感染鸭腺病毒1型阳性血清以确定Hexon 间接ELISA的批内和批间可重复性。分别检测同一批次和5个不同批次包被的酶标板中的6个阳性血清样品，每个样本在同一酶标板上做3个重复孔并测定OD450值，分别计算每个血清样本的OD450平均值和标准方差(SD)，通过计算变异系数，以确定建立的间接ELISA方法的批内和批间重复性。结果显示，基于Hexon建立的间接ELISA方法的批内的重复变异系数在2％-6.57％之间，批间重复变异系数在2.53％-7.47％之间，所有变异系数均在10％以内，表明Hexon间接ELISA方法重复性好，结果可靠。

7、间接ELISA方法的特异性分析

用上述建立的ELISA方法同时测定鸭腺病毒1型(DAdV-1)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒、禽腺病毒4型 (FAdV-4)、禽腺病毒8型 (FAdV-8)及禽呼肠孤病毒（REO）鸡的阳性血清的OD值，结果显示，只有鸭1型腺病毒的血清检测结果为阳性，其他病原的阳性血清，检测结果均为阴性。

8、鸭腺病毒1型间接ELISA检测试剂盒组成：

(1)包被板包被酶标板(包被重组蛋白Hexon)6板；

(2)阴性对照血清3m L；

(3)阳性对照血清3m L；

(4)酶标二抗0.8m L；

(5)酶标二抗稀释液80m L；

(6)样品稀释液150m L；

(7)显色液A 50m L；

(8)显色液B 50m L；

(9)终止液50m L；

(10)浓缩洗涤液(20×洗涤液)150m L；

(11)盖板膜8张；

(12)血清稀释板8块；

(13)说明书1份。

9、鸭腺病毒1型抗体间接ELISA试剂盒操作说明：

（1）包被：以纯化后的Hexon重组蛋白作为包被抗原，Hexon蛋白用碳酸盐缓冲液稀释后加入96孔的ELISA塑胶孔板上，每孔100μL，于4℃包被过夜；弃去包被后孔中多余的抗原，每孔加入200μL的PBST洗涤4次，洗完后将板拍干；

（2）封闭：每孔加入200μL 封闭液，37℃，封闭2h；弃去封闭液，用PBST洗涤4次，洗完后拍干；

（3）加待检血清：每孔加入100μL用PBS缓冲液稀释过的鸡血清，37℃，孵育1h；弃去孵育后孔中多余的血清，用PBST洗涤4次，洗完后拍干；

（4）加二抗：每孔加入100μL用PBS缓冲液稀释过的羊抗鸡IgG酶标二抗，37℃，孵育1h。之后，弃去孵育后孔中多余的酶标二抗，用PBST洗涤4 次，洗完后拍干；

（5）显色：每孔加入100μL TMB显色剂，37℃避光显色10min；终止：鸭1型腺病毒阳性血清样品孔出现蓝绿色，立即加入0.5M的 H₂SO₄ 终止反应；

（6）结果判断：反应终止后置于酶标仪中，在450nm读取每个样品的OD值。即刻在酶标仪上 450nm 读数，将 OD 值大于设定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

效果例

应用本实施例的鸭腺病毒1型抗体间接ELISA方法对临床送检的98份鸡血清样品进行检测。鸡血清检测出鸭1型腺病毒阳性血清20份，阳性率为20.4％，表明鸭1型腺病毒在该次送检的鸡群中有较高的感染率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<212> PRT

<213> duck adenovirus

<400> 1

Met Glu Pro Gln Arg Glu Phe Phe His Ile Ala Gly Arg Asn Ala Lys

1 5 10 15

Glu Tyr Leu Ser Glu Asn Leu Val Gln Phe Ile Thr Ala Thr Gln Asn

20 25 30

Tyr Phe Asn Leu Gly Asp Lys Phe Arg Asp Pro Tyr Val Ala Pro Thr

35 40 45

Asn Gly Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Lys Leu His Leu Arg Ile Val

