CN103714267A - 基于种特有序列的检测或辅助检测待测菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于种特有序列的检测或辅助检测待测菌株的方法。本发明提供了一种基于种特有序列的检测或辅助检测待测菌株种属的方法，包括如下步骤：1）建立种特有基因片段数据库和待测菌株的基因片段集合；2）将步骤1）得到所述待测菌株的基因片段集合中的所有片段和所述种特有基因片段数据库中的各个菌株中的种特有基因片段分别进行比对，计算比对比例，选取最大比对比例对应的菌株隶属的种属为或候选为待测菌株隶属的种属；本发明的实验证明，本发明通过建立细菌基因组种特有基因片段数据库，依托细菌基因组初步测序结果，可实现对多种未知细菌性病原体的快速鉴定和检测，检测速度快、灵敏度高、特异性好。

Description

基于种特有序列的检测或辅助检测待测菌株的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于种特有序列的检测或辅助检测待测菌株的方法。

背景技术

每年病原体感染引发数万人甚至数十万人死亡，其中有很多是由病原性细菌引发的传染性疾病。及时对病原体进行快速检测和鉴定对于传染病的预防和控制具有积极意义。

近年来，针对细菌性病原体的快速检测技术发展迅速，主要包括基于微生物学、化学、分子生物学和免疫学理论的病原体检验方法。传统的病原微生物检测技术主要包括生化培养检测法和血清免疫学方法等，它们主要对病原微生物进行定性检测。生化培养检测法鉴定结果虽然准确可靠，但这种方法操作繁琐、耗时长，不能达到快速诊断检测的目的；此外，一些细菌是不能或很难能够培养检测的，例如嗜肺军团菌属（Legionella spp.）和分支杆菌属（Mycobacteria spp.）；而且生化培养技术检测灵敏度也比较低（30-50%）。免疫学方法虽然灵敏性高，但易污染，容易导致假阳性结果，而且免疫学检测方法受到抗体和检测方法的限制，每次只能确定或排除一种病原微生物，往往延误紧急突发公共卫生事件的处置。另外，这些常用的生化和免疫学检验都不能提供病原微生物的潜在的致病性信息或者相关毒性信息。

分子生物学及分子遗传学的发展，使人们对微生物的认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征，微生物检测也相应的从生化、免疫方法转向基因水平的检测。分子生物学方法主要是以病原体遗传物质核酸为基础的检测方法，例如核酸杂交技术、PCR及其衍生技术等。当样本中病原菌含量太低时，可用PCR方法在体外进行DNA扩增，不需进行分离培养，其中利用多重PCR方法进行单一或多种致病菌的试验屡有报道，不足之处在于PCR存在易受污染、假阳性高的缺点。目前，核酸杂交技术广泛用于细菌的鉴定，对于那些难以分离培养或不能培养的细菌、生长周期长的细菌，例如生长缓慢的分枝杆菌、布鲁氏菌、嗜肺军团菌、血清学不易测出的细菌及细菌毒素等，在确定其致病性方面核酸杂交技术更显示了其优越性。

生物传感器技术主要基于病原体核酸或抗原检测，是将新兴的传感器技术和分子诊断技术相结合而成的一种新技术，例如光纤传感器、电化学传感器、上转换磷光生物传感器、纳米传感器等。尽管生物传感器作为一种新的传感元件近年来得到了很大的发展，许多光化学、电化学以及压电晶体都相继在生物传感器中得到应用，虽然与常规的核酸和蛋白质检测相比，生物传感器技术具有检测准确、操作简单等特点，但它同时存在灵敏度不够、稳定性不好，容易受杂质干扰等缺点。

生物芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的一项新技术，最初是由核酸分子杂交衍生而来，它利用已知序列的核酸探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测。目前，生物芯片不仅可以将寡核苷酸、cDNA、基因组DNA等片段固定在诸如硅片、玻璃片和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵，而且可以将生物大分子，例如肽、抗原以及抗体等固定在这些固相介质上形成生物分子点阵，当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析。根据生物芯片上探针的分子种类而将之分为DNA芯片(即基因芯片)和蛋白质芯片。

