CN108559749A

CN108559749A - 一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其应用

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Publication number: CN108559749A
Application number: CN201810028794.0A
Authority: CN
Inventors: 李光鹏; 魏著英; 白春玲; 高洋; 陈晨; 王东; 佟彬; 张立
Original assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2018-01-11
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2018-09-21

Abstract

本发明公开了一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因即MSTN突变基因。所述MSTN突变基因是在MSTN基因第一内含子上敲除几个碱基序列。该MSTN突变基因能够促进牛骨骼肌产生双肌现象。还公开了该MSTN突变基因的应用。

Description

一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的基因工程技术，具体涉及一种肌肉抑制素基因密码子及其应用，更具体涉及一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因(即MSTN突变基因)及其应用。

背景技术

MSTN是一种肌肉抑制素基因，属于TGF-β超家族，它的合成主要是由骨骼肌完成，属于多肽中的分泌型，作为TGF-β超家族的成员，它具有与这个家族共同的生物结构：包括位于N-末端的分泌信号肽、蛋白酶水解位点(proteolytic processing site，RSRR)和位于C-末端的成熟肽区，含有半胱氨酸(cystine knot)结构，这些组件组成一个52kDa的没有活性的前体蛋白，通过中间的蛋白水解位点的加工后才可形成一个26kDa的活性肽，从而发挥该有的生物功能。MSTN基因cDNA的组成：1个可读框(ORF)、3个外显子、2个内含子的核苷酸序列。

1997年Mcpherron等人在筛选小鼠的肌肉cDNA文库首次发现myostatin(MSTN)基因，同年Grobet等人对自然双肌的比利时兰牛进行了测序，结果发现比利时蓝牛MSTN的p.D273RfsX13发生了纯合突变，从而引起双肌性状。1999年，Carlson等人也发现若大量的MSTN存在于骨骼肌中会使得肌肉生长受到抑制，形成肌肉萎缩，同时Lee等人则发现该基因由特定的肌肉组织产生，调节肌肉组织的生长，该基因缺失后，会使一些动物出现双肌现状。此后，人们开展了一系列与MSTN相关的研究，发现MSTN突变小鼠除了出现双肌性状，还可以以肌肉再生增强以及纤维化程度降低的方式提高肌肉愈伤能力；糖的消耗和糖摄入加强，对胰岛素的敏感性加强；心脏增大且压力应激增强；脂肪含量减少，脂肪的发生也会受到抑制，且白色脂肪向棕色脂肪转变加强从而促进机体的生热作用；骨密度、骨矿物质含量也会有所增强，同时还可以可增加骨痂、骨折的尺寸和强度而加快骨折后的愈合。通过调控胎盘的建立和葡萄糖的摄入，以此来调控子宫平滑肌细胞和内膜上皮细胞的增殖及乳腺的发育，参与雌性哺乳动物的生殖调控。

CN102653764B公开了一种在牛MSTN基因中引入移码突变的方法，其构建了一个牛MSTN基因移码突变的打靶载体，通过同源重组将移码突变引入牛MSTN基因第3外显子；首先合成出包含移码突变的MSTN同源短臂，使其在第3外显子上缺失11bp，形成移码突变；然后合成MSTN的同源长臂，利用酶切位点插入载体pFPC-1，构建出牛MSTN基因移码突变的打靶载体pFPC-MSTN，得到的打靶载体线性化后转染牛体细胞，通过同源重组在牛MSTN基因中引入移码突变，利用这种细胞可以在生产中得到MSTN基因移码突变的转基因牛，从而提高其产肉性状，提高牛肉的品质与产量。

CN103088044B公开了一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体，其为PIII MSTN，包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基，在同源臂之间还具有标记基因；所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO：1的8824～10133；3’同源臂核苷酸序列如SEQID NO：1的15091～21957；所述标记基因包括报告基因EGFP和带有启动子PGK的新霉素抗性选择基因Neor；该打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

CN106119283A公开了一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法，该方法通过对多物种进行同源对比选取两对MSTN基因靶序列，利用gRNA的PAM设计原则，合成两对靶序列不同，表达的蛋白相同，带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链，将双链与pPDNA330质粒进行连接得到携带有多物种的MSTN同源基因的重组载体，重组载体利用荧光蛋白表达法对基因敲除效率进行检测，选择敲除效率更高的载体转染多物种受体细胞，进行基因敲除并验证。

