CN107384961A

CN107384961A - Tk基因缺失型的山羊痘病毒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107384961A
Application number: CN201710570119.6A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Jilin Kaibo Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jilin Kaibo Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: CN107384961B

Abstract

本发明提供一种TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制备方法，首先构建两种山羊痘病毒穿梭载体pGVTK和pGVTKα，质粒pGVTK包含的核心元件依次为TK基因同源左臂、痘病毒通用早晚期启动子PE/L、荧光标记基因、转录终止子和TK基因同源右臂，质粒pGVTKα包含的核心元件依次为TK基因同源左臂、无意义序列和TK基因同源右臂；然后利用二次同源重组技术特异性敲除TK基因，并可将筛选标记一并敲除，构建得到的TK基因缺失型的山羊痘病毒的毒性有所降低，但是并不影响病毒增殖，仍然保持亲本毒株的生长特性，同时还具备良好的遗传稳定性，适合于山羊痘疫苗的制备，具备良好的安全性。

Description

TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制备方法与应用。

背景技术

山羊痘(goat pox)是山羊的一种高度接触性传染病，以发热、全身痘疮、结节和死亡为特征。由于该病可造成严重的经济损失、阻碍国际贸易，被世界动物卫生组织(OIE)列为需报告的传染病，而我国农业部将其列为一类动物疫病。

现有的弱毒疫苗虽然可有效预防该病的发生，但在使用上仍存在较大的安全隐患，难以区分疫苗接种和强毒感染。我国是山羊痘多发的国家，要从根本上控制该病只有启动根除计划，因此开展新型疫苗的研制尤为重要。

山羊痘病毒(GTPV)宿主范围仅限于羊及小反刍兽，对人类不具感染性和致病性，作为活病毒载体研制重组多价疫苗有着明显的优势。表达口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒等病原体保护性抗原的重组GTPV不但可以有效预防上述病原体的感染，而且不会干扰这些传染病常规血清学监测。因此，研制山羊痘病毒载体在防治羊及其他小反刍兽疫病方面具有广阔的应用前景，但是国内现用的山羊痘弱毒株，虽有较高的免疫力，但接种后仍会刺激局部痘疹反应，严重时还可能引起继发感染而导致动物死亡。特别是发现我国目前的山羊痘弱毒活苗在南方省份对当地品种山羊和进口纯种羊的免疫副反应大，常发生全身发痘、孕羊流产等，所以有必要进一步研制出更加安全有效的减毒山羊痘载体。随着DNA重组技术的发展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速发展，以此构建的新型基因缺失型山羊痘弱毒疫苗不仅可以具有更低的毒力和更高的安全性，还可根据缺失的基因建立有效的诊断方法，因此极有潜力取代传统疫苗。

鉴于此，采用稳定、高效、安全的DNA重组技术构建基因缺失型的山羊痘病毒具有非常重要的意义。由于山羊痘病毒基因组十分庞大，且其DNA不具有感染性，因而不易通过直接的基因剪切方法将相应基因特异性定点敲除。利用携带筛选标记的穿梭载体在感染山羊痘病毒的细胞中与山羊痘病毒进行同源重组，并且在获得重组山羊痘病毒后再将筛选标记特异性的敲除，成为获得TK基因缺失型的山羊痘病毒的主要手段。因此，山羊痘病毒TK基因重组臂的选择和筛选标记的特异性敲除，成为构建TK基因缺失型的山羊痘病毒的基础和关键点。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的山羊痘病毒穿梭载体。

本发明的另一目的是提供一种新型的TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制备方法。

本发明的又一目的是提供所述TK基因缺失型的山羊痘病毒的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种山羊痘病毒穿梭载体，包括质粒pGVTK和pGVTKα，质粒pGVTK包含的核心元件依次为TK基因同源左臂、痘病毒通用早晚期启动子PE/L、荧光标记基因、转录终止子和TK基因同源右臂，质粒pGVTKα包含的核心元件依次为TK基因同源左臂、无意义序列和TK基因同源右臂。

