CN110004238A - 一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物及其应用，包括SEQ ID NO 1～4所示的任意一种核苷酸序列，及SEQ ID NO 5～12所示的引物。本发明通过过生物信息学手段进行前期分析，简化了整个实验过程，高效率地获得了目的微生物菌株的特异性核酸序列，实验结果的可重现性极高引物能快速高效实现Arthrobacter sp.2菌株鉴定，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物信息学技术领域，具体涉及一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物及其应用。
技术背景
对于亲缘关系较近微生物的鉴别一直是微生物育种学家，特别是进行植物促生菌研究的专家的一项重要工作。以传统的以形态、生理生化特性为基础的鉴别方法具有很多缺陷，例如：同一个属内的微生物的形态、生理生化特性基本相似，难以鉴别。
随着分子生物学和生物信息学技术的发展，以及越来越多的微生物基因组测序的完成，以DNA片段作为鉴别物种的分子标记的各种方法不断发展出来。这些技术具有特异性强、准确率高、可重复性强、时间短等特点，已经广泛应用于各类治病微生物、环境微生物等的分析鉴定中。而这些技术对针对特定种属的高度特异性的核酸序列，很难区分同一种属内的不同菌株，针对某一特定目标微生物的特异性核酸序列筛选存在一定的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物及其应用，以解决现有技术中同一种属不同菌株鉴定困难的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的寡核苷酸片段，包括SEQ ID NO 1～4所示的任意一种核苷酸序列。
一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物，以SEQ ID NO 1～4任一所示的核苷酸序列为模板，设计得到的引物。
作为优选，包括如下引物对中的任意一对：
A2Fw3：ACAGGAAACGGAAATCGTTG，A2Rv3：GTTCTTCCTGCGAAGCTCAT；
或者：
A2Fw4：TTTTTCTCGGCGTCCATATC，A2Rv4：TGTTCCAGTGGTGCTTTGTC；
或者：
A2Fw5：TTCCCGCAGACCAGTTTATC，A2Rv5：GCACTATTATCCGCGTTCGT；
或者：
A2Fw6：TGGAGCAGGGACTTAGATGG，A2Rv6：TACATGGGCTCGGTGTATCC。
上述用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的寡核苷酸片段在鉴定Arthrobactersp.2菌株中的应用在本发明的保护范围之内。
上述用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物在鉴定Arthrobacter sp.2菌株中的应用在本发明的保护范围之内。
上述的用于鉴定Arthrobacter sp.2的菌株的寡核苷酸片段的筛选方法，该方法包括如下步骤：
(1)获得Arthrobacter sp.2的全基因序列；
(2)利用splitter在线软件的电子剪切技术，将Arthrobacter sp.2菌株的基因组序列剪切成含100～500bp重叠区的200～1500bp核酸小片段；所述splitter在线软件的网址为：http://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/。
(3)将步骤(2)得到含重叠区的核酸小片段的fasta文件在NCBI NT数据库中比对；
(4)步骤(3)比对后得到命中表Ⅰ，删除重复重复序列，进而获得命中核酸序列Ⅰ；
(5)将步骤(4)得到的命中核酸序列Ⅰ与步骤(2)得到的含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列Ⅰ；
(6)将步骤(5)中获得的非命中核酸序列Ⅰ在NCBI NT数据库中再次进行比对，获得命中表Ⅱ，删除重复重复序列，进而获得命中核酸序列Ⅱ；
(7)重复步骤(5)，将步骤(6)获得的命中核酸序列Ⅱ与步骤(2)得到的含重叠区的核酸小片段进行比对，获得非命中核酸序列Ⅱ，该非命中核酸序Ⅱ列即为可能的目标微生物的菌株特异性核酸片段；
(8)以步骤(7)获得的可能的目标微生物的菌株特异性核酸片段为模板，设计PCR引物；
(9)提取目标微生物菌株所在属或近缘属的菌株10种以上的基因组总DNA，构建核酸池；
(10)分别以目标微生物菌株的基因组DNA和步骤(9)获得的核酸池为模板，以步骤(8)设计的引物为引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳检测；
若以目标微生物菌株的基因组DNA为模板的PCR检测为阳性，且以步骤(9)获得的核酸池为模板的PCR检测为阴性的引物对应的核酸片段，即为用于目标微生物菌株鉴别的特异性核酸片段。
将核苷酸序列提交到NCBI NT数据库 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)进行比对时，选择目标微生物菌株对应的属，其他参数均设为默认值。
有益效果：
本发明提供的一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的寡核苷酸片段及引物，通过生物信息学手段进行前期分析，简化了整个实验过程，高效率地获得了目的微生物菌株的特异性核酸序列，实验结果的可重现性极高；在Arthrobacter sp.2制备成微生物菌剂或微生物肥料后，可以根据菌株特异性序列来进行菌株的保护。另外，采用本发明方法筛选的鉴定Arthrobacter sp.2菌株特定核酸序列，通过PCR、qPCR和核酸探针等的设计，定量或半定量检测目标微生物菌株在生态系统(例如在土壤或植物根际)的丰度，进一步说明该菌株在自然生态系统中的存活和发挥作用的情况。