CN102260711B公开了一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，该方法设计特异的锌指结合蛋白酶ZFNs，其作用的DNA序列为：ZFNs-Setl：GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT；包括如下步骤：1)构建MSTN-ZFN-Set1-pZFN1和MSTN-ZFN-Setl-pZFN2表达载体，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；2)将上述表达载体分别转入牛的成纤维细胞中，通过PCR产物测序检测肌肉抑制素基因发生敲除的细胞。

CN105671080A公开了CRISPER-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，该方法是根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRISPER-Cas9载体、上述构建的gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转入羊的成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。

US444745A公开了一种能在转移基因牛中产生重组多肽的转移基因，包括能在至少一种所述牛的细胞类型中通过操作与编码重组多肽的重组DNA连接的至少一种表达调控DNA顺序，其中所述转移基因能使所述重组DNA顺序在至少所述一种含有该转移基因的牛细胞类型中进行表达，产生所述重组多肽。

“牛肌肉生长抑制素(MSTN)基因的检测、分型研究”，孙少华等，中国农业科技导报，2001，3(6)：66-67，该研究根据皮埃蒙特牛肌肉生长抑制素(MSTN)基因序列设计了3条特异性引物，以纯种皮埃蒙特牛、皮荷杂种牛和荷斯坦牛的DNA为模板，对是否携带MSTN基因的个体牛进行单核苷酸多态性分析，提出了一套牛肌肉生长抑制素基因检测分析以及准确鉴定其基因型的方法。

以上研究说明，肌肉抑制素突变基因在动物体内是可以发挥肌肉含量增加的功效，而且没有表现出影响机体正常生理功能的征兆。然而，在动物体上自然突变的MSTN很少，因此如何对小鼠原有MSTN基因进行碱基敲除，使得其能够在哺乳动物中发挥作用是本领域亟待解决的技术问题，在进行gRNA优化过程中面临诸多挑战：首先是如何获得能够表达的基因序列，其次，还要构建打靶载体，考虑到打靶载体的打靶效率，外源基因mRNA的稳定性和mRNA二级结构对翻译效率的影响，优化的同时一定要避免阻碍表达的特殊的mRNA的二级结构的形成。上述挑战阻碍了对基因序列的优化。

目前需要一种能够更有效地使小牛的肌肉量明显增大、体重显著增加、生化检测未发现健康异常的基因、更高效且低成本地获得该基因的方法及其应用。

发明内容

为了同时克服上述缺陷，本发明人经过深入研究和大量试验，提供了一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其获得方法和应用。

为此，在本发明的一方面，提供了一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因，所述基因包含两个内含子和三个外显子序列，第一内含子上有部分碱基缺失。

在本发明的另一方面，还提供了一种含有所述肌肉抑制素基因的序列的切割载体。

在本发明的另一方面，提供了所述载体在制备转基因牛或MSTN生物体性状研究中的应用。

关于所述应用，优选地，所述载体用于制备转基因牛。

关于所述应用，优选地，所述的载体用于增加牛骨骼肌的肌肉量，产生双肌现象。

在本发明的另一方面，提供了根据上述应用获得的转基因牛。

在本发明的另一方面，还提供了一种获得所述能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法，该方法包括以下步骤：一、MSTN靶位点设计与合成；二、切割载体构建；三、获得基因敲除细胞。

就本发明而言，优选地，所述MSTN靶位点设计与合成步骤包括：

(1)登陆网站(优选为NCBI网站)，搜索网站上公布的牛MSTN基因序列并下载(优选地，本试验所用的基因ID：JQ711180.1)。

(2)打开靶点预测网站(http：//www.genome-engineering.org/crispr/)，打开网站中靶位点在线设计工具“CRISPR design tool”，在文本框中输入基因序列，选择物种提交后，可给出该序列所有的靶位点，并给出各位点的潜在脱靶位点和综合评分等。

(3)根据网站给出的靶位点序列，综合考虑各项参数后选取其中预测脱靶效应较低的2组靶位点(位点可以如图1所示)，其中，A：sgRNA1，B：sgRNA2，C：Donor sequence。在例如由图1所示时，sgRNA在原序列中用粗下划线标注，PAM用加方框标注，细下划线标注的碱基(带有下划线的GTGTGA)代表缺失目标序列。

