CN1955301A

CN1955301A - 一种鸡痘病毒通用转移载体、重组鸡痘病毒及其制备方法

Info

Publication number: CN1955301A
Application number: CN 200610069200
Authority: CN
Inventors: 王莉莉; 黄兵; 宋敏训; 于可响; 黄宝华
Original assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2006-10-19
Filing date: 2006-10-19
Publication date: 2007-05-02

Abstract

本发明涉及一种鸡痘病毒通用转移载体、重组鸡痘病毒及其制备方法。即以鸡痘病毒作为材料，通过PCR方法对其的一个复制非必需区片段进行扩增、克隆得到载体pPCI。利用禽痘病毒早晚期复合启动子构建绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，并在其两侧分别引入loxP序列，一同插入到pPCI，获得通用转移质粒载体pHBP。将其与鸡痘病毒基因组DNA共转染CEF，获得重组病毒rFPVGFP。将其基因组DNA与表达Cre酶的质粒DNA共转染CEF筛获重组病毒rFPV。本发明的pHBP可插入其它目的基因，筛获的重组禽痘病毒不含有GFP基因，解决了重组病毒基因组中含有报告基因问题，大大方便了目的基因重组禽痘病毒的构建。

Description

一种鸡痘病毒通用转移载体、重组鸡痘病毒及其制备方法

技术领域

本发明鸡痘病毒通用转移载体属于生物技术高科技领域，专用于外源基因重组鸡痘病毒的构建。

背景技术

禽痘病毒属于痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科禽痘病毒属的成员，其宿主范围较窄，仅感染禽类，在哺乳动物体内呈现流产性感染，但不影响外源基因的表达和DNA复制。所以它不仅可以用来研制禽类的基因工程活载体疫苗，而且可以作为非复制型病毒载体研制哺乳动物基因工程活载体药物，用于禽类以外的动物乃至人类疾病的预防或治疗。现已成功地将禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒的保护性抗原基因在禽痘病毒中表达。禽痘病毒基因的表达调控主要是在转录水平上，表达量的高低主要取决于启动子的强弱。禽痘病毒有其自身复制的特殊性，所以构建外源基因表达盒时应选用痘病毒自身的启动子。禽痘病毒启动子有早期与晚期之分，选用不同时期的启动子将会直接影响到外源基因的表达时相及表达产量。通常是采用晚期或兼有早/晚期两种功能的启动子。商品化的绿色荧光蛋白基因表达盒的启动子为CMV启动子，在禽痘病毒重组体中的表达效率不是太高，不利于重组毒的筛选。更为重要的是，在基因操作和重组体的筛选纯化过程中，常常需要荧光素酶、LacZ等筛选标记，所以构建好的重组病毒基因组中含有这些报告基因，这给重组病毒的应用带来一定困难。因此，将重组体中的报告基因去除是非常重要的内容。已知，由Sternberg发现的Cre重组酶存在于细菌噬菌体P1中，编码38kDa蛋白，它能识别34bp部分回文的loxP序列，并通过分子间重组将相同方向的两个loxP序列间的核苷酸序列有效切除。Cre-loxP位点依赖的重组发生在表达Cre重组酶的组织类型中，导致靶基因被去除，而其他组织或细胞中由于Cre不表达，靶基因仍然有功能。近年来国外的研究报告表明，基于Cre-loxP系统的遗传操作还广泛的应用于精细突变的引入、染色体大片段的删除与重排以及时空上可调节的基因打靶等研究领域。本发明在构建了以绿色荧光蛋白作为标记系统的禽痘病毒通用载体，并利用Cre-loxP系统自动去除重组病毒基因组中的GFP报告基因，解决了上述问题，大大方便了目的基因重组禽痘病毒的构建。

发明内容

本发明的目的是利用痘病毒早晚期复合启动子改造绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒作为筛选标记，并在其两侧引入loxP序列构建一种通用转移质粒载体。将该转载体与外源目的基因串联转移到禽痘病毒基因组中，通过Cre-loxP位点重组自动敲除重组毒中的筛选标记基因，最终获得只含目的基因的禽痘病毒重组体。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，所述的绿色荧光蛋白基因表达盒的两侧各有一个loxP序列，即该绿色荧光蛋白基因表达盒具有loxP-GFP-loxP序列。所述的绿色荧光蛋白基因表达盒是用痘病毒早晚期复合启动子改造，其序列由痘病毒特有的早晚期复合启动子、绿色荧光蛋白编码序列及SV40polyA序列组成。

