CN110724674A

CN110724674A - 表达羊口疮病毒f1l蛋白的无筛选标记重组山羊痘病毒及其构建方法

Info

Publication number: CN110724674A
Application number: CN201911048763.2A
Authority: CN
Inventors: 许国洋; 杨柳; 余远迪; 沈克飞; 付利芝; 白运川
Original assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Current assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2020-01-24

Abstract

本发明通过同源重组，创新性的利用蚀斑与反向蚀斑筛选技术，最终获得无筛选标记重组病毒，尤其是rGTPV‑F1L重组羊痘病毒，该方法简单有效，易于操作，提供了可用于重组病毒疫苗开发的无筛选标记基因重组病毒，为新型ORF疫苗研究提供了新思路和措施，具有广阔的应用前景。

Description

表达羊口疮病毒F1L蛋白的无筛选标记重组山羊痘病毒及其构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体为涉及一种重组病毒，更具体涉及一种无筛选标记重组山羊痘病毒及其构建方法。

背景技术

羊口疮(Orf)又称羊传染性脓疱(Contagious Ecthyma，CE)，是羊口疮病毒(orfvirus，ORFV)引起的一种人兽共患病，被我国列为B类动物传染病，也是20种最重要的危害山羊和绵羊的病毒性疫病之一。该病主要侵害羊的口唇部、尾根部和乳房等，常导致感染部位出现脓疱、溃烂和结节等症状。该病传播迅速，流行广泛，发病率高，不同品种、性别和年龄段的羊只均可感染，在羔羊中的发病率和死亡率最高，由于ORFV对羔羊口唇部具有良好嗜性，羔羊发病后口唇部伤口常继发感染多种病原菌，造成进食困难，免疫力下降，最终因营养不良和器官衰竭而死亡。ORFV也可感染鹿、松鼠、骆驼和羚羊等多种动物，偶尔感染人。目前，该病在我国分布广泛，常呈群发性流行，由于ORFV生命力顽强，对环境耐受性较好，在干燥痂皮中可以存活10年以上，且保持较好的感染性，因此，该病一旦流行，流行区域就很难彻底清除病原，不仅危害我国畜牧业发展，造成巨大经济损失，还直接威胁着人类的健康和公共卫生安全,因此该病的防控意义重大。

ORFV属于痘病毒科副痘病毒属，是一种双链DNA病毒，全基因组大小为135～139kb，含有以甲硫氨酸为开头的300个左右开放性阅读框，ORFV基因组中含有131个基因。F1L基因位于ORFV基因组的中部，编码的蛋白参与病毒表面微管的合成，能够诱导机体产生中和抗体，且可与多数细胞表面的硫酸乙酰肝素(Heparansulfate，HS)受体结合，在病毒吸附和侵入细胞的过程中起到重要作用，已被认为是ORFV亚单位疫苗研制的主要候选抗原。

目前，关于ORFV的防治尚无有效药物和疫苗产品，多数报道集中于疫病诊断、药物防控和病原学研究等，在可用于临床的安全、有效的疫苗产品方面仍未有突破性进展。近年来，重组活载体疫苗已成为研究热点，其克服了常规疫苗的缺点，兼有灭活疫苗和减毒疫苗的优点。重组活载体疫苗主要包括重组痘病毒载体、重组腺病毒载体、重组沙门菌载体、重组李斯特菌载体、其他重组载体等，其中，重组痘病毒载体在山羊疫苗产品研制方面具有显著优势，实现了表达载体与免疫载体的有机融合，既可以激发羊痘病毒的免疫反应，又可以发挥外源蛋白的免疫活性。

但是，重组痘病毒载体技术仍存在有待克服的问题。比如，重组痘病毒载体技术普遍采用了标记基因，标记基因技术是随着基因工程发展而兴起的一个研究领域，是对目的基因进行标记的工具，主要包括抗性基因、颜色反应基因、代谢缺陷型互补基因和一些其他具有明显性状表型的相关基因等，其中，eGFP作为一种颜色反应基因常被用于表达产物的精细定位，已被广泛应用于重组病毒的筛选。随着科学技术的不断发展，标记基因技术逐渐成熟，但依然存在诸多弊端，比如，目标转化子被筛选出后，筛选标记即失去了价值，筛选标记的存在反而可能对机体基因表达和正常生命活动造成影响，存在安全隐患。此外，含有标记基因的重组病毒不符合商业疫苗生物安全的要求和基因工程疫苗的种毒标准，易造成基因工程重组活载体疫苗转基因安全问题，疫苗产品的研发及推广应用方面存在局限性。同时，若疫苗产品含有筛选标记，经临床应用后残留在肉制品中，影响肉制品的质量及消费，还有可能引起食品安全恐慌。