就本发明而言，优选地，所述切割载体构建步骤包括：在设计好的gRNA两端添加酶切位点Bsmb1，进行合成(优选送TaKaRa公司合成)，得到带有粘性末端的双链gRNA序列(g1，g2)，连入pCas-Guide载体，构建好pCas-Guide-gRNA(g1，g2)载体并测序得到正确载体，其中Cas9载体优选购自origene公司pCas-Guide cloning kit(SKU GE100001)。优选地，合成Donorsequence序列(优选地，Donor sequence序列送TaKaRa公司)，并连接在19T simple载体中。

优选地，所述获得基因敲除细胞步骤可以参见invitrogen公司LTX转染试剂盒操作说明书。更优选地，在本发明中，具体步骤如下：将2μl质粒DNA(1μlpCas-Guide-gRNA质粒，和1μl Donor sequence质粒)用100μl opti-MEM稀释，加入2μl Plus液体，混匀后室温静置5min；在将3μl LTX用100μl opti-MEM稀释，加入DNA液体中，混匀，室温静置30min。30min后将DNA-LTX复合物添加到培养在24孔板中的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞上(优选1个孔)，在例如37℃下，培养箱中孵育6h后更换正常细胞培养液，24小时检查转染情况，48小时将转染的细胞消化成细胞悬液，并通过流式细胞仪分选单细胞，培养在96孔板中，将能够长满孔的细胞分别传代至24孔板，取5000个细胞用于基因型鉴定。

本领域技术人员可以意识到，所述步骤中各种试剂的用量可以按比例放大或缩小，并能取得基本相同或相当的效果，下文同理。

特别优选地，在所述正常细胞培养液中加入下式(I)所示的培养诱导物：

其中R为乙基或异丙基或羟基。

本发明人经研究发现，该培养诱导物的分子结构中由于同时含有黄酮主体结构和糖结构，能够减轻氧化应激反应所可能带来的损伤，促进细胞增殖，提高基质分泌，并且可以抑制损伤细胞凋亡，诱导细胞发生增殖，其发挥作用的机制在进一步研究中。此外，该培养诱导物由于含有葡糖基，还具有较小的免疫毒性。该诱导物的加入对于获得基因敲除细胞步骤有非常好的效果，能够大幅提高细胞培养的可靠性，并且能够使培养时间缩短20-30％。

该培养诱导物可以通过蒸馏提取和柱层析分离方法提取自菊科植物，例如菊花，优选白菊。

优选地，所述培养诱导物在正常细胞培养液中的浓度为0.00001mol/L-0.01mol/L，优选0.001-0.005mol/L。

任选地，所述方法还包括步骤四：基因敲除细胞鉴定。该步骤包括：

(1)提取细胞基因组

收集细胞于EP管中，加细胞裂解液(优选600μl)，室温震荡，冰浴，加入终止液，离心，将上清液转移至新EP管中，并加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混合均匀，室温静置，离心，弃去上清，在白色沉淀中加入乙醇(优选70％浓度乙醇溶液)，上下颠倒洗涤数次，离心，弃去乙醇，室温干燥，加入适量的无酶水溶解沉淀，保存DNA于-20℃。

(2)MSTN基因型分析

通过PCR的方法，克隆MSTN基因的部分序列，测序分析基因敲除细胞的基因型。

引物序列优选为如下：

MSTN上：TTTAATATTAAAGTAGGATTTTCATTATGTG

MSTN下：CATTACCTAAGTTAACTCCTGTTAAAG

PCR体系优选为如下：

退火温度优选是55℃，PCR产物可以为约4000bp。

通过PCR产物测序，分析出在第一内含子1-6位碱基缺失的细胞株。序列信息可以由例如图2所示，方框标记的位置为碱基缺失序列。

优选地，根据上述应用获得转基因牛的应用，在上述步骤一至三的基础上，还包括：五、克隆胚胎制备及胚胎移植；六、任选地，MSTN基因敲除牛鉴定；七、任选地，MSTN基因敲除牛性状检测。

