CN1936008A - 鸭腺病毒1型病毒复制非必需区片段的筛选及其通用转载体和由该通用转载体所获得的重组禽腺病毒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭腺病毒1型病毒复制非必需区片段的筛选方法及其通用转载体和由该通用转载体所获得的重组禽腺病毒。以鸭腺病毒1型病毒为材料，通过PCR方法扩增病毒基因组的右侧E4区附近序列，在绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒的两侧分别引入loxP序列后，插入到上述扩增片段中，构建鸭腺病毒1型病毒通用转载体。由该通用转载体获得稳定表达GFP的重组腺病毒，从而确定所选扩增片段为鸭腺病毒1型病毒的1个复制非必需区。该通用转载体的loxP－GFP－loxP序列侧翼含有1个独特酶切位点Bgl II，可插入相关目的基因，获得不含GFP基因的重组病毒。因此，以该通用转载体开发的禽类其它目的基因的基因工程药物不含有筛选标记基因。

Description

鸭腺病毒1型病毒复制非必需区片段的筛选及其通 用转载体和由该通用转载体所获得的重组禽腺病毒

技术领域

本发明属于生物技术制药工业中的基因工程技术领域，专用于外源基因重组鸭腺病毒1型病毒的构建。

背景技术

禽腺病毒可以通过消化道和呼吸道感染，刺激机体局部产生粘膜免疫。将禽腺病毒作为载体亦可用于禽腺病毒1型(CELO)、8型、10型等病毒载体重组疫苗的构建研究。I群禽腺病毒在细胞培养及生产工艺上存在一些困难，而且多数商业鸡群都存在CELO病毒隐性感染，以此构建的病毒载体疫苗的免疫效力会受到一些干扰。鸭腺病毒1型病毒与I群禽腺病毒存在很小的共同抗原，且具有广泛的宿主嗜性，可以在多种宿主细胞中增殖。选用无致病力的鸭腺病毒1型病毒作为候选载体，在重组病毒构建及病毒疫苗生产中具有很大的潜力。鸭腺病毒1型病毒是包括产蛋下降综合症病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)或类似EDSV的一类腺病毒，为腺病毒科胸腺病毒属(Atadenovirus)的成员。以AV127株为代表的EDSV的基因组全序列分析及其转录物组成确认已完成，但仍不清楚其复制非必需区。人腺病毒2型和5型的E3、E4区是病毒的复制非必需区，该区己成功用于基因插入或缺失。然而，EDSV没有E3区，E4区亦不明显，只在EDSV基因组右侧E4区附近有几个小的预测开放阅读框(ORF)序列，这可能与病毒复制无关或不影响病毒复制。所以，可从E4区域附近核酸序列入手，通过插入绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)以确定该区域是否为病毒复制非必需区，为完全复制型禽腺病毒载体的构建创造条件。

在基因操作和重组体的纯化过程中，常常需要荧光素酶、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、β半乳糖苷酶(lacZ)等筛选标记。如果构建好的重组病毒基因组中含有这些报告基因，则给重组病毒的应用带来一定的困难。因此，如何将重组体中的报告基因去除是非常重要的内容。已知，由Sternberg发现的Cre重组酶存在于细菌噬菌体P1中，编码38kDa蛋白，它能识别34bp部分回文的loxP序列，并通过分子间重组将相同方向的两个loxP序列间的核苷酸序列有效切除。Cre-loxP位点依赖的重组发生在表达Cre重组酶的组织类型中，导致靶基因被去除，而其他组织或细胞中由于Cre不表达，靶基因仍然有功能。近年来国外的研究报告表明基于Cre-loxP系统的遗传操作还广泛的应用于精细突变的引入、染色体大片段的删除与重排以及时空上可调节的基因打靶等研究领域。因此，可以通过引入loxP序列，将重组病毒中用于筛选标记的报告基因定向敲除，以使获得的重组毒更接近于野生毒。