张倩等(“表达羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒的构建与特性鉴定”[J].微生物学报,2014,54(7):813-820.)利用同源重组原理，通过脂质体转染技术成功构建了表达羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒，但存在一定弊端：首先，获得的重组病毒中包含了LacZ筛选标记，仅在筛选重组病毒时起到标记的作用，获得重组病毒后便失去价值，难以达到商品化疫苗标准。然后，利用LacZ筛选标记筛选重组病毒时，需要对染毒细胞进行固定、染色，再进行蓝白斑蚀斑挑选，操作复杂，且易出现假阳性。其次，细胞产生病变是一个动态过程，利用蓝白斑来挑取阳性蚀斑时，收毒时机难以把握，且用于固定的低熔点琼脂糖会干扰蚀斑的观察结果，易错过最佳挑斑时间。

因此，开展无筛选标记基因重组病毒的研究是重组病毒疫苗开发的关键。但是，这仍是业界的难题。中国医学科学院病原生物学研究所的郭斐等(一种高效重组且无筛选标记的痘苗病毒载体及其建立方法，CN201910370701.7，2019-07-19.)采用CRISPR-Cas9技术敲出痘苗病毒TK基因，再对痘病毒进行eGFP荧光标记，然后利用Cre-LoxP系统对标记基因进行删除，虽然提高了同源重组效率，但存在以下弊端：(1)CRISPR-Cas9是近年来新兴技术，现阶段主要面临精确修复比较低、PAM识别序列的限制、脱靶现象、马赛克现象等问题，很多方面仍需不断改进和完善；(2)在构建无标记重组痘病毒的过程中，多次利用基因编辑技术后，仍然需要经过多次蚀斑纯化筛选，并未简化病毒纯化过程，而重组病毒的纯化是获得重组病毒的关键。

CN 102559611A公开了一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒及其构建方法，其中采用同源重组技术和终点稀释法实现构建、筛选无标记重组病毒，但其存在以下弊端：首先，选用的安卡拉牛痘病毒(MVA)载体在人体和大多数哺乳动物细胞中不能有效增殖，选用仓鼠肾细胞(BHK21)进行脂质体转染来构建重组MVA病毒，必然影响同源重组效率，给重组病毒的构建造成困扰；其次，在重组病毒的构建过程中，未对目的基因进行标记，造成重组病毒与亲本毒无法直观的、有效的区分，导致重组病毒的纯化、鉴定十分困难，这也是目前大部分研究构建含有筛选标记基因的重组病毒所要克服的难题，而文中也未给出更有效的解决方案；然后，在重组病毒的纯化过程中，文中将BHK21细胞更换为兔肾细胞(RK-13)，而病毒在新株系细胞上增殖均需要适应期，增加了病毒纯化的难度，且采用终点稀释法获得重组病毒需要更大的工作量，易出现假阳性。

发明内容

本发明的目的在于克服ORFV重组山羊痘病毒含有筛选标记问题，并开发新型防ORF候选疫苗毒株。

本发明的目的是这样实现的：

一种重组病毒，其特征在于所述病毒无筛选标记，采用同源重组与反向蚀斑相结合。

上述重组病毒，采用带有目的基因的质粒与带有筛选标记的病毒载体进行同源重组，目的基因替代病毒载体中的筛选标记，进行反向蚀斑筛选并纯化。

具体的，发明人将上述重组病毒技术应用于ORFV疫苗产品开发，构建重组山羊痘病毒活载体，获得一种稳定表达羊口疮病毒F1L蛋白的无筛选标记重组山羊痘病毒。

优选的，上述质粒为pUC19-lateP-earlyP-F1L质粒(图1)，病毒载体为rGTPV-eGFP。类似的质粒包括：pUC119、pUC18、pUC118等，类似的病毒包括：绵羊痘病毒等。

上述述重组病毒、制备方法可应用于无筛选标记重组山羊痘病毒的构建。

所述目的基因为F1L，所述重组病毒为无筛选标记重组山羊痘病毒rGTPV-F1L。类似的目的基因包括B2L等。

上述筛选标记为eGFP。类似的筛选标记包括：GFP等。

优选的，一种无筛选标记重组山羊痘病毒，其特征在于：将pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒与重组病毒rGTPV-eGFP同源重组将F1L基因序列插入并替代rGTPV-eGFP重组羊痘病毒中的eGFP基因序列，利用反向蚀斑筛选技术，纯化不表达绿色荧光蛋白的蚀斑，获得稳定表达羊口疮病毒F1L蛋白无筛选标记的重组山羊痘病毒rGTPV-F1L。

上述pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒，其特征在于：使用F1L-F/F1L-R为引物扩增ORFV的F1L全长基因序列，通过双酶切，插入并替代pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒中的eGFP序列，获得pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒。所述F1L-F(上游扩增引物)的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，F1L-R(下游扩增引物)的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

上述rGTPV-eGFP重组病毒，其特征在于：利用脂质体转染技术，将重组质粒pUC19-lateP-earlyP-eGFP转染接种了羊痘弱毒疫苗株的BHK21细胞后，通过同源重组和蚀斑筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白的rGTPV-eGFP重组羊痘病毒。

上述rGTPV-eGFP重组病毒，其特征在于：通过引物reF/reR进行PCR鉴定，所述reF(上游扩增引物)的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，reR(下游扩增引物)的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