微生物检测基因芯片是指用来检测样品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片。基于高通量、微型化和平行分析的特点，微生物检测基因芯片在微生物病原体检测、种类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测、基因组监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用。但是目前微生物检测芯片研究中也还存在某些不足，大部分研究只针对一种细菌或一组细菌，检测的基因探针数量有限，没有充分发挥基因芯片高通量这一主要优势；同时芯片规模的不足也使制造成本上相对提高，难以规模化应用；另外大规模的特异性探针设计复杂，芯片设计及结果分析往往缺少一个完整的分析系统。随着测序技术的不断发展，尤其是新一代测序技术的出现，利用基因组信息对细菌性病原体进行溯源成为可能。在测序过程中，完成原始测序的过程是比较快的，而后期的拼接过程往往需要耗费的时间周期较长。如果等到完成整个基因组的拼接再进行进化溯源分析，往往会耽误很长时间，影响传染病的预防与控制。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种基于种特有序列的检测或辅助检测待测菌株种属的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）建立菌株的种特有基因片段数据库和待测菌株的基因片段集合；

所述建立菌株的种特有基因片段数据库的方法包括如下步骤：

(1)、从NCBI的ftp服务器下载已完成全基因组测序菌株全基因组序列，生成下载文件，所述下载文件记载每个菌株的基因组序列；

(2)、对所述每个菌株的基因组序列以长度l_subseq为界进行切分，找出基因组中所有的连续l_subseq个碱基组成的基因片段库，将每个菌株所述基因片段库进行去冗余，得到每个菌株基因片段集合，记作S_{strain_k},strain_k为第k株菌；所述长度

其中N为下载的所有菌株的基因组序列中最长的基因组序列的长度；

所述去冗余为将每个菌株的基因片段库中重复出现的基因片段只保留一份；

如：对于一个基因组碱基长度为L的菌株strain_k来说，将会切分出(L-l_subseq+1)个基因片段。

K为下载的菌株中的任意一个。

具体切分方法：每次切分后移1个碱基，即考虑序列中的所有连续l_subseq个碱基的情况；去冗余：将重复出现的基因片段只记录一次，可采用程序中的字典或者集合数据结构实现。

(3)、将隶属于同一个菌种的所述每个菌株基因片段集合进行合并，得到每个菌种基因片段集合，记作S_{specie_i}；所述合并的计算公式为

其中S_{strain_k}为菌株strain_k的基因片段集合，S_{specie_i}为菌种specie_i的基因片段集合，且strain_1,strain_2,…,strain_m∈specie_i，m为每个菌种中的菌株数；

(4)、将所述每个菌种基因片段集合与所述下载文件中除了该菌种之外其他所有菌种的基因片段集合进行差集比较，选取所述每个菌种基因片段集合中不与任一个其他菌种的基因片段集合重叠的基因片段作为该菌种种特有基因片段集合，记作S_{unique_i}；

所述差集比较的计算公式为

其中n为下载文件中的菌种总数，S_{specie_i}为菌种specie_i的基因片段集合，S_{specie_j}为除菌种specie_i以外的其他菌种specie_j的基因片段集合，S_{unique_i}为菌种specie_i的种特有基因片段集合。

(5)、根据步骤(4)得到的每个菌种种特有基因片段集合和步骤(2)得到的每个菌株基因片段集合，将每个菌株基因片段集合与其隶属的菌种的种特有基因片段集合进行交集，得到各个菌株中的种特有基因片段集合，记作S_{sInUnique_k}；所述计算公式为S_{sInUnique_k}＝S_{strain_k}∩S_{unique_i}，其中strain_k∈specie_i，S_{unique_i}为菌株strain_k隶属的菌种的种特有基因片段集合，S_{strain_k}为菌株strain_k的基因片段集合；

所述待测菌株的基因片段集合的建立方法包括如下步骤：

A、提取所述待测菌株的基因组DNA，测序，得到未拼接的基因组DNA序列；

B、将所述未拼接的基因组DNA序列按照所述（2）的步骤进行切分和去冗余，得到待测菌株的基因片段集合；

2）将步骤1）得到所述待测菌株的基因片段集合中的所有片段和所述各个菌株中的种特有基因片段分别进行比对，计算比对比例，将所述各个菌株按照比对比例由大到小的顺序排列，选取最大比对比例对应的菌株隶属的种属为或候选为待测菌株隶属的种属；

