CN114891101A - 一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。单克隆抗体具有如SEQ ID NO.15所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的重链可变区。牛MSTN蛋白单克隆抗体量的增加，可刺激肌肉细胞的增生，增加肌肉发育速度，提高肉牛肌肉占比，牛MSTN蛋白单克隆抗体与牛MSTN蛋白结合能力EC50达到稀释0.14倍。在肉牛育种过程中，该抗体能有效快速的定位牛肌肉生长抑制素蛋白，实现辅助育种的快速有效化。

Description

一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
牛肌肉生长抑制素是一种牛体内天然产生的蛋白质，具有动物肌肉抑制生长的功能。肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)是抑制肌细胞增殖与分化的关键基因，对骨骼肌生长发育起着负调控作用，还参与到机体脂肪沉积等其他生命过程中。MSTN不仅能够调控肌肉生长，也能调控脂肪的发育，而这两者对于肉牛产肉量和肉质均起到关键作用，研究显示MSTN可以在肉牛育种中作为分子靶标，通过分子标记辅助育种、基因编辑等方法提高肉牛肌肉发育效率、提升产肉量、优化肌肉和脂肪分布，同时提高育种效率。
目前通用的是肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因检测方法，如荧光定量PCR等。这种方法能在快速最大化的实现基因拷贝数的检测。但是目前该方法需要配套的分子生物学仪器，基层普及度不高。另外，仅仅检测基因的表达量，无法检测出实际最终实际蛋白的表达量。因此本研究研发的牛肌肉生长抑制素能在蛋白水平上检测表达水平，辅助提高育种效率。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种特异检测牛肌肉生长抑制素的试剂。
本发明提供一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体轻链的可变区的CDR-L1的氨基酸序列为S S V S Y，CDR-L2的氨基酸序列为L T S，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述单克隆抗体重链的可变区的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
进一步地限定，所述单克隆抗体重链的可变区的CDR-H1的基因序列如SEQ ID NO:9所示，所述单克隆抗体重链的可变区的CDR-H2的基因序列如SEQ ID NO:111所示，所述单克隆抗体重链的可变区的CDR-H3的基因序列如SEQ ID NO:13所示。
进一步地限定，所述重链的基因序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地限定，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
进一步地限定，所述单克隆抗体轻链的可变区的CDR-L1的基因序列如SEQ ID NO:5所示，所述单克隆抗体轻链的可变区的CDR-L2的基因序列为GTCACATCC，所述单克隆抗体轻链的可变区的CDR-L3的基因序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步地限定，所述轻链的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地限定，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明提供编码上述牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体的基因。
本发明提供携带上述基因的载体或细胞。
本发明提供上述单克隆抗体在制备检测牛肌肉生长抑制素试剂盒中的应用。
有益效果：牛MSTN蛋白单克隆抗体量的增加，可刺激小鼠成纤维细胞的增生，增加肌肉发育速度，提高肉牛肌肉占比，牛MSTN蛋白单克隆抗体与牛MSTN蛋白结合能力EC50达到稀释至0.14倍。在肉牛育种过程中，该抗体能有效快速的定位牛肌肉生长抑制素蛋白，实现辅助育种的快速有效化。
附图说明
图1为牛肌肉生长抑制素体外表达结果图，注：M代表蛋白质Marker,1代表纯化前蛋白，2代表纯化后蛋白；
图2为牛MSTN蛋白单克隆抗体Western blot鉴定试验结果图；
图3为牛MSTN蛋白单克隆抗体结合活性结果图；
图4为单克隆抗体激活细胞增殖结果。
具体实施例
实施例1.牛肌肉生长抑制素体外表达与纯化
从牛体细胞中提取全部RNA作为模板，反转录生产cDNA，利用该模板设计PCR扩增引物，扩增肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN；Genbank ID：NM_001124282)。其中，上游引物的序列为5’-ATTGGCGATGGACCTGGCCATG-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物的序列为5’-TCAGTGGCTCGCCTGAGGT-3’(SEQ ID NO.2)。对PCR产物胶回收，将全部PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后进行胶回收。
将胶回收得到的基因如SEQ ID NO.3所示，以及原核表达载体pEASY-E1分别进行连接。转入Ecoli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，之后42℃水浴热刺激90s，再迅速冰浴2min。向管中加入250μL LB液体培养基，37℃摇床中摇动培养1h，将100μL菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到3mL LB(Amp+，100μg/mL)液体培养基中37℃振荡培养。将经过PCR鉴定，结果阳性的质粒送交上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，将通过序列测定鉴定正确的重组质粒命名为pEASY-MSTN。
将重组质粒pEASY-MSTN转化到原核表达用BL21感受态细胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取LB平板培养基上的白色菌落。取1mL重组菌菌液加入到100mL的LB培养基中37℃震荡培养至OD600nm约为0.5h-1h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导4h。将表达产物进行SDS-PAGE电泳，通过HIS标签的亲和层析方法进行纯化，结果如图1。
实施例2.牛MSTN蛋白单克隆抗体的制备
一、制备杂交瘤细胞
采用实施例1中质控合格的MSTN蛋白作为抗原免疫4只6周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)和不完全弗氏佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期1周，每次50μg免疫抗原，之后进行效价检测，采用最高效价者1周内进行腹腔冲击(无佐剂)。每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。
末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5)，离心5min弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1mL的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10mL无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min弃上清后，加入10mL血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5mL混合10×HAT(Sigma公司)的小鼠胸腺细胞，混匀。将细胞悬液分配至3-5个96孔细胞板中，置于5％CO2，37℃下培养。