其中，所述TK基因同源左臂、右臂的核苷酸序列分别如SEQ ID No:1、5所示。所述无意义序列如SEQ ID No:6所示。

优选地，所述荧光标记基因编码的蛋白为增强型绿色荧光蛋白EGFP；所述转录终止子为T5NT。

更优选地，所述痘病毒通用早晚期启动子PE/L、荧光标记基因、转录终止子的核苷酸序列分别如SEQ ID No:2-4所示。

本发明中，质粒pGVTK和pGVTKα的出发载体均可以为pGH。

本发明还提供利用所述穿梭载体制备TK基因缺失型的山羊痘病毒的方法，包括以下步骤：

1)将质粒pGVTK和山羊痘病毒共转染于山羊痘病毒宿主细胞中，通过荧光噬斑筛选获得重组病毒中间体；

2)利用二次同源重组技术定向特异性敲除EGFP基因，将质粒pGVTKα和重组病毒中间体共转染于山羊痘病毒宿主细胞中，通过非荧光噬斑筛选，最终获得TK基因缺失型的山羊痘病毒。

优选地，所述山羊痘病毒包括但不限于GTPV-AV41。所述宿主细胞包括但不限于Vero细胞。

本发明还提供利用上述方法制备的TK基因缺失型的山羊痘病毒。

本发明还提供所述TK基因缺失型的山羊痘病毒在制备山羊痘疫苗中的应用。

本发明进一步提供由所述TK基因缺失型的山羊痘病毒制备的山羊痘疫苗。

本发明提供的TK基因缺失型的山羊痘病毒，通过二次同源重组技术对山羊痘病毒的TK基因进行特异性敲除，以山羊痘病毒TK基因作为重组臂，可以降低山羊痘病毒的毒性，提供安全性。利用该方法获得了TK基因缺失型的山羊痘病毒，通过病毒滴度的对比，一步生长曲线以及遗传稳定性分析，对TK基因缺失型的山羊痘病毒进行验证，结果表明，TK基因缺失型的山羊痘病毒毒性有所降低，但是并不影响病毒增殖，仍然保持亲本毒株的生长特性，同时还具备良好的遗传稳定性。

本发明具有以下优点：

(一)本发明首次提供一种TK基因缺失型的山羊痘病毒。

(二)本发明提供的二次同源重组技术的特异性敲除方法，能够用于构建TK基因缺失型的山羊痘病毒，并可以完成筛选标记的一并敲除，因此在免疫时具备更好的安全性。

(三)本发明提供的培养细胞优选为Vero细胞，其在构建TK基因缺失型的山羊痘病毒的转染效率上要远远高于BHK细胞，同时Vero细胞是唯一已被批准用于生产人用病毒疫苗的细胞株，因此具备良好的安全性。

附图说明

图1A为本发明实施例1中山羊痘穿梭载体pGVTK结构示意图，其中核心原件包括同源重组左臂TKL、同源重组右臂TKR、复合强启动子序列PE/L、增强型绿色荧光蛋白EGFP及强转录终止序列T5NT。

图1B为本发明实施例1中山羊痘穿梭载体pGVTKα结构示意图，其中核心原件包括同源重组左臂TKL、无意义序列、同源重组右臂TKR。

图2为本发明实施例2中Vero细胞和BHK细胞转染效率对比结果。

图3为本发明实施例2中构建的重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP的筛选过程(A)和PCR的鉴定结果(B)。

图4为本发明实施例2中构建的TK基因缺失型的山羊痘病毒GTPV-TK的筛选过程(A)和PCR的鉴定结果(B)。

图5为本发明实施例2中山羊痘病毒GTPV-TK的一步生长曲线。

图6为本发明实施例2中山羊痘病毒GTPV-TK的遗传稳定性的分析结果，其中1st：1代病毒GTPV-TK，5th：5代病毒GTPV-TK，10th：10代病毒GTPV-TK。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 山羊痘病毒穿梭载体pGVTK和pGVTKα的构建