所述比对比例为E/F，所述E为所述待测菌株的基因片段集合中与各个菌株中的种特有基因片段相同的片段个数，所述F为各个菌株的种特有基因片段个数。

上述方法中，所述菌为细菌。

本发明的另一个目的是提供一种对待测菌株溯源的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）根据上述方法中的待测菌株隶属的菌种种特有基因片段集合和待测菌株基因片段集合，按照上述方法中的方法计算待测菌株对其隶属菌种的种特有基因片段集合的贡献量，得到待测菌株的种特有基因片段集合；

2）以待测菌株的种特有基因片段集合和所述待测菌株隶属的各菌株种特有基因片段集合为标记，构建系统发育树，实现待测菌株溯源。

本发明的基本思路是：首先在基因组数据库网站上下载已完成全基因组测序的细菌基因组信息，通过筛选全基因组中的基因片段信息，建立菌种特有片段数据库；然后编写计算机程序实现对待测菌株的序列的切割和比对，从而实现对待测菌株的菌种鉴定；在鉴定待测菌株所属菌株后，依据该菌种的特有指纹数据在不同菌株及待测菌株中的分布情况，建立系统发生关系树，完成相应溯源工作。

本发明的实验证明，与现有技术相比，本发明的优点在于：1、快速，本发明中涉及到的种特有基因片段数据库应在实施检测准备就绪，待测菌株完成初步快速测序后无需任何拼接即可直接进行鉴定，检测时间小于1小时；2、特异性好，由于本发明基于种特有指纹数据库，具有很好的种特异性。3、全面系统，该发明可以在菌株基因组在未经拼接的情况下对其在2000多株细菌基因组中基因片段的分布情况进行分析，全面鉴定其种属关系。4、溯源，除以上优点外，本发明还针对待测菌株的原始序列与所鉴定菌种中各菌株的基因片段杂交情况构建种内进化树，从而分析出与待测菌株最为接近的进化来源，或待测菌株的重组情况。

综上所述，本发明通过建立细菌基因组种特有基因片段数据库，依托细菌基因组初步测序结果，可实现对多种未知细菌性病原体的快速鉴定和检测，检测速度快、灵敏度高、特异性好，系统全面地分析未知病原体的种属关系及其毒力，并对其进化过程进行一定的溯源。该发明避免了以往芯片技术往往只针对几种或者几十种菌株进行检测的局限性。利用该技术优势，将为细菌病原体的疾病预防控制提供强有力的支撑。

附图说明

图1为DNA序列切分示意图。

图2为细菌性病原体种特有序列片段数据库示意图。

图3为待测菌株鉴定流程示意图。

图4为包含待测菌株的种内系统发育树。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、基于种特有指纹序列的细菌性病原体检测方法

一、菌株的种特有基因片段数据库的获得

1、下载NCBI细菌基因组序列数据

登陆NCBI的ftp服务器(ftp.ncbi.nlm.nih.gov)，下载已完成全基因组测序菌株全基因组序列（该服务器上是都是全基因组测序的，下载的菌均为细菌），生成下载文件，下载文件记载每个菌株的基因组序列；

本实施例于2013-05-11在NCBI数据库中下载的完成全基因组测序的菌株的全基因组序列，共2349株。

2）、切分基因组数据

在下载的细菌基因组序列中查找长度最长的基因序列，即查找下载的所有菌株的基因组序列中最长的基因组序列的长度，设其长度为N，将切分片段长度设为

如图1所示，编写python脚本对每个菌株的基因组序列以长度l_subseq为界进行切分，找出一个基因组中所有的连续l_subseq个碱基组成的基因片段库，且利用python中的集合数据结构将每个菌株所述基因片段库去冗余（去冗余为将每个菌株所述基因片段库中重复出现的基因片段只保留一份），得到每个菌株基因片段集合S_{strain_k},strain_k为为第k株菌。k为下载的菌株中的任意一个。