一种鸡痘病毒通用转移载体，在所述的鸡痘病毒通用转移载体中具有所述的GFP基因表达盒，即具有loxP-GFP-loxP序列，所述的loxP-GFP-loxP序列的侧翼含有独特的酶切位点BalI，该位点可以插入其它目的基因，进而获得表达外源蛋白的重组鸡痘病毒。所述的其它目的基因可以是病毒、细菌、寄生虫的抗原基因等。

一种重组鸡痘病毒，由上述的鸡痘病毒通用转移载体所获得，所述的重组鸡痘病毒基因组中不含有GFP报告基因。因为在重组酶(Cre)的作用下，通过loxP位点特异性重组，可以非常方便地将基因组中的GFP序列敲除。所述的重组鸡痘病毒的病毒株可获得只有野生毒株才能获得的特异性扩增产物，用于扩增的上下游引物分别是：正链引物为5’-CCGTTGTTGTTAGCGGGATTTA-3’，负链引物为5’-TCGATCGGGTGGATTCCA-3’；引物序列位于重组臂扩增片断的MluI位点两侧，扩增产物大小为171bp。

一种鸡痘病毒通用转移载体的制备方法，包括以下步骤：

1)以鸡痘病毒作为材料，通过PCR方法扩增病毒基因组的复制非必需区片段，得到命名为pPCI的阳性质粒；其中所述的扩增片段上下游引物分别是：

正链引物为5′-TAGAAACTCATACTCGTTACTG-3′，

负链引物为5′-CGATGAAGATATGTCTATACAC-3′，扩增跨幅为2.35kb的片段，位于禽痘病毒基因组(GENBANK登陆号AJ581527)的34180～36534之间；

2)利用痘病毒早晚期复合启动子改造GFP基因表达盒，将其作为外源基因重组鸡痘病毒的筛选标记，在GFP基因表达盒两侧分别引入一个loxP序列。其具体的构建方法是：首先将质粒pEFGPT12s用XbaI/SalI双酶切，获得含痘病毒的早晚期复合启动子的160bp的小片段，补平，然后将pEGFP-C1用SnaBI/NheI双切，回收大片段，补平，去磷酸化，再将上述两个补平片段用T4DNA连接酶连接，转化DH5α细菌，通过HindIII酶切鉴定启动子序列的方向，获得阳性质粒pX03，最后将pX03用MluI/AseI双酶切得到的GFP表达盒片段，将该GFP表达盒片段连入pLOX质粒的NotI位点，转化DH5α细菌获得了含loxP-GFP-loxP顺序的质粒pX04；

3)将引入了loxp序列的GFP基因表达盒插入到由步骤1)得到的pPCI的MluI和SacII酶切位点之间，获得通用转移质粒载体pHBP。其具体的构建方法是：将上述的pX04用EcoRI/SalI双切得到loxP-GFP-loxP序列片段，与所述的pPCI的MluI/SacII双切大片段相连，转化DH5α感受态细胞，获得转移载体pHBP，其loxP序列外侧含有1个BalI酶切位点。将该GFP基因表达盒整合入鸡痘病毒基因组中可以获得高效表达，利于重组病毒的筛选纯化。

一种不含有GFP表达盒基因的重组鸡痘病毒的制备方法，包括以下步骤：1)将根据上述的方法所获得的转移载体pHBP与野生毒基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞，通过荧光信号筛获重组病毒，2)将步骤1)获得的将重组病毒基因组DNA与表达Cre酶的质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞，获得不含GFP表达盒基因的重组鸡痘病毒。该重组病毒，是在重组酶(Cre)的作用下，利用Cre-loxP位点特异性重组，将基因组中的GFP序列敲除掉的。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明在构建了以GFP作为标记系统的禽痘病毒通用载体，并利用Cre-loxP系统自动去除重组病毒基因组中的GFP报告基因，解决了重组病毒基因组中含有报告基因问题，大大方便了目的基因重组禽痘病毒的构建。

2、本发明利用痘病毒早晚期复合启动子改造GFP基因表达盒，将其作为外源基因重组鸡痘病毒的筛选标记，使得该GFP基因表达盒整合入鸡痘病毒基因组中可以获得高效表达，利于重组病毒的筛选纯化。

附图说明

图1是重组臂基因的扩增、克隆的电泳图片，其中M：DNA标准分子量DL15000；1：以禽痘病毒DNA为模板的扩增片段(2.35kb)；2：将以禽痘病毒DNA为模板的扩增片段克隆入pMD18-T载体得到的pPCI质粒(5kb)；3：pUC19质粒(2.7kb)