上述pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒，其特征在于：以转移载体pUC19为骨架，以山羊痘病毒TK基因为核心序列设计合成上、下游同源臂，在同源臂之间依次插入晚期、早期启动子和增强型绿色荧光蛋白eGFP基因序列，构建得到pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒。所述上游同源臂大小为906bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述下游同源臂大小为908bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述晚期启动子大小为44bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述早期启动子大小为39bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述eGFP序列大小为720bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明表达羊口疮病毒F1L蛋白的无筛选标记重组山羊痘病毒的构建方法，包括以下步骤：(1)以转移载体pUC19为骨架，以山羊痘病毒TK基因为核心序列设计合成上、下游同源臂，在同源臂之间依次插入晚期、早期启动子和增强型绿色荧光蛋白eGFP基因序列，构建pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒；(2)利用脂质体转染技术，将重组质粒pUC19-lateP-earlyP-eGFP转染接种了羊痘弱毒疫苗株的BHK21细胞后，通过同源重组和蚀斑筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白的rGTPV-eGFP重组羊痘病毒；(3)设计引物，扩增ORFV的F1L全长基因序列，通过双酶切，插入并替代pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒中的eGFP序列，获得pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒；(4)利用脂质体转染技术，将步骤(3)获得的重组质粒，转染接种了rGTPV-eGFP重组羊痘病毒的BHK21细胞后，通过二次同源重组，将F1L基因序列插入并替代rGTPV-eGFP重组羊痘病毒中的eGFP基因序列，利用反向蚀斑筛选技术，纯化不表达绿色荧光蛋白的蚀斑，通过PCR、IFA、Western blot鉴定，获得稳定表达羊口疮病毒F1L蛋白无筛选标记的重组山羊痘病毒rGTPV-F1L。

一种疫苗，包括权利要求上述重组病毒。

有益效果

(1)本发明以山羊痘疫苗弱毒株为载体，引入晚期/早期启动子，有利于ORFV F1L蛋白的持续高效表达。

(2)本发明通过两次同源重组，创新性的利用蚀斑与反向蚀斑筛选技术，最终获得无筛选标记的rGTPV-F1L重组羊痘病毒，方法简单有效，易于操作。

(3)本发明为重组病毒疫苗开发的无筛选标记基因重组病毒的研究提供了新的思路，并取得突破。

(4)本发明将F1L基因插入到羊痘病毒载体中，构建无筛选标记基因的重组山羊痘病毒株，为新型ORF疫苗研究提供了新思路，也为防控羊口疮，羊痘疫苗的研制奠定基础，具有广阔的应用前景。

(5)本发明获得的重组候选疫苗毒株不含筛选标记；不会出现基因敲除过程中精确修复比较低、PAM识别序列筛选难、脱靶及马赛克现象等问题；候选疫苗株形成的蚀斑易于观察，挑斑时间可控，收毒时机易于把握。

附图说明

图1是pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒的构建流程示意图，pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒与pMD18-T-F1L分别经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后，粘端连接获得pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒。

图2是rGTPV-eGFP重组羊痘病毒的蚀斑筛选结果，A1：转染12h后，接毒的BHK21细胞出现绿色荧光，A2：对照孔BHK21细胞未检测到荧光信号；B1：转染72后接毒孔的细胞开始变圆、皱缩和聚团，出现明显的绿色荧光团块；B2：对照孔仍未检测到绿色荧光信号。

图3是rGTPV-eGFP重组羊痘病毒的PCR鉴定结果，1、2为阳性重组羊痘病毒PCR产物；M为DNA marker DL2000。

图4是ORFV的F1L目的基因的PCR鉴定结果，1为ORFV的PCR产物，M为DNAmarkerDL2000。

图5是pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒的双酶切鉴定结果，1为双酶切产物，分别在约1000bp和4700bp出现预期条带，M为DNA markerDL5000。

图6是rGTPV-F1L重组山羊痘病毒的反向蚀斑筛选结果，转染后12h，即可观察到只接毒而未转染重组质粒的BHK21细胞出现绿色荧光(见A1)；72h后，转染了重组质粒的BHK21细胞开始皱缩、变圆、聚团，形成细胞团块(见A2)，但检测到荧光信号(见A3)。

图7是rGTPV-F1L重组山羊痘病毒的PCR鉴定结果，1为阳性重组羊痘的PCR产物；2为阴性对照；M为DNA Marker DL2000。

图8是rGTPV-F1L重组山羊痘病毒的IFA鉴定结果，A1为接种了重组病毒BHK21细胞，出现红色荧光；A2为未接种病毒的阴性对照，未检测到荧光信号。

图9是rGTPV-F1L重组山羊痘病毒表达的F1L蛋白的Western blot鉴定结果，1为阳性重组病毒的F1L蛋白鉴定，在约39kD出现预期条带；2为阴性对照，未见任何条带；M为蛋白质Marker。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒的构建