在杂交瘤细胞培养3天后，细胞量大约占底面积2/3，加入1％HT(Sigma公司)的完全培养基。5-7天后进行ELISA筛选，得到与免疫原间接ELISA检测OD值高于0.5的杂交瘤作为阳性克隆进行后续培养。这些阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。
4只小鼠初步筛选得到阳性杂交瘤细胞12株，而对阴性对照的结合有7株(检测纯化蛋白的His部分)，识别杂交瘤信号最高的被命名为1D3株。
二、制备和纯化抗体
先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后分别将牛MSTN蛋白单抗杂交瘤细胞株1D3接种到小鼠腹腔中，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。
收集后的腹水经过预处理后选用Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化。用足够的起始缓冲液(8mL-10mL)平衡Protein A-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein A 1mL，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10mg)15-25mL上柱，流速为0.5mL/min；用PBS洗涤后，用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱结合的抗体，然后用2.0M Tris中和pH，获得纯化后的单克隆抗体。
小鼠腹水抗体使用G蛋白亲和纯化。方法如下：将填料装载到层析柱中，用缓存液(20mM PBS，300mM NaCl，pH7.4-8.5)将腹水稀释约5倍，上柱进行纯化。上样后，用平衡缓冲液(20mM PBS，300mM NaCl，pH7.4-8.5)将蛋白未结合部分除去；然后加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH4.0)，将结合蛋白洗脱下来，最后用中和缓冲液(1M tris-HCl,pH9.0)进行PH值调整。
将5倍体积纯化抗体和1体积的buffer蛋白混匀后煮沸5min。离心后上清上样。上样：样品10μL；蛋白Marker 5μL。电泳条件：95伏，电流约75mA，电泳2h。电泳结束后，取出电泳胶，置入染色液中1h，摇床缓慢摇晃。染色完全后，取出放入脱水液中，摇床缓慢摇晃1-2h。脱色完全后取出观察结果。
三、牛MSTN蛋白单克隆抗体的鉴定
Western blot鉴定试验：将肌肉组织液氮处理后进行SDS-PAGE电泳，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为18V电压30min，用5％脱脂奶粉封闭液将转印后的硝酸纤维素膜4℃封闭过夜；加入单克隆抗体上清室温孵1h，用PBST(含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBS缓冲液)洗涤三次，再与4000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体室温孵育1h，PBST洗涤3次后，用DAB显色试剂盒显色，扫描记录。试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体1D3能够与牛MSTN蛋白发生特异性反应，牛MSTN蛋白大小约为35kDa，图2中显色部分与预测的相同。
利用以下实验验证实验效果：
(1)体外孵育法测定单克隆抗体激活体外肌肉组织生长，使用小鼠成纤维细胞增生效果检测，结果如图4所示，显示随着加入牛MSTN蛋白单克隆抗体量的增加，可刺激小鼠成纤维细胞的增生，增加肌肉发育速度，提高肉牛肌肉占比。10μg/mL时刺激细胞增值最高，随后减弱。
(2)牛MSTN蛋白单克隆抗体的结合能力
将96孔板每孔加入100μL的2μg/mL牛MSTN蛋白单克隆抗体，4℃包被过夜。用PBST洗涤3次，并用300μL/孔的1％BSA的封闭液在37℃封闭2h。洗板后，每孔加入100μL梯度稀释的纯化抗体，37℃孵育2小时。洗板后，每孔加入100μL偶联HRP的山羊抗小鼠IgG孵育1h。洗板后，加入100μL/孔的底物溶液TMB，并将板在室温下孵育5分钟。然后，加入50μL/孔的终止溶液(2N H2SO4)以终止反应。测量450nm处的吸光度，并记录为光密度(OD450nm)。以EC50作为牛MSTN蛋白单克隆抗体及其蛋白结合活性的指标时(EC50为达到最大效率一半时抗体的浓度)，结果如图3所示，该单克隆抗体与牛MSTN蛋白结合能力EC50达到0.14，换言之稀释到0.14倍后，抗体与蛋白的结合能力达到50％。
(3)单抗1D3的重(VH)和轻(Vk)可变区的核苷酸和氨基酸序列
按照TRIzol试剂的说明书(Invitrogen,货号：15596018)从3×106个杂交瘤细胞1D3中提取总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。使用SMARTer RACE 5’Kit(Takara，日本)对鼠免疫球蛋白重链和κ轻链可变区片段进行PCR扩增，扩增引物见分子克隆指南(Jones等，Bio/Technology 9：88-89，199)。PCR产物分离后回收纯化目的片段，克隆到pMD-19T载体系统(Takara，日本)中，并使用载体特异性引物M13 Primers对插入片段进行测序。
单抗1D3轻链：核酸序列
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGTAGTGCCAGCCCAAGTGTCAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAAGATCCTCTCCCAAACCCTGGATTTATGTCACATCCAAATTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCACCCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO.4)
单抗1D3轻链氨基酸序列：(SEQ ID NO.15)QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASPSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYVTSKLASGVPARF SGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSGNPPITFGAGTKLELK
单抗1D3轻链CDR1核酸序列：CCAAGTGTCAGTTAC(SEQ ID NO.5)
单抗1D3轻链CDR1氨基酸序列：SSVSY(SEQ ID NO.17)
单抗1D3轻链CDR2核酸序列：GTCACATCC
单抗1D3轻链CDR2氨基酸序列：LTS
单抗1D3轻链CDR3核酸序列：CAGCAGTGGAGTGGTAACCCACCCATCACG(SEQ ID NO.6)
单抗1D3轻链CDR3氨基酸序列：QQW SGNPPIT(SEQ ID NO.7)
