CN102516394A - CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质：1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明提供的蛋白，其可以保护细胞免受炭疽毒素的攻击，可以作为炭疽疫苗，该蛋白与抗原高亲和力结合，相当于抗体的Fc片段，而Fc段又提供抗体的生物学活性。

Description

CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

炭疽(Anthrax)是由感染炭疽杆菌(Bacillus anthracis)而引发的一类传染性疾病。炭疽杆菌为革兰氏阳性芽孢杆菌，携带者为马、鹿等食草动物。人感染炭疽事件主要发生于那些经常接触动物的牧民和从事皮革工作的工人。引发炭疽感染的方式有三种：一是经皮肤感染，主要由炭疽芽孢从破损皮肤进入而致病，炭疽杆菌常聚集于皮肤破损处，这类感染常可恢复而不会引发严重后果。二是经胃肠道感染，常因食用含有芽孢污染的生肉而引发，这类感染常是致死性的，也是我国炭疽感染散发病例的主要感染方式。三是经呼吸道吸入感染，炭疽芽孢直径在5μm以下，因此，芽孢经呼吸道吸入后可直达肺泡组织，而肺泡巨噬细胞可以吞噬芽孢，肺泡巨噬细胞目前被认为是炭疽芽孢的发芽位点，并且由此进入纵隔淋巴组织，在那里，炭疽杆菌快速弥散入血，如果不及时治疗，常可以引起100％的死亡。

炭疽杆菌的致病因子主要集中在两个质粒上。一是pX01质粒，主要表达保护性抗原(protective antigen，PA)、水肿因子(edema factor，EF)和致死因子(lethal factor，LF)，三种蛋白统称为炭疽毒素(anthrax toxin)，其中PA是介导EF和LF进入宿主细胞的关键蛋白，也是炭疽疫苗研制的基础成分。LF是Zn²⁺依赖的蛋白激酶，可以阻断细胞内MAPK信号通路而导致细胞死亡，EF是Ca²⁺依赖的蛋白激酶，具有腺苷环化酶活性，可提高细胞内cAMP水平，引发细胞水肿并损伤细胞生理功能。炭疽杆菌的另一个毒力因子是pX02质粒，该质粒主要编码荚膜成分D-多聚谷氨酸，该成分能抑制巨噬细胞的吞噬作用，有利于细菌快速入血和向全身扩散，对炭疽芽孢杆菌的侵袭和感染具有重要作用。

TEM8(tumor endothelial marker 8)是PA的受体之一，最初发现其在肿瘤血管系统和胚胎小鼠血管系统上有较高表达，因此命名为肿瘤血管内皮标志物，而cDNA表达分析和原位杂交分析显示在脑，心脏，肠，肺，骨骼肌和胰腺等组织中也有少量分布，其天然功能未知。TEM8有三种蛋白亚型(isoform，variant 1-3)，variant1由564个氨基酸组成，其肽链包括信号肽，胞外区，跨膜区和约221个氨基酸的胞内区，而variant2和variant1相比有一个较短的约25个氨基酸的胞内区和4个不同的C端氨基酸残基，variant3是一个分泌性的蛋白，仅由318个氨基酸组成，不过其C端有15个不同的氨基酸。炭疽感染中，和PA受体结合的主要是TEM8 variant2和variant1。

CMG2(capillary morphogenesis protein 2)是炭疽PA的另一个受体，最初在人的脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells HUVECs)上发现，可能参与毛细血管的形成，故名CMG2，后来发现CMG2也表达于其它组织如心脏，肺，肝脏和骨骼肌等。CMG2也有三种异构体，分别由489、488、386个氨基酸构成，这些变异体都含有胞外区，跨膜区和胞内区，CMG2与PA结合的区域序列与TEM8高度相似，相似度达60％，CMG2的天然功能目前还不清楚，但是由于这一蛋白的VWA domain可以选择性的结合collagen IV和laminin(IV型胶原蛋白和层粘连蛋白)，所以有报道认为它是这些蛋白的天然配体。

