CN110257434A - 利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆 - Google Patents

利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆 Download PDF

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Abstract

利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，属于基因工程技术领域，其特征在于：细胞克隆被分离纯化且经过2％马血清诱导分化后可以形成肌纤维；该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力；MSTN基因敲除载体靶位点已成功连接，未发生碱基突变；实验组细胞经分化能够形成一定数目的肌管，表明干扰MyoG基因后，细胞依然能够分化成为肌管，但总体肌管融合率降低，形态和数目较对照组有极显著差异。

Description

利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的 细胞克隆
技术领域
本发明涉及利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，属于基因工程技术领域。
背景技术
转基因技术已成为现代动物育种技术的重要手段，被公认是遗传学研究中继20世纪初的连锁分析、60年代的体细胞遗传和70年代基因克隆技术之后的第四代技术，被列为生物学发展史上的转折点。传统的动物品种改良只能在同种或亲缘关系很近的物种之间进行，且以自然突变作为选种的前提，这种自然突变的发生几率相当低。转基因技术则可以克服上述问题，创造新突变或打破物种间基因交流限制，加快动物改良进程。目前转基因技术已经成功地应用在提高动物个体的生长速度、改良家畜的生产品质和增强抗逆、抵御疾病的能力等方面。例如，1998年美国农业部研究人员成功获得了促生长转基因猪(胰岛素样生长因子)。显著改变了猪的产肉性能，猪肉脂肪含量减少10％，瘦肉含量增加6％～8％，显著提高了猪的经济性能。Wall等利用转基因的方法得到了牛乳腺特异表达溶葡球菌酶(Lysostaphin)的转基因牛，转基因牛乳房进行金黄色葡萄球菌培养物注射实验发现，与非转基因牛相比较，转基因牛乳房抗菌能力提高5倍，为畜牧业中疾病的防治提供一个新的可行的路线。2003年， Brophy等培育的转基因牛牛奶中β-酪蛋白的含量提高了20％，κ-酪蛋白的含量也增加了2倍，很大程度上提高了牛乳乳蛋白含量，增加了牛乳的营养价值。目前，我国科学家已经利用转基因技术在动物育种中获得了一些成就，如2010年，内蒙古大学李光鹏教授课题组获得了转线虫Fat-1转基因牛，多不饱和脂肪酸比值得到明显提高。食用这种牛肉对于改善人体不饱和脂肪酸组成，预防心脑血管疾病等具有重要作用。2011年，中国农业大学李宁课题组利用锌指酶技术首次获得了MSTN双等位基因敲除牛，该牛臀部肌肉明显比对照普通牛增加。但是在目前的转基因动物育种的研究中通常都是针对单一的基因进行操作，效果有限，且常用的转基因方法操作繁琐，难度大，成功率低，研究成本高。2013年，CRISPR/Cas9技术被应用于转基因操作(Cong L，2013；Mali，2013；Hwang，2013；Chang N，2013；Shen B，2013)，它基于细菌的获得性免疫系统改造而成(Westra，2010；Garneau，2010)，其操作简单、成本低、作用高效，适用于大多分子生物学实验室，尤其是不需要抗性基因作为筛选标记，这对动物育种具有重要的意义。它作为新兴的基因组定点编辑技术逐渐成熟并已在多个物种中得到应用，其中包括：大肠杆菌、肺炎双球菌、酿酒酵母、小鼠、果蝇、线虫、大鼠、小麦、水稻、拟南芥中，这为基因功能领域的研究提供广阔前景(Hwang，2013；Gilbert，2013)。肌细胞生成素(Myogenin，MyoG)是生肌调节因子家族成员之一，是肌细胞终末端分化的关键因子，其可以促进成肌细胞的增殖，使单核成肌细胞转变成为多核的肌纤维，在肌细胞的生成过程中起着中心调控作用，这一功能其它生肌调节因子无法代替(胡迎春等，2004；Charge SB等，2004；Schuster-Gossler K等，2007；Vasyutina E等，2007)。Nabeshima等(1993) 通过胚胎干细胞基因打靶使小鼠MyoG基因失活，产生突变纯合小鼠，MyoG基因缺失的小鼠虽有成肌细胞正常存在，但绝大部分细胞不分化形成肌纤维，由于骨骼肌的缺损，这些纯合突变小鼠在出生前后致死。MyoG基因在肌肉形成后也可以发挥着重要作用，Jennifer等 (2005)通过Cre-loxP技术在小鼠胚胎肌肉形成之后敲除MyoG发现，MRFs家族其他成员如MyoD和Myf5都有不同程度的下降，小鼠骨骼肌能够正常形成也能够出生并存活，但是出生后的体重比野生型小30％，相同位置的骨骼肌的尺寸与重量均小于野生型。这说明MyoG 不仅控制胚胎期的肌肉形成，而且对于出生后的肌肉生长也是极为重要的。在牛和猪中，科学家进行了大量的MyoG基因多态性分析。研究表明MyoG基因的突变位点与猪、牛的初生重有关，MyoG不同的基因型可影响肌纤维的数目，同时影响肉的质量。王珊等(2006)克隆了牛MyoG基因的启动子序列后，采用PCR-RFLP技术研究了该基因启动子序列多态性与牛生长发育性状之间的相关性。结果表明：牛MyoG基因启动子表现出多态性，含有AA、 AB基因型。其中AA基因型个体在体高、体重等生长性状指标上显著高于AB型个体，AA 基因型为优势基因型。林万华等(2000)也利用PCR-RFLP的方法证实了MyoG基因对猪的胴体性状有显著影响。MyoG由于其基因的多态性能够影响产肉动物的肉质，也使其成为产肉动物生产育种的候选基因。以上这些研究都表明MyoG基因是与肌纤维数目有关的基因，其不同的基因型可影响肌纤维的数目，同时影响了肉的质量。大量的研究表明，脊椎动物的肌肉组织在出生以后肌纤维的数目是不再改变，肌肉的生长主要依赖于肌纤维纤维长度增加和周径增大(Buonanno A等，1996；张海平等，2008；孙文杰等2009)。