CN110317268B - 一种中和a型肉毒毒素的鼠源单抗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种中和A型肉毒毒素的鼠源单抗及其应用，所述中和A型肉毒毒素的鼠源单抗由轻链和重链组成，所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的编码基因依次为序列表的序列1自N末端第71‑94位核苷酸、第151‑171位核苷酸和第286‑315位核苷酸；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的编码基因依次为序列表的序列3自N末端第78‑95位核苷酸、第147‑155位核苷酸和第259‑282位核苷酸。

Description

一种中和A型肉毒毒素的鼠源单抗及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种中和A型肉毒毒素的鼠源单抗及其应用。

背景技术

肉毒毒素(botulinum toxin，BoNT)是由厌氧的肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)产生的一种蛋白类神经毒素，是迄今为止已知毒性最强的物质，可分为A-G七种血清型，A、B、E、F型能引起人类肉毒中毒，其中又以A型毒性最强且最为常见。肉毒毒素因其强毒性和易于生产被列为A类生物战剂，目前食物和婴儿肉毒中毒仍常有报道，且随着BoNT/A在药物和美容应用上越来越广泛，因使用不当导致的肉毒中毒案例也越来越多。综上所述，我们目前仍然时刻面临着BoNT/A的威胁，其预防和治疗理该引起广泛重视。BoNT/A的预防采用接种疫苗的方式，但其治疗目前尚无有效的小分子化学药物，临床上使用马血清。

马血清抗毒素存在病毒污染、过敏反应等风险以及制备成本高、生产期长、稳定性差等缺点。单克隆抗体亲和力高、特异性强，取代马血清成为临床上治疗药物是必然的发展趋势。

发明内容

本发明旨在获得一种中和活性高的A型肉毒毒素的鼠源单抗，为A型肉毒毒素中毒治疗和检测奠定基础。

本发明提供一种中和A型肉毒毒素的鼠源单抗，由轻链和重链组成，其特征在于，所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的编码基因依次为序列表的序列2自N末端第71-94位核苷酸、第151-171位核苷酸和第286-315位核苷酸；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的编码基因依次为序列表的序列4自N末端第78-95位核苷酸、第147-155位核苷酸和第259-282位核苷酸。

其中，所述重链为序列表2所示的氨基酸序列，所述轻链为序列表4所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种编码所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗的基因，编码所述重链的基因为序列表1所述的核苷酸序列；编码所述轻链的基因为序列表3所述的核苷酸序列。

所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗在制备用于中和A型肉毒毒素的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供一种用于中和A型肉毒毒素的药物，所述药物的活性成分包括中和A型肉毒毒素的鼠源单抗。

本发明还提供一种所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗的人源化抗体。

所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗的人源化抗体在制备用于中和、治疗或者预防A型肉毒毒素的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供一种用于预防A型肉毒毒素的药物，所述药物的活性成分包括中和A型肉毒毒素的鼠源单抗的人源化抗体。

本发明的A型肉毒毒素的鼠源单抗的中和活性能达到250LD₅₀/mg；故而仅需10μg抗体能完全保护4LD₅₀剂量BoNT/A的攻毒；在4LD₅₀的BoNT/A腹腔注射攻毒后不同时间点注射100μg抗体,攻毒后1h注射可起到完全保护的效果，攻毒后2h、4h注射可起到部分保护效果；对于4LD₅₀剂量腹腔注射攻毒，提前14d注射100μg抗体仍能起到完全保护的作用。扩增出抗体轻链和重链可变区基因，经IMGT软件分析确定抗体轻重链CDR区。有利于A型肉毒毒素的鼠源单抗的进一步应用。

本发明提供了一种能够中和A型肉毒毒素的鼠源单抗，其中和活性与现在临床使用使用的马血清抗毒素相比具有背景清楚、可放大生产等优点。

附图说明

图1为本发明的3次免疫后小鼠尾血效价测定；

图2为本发明的45号抗体亚型鉴定的结果；

图3为本发明的45号抗体纯化效果鉴定；

图4为本发明的45号抗体与抗原BoNT/AHc结合Western检测；

图5为本发明的Foterbio测定45号抗体亲和力常数；

图6为本发明的45号抗体中和活性测定；

图7为本发明的45号抗体保护剂量测定；

图8为本发明的抗体治疗窗口期测定。

具体实施方式

材料列表

实验动物、细胞、菌株：雌性BALB/c小鼠(6-8w)(维通利华)，雄性昆明小鼠(6-8w)(维通利华或军事医学科学院实验动物中心)，SP2/0细胞(实验室保存)。

