CN103509086A - 肉毒毒素的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肉毒毒素的功能表位FYQ*I，*可以是任意氨基酸，本发明还公开了与此功能表位特异性结合的抗肉毒毒素的单克隆抗体。本发明还公开了上述抗体在制备预防和/或治疗肉毒毒素中毒药物中的应用。

Description

肉毒毒素的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，本发明公开了一种新的毒素功能表位、与这个表位特异性结合的单克隆抗体及其在制备预防和/或治疗毒素中毒药物中的用途。

背景技术

肉毒梭菌(Clostridium botulium)是一种厌氧菌，是革兰氏阳性的孢子形成菌。肉毒毒素(botulium neurotoxin，简称BoNT)是由肉毒梭菌分泌的神经毒素，是目前自然界中人类已知生物和化学毒素中的毒性最强的毒素，肉毒毒素对人的半致死剂量LD50仅为0.1ng-1ng/kg，毒性比氰化物高一万倍。它作用于外周运动神经未稍，神经与肌肉的接合处，即突触处，抑制突触前膜释放神经递质乙酰胆碱，从而导致肌肉松驰性麻痹。食品污染、婴儿肠道感染和伤口感染是自然状态下引起人类肉毒中毒的主要因素。一个肉毒毒素分子就能阻断一个神经细胞的功能，抑制神经肌肉接合处乙酰胆碱的释放而产生毒性功能，严重中毒者由于其呼吸肌的深度麻痹导致呼吸衰竭而死亡。由于毒素具有超强的神经毒性、中毒死亡率高且易于生产的特点，肉毒毒素被FDA归为A级生物战剂，同时，也被列为六种最主要的战剂之一。因此，肉毒毒素无论是偶发的中毒事件，还是用其作为生物武器和生物恐怖性的战剂，其潜在的危害性难以估计。所以肉毒毒素的预防和治疗问题是国家和社会制定防御策略不得不考虑的问题，进行肉毒毒素的防治研究无论对国家的生物安全、公共卫生安全及人民生命健康安全都具有重要的现实意义。

肉毒毒素有7种不同的血清型(BoNT/A-G)，其中A型、B型、E型和F型与人类肉毒中毒有关，各型肉毒毒素分子在结构和功能上有许多相似之处，均由轻链(L链，相对分子质量为50KD)和重链(H链，相对分子质量为100KD)组成，两者通过一个二硫键相连。重链的羧基端(Hc结构域)，为肉毒毒素的受体结合功能域，它负责与神经细胞特异地结合；而重链的氨基末端(H_N结构域)为一个跨膜转运功能结构域，具有帮助轻链进入细胞质的功能；轻链则具毒性的功能，它是一种Zn2+依赖性的肽链内切酶，可特异性地作用于SNARE蛋白复合体中的一种(VAMP/Synaptobrevin，Syntaxin，Snap-25，此三种蛋白是SNARE学说的关键蛋白，是神经突出小泡靶向和融合的载体(Rothman，1994)，同时也是BoNT内肽酶的作用底物)，影响突触小体的融合，从而抑制乙酰胆碱的释放，引起以驰缓性神经麻痹为主的一系列症状，结合功能域，转运功能域和催化酶切活性功能域呈线性排列，转运区域位于中间，而酶活性的催化区域和结合区域位于两侧(C MONTECUCCO，SCHIAVO G.Structure and function oftetanus and botulinum neurotoxins.Quarterly Reviews of Biophysics[J]28，423-472(1995))。

肉毒梭菌最初产生的毒素是无活性的原毒素(单肽链)相对分子量为150KD，随后经肉毒梭菌自身的内源性蛋白水解酶消化分解为重链和轻链，从而产生活性，提高了肉毒毒素的毒力。肉毒毒素的毒理作用主要包括结合、转位、催化酶切这三个阶段。毒素通过Hc端受体结合域与神经细胞特异受体结合，在受体介导的内吞作用下内陷，诱导内体的酸性发生变化，引发毒素转运结构域的构象发生改变，同时囊泡腔在泡膜质子泵ATP酶作用下PH值降低，使疏水区域暴露，在膜上形成一个膜通道，LC通过该通道进入胞质，在神经细胞内，肉毒毒素分解相关的SNARES蛋白，阻断神经递质的释放从而导致一系列的中毒临床症状，其中作用机制的起始阶段，肉毒毒素与其神经细胞表面受体的特异结合是决定毒素分子毒性发生的关键步骤，是毒素进入细胞发挥毒性效应的前提。如果在起始阶段能阻断毒素与受体的相互作用，可以达到有效的毒素抑制作用(GSCHIAVO，BENFENATI F，POULAIN B，et al.Tetanus and botulinum-Bneurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage ofsynaptobrevin.Nature[J]359，832-835(1992))。