TEM8和CMG2胞外都含有一个VWA区域(von Willebrand factor A)，VWA功能区常见于细胞粘附蛋白中，常常是蛋白-蛋白相互作用的位点，如整合素integrin和细胞外基质的作用。在两个PA受体中，同样也是和PA相互作用的区域。

虽然接种疫苗是防治细菌和病毒等引起的传染性疾病的有效手段，但是仅仅采用疫苗接种来应对突发性传染病还很不够，以防治炭疽为例，用疫苗免疫有以下不足：(1)炭疽感染一般是源自突发事件，很难预计何时需要接种疫苗。(2)如已遭到恐怖袭击再接种疫苗往往为时已晚，因为炭疽疫苗在初次注射几周甚至几个月以后才开始产生免疫力。(3)不是所有人疫苗接种后都能产生抗体。(4)减毒的炭疽疫苗，安全性上仍有一定风险，无法全面推广使用。(5)单独使用疫苗不能治疗炭疽感染和中和炭疽毒素。

采用疫苗免疫和抗体治疗可有效防治炭疽等传染性疾病，其有如下优势：(1)注射特异性抗体能使机体迅速产生抵抗病原体的免疫力；(2)被动免疫一个剂量产生的免疫力可持续几周至几个月；(3)副作用极低；(4)抗体作为治疗药物，不仅能够杀死病原体，还可中和病原体产生的毒素，阻止病情的发展。(5)抗体作为预防药物，快速、灵活、安全和有效，能很好应对突发性和不确定性事件。

研制用于临床治疗的抗炭疽毒素抗体有3个难点：(1)病原体抗原的突变可能会导致已有抗体丧失与抗原的亲和力，使抗体无法发挥作用；(2)目前抗体多为鼠源，其人源化需要大量时间和实验验证。(3)更具挑战性的是，由于PA与其受体CMG2的亲和力Kd达到170pM，而研制的抗体要发挥治疗作用，其亲和力一般要相当于或高于毒素与受体的亲和力，要研制高于此亲和力的鼠源抗体已很困难，而将其人源化又保持高亲和力则更困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质：

1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由447个氨基酸残基组成，成熟的二聚体蛋白有854个氨基酸。

上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。

上述编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

在上述编码基因中，所述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由2144个脱氧核苷酸组成。

含有所述蛋白的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。

在上述重组载体中，所述重组载体为将上述编码基因插入载体pIRES2-EGFP中得到的重组载体；在本发明的实施例中其具体为将所述编码基因插入载体pIRES2-EGFP的XhoI和BamHI位点间得到的重组载体。

在上述转基因细胞系中，在本发明的实施例中其具体为将上述重组载体导入宿主细胞得到的转基因细胞系，所述宿主细胞具体为CHO-K1细胞。

扩增上述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围。

在上述的引物对中，本发明具体的实施例采用的引物对如下：一条引物为序列5所示的DNA分子，另一条引物为序列6所示的DNA分子。

本发明的另一个目的是提供一种炭疽疫苗。

本发明提供的一种炭疽疫苗，它的活性成分为如下1)-3)中任一一种：1)上述的蛋白；2)上述的重组载体；3)上述的转基因细胞系。

本发明的第三个目的是提供一种抗炭疽毒素产品。

本发明提供的一种抗炭疽毒素产品，它的活性成分为如下1)-3)中任一一种：1)上述的蛋白；2)上述的重组载体；3)上述的转基因细胞系。

上述的蛋白、上述重组载体或上述转基因细胞系在抗炭疽毒素、制备炭疽疫苗和/或制备抗炭疽毒素产品中的应用也是本发明保护的范围。

在应用中，所述炭疽毒素为保护性抗原PA和致死因子LF的混合物。

本发明的实验证明，本发明提供的蛋白，其可以保护细胞免受炭疽毒素的攻击，可以作为炭疽疫苗，该蛋白与抗原高亲和力结合，相当于抗体的Fc片段，而Fc段又提供抗体的生物学活性，它有以下特点：(1)无抗原性，两段蛋白均来自于人体；(2)高亲和力，CMG2-Fc突变体和配体PA的亲和力KD值都达到10^-11mol/L。(3)和目前在研的PA抗体相比，不用担心病毒和菌株PA抗原的突变。(4)也具有抗体的ADCC和CDC效应。(5)半衰期较长，与人源抗体相近(10-20天左右)。