图2是rFPVGFP感染CEF后GFP表达情况(36h)，其中上面是荧光显微镜观察到的照片：A：携带GFP基因的重组禽痘病毒rFPVGFP；B：282E4株禽痘病毒(parent fowlpox virus)；C：CEF对照；下面的是光学显微镜观察到的照片：D：携带GFP基因的重组禽痘病毒rFPVGFP；E：282E4株禽痘病毒(parent fowlpox virus)；F：CEF对照

图3是通用转载体的构建及重组痘病毒基因组中GPF的敲除模式图，其中A表示病毒基因组；B表示候选基因；带箭头椭圆圈表示loxP序列；表达基因组方向。

图4是rFPV基因组中的loxP序列，其中下划线部分为loxP序列；^*表示碱基缺失。

具体实施方式

1.pPCI重组臂的扩增、克隆

引物设计：正链引物为5′-TAGAAACTCATACTCGTTACTG-3′，负链引物为5′-CGATGAAGATATGTCTATACAC-3′。扩增跨幅为2.35kb的片段，位于禽痘病毒基因组(GENBANK登陆号AJ581527)的34180～36534之间。

DNA提取：将鸡痘病毒282E4株(商业疫苗)接种单层CEF，96h后收获细胞，加入等体积裂解液(含0.2mg/mL蛋白酶K，1％SDS，10mmol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl pH8.0，1mmol/LEDTA)，置37℃水浴3～4h。将裂解物用酚，酚：氯仿，氯仿各抽提一次，加入2.5倍体积无水乙醇，1/10体积NaAc(5mol/LpH5.2)，-20℃放置30min，10000g离心10min沉淀DNA，70％乙醇洗涤一次，待沉淀稍干溶于适量TE(pH8.0)，-20℃保存备用。

PCR扩增克隆：在0.2mL反应管中依次加入5μL PCR Buffer(10×)，200μmol/LdNTP混合物，1.5mmol/LMgCl2，正链和负链引物各10pmoL，5UTaq DNA聚合酶，DNA模板100ng，补ddH2O至50μL。反应参数为95℃变性3min，然后94℃1min，49℃1min，72℃2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取3μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色，紫外光线下观察。将扩增产物用DNA柱式离心回收试剂盒回收，克隆入PMD18-T载体，阳性质粒命名为pPCI。重组臂基因的扩增、克隆的图片如图1所示。

2绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒的构建

将pEFGPT12s质粒(南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室)上含痘病毒的早晚期复合启动子的160bp的小片段用XbaI/SalI双酶切回收，补平。将pEGFP-C1(Clontech)用SnaBI/NheI双切，回收大片段，补平，去磷酸化。将上述两个补平片段用T4DNA连接酶连接。转化DH5α细菌，通过HindIII酶切鉴定启动子序列的方向，获得阳性质粒pX03。

将pX03用MluI/AseI双酶切得到的GFP表达盒片段连入pLOX质粒(该pLOX质粒是通过人工合成含34bploxP序列的2条寡核苷酸引物，引物1为5′-CTAGATCT ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAATGCGGCCGCACGCG-3′，5’含BglII酶切位点，3’含NotI位点；引物2为5′-CTGGCC ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTGCGGCCGCATTAA-3′，5’含BalI酶切位点，3’含NotI位点。在聚合酶作用下退火延伸，得到的双链DNA克隆到PMD18-T载体而得)的NotI酶切位点，转化DH5α细菌获得了含loxP-GFP-loxP顺序的质粒pX04。

3通用转移载体的构建

将质粒pX04用EcoRI/SalI双切得到loxP-GFP-loxP序列片段，与pPCI的MluI/SacII双切大片段相连，转化DH5α感受态细胞，获得转移载体pHBP，其loxP序列外侧含有1个BalI酶切位点。

4表达绿色荧光蛋白的重组鸡痘病毒(rFPVGFP)的构建

按碱裂解法提取质粒和聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化DNA。利用脂质体(LipofectamineTM2000)将282E4株病毒基因组DNA与转移载体pHBP共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)单层细胞。将有绿色荧光的蚀斑取出，梯度稀释后接到新的96孔板细胞上，如此重复5～6次。将带有荧光的病毒液提取DNA，通过PCR鉴定纯度。鉴定引物序列正链为5’-CCGTTGTTGTTAGCGGGATTTA-3’，负链为5’-TCGATCGGGTGGATTCCA-3’，扩增产物大小为171bp。反应体系为30μL：反应管中依次加入3μL PCR Buffer(10×)，200μmol/LdNTP混合物，1.5mmol/LMgCl2，正链和负链鉴定引物各15pmoL，1.5U Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，补ddH2O至30μL。于95℃变性3min，然后94℃15s，57℃15s，72℃10s，共35个循环，最后72℃延伸2min。反应结束后取10μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色分析。结果是只有亲本毒才能获得扩增产物，重组病毒只有荧光信号而检测不到扩增片段。将获得的重组病毒命名为rFPVGFP。