因此，对于一个基因组碱基长度为L的菌株strain_k来说，将会切分出(L-l_subseq+1)个基因片段。

本实施例下载的2349株菌中基因组长度最长的菌株为Sorangium_cellulosum__So_ce_56__uid61629，其基因组长度N=13033779；将切分片段长度设为

，对每个菌株的全基因组序列按照长度为14进行切分，且将各个菌株中重复出现的基因片段去冗余后，最终得到每个菌株基因组中的基因片段集合。

3）、合并同一菌种的菌株的基因片段

依据菌种划分情况，将隶属于同一个菌种的所述每个菌株基因片段集合进行合并，得到每个菌种的基因片段集合，记作S_{specie_i}。

合并的计算公式为

其中S_{strain_k}为菌株strain_k的基因片段集合，S_{specie_i}为菌种specie_i的基因片段集合，并且strain_1,strain_2,…,strain_m∈specie_i，m为每个菌种中的菌株数。

4）筛选菌种特有基因片段

将每个菌种的基因片段集合S_{specie_i}与下载文件中除该菌种之外的其他所有菌种的基因片段集合进行差集比较，选取所述每个菌种基因片段集合中不与任一个其他菌种的基因片段集合重叠的基因片段作为该菌种种特有基因片段集合，记作S_{unique_i}；

差集比较的计算公式为 $S_{\mathrm{unique}\_i}=S_{\mathrm{specie}\_i}-\underset{j=1\→i-1,i+1\→n}{\∪}{S}_{\mathrm{specie}\_j},$

其中n为下载文件中的菌种总数，S_{specie_i}为菌种specie_i的基因片段集合，S_{specie_j}为除菌种specie_i以外的其他菌种specie_j的基因片段集合，S_{unique_i}为菌种specie_i的种特有基因片段集合。

具体得到5075077个种特有基因片段集合。

5）菌株的种特有基因片段集合的获得

根据步骤4）得到的每个菌种种特有基因片段集合和步骤(2)得到的每个菌株基因片段集合，计算各个菌株对其隶属菌种的种特有基因片段集合的贡献量，即为将每个菌株基因片段集合与其隶属的菌种的种特有基因片段集合进行交集，得到各个菌株中种特有基因片段的集合，记作S_{sInUnique_k}。

所述计算公式为S_{sInUnique_k}＝S_{strain_k}∩S_{unique_i}，其中strain_k∈specie_i，S_{unique_i}为菌株strain_k隶属的菌种的种特有基因片段集合，S_{strain_k}为菌株strain_k的基因片段集合。

图2为细菌性病原体种特有序列片段数据库示意图。

二、待测菌株的基因片段集合的获得

提取待测菌株（已通过表型鉴定为大肠杆菌O157:H7型）的基因组DNA，测序，结果得到测序原始文件（未拼接的基因组DNA序列）。

将待测菌株的测序原始文件（fastq格式文件）按照一的2）的步骤进行切分和去冗余，得到待测菌株的基因片段集合。

三、将待测菌株的基因片段集合与菌株的种特有基因片段集合进行比较

将步骤二得到待测菌株的基因片段集合中的所有片段和步骤一的得到的各个菌株的种特有基因片段集合分别进行比对，计算比对比例，将各个菌株按照比对比例由大到小的顺序排列，选取最大比对比例对应的菌株隶属的种属为或候选为待测菌株隶属的种属；

比对比例为E/F，E为待测菌株的基因片段集合中与各个菌株中的种特有基因片段相同的片段个数，F为各个菌株的种特有基因片段个数。

本实施例的待测菌株的结果如表1所示：

表1为待测菌株与种特有基因片段数据库的杂交情况

（比例小于10.0%的结果省略）

图3为待测菌株鉴定流程示意图。

由以上结果可以初步判定该菌株为一株大肠杆菌菌株（O157:H7），与其最近缘的是Escherichia_coli_Xuzhou21_uid163995菌株。在Intel i5-2520M CPU运行条件下鉴定程序的运行时间约为64秒。