下面结合附图和具体实施方案对本发明进行进一步说明，不以任何方式限制本发明的实施。凡是依照本发明公开内容进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为通过Protein A亲和层析柱纯化CMG2-Fc(E117Q)突变体蛋白结果

图2为CMG-Fc(E117Q)突变体蛋白非还原电泳检测结果

图3为CMG-Fc(E117Q)突变体蛋白还原电泳检测结果

图4为质谱法测定CMG-Fc(E117Q)突变体蛋白分子量

图5为FortéBio仪器测定CMG2-Fc(E117Q)突变体蛋白和PA配体的亲和力

图6为FortéBio仪器测定未突变CMG2-Fc蛋白和PA配体的亲和力

图7为CMG2(E117Q)-Fc保护RAW264.7巨噬细胞免受炭疽毒素攻击

图8为CMG2(E117Q)-Fc用于保护注射受炭疽毒素大鼠的存活率

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、CMG2突变体基因设计及载体构建

pIRES2-EGFP-CMG2(E117Q)-Fc为将CMG2-Fc(E117Q)编码基因(序列表中的序列1)插入pIRES2-EGFP(Clontech公司，产品目录号：6029-1)的XhoI和BamHI间得到的载体。具体构建过程如下：

含有CMG2胞外区34-225AA的基因载体pIRES2-EGFP-CMG2-Fc，为将CMG2-Fc蛋白(其氨基酸序列见序列表4，其核苷酸为序列表中的序列3)插入pIRES2-EGFP(Clontech公司，产品目录号：6029-1)的XhoI和BamHI间得到的载体。其中CMG2-Fc蛋白的信号肽为尿激酶原信号肽序列，采用重叠PCR方法将117位Glu(E)突变为Gln(Q)，将158为Tyr(Y)突变为Gln(Q)，突变体引物见表1。具体试验操作如下：

以pIRES2-EGFP-CMG2-Fc为模板，先用CMG2-up-XhoI和C117do1扩增出CMG2(E117Q)突变体前一部分，同时用C117up2和CMG-do-BamHI扩增出CMG2(E117Q)突变体后一部分，而后对这两部分进行重叠PCR，最后再用CMG2-up-XhoI和CMG-do-BamHI进行扩增，得到659bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1的自5’末端第1-636位核苷酸，即为CMG2(E117Q)。

将上述获得的CMG2(E117Q)用XhoI和BamHI双酶切，得到酶切产物，将酶切产物与经过同样酶切的pIRES2-EGFP-CMG2-Fc连接，得到连接产物，将连接产物转化Trans10感受态细胞，涂LB平板培养，提取阳性克隆的质粒测序，结果为将序列表中的序列1的自5’末端第1-636位核苷酸插入pIRES2-EGFP-CMG2-Fc的XhoI和BamHI酶切位点间，且替换掉CMG2得到的质粒，即将序列1插入pIRES2-EGFP的XhoI和BamHI间得到的载体，命名为pIRES2-EGFP-CMG2(E117Q)-Fc。

其中，序列1的核苷酸所示的基因命名为CMG2(E117Q)-Fc，该基因编码的蛋白为CMG2(E117Q)-Fc，其氨基酸序列为序列表中的序列2。其中序列1的第1-636位CMG2(E117Q)，序列1的第637-2114位为Fc；序列2的第21-212位为CMG2(E117Q)，序列2的第213-444位为Fc。