1.目的基因序列的设计

目的基因序列顺序依次为上游同源臂、晚期启动子、多克隆酶切位点、早期启动子、eGFP、下游同源臂构成，基因全长2 712bp。

1.1上游同源臂序列信息：大小为906bp，在SEQ ID NO:1的5’端插入SphⅠ酶切位点。

1.2晚期启动子与早期启动子序列信息：大小分别为44bp(SEQ ID NO:2中1-44碱基位点)和39bp(SEQ ID NO:3中1-39bp)，晚期启动子3’端插入Sal I SmaI AfIII NarIBspMI BamHI ApaI NheI SacII KpnI、HindIII多克隆酶切位点(SEQ ID NO:2中45-114bp)，早期启动子3’端插入Xho I酶切位点(SEQ ID NO:3中40-46bp)。

SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:3

1AAGCTCGTAA AAGTAGAAAA TATATTCTAA TTTATTGCAC TCGAGC

1.3eGFP序列信息：大小为720bp，3’端插入Xba I酶切位点(SEQ ID NO:4中721-726bp)1.4下游同源臂序列信息：大小为908bp，3’端插入EcoRⅠ酶切位点(SEQ ID NO:5中909-914bp)。

2.目的基因的合成目的基因全长2712bp，5'端为SphI酶切位点(5'-GCATGC)，3'-端为EcoRⅠ酶切位点(GAATTC-3')，基因序列由上海生工生物工程技术有限公司合成。

3.pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒的构建

合成的目的基因序列经SphI/EcoRⅠ双酶切后定向插入pUC19质粒中，重组质粒由上海生工生物工程技术有限公司构建。

实施例2

稳定表达绿色荧光蛋白的rGTPV-eGFP重组羊痘病毒的构建、纯化及鉴定

重组病毒的构建

1.重组质粒的抽提：采用Invitrigen公司的无内毒素中量质粒提取试剂盒HiPurePlasmind Midiprep Kit提取pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒，-20℃保存备用。2.细胞培养及接毒：取6孔培养板，向每孔中加入2mL的BHK21细胞，含量为1～2×105个，37℃5％CO2培养，至80％汇合时，接种羊痘弱毒疫苗株，病毒接种量为0.05个MOI，并设空白对照，37℃孵育2h，换维持液(不含抗生素)，继续培养4h；

3.转染液配制：制备250μL A液，具体步骤如下：将240μL不含抗生素和血清的OPTI-MEM培养液与10μL脂质体混匀；制备250μL B液，具体步骤如下：用不含有抗生素和血清的OPTI-MEM培养液稀释4μg要转染的质粒至250μL；将A液室温放置5min后，滴加入到B液中，轻柔的混合均匀，室温放置20min；

4.转染：吸弃6孔板中的细胞维持液，PBS洗涤3次，将上述混合液逐滴加入到已接种病毒的BHK21细胞及正常的BHK21细胞中，在37℃，5％CO 2的培养箱中培养6h，吸弃转染液，加入2mL含2％新生牛血清OPTI-MEM培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，持续观察荧光信号变化情况。转染后12h，即可观察到接毒的BHK21细胞出现绿色荧光(见图2-A2)。

重组病毒的纯化及鉴定

1.当细胞开始出现病变，且荧光病毒蚀斑最多时，将细胞培养板置于-80℃，反复冻融3次，低速离心收集上清，作为种毒备用。

2.将BHK21细胞接种24孔细胞培养板，80％融合时，接种上述收集的重组病毒液，接种量为20％，孵育2h，吸弃上清，PBS洗3次，加入细胞维持液，37℃，5％CO2恒温培养箱中持续培养。48h后，观察细胞荧光斑出现情况，当细胞开始出现皱缩、变圆、聚团，但未脱落时，标记荧光蚀斑(见图2-B1)，用直径为2mm含2.5％胰蛋白酶的无菌滤纸片覆盖于标记处，37℃孵育1min后，将消化下来的细胞和滤纸片转入含有200ul细胞培养液(含10％FBS的DMEM培养液)的1.5mL EP管中，尽可能多的挑出有荧光的蚀斑，反复吹打，-80℃冻融3次。将挑出的重组病毒继续在12孔细胞培养板中进行挑斑纯化，连续筛选6次后，纯化获得rGTPV-eGFP重组羊痘病毒，设计特异性引物reF/reR，对重组病毒进行PCR鉴定，通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，约在1500bp位置出现特异性条带(见图3)。PCR产物经纯化后送生工生物工程有限公司进行测序分析，大小为1491bp，与预期结果一致。

Seq ID NO.6(reF)：	5'-CAAGCCACTACAAGAACCAGTTAG-3'
		Seq ID NO.7(reR)：	5'-CGTCCTTGAAGAAGATGGTG-3'

测序结果：PCR产物长度1 491bp：同源臂前端羊痘病毒部分核酸序列115bp(SEQID NO:8中1-115碱基位点)，上游同源臂906bp(SEQ ID NO:8中116-1021碱基位点),启动子：160bp(SEQ ID NO:8中1022-1181碱基位点)，部分eGFP：310bp(SEQ ID NO:8中1182-1491碱基位点)