根据GenBank中公布的山羊痘病毒全基因序列，对山羊痘病毒GTPV-AV41的胸苷激酶基因TK进行分析和同源性比较后，根据山羊痘病毒胸苷激酶基因TK及其侧翼序列选择两段核苷酸序列作为同源重组左臂TKL(422bp，SEQ ID No:1)与同源重组右臂TKR(402bp，SEQID No:5)，并在同源左臂与同源右臂之间依次添加痘病毒通用早晚期启动子PE/L(SEQ IDNo:2)、增强型绿色荧光蛋白EGFP(SEQ ID No:3)、转录终止信号T5NT(SEQ ID No:4)，得到山羊痘病毒穿梭载体pGVTK。另一种羊痘病毒穿梭载体pGVTKα也含有上述同源重组左臂TKL(422bp)与同源重组右臂TKR(402bp)，但在TKL与TKR之间仅含有一段无意义序列(21bp，SEQID No:6)。上述核心元件由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成，

质粒pGVTK和pGVTKα的出发载体均为pGH，它们的质粒图谱见图1A和图1B。

实施例2 TK基因缺失型的山羊痘病毒的筛选和鉴定

1、山羊痘穿梭质粒的制备

利用《无内毒素质粒大提试剂盒(离心柱型)》(天根生化科技(北京)有限公司)制备穿梭质粒，并采用分光光度法测定核酸的浓度，且OD260/280在1.8-2.0之间，-40℃保存备用。

2、细胞培养及消化传代

本实施例中使用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，它是一种贴壁成纤维细胞。用含5％FCS的DMEM培养液，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。待Vero细胞在培养瓶中长成单层后，在无菌的条件下将培养瓶内的DMEM培养液倒出，加适量的0.25％胰酶溶液洗一次，然后再加少量胰酶在37℃、5％CO₂培养箱中静置消化4min，至壁上细胞全部脱落下来，补加2-3mL 5％FCS的DMEM培养液，吹打混匀后，分置于六孔板的培养孔中(2mL/孔)，置37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，用于后续实验。

3、细胞计数

取细胞悬液0.1mL，10倍稀释后利用Muse^TM Cell Analyer进行计数。

4、山羊痘病毒滴度测定

将制备好的Vero细胞平铺在96孔板中，按照10^-1倍比稀释山羊痘病毒GTPV-AV41，即吸取100μL的病毒原液，将其加入到900μL的无FCS的DMEM中混匀，一直将山羊痘病毒稀释到10^-8，然后将各个稀释倍数依次接于96孔板中，每个稀释倍数稀释度8个重复，留取一排为空白对照组。37℃、5％CO₂温箱吸附4h。然后加入100μL含2％FCS的DMEM培养液，在37℃、5％CO₂温箱继续培养120h。在倒置显微镜下直接观察每个稀释度的噬斑形成情况，按如下公式计算出每毫升病毒液中所含的空斑形成单位(Plaque forming units，PFU)，计算公式如下：

PFU/mL＝(病毒空斑数×稀释倍数)/接种体积

5、Vero细胞与BHK细胞的转染效率对比

6孔板中Vero细胞和BHK细胞长满80％时，以5MOI GTPV-AV41感染Vero细胞和BHK细胞，37℃5％CO₂的条件下吸附2h后，利用转染试剂Effectene Transfection Reagent转染实施例1制备的山羊痘病毒穿梭载体pGVTK，构建重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP，并设立空白对照、GTPV-AV41对照、GTPV-AV41转染试剂对照、pGVTK质粒对照。转染的具体操作步骤如下：

(1)取100μL EC Buffer加入到高压过得Eppendorf管，加入1μg重组质粒pGTPV-TK，充分混匀后加入3.2μL Enhancer，漩涡震荡1s，室温静置5min。