5rFPVGFP基因组中GFP报告基因序列的敲除

从rFPVGFP接种CEF细胞毒中提取DNA，与表达Cre酶的质粒DNA一起在脂质体介导下共转染CEF单层细胞，rFPVGFP感染CEF后GFP表达情况如图2所示。通过梯度稀释筛选不含荧光的细胞毒，如此重复3～4次，将获得的无荧光信号的重组病毒命名为rFPV。rFPV基因组中的loxP序列如图4所示。通过重组臂扩增引物进行PCR鉴定和序列分析，结果表明该重组病毒中不含GFP表达盒基因。

通用转载体的构建及重组痘病毒基因组中GPF的敲除模式图如图3所示。

6病毒复制效率测定

将病毒以10倍系列称释，接种CEF单层细胞，计算病毒蚀斑数目及蚀斑大小。结果发现重组病毒的复制效率与亲本毒一致。

Claims

1.一种绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，其特征在于，所述的绿色荧光蛋白基因表达盒的两侧各有一个loxP序列，即该GFP基因表达盒具有loxP-GFP-loxP序列。

2.根据权利要求1所述的GFP基因表达盒，其特征在于，所述的GFP基因表达盒用痘病毒早晚期复合启动子改造，其序列由痘病毒特有的早晚期复合启动子、绿色荧光蛋白编码序列及SV40polyA序列组成。

3.一种鸡痘病毒通用转移载体，其特征在于，在所述的鸡痘病毒通用转移载体中具有如权力要求1所述的GFP基因表达盒。

4.根据权利要求3所述的鸡痘病毒通用转移载体，其特征在于，所述的loxP-GFP-loxP序列的侧翼含有独特的酶切位点Bal I，该位点可以插入其它目的基因。

5.根据权利要求4所述的鸡痘病毒通用转移载体，其特征在于，所述的其它目的基因可以是病毒、细菌、寄生虫的抗原基因。

6.由权利要求3、4或5所述的鸡痘病毒通用转移载体所获得的重组鸡痘病毒，其特征在于，所述的重组鸡痘病毒基因组中不含有GFP报告基因。

7.一种鸡痘病毒通用转移载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以鸡痘病毒作为材料，通过PCR方法扩增病毒基因组的复制非必需区片段，得到命名为pPCI的阳性质粒；

2)利用痘病毒早晚期复合启动子改造GFP基因表达盒，将其作为外源基因重组鸡痘病毒的筛选标记，在GFP基因表达盒两侧分别引入一个loxP序列；

3)将引入了loxP序列的GFP基因表达盒插入到由步骤1)得到的pPCI的MluI和SacII酶切位点之间，获得通用转移质粒载体pHBP。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的扩增片段上下游引物分别是：

正链引物为5′-TAGAAACTCATACTCGTTACTG-3′，

负链引物为5′-CGATGAAGATATGTCTATACAC-3′，扩增跨幅为2.35kb的片段，位于禽痘病毒基因组(GENBANK登陆号AJ581527)的34180～36534之间。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的GFP基因表达盒的构建方法是：首先将质粒pEFGPT12s用XbaI/SalI双酶切，获得含痘病毒的早晚期复合启动子的160bp的小片段，补平，然后将pEGFP-C1用SnaBI/NheI双切，回收大片段，补平，去磷酸化，再将上述两个补平片段用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α细菌，通过HindIII酶切鉴定启动子序列的方向，获得阳性质粒pX03，最后将pX03用MluI/AseI双酶切得到的GFP表达盒片段，将该GFP表达盒片段连入pLOX质粒的NotI位点，转化DH5α细菌获得了含loxP-GFP-loxP顺序的质粒pX04。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的通用转移质粒载体的构建方法是：将如权利要求9获得的pX04用EcoRI/SalI双切得到loxP-GFP-loxP序列片段，与所述的pPCI的MluI/SacII双切大片段相连，转化DH5α感受态细胞，获得转移载体pHBP，其loxP序列外侧含有1个BalI酶切位点。

11.一种不含有GFP表达盒基因的重组鸡痘病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将根据权利要求7-10的方法所获得的转移载体pHBP与鸡痘病毒基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞，通过荧光信号筛获重组病毒；

2)将步骤1)获得的重组病毒基因组DNA与表达Cre酶的质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞，获得不含GFP表达盒基因的重组鸡痘病毒。