发明内容

本发明的目的在于筛选出鸭腺病毒1型病毒的复制非必需区，开发出适于禽类免疫的完全复制型活病毒载体。通过构建通用的转移质粒载体，将相关外源目的基因导入禽腺病毒基因组，并将重组病毒的筛选标记基因定向去除，以期获得符合生物安全标准的基因工程药物。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种鸭腺病毒1型病毒复制非必需区片段的筛选方法，包括以下步骤：

1)以从健康鹌鹑体内分离的1株对鸡鸭等禽类无致病力的鸭腺病毒1型病毒QU株为材料，通过PCR方法扩增病毒基因组的右侧E4区附近序列(参照GENBANK登陆号为 Y09598有腺病毒序列，位于26462～29162之间)，获得阳性质粒pAD16，然后在该扩增区域插入含有loxP序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，构建质粒转移载体pADGFP，所述的质粒转移载体具有loxP-GFP-loxP序列。其loxP-GFP-loxP序列侧翼含有独特的酶切位点，可以插入其它目的基因，通过荧光标记获得重组病毒。

2)将该质粒转移载体与QU株病毒基因组共转染鸡胚成纤维细胞，然后筛选重组鸭腺病毒1型病毒。

3)通过病毒复制效率证实所选重组区域为鸭腺病毒1型病毒的1个复制非必需区。

上述步骤1)所述的扩增基因组右侧E4区附近序列的重组臂扩增片段引物分别是：

正链引物为5′-CCGCGGAAGCATTGAATTCTGGAT-3′

负链引物为5′-CGCGTGCTGTAACAGGCATTCGTA-3′

扩增跨幅为2.73kb的片段。

所述的步骤1)中含有loxP序列的GFP基因表达盒的构建方法是将pEGFP-Cl质粒用BglII和BamHI双酶切，回收大片段，用连接酶连接，转化DH5α细菌，获得阳性质粒命名为pEGFP-H，再将pLOX质粒用NotI酶切，补平、去磷酸化；然后将pEGFP-H质粒用MluI/VspI双酶切，回收GFP表达盒小片段，补平，最后将上述的GFP表达盒小片段连入pLOX质粒的NotI位点，转化DH5α感受态细胞获得了含loxP-GFP-loxP序列的阳性质粒pLOXH。

所述的步骤1)中的构建质粒转移载体的方法是上述的pLOXH的阳性质粒分别用BalI和BglII酶切，回收含loxP-GFP-loxP基因片段，然后将所述的质粒pAD16，分别用BglII和StuI酶切，回收片段，最后将上述的两个回收片段用连接酶连接，转化DH5α细菌，获得质粒转移载体pADGFP。

一种重组禽腺病毒的通用转载体，所述的通用转载体具有loxP-GFP-loxP序列，该loxP-GFP-loxP序列侧翼含有独特的酶切位点BglII，可以插入其它目的基因。所述的其它目的基因可以是病毒、细菌或寄生虫的抗原基因。

一种重组禽腺病毒，由上述的禽腺病毒的通用转载体所获得，所述的重组禽腺病毒基因组中不含有GFP报告基因。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明确定了鸭腺病毒1型病毒基因组的1个复制非必需区；通过引入loxP序列可以将重组病毒中用于筛选标记的报告基因定向敲除，使获得的重组病毒更接近于野生毒，并且以该通用转载体开发的禽类其它目的基因的基因工程药物不含有筛选标记基因。

附图说明

图1重组臂扩增片段所在鸭腺病毒1型病毒基因组位置，其中A是病毒基因组，B是候选基因；

图2是鸭腺病毒1型重组臂基因的扩增、克隆的电泳图片，其中M：DNA标准分子量DL15000；1：以QU株病毒基因组DNA为模板的重组臂扩增片段(2.73kb)；2：将重组臂扩增片段克隆到Pmd18-T载体获得的pAD16质粒(5.4kb)；3：pUC19质粒对照；4：以PUC19为模板，用重组臂扩增引物获得的扩增产物；5：以pAD16为模板，用重组臂扩增引物获得的扩增产物；