因此，通过对MyoG 基因人为的修饰或改造，增加其表达时间和表达量可能有助于增加肌纤维的数量，从而提高产肉量。肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)是抑制肌肉分化和生长的基因，MSTN通过阻止细胞周期进程实现抑制成肌细胞增殖的功能。大量研究表明，在体外培养的成肌细胞中，MSTN具有阻止细胞周期由G1期向S期的转变的功能，进而抑制成肌细胞的增殖(Thomas，2000；Taylor，2001；Joulia，2003)。McPherron等人通过基因敲除技术使小鼠体内MSTN基因不能发挥作用，结果发现突变小鼠的体型明显大于野生型老鼠，每块骨骼肌质量都是野生型3到4倍，而且MSTN基因失活小鼠骨骼肌纤维的数量比正常野生小鼠高出86％，由这些现象可以推测这些肌肉质量的增加可能是由于MSTN基因失活导致肌细胞增生和肥大造成的。Lin等(2002)成功研制转基因的小鼠，这些小鼠所表达的MSTN发生突变，肌肉重量增加20-35％，研究中还发现肌肉的增加不是由于肌纤维增生而引起的，而是由肌纤维肥大导致的。因此如何根据MyoG基因和MSTN基因在肌肉分化和发育中的重要作用，将目前最先进的基因打靶技术CRISPR/Cas9技术应用于转基因牛的研究中，对MyoG和MSTN两个基因进行操作，同时实现促肌肉分化的MyoG基因的高表达并敲除抑制肌纤维增殖的MSTN基因，研究其对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖及下游基因表达的影响成为目前养牛生产过程中急需解决的一大难题，所以利用CRISPR/Cas9技术同时对MSTN和MyoG两个基因进行修饰改造，并对改造的牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖情况进行检测，并研究其作用的分子机制。肌纤维的数量将得到增加，肌纤维将发育得更为粗大，从而提高产肉率，进一步通过体细胞核移植技术就可能获得适合本地环境的高产肉牛，研究其对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖及下游基因表达的影响，发明利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆是必要的。
发明内容
为了克服如何根据MyoG基因和MSTN基因在肌肉分化和发育中的重要作用，将目前最先进的基因打靶技术CRISPR/Cas9技术应用于转基因牛的研究中，对MyoG和MSTN两个基因进行操作，同时实现促肌肉分化的MyoG基因的高表达并敲除抑制肌纤维增殖的MSTN基因，研究其对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖及下游基因表达的影响的难题，本发明提供了利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，该种利用Crispr/Cas9 技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆利用CRISPR/Cas9技术同时对MSTN和 MyoG两个基因进行修饰改造，并对改造的牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖情况进行检测，并研究其作用的分子机制。肌纤维的数量将得到增加，肌纤维将发育得更为粗大，从而提高产肉率，进一步通过体细胞核移植技术就可能获得适合本地环境的高产肉牛，研究其对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖及下游基因表达的影响，从而达到将基因打靶技术CRISPR/Cas9技术应用于转基因牛的研究中，实现促肌肉分化的MyoG基因的高表达并敲除抑制肌纤维增殖的 MSTN基因的目的。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆的实验方案：1)MSTN打靶载体的构建：(1)靶位点引物的设计及退火：根据预测靶位点网站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)对MSTN基因成熟蛋白编码区进行靶位点预测，根据预测结果分别针对MSTN的第二外显子和第三外显子分别设计相应引物(具体引物见表1)。将相应引物稀释到终浓度为50nM，94℃反应3min，37℃保温1h，进行退火。 (2)psPgRNA、pX330质粒的单酶切及载体片段的回收：利用质粒提取试剂盒提取psPgRNA、pX330，紫外分光光度计测浓度后各吸取1ng，用限制性内切酶BbsI进行单酶切，1.0％琼脂糖电泳观察酶切结果，利用胶回收试剂盒回收载体。(3)载体的连接、转化与测序鉴定：退火产物和psPgRNA、pX330质粒单酶切回收产物在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌中，并送交上海生工测序。2)牛胎儿成纤维细胞的转染及突变效率的检测：(1)用去内毒素的大量质粒提取试剂盒提取MSTN打靶载体的质粒：按照试剂盒说明进行操作。(2)牛胎儿成纤维细胞的冻存与复苏：待细胞生长状态良好、且细胞铺满细胞瓶底时，吸干培养液，用PBS清洗2遍细胞后，用1mL的胰蛋白酶消化细胞，消化完全后加入5mL相应培养液终止细胞消化，将消化下来的细胞连同培养液转移到一个干净的15mL 离心管中，1200rpm离心5min，用枪头吸去上清，再用1ml胎牛血清重悬细胞沉淀，并将其转移至冻存管中，然后逐滴加入0.9mL的4℃预冷的冻存液，在冻存管壁上表注明细胞名、代数、日期、冻存人名。按照4℃/1h、-20℃/1h、-80℃/过夜→液氮的顺序将细胞放入液氮罐中。取出存放要复苏细胞的冻存管，37℃水浴锅中，不断摇晃，快速让冻存管中的固体融化，待固体完全融化后，将管中液体转移至15mL离心管中，加入5mL 37℃预热好的培养液， 1200rpm离心5min，用枪头小心吸去上清，再用新鲜培养液重悬细胞，转移到干净的细胞瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养，24h后换液。