单抗1D3重链：核酸序列CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTAGCCTAGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGTCCATAACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTCTGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAATGGCTGGGAGTGATATGGAGACGTGGAAACACAGACTACAATGCAGCTTTCATGTCCAGATTGAGTATCACCAAGGACAACTCCAAGAATCAAGTCTTCTTTAAAATGAACAGTCTTCAAAGTGATGACACTGCCATATATTACTGTGCGGCCTCCTACGGTAGTACCTACGGGGGTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGGCTCTGCA(SEQ ID NO.8)；
单抗1D3重链氨基酸序列：(SEQ ID NO.16)QVQLKESGPSLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNSGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWRRGNTDYNAAFMSRLSITKDNSKNQVFFKMNSLQSDDTAIYYCAASYGSTYGGFAYWGQGTLVTGSA单抗1D3重链CDR1核酸序列：GGTTTCTCATTAACTAACTCTGGT(SEQ ID NO.9)；
单抗1D3重链CDR1氨基酸序列：GFSLT NSG(SEQ ID NO.10)；
单抗1D3重链CDR2核酸序列：ATATGGAGACGTGGAAACACA(SEQ ID NO.11)；
单抗1D3重链CDR2氨基酸序列：IWRRGNT(SEQ ID NO.12)；
单抗1D3重链CDR3核酸序列：GCGGCCTCCTACGGTAGTACCTACGGGGGTTTTGCTTAC(SEQID NO.13)；
单抗1D3重链CDR3氨基酸序列：AASYGSTYGGFAY(SEQ ID NO.14)。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ccaagtgtca gttac 15
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cagcagtgga gtggtaaccc acccatcacg 30
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 8
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctagc ctagtgcagc cctctcagag cctgtccata 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactctggtg tacactgggt tcgccagtct 120
ccaggaaagg gtctggaatg gctgggagtg atatggagac gtggaaacac agactacaat 180
gcagctttca tgtccagatt gagtatcacc aaggacaact ccaagaatca agtcttcttt 240
aaaatgaaca gtcttcaaag tgatgacact gccatatatt actgtgcggc ctcctacggt 300
agtacctacg ggggttttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgg ctctgca 357
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggtttctcat taactaactc tggt 24
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Ser Gly
1 5
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
atatggagac gtggaaacac a 21
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Ile Trp Arg Arg Gly Asn Thr
1 5
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gcggcctcct acggtagtac ctacgggggt tttgcttac 39
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Ala Ala Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Gly Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Pro Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Val Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Arg Arg Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Gly Ser Ala
115
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 17
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5

Claims (10)

1.一种牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体轻链的可变区的CDR-L1的氨基酸序列为S S V S Y，CDR-L2的氨基酸序列为L T S，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述单克隆抗体重链的可变区的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
2.根据权利要求1所述的牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链的可变区的CDR-H1的基因序列如SEQ ID NO:9所示，所述单克隆抗体重链的可变区的CDR-H2的基因序列如SEQ ID NO:11所示，所述单克隆抗体重链的可变区的CDR-H3的基因序列如SEQ ID NO:13所示。
3.根据权利要求1所述的牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述重链的基因序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求1所述的牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
5.根据权利要求1所述的牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体轻链的可变区的CDR-L1的基因序列如SEQ ID NO:5所示，所述单克隆抗体轻链的可变区的CDR-L2的基因序列为GTCACATCC，所述单克隆抗体轻链的可变区的CDR-L3的基因序列如SEQ ID NO:6所示。
6.根据权利要求1所述的牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述轻链的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求1所述的牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
8.编码权利要求1-7任一所述牛肌肉生长抑制素蛋白单克隆抗体的基因。
9.携带权利要求8所述基因的载体或细胞。
10.权利要求1-7任一所述单克隆抗体在制备检测牛肌肉生长抑制素试剂盒中的应用。
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