50 55 60

Pro Ile Gln Thr Glu Asp Asn Asp Ser Phe Phe Lys Ala Arg Phe Thr

65 70 75 80

Leu Asn Val Gly Asp Asn Arg Ile Val Asp Met Gly Ser Ser Tyr Phe

85 90 95

Asp Ile Gln Gly Ile Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Arg

100 105 110

Gly Thr Ala Tyr Asn Pro Leu Ala Pro Thr Ser Gly Met Pro Asn Met

115 120 125

Ala Tyr Thr His Ser Asn Asn Thr Thr Tyr Ile Gly Gln Leu Pro Gln

130 135 140

Ile Tyr Ser Val Thr Asp Lys Gly Val Thr Glu Ala Lys Gln Gln Gln

145 150 155 160

Ile Gln Ser Thr Asp Pro Asn Pro Gln Val Gly Gln Ser Tyr Gly Ala

165 170 175

Gly Gly Pro Asp Asp Val Asp Thr Glu Lys Ser Gly Gly Lys Gly Arg

180 185 190

Leu Val Val Gly Thr Ala Gly Asp Ser Gln Val Thr Gly Phe Pro Ala

195 200 205

Tyr Gly Ser Trp Cys Pro Pro Gln Ser Val Thr Gly Asp Ile Asn Thr

210 215 220

Thr Leu Asn Pro Ser Thr Val Tyr Leu Asn Thr Thr Thr Asp Thr Asp

225 230 235 240

Arg Val Thr Gly Leu Val Ala Gly Asp Thr Val Glu Trp Asn Ala Pro

245 250 255

Asp Ala His Tyr Val Asn Tyr Val Ser Asp Met Gln Cys Ser Ala Ala

260 265 270

Gly Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Ile

275 280 285

Met Tyr Tyr Asn Ser Gly Ser Asn Ala Gly Ser Phe Ser Ser Gln Thr

290 295 300

Gln Gln Leu Asn Val Val Leu Asp Leu Asn Asp Arg Asn Ser Glu Leu

305 310 315 320

Ser Phe Gln Tyr Leu Ile Ala Glu Leu Thr Asp Arg Tyr Lys His Phe

325 330 335

Ala Leu Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Lys Phe Val Arg Val

340 345 350

Ile Glu Asn Asp Gly Tyr Glu Glu Gly Pro Pro Ser Leu Ser Phe Pro

355 360 365

Pro His Gly Phe Met Asn Phe Phe Thr Ala Pro Asp Thr Gly Thr Ala

370 375 380

Met Thr Val Ser Asp Asp Thr Ala Thr Lys Thr Ala Asn Thr Thr Ala

385 390 395 400

Ile Phe Gly Tyr Gly Asn Leu Pro Ser Met Glu Ile Asn Leu Thr Ala

405 410 415

Asn Leu Gln Arg Thr Phe Leu Trp Ser Asn Val Ala Met Tyr Leu Pro

420 425 430

Asp Tyr Leu Lys Thr Thr Pro Pro Gly Val Thr Leu Pro Ala Asn Pro

435 440 445

Asn Ser Tyr Ala Tyr Met Asn Gly Arg Leu Pro Leu Pro Asn Ile Ile

450 455 460

Asp Thr Trp Thr Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Val Met Asp

465 470 475 480

Glu Ile Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Leu Gly Leu Lys Tyr Arg

485 490 495

Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Cys Lys Phe His Ile Gln Val

500 505 510

Pro Gln Lys Phe Phe Ala Leu Arg Asn Leu Leu Leu Leu Ser Gly Thr

515 520 525

Tyr Asn Tyr Glu Trp Tyr Phe Arg Lys Asp Pro Asn Met Ile Leu Gln

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Ser Thr Leu Gly Asn Asp Leu Arg Ala Asp Gly Ala Ser Val Thr Tyr

545 550 555 560

Thr Ser Ile Asn Leu Tyr Val Ala Phe Phe Pro Leu Ala Tyr Asp Thr

565 570 575

Val Ser Glu Leu Glu Leu Met Leu Arg Asn Ala Thr Asn Asp Gln Asn

580 585 590

Phe Ser Asp Tyr Leu Gly Ala Val Asn Asn Leu Tyr Gln Ile Pro Ala

595 600 605

Asn Ser Thr Ser Val Val Val Asn Val Pro Asp Arg Ser Trp Gly Ala

610 615 620

Phe Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Ile Lys Ala Arg Glu Thr Pro Ala

625 630 635 640

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Leu Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Ser His Thr Phe Asn Arg Val Ser

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Ile Gln Trp Asp Ser Ser Val Pro Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu

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Thr Pro Asn Trp Phe Glu Ile Lys Arg Asn Val Asn Ala Asp Pro Glu

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Gly Tyr Thr Met Ser Gln Ser Ser Ile Thr Lys Asp Trp Phe Met Val

705 710 715 720

Gln Met Ala Ala Asn Tyr Asn Gln Ala Tyr Gln Gly Tyr Ser Leu Pro

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His Thr Lys Phe Tyr Asp Phe Leu Ser Asn Phe Glu Pro Met Thr Arg

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Gln Ile Pro Asp Tyr Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Tyr Thr Gln Tyr Leu

755 760 765

Gln Asp Pro Lys Lys Met Pro Ile Trp Asn Asn Ser Gly Val Gln Gln

770 775 780

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785 790 795 800

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805 810 815

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<212> DNA

<213> duck adenovirus

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atggaacccc aacgtgaatt ttttcacatc gctggtagaa atgcaaaaga gtatctatca 60