优选地，所述步骤五即克隆胚胎制备及胚胎移植包括：(1)核移植：挑取带有第一极体(如pb1)的卵母细胞，移入操作液中，在200倍显微镜下用固定针固定卵母细胞，调整卵母细胞的位置，使pbl位于时钟的12点到1点的位置，然后用内径为18μm的注射针自约2点的位置处穿过透明带，将pb1及卵母细胞染色体一并吸除。然后，选取形态良好、细胞质均一、直径约12μm的MSTN基因敲除细胞作为供核细胞，用注射管沿去核时留下的孔将细胞嵌到卵质膜与透明带之间，完成重构胚的制作。(2)电融合：完成核移植后，马上进行融合操作，融合液为0.27M的甘露醇其中含有0.1mM CaCl₂、0.1mM MgCl₂以及0.05％BSA，融合电压为1.25kV/cm，电击时间为25μsec，融合操作后30分钟左右挑取融合的胚胎进行下一步操作。(3)重构胚的激活：将获得的重构胚进行体外激活，激活方案为5μM离子霉素(ionomycin)处理5min，接着使用10μg/mL的放线菌酮处理5h，完成激活操作。(4)胚胎培养：激活后的胚胎用培养液(CR1aa+0.4％BSA)洗3次，把胚胎放入由石蜡油覆盖的30μL培养滴内(优选38.5℃，5％CO₂)，饱和湿度条件下培养。每个微滴中培养20枚左右胚胎，在胚胎培养40h后，挑取其中卵裂的胚胎转移入铺有单层卵丘细胞作饲养层的培养滴中，每个微滴中培养14-16枚胚胎，培养液为CR1aa添加4％FBS，每48h更换培养液，继续培养至第7天，统计囊胚率。(5)胚胎移植和妊娠检查：选择身体健康，膘情适中，无生殖系统疾病的育成母牛做受体，使用前列腺素(PGF2α)一次肌注法进行同期发情。移植前使用盐酸利多卡因进行尾椎硬膜外麻醉，直检黄体，要求黄体质地软而充实，然后将胚胎移植到有黄体一侧的子宫角内。在移植后3个月使用直肠检查法进行妊检。

优选地，所述步骤六即MSTN基因敲除牛鉴定包括：(1)提取小牛基因组：无菌条件下剪取少许小牛组织于1.5ml EP管中，置于冰上。在组织中加入冷冻的核裂解液(核裂解液500ul核裂解液(Nuclei lysis solution)+120ulEDTA)，再加入的蛋白酶K(优选17.5ul20ng/ul)，混匀后，置于55℃固浴上孵育一夜。加入200ul蛋白沉淀溶液(proteinprecipitation solution)，涡旋振荡(优选20s)后置于冰上(优选5min)，优选13000-16000r离心5min，将上清转移至一个新管中，加入异丙醇(优选600ul)，颠倒混匀，优选13000-16000r离心1min，弃上清，加入乙醇(优选600ul 70％乙醇)，颠倒混匀。优选13000-16000r离心1min，弃酒精，倒置风干酒精。加水溶解，优选65℃孵育1h或4℃过夜，分光光度计测定OD值。(2)MSTN基因型分析：MSTN基因型分析方法与细胞方法相同。

在一个特别的实施方式中，所述EDTA用下式(II)所示的络合剂替代：

该络合剂即二亚乙基三胺五乙酸。该络合剂与EDTA相比，能够更有效抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，在达到相同或相当的抑制作用的情况下，式(II)所示的络合剂的用量仅仅只需EDTA的1/5-1/10，用量的减少远远超过了二者羧基当量摩尔数的比例，这在先前是未曾预料到的。

优选地，所述步骤七即MSTN基因敲除牛性状检测包括：(1)血清中MSTN蛋白检测；(2)生长性状测定分析。

本发明的方法获得的MSTN基因突变牛的肌肉量明显增大，体重显著增加，生化检测未发现健康异常。

附图说明

图1是CRISPR/Cas9介导的MSTN基因敲除方案图；

图2是突变型序列图；

图3是MSTN标准曲线图；

图4是小牛血清中MSTN蛋白ELISA分析图；

图5是血清碱性磷酸酶含量变化图；

图6是血糖含量随月龄变化图；

图7是丙氨酸氨基转移酶含量图；

图8是天冬氨酸氨基转移酶含量图；

图9是谷氨酰转移酶含量图；

图10是尿素氮含量图；

图11是肌酐含量图；

图12是血清总胆红素含量图；

图13是血清肌酸激酶含量图。

具体实施方式

通过以下具体实施例，进一步描述本发明，但是所述实施例和对比例仅用于说明本发明，并不能限制本发明的范围。

实施例1

一、MSTN靶位点设计与合成

1、登陆NCBI网站，搜索网站上公布的牛MSTN基因序列并下载(本试验所用的基因ID：JQ711180.1)。

2、打开靶点预测网站(http://www.genome-engineering.org/crispr/)，打开网站中靶位点在线设计工具“CRISPR design tool”，在文本框中输入基因序列，选择物种提交后，即可给出该序列所有的靶位点，并给出各位点的潜在脱靶位点和综合评分等。