目前中毒后的治疗方面，唯一有效的治疗性药物是中和性抗体，治疗成人及婴儿肉毒毒素中毒，在中毒后24小时内可起到显著的保护作用。目前所使用的中和抗体为马源的血清抗毒素和BabyBIG，一种来源于健康的志愿者血液的IgG制品，用以治疗婴儿肉毒中毒，但这种药物供应有限。相对于人而言，马源的血清抗毒素具有强免疫原性，易引起一些副作用，近10％的人使用后可能产生如荨麻疹，血清病等过敏性反应，而且存在着潜在病毒污染等问题，应用受到了极大的限制。因此研发新一代的防治药物，单克隆抗体和基因工程抗体是未来的必然趋势。近年来，国内外的研究热点集中在肉毒毒素中和抗体的研究方面，其中包括：鼠源单克隆抗体的制备和人源化研究，应用噬菌体展示技术进行毒素抗原的中和抗体表位定位研究，筛选及制备的抗肉毒毒素抗体，进行体内体外中和活性比较研究和中和活性的评价等，取得了很大的研究进展。

研究表明，BoNT/Hc片段包含保护性抗原基本决定簇(PPAPS)，作为免疫原能引发显著保护性免疫应答。最理想的重组疫苗是能引发显著保护性免疫应答的最小片段。Dertzbaugh等的研究将引发显著保护性免疫的片段进一步缩小至BONT/A的H1150-1289的139个氨基酸范围，根据认为其他类型BoNT的Hc端也具有较强免疫保护作用。BoNT的重链与轻链相比，各型之间的同源性较低。重链中大约有110个氨基酸残基是较保守的(Hc以845个氨基酸残基计)保守程度最高的为Trp，B型肉毒毒素H链的13个Trp中有9个是保守的，虽然毒素重链同源性较低，但晶体结构学研究表明，A、B、E、F和TeNT之间的Hc可能具有相同的折叠方式，只是延伸的LOOP区域序列不同(B R SINGH.Intimatedetails of the most poisonous poison.Nature structural biology[J]7，617(2000))。

但是，目前无论是肉毒毒素的单克隆抗体，还是基因工程中和性抗体的研发均处于实验室研究阶段，还没有一种中和性抗体上市销售。研制肉毒毒素中和性抗体进展缓慢，其中较大的困难是尽管获得了一些亲和力较高的中和抗体，但无论亲和力多高，单一抗体均不能很好地完全中和毒素，而联合使用两至三株抗体则可能大大提高中和活性(Nowakowski A，Wang C.Potentneutralization of botulinum neurotoxin by recombinant oligoclonalantibody.Proc Natl Acad Sci U S A.99(17)：11346-11350(2000))。

发明内容

本发明的目的之一是公开了肉毒毒素BoNT/B Hc新的功能表位FYQ*I，*可以是任意氨基酸。

本发明还公开了与上述功能表位特异性结合的抗肉毒毒素的单克隆抗体。更具体的，本发明公开了与抗肉毒毒素BoNT/B的4株单克隆抗体5G10、8E10、8D1、1D12，还公开了单克隆抗体8E10对BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F有交叉保护功能。同时对单克隆抗体8E10的基因进行了克隆并测定了其序列，8E10单抗的重链可变区核苷酸序列SEQ ID NO.15，氨基酸序列SEQ ID NO.16，轻链可变区核苷酸序列SEQ ID NO.17，氨基酸序列SEQ ID NO.18，恒定区为小鼠IgG恒定区。

本发明的另外一个目的是公开了上述抗肉毒毒素的单克隆抗体在制备预防和/或治疗肉毒毒素中毒药物中的应用。

具体地，本发明的申请人首先利用分子生物技术克隆肉毒毒素基因，利用原核表达了肉毒毒素重组蛋白BoNT/B Hc、E Hc、F Hc，并通过细胞融合-杂交瘤的方法制备了8株特异性抗肉毒毒素的单克隆抗体，进一步研究了5G10、8E10、8D1、1D12这4株抗体的体内外中和实验。

本发明的申请人利用小鼠体内攻毒试验证实4株抗体(5G10、8E10、8D1、1D12)能完全中和4倍LD50(半数致死量)BoNT/B毒素的攻击，40倍LD50BoNT/B攻击下能延长小鼠生存时间达60小时左右。单克隆抗体8E10对BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F具有交叉中和保护活性，为最佳。体外抗体阻断实验证实8E10不仅能阻断BoNT/BHc与SH-SY5Y细胞(神经母细胞瘤，购自中国科学院细胞库)的结合，也能阻断BoNT/E Hc、BoNT/F Hc与SH-SY5Y细胞的结合，确证抗体8E10的中和保护功能。