实验试剂与耗材：96孔酶标板(NEST)，Protein-G亲和层析柱(GE公司)，HRP标记的羊抗鼠IgG(Thermo)，TMB(索莱宝)，完全弗氏佐剂(Sigma)，不完全弗氏佐剂(Sigma)，1640培养液(Gibico)，双抗(Gibico)，血清(Gibico-148)，血清(Sigma)，PEG(Sigma)，小鼠单抗Ig类/亚类鉴定试剂(博奥龙)，DMEM培养基(Kccell)，细胞/细菌总RNA提取试剂盒(天根)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)，质粒小提试剂盒(天根)，PVDF膜(Millipore)，Easysee Western Blot Kit(全式金)SDS-PAGE样品缓冲液(生工)，DMSO(伊诺凯)，细胞培养瓶T25(CORNING)，细胞冻存管(CORNING)，20mL、50mL无菌离心管(CORNING)6、24、96孔细胞培养板(COSTAR)。

溶液配制

包被缓冲液：称取Na₂CO₃1.59 g，NaHCO₃2.93 g溶于800mL ddH₂O中，调节pH到9.6定容到1L。

封闭液(5％脱脂奶粉、ELISA稀释液)：称取脱脂奶粉5g溶于PBST缓冲液中，现用现配，充分溶解。

PBS(磷酸盐缓冲液)：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，KH₂PO₄0.24g溶于800mL ddH₂O中浓HCl调节pH到7.4，定容到1L。

PBST：1L PBS中加500μL吐温20，混匀。

2％的BSA：称取2g白蛋白BSA，溶于ddH₂O定容到100m了。

不完全培养液：DMEM无血清培养基。

HAT选择培养基液：用含20％Sigma血清的DMEM培养基将50×HAT稀释为1×HAT。

冻存液：90％的Sigma血清，10％DMSO。

LB液体培养基：称取NaCl 10g，酵母提取物5g，蛋白胨10g，溶于800mL ddH₂O中，定容到1L。

LB固体培养基：每100mL液体LB加1.5g琼脂。

Protein-G纯化结合缓冲液：称取NaH₂PO₄1.47 g，Na₂HPO₄·12H₂O1.1 g，定容至1L，调节pH至7.0，抽滤。

Protein-G纯化洗脱缓冲液：称取Glycine 7.507g，定容至1L，浓HCl调节pH至2.7，抽滤。

1M pH7.9的tris-HCl缓冲液：称取Tris-Base 12.11g，溶于ddH₂O定容至100mL，用浓HCl调节pH至9.0。

1640细胞培养基：1640培养基加入10％Gibico血清和1％双抗。

DMEM细胞培养基：DMEM培养基加入10％Sigma血清和1％双抗。

10×转膜缓冲液：称取甘氨酸29g，Tris-Base58g，SDS3.7g溶于ddH₂O定容到1L。

1×转模缓冲液：量取100mL 10×转膜缓冲液中加入200命令甲醇再用ddH₂O定容至1L。

单克隆抗体的制备与纯化

按单克隆抗体制备方法，选取雌性BALB/c小鼠(6-8w)，将50μg抗原BoNT/AHc(重链C端)(其中，BoNT/AHc可以按照Immunopharmacology and Immunotoxicology,2009；31(2):261-266中记载的制备方法制备)与完全弗氏佐剂混匀，采用皮下多点注射的方式进行首次免疫。在第21天时，以相同剂量的BoNT/AHc与不完全弗氏佐剂混匀、以相同的注射方式进行第2次免疫。在第42天时，不加佐剂用相同的剂量的BoNT/AHc进行腹腔注射完成第3次免疫。在第56天时，以500μg的BoNT/AHc采用腹腔注射进行强化免疫。

强化免疫后3d(天，以下均表示此含义)，将小鼠断颈处死，用75％酒精消毒。在将无菌状态下分离出脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞按1:5比例混合，采用PEG法进行细胞融合。筛选阳性克隆，采用有限稀释法将阳性孔进行克隆化，获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