实施例3

pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒的构建及鉴定

1.F1L目的基因的扩增：利用病毒基因组提取试剂盒提取ORFV基因组，作为模板，F1L-F/F1L-R为引物，进行F1L全长基因徐列的扩增。PCR反应体系为：DNA模板2μL，引物F1L-F/F1L-R(10pmol/μL)各0.5μL，2×Taq MasterMix 10μL，ddH2O补足至20μL，反应条件：94℃5min；94℃40sec，55℃40sec，72℃40sec，共30个循环；72℃延伸10min；反应结束后经琼脂糖凝胶电泳鉴定分析，在约1000bp出现预期条带(见图4)。

Seq ID NO.9(F1L-F)：	5'-CCG<u>CTCGAG</u>ATGGATCCACCCGAAATC-3'
		Seq ID NO.10(F1L-R)：	5'-TGC<u>TCTAGA</u>TCACACGATGGCCGTGAC-3'

F1L-F下划线标记的为XhoⅠ酶切位点。

F1L-R下划线标记的为XbaⅠ酶切位点。

2.pMD18-T-F1L重组质粒的构建：利用胶回收试剂盒将上述PCR产物进行回收，将回收的目的片段连接到pMD18-T载体上，连接组分混合均匀后在PCR仪中16℃过夜，各反应组分及加样量分别为：回收产物1μL，SolutionⅠ5μL(包含有T4DNA连接酶)，pMD18-T质粒1μL，去离子水3μL，总体积为10μL。

3.转化：将感受态细胞在冰上溶解，取10μL连接产物与80μL感受态细胞在离心管中混匀，冰水浴30min；将含有混合物的离心管在42℃水浴锅中热击90sec，冰浴2～3min。然后，加入800μL LB液体培养基，37℃，120r/min，振摇培养60min。取200μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)的LB平板中，倒置平板，37℃，在恒温培养箱中进行培养。菌落直径达到1mm左右时，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。

4.转化子的鉴定：利用Mini Plasmid Kit质粒提取试剂盒提取重组菌株质粒，F1L-F/F1L-R为测序引物，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，结果表明目的片段大小为1041bp，与预期结果一致。

F1L测序结果为SEQ ID NO.11。

5.将pMD18-T-F1L与pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒，分别在37℃下用XhoⅠ与XbaⅠ进行双酶切2h，双酶切后，回收、纯化F1L与pUC19-lateP-earlyP基因片段。将两个回收产物在16℃下连接过夜，连接产物转化感受态DH5a。筛选阳性转化子，获得pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒，提取重组质粒进行双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，发现其在预期位置出现目的条带(见图5)。

实施例4

无筛选标记的重组山羊痘病毒rGTPV-F1L的构建及鉴定

无筛选标记基因重组病毒的构建

1.重组质粒的抽提：参照实例2的方法提取pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒，-20℃保存备用。

2.细胞培养及接毒：取6孔培养板，向每孔中加入2mL的BHK21细胞，含量为1～2×10⁵个，37℃5％CO₂培养，至80％汇合时，接种荧光标记的rGTPV-eGFP重组病毒，病毒接种量为0.05个MOI，37℃孵育2h，换维持液(不含抗生素)，继续培养4h；

3.转染：参照实例2的方法将pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒与接种了rGTPV-eGFP重组病毒的BHK21细胞进行脂质体转染，37℃，5％CO₂培养箱中培养，持续观察荧光信号变化。转染后12h，即可观察到只接毒而未转染重组质粒的BHK21细胞出现绿色荧光(见图6-A1)。72h后，转染了重组质粒的BHK21细胞开始皱缩、变圆、聚团，形成细胞团块(见图6-A2)，但检测到荧光信号(见图6-A3)。

重组病毒的纯化

1.当80％细胞出现病变时，将细胞培养板置于-80℃，反复冻融3次，低速离心收集上清，作为种毒备用。

2.参照实例2中方法，对未出现荧光信号的细胞团块进行标记，用含胰酶的无菌滤纸片尽可能多的挑出未出现荧光的细胞团块，加入含有200ul细胞培养液(含10％FBS的DMEM培养液)的1.5mL EP管中，反复吹打，-80℃冻融3次。将挑出的重组病毒继续在12孔细胞培养板中进行纯化，连续筛选8次后，纯化获得无筛选标记的rGTPV-F1L重组羊痘病毒。

3.rGTPV-F1L重组羊痘病毒的鉴定

3.1 PCR鉴定：利用病毒基因组提取试剂盒提取rGTPV-F1L重组病毒基因组，作为模板，F1L-F/F1L-R为引物进行PCR鉴定，反应体系为：DNA模板5μL，2×Taq MasterMix25μL，，引物各0.5μL，ddH2O补足至50μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃40sec，55℃40sec，72℃40sec，共30个循环；72℃延伸10min；反应结束后经琼脂糖凝胶电泳鉴定分析，在预期位置出现目的条带(见图7)，经测序，与预期结果一致。