本发明的申请人还通过蛋白印迹方法鉴定了8E10抗体对SNARES复合物(VAMP2、SNAP-25)酶解作用的保护效果，进一步证实了该抗体的交叉中和保护功能。

本发明的申请人利用噬菌体展示技术对单克隆抗体8E10所识别的抗原表位进行淘选获得了其一致的表位序列。序列比对结果表明，该单抗所识别的多肽序列落在BoNT/BHc的受体结合区域。更具体地，本发明的申请人通过单克隆抗体抗原表位的淘选、噬菌体克隆ELISA和测序及序列分析推测出BoNT/B Hc的功能表位。合成肽的阻断实验也证实了该表位结合的特异性。从现有结晶的三维结构上分析BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc的这三段序列具有呈现相似构象，表位序列落在位于肉毒毒素表面的Loop环结构。

附图说明

图1、BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc的基因表达载体克隆BamH I和Xho I双酶切鉴定结果。

图2、BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc三种蛋白的聚丙烯凝胶电泳、Western Blotting鉴定及亲和层析纯化色谱图。

图3、纯化的各种单克隆抗体的量。

图4、8株单克隆抗体亚型的ELISA分析检测结果。

图5、8株单克隆抗体与不同血清型肉毒类毒素结合的ELISA结果。

图6、Western blot鉴定BoNT mAb筛选的单克隆抗体结合活性结果。

图7、8株单克隆抗体结合BoNT/B Hc蛋白的亲和力测定。

图8、8株抗体对4倍LD50(半数致死剂量)BoNT/B的中和保护作用实验结果。

图9、4株单克隆抗体8E10、5G10、8D1、1D12对4倍LD50(半数致死剂量)BONT/B中和保护实验结果。

图10、4株单克隆抗体8E10、5G10、8D1、1D12对10倍LD50(半数致死剂量)BONT/B中和保护实验结果。

图11、4株单克隆抗体8E10、5G10、8D1、1D12对20倍LD50(半数致死剂量)BONT/B中和保护实验结果。

图12、4株单克隆抗体8E10、5G10、8D1、1D12对40倍LD50(半数致死剂量)BONT/B中和保护实验结果。

图13、三个剂量的mAb 8E10(1μg、10μg、100μg)对3个剂量(4倍、10倍、20倍LD50(半数致死剂量))的BoNT/E和BoNT/F毒素攻击的中和保护实验结果。

图14、细胞流式法检测8E10对BoNT/B Hc(A)、BoNT/E Hc(B)、BoNT/F Hc(C)与SH-SY5Y细胞结合的抑制作用。

图15、免疫荧光法检测BoNT/B Hc蛋白与SH-SY5Y细胞的结合。

图16、细胞免疫荧光共聚焦法检测8E10对BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/FHc与SH-SY5Y细胞结合的抑制作用(A、B、C)。

图17、8E10对BONT/B、E、F酶解VAMP2(或Snap25)的保护功能检测结果。1.PBS 2.BoNT/B/E/F+马源抗毒血清3.BoNT/B或E或F+8E10(1∶100摩尔比)4.BoNT/B或E或F+8E10(1∶10摩尔比)5.BoNT/B或E或F+8E10(1∶1摩尔比)6.BoNT/B或E或F。

图18、单抗8E10噬菌体表位三轮淘选的富集效率。

图19、单抗8E10特异结合噬菌体的序列分析。

图20、8E10与合成的表位肽结合的特异性实验结果。

图21、合成的表位肽竞争性结合8E10的实验结果。

图22、单抗8E10的表位在肉毒毒素B、E、F Hc蛋白的三维结构比对分析

具体实施方式

以下结合实施例、实验例进一步对本发明进行说明，这些实施例、实验例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press.