(3)牛胎儿成纤维细胞的传代培养：当细胞的生长密度到达80％-90％左右时，弃掉培养液，用PBS冲洗三遍，加入1ml胰蛋白酶消化， 37℃放置1-2min。显微镜下80％细胞变圆时，加入5ml含有双抗的DMEM+15％FCS培养液终止消化，按1：2比例进行传代。(4)牛胎儿成纤维细胞的转染：将牛胎儿成纤维细胞传至 6孔板中，待细胞密度达到70％-80％时，进行转染。质粒转染试剂为PEI，方法如下：取24μg CRISPR/Cas9(gRNA和Cas9)的质粒溶于600μL Opti-MEM孵育液中，然后取48μLPEI加入600μLOpti-MEM孵育液中，室温孵育5min。将含PEI的Opti-MEM孵育液600μL加入到含质粒的Opti-MEM孵育液中，均匀混合后室温孵育15min。弃掉6孔板中的培养液，用无血清的DMEM洗两遍，每孔加入1.8mL的加入无双抗的DMEM+10％FCS培养液。然后均匀吸取混合物，每孔缓慢加入孵育后含有MSTN打靶载体的质粒和PEI的溶液200μL，轻轻摇匀6孔板。放入37℃5％CO2培养箱中培养。(5)引物的设计及PCR产物的扩增：利用Cell/Tissue DNA Kit(Bioteke Corporation)在转染后72h提取PEI转染的细胞基因组总DNA，根据GenBank 已公布的牛MSTN基因序列以及确定的靶点位置，利用Primer5.0设计引物。第二外显子A 位点引物，PCR产物大小为612bp：第三外显子B位点引物：PCR产物大小为780bp，以提取的细胞全基因组为模版，PCR扩增目的片段。PCR反应条件为：预变性94℃5min；变性 94℃30s、退火56℃45s、延伸72℃1min，循环40次；延伸72℃10min，4℃保存。(6)细胞突变效率的检测：采用T7EI(NEB)检测转染细胞的突变效率。将上述的PCR产物取10μL 进行退火反应，反应条件如下：95℃10min；95℃～85℃(-2.0℃/s)；85℃1min； 85℃-75℃(-0.3℃/s)；75℃1min；75℃～65℃(-0.3℃/s)；65℃1min；65℃-55℃(-0.3℃/s)；55℃ 1min；55℃～45℃(-0.3℃/s)；45℃1min；45℃～35℃(-0.3℃/s)；35℃1min；35℃-25℃(-0.3℃/s)； 25℃1min；4℃保存。取退火后的PCR产物加入缓冲液Buffer和5U T7EI，37℃酶切45min。用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否产生突变条带，利用灰度扫描软件BandScan5.0扫描条带灰度，根据突变率的计算公式indel(％)＝100×{1-[1-(a+b)/(a+b+c)]0.5}进行突变率的计算(Indel 为插入缺失比率，a为未被切割条带的灰度值，b和c表示切割产生的新条带的灰度)，最终选出突变率较高的打靶位点及打靶载体。3)MyoG基因敲入载体的构建：(1)设计扩增同源臂片段的引物：为将MyoG基因定点敲入到MSTN基因的靶点位置，利用PCR技术分别克隆打靶位点两端的DNA序列作为定点靶入的同源臂，扩增左同源臂的扩增片段长度为702bp，扩增右同源臂的扩增片段长度为613bp。(2)左侧同源臂的连接：在设计的引物序列中，左同源臂的序列分别添加了KpnI和BamHI的酶切位点，因此利用左同源臂的引物，以牛成纤维细胞提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物用KpnI和BamHI双酶切，电泳后利用胶回收试剂盒回收左同源臂片段，利用相同的酶双酶切牛MyoG基因肌肉特异性表达载体pCDNA3.1-MyoG，电泳后利用胶回收试剂盒回收载体片段，T4DNA连接酶4℃过夜连接后转化大肠杆菌DH5α，待菌落长出后，KpnI和BamHI双酶切鉴定，阳性载体命名为 pCDNA3.1-L-MyoG。(3)右侧同源臂的连接：在设计的引物序列中，右同源臂的序列分别添加了NotI和XbaI的酶切位点。因此利用右同源臂的引物，以牛成纤维细胞提取的基因组DNA 为模板，进行PCR扩增，PCR产物用NotI和XbaI双酶切，电泳后利用胶回收试剂盒回收右同源臂片段，利用相同的酶双酶切pCDNA3.1-L-MyoG，电泳后利用胶回收试剂盒回收载体片段，T4DNA连接酶4℃过夜连接后转化大肠杆菌DH5α，待菌落长出后，NotI和XbaI 双酶切鉴定，获得MyoG基因的敲入载体pCDNA3.1-L-MyoG-R。4)敲除MSTN基因并敲入 MyoG对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖的影响：(1)牛骨骼肌卫星细胞的培养：待骨骼肌卫星细胞汇合度达到90％以后，弃掉培养液，PBS洗三次，用0.25％胰蛋白酶进行消化，以1： 2的比例进行传代，每天在倒置显微镜下进行观察。(2)牛骨骼肌卫星细胞的转染：用不含双抗的生长培养将牛骨骼肌卫星细胞接种至6孔细胞培养板中，至细胞铺满孔底的70％～80％左右时进行转染，质粒转染试剂为PEI，将敲入载体和敲除载体同时转入牛骨骼肌卫星细胞中，具体方法与牛胎儿成纤维细胞的转染方法相同。(3)敲除MSTN并转入MyoG基因， MyoG及MSTN mRNA及蛋白表达情况：分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48和72小时，提取转染细胞的总RNA，Real-time PCR检测MyoG及MSTN mRNA的表达情况(引物序列及扩增长度见表2)，根据CT(△△CT)值方法，计算出基因相对表达量，绘制柱形图。分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48和72小时，提取转染细胞的总蛋白，Western blot法检测 MyoG及MSTN蛋白的表达情况，灰度扫描后，进行分析，确定敲除敲入载体的效果。(4) 敲除MSTN并转入MyoG基因，对细胞增殖的影响：分别在敲除MSTN并转入MyoG基因 48和72小时，每孔加10ul CCK-8溶液，培养箱内孵育2h。孵育结束后，选择450nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值。