3.2 IFA检测：

取6孔培养板，向每孔中加入2mL的BHK21细胞，含量为1～2×10⁵个，37℃5％CO₂培养，至50％汇合时，每孔加入200ul的rGTPV-F1L重组病毒，并设空白对照，孵育2h，弃上清，PBS洗3次，每孔加入2mL细胞维持液，继续培养。48h后，弃细胞维持液，PBS洗3次，加入预冷的丙酮-甲醇(4：1)溶液，固定15min，弃去固定液，PBS洗3次，每次2min，自然晾干；每孔加入BSA进行封闭处理，37℃1h，PBS洗3次，每次2min；接毒孔中加入兔抗F1L蛋白的血清，37℃孵育1h，PBS洗3次，每次2min，自然晾干，加入1:500稀释的羊抗兔IgG(Alexa594)预吸附二抗(红色荧光标记)，37℃孵育1h，PBS洗3次，每次2min，自然晾干，直接在荧光显微镜下观察荧光信号情况。结果发现，接毒孔细胞出现红色荧光，对照孔无荧光出现(见图8)。

3.3Western blot鉴定

将rGTPV-F1L重组病毒接种BHK21细胞，37℃5％CO₂培养箱中持续培养72h后，-80℃反复冻融3次，低速离心收集上清，备用。取200ul重组病毒液进行SDS-PAGE，电泳结束后，取出硝酸纤维素膜，用铅笔标记好紧贴凝胶的一面，在室温条件下，用封闭液(5％脱脂奶粉)浸泡2h，再用TBST溶液洗膜3次，每次10min。将硝酸纤维素膜放于干净的平皿中，再加入兔抗F1L血清，进行一抗的孵育，4℃处理1h后，重复上述的洗膜操作。洗膜后，再加入用TBST稀释了30000倍的羊抗兔IgG(H+L)抗体(碱性磷酸酶标记)，4℃孵育1h，重复上述的洗膜操作。将硝酸纤维素膜置于BCIP/NBT显色液中避光显色，出现条带后用去离子水反复冲洗，以终止反应。结果在39kD的位置出现预期条带，对照孔无条带(见图9)。