本发明实施例或实验例中未标明来源地的原、辅料均为市售。

实施例1：BoNT/B/E/F重链C端基因克隆表达及蛋白纯化

实施例1.1：BoNT/BHc、BoNT/EHc、BoNT/FHc优化序列的全基因合成

参照NCBI中的GENEBANK提供的BoNT/B(GenBank：GU271943.I)、BoNT/E(GenBank：x62683.1)、BoNT/F(GenBank：L35496.1)的原始Aa序列和天然DNA序列分别截取BoNT/B Hc端(第853-1291Aa段)BoNT/E Hc(第830-1252Aa段)和BoNT/F Hc(第847-1278Aa段)为优化模板，其序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，并且分别设计引物如下：

BoNT/B Hc引物：

正义(BamHI+EK酶切位点)

5’-AATGGATTC GACGACGACGACAAA agttaacaatacaacagc-3’

反义(Xho1位点)

5’-AAT CTCGAG ttattcggtccaaccttttc atcttt aggaataaa-3’

BoNT/E Hc引物：

正义(BamHI+EK酶切位点)

5’-AAT GGATCC GAC GAC GAC GAC AAA tataccgatgataaaattctg-3’

反义(Xho1位点)

5’-AAT CTCGAG ttatttttcctgccagccatgttcttcgctaataa-3’

BoNT/F Hc引物：

正义(BamHI+EK酶切位点)

5’-AATGGATCCGACGACGACGACAAA agcagctataccaccgataaa-3’

反义(XhoI位点)

5’-AAT CTCGAG ttagttttcctgccagccatcttctttgct-3’

扩增BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc基因片段，通过凝胶回收试剂盒(上海华舜生物工程公司)回收片段后，与pGEM-T-easy质粒(Promega)连接，转化大肠杆菌TG1后获得阳性克隆。质粒抽提后酶切鉴定，送华大测序的结果显示与合成序列完全一致。BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

实施例1.2：BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc的原核表达纯化及WesternBlot鉴定

将实施例1.1所得的序列正确的重组质粒BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc基因片段用BamHI和XhoI双酶切后，装入表达质粒pGEX-4T-2(Promega)，再转化至BL21(DE3)感受态细胞，进行PCR或者酶切鉴定，结果见附图1。挑单菌落接种于含有100μg/mL Amp(氨苄青霉素)的LB培养液(蛋白胨(trytone)10g、酵母提取物(yeast extract)5g、NaCl 5g，溶于1L去离子水中)，次日菌液OD600为0.6～0.8的时候，在待诱导的菌液中分别加入5个梯度浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，Sigma)(浓度为0.2mM 0.4mM 0.6mM 0.8mM 1.0mM)小量表达，根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果确定最佳诱导表达条件。根据最佳表达诱导条件进行大量培养和诱导表达后收集上清，经GST亲和层析柱纯化后得到纯度高达90％的BoNT/Hc蛋白(为保证和蛋白的纯度仅收集窄峰流出的洗脱液)，经Western Blotting鉴定结果见附图2。

实施例2：BONT鼠源单克隆抗体的筛选和制备

实施例2.1抗BONT淋巴细胞杂交瘤抗体的制备

为了制备BoNT中和保护性单抗，采用BoNT/B Hc蛋白免疫BALB/C小鼠(中国科学院上海动物中心)，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合，用ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，用有限稀释法克隆化。具体地说，用福氏完全佐剂与抗原(BoNT/Hc)的PBS液等量比例充分混合，以抗原的剂量100μg/只，0.2ml/只，腹腔注射首次免疫小鼠。首次免疫3周后进行第二次免疫，用福氏不完全佐剂和抗原液等量混合，剂量与首次免疫相同。在第二次免疫的3周后进行剂量方法同第一次免疫的第三次免疫。在三次免疫后5-7天，抽取小鼠血液分离血清以纯化的BoNT/BHc蛋白包被酶标板，ELISA检测小鼠血清抗体滴度。选取血清中抗BoNT/Hc抗体滴度较高小鼠，摘除眼球采血，并分离血作为抗体筛选时的阳性对照，同时分离其脾脏淋巴细胞，利用经典的PEG法，将小鼠脾脏淋巴细胞与NS-1细胞进行细胞融合。可溶性抗原(BHc)包被酶标板(Greiner)后，用ELISA法对杂交瘤细胞进行了第一轮筛选，用有限稀释法克隆化。最终获得了6株(1D12、8D1、1F4、2F4、5G10、2H12)可稳定分泌BoNT/B Hc特异性的杂交瘤细胞，2株(8E10、3F11)可稳定分泌BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/FHc交叉结合活性的杂交瘤细胞。

实施例2.2：单克隆抗体的腹水制备及腹水抗体的纯化

大量扩增单克隆细胞株，按照每只BALB/C小鼠2×10⁶个杂交瘤细胞腹腔注射，10天左右开始收集小鼠腹水，利用Protein A柱，亲和层析纯化抗BoNT/Hc的单克隆抗体。8种单克隆抗体纯化的量见附图3。利用sigma抗体亚型检测试剂盒对单抗的亚类进行鉴定均为IgG/κ，结果见附图4。