图3是pAD16插入位点的双酶切电泳图片，其中M：DNA标准分子量DL15000；1：pAD16质粒；2：pAD16(用BglII单酶切)；3：pAD16(用BglII和StuI双酶切)；

图4是携带loxP-GFP-loxP基因转移质粒载体的鉴定的电泳图片，其中M：DNA标准分子量DL15000；1：将loxP-GFP-loxP基因亚克隆到pAD16获得pADGFP质粒(大小为5.5kb)；2：pAD16质粒(5.4kb)；3：以pADGFP为模板，用重组臂扩增引物获得的扩增产物(2.8kb)；4：以pAD16为模板，用重组臂扩增引物获得的扩增产物(2.7kb)；

图5是携带loxP-GFP-loxP基因的rQUGFP重组病毒蚀斑纯化(56h)的照片，其中A：在荧光显微镜下看到的绿色荧光号；B：在荧光显微镜和光学显微镜同时开启下看到的绿色荧光号；

图6是利用扩增片段为151bp的鉴别引物PCR鉴定rQUGFP纯度的电泳图片，其中M：DNA标准分子量DL2000；1：rQUGFP重组病毒；2：CEF；3：亲本QU病毒；

图7是rQUGFP重组毒在CEF上的一步生长曲线；

图8是不同代次rQUGFP重组毒的TCID₅₀测定结果。

具体实施方式

1重组臂的扩增、克隆

引物设计：正链引物为5′-CCGCGGAAGCATTGAATTCTGGAT-3′，负链引物为5′-CGCGTGCTGTAACAGGCATTCGTA-3′。扩增跨幅为2.73kb的片段，位于鸭腺病毒1型病毒基因组右侧E4区域(参照GENBANK登陆号为 Y09598有腺病毒序列，位于26462～29162之间)，见图1所示。

病毒基因组总DNA的提取：将从健康鹌鹑体内分离的1株对鸡鸭等禽类无致病力的鸭腺病毒1型病毒QU株接种鸭胚尿囊液以6000g离心10min，收集上清。加入等体积裂解液(含0.2mg/mL蛋白酶K，1％SDS，10mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/LEDTA)，置37℃水浴3～4h。将裂解物分别用酚，酚：氯仿，氯仿各抽提一次，加入2.5倍体积无水乙醇，1/10体积NaAc(5mol/LpH5.2)，-20℃放置30min，10000g离心10min沉淀DNA，70％乙醇洗涤一次，待沉淀稍干溶于适量TE(pH8.0)，-20℃保存备用。

PCR：在0.2mL反应管中依次加入5μL PCR Buffer(10×)，200μmol/L dNTP混合物，1.5mmol/L MgCl2，正链和负链引物各10pmoL，5U Taq DNA聚合酶，DNA模板100ng，补ddH2O至50μL。反应参数为95℃变性3min，然后94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 3min，共进行35个循环，最后在72℃延伸10min。反应结束后取3μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色，紫外光线下观察。

扩增产物克隆鉴定：将扩增产物分别用DNA柱式离心回收试剂盒回收，与PMD18-T载体连接，转化新鲜制备的DH5α感受态细胞。挑取LB平板上的白色菌落，接种于4mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养过夜。取菌液进行常规小量质粒的提取，通过PCR鉴定，将阳性质粒命名为pAD16，经测序鉴定正确，见图2。