序列表

<110>重庆市畜牧科学院

<120>重组病毒、表达羊口疮病毒F1L蛋白的重组山羊痘病毒及其构建方法

<160> 11

<210>1

<211> 912

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222> （1）..（6）

<223> SphⅠ酶切位点

<400>1

gcatgcatgg agaaaaataa cacaaaaaac atttatttta ctcctgtatt tatagaacct 60

actataaaac attccctttt acaatcttac aaatatacat atatcataat atttgaaatt 120

ataacagtgg tggtattatt atttttattt tttaagtcag aaatcaacat gttgtttaat 180

tttaaacaac gaaaagttat cagtccgata gataaatttt caaaaaccac tttatactgt 240

aaagaaaata agctttttat tagtgggtta cctaatacta tgtactcaaa ggaagcacta 300

tcattaaata gacaaccgat aacatataaa tattgtgatg atcttttaca atcaataaat 360

ggatcacagc aagtatctat taacgatatt cttagaaaat gatgactcct tttttaaata 420

cttatcagaa caagatgatg aaacagctat gtctgatatc gaaaccattg taacatattt 480

aaatttttta ttgtcattgt taattagatc aaaggataaa ctagagtcga taggttatta 540

ttatgaacca ctgtctgaag aatgtaaaac attagttgat tttaccaata tgaaaaattt 600

taggatatta tttaataaga ttcctataaa tatactaaat aaacaaataa ctgtaaataa 660

agggtactta tcagattttg ttactacatt aatgagatta aaaaaagaac tttttttaga 720

atcaccagag ccgataacat atatagatct tagaaaagat ccaacatttt taaacatttt 780

atcaatattg cacgaaaaat aattgaacaa atattttttt taaaaaaaat ggactatgga 840

tatatacatt taattatagg acctatgttt tctggcaaaa gtactgaatt gataagaata 900

gttaaaaggt ac 912

<210>2

<211>114

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222> （1）..（44）

<223> 早期启动子

<222> （45）..（114）

<223> 晚期启动子

<400>2

aattggatca gctttttttt tttttttttt ggcatataaa taaggtcgac cccgggctta 60

agggcgcctc cggaggatcc gggcccgcta gcccgcgggg taccaagctt cgac 114

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222> （1）..（39）

<223> 早期启动子

<222> （40）..（46）

<223> Xho I酶切位点

<400>3

aagctcgtaa aagtagaaaa tatattctaa tttattgcac tcgagc 46

<210>4

<211>726

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222> （721）..（726）

<223> Xba I酶切位点

<400> 4

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

tctaga 726

<210>5

<211>914

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222> （909）..（914）

<223> EcoRⅠ酶切位点

<400>5

caaatagcgc agtataaatg ttgtgtagta aaatacttaa atgatatccg atatggtaat 60

tctgtgtata cacatgataa taaccatgta tctgccatgt caacaacttt attatatgac 120

gtcgttgata aaattatgaa tttcgacatt ataggtatag atgaagggca attttttaaa 180

gatattgtac ctttttctga aaatatggca aatatgggaa agataattat aatagctgca 240

ctagatagca cgtttcaacg aaaagaattt aatgatatat tgaaattgat accgttatct 300

gaaaaagtaa caaaattaaa cgctgtatgt atggaatgtt ataaagatgc cgcattttct 360

aagaggatca ctaaagaaaa ggaaatagaa ctcatcgggg gtaaggaaaa atataaatct 420

gtttgtagga aatgttattt tttagaataa taaatattaa tgaaaaaaaa gtaaaaaaaa 480

agtgatctat ttacttatta aactatatag ttaataagta aaatgggtat cagacacgag 540

ttagatattt tgcttgtttc tgaaaatatt gcactaaaga atgttgaact tcttaaaggt 600

gatagttatg gatgtactat taatataaaa gttaatcaac aaaaaaaatt ggattttatt 660

attatattac ggcccgattg gacagaggta aggaatgtta aaaaaataaa tatggtatgt 720

aacggtgttg ttattgatac aacactaatc aaaaaatctt tttacgaaga agtatattca 780

tcatctgtaa cagtttttca aaatactaca gttgaatttt ttagtgatac tagtaagaaa 840

tataaagaag aatatcccat tgttaacata aacaccataa agcgttatta cgaaataaaa 900

gattcaagga attc 914

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

caagccacta caagaaccag ttag 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgtccttgaa gaagatggtg 20

<210>8

<211>1491

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222> （1）..（115）

<223> 同源臂前端羊痘病毒部分核酸序列

<222> （116）..（1021）

<223> 上游同源臂

<222> （1022）..（1181）

<223> 启动子

<222> （1182）..（1491）

<223> 部分eGFP

<400>8

caagccacta caagaaccag ttagattaaa tgactttatt gggctgtttg attgtgtaaa 60

gaaaaatata ccactaacaa atattccaat tatggaataa aatatcatca gttaaatgga 120

gaaaaataac acaaaaaaca tttattttac tcctgtattt atagaaccta ctataaaaca 180

ttccctttta caatcttaca aatatacata tatcataata tttgaaatta taacagtggt 240

ggtattatta tttttatttt ttaagtcaga aatcaacatg ttgtttaatt ttaaacaacg 300

aaaagttatc agtccgatag ataaattttc aaaaaccact ttatactgta aagaaaataa 360

gctttttatt agtgggttac ctaatactat gtactcaaag gaagcactat cattaaatag 420

acaaccgata acatataaat attgtgatga tcttttacaa tcaataaatg gatcacagca 480

agtatctatt aacgatattc ttagaaaatg atgactcctt ttttaaatac ttatcagaac 540

aagatgatga aacagctatg tctgatatcg aaaccattgt aacatattta aattttttat 600

tgtcattgtt aattagatca aaggataaac tagagtcgat aggttattat tatgaaccac 660

tgtctgaaga atgtaaaaca ttagttgatt ttaccaatat gaaaaatttt aggatattat 720

ttaataagat tcctataaat atactaaata aacaaataac tgtaaataaa gggtacttat 780

cagattttgt tactacatta atgagattaa aaaaagaact ttttttagaa tcaccagagc 840

cgataacata tatagatctt agaaaagatc caacattttt aaacatttta tcaatattgc 900

acgaaaaata attgaacaaa tatttttttt aaaaaaaatg gactatggat atatacattt 960

aattatagga cctatgtttt ctggcaaaag tactgaattg ataagaatag ttaaaaggta 1020

caattggatc agcttttttt tttttttttt tggcatataa ataaggtcga ccccgggctt 1080

aagggcgcct ccggaggatc cgggcccgct agcccgcggg gtaccaagct tcgacaagct 1140

cgtaaaagta gaaaatatat tctaatttat tgcactcgag catggtgagc aagggcgagg 1200

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 1260

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 1320

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 1380

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 1440

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac g 1491

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ccgctcgaga tggatccacc cgaaatc 27

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tgctctagat cacacgatgg ccgtgac 27

<210>11

<211>1041

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ccgctcgaga tggatccacc cgaaatcacg gcctacataa tcggggttgc cgaaggccgc 60