取杂交瘤细胞培养上清采用MNA法初步测定其分泌抗体的中和活性。将BoNT/A标准品(10000LD₅₀/mL)用灭过菌的PBS稀释至20LD₅₀/mL。取400μLBoNT/AH_C鼠单抗细胞培养上清1-55分别和20LD₅₀/mL BoNT/A标准品100μL混合室温孵育1h。将500μL室温孵育后的细胞上清和毒素混合物对小鼠进行腹腔注射。每隔12h观察小鼠生存情况，连续观察4d。选取出中和活性最好的部分抗体。

采用BALB/c小鼠通过体内诱生方法制备抗体。每只小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡，2周以后取1×10⁶个杂交瘤细胞腹腔注射，注射细胞10天后收集腹水，饱和硫酸铵盐析后用Protein-G亲和层析柱进行纯化。

进一步测定部分抗体的活性，在攻毒剂量为4LD₅₀时，测定每株抗体的生存曲线。将BoNT/A毒性标准品(10000LD₅₀/mL)用灭过菌的PBS稀释至40LD₅₀/mL。分别取100μg抗体和40LD₅₀/mL BoNTA标准品100μL混合用经灭菌的PBST补齐到500μL室温孵育1h。将500μL室温孵育后单抗细胞上清和毒素混合物对小鼠进行腹腔注射。每组5只小鼠，阴性对照不加抗体。观察小鼠生存情况，连续观察4d。绘出每株抗体的生存曲线。根据抗体的生存曲线选出活性最高的一株抗体。

取活性最高的抗体细胞上清稀释10倍，按照北京博奥龙免疫技术公司说明书鉴定鼠单抗重链和轻链亚型。所述重链的DNA序列如序列1所示，所述重链的氨基酸序列如序列2所示，所述轻链的

采用Western blot技术，分别取10ngBoNT/AH_C、取1μL 1×10⁶LD₅₀/mL的BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F为抗原进行胶浓度为12.5％SDS-PAGE分析。半干法将蛋白转移到PVDF膜，将BAS45抗体用5％脱脂奶粉稀释500倍为一抗，加入稀释后抗体室温孵育1h，用PBST洗3遍每次5min，将膜加入用PBST稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG室温孵育1h。加入化学发光试剂于化学发光分析仪显影并记录。鉴定其是否与抗原BoNT/AHc特异性结合。采用Foterbio测定亲和力常数。

选取雌性BALB/c小鼠(6-8w)进行3次BoNT/AHc抗原免疫，选取效价最高的5号小鼠(32000)进行加强免疫(如图1所示)。采用细胞融合技术将5号小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合筛选杂交瘤细胞，阳性孔进行克隆化最终得到55株阳性细胞株并按顺序编号为1-55号抗体，采用试剂盒鉴定鼠单抗亚型。通过细胞上清中和活性初步测定选出活性最好的5株，采用BALB/c小鼠通过体内诱生方法制备抗体，接种细胞10天后收集腹水，饱和硫酸铵盐析后Protein-G亲和纯化。将纯化后的抗体进行定量的活性评价，选出活性最好的体采用Western blot鉴定其与抗原BoNT/AHc特异性结合。

通过两轮中和活性筛选最终确定45号抗体亲和力最高，其重链为IgG1型，轻链为κ链如图2所示。45号抗体纯化后蛋白纯度大于80％如图3所示，Western blot结果显示能与BoNTAHc特异性结合如图4所示，Foterbio测定其亲和力常数为8.62×10⁷如图5所示。

抗体中和活性测定

攻毒剂量为4LD₅₀测定抗体的生存曲线将BoNT/A标准品(10000LD₅₀/mL)用灭过菌的PBS稀释至。分别取0μg、2μg、4μg、8μg、16μg抗体和40LD₅₀/mL BoNT/A100μL混合用经灭菌的PBS补齐到500μL室温结合1h。将500μL室温孵育后单抗和毒素混合物对小鼠进行腹腔注射。每组5只小鼠。观察小鼠生存情况，连续观察4d。绘出BAS45抗体的生存曲线如图6所示。实验结果显示抗体剂量为2μg、4μg、8μg时起到了部分保护的作用，剂量为16μg时起到完全保护的作用，抗体中和活性为250LD₅₀/mg。

抗体保护剂量测定

将BoNT/A标准品(10000LD₅₀/mL)用灭过菌的PBS稀释至8LD₅₀/mL。第一次分别取0μg、0.1μg、1μg、10μg、100μg抗体用灭过菌的PBS稀释至500μL。第二次分别取0μg、2μg、4μg、8μg、10μg抗体用灭过菌的PBS稀释至500μL。取8LD₅₀/mL毒素500μL对小鼠进行腹腔注射，立刻在不同的位置腹腔注射500μL不同剂量的抗体，每组5只小鼠。观察小鼠生存情况，连续观察4d。绘出每株抗体的生存曲线如图7所示。实验结果表示，2μg、4μg、8μg抗体起部分保护作用，10μg抗体能起完全保护作用。