2含loxP序列的增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒的构建

将pEGFP-Cl质粒(Clontech)用BglII和BamHI双酶切，回收大片段。用T4连接酶连接，转化DH5a细菌，获得阳性质粒命名为pEGFP-H。将pLOX质粒(该质粒是通过人工合成含34bp loxP序列的2条寡核苷酸引物，引物1为5′-CTAGATCT ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAATGCGGCCGCACGCG-3′，5’含BglII酶切位点，3’含NotI位点；引物2为5′-CTGGCC ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTGCGGCCGCATTAA-3′，5’含BalI酶切位点，3’含NotI位点。在聚合酶作用下退火延伸，得到的双链DNA克隆到PMD18-T载体而得)用NotI酶切，补平、去磷酸化；将pEGFP-H质粒用MluI/VspI双酶切，回收GFP表达盒小片段，补平。将上述的GFP表达盒小片段连入pLOX质粒的NotI位点，转化DH5α感受态细胞。挑取单个白色菌落，用含氨苄青霉素LB液体培养基增菌，小量提取阳性质粒通过酶切电泳鉴定，阳性质粒命名为pLOXH。

3含GFP报告基因的鸭腺病毒1型转移质粒载体的构建

将pLOXH用BalI酶切，回收片段，然后用BglII酶切，胶回收1.8kb含loxP-GFP-loxP基因片段。取制备鉴定好的质粒pAD16，用BglII单酶切，回收片段，然后StuI酶切，用1％琼脂糖电泳，用小量胶回收试剂盒回收大片段(见图3)。将两者用T4DNA连接酶连接，转化DH5a细菌，挑取单个菌落进行小量培养，常规方法提取质粒，酶切鉴定，阳性质粒即为转移载体，命名为pADGFP(见图4)。

4表达GFP的重组鸭腺病毒1型病毒的构建

pADGFP质粒的提取和纯化：按碱裂解法提取质粒和聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化质粒DNA。挑取纯化鉴定好pADGFP单个菌落，接种于3mL含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃培养过夜；按1％的浓度取培养过夜的菌液1mL接种于100mL液体培养基中，快速震摇培养4～6h。将细菌液4℃6000r/m离心10min，沉淀悬于5mL溶液I中；加入1mL新鲜配置的溶菌液(10mg/mL)、10mL新配置的溶液II，轻轻混匀，室温放置10min；加8mL冰预冷的溶液III，混匀后冰浴放置10min；6000r/m4℃离心10min，如仍有白色絮状沉淀，将上清再离心一次，吸取上清；加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温放置10min；6000r/m离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤一次，干燥后溶于1mL的TE(pH8.0)中。加入等体积的5mol/L LiCl溶液，混匀后4℃ 12000r/m离心10min；上清加入等体积异丙醇，充分混匀，室温12000r/m离心10min；沉淀经70％乙醇洗涤，吹干后溶于500μL含RNA酶TE中，室温放置30min；加入500μL含13％(W/V)PEG8000和1.6mol/L NaCl溶液，混匀后12000r/m4℃离心5min；沉淀用400μL TE溶解；以酚、酚:氯仿、氯仿各抽提1次；水相中加入100μL10mol/L乙酸铵和2×体积的无水乙醇，混匀后室温放置5min，12000r/m离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤，自然干燥，溶解于100μL灭菌的超纯水中；下列步骤需在超净工作台中完成，将上述纯化好的质粒于高压灭菌后的EP管，并加入1/10体积的3mol/L的NaAc(pH5.2)和2×体积的无水乙醇，沉淀质粒，再用70％的乙醇充分洗涤，自然干燥后，用无菌的TE溶解测定DNA含量，稀释成1μg/μL后分装，-20℃保存备用。