CMG2(E117Q)-Fc(序列2)与未突变的CMG2-Fc(序列4)的氨基酸相比，为将序列4的第104位Glu(E)突变为Gln(Q)；

CMG2(E117Q)-Fc(序列1)与未突变的CMG2-Fc(序列3)的氨基酸相比，为将序列3的第310-312位GAA突变为CAG；

也可人工合成序列1，以CMG2-up-XhoI和CMG-do-BamHI为引物，进行PCR扩增，得到的PCR产物经过XhoI和BamHI酶切后与经过同样酶切的pIRES2-EGFP连接，得到重组载体，经过测序，该载体为将序列表中的序列1插入pIRES2-EGFP的XhoI和BamHI间得到的载体，即为pIRES2-EGFP-CMG2(E117Q)-Fc。

表1CMG2-Fc突变体构建所需引物

CMG2-up-XhoI；CCACCATGGTGGCGGAG(序列5)

CMG-do-BamHI；CCGGATCCACTTACCTGTCT(序列6)

C117do1；TCCTTCATGGATATATGTCTGTCCTACTGGACTAACACGT

C117up2；CAGACCTACATTCACGAGGGA

实施例2、CMG2(E117Q)-Fc的应用

一、蛋白的表达和鉴定

1、重组突变体基因质粒转染CHO-K1细胞及阳性克隆筛选

转染采用Invitrogen公司生产的Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体转染试剂盒。按照试剂盒说明书操作，将由实施例1得到的载体pIRES2-EGFP-CMG2(E117Q)-Fc转染的CHO-K1细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号：GNHa 7)培养于5％CO₂、37℃温箱。转染12小时后，更换含10％肽牛血清(杭州四季青公司，产品目录号：4033)的D-MEM/F-12培养基(Gibco公司，产品编号12500-096)培养。48小时后，采用含750ug/ml G418和10％肽牛血清的D-MEM/F-12培养基(invitrogen公司，

产品目录号：12500-096)继续培养，每2-3天换液一次，加压12天后，采用有限稀释法对加压细胞进行单克隆，按2个细胞/孔传入96孔板，2周后出现细胞克隆。

将上述得到的细胞克隆换D-MEM/F-12培养基(invitrogen公司，Gibco公司，产品编号12500-096)继续培养24小时，后吸取细胞培养上清液10倍稀释后进行ELISA检测，所用抗体为HRP标记的羊抗人IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号ZDR-5301)，TMB显色后450nm测定OD值，以无血清培养基做阴性对照。

其中颜色越深的ELISA孔，表示该孔相对应的细胞克隆表达目的蛋白也越高，将该细胞克隆称之为阳性细胞克隆，命名为CHO-K1/pIRES2-EGFP-CMG2(E117Q)-Fc。

挑选15个阳性细胞克隆传入24孔板进行进一步ELISA检测(方法同上)，结果见下表2(H2为阴性对照)，将OD450nm数值在1以上的细胞株进行扩大培养后冻存。

表2 OD450nm数值

	1	2
			A	0.370	0.279
B	1.174	1.069
			C	1.120	1.292
D	0.774	0.633
			E	0.634	0.599
F	1.037	0.047
			G	1.140	0.249
H	0.560	0.042

根据ELISA表达高低和细胞生长状态观察，最终筛选表达较高、且细胞生长状态较好的编号为C2的CHO-K1/pIRES2-EGFP-CMG2(E117Q)-Fc细胞进行下述实验。

2、细胞的扩大培养及表达蛋白纯化

将上述编号为C2的CHO-K1/pIRES2-EGFP-CMG2(E117Q)-Fc细胞按25cm²方瓶-75cm²方瓶-2L转瓶进行扩大培养，待细胞长满瓶壁后，更换为无血清培养基，隔天收液，可连续收取培养上清液4次。