BAS45抗体治疗窗口期的测定

将BoNTA标准品(10000LD₅₀/mL)用灭过菌的PBS稀释至8LD₅₀/mL。取100μg抗体用灭过菌的PBS稀释至500μL。取500μL毒素标准品对小鼠进行腹腔注射，每组5只小鼠。分别在注射毒素后0h、0.5h、1h、2h、4h、6h腹腔注射500μL抗体。观察小鼠生存情况，连续观察4d。绘出每株抗体的生存曲线如图8所示。每只小鼠4LD₅₀的BoNT/A腹腔注射攻毒后0h、0.5h、1h、2h、4h、6h分别注射100μg抗体。结果表示，攻毒后1h后注射抗体可以起到完全保护的作用，2h和4h可以起到部分保护的作用，抗体治疗窗口期为1h。

2.5抗体预防保护试验

将BoNT/A标准品(10000LD₅₀/mL)用灭过菌的PBS稀释至8LD₅₀/mL。取100μg抗体用灭过菌的PBS稀释至500μL。取500μL抗体对小鼠进行腹腔注射，每组5只小鼠。分别在注射抗体后0d、1d、3d、7d、14d腹腔注射8LD₅₀/mL BoNT/A500μL。观察小鼠生存情况，连续观察4d。

提前14d、7d、3d、1d、0d注射100μg抗体后，4LD₅₀剂量毒素腹腔注射攻毒，每组5只小鼠。结果如表1所示，提前14d注射抗体抗体仍能起到完全保护的作用。

表1抗体预防保护效果评价

抗体重链、轻链可变区基因的扩增

采用天根RNAprep pure Cell/Bacteria Kit RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒调取细胞中的总RNA，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit将其逆转录成cDNA。

(1)阳性克隆株细胞的复苏和培养

将装有编号为45的阳性克隆细胞株冻存管从液氮罐中取出立即放入37℃水中融化，融化后立即1000r/min离心3min。去上清，取1mL DMEM细胞培养基迅速加入冻存管中重悬细胞，转移到加有10mL DMEM细胞培养基的细胞培养瓶中。待细胞长到增值期取1mL到装有10mL DMEM细胞培养基的细胞培养瓶中，待细胞长到增值期提取总RNA。

(2)提取阳性克隆株的总RNA

将细胞轻轻吹起并计数，收集细胞于离心管中1000r/min离心3min，去上清(控制细胞量不超过5×10⁶个)。按天根细胞/细菌总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA(最后用30μL的无核酸酶的ddH₂O洗脱)。

(3)逆转录成单链cDNA

根据Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书设计体系如下：

试剂融化后按以上体系混匀后置于冰上，离心3～5s在65℃孵育5min。

将试管冰浴加入以下组分：

轻轻混匀后离心3～5s，42℃，孵育60min。将反应体系置70℃金属浴5min终止反应。最后将cDNA保存于-70℃冰箱中。

以获得抗体的cDNA为模板，采用简并引物(李竞、王琰、李全喜等。抗胃癌鼠单抗3H11V区基因的克隆及人-鼠嵌合轻链的表达.中华微生物学和免疫学杂志.1997年5月第17卷第3期。)分别扩增出抗体轻链及重链可变区基因。将抗体可变区基因连入pMD-18T质粒后转入DH5ɑ，将菌落PCR鉴定结果为阳性的菌送测序，通过PCR引物与测得的序列比对截取抗体基因序列。查看其阅读框后用数据库IMGT分析测得的抗体可变区序列分析得出其CDR区序列。其中，重链可变区的DNA序列如序列1所示，其对应的氨基酸序列如序列2所示，轻链可变区的序列如序列3所示，其对应的蛋白序列如序列4所示。

(1)目的片段PCR

取得到的抗体的cDNA为模板PCR。所用PCR简并引物如表1-1，抗体轻链的正向引物有5种，抗体重链的正向引物有4种。根据Trans Taq DNA Polymerase HiFi Fidelity(HiFi)说明书设计PCR反应体系如下：