实施例2.3：鼠源BoNT/Hc单克隆抗体生物结合活性的检测

用BoNT/A、B、E、F类毒素(购自兰州生物制品研究所)作为抗原分别包被ELISA板，进行ELISA第二轮筛选以鉴定所分泌的单克隆抗体针对的血清型，以及是否有各型之间的交叉结合活性。实验结果如附图5所示，所有的单抗均与BoNT/B类毒素有较强的结合反应，其中两株单抗与BoNT/E类毒素和BoNT/F类毒素也有较强的结合活性。为进一部确定这8株单克隆抗体的生物结合活性，我们利用Western Blotting技术验证先前的ELISA筛选结果，具体地说，常规10％SDS-PAPE电泳BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc后，转移至PVDF上，5％的脱脂奶粉的TBST液封闭。取ELISA方法证实为强阳性的克隆上清为一抗、孵育、洗后，以HRP标记的羊抗鼠的二抗孵育，显色、曝光。WB鉴定结果如附图6所示，1D12、8D1、1F4、2F4、5G10、2H12六株为型特异性的只与BoNT/B Hc结合，8E10、3F11两株抗体与BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc交叉结合。与先前类毒素的ELISA检测结果是一致的。

实施例2.4抗体与B Hc抗原亲和力活性的测定

BoNT/B Hc蛋白包被：装入新的Chips(GE)，50nM的BoNT/B Hc蛋白配置于不同pH的20mM乙酸钠溶液中(pH4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)，分别注射于BIACORE 3000(GE)，流速10μl/min，回应(response)最强的包被条件为最佳抗原与Chips结合的条件。同时包被鼠源IgG(Genetech)作为参照，控制回应(Responses)在500以内。

Chips的再生：分别用100mM甘氨酸盐酸盐(pH2.2)、0.1mM盐酸(pH2.2)及6M盐酸胍作为再生溶液摸索Chips再生的最佳条件，流速30μl/min，观察基线是否稳定，以各点回应(Responses)之差小于5的再生系统为最佳系统。样品亲和活性的测定：单克隆抗体样品经系列稀释成不同浓度(1μM，800nM，400nM，200nM，100nM，50nM，25nM)分别注入BIACORE仪器，流速30μl/min，再生溶液为6M盐酸胍，再生后稳定时间为3分钟，注入时间2分钟，解离时间为10分钟，同时以BSA(Amresco)作为参照。

经BIAcore检测，软件BIAevaluation 3.1数据处理，计算出8株抗体的亲和常数Kd，结合常数(Kon)，解离常数(Koff)，见附图7。其中1F4、2F4、3F11、8E10、5G10的Kd值较高，达10^-9数量级。

实验例1：单克隆抗体在小鼠体内中和保护性实验

采用小鼠体内攻毒保护实验，分别检测8株抗体的单株应用时体内中和保护活性。具体为：分别将4倍LD50(由兰州生物制品所的检测4倍LD50为最小致死剂量1MLD)的剂量的毒素BoNT/B(兰州生物制品研究所提供)与100μg的单克隆抗体混合，37℃孵育1小时后，进行小鼠腹腔注射，每只小鼠注射液体量不超过500μl。注射后，96小时内，每12小时观察小鼠的存活率及存活时间。初步的实验结果可以看出，注射毒素组，小鼠在12小时内全部死亡，其中2F4、3F11是非中和性抗体，与对照相同，24-36小时内，小鼠也无一生存，没有保护功能，是非中和性抗体。为8E10、5G10、1F4、2H12、8D1、1D12为中和性保护抗体，100μg可以保护大部分小鼠免受4倍LD50BoNT/B剂量的攻击。实验结果见附图8所示。

根据上述实验结果，选取四株具有中和性保护作用的抗体(8E10、5G10、8D1、1D12)，比较这四株BoNT/B的中和保护能力的强弱。具体实验方法同上，目的是观察四株抗体不同剂量(1μg、10μg、100μg)对不同剂量的BONT/B(4倍LD50、10倍LD50、20倍LD50、40倍LD50)的攻击保护效果。附图9结果表明4株抗体在剂量为100μg/只时，可完全保护4倍LD50的BONT/B攻击。附图10结果表明在10倍LD50剂量的攻击下，4株100μg/只的抗体小鼠保护率为50％-70％。附图11结果表明在20倍LD50剂量的攻击下，4株100μg/只的抗体小鼠保护率相近，为20-40％左右，不能完全保护。附图12结果表明在40倍LD50BoNT/E(兰州生物制品研究所提供)的攻击下，8E10抗体小鼠保护率96小时生存率为零，但它们的死亡时间明显延迟，且随着抗体浓度的不断增加，死亡时间延迟增加。