每组5个重复，做柱形图分析其增殖情况。(5)敲除MSTN 并转入MyoG基因，对增殖相关基因表达的影响：分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48 和72小时，提取转染细胞的总RNA，Real-Time法检测增殖相关基因CDK2和P21mRNA 的表达(引物序列及扩增长度见表2)，根据CT(△△CT)值方法，计算出基因相对表达量，绘制柱形图。分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48和72小时，提取转染细胞的总蛋白，Western blot法检测增殖相关的CDK2和P21蛋白表达变化，灰度扫描后，进行分析。(6)敲除MSTN 并转入MyoG基因，细胞分化形成的肌管形态的观察：敲除MSTN并转入MyoG基因后，分别在2％血清诱导分化后的48，72小时，于倒置显微镜下观察细胞分化形成的肌管形态，随机选取5个视野，对分化形成的短肌管、长肌管及肌管总数进行计数并统计分析。(7)敲除 MSTN并转入MyoG基因，对分化基因表达的影响：敲除MSTN并转入MyoG基因后，分别在2％血清诱导分化后的48，72小时，提取转染细胞的总RNA，Real-time PCR检测细胞于分化期间肌肉特异性分子MCK、MHC及Desmin mRNA的表达(引物序列及扩增长度见表 2)。根据CT(△△CT)值方法，计算出基因相对表达量，绘制柱形图。敲除MSTN并转入MyoG 基因后，分别在2％血清诱导分化后的48，72小时，提取转染细胞的总蛋白，Western Blot 法检测细胞于分化期间肌肉特异性分子MCK、MHC及Desmin蛋白的表达情况。5)有限稀释法制备单克隆细胞及突变细胞株的筛选：(1)电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞：选择突变效率最高靶位点的质粒进行去内毒素质粒的提取，对牛胎儿成纤维细胞进行电穿孔转染。将培养瓶中生长至90％的细胞用0.25％的胰酶消化下来，待大多数细胞变圆时加入含有血清的培养液，反复吹打使细胞悬浮；将细胞移至15mL的离心管中，1000rpm离心10min；弃上清，加入无血清无双抗的培养液2mL吹匀；吸取10μL左右加入有盖玻片的细胞计数板上计数；剩余细胞吹匀，1000rpm离心10min；根据计数得出的浓度，加入适量无血清无双抗的 DMEM+NaHCO3培养液，调整细胞浓度为每mL培养液中含有2×106个细胞；取出800μL加入到电转杯中，加入30ug CRISPR/Cas9(gRNA和Cas9)，冰浴10min；擦干净电转杯外壁上面的水，防止产生电火花使电转杯爆杯，放入电转仪中，调节电转仪的电压为250V、时间为20ms、电击2次；取出电转杯，冰上冰浴10min。(2)有限稀释法稀释细胞：采用上述电转方法转染牛胎儿成纤维细胞，取电转染后的细胞加入1/9倍体积的台盼兰混匀后用细胞计数板计活细胞数目，按照每10mL培养液中含有400～500个细胞进行稀释，分装到15个100mm细胞培养皿，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养，48h以后换成新鲜的15％ FCS的DMEM培养液和回收培养细胞24h后的15％FCS的DMEM培养液(滤过)，每3天换一次培养液，随时观察细胞的大小及生长状态。(3)突变细胞株的鉴定：观察细胞培养皿中细胞克隆，当直径生长至2mm以上时，用记号笔将单克隆细胞系圈上做标记，取出细胞培养皿鉴定筛选阳性细胞克隆。用灭菌的牙签刮取1/2的细胞克隆提取基因组进行PCR扩增，送北京金唯智生物科技有限公司测序鉴定。细胞克隆基因组提取步骤如下：取出细胞培养皿，弃掉培养液，加入PBS轻轻冲洗2遍；用灭菌的牙签刮取1/2的细胞，加入到含有1mL PBS的1.5mL 的离心管中；1000rpm离心3min，弃上清；加入50μL的无菌水，用枪头吹打均匀；沸水浴煮10min，冰上5min；涡旋振荡5s，1000rpm离心3min；取上清液用于PCR扩增。(4)MSTN 突变细胞株的冻存：鉴定正确的细胞克隆，消化、收集突变细胞将其冻存用于后续研究。过程如下：弃掉细胞培养皿中的细胞培养液；加入PBS轻轻冲洗一遍；用灭菌的克隆环沾上灭菌的固体状态的凡士林放入阳性单克隆细胞上将其围住；加入100μL的0.25％胰蛋白酶消化细胞克隆；消化完全后(约30s)加入200μL血清终止消化；将其转移到冻存管中；然后逐滴加入200μL的4℃预冷的冻存液。
本发明的有益效果为，利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆利用CRISPR/Cas9技术同时对MSTN和MyoG两个基因进行修饰改造，并对改造的牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖情况进行检测，并研究其作用的分子机制。肌纤维的数量将得到增加，肌纤维将发育得更为粗大，从而提高产肉率，进一步通过体细胞核移植技术就可能获得适合本地环境的高产肉牛，研究其对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖及下游基因表达的影响，从而达到将基因打靶技术CRISPR/Cas9技术应用于转基因牛的研究中，实现促肌肉分化的 MyoG基因的高表达并敲除抑制肌纤维增殖的MSTN基因的目的。本发明为高产转基因肉牛的研究和生产奠定了基础，具有重要的实践应用价值。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1是体外培养的牛骨胳肌卫星细胞(A.40×,B.100×)。
图2是牛骨胳肌卫星细胞诱导分化3天后肌管的形成(A.40×,B.100×)。
图3是牛骨胳肌卫星细胞及肌管中标志性分子的免疫荧光染色结果
图中A.Sca-1(40×)；B.CD34(40×)；C.Desmin(40×)；D.α-actin(10×)； E.MHC(10×)；F.MyoG(10×)。
图4是psPgRNA、pX330质粒的单酶切结果图。
图5是第二外显子A靶点测序Blast结果图。
图6是第三外显子B靶点测序Blast结果。
图7是相差显微镜下观测分化72h后的细胞(200×)