利用Protein A亲和填料(rProtein A Sepharose 4 Fast Flow，GE公司，产品编号71-5900-09 AC)对培养上清液进行目的蛋白亲和层析纯化回收，具体操作方法见产品说明书，洗脱缓冲液用pH2.5、100mM的Gly-HCl(用天平称取7.5g甘氨酸溶解于800ml灭菌蒸馏水中，用浓盐酸调至pH2.5，然后补加灭菌蒸馏水至1000ml)洗脱，流速为2ml/min。

结果如图1所示，当紫外吸收峰值上升至高出基线值30mAu时，开始收集洗脱液(该洗脱液中含有目的蛋白)，收集约1个柱体积为洗脱收集液(即紫外吸收峰下降至高于基线30mAu停止收集)；洗脱液用1M的pH9.0的Tris-HCl调节PH值至7。

将上述的洗脱液通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度，PAGE电泳胶浓度为10％，电泳结果如图2和图3所示，图2为非还原电泳检测突变体大小，其中1为Marker；2为洗脱液；显示得到蛋白条带单一，非还原时双链分子量大小约95kD，与预期的结果一致；

图3为还原电泳检测突变体大小，其中1为洗脱液；3为Marker(8条Marker带，从上往下依次为175kDa，130kDa，95kDa，72kDa，55kDa，43kDa，34kDa，26kDa)；

从图2和图3的结果可以看出，显示得到蛋白条带单一，还原后单链分子量约47.5kD，与预期的结果一致。

证明洗脱液即为纯化的CMG2(E117Q)-Fc蛋白，且该蛋白的浓度为0.3mg/ul。

将上述的纯化的CMG2(E117Q)-Fc蛋白进一步通过质谱测定分子量(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry，简写为MALDI-TOF-MS)，结果如图4所示，可以看出，显示双链CMG2(E117Q)-Fc分子量大小约95.4kDa，单链约47.7kDa，进一步证明得到纯化的CMG2(E117Q)-Fc蛋白。

采用相同的方法将pIRES2-EGFP-CMG2-Fc转染CHO-K1细胞，得到CHO-K1/pIRES2-EGFP-CMG2-Fc，经过扩大培养和纯化，方法同上，得到纯化的未突变的CMG2-Fc。

二、CMG2(E117Q)-Fc和PA亲和力测定

通过Octet QK仪器(FortéBio公司)测定CMG2(E117Q)-Fc和PA(保护性抗原PA购自Merck公司，产品目录号为176905，其中结合于AHC sensor的CMG2(E117Q)-Fc浓度为25μg/ml，而PA设定四个浓度梯度，分别为300μg/ml，100μg/ml，33μg/ml和0μg/ml)的亲和力，具体试验步骤参见仪器说明书，以纯化的未突变的CMG2-Fc为对照。

结果如表3、图5和6所示，图5为FortéBio仪器测定CMG2(E117Q)-Fc突变体蛋白和PA配体的亲和力(E1、F1、G1和H1分别代表CMG2(E117Q)-Fc和浓度梯度稀释的PA的结合-解离曲线)，图6为FortéBio仪器测定未突变CMG2-Fc蛋白和PA配体的亲和力(A4、B4、C4和D4分别代表CMG2-Fc和浓度梯度稀释的PA的结合-解离曲线)。CMG2(E117Q)-Fc的亲和力要高于CMG2-Fc(KD值)。

表3各突变体与PA的亲和力

三、细胞保护试验检测CMG2-Fc(E117Q)保护效果

选用小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号：TCM13)检测CMG2-Fc(E117Q)抵抗炭疽毒素效果，具体试验过程如下：