(2)向DNA-Enhancer混合物中加入10μL Effectene Transfection Reagent，用移液器反复吹打5次或漩涡震荡10s，室温静置10min。

(3)向Eppendorf管内的转染混合物中加入600μL 5％FCS的DMEM，并用移液器缓慢地吹打2次使之混匀，然后吸掉6孔板中液体，并将Eppendorf管中DMEM转染混合液全部加入到一个孔中，其余对照孔均加入等量的5％FCS的DMEM，并在37℃5％CO₂的条件下培养8h后，补加5％FCS DMEM至2mL。

37℃5％CO₂的条件下培养96h，在荧光显微镜下观察绿色荧光。结果如图2所示，结果表明Vero细胞在构建TK基因缺失型的山羊痘病毒的转染效率上要远远高于BHK细胞，Vero细胞更适合用于TK基因缺失型的山羊痘病毒的构建、筛选与扩增。

6、重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP的获得

将病变细胞收于Eppendorf管中，用封口膜封好并超声破碎即15个循环，15s超声，15s停息。将超声后病毒液放于-40℃保存。并将重组山羊痘病毒命名为GTPV-TK-EGFP。

7、重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP的筛选

通过挑取绿色荧光噬斑的方法来筛选重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP，具体操作如下：

(1)以30MOI转染后的山羊痘病毒感染Vero细胞，37℃5％CO₂的条件下感作4h后，弃掉上清并补加5％FCS DMEM 2mL，37℃5％CO₂的条件下培养至96h。

(2)将完全病变后的细胞置于荧光显微镜下观察绿色荧光噬斑，并用mark笔做好标记，然后在无菌的条件下，使用200μL枪头将事先用mark笔标记的病变细胞挑出，并加入装有500μL无FCS DMEM的Eppendorf管中，用封口膜封好并超声破碎即15个循环，15s超声，15s停息。将超声后病毒液放于-40℃保存。

(3)重复步骤(1)和(2)直至出现大量清晰明显的绿色荧光噬斑时，挑取噬斑并改变接毒量以10MOI感染Vero细胞，并以相同的方法进行筛选，直到待形成的细胞病变均为绿色荧光病变细胞时，挑取绿色荧光噬斑用于扩增。

(4)将最后一次挑取的噬斑以50MOI感染Vero细胞，在37℃5％CO₂的条件下感作4h后，弃掉上清并补加5％FCS DMEM 2mL，37℃5％CO₂的条件下培养至96h。收取全部病变细胞转移至Eppendorf管中，用封口膜封好并超声破碎即15个循环，15s超声，15s停息。

(5)重复步骤(4)一次，即完成病毒的扩增。

8、重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP的鉴定

将扩增后的重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP以5MOI接种Vero细胞，在37℃5％CO₂培养96h后收取病变细胞，利用TIANamp Genomic DNA Kit提取感染细胞的总基因组。

以上述所提取的总基因组为模板，PCR扩增TK基因。

上游引物序列为：5’-GAATCACCAGAGCCGATAACA-3’

下游引物序列为：5’-TCCTTACCCCCGATGAGTTC-3’

反应体系为：

模板2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×MasterMix 12.5μL，ddH₂O 9.5μL。

反应条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min 20s，共30个循环；最后72℃延伸10min。通过琼脂凝胶电泳记录并分析PCR产物的结果。

9、GTPV-TK-EGFP的筛选过程与PCR鉴定结果

检测结果表明，山羊痘穿梭载体能够与山羊痘病毒发生重组，并能将山羊痘病毒TK基因中的部分碱基替换掉，其中图3A为GTPV-TK-EGFP的筛选过程，图3B为GTPV-TK-EGFP的PCR鉴定结果。

10、TK基因缺失型的山羊痘病毒GTPV-TK的构建、筛选、扩增与鉴定

利用二次同源重组技术敲除EGFP基因，具体操作方法参照“5、重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP的构建”，用重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP和山羊痘病毒穿梭载体pGVTKα同时转染Vero细胞。