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agtcaggtta ctggttttcc agcttatgga agttggtgtc cacctcagag tgtcacggga 660

gacatcaata ctactttgaa tcctagcaca gtgtatctga atacaacaac ggacactgat 720

cgtgttactg gattggttgc tggggatacg gtagaatgga atgctcctga tgctcattat 780

gttaattacg ttagtgacat gcagtgctct gctgccggta atcggcctaa ctacattggt 840

tttagggata attttatcgg cataatgtat tataactcgg ggagtaatgc tggatcattt 900

tccagtcaaa cacagcaact caacgtggta ctagatctta atgacaggaa tagtgagctt 960

agtttccaat atttaattgc tgagcttact gatagatata aacattttgc tctttggaat 1020

caagctgttg atagctatga taaatttgta cgtgttattg agaatgatgg atatgaggaa 1080

gggccgcctt cgctgtcttt tcctcctcat ggttttatga atttttttac ggctcctgac 1140

actggcacgg ctatgactgt gtcagacgac acggccacaa aaacagctaa tactactgca 1200

atcttcggtt atggcaattt gccatctatg gagattaatc tcactgcaaa tttgcagcgt 1260

acgtttttgt ggtcaaatgt tgcaatgtac ctgccagatt atttgaaaac gactccacct 1320

ggagttactc tgccagctaa cccaaattcc tatgcttata tgaatggtcg gttgccgctg 1380

ccaaatatta ttgacacgtg gaccaatatt ggcgctaggt ggtctttgga tgtaatggat 1440

gaaattaatc ctttcaacca ccatagaaat ttgggattga agtacagaag tcagctgttg 1500

ggcaatggca gatattgtaa attccatatc caagtaccac agaaattctt tgcgcttcgc 1560

aatttgttgc tgctgtctgg cacatacaat tatgagtggt actttagaaa agaccctaac 1620

atgattttgc agagtacgct tggcaatgac ttgagagcag atggagcctc tgtaacttat 1680

actagcatta atttgtatgt ggcatttttt cctctcgctt atgatactgt aagcgagctg 1740

gaattgatgc tgcgtaacgc gactaacgat cagaattttt ctgattatct tggcgctgtt 1800

aataatctgt atcagattcc agccaacagt acgagcgttg tggtcaatgt ccctgataga 1860

tcttggggag cttttcgagg ttggtcgttt actagaatta aagctagaga gacgccagca 1920

attggagcca caaaagatcc gaatttcaca tattcaggat caattcccct gttggatggc 1980

acattttacc tttctcatac ttttaacagg gtttctattc agtgggattc cagtgttccc 2040

tggcctggaa atgacagatt gcttacgcca aattggtttg aaattaaacg caatgttaac 2100

gctgatccag aaggttatac aatgtcacaa agttctatca ccaaggactg gtttatggtg 2160

caaatggcag ccaattataa tcaagcatat cagggctata gtttgccgca tactaaattc 2220

tacgattttc tcagcaactt tgagccgatg acgcgccaaa ttccagatta ctcaaagtat 2280

tttgatttgt acacccaata cttgcaggat cctaaaaaga tgcccatttg gaataactca 2340

ggggtgcagc aaatgactaa ctctcctgct ttgctggaaa acacgggtca cttgtatatg 2400

gctaactggc catatccttt gatcggtacg gcagctgtag aaagtcagat tacagagagt 2460

aaatttctgt gtgatagata catgtggatg attcctttca gcagtaactt tttgaacatg 2520

ggcactttaa ctgacttagg tcaaaatgtt ttgtatgcta actctagcca ttccctaaac 2580

atggtttttg atgttgatcc aatggctgag actacatatc tgttgttgct ctttggtgta 2640

tttgatcagg ttgttattaa tcaaccgacg agaagcggta tcagcgtagc ttatctcaga 2700

ttgccttttg ccgccggtag tgcagcaaca tga 2733

Claims

1.一种鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon，其特征在于：所述重组蛋白Hexon的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）合成EDSV基因，并将EDSV基因连接至pCzn1 载体的 Nde I 和 Xba I 之间，3’端添加 taa，获得重组质粒pCzn1-EDSV；

3.根据权利要求2所述的鸭腺病毒1型重组蛋白Hexon的制备方法，其特征在于：所述EDSV基因的序列如SEQ ID No.2所示。

4.权利要求1所述的重组蛋白Hexon在制备检测鸭腺病毒1型抗体的间接ELISA试剂盒中的应用，其特征在于：所述间接ELISA试剂盒包括表达蛋白ELISA酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、酶标二抗稀释液、稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述表达蛋白ELISA酶标板以重组蛋白Hexon作为包被抗原，每孔包被0.5μg所述重组蛋白Hexon，阳性对照为抗鸭腺病毒1型的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述稀释液或洗涤液均为含0.05％Tween-20的PBST，终止液为2M的H₂SO₄溶液，显色液为100mL TMB显色液。