3、根据网站给出的靶位点序列，综合考虑各项参数后选取其中预测脱靶效应较低的2组靶位点。位点如图1所示。其中，A：sgRNA1，B：sgRNA2，C：Donor sequence。sgRNA在原序列中用最深色标注，最浅色色标注的是碱基代表缺失目标序列，PAM用中间色标注。

二、切割载体构建

设计好的gRNA两端添加酶切位点Bsmb1，送TaKaRa公司合成，得到带有粘性末端的双链gRNA序列(g1，g2)，连入pCas-Guide载体，构建好pCas-Guide-gRNA(g1，g2)载体并测序得到正确载体，Cas9载体购自origene公司pCas-Guide cloning kit(SKU GE100001)。Donor sequence序列送TaKaRa公司合成，并连接在19T simple载体中。

三、获得基因敲除细胞

基因敲除细胞的获得方法参见invitrogen公司LTX转染试剂盒操作说明书，具体步骤如下：

将2μl质粒DNA(1μl pCas-Guide-gRNA质粒，1μl Donor sequence质粒)用100μlopti-MEM稀释，加入2μl Plus液体，混匀后室温静置5min；在将3μl LTX用100μl opti-MEM稀释，加入DNA液体中，混匀，室温静置30min。30min后将DNA-LTX复合物添加到培养在24孔板中的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞上(1个孔)，37℃，培养箱中孵育6h后更换正常细胞培养液。24小时检查转染情况，48小时将转染的细胞消化成细胞悬液，并通过流式细胞仪分选单细胞，培养在96孔板中，将能够长满孔的细胞分别传代至24孔板，取5000个细胞用于基因型鉴定。

四、基因敲除细胞鉴定

(1)提取细胞基因组

收集细胞于EP管中，加600μl细胞裂解液(nuclei lysis solution，Promega，A7943)，室温震荡20sec，冰浴10min，加入200μl终止液(proteinprecipitation solution，Promega，A7953)，14,000rpm离心10min，将上清液转移至新EP管中，并加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混合均匀，室温静置5min。14,000rpm离心10min，弃去上清，在白色沉淀中加入70％乙醇700μl，上下颠倒洗涤数次，14,000rpm离心5min，弃去乙醇。室温干燥50min，加入适量的无酶水溶解沉淀，保存DNA于-20℃。

(2)MSTN基因型分析

引物序列如下：

MSTN上：TTTAATATTAAAGTAGGATTTTCATTATGTG

MSTN下：CATTACCTAAGTTAACTCCTGTTAAAG

PCR体系如下：

退火温度是55℃，PCR产物约4000bp。

通过PCR产物测序，分析出在第一内含子1-6位碱基缺失的细胞株，序列信息如图2所示，方框标记的位置为碱基缺失序列。

五、克隆胚胎制备及胚胎移植

(1)核移植

挑取带有第一极体(pb1)的卵母细胞，移入操作液(M199添加10％FBS和7.5μg/mL的CB)中，在200倍显微镜下用固定针固定卵母细胞，调整卵母细胞的位置，使pb1位于时钟的12点到1点的位置，然后用内径为18μm的注射针自约2点的位置处穿过透明带，将pb1及卵母细胞染色体一并吸除。然后，选取形态良好、细胞质均一、直径约12μm的MSTN基因敲除细胞作为供核细胞，用注射管沿去核时留下的孔将细胞嵌到卵质膜与透明带之间，完成重构胚的制作。

(2)电融合

完成核移植后，马上进行融合操作，融合液为0.27M的甘露醇其中含有0.1mMCaCl2、0.1mM MgCl2以及0.05％BSA，融合电压为1.25kV/cm，电击时间为25μsec，融合操作后30分钟左右挑取融合的胚胎进行下一步操作。