用同样的方法设计mAb 8E10三个剂量(1μg、10μg、100μg)对不同剂量的BoNT/E和BoNT/F(兰州生物制品研究所提供)(4倍、10倍、20倍LD50)毒素攻击的中和保护实验。附图13结果表明，具有交叉结合活性的抗体8E10，也具有交叉中和保护活性，在约20倍LD50的BoNT/E和BoNT/F攻击时，抗体8E10可延长小鼠的生存时间40-50小时。

实验例2：体外细胞与BoNT/Hc结合的抗体阻断实验

实验例2.1：细胞流式仪检测交叉中和保护抗体体外阻断B Hc、E Hc、F Hc与SH-SY5Y(BoNT的靶细胞)的结合

将B Hc、E Hc、F Hc进行FITC标记，实验流程如下：分别将纯化的5mg/ml的BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc用PH9.0～9.5碳酸盐缓冲液透极过夜，透析后蛋白移入小烧杯中。称取适量的FITC(异硫氰酸荧光素，购自宝生物)，加入DMSO(二甲基亚砜)使终浓度为1mg FITC/mL DMSO。FITC-BoNT/B Hc，FITC-BoNT/E HC、FITC-BoNT F Hc的比例均为25μg FITC/mg蛋白(蛋白浓度为5mg/ml)。

按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的蛋白液中，将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下闭光搅拌2小时，用sephadex G-25柱(GE)除去游离荧光素，先用25ml PBS冲洗G-25柱子。收集PBS洗脱的第一荧光素结合蛋白峰，测定F/P比值(既每个蛋白分子上所标记的FITC分子数量)。合适的F/P比值为2-4。分别设置阴性对照、阳性对照和实验组观察8E10抗体阻断B Hc、E Hc、F Hc与SH-SY5Y细胞(神经母细胞瘤，购自中国科学院细胞库)的结合情况。具体实验按照下面的方案进行：

a、阴性对照，培养的SH-SY5Y细胞+PBS孵育12小时；

b、阴性对照标记的B Hc、E Hc、F Hc(0.5μM)与SH-SY5Y细胞孵育12小时后，PBS洗1500rpm×5次，200μl PBS重悬。

c、实验组：

BHc+8E10mAb(摩尔比分别为1∶101∶1001∶200)孵育1h

EHc+8E10mAb(摩尔比分别为1∶101∶1001∶200)孵育1h

FHc+8E10mAb(摩尔比分别为1∶101∶1001∶200)孵育1h

每组均用鼠源性IgG(Genetech)作无关抗体对照。

各组孵育后，混合液加入SH-SY5Y细胞中再孵育12小时后，PBS洗3次，每次离心1500rpm，5分钟，弃上清再加入，加入PBS 200μl重悬后，上细胞流式技术检测结果显示：mAb 8E10对BoNT/B Hc，BoNT/E Hc和BoNT/F Hc都具有显著的阻断体外结合SH-SY5Y细胞的效果，且呈浓度依赖性的阻断增强功能，当抗体的分子为Hc蛋白分子的10倍时，可显著观察到抗体的阻断效果，为Hc蛋白分子的200倍时，可在完全阻断Hc蛋白分子与细胞受体体外的结合。结果见附图14。

实验例2.2：细胞免疫荧光法检测BoNT/B Hc、BoNT/E Hc、BoNT/F Hc与SH-SY5Y细胞的培养

首先将正常培养的SH-SY5Y细胞进行免疫染色后，激光共聚焦显微镜下观察显示：蛋白BoNT/B Hc与SH-SY5Y细胞的细胞膜受体蛋白发生结合，细胞膜呈现绿色荧光，细胞核因为DAPI(4’6-二脒基2-苯基吲哚，购自宝生物)的衬染而呈现兰色；BSA对照未检测到与细胞的结合，仅细胞核被染为兰色，如图15所示。

同样应用该方法检测交叉中和保护性抗体8E10的体外中和活性，检测其可否有效地抑制毒素与细胞受体的结合。具体地说，设置下面实验方案。

对照组

1：正常培养的SH-SY5Y细胞，PBS(2％的BSA)孵育过夜；

2：FITC荧光标记的B Hc、E Hc、F Hc分别与SH-SY5Y细胞4℃孵育过夜。

实验组：

BoNT/B Hc+mAb 8E10(摩尔比1∶10；1∶100)

BoNT/E Hc+mAb 8E10(摩尔比1∶10；1∶100)

BoNT/F Hc+mAb 8E10(摩尔比1∶10；1∶100)