图中左图为转染pGenesil1.1-MyoG质粒的细胞；右图为转染阴性对照质粒的细胞。
图8是肌管融合率的统计分析图。
图9是干扰MyoG表达后，细胞于分化期间MCK基因mRNA表达量变化图。
具体实施方式
实施例一：
1、实验方案
1)MSTN打靶载体的构建
(1)靶位点引物的设计及退火：根据预测靶位点网站(http:// zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare 9Nuclease.aspx)对MSTN基因成熟蛋白编码区进行靶位点预测，根据预测结果分别针对MSTN 的第二外显子和第三外显子分别设计相应引物(具体引物见表1)。将相应引物稀释到终浓度为50nM，94℃反应3min，37℃保温1h，进行退火。
表1根据预测靶点设计的相应SgRNA引物
(2)psPgRNA、pX330质粒的单酶切及载体片段的回收：利用质粒提取试剂盒提取psPgRNA、 pX330，紫外分光光度计测浓度后各吸取1ng，用限制性内切酶BbsI进行单酶切，1.0％琼脂糖电泳观察酶切结果，利用胶回收试剂盒回收载体。
(3)载体的连接、转化与测序鉴定：退火产物和psPgRNA、pX330质粒单酶切回收产物在 T4DNA连接酶的作用下16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌中，并送交上海生工测序。
2)牛胎儿成纤维细胞的转染及突变效率的检测
(1)用去内毒素的大量质粒提取试剂盒提取MSTN打靶载体的质粒：按照试剂盒说明进行操作。
(2)牛胎儿成纤维细胞的冻存与复苏：待细胞生长状态良好、且细胞铺满细胞瓶底时，吸干培养液，用PBS清洗2遍细胞后，用1mL的胰蛋白酶消化细胞，消化完全后加入5mL相应培养液终止细胞消化，将消化下来的细胞连同培养液转移到一个干净的15mL离心管中，1200rpm离心5min，用枪头吸去上清，再用1ml胎牛血清重悬细胞沉淀，并将其转移至冻存管中，然后逐滴加入0.9mL的4℃预冷的冻存液，在冻存管壁上表注明细胞名、代数、日期、冻存人名。按照4℃/1h、-20℃/1h、-80℃/过夜→液氮的顺序将细胞放入液氮罐中。取出存放要复苏细胞的冻存管，37℃水浴锅中，不断摇晃，快速让冻存管中的固体融化，待固体完全融化后，将管中液体转移至15mL离心管中，加入5mL 37℃预热好的培养液，1200rpm离心5min，用枪头小心吸去上清，再用新鲜培养液重悬细胞，转移到干净的细胞瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养，24h后换液。
(3)牛胎儿成纤维细胞的传代培养：当细胞的生长密度到达80％-90％左右时，弃掉培养液，用PBS冲洗三遍，加入1ml胰蛋白酶消化，37℃放置1-2min。显微镜下80％细胞变圆时，加入5ml含有双抗的DMEM+15％FCS培养液终止消化，按1：2比例进行传代。
(4)牛胎儿成纤维细胞的转染：将牛胎儿成纤维细胞传至6孔板中，待细胞密度达到70％-80％时，进行转染。质粒转染试剂为PEI，方法如下：取24μg CRISPR/Cas9(gRNA和Cas9)的质粒溶于600μL Opti-MEM孵育液中，然后取48μLPEI加入600μLOpti-MEM孵育液中，室温孵育5min。将含PEI的Opti-MEM孵育液600μL加入到含质粒的Opti-MEM孵育液中，均匀混合后室温孵育15min。弃掉6孔板中的培养液，用无血清的DMEM洗两遍，每孔加入1.8mL 的加入无双抗的DMEM+10％FCS培养液。然后均匀吸取混合物，每孔缓慢加入孵育后含有 MSTN打靶载体的质粒和PEI的溶液200μL，轻轻摇匀6孔板。放入37℃5％CO2培养箱中培养。
(5)引物的设计及PCR产物的扩增：利用Cell/Tissue DNA Kit(BiotekeCorporation)在转染后72h提取PEI转染的细胞基因组总DNA，根据GenBank已公布的牛MSTN基因序列以及确定的靶点位置，利用Primer5.0设计引物。
第二外显子A位点引物：
Sense(5’-TGGAAAGGAAGTAGGCTGCTCAT-3’)
Antisense(5’-TTCTCCTGGTTCTGGGAAGGTTA-3’)PCR产物大小为612bp
第三外显子B位点引物：
Sense(5’-CTCCCTTTACTGTCATCC-3’)
Antisense(5’-GCTGTAACCTTCCCAGAACCAGGAGAA-3’)PCR产物大小为780bp，以提取的细胞全基因组为模版，PCR扩增目的片段。PCR反应条件为：预变性94℃5min；变性 94℃30s、退火56℃45s、延伸72℃1min，循环40次；延伸72℃10min，4℃保存。
(6)细胞突变效率的检测：采用T7EI(NEB)检测转染细胞的突变效率。将上述的PCR产物取10μL进行退火反应，反应条件如下：95℃10min；95℃～85℃(-2.0℃/s)；85℃1min；85℃-75℃(-0.3℃/s)；75℃1min；75℃～65℃(-0.3℃/s)；65℃1min；65℃-55℃(-0.3℃/s)；55℃ 1min；55℃～45℃(-0.3℃/s)；45℃1min；45℃～35℃(-0.3℃/s)；35℃1min；35℃-25℃(-0.3℃/s)； 25℃1min；4℃保存。取退火后的PCR产物加入缓冲液Buffer和5UT7EI，37℃酶切45min。用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否产生突变条带，利用灰度扫描软件BandScan5.0扫描条带灰度，根据突变率的计算公式indel(％)＝100×{1-[1-(a+b)/(a+b+c)]0.5}进行突变率的计算(Indel 为插入缺失比率，a为未被切割条带的灰度值，b和c表示切割产生的新条带的灰度)，最终选出突变率较高的打靶位点及打靶载体。
3)MyoG基因敲入载体的构建
(1)设计扩增同源臂片段的引物：为将MyoG基因定点敲入到MSTN基因的靶点位置，利用PCR技术分别克隆打靶位点两端的DNA序列作为定点靶入的同源臂，扩增左同源臂的引物序列为：
sense:5’-CAGCGGCCGCGATTCACTGGTGTGGCAAGTT-3’