(3)重构胚的激活

将获得的重构胚进行体外激活，激活方案为5μM离子霉素(ionomycin)处理5min，接着使用10μg/mL的放线菌酮(cycloheximide，CHX)处理5h，完成激活操作。

(4)胚胎培养

激活后的胚胎用培养液(CRlaa+0.4％BSA)洗3次，把胚胎放入由石蜡油覆盖的30μL培养滴内，38.5℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。每个微滴中培养20枚左右胚胎，在胚胎培养40h后，挑取其中卵裂的胚胎转移入铺有单层卵丘细胞作饲养层的培养滴中，每个微滴中培养14-16枚胚胎，培养液为CR1aa添加4％FBS，每48h更换培养液，继续培养至第7天，统计囊胚率。

(5)胚胎移植和妊娠检查

选择身体健康，膘情适中，无生殖系统疾病的育成母牛做受体，使用前列腺素(PGF2α)一次肌注法进行同期发情。移植前使用盐酸利多卡因进行尾椎硬膜外麻醉，直检黄体，要求黄体质地软而充实，然后将胚胎移植到有黄体一侧的子宫角内。在移植后3个月使用直肠检查法进行妊检。

六、MSTN基因敲除牛鉴定

(1)提取小牛基因组

无菌条件下剪取少许小牛组织于1.5mlEP管中，置于冰上。在组织中加入冷冻的500ul Nuclei lysis solution+120ul EDTA，再加入17.5ul 20ng/ul的蛋白酶K，混匀后，置于55℃固浴上孵育一夜。加入200ul protein precipitation solution，涡旋振荡20s后置于冰上5min。13000-16000r离心5min，将上清转移至一个新管中，加入600ul异丙醇，颠倒混匀。13000-16000r离心1min，弃上清，加入600ul 70％乙醇，颠倒混匀。13000-16000r离心1min，弃酒精，倒置风干酒精。加水溶解，65℃孵育1h或4℃过夜，分光光度计测定OD值。

(2)MSTN基因型分析

MSTN基因型分析方法与细胞方法相同。

七、MSTN基因敲除牛性状检测

1、血清中MSTN蛋白检测

(1)标准曲线的绘制

使用双夹心抗体ELISA法测定小牛血清中MSTN蛋白质含量。通过不同浓度的标准样品的吸光度值绘制其标准曲线，由软件CurveExpert14.绘制标准曲线，并计算浓度方程(图3)，曲线斜率r＝0.99998945，说明曲线的拟合度较好，标准曲线绘制合格，可以根据该曲线方程计算出样品中MSTN蛋白的含量。

(2)MSTN蛋白含量

根据测得的样品吸光度值计算出其蛋白浓度，如图4所示。MT小牛血清MSTN蛋白含量为(34.31±2.82)ng/ml，均极显著低于CON(44.54±3.77)ng/ml(P＜0.01)。MSTN敲除位点均影响了MSTN基因的表达而导致MSTN蛋白在血液内的含量降低。

2、生长性状测定分析

(1)体重变化

从表1可得出，MT小牛在一月龄到七月龄的生长过程中，体重始终极显著高于对照组(P＜0.01)。

表1各月龄体重数值

(2)体斜长变化

从表2分析得出，MT小牛在一月龄和五月龄体斜长与CON小牛无显著差异(P＞0.05)，而在其他月龄均显著高于CON公牛(P＜0.05)。

表2各月龄体斜长数值

(3)体高变化

从表3分析得出，MT小牛在一月龄至七月龄的体高指标都极显著高于CON(P＜0.01)。

表3各月龄体高数值

(4)胸围变化

由表4可得出，MT小牛各月龄的胸围指标均显著高CON(P＜0.05)。

表4各月龄胸围数值

(5)腹围变化

由表5可知，MT小牛在一月龄和五月龄时的腹围指标与CON无显著差异(P＞0.05)，其它月龄均显著高于CON(P＜0.05)。

表5各月龄腹围数值

3、血液生化结果

分别对一月龄至七月龄的MTA、MTB以及CON牛的血清碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、血液淀粉、尿素氮、葡萄糖、磷、钙、白蛋白、尿酸、肌酸激酶、肌酐、总胆红素与球蛋白进行测定。结果表明，碱性磷酸酶与血糖含量在MSTN敲除小牛中变化较显著，而与蛋白代谢、肝功能、机体免疫以及血液离子等相关评定机体健康状态的指标个体差异较大，但总体上可说明MSTN敲除牛F1代小牛的机体处于健康状态与CON无显著差异。