GTPV-TK的筛选步骤参照“7、重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP的筛选”，其中GTPV-TK的筛选获取标准为，形成的细胞病变均为无绿色荧光病变细胞时，挑取噬斑用于扩增。

11、GTPV-TK的筛选与PCR鉴定结果

其中，PCR鉴定引物、反应体系、反应条件参照“8、重组山羊痘病毒GTPV-TK-EGFP的鉴定”。

检测结果表明，二次同源能够敲除EGFP标记基因，并完成TK基因缺失型的山羊痘病毒的构建，其中图4A为GTPV-TK的筛选过程，图4B为GTPV-TK的PCR鉴定结果。

12、GTPV-TK的生物特性鉴定与制备

(1)GTPV-TK与亲本毒株的病毒滴度比较分析

在制备单层Vero细胞，在接毒前弃去上清，用无FCS DMEM洗一遍，加入GTPV-TK病毒液后，37℃吸附4h，加入含2％FCS DMEM继续培养直至细胞完全病变。收获细胞和上清，超声破碎，以此作为GTPV-TK种毒。分别测定GTPV-TK和GTPV AV41在Vero细胞中的病毒滴度。

(2)病毒滴度比较结果

将GTPV-TK和GTPV AV41株Vero细胞，收毒后测定病毒滴度，GTPV-TK的病毒滴度为7×10⁵PFU/mL，GTPV-AV41的病毒滴度为1.66×10⁶PFU/mL。与亲本病毒GTPV AV41相比，GTPV-TK病毒滴度略有降低，但是没有明显差异。表明TK基因缺陷对GTPV在细胞上的增殖影响较小，符合TK基因为痘病毒复制非必需基因的理论。

(3)GTPV-TK病毒生长特性分析

以100PFU的GTPV-TK与GTPV AV41株分别接种己长满6孔板的Vero细胞，分别在接种后培养0h，12h，24h，48h，72h和96h用细胞刮子收获病毒，超声破碎，再接种Vero细胞，测定各个时间点的病毒滴度，绘制一步生长曲线。

(4)GTPV-TK生长特性结果

结果如图5所示，通过测定0h、12h、24h、48h、72h、96h这几个时间点的病毒滴度，绘制GTPV-TK和GTPV AV41的生长曲线，结果TK基因缺失型病毒与亲本病毒的生长曲线无明显差异，表明TK基因的敲除对病毒的复制无明显影响。

(5)GTPV-TK遗传稳定性分析

将GTPV-TK在Vero细胞上连续传代。定期检查细胞的状态，记录80～90％以上细胞出现病变的时间，并收获病毒。如此连续培养10代，每隔5代提取病毒DNA进行PCR检测，并测定GTPV-TK的病毒滴度。

(6)GTPV-TK遗传稳定性检测结果

GTPV-TK连续传代10代，分别提取第1、5、10代的基因组并测定病毒滴度，各代的病毒滴度分别为GTPV-TK(1代)为3.8×10⁴PFU/mL，GTPV-TK(5代)4.4×10⁴PFU/mL，GTPV-TK(10代)6×10⁴PFU/mL，PCR鉴定结果如图6所示，结果表明GTPV-TK传代10次内具有良好的遗传稳定性，无野生型病毒的污染，并且病毒滴度无明显变化。

(7)GTPV-TK的扩增

待6孔板中Vero细胞长至90％时，以10MOI GTPV-TK感染Vero细胞，37℃5％CO₂条件下吸附4h后，弃去病毒液补加含2％FCS的DMEM 2mL，37℃5％CO₂条件下培养96h，然后弃去培养液，并于每孔加入0.5mL含1％双抗无FCS的DMEM，冻融一次，无菌条件下用Eppendorf收取病毒液，每管0.5mL，然后用封口膜封好，超声破碎(超声功率160W，15s超声，15s停息，15个循环)。将超声后病毒液收集于50mL离心管中，测定病毒滴度，置于-80℃保存用于后续试验。GTPV-TK的病毒滴度为1.25×10⁶PFU/mL。以上结果表明，TK基因缺失型的山羊痘病毒毒性有所降低，但是并不影响病毒增殖，仍然保持亲本毒株的生长特性，同时还具备良好的遗传稳定性，适合于山羊痘疫苗的制备，具备良好的安全性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 吉林省凯博生物技术有限公司