antisense：5’-ACACTCGAGGCTTATGTCTCCCTGCTTATTG-3’，扩增片段长度为702bp，扩增右同源臂的引物序列为：
sense：5’-CCGGAATTCAATATATAAGGCCAATTACTGC-3’
antisense：5’-CCATCGATAGCCATCATGAAGCCATAAGTG-3’，扩增片段长度为613bp。
(2)左侧同源臂的连接：在设计的引物序列中，左同源臂的序列分别添加了KpnI和BamHI 的酶切位点，因此利用左同源臂的引物，以牛成纤维细胞提取的基因组DNA为模板，进行 PCR扩增，PCR产物用KpnI和BamHI双酶切，电泳后利用胶回收试剂盒回收左同源臂片段，利用相同的酶双酶切牛MyoG基因肌肉特异性表达载体pCDNA3.1-MyoG，电泳后利用胶回收试剂盒回收载体片段，T4DNA连接酶4℃过夜连接后转化大肠杆菌DH5α，待菌落长出后，KpnI和BamHI双酶切鉴定，阳性载体命名为pCDNA3.1-L-MyoG。
(3)右侧同源臂的连接：在设计的引物序列中，右同源臂的序列分别添加了NotI和XbaI的酶切位点。因此利用右同源臂的引物，以牛成纤维细胞提取的基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，PCR产物用NotI和XbaI双酶切，电泳后利用胶回收试剂盒回收右同源臂片段，利用相同的酶双酶切pCDNA3.1-L-MyoG，电泳后利用胶回收试剂盒回收载体片段，T4DNA连接酶4℃过夜连接后转化大肠杆菌DH5α，待菌落长出后，NotI和XbaI双酶切鉴定，获得MyoG基因的敲入载体pCDNA3.1-L-MyoG-R。
4)敲除MSTN基因并敲入MyoG对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖的影响
(1)牛骨骼肌卫星细胞的培养：待骨骼肌卫星细胞汇合度达到90％以后，弃掉培养液，PBS 洗三次，用0.25％胰蛋白酶进行消化，以1：2的比例进行传代，每天在倒置显微镜下进行观察。
(2)牛骨骼肌卫星细胞的转染：用不含双抗的生长培养将牛骨骼肌卫星细胞接种至6孔细胞培养板中，至细胞铺满孔底的70％～80％左右时进行转染，质粒转染试剂为PEI，将敲入载体和敲除载体同时转入牛骨骼肌卫星细胞中，具体方法与牛胎儿成纤维细胞的转染方法相同。
(3)敲除MSTN并转入MyoG基因，MyoG及MSTN mRNA及蛋白表达情况：分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48和72小时，提取转染细胞的总RNA，Real-time PCR检测MyoG 及MSTNmRNA的表达情况(引物序列及扩增长度见表2)，根据CT(△△CT)值方法，计算出基因相对表达量，绘制柱形图。分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48和72小时，提取转染细胞的总蛋白，Western blot法检测MyoG及MSTN蛋白的表达情况，灰度扫描后，进行分析，确定敲除敲入载体的效果。
(4)敲除MSTN并转入MyoG基因，对细胞增殖的影响：分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48和72小时，每孔加10ul CCK-8溶液，培养箱内孵育2h。孵育结束后，选择450nm 波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值。每组5个重复，做柱形图分析其增殖情况。
(5)敲除MSTN并转入MyoG基因，对增殖相关基因表达的影响：分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48和72小时，提取转染细胞的总RNA，Real-Time法检测增殖相关基因CDK2 和P21mRNA的表达(引物序列及扩增长度见表2)，根据CT(△△CT)值方法，计算出基因相对表达量，绘制柱形图。分别在敲除MSTN并转入MyoG基因48和72小时，提取转染细胞的总蛋白，Western blot法检测增殖相关的CDK2和P21蛋白表达变化，灰度扫描后，进行分析。
(6)敲除MSTN并转入MyoG基因，细胞分化形成的肌管形态的观察：敲除MSTN并转入MyoG基因后，分别在2％血清诱导分化后的48，72小时，于倒置显微镜下观察细胞分化形成的肌管形态，随机选取5个视野，对分化形成的短肌管、长肌管及肌管总数进行计数并统计分析。
(7)敲除MSTN并转入MyoG基因，对分化基因表达的影响：敲除MSTN并转入MyoG基因后，分别在2％血清诱导分化后的48，72小时，提取转染细胞的总RNA，Real-time PCR 检测细胞于分化期间肌肉特异性分子MCK、MHC及Desmin mRNA的表达(引物序列及扩增长度见表2)。根据CT(△△CT)值方法，计算出基因相对表达量，绘制柱形图。敲除MSTN 并转入MyoG基因后，分别在2％血清诱导分化后的48，72小时，提取转染细胞的总蛋白， Western Blot法检测细胞于分化期间肌肉特异性分子MCK、MHC及Desmin蛋白的表达情况。
表2 Real-Time PCR引物序列及扩增片段长度
5)有限稀释法制备单克隆细胞及突变细胞株的筛选
(1)电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞：选择突变效率最高靶位点的质粒进行去内毒素质粒的提取，对牛胎儿成纤维细胞进行电穿孔转染。将培养瓶中生长至90％的细胞用0.25％的胰酶消化下来，待大多数细胞变圆时加入含有血清的培养液，反复吹打使细胞悬浮；将细胞移至15mL 的离心管中，1000rpm离心10min；弃上清，加入无血清无双抗的培养液2mL吹匀；吸取10μL 左右加入有盖玻片的细胞计数板上计数；剩余细胞吹匀，1000rpm离心10min；根据计数得出的浓度，加入适量无血清无双抗的DMEM+NaHCO3培养液，调整细胞浓度为每mL培养液中含有2×106个细胞；取出800μL加入到电转杯中，加入30ug CRISPR/Cas9(gRNA和Cas9)，冰浴10min；擦干净电转杯外壁上面的水，防止产生电火花使电转杯爆杯，放入电转仪中，调节电转仪的电压为250V、时间为20ms、电击2次；取出电转杯，冰上冰浴10min。(2)有限稀释法稀释细胞：采用上述电转方法转染牛胎儿成纤维细胞，取电转染后的细胞加入1/9 倍体积的台盼兰混匀后用细胞计数板计活细胞数目，按照每10mL培养液中含有400～500个细胞进行稀释，分装到15个100mm细胞培养皿，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养，48h以后换成新鲜的15％FCS的DMEM培养液和回收培养细胞24h后的15％ FCS的DMEM培养液(滤过)，每3天换一次培养液，随时观察细胞的大小及生长状态。