程序采用降落PCR，95℃预变性5min，95℃变性30s，前十个循环退火温度依次从65℃降到56℃，后20个循环维持56℃。72℃延伸90s，共30个循环，72℃终延伸10min，20℃保存。

表1-1抗体可变区扩增引物序列表

(2)基因片段的切胶回收

采用1％琼脂糖胶分离PCR产物，分别回收轻链可变区的基因片段以及重链可变区的基因片段。若是有非特异条带选取250-500bp之间的条带回收。

(3)轻链可变区的基因片段以及重链可变区的基因片段的鉴定

将回收目的片段连入pMD-18T，转入DH5a,进行蓝白斑筛选，挑白斑进行菌落PCR鉴定，将鉴定成功的菌液送测序。

连接反应体系如下：

将体系混匀后16℃过夜，次日将连接产物与100μLDH5α感受态细胞冰上混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入200μL无抗性LB培养基混匀后于37℃摇床200r/min活化0.5h。将活化好的菌均匀的涂布于AMP抗性的LB固体培养基置37℃培养箱中培养过夜。

挑取单克隆于5mL AMP抗性的LB液体培养基中培养8h。取菌液为模板进行菌液PCR鉴定，设计PCR反应体系如下：

程序采用降落PCR，95℃预变性5min，95℃变性30s，前十个循环退火温度依次从65℃降到56℃，后20个循环维持56℃。72℃延伸90s，共30个循环，72℃终延伸10min，20℃保存。

采用1％琼脂糖胶对PCR产物进行分离鉴定后将PCR结果为阳性的菌液送测序。将测序成功的菌液提质粒，保存质粒。

(4)通过RCR引物从测序得到的序列中找出抗体可变区序列

用软件DNAMAN将正向引物和反向引物引物与测序所得的序列进行序列比对，中间的序列即为单抗可变区的基因序列。保存单抗可变区的基因序列。

对扩增出的抗体可变区氨基酸序列进行同源性分析：

通过IMGT数据库对测得的抗体可变区序列进行分析总结。经IMGT软件分析确定抗体CDR区序列及同源基因，结果如表2所示。

表2抗体序列同源性分析

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种中和A型肉毒毒素的鼠源单抗及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggtgcatc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acttgcactg tctctggatt ttcattatcc acctatggtg tccactggat tcgtcagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atttgggctg ttggcagcac aaactataat 180

tcggctctcg agtccagact gaacatcagt aaagacaact cccagagcca agttttctta 240

agaatgacca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag cctcccttat 300

ggtcggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcacag tctccgca 348

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val His Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Val Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Glu

50 55 60

Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Arg Met Thr Ser Leu Gln Thr Asp Asp Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser

85 90 95

Leu Pro Tyr Gly Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtattgtga tgacccagac tcccagattc ctgcttgtat cagcaggaga caggattacc 60

ataacctgca aggccagtca gaatgtgaat aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120

gggcagtctc ctaaactgct aatatactat gcatccaatc gttacactgg agtccctgat 180

cgcttcagtg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcaacac tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttattc ctgtcatcag gattatagct ccctcacgtt cggtgctggg 300

accaagttgg aaatcaaa 318

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Arg Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Ser Cys His Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims (9)

1.一种中和A型肉毒毒素的鼠源单抗，由轻链和重链组成，其特征在于，所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的编码基因依次为序列表的序列1自N末端第71-94位核苷酸、第151-171位核苷酸和第286-315位核苷酸；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的编码基因依次为序列表的序列3自N末端第78-95位核苷酸、第147-155位核苷酸和第259-282位核苷酸；所述重链为序列表中序列2所示的氨基酸序列，所述轻链为序列表中序列4所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗的基因，其特征在于：编码所述重链的基因为序列表1所述的核苷酸序列；编码所述轻链的基因为序列表3所述的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗在制备用于中和或者治疗A型肉毒毒素的药物中的应用。

4.一种用于中和或者治疗A型肉毒毒素的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括权利要求1所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗。

5.权利要求1所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗在制备用于预防A型肉毒毒素的药物中的应用。

6.一种用于预防A型肉毒毒素的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括权利要求1所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗。

7.一种如权利要求1所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗的人源化抗体。

8.一种如权利要求1所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗的人源化抗体在制备用于中和、治疗或者预防A型肉毒毒素的药物中的应用。

9.一种用于预防A型肉毒毒素的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括权利要求1所述的中和A型肉毒毒素的鼠源单抗的人源化抗体。

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