<120> TK基因缺失型的山羊痘病毒及其制备方法与应用

<130> KHP171112416.4

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 422

<212> DNA

<213> pGVTK-TKL

<400> 1

tgaaccactg tctgaagaat gtaaaacatt agttgatttt accaatatga aaaattttag 60

gatattattt aataagattc ctataaatat actaaataaa caaataactg taaataaagg 120

gtacttatca gattttgtta ctacattaat gagattaaaa aaagaacttt ttttagaatc 180

accagagccg ataacatata tagaccttag aaaagatcca acatttttaa acattttatc 240

aatattgcac gaaaaataat tgaacaaata tttttttaaa gaaaaaatgg actatggata 300

tatacattta attataggac ctatgttttc tggcaaaagt actgaattga taagaatagt 360

taaaaggtac caaatagcgc agtataaatg ttgtgtagta aaatacttaa atgatatccg 420

at 422

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 痘病毒通用早晚期启动子PE/L

<400> 2

aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 增强型绿色荧光蛋白EGFP基因

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 4

<211> 7

<212> DNA

<213> 转录终止子T5NT

<400> 4

tttttgt 7

<210> 5

<211> 409

<212> DNA

<213> pGVTK-TKR

<400> 5

tttcaacgaa aagaatttaa tgatatattg aaattgatac cgttatctga aaaagtaaca 60

aaattaaacg ctgtatgtat ggaatgttat aaagatgccg cattttctaa gaggatcact 120

aaagaaaagg aaatagaact catcgggggt aaggaaaaat ataaatctgt ttgtaggaaa 180

tgttattttt tagaataata aatattaatg aaaaaaaagt aaaaaaaaag tgatctattt 240

acttattaaa ctatatagtt aataagtaaa atgggtatca gacacgagtt agatattttg 300

cttgtttctg aaaatattgc actaaagaat gttgaacttc ttaaaggtga tagttatgga 360

tgtactatta atataaaagt taatcaacaa aaaaaattgg attttatta 409

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atacaataat taatttctcg t 21

Claims

1.山羊痘病毒穿梭载体，其特征在于，包括质粒pGVTK和pGVTKα，质粒pGVTK包含的核心元件依次为TK基因同源左臂、痘病毒通用早晚期启动子PE/L、荧光标记基因、转录终止子和TK基因同源右臂，质粒pGVTKα包含的核心元件依次为TK基因同源左臂、无意义序列和TK基因同源右臂；

其中，所述TK基因同源左臂、右臂的核苷酸序列分别如SEQ IDNo:1、5所示，所述无意义序列如SEQ ID No:6所示。

2.根据权利要求1所述的穿梭载体，其特征在于，所述荧光标记基因编码的蛋白为增强型绿色荧光蛋白EGFP，所述转录终止子为T5NT。

3.根据权利要求2所述的穿梭载体，其特征在于，所述痘病毒通用早晚期启动子PE/L、荧光标记基因、转录终止子的核苷酸序列分别如SEQ ID No:2-4所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的穿梭载体，其特征在于，质粒pGVTK和pGVTKα的出发载体均为pGH。

5.利用权利要求1-4任一项所述穿梭载体制备TK基因缺失型的山羊痘病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述山羊痘病毒包括GTPV-AV41。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括Vero细胞。

8.根据权利要求5-7任一项所述方法制备的TK基因缺失型的山羊痘病毒。

9.权利要求8所述的山羊痘病毒在制备山羊痘疫苗中的应用。

10.由权利要求8所述的山羊痘病毒制备的山羊痘疫苗。