(3)突变细胞株的鉴定：观察细胞培养皿中细胞克隆，当直径生长至2mm以上时，用记号笔将单克隆细胞系圈上做标记，取出细胞培养皿鉴定筛选阳性细胞克隆。用灭菌的牙签刮取1/2 的细胞克隆提取基因组进行PCR扩增，送北京金唯智生物科技有限公司测序鉴定。细胞克隆基因组提取步骤如下：取出细胞培养皿，弃掉培养液，加入PBS轻轻冲洗2遍；用灭菌的牙签刮取1/2的细胞，加入到含有1mL PBS的1.5mL的离心管中；1000rpm离心3min，弃上清；加入50μL的无菌水，用枪头吹打均匀；沸水浴煮10min，冰上5min；涡旋振荡5s，1000rpm 离心3min；取上清液用于PCR扩增。
(4)MSTN突变细胞株的冻存：鉴定正确的细胞克隆，消化、收集突变细胞将其冻存用于后续研究。过程如下：弃掉细胞培养皿中的细胞培养液；加入PBS轻轻冲洗一遍；用灭菌的克隆环沾上灭菌的固体状态的凡士林放入阳性单克隆细胞上将其围住；加入100μL的0.25％胰蛋白酶消化细胞克隆；消化完全后(约30s)加入200μL血清终止消化；将其转移到冻存管中；然后逐滴加入200μL的4℃预冷的冻存液。
2.实验结果：
2.1分离纯化了牛骨骼肌卫星细胞(见图1)，且经过2％马血清诱导分化后可以形成肌纤维(见图2)。
2.2利用免疫荧光技术对牛骨骼肌卫星细胞进行鉴定，结果显示，CD34、Sca-1、Desmin在牛骨胳肌卫星细胞中均呈阳性(如图3A、B、C所示)，随机计数100个细胞，3种抗体的阳性细胞高达98％以上。α-actin、MHC及MyoG在诱导分化后的肌管中呈阳性表达(如图3D、 E、F所示)，表明该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力。其中图中绿色荧光为阳性信号，蓝色荧光为DAPI染色的细胞核。
2.3MSTN基因敲除载体：BbsI单酶切psPgRNA、pX330，酶切电泳的鉴定结果均与预期大小相符，结果见图4。分别按照预定的设计，合成针对第二外显子和第三外显子的两个靶点的sgRNA的引物，退火后与单酶切的psPgRNA、pX330质粒连接，共获得4个MSTN的敲除载体 psPgRNA-M-A、pX330-M-A、psPgRNA-M-B和pX330-M-B。第二外显子A靶点测序Blast结果如图5所示；第三外显子B靶点测序Blast结果如图6所示，可确认靶位点已成功连接，未发生碱基突变。下一步需将这四种MSTN敲除载体转染牛胎儿成纤维细胞，根据打靶效率筛选出最适合的载体和靶点。
2.4研究中利用了RNA干扰技术研究了MyoG基因对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：在相差显微镜下观察细胞分化72h后所形成的肌管形态(图7)。实验对细胞分化72h后所形成的肌管数目(表3)及肌管融合率(图8)进行了统计分析。结果表明，实验组细胞经分化能够形成一定数目的肌管，与阴性对照组细胞相比，长肌管所占的比例及短小的肌管所占的比例均有显著差异(P<0.05)，表明干扰MyoG基因后，细胞依然能够分化成为肌管，但总体肌管融合率降低，形态和数目较对照组有极显著差异。
表3肌管数目的统计
2.5利用实时荧光定量PCR检测肌肉分化标志性基因MCK的表达变化：结果显示，无论是MyoG 基因干扰组还是对照组，进入分化期间的细胞，MCK基因mRNA的表达量显著增加，且随着分化时间的增长，基因表达量呈极显著的上升趋势；但MyoG基因干扰组与对照组相比，MCK基因的表达显著降低(见图9)。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 1
gatcttctaa cgcaagtgga 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 2
caccgatctt ctaacgcaag tgga 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 3
aaactccact tgcgttagaa gatc 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 4
gtgcaccaag caaaccccag 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 5
caccgtgcac caagcaaacc ccag 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 6
aaacctgggg tttgcttggt gcac 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 7
tggaaaggaa gtaggctgct cat 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 8
ttctcctggt tctgggaagg tta 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 9
ctccctttac tgtcatcc 18
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 10
gctgtaacct tcccagaacc aggagaa 27
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 11