37℃孵育1小时，加入细胞4℃过夜PBS洗涤三次后，激光共聚焦荧光显微镜观察。实验结果(附图16所示)可以看到8E10均能抑制BoNT/B Hc、BoNT/EHc、BoNT/F Hc与SH-SY5Y的结合，而BSA对照及无关抗体则不能抑制这种结合，仍能观察到因BoNT/Hc与SH-SY5Y细胞结合而产生的绿色荧光。由于BoNT/Hc是BoNT的非毒性基团，其功能是与细胞膜表面的受体结合，进而帮助毒性基团BoNT/H_N进入细胞。本专利获得的抗体，其作用就是阻碍BoNT与细胞的结合，阻断BoNT发挥作用。因此通过抗体阻断BoNT/Hc与靶细胞SH-SY5Y的结合实验，就能体现抗体的综合保护作用。)

实验例3：Western Blotting检测mAb 8E10对全毒素酶解底物的保护效果

已知SH-SY5Y细胞可表达多种SNARE蛋白。预实验中，我们摸索确定了三种毒素作用于SH-SY5Y细胞底物SNAP-25、VAMP和syntaxin临界毒力值BoNT/B为625倍LD50、BoNT/E为250倍LD50、BoNT/F为800倍LD50。具体的实施按照下面实验方案进行：

阴性对照组：PBS

阳性对照照：625倍LD50 BoNT/B+0.1 IU马源抗毒血清；500倍LD50 BoNT/E+0.1IU的马源抗毒血清；BoNT/F 800倍LD50+0.1 IU马源抗毒血清。

实验样品组：(抗体与毒素的比分别为1∶1、10∶1、100∶1)

把上述各组的毒素和抗体混合物混合均匀，37℃孵育1小时，裂解细胞，用SDS提取细胞总蛋白后进行蛋白电泳和Western Blotting，凝胶图像处理系统结果显示8E10抗体对三种毒素具有一定的交叉中和保护功能，从免疫印迹结果上看，随着抗体量的增加，保护功能加强。(如附图17所示，1.PBS 2.BoNT/B/E/F+马源抗毒血清 3.BoNT/B或E或F+8E10(1∶100摩尔比) 4.BoNT/B或E或F+8E10(1∶10摩尔比) 5.BoNT/B或E或F+8E10(1∶1摩尔比) 6.BoNT/B或E或F)。

实验例4：BoNT/B/E/F型交叉保护性中和抗原表位的筛选和鉴定

实验例4.1：单克隆抗体8E10抗原表位的淘选

以8E10单抗作为筛选分子，采用噬菌体随机12肽库(购自NEB，Ph.D.-12^TMPhage Display Peptide Library Kit)经过三轮亲和淘选，与单克隆抗体8E10特异结合的噬菌体克隆被富集，滴度与得率均逐步升高。具体的说，将100μl用0.1mol/L NaHCO₃(碳酸氢钠)溶液(pH 8.6)稀释成100μg/ml的单抗8E10加入96孔酶联板中，4℃孵育过夜。弃包被液，加入200μl含1％BSA(牛血清白蛋白)的TBS缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl)，37℃封闭2小时。然后用TBST(TBS缓冲液+0.1％吐温-20)缓冲液快速洗涤10次，加入100μl用TBS缓冲液稀释的含2×10¹¹PFU的噬菌体溶液，室温孵育1小时。1×TBST(吐温-20 0.1％)、1×TBST(吐温-20 0.3％)、1×TBST(吐温-20 0.5％)分别洗涤5次。加入100μl洗脱液(0.2mol/L甘氨酸盐酸盐，pH 2.2，10g/L BSA)，室温放置10分钟以洗脱结合的噬菌体，加入15μl中和液(1mol/l Tris-HcI，pH 9.1)中和。取10μL测滴度，其余扩增。扩增产物经聚乙二醇/氯化钠(PEG/NaCl)沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选。对结果进行总结：经过三轮淘选，特异性结合于单克隆抗体8E10的噬菌体得到了有效富集。与8E10特异结合的噬菌体克隆第一轮至第三轮的滴度依次为3.6×10⁵pfu、2.6×10⁷pfu、4.7×10⁹pfu。从附图18中可以看出，第三轮的富集效率是第一轮的13050倍。

实验例4.2：阳性克隆筛选和序列分析

从实验例4.1第三轮淘选产物中随机挑取60个蓝色噬菌斑，经扩增后对噬菌体上清进行ELISA检测，最终获得了48个单抗8E10特异的阳性噬菌体。将阳性克隆扩增后，提取单链DNA，以-96gIII引物对它们进行序列测定。结果显示，在所选的64个阳性克隆中，包括了6个独特的序列，它们包含有一致序列SXWY(其中X可以是任意氨基酸)。将一致序列同BoNT/B Hc蛋白序列进行比对后发现，表位落于B Hc蛋白FCISKWYLKEVK区域(SEQ ID NO.7)，见附图19。