gggaccaagg aggtgttccc cacgctgccg tacctggtgg gcctcgccga cgacccgccc 120

aagcctcaac ccgcacctaa gcctgctccc tctcctgcgc cagccccagc gccggccccc 180

gcaccggccc ccgcgccagc acccaagcca tctcctcccg cgccgcaccc caaaggcgac 240

cacgtgctca aggcggtgga atggaaagac gttgactcca aagactaccc gcacttcttc 300

acggacatgt gcaagtccac gtgtccgaag gagatgcagc gccgcgcggc acaccacctc 360

aacctctggg agagcatatc ggccggcact gtccccacca agtactccga cgatgacttc 420

gtcctggtgg tcgacaacga catgaccttc cgcaagcccg agatggtaaa gccgctcatt 480

gaggcgatga ggacgaacgg ctggtacatg acgcagctca aggagaccta catgaccggc 540

gcgctggcca ccaacgtccc cggcaccggc gacccagagc tcatggtcta ccccggcggg 600

tacgacgtct cgctagacgc ctacatcatc aacgtcggcg gcatgaagaa gctatacgac 660

gcgatcatca aggagggagg gctgcgcagc ggcctgctta ccgaggtgtt cacgctggag 720

aagcggctct ctctggcgcg cgtggtgctc tccggcgccg agcaggtggt ctaccccgag 780

tactacatac aggtgaagac gcggctcggc ggcgcgccct ccctgtggtc gctgctcgcc 840

acgtggctgg cgcgcttctg gcccggcgcc atctacttcc tcaccacgcc gctcttctcc 900

ttcatggggc tcttcgacgt ggacgtggtc gacatcttca tcctggcata cctgctggtg 960

ctcgtgctgc tgctgccgaa ctcgcggctg ctgtggttca tcgccgggct gctggtcacg 1020

gccatcgtgt gatctagagc a 1041

Claims

1.一种重组病毒，其特征在于：所述重组病毒无筛选标记，采用同源重组与反向蚀斑筛选相结合。

2.如权利要求1所述的重组病毒的制备方法，采用带有目的基因的质粒与带有筛选标记的病毒进行同源重组，目的基因替代病毒中的筛选标记，进行反向蚀斑筛选纯化。

3.如权利要求2所述重组病毒的制备方法，所述质粒为pUC19-lateP-earlyP-F1L质粒，所述病毒为rGTPV-eGFP。

4.如权利要求1-3任一所述重组病毒的制备方法应用于无筛选标记重组山羊痘病毒的构建。

5.一种无筛选标记重组山羊痘病毒，采用权利要求2或3所述方法构建，所述目的基因为F1L，所述重组病毒为无筛选标记重组山羊痘病毒rGTPV-F1L。

6.如权利要求5所述无筛选标记重组山羊痘病毒，所述筛选标记为eGFP。

7.如权利要求5或6所述的重组山羊痘病毒，将pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒与接种了病毒载体rGTPV-eGFP的细胞进行转染，通过二次同源重组，将F1L基因序列插入并替代rGTPV-eGFP重组羊痘病毒中的eGFP基因序列，利用反向蚀斑筛选纯化不表达绿色荧光蛋白的蚀斑。

8.如权利要求5-7任一所述的重组山羊痘病毒，所述pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒的制备方法包括以下步骤：使用F1L-F/F1L-R为引物扩增ORFV的F1L全长基因序列，通过双酶切，插入并替代pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒中的eGFP序列，获得pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒。

9. 如权利要求8所述的重组山羊痘病毒，所述F1L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，F1L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

10.如权利要求5-9任一所述的重组山羊痘病毒，所述rGTPV-eGFP的制备方法包括以下步骤：利用脂质体转染技术，将重组质粒pUC19-lateP-earlyP-eGFP转染接种了羊痘弱毒疫苗株的BHK21细胞后，通过同源重组和蚀斑筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白的rGTPV-eGFP。

11. 如权利要求10所述的重组山羊痘病毒，所述rGTPV-eGFP通过引物reF/reR进行PCR鉴定，所述reF的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，reR的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

12.如权利要求8-11所述的重组山羊痘病毒，所述pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒的制备方法是以转移载体pUC19为骨架，以山羊痘病毒TK基因为核心序列设计合成上、下游同源臂，在同源臂之间依次插入晚期、早期启动子和增强型绿色荧光蛋白eGFP基因序列，构建得到pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒。

13. 如权利要求12所述的重组山羊痘病毒，所述上游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述下游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述晚期启动子核苷酸序列如SEQID NO：3所示；所述早期启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述eGFP序列核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

14.如权利要求5-12任一所述的重组山羊痘病毒的制备方法，包括以下步骤：

（1）以转移载体pUC19为骨架，以山羊痘病毒TK基因为核心序列设计合成上、下游同源臂，在同源臂之间依次插入晚期、早期启动子和增强型绿色荧光蛋白eGFP基因序列，构建pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒；

（2）利用脂质体转染技术，将重组质粒pUC19-lateP-earlyP-eGFP转染接种了羊痘弱毒疫苗株的BHK21细胞后，通过同源重组和蚀斑筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白的rGTPV-eGFP重组羊痘病毒；

（3）设计引物，扩增ORFV的F1L全长基因序列，通过双酶切，插入并替代pUC19-lateP-earlyP-eGFP重组质粒中的eGFP序列，获得pUC19-lateP-earlyP-F1L重组质粒；

（4）利用脂质体转染技术，将步骤（3）获得的重组质粒，转染接种了rGTPV-eGFP重组羊痘病毒的BHK21细胞后，通过二次同源重组，将F1L基因序列插入并替代rGTPV-eGFP重组羊痘病毒中的eGFP基因序列，利用反向蚀斑筛选技术，纯化不表达绿色荧光蛋白的蚀斑，通过PCR、IFA、Western blot鉴定，获得稳定表达羊口疮病毒F1L蛋白无筛选标记的重组山羊痘病毒rGTPV-F1L。

15.一种疫苗，包括权利要求1-13任一所述重组病毒。