附图说明
图1 Arthrobacter sp.2的菌株特异性引物PCR电泳图(孔道M：DL2000分子量，孔道1-8：核酸池1-8，孔道9：Azospirillum sp.TSA2S，孔道10：无菌水)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1设计Arthrobacter sp.2的菌株特异性片段。
进行Arthrobacter sp.2的全基因组精细测序，用电子剪切工具splitter进行电子剪切，生成含100bp重叠的300bp片段。获得的300bp片段建立核酸片段数据库。在NCBI NT数据库中，以核酸片段为查询条件，展示的最大靶标为10，其他采用默认参数，进行BLASTN搜索。下载命中表，提取命中序列，并进一步获得非命中表，在核酸片段数据库中提取非命中序列。用提取到的非命中序列为为查询条件，展示的最大靶标为10，其他采用默认参数，进行BLASTN搜索。下载命中表，提取命中序列，并进一步获得非命中表，在核酸片段数据库中第二次提取非命中序列，即为可能的菌株特异性片段。获得的部分菌株特异性片段如SEQID NO.1～4所示。
实施例2：
以SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列为模板，设计的Arthrobacter sp.2的菌株特异性引物如表1所示。
表1 Arthrobacter sp.2的菌株特异性引物
实施例3
提取Arthrobacter sp.2总基因组DNA，用表2中的可能的Arthrobacter sp.2的菌株特异性引物，按表3构建非目标菌株的基因组核酸池，以无菌水作为阴性对照。
表2用于验证的可能的Arthrobacter sp.2的菌株特异性引物信息
表3非目标菌株的基因组核酸池信息
用2720 Thermal cycler(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)PCR仪，采用按照以下条件进行PCR扩增。
反应体系：
反应参数：
用2％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测。如果成功扩增Arthrobacter sp.2、未能扩增无菌水和非目标核酸池的引物，即为菌株特异性引物。如附图1中的A2Fw3Rv3、A2Fw4Rv4、A2Fw5Rv5和A2Fw6Rv6。
实施例4
筛选得到的Arthrobacter sp.2的菌株特异性引物转化为qPCR引物，并进行土壤样品中Arthrobacter sp.2菌株数量测定。
实施例5
根据筛选得到的Arthrobacter sp.2的菌株特异性核酸序列设计Southern杂交探索，并进行土壤样品中Arthrobacter sp.2菌株数量的半定量测定。
序列表
<110> 南京信息工程大学
南京工业大学
<120> 一种用于鉴定Arthrobacter sp. 2菌株的引物及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gtacatcgat gagcttcgca ggaagaacga cgagatcagt ccttccaagg tcagcccgcg 240
agacaaggta ttcccgccca cagcgatgac cgtagcaggc tcgtccgtat agatgagacg 300
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Claims (5)
1.一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的寡核苷酸片段，其特征在于，包括SEQ IDNO：1～4所示的任意一种核苷酸序列。
2.一种用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物，其特征在于，以SEQ ID NO 1～4任一所示的核苷酸序列为模板设计得到的引物。
3.根据权利要求2所述用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物，其特征在于，
包括SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12所示引物对中的任意一对。
4.权利要求1所述用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的寡核苷酸片段在鉴定Arthrobacter sp.2菌株中的应用。
5.权利要求2或3所述用于鉴定Arthrobacter sp.2菌株的引物在鉴定Arthrobactersp.2菌株中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 210044 No. 219 Ningliu Road, Jiangbei New District, Nanjing City, Jiangsu Province Applicant after: Nanjing University of Information Science and Technology Applicant after: NANJING University OF TECHNOLOGY Address before: 211500 Yuting Square, 59 Wangqiao Road, Liuhe District, Nanjing City, Jiangsu Province Applicant before: Nanjing University of Information Science and Technology Applicant before: Nanjing University of Technology |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190712 |