cagcggccgc gattcactgg tgtggcaagt t 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 12
acactcgagg cttatgtctc cctgcttatt g 31
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 13
ccggaattca atatataagg ccaattactg c 31
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 14
ccatcgatag ccatcatgaa gccataagtg 30
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 15
cctgcgggca ttcaacgaaa ctac 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 16
tcttgatctt cattgtgctg ggtg 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 17
gactcaagaa ggtgaatgaa gcc 23
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 18
tattatagtg cgctgcccca c 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 19
gaagaagtaa gaacaaggg 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 20
tcaccgtctt cttggtatgg a 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 21
gcagaccagc atgacagat 19
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 22
gcagcaagca gggtatgt 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 23
gacaagagcg ggagatacac 20
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 24
ttgataagca ggttctgagg tt 22
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 25
gctagaggac cgcttttgct 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 26
tcaccgtctt cttggtatgg a 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 27
aggaataccc agacctcagc aa 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 28
gactcctcat caccagccac a 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 细胞克隆(cell clone)
<400> 29
gcccacttct ccctcattca c 21

Claims (1)

1.利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，其特征在于：所述的细胞克隆被分离纯化且经过2％马血清诱导分化后可以形成肌纤维；利用免疫荧光技术对牛骨骼肌卫星细胞进行鉴定，结果显示，CD34、Sca-1、Desmin在牛骨胳肌卫星细胞中均呈阳性，随机计数100个细胞，3种抗体的阳性细胞高达98％以上；α-actin、MHC及MyoG在诱导分化后的肌管中呈阳性表达，表明该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力；MSTN基因敲除载体：BbsI单酶切psPgRNA、pX330，酶切电泳的鉴定结果均与预期大小相符；分别按照预定的设计，合成针对第二外显子和第三外显子的两个靶点的sgRNA的引物，退火后与单酶切的psPgRNA、pX330质粒连接，共获得4个MSTN的敲除载体psPgRNA-M-A、pX330-M-A、psPgRNA-M-B和pX330-M-B，可确认靶位点已成功连接，未发生碱基突变；利用RNA干扰技术研究MyoG基因对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：在相差显微镜下观察细胞分化72h后所形成的肌管形态，实验对细胞分化72h后所形成的肌管数目及肌管融合率进行了统计分析，结果表明，实验组细胞经分化能够形成一定数目的肌管，与阴性对照组细胞相比，长肌管所占的比例及短小的肌管所占的比例均有显著差异，表明干扰MyoG基因后，细胞依然能够分化成为肌管，但总体肌管融合率降低，形态和数目较对照组有极显著差异；利用实时荧光定量PCR检测肌肉分化标志性基因MCK的表达变化：结果显示，无论是MyoG基因干扰组还是对照组，进入分化期间的细胞，MCK基因mRNA的表达量显著增加，且随着分化时间的增长，基因表达量呈极显著的上升趋势；但MyoG基因干扰组与对照组相比，MCK基因的表达显著降低。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110777192A (zh) * 2019-10-27 2020-02-11 复旦大学 一种分离和富集以及从头组装mhc基因的方法
CN111808887A (zh) * 2020-09-10 2020-10-23 中国农业大学 一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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