(1)血清碱性磷酸酶变化

由图5可看出，MSTN敲除牛与CON相比血液碱性磷酸酶含量更高，在二月龄与六月龄时MT的碱性磷酸酶含量极显著高于CON(P＜0.01)。可以推断，MSTN基因敲除，影响了小牛体内碱性磷酸酶的表达，这可能与MSTN敲除后小牛的生长速率提高有关系。

(2)血糖含量变化

一月龄到七月龄的血糖变化结果如图6所示，MT小牛的血糖含量比CON组明显降低。通过对每个月的测定结果进行显著性分析发现，二月龄、六月龄和七月龄时的MT组的血糖极显著低于CON组(P＜0.01)，在四月龄时，MT组显著低于CON组(P＜0.05)。

(3)肝功与免疫指标

在动物体内，活力最强的两种转氨酶是天冬氨酸氨基转移酶(GPT)和丙氨酸氨基转移酶(GOT)，两者在氨基酸代谢中占有重要地位。谷氨酰转移酶(GGT)主要参与谷胱甘肽代谢。GOT、GPT和GGT主要存在于组织细胞内，在心脏、肝脏中活性最强。在机体处于健康状态时，血液中的GOT、GPT和GGT的含量很低；当肝脏受损以及通透性增大时，大量的GOT、GPT和GGT才会进入血液中。同样地，白蛋白是判断动物能量和蛋白营养状况的一项重要指标，指示肝脏的合成功能，血清中白蛋白下降是肝功能损害的标志。球蛋白在体内主要参与免疫反应，血液中球蛋白含量高低与机体体液免疫呈正相关。由图7至11得出，在一月龄至七月龄生长期间，MT小牛与CON组小牛的GOT、GPT和GGT无显著差异(P＞0.05)，说明对MSTN基因敲除可能不影响机体的肝功能及机体的免疫能力。

(4)蛋白代谢指标

血液中尿素氮含量是体内营养状况和肾脏功能的指标，其浓度代表动物机体蛋白代谢的状况，是反刍动物瘤胃中可降解蛋白和碳水化合物平衡的重要指标。瘤胃中可以降解的蛋白以及瘤胃壁吸收的氨氮，在血液中的含量与饲料氮利用率呈负相关。肌酐作为肌肉分解的主产物，源自于磷酸肌氨酸和肌氨酸，其浓度的高低可以反映体内蛋白质分解程度，高浓度肌酸酐说明机体蛋白质分解代谢提高。由图10和11可得出，在MT和CON组中，尿素氮和肌酐水平无显著差异(P＞0.05)，说明MSTN基因敲除可能不影响牛的尿素氮和肌酐代谢。

(5)其它相关指标

血清总胆红素由血红蛋白的血红素转化而来，大部分来源于衰老的细胞，用来判断诊断肝胆疾病，在MT和CON组无显著差异(图12，P＞0.05)。肌酸激酶是人体能量代谢重要酶类，大量存在于心脏、肌肉中，当发生肌萎缩症、心肌梗死时，其血液中含量会明显升高。由图13可看出，总体上MSTN敲除组与CON组在肌酸激酶指标中无显著差异(P＞0.05)。

综上可知，本发明利用Crispr/Cas9技术获得MSTN基因突变牛，小牛的肌肉量明显增大，体重显著增加，生化检测未发现健康异常。

最后应说明的是，显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims

1.一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因，所述基因包含两个内含子和三个外显子序列，第一内含子上有部分碱基缺失。

2.一种含有根据权利要求1所述的肌肉抑制素基因的序列的切割载体。

3.根据权利要求2所述的载体在制备转基因牛或MSTN生物体性状研究中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述载体用于制备转基因牛。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的载体用于增加牛骨骼肌的肌肉量，产生双肌现象。

6.根据权利要求4或5的应用获得的转基因牛。

7.获得根据权利要求1所述能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法，该方法包括以下步骤：一、MSTN靶位点设计与合成；二、切割载体构建；三、获得基因敲除细胞。