实验前一天用0.25％胰酶消化巨噬细胞RAW264.7，以3×10⁴细胞/孔传入96孔培养板(培养基为10％FBS的高糖DMEM培养基)，放至37℃ 5％ CO₂培养箱培养，次日待贴壁细胞汇合度达70％时，弃培养上清液，加入含有炭疽毒素(保护性抗原PA和致死因子LF，购自Merck公司，产品目录号分别为176905和176900，各200ng/ml)和CMG2(E117Q)-Fc融合蛋白(经过一系列浓度梯度稀释)的DMEM培养基。37℃培养箱培养4h(观察到单加毒素孔细胞已基本死亡)，加入CCK-8显色液(日本同仁化学研究所，产品货号：CK04)，37℃温箱静置2h，OD450nm读数。以CMG2-Fc为对照。

试验结果如表4和图7所示，和未突变CMG2-Fc相比，CMG2(E117Q)-Fc可提高CMG2-Fc的保护效果。

表4CMG2(E117Q)-Fc保护RAW264.7巨噬细胞免受炭疽毒素攻击

四、F344动物保护试验检测CMG2(E117Q)-Fc保护效果

在Fisher 344大鼠中检测CMG2(E117Q)-Fc蛋白的抗毒素效果，24小时不死即认为蛋白具有保护效果(参考文献：X.Zhang，J.Askins，R.Fleming，et al.Selectionof Potent Neutralizing Human Monoclonal Antibodies to Protective Antigen ofBacillus anthracis.Human Genome Sciences，Rockville(MD)，USA)，具体如下：

挑取200g大小的雄性Fisher 344大鼠(军事医学科学院试验动物中心，简写为F344大鼠)40只，每组五只，共设八组(具体见表5，方法见上述参考文献)，其中设置三个梯度组比较CMG2-Fc和CMG2(E117Q)-Fc保护效果，另外设置一个生理盐水组和一个毒素组，每组均溶解于400μl无菌生理盐水，溶解顺序为先溶解目的蛋白，后溶解LF，最后溶解PA。具体分组信息见下表5：

表5为8组的具体成分

注：a毒素剂量是指100μg PA和100μg LF

结果如图8和下表6所示，

表6为8组的小鼠的死亡率

备注：a：1∶1指目的蛋白和毒素的质量比例

b：指F344大鼠存活只数

从表5和图8可以看出，

阴性对照(毒素)组在2h内100％死亡；

CMG2-Fc(1∶1)组在24h内未见有小鼠死亡；

CMG2-Fc(0.5∶1)组和CMG2-Fc(0.25∶1)组在24h内有小鼠死亡，且CMG2-Fc低剂量组的保护效果要低于高剂量组；

CMG2(E117Q)-Fc(1∶1)和CMG2(E117Q)-Fc(0.5∶1)组在24h内未见有小鼠死亡；

CMG2(E117Q)-Fc(0.25∶1)组在24h有1只小鼠死亡。

试验结果显示CMG2(E117Q)-Fc突变体蛋白可以有效保护F344大鼠免受炭疽毒素攻击，且CMG2(E117Q)-Fc的保护效果要好于CMG2-Fc。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质：

1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述蛋白的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述编码基因插入载体pIRES2-EGFP中得到的重组载体。

6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述转基因细胞系为将权利要求4或5所述重组载体导入宿主细胞得到的转基因细胞系，所述宿主细胞具体为CHO-K1细胞。

7.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或任一片段的引物对，所述引物对具体如下：一条引物为序列5所示的DNA分子，另一条引物为序列6所示的DNA分子。

8.一种炭疽疫苗，其活性成分为如下1)-3)中任一一种：1)权利要求1所述的蛋白；2)权利要求4或5所述的重组载体；3)权利要求4或6所述的转基因细胞系。

9.一种抗炭疽毒素产品，其活性成分为如下1)-3)中任一一种：1)权利要求1所述的蛋白；2)权利要求4或5所述的重组载体；3)权利要求4或6所述的转基因细胞系。

10.权利要求1所述的蛋白、权利要求4或5所述重组载体或权利要求4或6所述转基因细胞系在抗炭疽毒素、制备炭疽疫苗和/或制备抗炭疽毒素产品中的应用。

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