可以看出，用本发明的方法可以鉴定待测菌株为一株O157:H7大肠杆菌菌株，且方法准确。

实施例2、构建种内系统发育树对待测菌株溯源

根据待测菌株隶属的菌种种特有基因片段集合和待测菌株基因片段集合，按照实施例2的一的步骤（5）计算待测菌株对其隶属菌种的种特有基因片段集合的贡献量，得到待测菌株的种特有基因片段集合；

以待测菌株的种特有基因片段集合和待测菌株隶属的菌种中的各菌株种特有基因片段集合为标记，构建系统发育树，实现对待测菌株的溯源。

具体如下：

待测菌株隶属大肠杆菌中共有菌株58株，种特有基因片段数目为20509个。在构建种内系统发育树时需要计算不同菌株之间的距离，假设菌株X的种特有基因片段集合为S_X，则在不同菌株A和B之间的距离计算公式为：

${\mathrm{dist}}_{A,B}=\frac{S_A\∩S_B}{\max (S_A,S_B)}$

在获得不同菌株之间的距离之后构建距离矩阵M_dist:

其中dist_i,j表示菌株i与菌株j之间的距离。

利用开源软件Phylip中neighbor工具构建进化树，输入为矩阵M_dist，得到含有待测菌株的大肠杆菌菌种系统发育树，如图4所示。

Claims (3)

1.一种基于种特有序列的检测或辅助检测待测菌株种属的方法，包括如下步骤：

1）建立菌株的种特有基因片段数据库和待测菌株的基因片段集合；

所述建立菌株的种特有基因片段数据库的方法包括如下步骤：

(1)、从NCBI的ftp服务器下载已完成全基因组测序菌株全基因组序列，生成下载文件，所述下载文件记载每个菌株的基因组序列；

(2)、对所述每个菌株的基因组序列以长度l_subseq为界进行切分，找出基因组中所有的连续l_subseq个碱基组成的基因片段库，将每个菌株所述基因片段库进行去冗余，得到每个菌株基因片段集合，记作S_{strain_k},strain_k为第k株菌；所述长度其中N为下载的所有菌株的基因组序列中最长的基因组序列的长度；

所述去冗余为将每个菌株的基因片段库中重复出现的基因片段只保留一份；

(3)、将隶属于同一个菌种的所述每个菌株基因片段集合进行合并，得到每个菌种基因片段集合，记作S_{specie_i}；

(4)、将所述每个菌种基因片段集合与所述下载文件中除了该菌种之外其他所有菌种的基因片段集合进行差集比较，选取所述每个菌种基因片段集合中不与任一个其他菌种的基因片段集合重叠的基因片段作为该菌种种特有基因片段集合，记作S_{unique_i}；

(5)、根据步骤(4)得到的每个菌种种特有基因片段集合和步骤(2)得到的每个菌株基因片段集合，将每个菌株基因片段集合与其隶属的菌种的种特有基因片段集合进行交集，得到各个菌株中的种特有基因片段集合，记作S_{sInUnique_k}；

所述待测菌株的基因片段集合的建立方法包括如下步骤：

A、提取所述待测菌株的基因组DNA，测序，得到未拼接的基因组DNA序列；

B、将所述未拼接的基因组DNA序列按照所述（2）的步骤进行切分和去冗余，得到待测菌株的基因片段集合；

2）将步骤1）得到所述待测菌株的基因片段集合中的所有片段和所述各个菌株中的种特有基因片段分别进行比对，计算比对比例，将所述各个菌株按照比对比例由大到小的顺序排列，选取最大比对比例对应的菌株隶属的种属为或候选为待测菌株隶属的种属；

所述比对比例为E/F，所述E为所述待测菌株的基因片段集合中与各个菌株中的种特有基因片段相同的片段个数，所述F为各个菌株的种特有基因片段个数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菌为细菌。

3.一种对待测菌株溯源的方法，包括如下步骤：

1）根据权利要求1或2所述方法中的待测菌株隶属的菌种种特有基因片段集合和待测菌株基因片段集合，按照权利要求1或2所述方法中的方法计算待测菌株对其隶属菌种的种特有基因片段集合的贡献量，得到待测菌株的种特有基因片段集合；

2）以待测菌株的种特有基因片段集合和所述待测菌株隶属的各菌株种特有基因片段集合为标记，构建系统发育树，实现待测菌株溯源。

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