实验例4.3单克隆抗体mAb 8E10与表位肽的特异性结合分析及竞争结合实验

为了验证SXWY是8E10单克隆抗体的抗原表位，我们化学合成了BoNT/BHc上的1个12肽(FCISKWYLKEVK，SEQ ID NO.7)，将其命名为BP。另外对照肽5A8，其序列为(VATWLNPDPSQK，SEQ ID NO.8)。经HPLC(高压液相色谱法)纯化，纯度大于95％。

在抗体与多肽结合实验中，单克隆抗体8E10只与BP肽作用，不与对照肽5A8反应；并且，抗体与多肽的结合随着抗体浓度的升高而OD450值升高，由此可见，抗体8E10与多肽BP的结合是特异性，并且是浓度依赖的(附图20所示)。在短肽竞争结合试验中，合成多肽BP随着浓度升高抑制8E10与BoNT/B Hc结合的能力逐渐增强，其IC50(抑制50％时的浓度)小于2.5μg/ml；然而对照肽则不能抑制8E10与BoNT/B Hc的结合(附图21所示)。

以上数据证明：单克隆抗体8E10的抗原结合位点位于多肽BP所对应的氨基酸序列上。

实验例4.4：计算机模拟抗原识别表位

以PDB据库中，BoNT/B，BoNT/E，和BoNT/F蛋白晶体结构(1EPW，3FFZ，3FVQ)为模板，由噬菌体展示所筛选出的表位结果，利用Discovery Studio 2.0(Accelrys，San Diego，CA)软件模拟单克隆抗体所识别的表位区域在BoNT/B HcBoNT/E Hc BoNT/F Hc蛋白结构中的构象位点，并对它们进行了比较。三维结构比对分析结果显示在肉毒毒素B序列的SXWY序列在E/Hc、F/Hc蛋白的氨基酸一级结构中都有性质类似的序列存在，而在三级结构中，也都处于肉毒毒素B、E、F蛋白的受体结合区，以此预测这可能是8E10具有交叉中和保护功能的原因。见附图22所示。

实验例4.5：8E10单抗的可变区基因克隆和序列测定

收集8E105×10⁶～1×10⁷杂交瘤细胞，用Trizol(InvitrogenCat.No.15596-026)抽提其总RNA，根据小鼠抗体恒定区序列，设计引物如下：

HGSP1：5’-GATACTGTGATCTGTTTG-3’(SEQ ID NO.9)

HGSP2：5’-TCGCAGATGAGTCTGGAC-3’(SEQ ID NO.10)

HGSP3：5’-ATGAACACACTCACATTG-3’(SEQ ID NO.11)

LGSP1：5’-GAGGTTATGACTTTCATAGTCAGC-3’(SEQ ID NO.12)

LGSP2：5’-AACACTGTCCAGGACACCATCTCG-3’(SEQ ID NO.13)

LGSP3：5’-TCTGGGATAGAAGTTGTTCATGAG-3’(SEQ ID NO.14)

按照Invitrogen 5’RACE kit(Cat.No.18374-058)的使用说明，分别以HGSP1，LGSP1为引物，合成第一链cDNA；在TdT(Invitrogen)和dCTP(Invitrogen)作用下，给第一链cDNA 3’端加poly C尾；分别以HGSP2，HGSP3、LGSP2，LGSP3为5’引物，通过巢式PCR得到重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的PCR产物；将PCR产物装入pGEM-T easy载体中；挑取克隆抽提质粒，限制性内切酶鉴定得到阳性克隆，通过测序确定其序列。8E10单抗的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.15，氨基酸序列为SEQ ID NO.16。8E10单抗的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.17，氨基酸序列为SEQID NO.18。

Claims (7)

1.一种肉毒毒素BoNT/B Hc功能表位FYQ*I，*可以是任意氨基酸。

2.与权利要求1所述的功能表位特异性结合的抗肉毒毒素的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的抗肉毒毒素的单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.16，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.18。

4.抗肉毒毒素的单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.16，轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO.18，恒定区为小鼠IgG恒定区。

5.一种DNA分子，编码权利要求3所述的单克隆抗体。

6.权利要求5所述的DNA分子，其编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.15，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.17。

7.权利要求2-4任一所述的抗肉毒毒素的单克隆抗体在制备预防和/或治疗毒素中毒药物中的用途。

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