细胞转染：按脂质体(LipofectamineTM2000)使用说明书的方法进行转染，具体步骤如下：(1)转染前一天，将长势良好的原代CEF单层细胞用胰酶消化，每孔中加入0.5～2×10⁵细胞和500μL无抗生素的培养基。待长至90％～95％满时，在细胞单层上按0.1 TCID₅₀/cell的MOI(感染复数)量接种QU株鸭胚尿囊液，37℃吸附1h。(2)DNA-脂质体混合物的制备：a.用50μL无血清无抗生素的DMEM培养基稀释1μg转移质粒载体DNA，轻轻混匀。b.在使用前临时将所需的2μL脂质体用48μL无血清DMEM培养基稀释，轻轻混匀，室温孵育5min。c.将稀释的DNA和稀释的脂质体混合(总体积100μL)，轻轻混匀，室温孵育20min。(3)将100μL DNA-脂质体复合物加入到用无血清DMEM洗涤1次的细胞培养孔中，轻轻混合，于37℃ CO2孵箱中培养4～6h。然后加入DMEM维持液，继续培养。

重组病毒的筛选纯化：转染后12h，开始观察荧光的出现情况。转染后第4d，将24孔板中有细胞病变的CEF细胞用0.05％胰酶消化，接种到有新鲜制备CEF细胞单层的96孔培养板上。观察荧光，将有绿色荧光的蚀斑孔消化并接到新的96孔板细胞上，将绿色荧光阳性的蚀斑数高的细胞毒进行梯度稀释接种到新鲜制备CEF细胞单层的96孔培养板上，如此重复5～6个循环。将带有荧光的病毒液提取DNA，用PCR鉴定病毒纯度。鉴别引物位于重组臂StuI酶切位点两侧，正链引物为5′-CTTCAGCATGGGCCTCATC-3′，负链引物为5′-CATGTCTGACCAGTCGCTCC-3′，扩增产物大小为151bp。在0.2mL反应管中依次加入3μLPCR Buffer(10×)，200μmol/L dNTP混合物，1.5mmol/L MgCl₂，禽腺病毒正链和负链鉴别引物各15pmoL，1.5U Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，补ddH₂O至30μL。于95℃3min，然后94℃ 15s，59℃ 15s，72℃ 10s，共35个循环，最后72℃延伸2min。反应结束后取10μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色分析。只有QU亲本毒株才能获得扩增产物，重组病毒只有荧光信号而检测不到扩增片段(见图6)。将该筛获的重组病毒命名为rQUGFP(见图5)。

重组病毒生长曲线的测定：将rQUGFP和QU亲本株毒各接种一块有CEF细胞单层的24孔细胞培养板(10⁴TCID₅₀/孔)，37℃吸附1h，用DMEM冲洗3次，吸弃上清液，加入DMEM维持液，于37℃5％CO₂培养箱中培养。分别在接种后病毒生长1、4、8、16、18、24、36、48、56和72h时，将细胞吹打下来，分别用CEF进行病毒滴定。重组病毒与亲本毒的生长曲线一致，病毒经过12h的隐蔽期开始复制，96h时病毒增殖量达到高峰。QU株病毒基因组该重组臂所在区域插入外源片段不影响病毒复制(见图7)。因此，通过病毒复制效率证实所选重组区域为鸭腺病毒1型病毒的1个复制非必需区。

重组病毒的稳定性：将纯化的rQUGFP以1∶100稀释，在CEF上连续传12代，观察荧光信号及测定病毒滴度。同时以10⁴TCID₅₀的病毒量经点眼滴鼻接种20只5日龄SPF鸡，每日观察鸡群状态，连续观察12d。结果是重组病毒在CEF上连续传12代后，绿色荧光蛋白基因仍然得到表达，病毒滴度亦未发生变化(见图8)。整个试验期间，重组病毒接种鸡群未发生可见的临床症状和死亡。

5rQUGFP基因组中GFP基因的敲除

将表达Cre酶的质粒DNA(pCre，南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室)和rQUGFP基因组DNA共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞：按脂质体(LipofectamineTM2000)使用说明书的方法进行转染。(1)将100μL rQUGFP重组病毒接种24孔板CEF单层，接种量为10⁴TCID₅₀/孔。于37℃5％CO₂培养箱中培养1h后，用无血清无抗生素的DMEM洗涤2次，每孔加入100μL无血清无抗生素的DMEM。(2)将rQUGFP重组病毒DNA(5μg)、pCre质粒DNA(5μg)和脂质体的无血清无抗生素的DMEM稀释混合物共100μL共转染上述CEF细胞单层，37℃5％CO₂培养箱中感作5h。(3)在每孔中加入1.5mLDMEM维持液(2％犊牛血清)，37℃ 5％CO₂条件下继续培养，96h后收获。

然后通过有限稀释法将重组病毒接种96孔板CEF细胞，收集不带荧光的孔细胞。这样连续用有限稀释法筛选5代，将获得的重组病毒命名为rQU。通过禽腺病毒鉴别引物确定重组毒中不含QU亲本毒。利用腺病毒重组臂扩增引物，通过扩增产物大小证实该重组毒基因组中的GFP基因序列已被去除。

Claims (9)

1.一种鸭腺病毒1型病毒复制非必需区片段的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以从健康鹌鹑体内分离的1株对鸡鸭等禽类无致病力的鸭腺病毒1型病毒QU株为材料，通过PCR方法扩增病毒基因组的右侧E4区附近序列(参照GENBANK登陆号为 Y09598有腺病毒序列，位于26462～29162之间)，获得阳性质粒pAD16，然后在该扩增区域插入含有 loxP序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，构建质粒转移载体pADGFP，所述的质粒转移载体具有 loxP-GFP- loxP序列。

2)将该质粒转移载体与QU株病毒基因组共转染鸡胚成纤维细胞，然后筛选重组鸭腺病毒1型病毒。

3)通过病毒复制效率证实所选重组区域为鸭腺病毒1型病毒的1个复制非必需区。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤1)所述的扩增基因组右侧E4区附近序列的重组臂扩增片段引物分别是：

正链引物为5′-CCGCGGAAGCATTGAATTCTGGAT-3′

负链引物为5′-CGCGTGCTGTAACAGGCATTCGTA-3′

扩增跨幅为2.73kb的片段。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中所述的含有 loxP序列的GFP基因表达盒的构建方法是将pEGFP-C1质粒用 BglII和 BamHI双酶切，回收大片段，用连接酶连接，转化DH5α细菌，获得阳性质粒命名为pEGFP-H，再将p LOX质粒用 NotI酶切、补平、去磷酸化；然后将pEGFP-H质粒用 MluI/ VspI双酶切，回收GFP表达盒小片段，补平，最后将上述的GFP表达盒小片段连入p LOX质粒的 NotI位点，转化DH5α感受态细胞获得了含 loxP-GFP- loxP序列的阳性质粒p LOXH。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中所述的构建质粒转移载体的方法是首先将如权利要求3得到的p LOXH的阳性质粒分别用 BalI和 BglII酶切，回收含 loxP-GFP- loxP基因片段，然后将所述的质粒pAD16，分别用 BglII和 StuI酶切，回收片段，最后将上述的两个回收片段用连接酶连接，转化DH5α细菌，获得质粒转移载体pADGFP。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的质粒转移载体中 loxP-GFP- loxP序列侧翼含有独特的酶切位点，可以插入其它目的基因，通过荧光标记获得重组病毒。

6.一种重组禽腺病毒的通用转载体，其特征在于，所述的通用转载体具有 loxP-GFP- loxP序列。

7.根据权利要求6所述的通用转载体，其特征在于，所述的 loxP-GFP- loxP序列侧翼含有独特的酶切位点 BglII，可以插入其它目的基因。

8.根据权利要求7所述的通用转载体，其特征在于，所述的其它目的基因可以是病毒、细菌或寄生虫的抗原基因。

9.一种重组禽腺病毒，其特征在于，由权利要求6、7或8所述的禽腺病毒通用转载体所获得，所述的重组禽腺病毒基因组中不含有GFP报告基因。

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